KR20190129543A - 흑설 추출물의 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents
흑설 추출물의 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 흑설 추출물은 세포 보호효과, ROS(Reactive oxygen species) 생성 억제효과, MMP-1(Matrix metalloproteinases-1)의 활성 억제 및 COL1A1(pro-collagen type 1)의 발현 증가 효과를 가지므로 항노화 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 유용할 수 있다.
Description
본 발명은 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 신체의 가장 바깥에 존재하는 기관으로, 외부 환경으로부터 우리 몸을 보호하는 역할을 수행한다. 그러나 피부는 다른 기관들에 비해 외부 자극에 많이 노출되어 있어 쉽게 공격받을 수 있고, 특히 그 중에서도 얼굴 피부의 경우에는 자외선 및 공해 물질 등에 직접적으로 노출되어 있어 조기에 노화가 발생하기 쉬운 특징을 갖는다.
사람의 피부는 크게 표피층, 진피층, 피하지방층으로 구성되어 있으며, 피부의 가장 기본적인 역할은 우리 몸으로부터 수분이 증발되는 것을 막아주며 외부로부터 유해성분이 침입하는 것을 막아주는 역할을 한다. 이러한 피부에서의 노화의 원인에 대해서는 크게 두 가지로 연구되고 있는데, 하나는 "내적 노화"로서 연령의 증가에 따른 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인한 것이고, 다른 하나는 "외적 노화"로서 외부 환경 즉, 자외선, 공해, 스트레스 등에 의한 것으로 나눌 수 있다.
피부의 세포는 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 인간의 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 끊임없이 일어나는 생화학 반응에서 발생하는 활성산소종에 의해 산화적 스트레스가 가해지게 되면, 세포 구성 성분들인 지질, 단백질, 탄수화물과 DNA 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 피부암 등의 각종 질병을 일으키는 원인이 되며, 노화를 촉진시킨다. 아울러 외적 노화의 원인 중에서 가장 큰 부분을 차지하고 있는 것은 자외선에 의한 광노화로서 UV에 지속적인 노출을 통해 피부암 등의 급성 및 만성적인 피부의 상해가 유발된다.
피부 진피층 기질을 이루는 중요한 성분의 하나인 콜라겐의 생합성과 분해는 피부 노화 억제에 핵심이 되고 있는데, 상기 활성산소종은 피부 섬유아세포에서 MMPs(matrix metalloproteinases)의 발현을 촉진하며, 자외선에 의한 콜라게나제의 합성을 촉진시킴으로써 피부 노화를 유발한다.
노화된 피부는 콜라겐 합성의 감소를 보이고, 이것은 matrix metalloproteinases(MMPs)의 통제와 연관이 있다. 즉 MMPs는 세포외기질(extracellular matrix)을 remodeling하여 다양한 파괴적인 과정에 중요한 역할을 수행하는 기질 특이성을 가진다. 이중 collagenase로 잘 알려진 MMP-1는 산화적 스트레스에 의한 콜라겐 분해에 관여하는 주요한 효소이다. 또 하나의 피부노화의 특징은 피부 진피에 구조적인 지지를 제공하는 세포외기질(ECM)의 일차적인 구성요소인 collagen type 1의 감소이다. 29가지의 콜라겐 가운데 collagen type 1은 인간의 피부세포에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이다. collagen type 1과 procollagen은 자외선에 의해 down-regulation 된다. 노화된 피부의 주름생성은 연령증가와 같은 자연적인 요인 뿐 아니라 환경적 요인의 영향을 받는데, 특히 자외선에 의한 광노화에서 나타나는 대표적인 증상이다. 주름생성 과정은 피부의 기질단백질인 콜라겐의 결핍에 의해 발생되므로, 주름을 예방하기 위해서는 콜라겐의 합성을 증가시키고 콜라겐 분해 효소의 작용을 억제하는 것이 필요하다.
