KR20190128746A - 비율계량 형광 화상화 방법 - Google Patents

비율계량 형광 화상화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20190128746A
KR20190128746A KR1020197033078A KR20197033078A KR20190128746A KR 20190128746 A KR20190128746 A KR 20190128746A KR 1020197033078 A KR1020197033078 A KR 1020197033078A KR 20197033078 A KR20197033078 A KR 20197033078A KR 20190128746 A KR20190128746 A KR 20190128746A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
image
fluorescence
fluorescence intensity
cancer
ratio
Prior art date
Application number
KR1020197033078A
Other languages
English (en)
Inventor
알렉 하루투니언
지저스 이 곤잘레즈
Original Assignee
아벨라스 바이오사이언시즈 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아벨라스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 filed Critical 아벨라스 바이오사이언시즈 인코포레이티드
Publication of KR20190128746A publication Critical patent/KR20190128746A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B1/00—Instruments for performing medical examinations of the interior of cavities or tubes of the body by visual or photographical inspection, e.g. endoscopes; Illuminating arrangements therefor
    • A61B1/00002—Operational features of endoscopes
    • A61B1/00004—Operational features of endoscopes characterised by electronic signal processing
    • A61B1/00009—Operational features of endoscopes characterised by electronic signal processing of image signals during a use of endoscope
    • A61B1/000096—Operational features of endoscopes characterised by electronic signal processing of image signals during a use of endoscope using artificial intelligence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C09K11/07—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials having chemically interreactive components, e.g. reactive chemiluminescent compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/10—Segmentation; Edge detection
    • G06T7/136—Segmentation; Edge detection involving thresholding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10064—Fluorescence image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/20—Special algorithmic details
    • G06T2207/20212—Image combination
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Quality & Reliability (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)

Abstract

본원은 비율계량 형광 화상화 시약, 그리고 형광 비율 및 강도 임계값을 이용하여 개선된 정확도로 생물 표본 중의 생물학적 활성 영역을 검출 및 시각화하는 화상 프로세싱 방법을 개시한다.

Description

비율계량 형광 화상화 방법
상호 참조
본 출원은 2017년 4월 7일에 제출된 미국 가출원 제62/483,004호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 본원에서 참조로 포함된다.
본원에서는 a) 생물 표본을 생물학적 활성의 비율계량(ratiometric) 형광 지시약과 접촉시키는 단계; b) 제1 방출 파장에서 생물 표본의 제1 형광 강도 화상을 포착하고, 제2 방출 파장에서 제2 형광 강도 화상을 포착하는 단계; c) 제1 형광 화상과 제2 형광 화상을 조합하여 형광 비율 화상을 생성하는 단계; d) 화상 분석 알고리즘을 이용하여 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합을 프로세싱하는 단계로서, 화상 분석 알고리즘은 i) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합을 이용하여, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합을 생성하는 단계, ii) 단계 (i)에서 2개 이상의 마스크 화상이 생성된 경우, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합에 대해 AND 논리 연산을 수행하는 단계, iii) 생물 표본을 생물학적 활성에 대해 양성 또는 음성인 것으로 분류하며, 여기서 분류는 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합의 값을 초과하는 형광 비율 값 또는 형광 강도 값을 나타내는, 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합 내의 관심 영역의 검출에 기초하는 것인 단계, 및 e) 사용자를 위해 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 또는 제2 형광 강도 화상 내의 관심 영역을 디스플레이하고, 임의로, 컴퓨터 메모리에 분류 결과를 저장하는 단계를 포함하는, 형광 비율 및 강도 임계값을 사용하여 생물 표본 중의 생물학적 활성 영역을 검출하고 시각화하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 생물 표본은 세포 샘플, 생체외 조직 샘플, 또는 생체내 조직 샘플이다. 일부 실시양태에서, 검출 및 시각화하고자 하는 생물학적 활성은 질환과 상관관계가 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 질환은 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 암, 전암(pre-cancer), 염증, 또는 이들의 임의 조합이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 검출 및 시각화하고자 하는 생물학적 활성은 악성 조직 또는 응고(혈액 응고)와 상관관계가 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 단계 (b) 내지 (e)는 소정의 시간 간격으로 2회 이상 반복되어, 시간 경과에 따른 생물학적 활성의 변화를 모니터링하기 위한 일련의 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 및 형광 비율 화상을 제공한다. 일부 실시양태에서, 관심 영역의 디스플레이는 실시간으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 영역의 디스플레이는 외과적 절차를 가이드하기 위해 수술중 환경에서 외과의에 의해 사용된다. 일부 실시양태에서, 제1 형광 강도 화상 및 제2 형광 강도 화상은 내시경을 사용하여 포착되고, 관심 영역의 디스플레이는 내시경의 위치 결정을 가이드하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 비율계량 형광 지시약은 절단가능한 링커에 의해 분리되어 있는 형광 공여체 모이어티 및 형광 수용체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광 공여체 모이어티 및 형광 수용체 모이어티는 각각 Cy5 및 Cy7이다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 또는 시스테인 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 비율계량 형광 지시약은 하기 화학식 (I)의 분자를 포함한다:
[DA-cA]-A-[cM-M]-X-B-[cB-DB] 화학식 (I)
상기 식에서, X는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이고, A는 5 내지 20 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고, B는 5 내지 20 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 0-1 개의 아미노산을 포함하고, M은 거대분자이고, DA 및 DB는 서로 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 수용체 및 공여체 형광성 모이어티이고; 여기서, [cM-M]은 A 또는 X 상의 임의의 위치에 결합되고, [DA-cA]는 A의 임의의 아미노산 잔기에 결합되고, [cB-DB]는 B의 임의의 아미노산 잔기에 결합된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 분자는 SDM-25이다. 일부 실시양태에서, 마스크 파일의 생성에 오직 형광 비율 임계값만이 이용된다.