흑설은 중부 평야지에 적응하고 가공용 연질미로 개발되었다. 최근 유색미에 대한 생리활성의 과학적으로 증명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직까지 흑설에 대한 피부 주름 개선 효과에 관해서는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 흑설 추출물이 세포 보호효과, ROS(Reactive oxygen species) 생성 억제 효과, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1(Matrix metalloproteinases-1)의 활성 억제효과 및 콜라겐 생합성을 증가시키는 COL1A1(pro-collagen type 1)의 발현 증가 효과를 가지므로, 이를 피부 주름 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 흑설 추출물을 포함하는 항노화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 흑설 추출물을 포함하는 항노화용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
나아가 본 발명은 흑설 추출물을 포함하는 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.
더 나아가 본 발명은 흑설 추출물을 포함하는 항노화용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 흑설 추출물은 세포 보호효과, ROS(Reactive oxygen species) 생성 억제효과, MMP-1(Matrix metalloproteinases-1)의 활성 억제 및 COL1A1(pro-collagen type 1)의 발현 증가 효과를 가지므로 항노화 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 유용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 전자공여능을 측정한 결과이다.
도 1b는 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 콜라게나아제 저해 활성을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 세포내 ROS 생성을 측정한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 유색미 5종의 에탄올 추출물의 UVB 조사 후 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 5는 흑설 에탄올 추출물의 MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-13의 발현억제 및 pro-collagen type I의 생성을 확인한 결과이다.
도 6은 흑설 에탄올 추출물의 ERK와 p38의 인산화 억제를 측정한 결과이다.
도 7은 흑설 에탄올 추출물의 UVB조사 후 MMP-1, MMP-3, MMP-9의 발현억제를 확인한 결과이다.
도 1b는 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 콜라게나아제 저해 활성을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 세포내 ROS 생성을 측정한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 유색미 5종의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 유색미 5종의 에탄올 추출물의 UVB 조사 후 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 5는 흑설 에탄올 추출물의 MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-13의 발현억제 및 pro-collagen type I의 생성을 확인한 결과이다.
도 6은 흑설 에탄올 추출물의 ERK와 p38의 인산화 억제를 측정한 결과이다.
도 7은 흑설 에탄올 추출물의 UVB조사 후 MMP-1, MMP-3, MMP-9의 발현억제를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 또는 항노화용 화장료 조성물
본 발명은 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 또는 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 흑설 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다:
흑설에 추출용매에 침지하여 추출하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 추출 후 상등액과 침전물을 분리하여 반복 추출 후 여과하는 단계(단계 2);
상기 단계 2의 여과한 추출물을 감압농축하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3의 농축된 추출물을 건조하는 단계(단계 4).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 70% 에탄올을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출 용매를 흑설 분량에 2 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 3의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있으며, 상기 단계 4의 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 흑설 추출물의 UVB 자극에 의해 증가한 ROS(Reactive Oxygen Species) 과생성에 대한 효과를 확인한 결과, 농도 의존적으로 높은 저해 효능을 확인하였다(도 2 참조).
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 흑설 추출물은 HaCaT 세포에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며(도 4a참조), 또한 UVB 자극에 대한 세포 생존율을 확인한 결과, 흑설 추출물의 높은 세포 생존율을 확인하였다(도 4b참조).
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 흑설 추출물을 UVB 자극을 준 세포에 농도별로 처리하였을 때, COL1A1(pro-collagen typeⅠ)의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며(도 5참조), MMP-1(Matrix Metallo Proteinase-1)의 억제 효과를 확인하였다(도 7참조).
본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 특별히 한정되는 것은 아니지만 피부 외용제의 제형인 것이 바람직하며, 상기 피부 외용제 제형의 하나의 바람직한 형태는 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 마사지크림, 영양크림, 팩, 클렌저, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물을 들 수 있고, 다른 바람직한 형태로는 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제와 같은 경피 투여형의 제형을 들 수 있다. 또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 바람직하게는 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액 마이크로 에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 바이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있으며, 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
상기와 같이 화장료 조성물을 의약품 또는 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로 작용하는 피부에 적용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 의약품으로의 제형화시에는 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화시에는 [International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 또는 항노화용 건강식품 조성물
본 발명은 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 또는 항노화용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 흑설 추출물을 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 흑설 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품 조성물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 흑설 추출물을 함유하는 건강식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 흑설 추출물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 조성물 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 흑설 추출물은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 흑설 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 흑설 추출물을 함유하는 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 흑설 추출물을 함유하는 건강식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 흑설 열수 추출물의 제조
유색미 5종인 조생흑찰(J), 신농흑찰(S), 신토흑미(SR), 흑진주벼(HR) 그리고 흑설(H)은 2015년 국립식량과학원에서 제공받아 시료 중량의 10배 양의 증류수를 첨가하여 85℃에서 3시간 환류 냉각 추출하였다. 각 추출물들은 추출 후 여과 및 농축 후 동결건조하여 냉장보관하고, 각각의 추출물을 JW, SW, SRW, HRW 및 HW라 약칭하였다.
<실시예 2> 흑설 에탄올 추출물의 제조
유색미 5종인 조생흑찰(J), 신농흑찰(S), 신토흑미(SR), 흑진주벼(HR) 그리고 흑설(H)은 2015년 국립식량과학원에서 제공받아 유색미 40g을 70% 에탄올 360㎖ 에 침지하여 상온에서 24시간 방치하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다. 각 추출물들은 여과 및 농축 후 동결건조하여 냉장보관하고, 각각의 추출물을 JE, SE, SRE, HRE 및 HE라 약칭하였다.
<실험예 1> 전자공여능 측정
전자공여능은 Blois의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 각 시료용액 100㎕에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 50㎕ 넣어 잘 혼합한 후 암소에서 30분간 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH를 이용한 항산화활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
선별된 유색미 5종에 대한 전자공여능 활성결과를 도 1(a)에 나타내었다. 유색미 5종의 에탄올추출물 대부분이 25μg/mL 농도에서 66% 이상의 높은 DPPH radical 소거능을 보였으며, 특히 신토흑미 에탄올 추출물(SRE)와 흑설 에탄올 추출물(HE)는 100 μg/mL에서 84% 이상의 소거능을 보였으며, 양성대조군인 BHT가 100 μg/mL에서 95.9%의 소거능을 보인 것과 비교하여 유의할만한 효과라고 볼 수 있다.
<실험예 2> ABTS 라디칼 소거능 측정
ABTS radical 소거활성의 측정은 Park et al.의 방법에 의해 측정하였다. 즉, 7.4mM ABTS[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), Sigma-Aldrich Co.] 0.5mL와 2.6mM potassium persulfate(K2S2O8) 88㎕를 섞은 용액 1㎖와 ethanol 88㎖를 혼합한 ABTS용액 1㎖를 1:1로 섞은 후 12시간 동안 radical을 형성시킨 용액을 99% ethanol에 약 1:13의 비율로 섞어서 734nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료용액 100㎕와 ABTSsolution 100㎕를 혼합하여 30초간 진탕한 후 1분간 상온에서 반응시키고 734nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical cation decolorization 효과는 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
ABTS radical을 이용한 항산화력의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 추출물 내의 항산화력 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 측정방법이다. 선별된 유색미 5종의 열수 추출과 에탄올 추출물에 대한 ABTS radical 소거활성 결과는 도 1(b)에 나타내었다. 신토흑미 에탄올 추출물(SRE), 신토흑미 열수 추출물(SRW)와 흑설 열수 추출물(HW)가 전 농도에서 양성 대조군인 BHT 보다 모두 높은 ABTS radical 소거능을 보였고, 50 μg/mL 이상에서는 유색미 5종의 열수와 에탄올 추출물 모두 72% 이상의 우수한 소거능을 보였다.