본원에서는 또한 a) 복수의 생물 표본을 제공하는 단계; b) 각각의 생물 표본을 생물학적 활성의 비율계량 형광 지시약과 접촉시키는 단계; c) 각각의 생물 표본에 대하여, 제1 방출 파장에서 제1 형광 강도 화상을 포착하고, 제2 방출 파장에서 제2 형광 강도 화상을 포착하는 단계; d) 각각의 생물 표본에 대하여, 제1 형광 화상과 제2 형광 화상을 조합하여 형광 비율 화상을 생성하는 단계; e) 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 형광 비율 임계값, 또는 이들의 임의 조합에 대한 출발 값을 제공하는 단계; 및 f) 각각의 생물 표본에 대하여, i) 화상 분석 알고리즘을 이용하여 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합을 프로세싱하고, 여기서 화상 분석 알고리즘은 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합을 이용하여, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합을 생성하고, 이전 단계에서 2개 이상의 마스크 화상이 생성된 경우, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합에 대해 AND 논리 연산을 수행하고, 임의로, 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합 내의 검출된 관심 영역이 명시된 최소 크기보다 큰지 체크하고, 여기서 검출된 관심 영역은 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합의 값을 초과하는 형광 비율 또는 형광 강도 값을 보이는 영역이고, 관심 영역이 검출된 경우, 생물 표본을 생물학적 활성에 대하여 양성인 것으로 분류하거나, 또는 관심 영역이 검출되지 않은 경우, 생물 표본을 생물학적 활성에 대하여 음성인 것으로 분류하고; ii) 화상 분석 알고리즘에 의해 제공된 분류를 생물 표본에 대한 병리학적 검사 시험 결과와 비교하여 분류가 진양성, 위음성, 진음성, 또는 위양성인지의 여부를 결정하고; iii) 컴퓨터 메모리에 진양성, 위음성, 진음성, 또는 위양성 분류 결과를 저장하는 단계; 및 g) i) 화상 프로세싱 알고리즘에 의해 모든 생물 표본이 음성인 것으로 분류될 때까지, 제2 형광 강도 임계값 및 형광 비율 임계값을 고정 상태로 유지시키면서, 제1 형광 강도 임계값의 증분식으로 증가된 값을 이용하거나, 또는 ii) 화상 프로세싱 알고리즘에 의해 모든 생물 표본이 음성인 것으로 분류될 때까지, 제1 형광 강도 임계값 및 형광 비율 임계값을 고정 상태로 유지시키면서, 제2 형광 강도 임계값의 증분식으로 증가된 값을 이용하거나, 또는 iii) 화상 프로세싱 알고리즘에 의해 모든 생물 표본이 음성인 것으로 분류될 때까지, 제1 형광 강도 임계값 및 제2 형광 강도 임계값을 고정 상태로 유지시키면서, 형광 비율 임계값의 증분식으로 증가된 값을 이용하여 단계 (f)를 반복하는 단계; h) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 및 제2 형광 강도 임계값의 값들의 각 세트에 대한 저장된 분류 결과를 이용하여 수신자 작동 특성(ROC: receiver operator characteristic) 곡선을 계산하는 단계; 및 i) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 및 제2 형광 강도 임계값의 값들의 각 세트에 대한 ROC 곡선하 면적을 비교하여 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합에 대한 최적 설정을 결정하는 단계를 포함하는, 생물 표본의 비율계량 형광 화상에서 생물학적 활성 영역을 검출하는 데 사용되는 형광 비율 및 형광 강도 임계값의 자동화된 최적화 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 생물 표본은 세포 샘플, 생체외 조직 샘플, 또는 생체내 조직 샘플이다. 일부 실시양태에서, 검출하고자 하는 생물학적 활성은 질환과 상관관계가 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 질환은 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 암, 전암, 염증, 또는 이들의 임의 조합이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 검출 및 시각화하고자 하는 생물학적 활성은 악성 조직 또는 응고(혈액 응고)와 상관관계가 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 비율계량 형광 지시약은 절단가능한 링커에 의해 분리되어 있는 형광 공여체 모이어티 및 형광 수용체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광 공여체 모이어티 및 형광 수용체 모이어티는 각각 Cy5 및 Cy7이다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 또는 시스테인 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 비율계량 형광 지시약은 Cy5 및 Cy7로 표지된 SDM-25이다.
본원에서는 a) 생물 표본을 생물학적 활성의 비율계량 형광 지시약과 접촉시키는 단계; b) 생물 표본에 제1 여기 파장의 여기광을 조사하는 단계; c) 제1 방출 파장에서 생물 표본의 제1 형광 강도 화상을 포착하는 단계; d) 후속적으로 또는 동시에, 제2 방출 파장에서 생물 표본의 제2 형광 강도 화상을 포착하는 단계; 및 e) 제1 형광 강도 화상과 제2 형광 강도 화상을 조합하여 형광 비율 화상을 생성하기 위해 화상 프로세싱 소프트웨어를 제공하는 단계로서, 여기서 화상 프로세싱 알고리즘은 생물 표본의 형광 비율 화상 내의 생물학적 활성을 보이는 관심 영역을 검출하거나 디스플레이하는 데 이용되고, 여기서 관심 영역은 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 형광 비율 임계값, 또는 이들의 임의 조합의 값을 초과하는 형광 비율 값, 제1 형광 강도 값, 제2 형광 강도 값, 또는 이들의 임의 조합을 보이는 비 화상의 영역을 포함하는 것인, 생물 표본 중의 생물학적 활성 영역을 검출하기 위한 비율계량 형광 화상화 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 시험관내 생물 표본의 제1 및 제2 형광 강도 화상이 포착된다. 일부 실시양태에서, 생체내 생물 표본의 제1 및 제2 형광 강도 화상이 포착된다. 일부 실시양태에서, 생물 표본은 세포 샘플, 생체외 조직 샘플, 또는 생체내 조직 샘플이다. 일부 실시양태에서, 비율계량 형광 지시약은 하기 화학식 (I)의 분자이다:
[DA-cA]-A-[cM-M]-X-B-[cB-DB] 화학식 (I)
상기 식에서, X는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이고, A는 5 내지 20 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고, B는 5 내지 20 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 0-1 개의 아미노산을 포함하고, M은 거대분자이고, DA 및 DB는 서로 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 수용체 및 공여체 형광성 모이어티이고; 여기서, [cM-M]은 A 또는 X 상의 임의의 위치에 결합되고, [DA-cA]는 A의 임의의 아미노산 잔기에 결합되고, [cB-DB]는 B의 임의의 아미노산 잔기에 결합된다.