<실험예 3> 콜라게나아제(Collagenase) 저해 활성 측정
Collagenase 저해활성 측정은 Cannell 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M tris-HCl buffer(pH7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3mg/㎖, Sigma-Aldrich Co.)를 녹인 기질액 0.25 mL 및 시료용액 0.1㎖L의 혼합액에 collagenase(0.2 mg/㎖, Sigma-Aldrich Co.) 0.15 ㎖를 첨가하여 실온에서 20분간 정치한 후 6% citric acid 0.5 ㎖을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5 ㎖을 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
콜라겐(Collagen)은 피부에서 탄력과 결합에 중요한 역할을 하고 있는데 트립신과 같은 단백질 분해효소의 작용을 받지 않고 콜라게나아제(collagenase)에 의해 분해된다. 따라서 콜라게나아제(collagenase)는 세포외기질 단백질을 분해하는 효소로 피부의 주름생성을 촉진시키는 요인이 된다. 이러한 콜라게나아제(collagenase) 억제능 실험결과는 도 2와 같다. 유색미 에탄올 추출물 모두 25 μg/mL의 농도에서 약 60% 이상의 효소 저해능을 나타내었고, 특히 흑설 에탄올 추출물(HE)는 25, 50 및 100 μg/mL의 농도에서 각각 약 76%, 89% 및 92%로 고르게 높은 저해효능을 보였다.
<실험예 4> 세포내 Reactive oxygen species(ROS) 생성 측정
UVB에 의한 세포 손상으로 인한 ROS의 생성을 측정하기 위한 실험을 진행하였다. HaCaT cells를 3Х105 cells/㎖의 농도로 부유시켜 96well plate에 분주하여 24시간 동안 incubation 하였다. 배지를 제거하고 형광염료인 20 μM 2',7'-dichlorofluoresce-in diacetate(DCFH-DA, Sigma-Aldrich Co.)를 90 ㎕를 처리한 후 20분간 배양하고, 시료용액을 농도별로 선 처리한 후 1시간 동안 배양하였고, DCFH-DA를 제거한 후 PBS로 3번 washing 하고 나서, UVB(50 mJ/cm2)를 조사하고 30분간 다시 배양한 후 형광도를 측정하였다. DCF 형광도는 excitation 485 nm, emission 530 nm의 파장에서 infinite PRO(INFINITE F200 PRO, TECAN, Grdig, Austria)로 분석하여 축적된 ROS에 결합된 형광 DCF-DA를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 수치로 나타내었다.
DCFH-DA는 쉽게 세포막을 뚫고 세포 안으로 확산되어 세포 안의 에스테라아제(esterase)에 의해 형광을 잃은 DCFH로 가수분해 되고, 이후 ROS가 존재하는 환경에서 높은 형광을 띄는 DCF로 빠르게 산화된다. 따라서 DCF의 형광 강도는 세포 안의 ROS의 양과 비례한다.
HaCaT 세포에 DCF-DA를 적용시킨 후 UVB를 이용하여 ROS를 발현시켜 유색미가 ROS 발현에 대한 영향을 실험한 결과를 도 3에 나타내었다. 선별된 유색미 5종 가운데 에탄올 추출물들은 대부분 농도의존적으로 높은 활성산소종 저해효능을 보였으며 그 중 신농흑찰 에탄올 추출물(SE), 흑설 에탄올 추출물(HE)가 전 농도에서 매우 효과적인 저해효과를 나타내었고, 특히 25 μg/㎖의 농도에서 자외선 조사군(Con)과 비교하여 각각 83.7%, 82.8%의 억제효과를 나타내었다.
<실험예 5> 세포 생존율 측정
세포 생존율 측정은 Mosmann의 방법에 따라 측정하였다. HaCaT cell을 96well plate에 1Х106 cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 0.02 mL 첨가하여 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 3-(4,5-dimetylthiazole-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich Co.) 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 상층액을 제거하고, 형성된 formazan에 각 well당 0.1㎖의 DMSO 용액을 가하여 실온에서 차광하여 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader(PowerWave XS, Biotek, Winooski, VT, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Yellow tetrazolium salt MTT는 담황색 기질로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 reductase에 의해 환원되어 formazan을 생성하는데 죽어있는 세포에서는 형성되지 않고 살아있는 세포의 수가 많을수록 formazan의 생성도 많아지고 세포의 성장을 측정할 수 있다.