일부 실시양태에서, A는 5 내지 9 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, A는 5 또는 9 개의 연속 글루타메이트 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, B는 7 내지 9 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, B는 8 또는 9 개의 연속 아르기닌 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, A는 5 또는 9 개의 연속 글루타메이트 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고, B는 8 또는 9 개의 연속 아르기닌 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, A는 개의 연속 글루타메이트 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고, B는 8 개의 연속 아르기닌 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 자연적으로 발생된 아미노산 또는 비자연적으로 발생된 아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 D 아미노산, L 아미노산, α-아미노산, β-아미노산, 또는 γ-아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 유리 티올 기를 갖는 임의의 아미노산, N 말단 아민 기를 갖는 임의의 아미노산, 및 하이드록실아민 또는 하이드라진 기와의 반응시 옥심 또는 하이드라존 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 임의의 아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 D-시스테인, D-글루타메이트, 리신, 및 파라-4-아세틸 L-페닐알라닌으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, cB는 유리 티올 기를 갖는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, cB는 D-시스테인이다. 일부 실시양태에서, cA는 N 말단 아민 기를 갖는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, cA는 D-글루타메이트이다. 일부 실시양태에서, cA는 리신이다. 일부 실시양태에서, cM은 하이드록실아민 또는 하이드라진 기와의 반응시 옥심 또는 하이드라존 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, cM은 파라-4-아세틸 L-페닐알라닌이다. 일부 실시양태에서, X는 펩티드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 PLGLAG, PLG-C(me)-AG, RPLALWRS, ESPAYYTA, DPRSFL, PPRSFL, RLQLKL, 및 RLQLK(Ac)L로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 메탈로프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 메탈로프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테이나제, ADAM 메탈로프로테이나제, 아다말리신, 파파라신, 매트릴리신, 네프리리신(중성 엔도펩티다제), 안지오텐신 전환 효소, 메탈로카복시펩티다제, 또는 글루타메이트 카복시펩티다제이다. 일부 실시양태에서, X는 MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, MMP13, 또는 MMP14에 의해 절단가능한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 세린 또는 트레오닌 프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 엘라스타제, 응고 인자(트롬빈, 인자 VIIa, 인자 IXa, 또는 인자 Xa), 조직 타입 플라스미노겐 활성인자, 우로키나제 타입 플라스미노겐 활성인자, 플라스민, 테스티신, 코린, 조직 또는 혈장 칼리크레인, 트립타제, 또는 디펩티딜 펩티다제이다. 일부 실시양태에서, X는 시스테인 프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 시스테인 프로테아제는 카텝신 B, 카텝신 K, 카텝신 S, 카텝신 L, 카스파제, 또는 레구메인이다. 일부 실시양태에서, DA 및 DB는 하나에서 나머지 다른 하나로의 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 형광 수용체 및 공여체 모이어티이다. 일부 실시양태에서, DA 및 DB는 Cy5 및 Cy7이다. 일부 실시양태에서, 제1 여기 파장은 약 610 nm 내지 약 650 nm이다. 일부 실시양태에서, 제1 방출 파장은 약 660 nm 내지 약 720 nm이다. 일부 실시양태에서, 제2 방출 파장은 약 760 nm 내지 약 830 nm이다. 일부 실시양태에서, DA 및 DB는 Cy5 및 IR Dye750이다. 일부 실시양태에서, DA 및 DB는 Cy5 및 IR Dye800이다. 일부 실시양태에서, DA 및 DB는 Cy5 및 ICG이다. 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e)는 소정의 시간 간격으로 2회 이상 반복되어, 시간 경과에 따른 생물학적 활성의 변화를 모니터링하기 위한 일련의 형광 비율 화상을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 형광 강도 화상은 형광 비율 화상의 생성 이전에 화상 노출 시간에 의해 정규화된다. 일부 실시양태에서, 화상 프로세싱 알고리즘은 관심 영역을 검출하기 위해 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화상 프로세싱 알고리즘은 (i) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합을 이용하여, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합을 생성하는 단계, (ii) 단계 (i)에서 2개 이상의 마스크 화상이 생성된 경우, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합에 대해 AND 논리 연산을 수행하는 단계, (iii) 관심 영역이 검출된 경우, 생물 표본을 생물학적 활성에 대하여 양성인 것으로 분류하거나, 또는 관심 영역이 검출되지 않은 경우, 생물 표본을 생물학적 활성에 대하여 음성인 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 영역 내의 평균 형광 비율 또는 평균 형광 강도 값은 관심 영역 중의 생물학적 활성의 정성적 척도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 관심 영역 내의 평균 형광 비율 또는 평균 형광 강도 값은 관심 영역 중의 생물학적 활성의 정량적 척도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 검출된 관심 영역은 암성 생물학적 활성과 상관관계가 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 형광 비율 화상은 암성 조직 대 정상 조직 사이에 적어도 1.5:1의 조영비를 제공한다. 일부 실시양태에서, 화상 프로세싱 알고리즘은 검출된 관심 영역이 명시된 최소 크기보다 큰지 체크하는 것을 추가로 포함한다.
본원에서는 a) 생물 표본을 비율계량 형광 지시약과 접촉시키는 단계; b) 생물 표본에 제1 여기 파장의 여기광을 조사하는 단계; c) 제1 방출 파장에서 생물 표본의 제1 형광 강도 화상을 포착하는 단계; d) 후속적으로 또는 동시에, 제2 방출 파장에서 생물 표본의 제2 형광 강도 화상을 포착하는 단계; 및 e) 제1 형광 강도 화상과 제2 형광 강도 화상을 조합하여 생물 표본의 형광 비율 화상을 생성하기 위한 화상화 소프트웨어를 제공하는 단계로서, 화상 프로세싱 알고리즘은 암성 생물학적 활성과 상관관계가 있는 생물 표본의 형광 비율 화상 내의 관심 영역을 검출하거나 디스플레이하는 데 이용되는 것인 단계를 포함하는, 암에 대하여 비율계량 형광 화상화 기반 진단 시험을 수행하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 제1 형광 강도 화상 및 제2 형광 화상은 형광 비율 화상의 생성 이전에 화상 노출 시간에 의해 정규화된다. 일부 실시양태에서, 화상 프로세싱 알고리즘은 암성 생물학적 활성과 상관관계가 있는 관심 영역을 검출하기 위해 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화상 프로세싱 알고리즘은 (i) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합을 이용하여, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합을 생성하는 단계, (ii) 단계 (i)에서 2개 이상의 마스크 화상이 생성된 경우, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합에 대해 AND 논리 연산을 수행하는 단계, (iii) 임의로, 검출된 관심 영역이 명시된 최소 크기보다 큰지 체크하는 단계, 및 (iv) 관심 영역이 검출된 경우, 생물 표본을 암성 활성에 대하여 양성인 것으로 분류하거나, 또는 관심 영역이 검출되지 않은 경우, 생물 표본을 암성 활성에 대하여 음성인 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비율계량 형광 지시약은 하기 화학식 (I)의 분자이다:
[DA-cA]-A-[cM-M]-X-B-[cB-DB] 화학식 (I)
상기 식에서, X는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이고, A는 5 내지 20 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고,
B는 5 내지 20 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 0-1 개의 아미노산을 포함하고, M은 거대분자이고, DA 및 DB는 서로 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 수용체 및 공여체 형광성 모이어티이고; 여기서, [cM-M]은 A 또는 X 상의 임의의 위치에 결합되고, [DA-cA]는 A의 임의의 아미노산 잔기에 결합되고, [cB-DB]는 B의 임의의 아미노산 잔기에 결합된다. 일부 실시양태에서, 비율계량 형광 지시약은 Cy5 및 Cy7로 표지된 SDM-25이다. 일부 실시양태에서, 암성 생물학적 활성은 흑색종, 비흑색종 피부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 림프절암, 갑상선암, 신경교종암, 위장관암, 또는 육종과 연관된 것이다. 일부 실시양태에서, 환자는 비율계량 형광 지시약을 주입받고, 본 방법은 절제후 외과적 표본에서 유방암을 검출하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 암 진단에 대한 임상적 감도는 80% 초과이다. 일부 실시양태에서, 암 진단에 대한 임상적 특이도는 80% 초과이다. 일부 실시양태에서, 환자는 비율계량 형광 지시약을 주입받고, 본 방법은 외과적 절차를 가이드하기 위해 수술중에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 진단 또는 치료 결정을 하기 위해 의사 또는 의료 제공자에 의해 이용되는 시험 결과를 제공한다. 일부 실시양태에서, 시험 결과는 본 방법이 수행된 위치로부터 의사 또는 의료 제공자의 위치로 전달된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 상세하게 기술되어 있다. 본 발명의 원리가 이용되는, 예시적인 실시양태를 기술하는 하기의 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점을 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다:
도 1은 Cy5 형광 공여체 및 Cy7 형광 소광제를 포함하는 선택적 전달 분자 (SDM: selective delivery molecule)(또는 활성화가능한 세포 투과 펩티드(ACPP: activatable cell-penetrating peptide))의 한 실시양태의 구조를 도시한 것이다. 도 1에 제시된 구조는 SDM-25 분자이다.
도 2a-도 2b는 Cy7 모이어티에 접합되고, Cy5 모이어티에 접합된 다가양이온성 도메인에 절단가능한 링커를 통해서 연결된 다가음이온성 도메인을 포함하는 비율계량 ACPP(RACPP: ratiometric ACPP)인 SDM-25에 대한 흡광도 및 형광 방출 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 2a: 500-800 nm로부터의 80%/20% PBS/아세토니트릴 중 17.5 ㎍/mL SDM-25(AVB-620)의 흡광도 스펙트럼. 도 2b: 630 nm 여기 파장 및 620-850 nm 범위의 방출 파장을 이용한 TCNB 완충제 중에서의 SDM-25 형광 방출 스펙트럼. MMP9와 함께 사전 인큐베이션된 샘플, 및 그렇지 않은 샘플인 2가지 샘플을 제조하였다. (6회의 실험으로부터) 대표 스펙트럼이 제시되어 있다. MMP9 프로테아제 처리 전(적색) 및 처리 후(청색), 둘 모두에서 630 nm 여기광을 사용하여 큐벳 분광형광계에서 형광 방출 스펙트럼을 측정하였다. 절단 후, Cy5는 Cy7에 의해 소광되고, 이는 780 nm에서 흡수된 여기광을 재방출한다. 절단 후, Cy7은 더 이상 Cy5를 소광시키지 않고, 그 결과, 670 nm Cy5 방출 피크는 증가되고, 780 nm에서의 Cy7 재방출은 감소된다. 710 nm부터 840 nm까지의 잔류 숄더는 대개 Cy5 방출에 기인하는 것이다.
도 3a-도 3c는 인간 유방암 종양 조직 및 정상 조직에서 SDM-25(AVB-620)에 대하여 관찰된 상이한 절단율, 및 인간 유방암 조직의 비율계량 형광 화상화 기반 검출에서 SDM-25의 사용에 대한 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 도시한 데이터의 예를 제공하는 것이다. 도 3a: 25 개의 쌍별 인간 유방암 환자 조직 균질물에서의 SDM-25 절단율(분당 절단된 것의 nM). 암 양성 종양 조직(적색 다이아몬드 표시) 및 암 음성 인접한 조직(청색 삼각형 표시)이 제시되어 있다. 쌍별 샘플이 선으로 연결되어 있다. 쌍별 t 검정 결과, 종양과 정상 사이에는 P < 0.0001로 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다. 도 3b: 평균 ± 95% 신뢰 수준하의 동일한 데이터의 산점도. 도 3c: 본 도면은 정상 조직 대비 종양 조직의 SDM-25 절단율 검출에 대한 ROC 곡선을 보여주는 것이다.
도 4a-도 4b는 비악성 유방 조직 및 종양 균질물에서의 MMP 활성의 정량화를 위한 SDM-25의 사용을 도시한 데이터의 예를 제공하는 것이다. 도 4a: 그의 데이터가 도 3a-도 3c에 제시되어 있는 25명의 환자로부터 선택된 3 개의 대표적인 인간 유방암 샘플 및 쌍별 정상 조직으로부터의 균질물을 10% 젤라틴 지모그람에서 분석하였다. 재조합 활성 MMP2 및 MMP9는 표준으로서 제시되었다(레인당 2 ng). 도 4b: 도 4a에 제시된 3 개의 쌍을 포함하는, 5 개의 대표적인 인간 유방암 샘플((1)로 표지) 및 쌍별 정상 조직((2)로 표지)에서의 6 개의 MMP의 ELISA 정량화. 오차 막대는 표준 편차이다. ND = 검출불가.
도 5는 2 개의 상이한 카메라에서 2 개의 상이한 파장에서 형광 방출을 화상화하는 화상 스플리터를 이용하는 비율계량 형광 화상화 시스템의 한 비제한적인 예를 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 하드웨어(예컨대, 화상 획득 하드웨어, 프로세서, 및 컴퓨터 메모리) 및 소프트웨어 컴포넌트(예컨대, 오퍼레이팅 시스템, 및 화상 획득, 화상 프로세싱, 및 화상 디스플레이 소프트웨어 모듈)를 포함하는 비율계량 화상화 시스템의 개략도를 제공하는 것이다.
도 7은 형광 비율 화상 내에서 높은 형광 비율 및/또는 형광 강도 값을 보이는 관심 영역(ROI: regions of interest)을 확인하는 데 사용되는 화상 프로세싱 알고리즘을 도시한 것이다.
도 8a-도 8b는 (AVB-620으로도 또한 지칭되는) SDM-25가 주입된, 인간 용량 증량 연구로부터의 생물 표본의 화상에 대한 형광 강도 데이터의 예를 보여주는 것이다.
도 9는 SDM-25를 이용한 비율계량 형광 화상화가 유방암 환자에서 악성(양성) 조직과 비악성(음성) 조직을 구별할 수 있다는 것을 시사하는 데이터의 예를 보여주는 것이다. 원발성 종양 및 림프절로부터의 데이터가 제시되어 있다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 비율계량 형광 지시약, 예컨대, SDM-25가 주입된 생물 표본에서 관심 영역(ROI)을 확인하고, 생물학적 활성(예컨대, 증진된 효소 활성)을 예측하는 데 사용된 화상 프로세싱 알고리즘을 도시한 것이다. 양 또는 음의 점수 예측은 형광 강도 비 임계값(예컨대, Cy5/Cy7 형광 강도 비 임계값) 및/또는 형광 강도 임계값(예컨대, Cy5 형광 강도 임계값)의 주어진 조합에 대해 생성된다.
도 11은 비율계량 형광 지시약, 예컨대, SDM-25가 주입된 생물 표본에서 생물학적 활성(예컨대, 증진된 효소 활성)의 양성 또는 음성 예측을 결정하는 데 사용된 화상 프로세싱 알고리즘을 도시한 것이다. 양성 또는 음성 활성의 결정은 형광 비율 임계값(예컨대, Cy5/Cy7 형광 비율 임계값) and/또는 형광 강도 임계값(예컨대, Cy5 형광 강도 임계값)의 주어진 조합에 대해 생성된다.
도 12는 비율계량 형광 지시약, 예컨대, SDM-25가 주입된 생물 표본에서 생물학적 활성(예컨대, 증진된 효소 활성)의 존재를 측정하는 데 있어 형광 비율 및/또는 강도 임계값의 가장 정확한 조합을 확인하는 데 사용된 화상 프로세싱 알고리즘의 한 비제한적인 예를 도시한 것이다. 본 예에서, 한 생물 표본에 대한 병리학적 검사 데이터(또는 생물학적 활성의 다른 독립 측정값)와의 화상화 데이터의 비교에 기초하여 가장 정확한 임계값을 생성하기 위해, 한 임계값(즉, 형광 비율 임계값 또는 형광 강도 임계값)은 가변적인 반면, 나머지 다른 하나는 고정된다. 상이한 형광 비율 및/또는 강도 임계값에서의 화상 분석으로부터의 예측을 예를 들어, 병리학적 검사 결과와 비교함으로써 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 작성한다.