선별된 유색미 5종에 대한 사람각질세포인 HaCaT 세포에서의 생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였으며, 그 결과는 도 4(a)에 나타내었다. HaCaT 세포에 대하여 25 μg/㎖의 농도에서 조생흑찰 에탄올 추출물(JE), 신농흑찰 에탄올 추출물(SE), 신토흑미 에탄올 추출물(SRE), 흑진주벼 에탄올 추출물(HRE), 흑설 에탄올 추출물(HE)이 95~100%의 세포생존율을 나타내었고 100 μg/㎖의 농도에서는 조생흑찰 에탄올 추출물(JE), 흑진주벼 에탄올 추출물(HRE), 흑설 에탄올 추출물(HE) 모두 80% 이상의 생존율을 보였다.
그 결과를 바탕으로 선별된 유색미 5종 가운데 에탄올 추출물에 대하여 UVB를 조사(50 mJ/cm2)한 후의 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과는 도 4(b)에서 나타낸 바와 같이, 흑설 에탄올 추출물(HE)이 전 농도에서 92% 이상의 세포 생존율을 보였다. 따라서 단백질 발현 및 mRNA 발현에 관한 실험을 진행하기 위하여 유색미 5종 가운데 흑설 에탄올 추출물(HE)을 선별하였으며, UVB 를 HaCaT cell에 50 mJ/cm2의 자극을 주는 조건으로 진행하였다.
<실험예 6> 단백질의 발현 측정
단백질의 발현을 보기 위하여 HaCaT cell을 96well culture plate에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 UVB(50 mJ/cm2)를 처치하고 일정시간 배양 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척하였다. Cell lysate으로 Bradford assay 방법으로 단백질 정량하여 10 μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE에서 전기 영동하여 분리하여 원하는 부위의 gel을 잘라 3시간 동안 nitrocellulose(NC) membrane에 옮긴 다음 4℃에서 1시간 동안 5% skim milk로 blocking 한 후 primary antibody(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Oregon, USA)를 1:1,000으로 희석하여 4℃에서 overnight 한 다음, 다시 30분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 각각의 HRP-conjugated secondary antibody(Santa Cruz Biotechnology)를 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리하고 3회 washing 한 뒤 ECL 용액을 가한 후 Western imaging system(EZ-Capture MG, ATTO, Tokyo, Japan) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.
진피의 90%를 차지하고 있는 콜라겐은 collagen type I, II, III, IV 그리고 V가 있으며, 세포 내에서 pro-collagen이라는 전구물질로 합성된 후 세포 외로 분비되어 콜라겐 섬유로 중합된다. 이 중 주요 구조 단백질은 collagen type I이 대부분이다. 세포외기질을 분해하는 단백질 분해효소인 MMP group에는 약 20여 종이 있으며, collagenase group(MMP-1, -8, -13), gelatinase group(MMP-2, -9), stromelysin group(MMP-3, -10, -11)이 있다. 그 중 MMP-1은 주로 type I, III형을 분해하는 collagenase이고 MMP-3은 collagen type IV를 특이적으로 분해하고 pro-MMP-1을 활성화시키며, MMP-8과 -13은 관절의 연골분해를 가속화시켜 관절조직의 파괴를 가속화시킨다.
우리는 MMP-1, -3, -8, 그리고 -13의 발현억제와 pro-collagen type I의 생성을 확인하였고, 결과는 다음과 같다(도 5참조). UVB 자극을 준 세포에 흑설 에탄올 추출물(HE)를 농도별로 처치하였을 때 pro-collagen type I은 100 μg/㎖의 농도에서 발현이 증가하였고, MMP-1과 -13은 농도의존적으로 발현이 억제되었으며, 특히 MMP-1의 발현이 자외선을 조사하지 않은 대조군(Non)보다도 억제되었다.