도 13a-도 13c는 형광 비율 임계값 및 형광 강도 임계값의 상이한 조합을 사용하여 작성된, SDM-25를 주입받은 인간 환자로부터의 원발성 종양 표본에 대한 ROC 곡선의 예를 제공하는 것이다.
도 14a-도 14b는 형광 비율 임계값 및 형광 강도 임계값의 상이한 조합을 사용하여 작성된, SDM-25를 주입받은 인간 환자로부터의 림프절 표본에 대한 ROC 곡선의 예를 제공하는 것이다.
도 15a-도 15c는 형광 비율 임계값 및 형광 강도 임계값의 상이한 조합을 사용하여 작성된, SDM-25를 주입받은 개별 환자 표본에 대한 ROC 곡선의 예를 제공하는 것이다.
도 16은 8 mg 용량의 SDM-25를 투여받은 환자로부터의 절개된 원발성 종양 표본 화상의 예로서, 여기서 화상화는 주입 이후의 날에 수행된 것인 예를 제공하는 것이다. 흰색은 Cy5/Cy7 형광 비율 임계값 R ≥ 120이고, Cy5 강도 임계값 I ≥ 50임을 나타낸다. 기술된 방법을 사용하여 임계값의 값들을 측정하였다.
도 17a-도 17d는 전이성 림프절 모델 및 생체내 진단 화상화 프로토콜의 개략도를 제공하는 것이다. 유방암 세포를 마우스 귀에 이식하고, 이는 경부 림프절로 전이된다(도 17a). 림프절 상태를 평가하기 위해, SDM-25(AVB-620)를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하고, 3 - 6시간 경과 후, 경부 부위를 외과 수술에 의해 노출시키고(도 17b), 림프절을 화상화한다. 형광 비율 화상을 수득하고, RGB 스케일을 이용하여 백색광 화상 상에 중첩시켜 디스플레이하고, 여기서 높은 형광 비율은 적색이고, 낮은 비는 청색이며 - 상기 예는 (도 17c)에 제시되어 있다. 이어서, 림프절을 외과 수술에 의해 제거하고, H&E 조직병리적 분석을 위해 프로세싱한다(도 17d). 적색은 비가 높은 것인 RGB 스케일을 이용하여 병리학적 결과를 화상 비 값과 직접 비교한다. 적색 화살표 표시는 SDM-25(AVB-620)에 의해 형광 표지된 전이성(암 양성) 경부 림프절을 나타낸다. 조직병리에 의해 측정된 바, 시안색 화살표 표시는 암 음성 경부 림프절을 나타낸다.
도 18a-도 18d는 뮤린 4T1 유방 전이성 림프절 모델을 이용한 형광 비율 화상화 및 조직병리의 비교를 보여주는 것이다. 도 18a: 마우스 귀의 원발성 종양에서 높은 형광 비율을 보이는, 형광 비율 화상이 중첩된 (우측) 및 중첩되지 않은 (좌측), 대표적인 검은색 및 백색 등 마우스 화상. 도 18b: H&E 조직병리로부터 측정된, 암 상태에 의해 군별로 분류된, 경부 림프절에 대한 SDM-25(AVB-620) 생성 형광 비율 값. 암 양성(적색 다이아몬드 표시) 및 암 음성(청색 삼각형 표시) 림프절이 제시되어 있다. 검은색 선은 평균 ± 95% 신뢰 수준을 나타낸다. 도 18c: SDM-25(AVB-620) 투여 후 6시간째에 촬영된, 반사광과 블렌딩된, 노출된 림프절의 대표적인 형광 비율 화상. 높은 비는 적색으로 표시되어 있고, 낮은 비는 청색으로 표시된 RGB 스케일을 이용하여 비가 디스플레이되어 있다. H&E 염색에 의해 측정된 바, 적색 및 시안색 화살표 표시는 각각 암 양성 및 음성 림프절을 나타낸다. 도 18d: SDM-25(AVB-620) 생체내 진단 형광 신호 발생에 대한 동적 성질이 제시되어 있다. 투여 후 1시간 내지 48시간 범위인 시점에 시점에 화상화를 수행하였다. 암 양성(적색 다이아몬드 표시) 및 암 음성(청색 삼각형 표시) 림프절이 제시되어 있다. 데이터 지점당 측정 횟수(N)는 3 내지 24회 범위였고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 19a는 8 mg 용량의 SDM-25를 투여받은 환자로부터의 원발성 종괴 절제술 표본 화상의 표면 변연부(margin)의 제1 예로서, 여기서 화상화는 주입 이후의 날에 수행된 것인 예를 제공하는 것이다.
도 19b는 8 mg 용량의 SDM-25를 투여받은 환자로부터의 원발성 종괴 절제술 표본 화상의 표면 변연부의 제2 예로서, 여기서 화상화는 주입 이후의 날에 수행된 것인 예를 제공하는 것이다.
비율계량 형광 검출 및 단일 강도 형광 검출은 시험관내 및 생체내 화상화 적용에서 사용하기 위한 방법이다. 일부 경우에서, 단일 파장에서의 형광 방출 측정은 상이한 형태, 두께, 세포 조성, 및 세포외 기질을 갖는 상이한 조직에 기인하여 교란된다. 비율계량 형광 검출은 2 개의 상이한 파장에서 특이적인 생물학적 활성에 대한 반응으로 비율계량 변화를 일으키는 형광성 작용제 또는 디케이터의 조합을 이용한다. 일부 경우에서, 이러한 방법은 예를 들어, 형광단 농도차, 대상 운동, 및 상이한 형광 검출기 및 장치에서의 여기광 강도 및/또는 형광 방출 수집 및 검출 효율에서의 가변성을 비롯한 다양한 실험 인자에 기인하여 아티팩트를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
본원에서는 특정 실시양태에서, 생체내 및 생체외에서 생물 표본 중의 생물학적 활성을 검출하고, 시각화하는 비율계량 형광 화상화 방법을 개시한다. 일부 경우에서, 본원에 기술된 비율계량 형광 화상화 방법은 당업계에 기술된 화상화 방법에 비해 개선된 정확도를 갖는다. 일부 경우에서, 정확도 개선은 관심의 대상이 되는 생물학적 활성을 보이는 생물 표본 부위와, 그러한 활성을 보이지 않는 부위를 더욱 잘 구별할 수 있는 특이적인 비율계량 형광 지시약의 사용을 통해 달성된다. 예를 들어, 하기 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, 일부 경우에서, 생물학적 활성(예컨대, 증진된 프로테아제 활성) 부위를 검출하고, 시각화하는 데 있어 그의 정확도 개선은 형광 공여체 및 형광 수용체 모이어티를 포함하는 비율계량 활성화가능한 세포 투과 펩티드(RACPP)의 사용을 통해 달성된다. 하기 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, 형광 수용체 모이어티의 한 비제한적인 예로는 (AVB-620으로도 또한 지칭되는) SDM-25가 있다.
일부 경우에서, 생물학적 활성 부위를 검출하고, 시각화하는 데 있어 그의 정확도 개선은 화상화된 생물 표본 내의, 관심의 대상이 되는 특이적인 생물학적 활성 또는 구조를 보이는 부위에 상응하는 형광 비율 화상 및 관심 영역(ROI)을 생성하고, 디스플레이하는, 본원에 개시된 화상 프로세싱 알고리즘의 사용을 통해 달성된다. 일부 예에서, ROI는 형광 비율 화상로부터 생성된다. 일부 예에서, ROI는 형광 비율 화상 및/또는 형광 강도 화상의 조합으로부터 생성된다.
일부 경우에서, 생물학적 활성 부위를 검출하고, 시각화하는 데 있어 그의 정확도 개선은 더욱 잘 구별할 수 있는 특이적인 비율계량 형광 지시약, 및 형광 비율 화상 및 ROI를 생성하고, 디스플레이하는 개시된 화상 프로세싱 알고리즘, 이 둘 모두의 사용을 통해 달성된다.
개시된 비율계량 화상화 기술을 사용하여 검출되고, 시각화되는 생물학적 활성의 예로는 이온 농도 변화(예컨대, Ca2 + 이온 축적 또는 방출, 또는 국부 pH 변화), 흥분성 세포의 막전위 변화, 증진된 프로테아제 활성 부위, 또는 이들의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 검출 및 시각화하고자 하는 생물학적 활성은 각종 질환 상태, 예컨대, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 암, 유방암, 전암, 악성 조직, 응고(혈액 응고), 염증, 또는 이들의 임의 조합과 상관관계가 있다.
일부 예에서, 개시된 화상화 및 화상 프로세싱 방법은 실시간으로 ROI를 시각화하는 데 사용된다. 일부 예에서, 본 방법은 수술 동안 사용된다. 일부 예에서, 본 방법은 조직의 외과적 절제를 가이드하는 데 사용된다. 일부 예에서, 절제되는 조직은 암성 조직이다. 일부 예에서, 본 방법은 내시경 수술 동안 사용된다. 일부 예에서, 본 방법은 내시경의 위치 결정을 가이드하는 데, 또는 최소 침습 외과적 절차에서 조직의 외과적 절제를 가이드하는 데 사용된다. 일부 예에서, 본 방법은 생체외에서 ROI를 시각화하는 데 사용된다. 상기에서 언급된 바와 같이, 일부 예에서, 본 방법은 형광 공여체 및 형광 수용체(즉, 비율계량 ACPP)를 포함하는 활성화가능한 세포 투과 펩티드(ACPP)와 함께 사용된다. 일부 예에서, 본 방법은 SDM-25와 함께 사용된다. 일부 예에서, 본 방법은 유방암 환자에서, 또는 상기 환자로부터의 절제된 조직과 함께 사용된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"("a", "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 본원에서 "또는"이라고 언급하는 것은 달리 언급되지 않는 한, "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, "생물 표본"이라는 용어는 배양된 세포 샘플, 1차 세포 샘플(예컨대, 세포외 기질이 개별 세포로 유리되어 현탁액으로 분해 또는 용해된 조직 샘플), 혈액 샘플 또는 그의 분획, 생체외 조직 샘플(예컨대, 생검 샘플 또는 절제된 외과적 샘플), 생체내 조직 샘플(예컨대, 외과적 절차 동안 노출된 종양 조직 또는 변연부 조직) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생물 표본은 다양한 유기체, 예컨대, 원핵생물, 진핵생물, 진균, 식물, 동물, 또는 인간 중 임의의 것으로부터 수집될 수 있다. 일부 경우에서, 생물 표본은 환자 샘플이다.
본원에서 사용되는 바, "생물학적 활성"이라는 용어는 이온 농도 또는 수송 활성 변화(예컨대, Ca2 + 이온 축적 또는 방출, 또는 국부 pH 변화), 흥분성 세포의 막전위 변화, 증진된 프로테아제 활성 부위, 비율계량 형광 지시약을 사용하여 모니터링될 수 있는 다른 생화학적 또는 생리적 프로세스의 변화, 또는 이들의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "비율계량 형광 지시약"(또는 "비율계량 형광 프로브") 및 "비율계량 형광 화상화"라는 용어는 광범위하게 사용되며, 종래 비율계량 지시약(예컨대, 형광 공명 에너지 전달(FRET: fluorescence resonance energy transfer) 기반 프로브) 및 연관된 화상화 기술의 사용 뿐만 아니라, 예를 들어, 둘 이상의 형광단(예컨대, FRET 쌍형성이 불가능한 형광단)의 조합이 사용되는 경우로서, 여기서 한 형광단은 내부 대조군으로서 작용하고, 적어도 하나의 나머지 다른 형광단은 관심의 대상이 되는 생물학적 활성의 지표로서 작용하는 것인 경우를 포함한다. 일부 경우에서, 비율계량 형광 지시약은 예컨대, 생체내 화상화 적용에서 사용하기 위한 화상화제이다.
본원에서 사용되는 바, "여기 파장"이라는 용어는 형광 지시약(예컨대, 형광단 또는 염료 분자)을 여기시키고, 형광을 생성하는 데 사용되는 광의 파장을 지칭한다. 여기 파장이 전형적으로는 예컨대, 620 nm와 같이, 단일 파장으로서 언급되지만, 본 명세서에서는 언급된 파장이 중심이 되는 파장 범위 또는 여기 필터 대역을 지칭한다는 것을 당업자라면 이해할 것이다. 일부 경우에서, 언급된 여기 파장의 광은 언급된 파장 ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm 또는 그 초과의 광을 포함한다. 일부 경우에서, 사용된 여기 파장은 형광 지시약의 흡수 피크 최대치와 일치하거나, 또는 일치하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "방출 파장"이라는 용어는 적절한 파장의 광에 의해 여기되었을 때, 형광 지시약(예컨대, 형광단 또는 염료 분자)에 의해 방출된 광의 파장을 지칭한다. 방출 파장이 전형적으로는 예컨대, 670 nm와 같이, 단일 파장으로서 언급되지만, 본 명세서에서는 언급된 파장이 중심이 되는 파장 범위 또는 방출 필터 대역을 지칭한다는 것을 당업자라면 이해할 것이다. 일부 경우에서, 언급된 방출 파장의 광은 언급된 파장 ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm 또는 그 초과의 광을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "실시간"이라는 용어는 예를 들어, 정보가 외과적 절차 동안 외과의에 의해 이환된 조직 절제를 가이드하는 데 사용될 수 있도록 형광 화상 데이터가 획득, 프로세싱 및/또는 디스플레이되는 속도를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 일반적으로, "실시간"이라는 용어는 적어도 0.5 Hz, 적어도 1 Hz, 적어도 5 Hz, 적어도 10 Hz, 적어도 20 Hz, 적어도 30 Hz, 적어도 40 Hz, 적어도 50 Hz, 적어도 60 Hz, 적어도 70 Hz, 적어도 80 Hz, 적어도 90 Hz, 또는 적어도 100 Hz인 화상 획득, 프로세싱, 및/또는 디스플레이 업데이트 속도를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 일반적으로, "수술"이라는 용어는 물리적 개입에 의해 조직을 연구, 조작, 변경, 또는 효과를 일으키는 데 사용되는 임의의 방법을 지칭한다. 상기 방법으로는 개복 수술, 내시경 수술, 복강경 수술, 최소 침습 수술, 로봇 수술, 및 예컨대, 종양 절제, 암 조직 제거, 암 병기 분류, 암 진단, 림프절 병기 분류, 감시 림프절 검출, 또는 암 치료와 같이, 암성 조직에 영향을 미치는 임의의 절차를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "유도 수술"이라는 용어는 외과의가 수술을 가이드하는 데 화상화제를 사용하는 임의의 외과적 절차를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "암"이라는 용어는 인체내 세포의 비제한된 성장 또는 증식을 포함하는 임의의 질환을 지칭한다. 암은 원래의 부위로부터 이동하고, 원위 부위로 확산될 수 있는(즉, 전이될 수 있는) 세포의 능력에 의해 추가로 특징화될 수 있다. 암은 육종, 암종, 림프종, 백혈병, 아세포종, 또는 생식 세포 종양일 수 있다. 암은 폐, 유방, 난소, 결장, 식도, 직장, 골, 전립선, 뇌, 췌장, 방광, 신장, 간, 혈액 세포, 림프절, 및 위를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 조직에서 발생할 수 있다.