MMP-1은 산화적 스트레스로 인해 콜라겐을 분해하는데 관여하는 주요한 효소이고, 이것은 mitogen activating protein kinase(MAPK) - extracellular signal-regulated kinase(ERK)/p38/JUN-N-terminal kinase(JNK) activation과 매개되어 있다. MAPK pathways는 자외선 조사를 포함하는 세포 외 자극들에 대응하여 활성화되고 MAPK signaling은 MMP 분비를 포함한 다양한 세포 과정에서 중요한 조절 역할을 수행하여 조기 피부노화와 노화된 피부의 특징인 피부 주름을 야기한다고 알려져 있다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, HE가 ERK와 p38의 인산화를 농도의존적으로 억제하고 있음을 확인하였다.
<실험예 7> RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)에 의한 MMPs의 mRNA 발현억제 측정
RNA는 High Pure RNA Isolation Kit(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하여 total RNA를 추출하였으며 1 μg/μL의 농도로 정량하고 추출된 total RNA는 Transcriptor first Stand cDNA synthesis kit(Roche)를 이용하여 역전사를 진행시켜 cDNA를 합성시켰다. 유전자 발현은 Fast start Essential DNA Green Master kit(Roche)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이 분석에서 internal control은 β-actin을 사용하였고 Primer의 sequences는 다음과 같다. Human MMP-1 (forward, 5'-ATT CTA CTG ATA TCG GGG CTT TGA-3' ; reverse, 5'-ATG TCC TTG GGG TAT CCG TGT AG-3'), MMP-3 (forward, 5'-TTG TTC TTT GAT GCA GTC AGC-3' ; reverse, 5'-GAT TTG CGC CAA AAG TGC-3'), MMP-9 (forward, 5'-CCC GGA CCA AGG ATA CAG-3 ' ; reverse, 5'-GGC TTT CTC TCG GTA CTG-3'), β-actin (forward, 5'-CTG GCA CCC AGC ACA ATG AAG-3' ; reverse, 5'-ACC GAC TGC TGT CAC CTT CA-3'). PCR의 증폭 조건은 다음과 같다. 95℃에서 5분간 초기 denaturation 시킨 후 40 cycle을 증폭시켰다. 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension시켰다. RT-PCR 증폭으로 생산된 DNA는 0.5 μg/mL의 ethidium bromide가 포함된 1% metaphor agarose gel에 전기영동하여 cooled CCD camera system EZ-Capture II와 CA analyzer ver. 3.00 software를 이용하여 mRNA의 발현정도를 확인하였다.
선별된 유색미 중 활성산소종을 유의하게 억제시킨 HE에 대한 MMPs의 mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 HaCaT 세포에 다양한 농도를 처치한 후 UVB로 자극한 후 24시간 배양하여 총 RNA를 추출하였고 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 그 결과(도 7참조) MMP-1, -3의 mRNA의 발현은 농도의존적으로 감소시켰으며 MMP-9의 경우 HE 100 μg/mL의 농도를 처치한 경우에 발현을 감소시켰음을 확인하였다.
<통계처리>
실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 22.0(IBM SPSS Inc., New York, USA)를 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 각 처리군 간의 유의성에 대한 검증은 ANOVA를 이용하여 유의성을 확인한 후, p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range tests를 이용하여 분석하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 흑설 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 흑설 추출물은 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 50 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 흑설 추출물은 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)을 억제함으로써 주름 개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 흑설 추출물은 COL1A1(pro-collagen typeⅠ)의 발현을 증가시킴으로써 주름개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 구성된 제형에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 중에서 선택된 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물. - 흑설 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 건강식품 조성물.
- 흑설 추출물을 포함하는 항노화용 화장료 조성물.
- 흑설 추출물을 포함하는 항노화용 건강식품 조성물.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20210156925A (ko) * | 2020-06-18 | 2021-12-28 | 애니젠 주식회사 | 유기산-올리고펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 및 주름 개선용 조성물 |
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