"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 자연적으로 발생된 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비자연적으로 발생된 아미노산(예컨대, 아미노산 유사체)인 아미노산 중합체에도 적용된다. 상기 용어는 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는, 전장 단백질(즉, 항원)을 비롯한, 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함한다.
본원에서 아미노산 서열이 제공되는 경우, 상기 서열의 L-, D- 또는 베타-아미노산 버전 뿐만 아니라, 역전, 역위 및 역전-역위 이소폼 또한 고려된다. 또한, 펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생된 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 자연적으로 발생된 아미노산 중합체도 포함한다. 추가로, 상기 용어는 펩티드 결합 또는 다른 변형된 결합(예컨대, 펩티드 결합이 α-에스테르, β-에스테르, 티오아미드, 포스폰아미드, 카바메이트, 하이드록실레이트 등에 의해 대체되는 경우(예컨대, 문헌 [Spatola, (1983) Chem. Biochem. Amino Acids and Proteins 7: 267-357] 참조), 및 아미드가 포화된 아민으로 대체되는 경우(예컨대, 미국 특허 제4,496,542호(Skiles et al.)(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다), 및 문헌 [Kaltenbronn et al., (1990) Pp. 969-970 in Proc. 11th American Peptide Symposium, ESCOM Science Publishers, The Netherlands] 등 참조)에 의해 연결된 아미노산에 적용된다.
"아미노산"이라는 용어는 자연적으로 발생된 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 자연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체도 지칭한다. 자연적으로 발생된 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 아미노산 뿐만 아니라, 추후에 변형된 아미노산, 예컨대, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산은 소수성 아미노산, 극성 아미노산, 비극성 아미노산, 및 하전된 아미노산으로 분류된다. 소수성 아미노산으로는 작은 소수성 아미노산 및 큰 소수성 아미노산을 포함한다. 작은 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 및 그의 유사체일 수 있다. 큰 소수성 아미노산은 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 및 그의 유사체일 수 있다. 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 티로신, 및 그의 유사체일 수 있다. 비극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 및 그의 유사체일 수 있다. 하전된 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파테이트, 글루타메이트, 및 그의 유사체일 수 있다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실 기, 아미노 기및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드를 지칭한다. 상기 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지지만, 자연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 가지지만, 자연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다. 아미노산은 D 아미노산 또는 L 아미노산이다.
일부 경우에서, 상기 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립형질 이외의 변이체이고 이들을 배제하지 않는다.
비율계량 형광 화상화
비율계량 형광 화상화는 세포내 이온 농도, 세포막 전압, 및 세포내 pH 역학적 성질을 실시간으로 측정하는 것을 비롯한, 다양한 측정을 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 상기에서 언급된 바와 같이, 비율계량 화상화 기술은 강도의 단순 변화를 모니터링하기보다는 형광 방출 파장 이동을 관찰함으로써, 또는 형광단 조합의 방출 강도를 비교함으로써, 정량화를 위해 형광 강도 측정을 사용하는 데 있어 그에 내재된 한계(예컨대, 형광 지시약 농도 변동, 상이한 장치 간의 여기광 강도 또는 형광 방출 수집 및 검출 효율에서의 이동, 및 상이한 형태, 두께, 세포 조성, 및 세포외 기질을 갖는 상이한 조직에 기인한 생체내 화상화의 추가 변화 등) 중 일부를 극복한다.
일부 경우에서, 비율계량 형광 지시약은 단일 여기 파장에서 여기되고, 특이적인 생물학적 활성 감지시, 예컨대, 이온 결합 또는 프로테아제에 의한 절단시, 형광 방출 파장의 이동을 나타내는 분자를 포함한다. 이러한 경우, 연관된 비율계량 형광 화상화 기술은 지시약이 주입된 생물 표본에 단일 여기 파장의 광을 조사하는 단계, 및 (연속하여 또는 동시에) 2 개의 상이한 방출 파장에서 형광 화상을 포착하여 형광 비율 화상을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, 비율계량 형광 지시약은 단일 방출 파장에서 형광을 방출하고, 특이적인 생물학적 활성 감지시, 예컨대, 이온 결합 또는 프로테아제에 의한 절단시, 흡수 최대치 이동을 나타내는 분자를 포함한다. 이러한 경우, 연관된 비율계량 형광 화상화 기술은 지시약이 주입된 생물 표본에 2 개의 상이한 여기 파장의 광을 조사하는 단계, 및 연속하여 단일 방출 파장에서 형광 화상을 포착하여 형광 비율 화상을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, "비율계량 형광 지시약"은 둘 이상의 형광단으로 이루어진 세트를 포함하며, 그 중 하나는 (예컨대, 염료 농도 또는 기준선 생물학적 프로세스를 모니터링하기 위한) 내부 대조군으로서 작용하고, 그 중 하나 이상의 것은 관심의 대상이 되는 생물학적 활성의 지표로서 작용한다. 이러한 경우, 연관된 비율계량 형광 화상화 기술은 둘 이상의 형광단으로 이루어진 세트가 주입된 생물 표본에 2개 이상의 상이한 여기 파장의 광을 조사하는 단계, 및 연속하여 2개 이상의 상이한 방출 파장에서 형광 화상을 포착하여 하나 이상의 형광 비율 화상을 생성하는 단계를 포함한다.
비율계량 형광 지시약
세포내 이온 농도, 세포막 전압, 프로테아제 활성, 및 다른 생물학적 프로세스 모니터링을 위해 다양한 비율계량 형광 지시약이 개발되어 왔다. 예로는 칼슘 지시약 Indo-1, Fura-2, Fura-4F, Fura-6F, Fura-FF, 및 Fura-Red(또는 조합하여 사용되는 Fluo-3 및 Fura Red)(ThermoFisher Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬 소재); pH 지시약 SNARF, 오레곤 그린(Oregon Green), 및 BCECF (ThermoFisher Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬 소재); 막 분극화 지시약 Di-4-ANEPPS, 디-8-ANEPPS, 디-2-ANEPEQ, JC-1, 및 JC-9(ThermoFisher Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬 소재)(또한, 문헌 [Gonzalez, J.E. and Tsien, R.Y. (1997), "Improved Indicators of Cell Membrane Potential that use Fluorescence Resonance Energy Transfer", Chemistry & Biology 4:269-277] 참조); 및 예컨대, HIV-1 프로테아제 활성(문헌 [Jin, et al. (2011), "Visualization of HIV Protease Inhibition Using a Novel FRET Molecular Probe", Biotechnol Prog. 27(4): 1107-1114]), 매트릭스 메탈로프로테이나제 MMP-7 및 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성 (문헌 [T. Jiang, et al. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17867 - 17872]; [Scherer, et al. (2008), Optical Imaging of Matrix Metalloproteinase-7 Activity In vivo Using a Proteolytic Nanobeacon", Mol Imaging. 7(3):118-131]; [Olson, et al. (2009) Integr. Biol. 1:382-393]), 엘라스타제 활성(문헌 [Whitney, et al., (2010), J. Biol. Chem. 285:22532 - 22541]), 트롬빈 활성(문헌 [Whitney, et al. (2013), "Ratiometric Activatable Cell-Penetrating Peptides Provide Rapid In vivo Readout of Thrombin Activation", Angew. Chem. Int. Ed. 52, 325-330]), 및 카스파제-3 활성화(문헌 [Mizukami, S. et al. (1999), "Imaging of Caspase-3 Activation in HeLa Cells Stimulated with Etoposide Using a Novel Fluorescent Probe", FEBS Lett. 453, 356-360])에 대한 비율계량 지시약과 같은, 형광 공여체 및 형광 수용체로 표지된 비율계량 효소 기질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
형광 공명 에너지 전달 기반 비율계량 형광 지시약
일부 비율계량 형광 지시약은 관심의 대상이 되는 특이적인 생물학적 활성에 대한 그의 반응을 부여하는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기전에 의존한다. 예를 들어, 프로테아제 활성을 모니터링하기 위한 형광원성 효소 기질은 빈번하게는 FRET 기반 기전에 의존하고, 전형적으로는, 한쪽 단부는 형광단(예컨대, 형광 공여체)으로 표지되고, 나머지 다른 한쪽 단부는 형광 소광제(예컨대, 형광 수용체)로 표지된 짧은 펩티드 서열 또는 링커(예컨대, 특정 프로테아제에 대한 천연 기질 서열 모두 또는 그의 일부에 상응하는 펩티드 서열)를 포함하는 형광 지시약의 한 부류이다. 형광 소광제는 그 자체로 형광단일 수 있거나, 또는 형광단이 아닐 수 있다. 무손상 FRET 기반 프로브에서, 형광 공여체 및 소광제는 서로 인접하게 유지되어 있고, 예컨대, 전형적으로, 약 100 Å 미만만큼 이격되어 있다. 형광 공여체의 방출 스펙트럼은 형광 소광제의 흡수 스펙트럼과 실질적으로 중복되어야 하는 것 이외에도, 형광 공명 에너지 전달 프로세스의 효율은 이격 거리 I에 극도로 민감하고, 1/R6에 비례한다. 공여체 및 소광제를 이격시키고 있는 링커를 프로테아제로 절단하는 것은 에너지 전달 프로세스의 효율을 억제시킴으로써 형광 공여체 방출 강도를 증가시키고, 형광 수용체 방출을 감소시키거나, 또는 제거한다(비율계량 프로브에 대해 전형적인 바, 수용체가 형광단인 경우). 형광 강도 변화가 (비율계량 프로브에 대해 공여체 및 수용체, 둘 모두에 대한 방출 파장에서) 모니터링되며, 이는 프로테아제 활성과 상관관계가 있다.
비율계량 활성화가능한 세포 투과 펩티드( RACPP )
활성화가능한 세포 투과 펩티드(ACPP; "선택적 전달 분자"(SDM)로도 또한 지칭)는 형광성 염료 또는 다른 화상화제를 비롯한 다양한 카르고를 생체내 프로테아제 활성 부위로 표적화된 방식으로 전달할 수 있는 분자이다(문헌 [Whitney, et al. (2013), "Ratiometric Activatable Cell-Penetrating Peptides Provide Rapid In vivo Readout of Thrombin Activation", Angew. Chem. Int. Ed. 52, 325-330]; Liu, et al., WO 2013/019681 A2). ACPP는 프로테아제-절단가능한 링커와 함께 카르고 및 다가음이온성 억제성 도메인에 부착된 다가양이온성 세포 투과 펩티드로 구성된다. 프로브 활성화 및 카르고 흡수는 프로브를 부착 형태로 전환시키는, 다가음이온성 및 다가양이온성 도메인을 연결하는 링커 서열의 국재화된 단백질분해에 의존한다. 이러한 방법은 절단된 프로브의 축적을 위해 살아있는 조직 내의 공간적으로 국재화된 효소 활성을 검출한다. 앞서 ACPP는 종양에서 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP: matrix metalloproteinase) 및 엘라스타제, 및 아테롬성 동맥 경화증 및 뇌 손상에서 트롬빈 활성화를 표적하는 것으로 보고된 바 있다.
비율계량 활성화가능한 세포 투과 펩티드(RACPP)는 실시간으로 프로테아제 활성을 모니터링하기 위한 FRET 의존성 방출 비율계량 판독값을 제공하는 형광 공여체 및 수용체 모이어티를 추가로 포함하고(문헌 [Whitney, et al. (2013), "Ratiometric Activatable Cell-Penetrating Peptides Provide Rapid In vivo Readout of Thrombin Activation", Angew. Chem. Int. Ed. 52, 325-330]), 생체내 화상화를 위해 단일 방출 파장 프로브에 비하여 유의적인 이점을 제공하는 ACPP이다. 예를 들어, ACPP 내에서 Cy5에서 Cy7로의 FRET는 절단 부위에서 대조를 이루도록 세척해야 할 필요성을 제거함으로써 그 뿐만 아니라, 단일 파장 방출 대역에서의 강도 측정을 교란하는 다수의 비효소 인자를 제거함으로써 강도 기반 ACPP 또는 형광-탈소광 프로브에 비해 유의적으로 개선시킨다. 다른 이점으로는 프로브의 효소적 절단시 발생하는 큰 분광 이동, 및 확산형 기질의, 절단 부위에 그대로 국재화된 상태로 남아 개서된 공간적 분할을 부여하는 부착성 생성물로의 전환을 포함한다. 헤어핀 구조는 효율적인 FRET가 확실히 이루어질 수 있도록 하는 거리로 Cy5 및 Cy7(또는 다른 형광 공여체-수용체 쌍)을 유지한다. 프로브 절단은 감지되는 기질 서열 또는 효소와 상관없이, 방출 비의 큰 변화를 일으킨다(문헌 [Whitney, et al. (2013)]에 보고된 Cy5/Cy7 표지된 트롬빈 활성화 RACPP의 경우, 대략 40x).
일부 실시양태에서, 본 개시된 화상화 방법에서 사용되는 RACPP(또는 비율계량 SDM 프로브)는 하기 구조식을 갖는 화학식 (I)의 분자를 포함한다:
[DA-cA]-A-[cM-M]-X-B-[cB-DB] 화학식 (I)
상기 식에서,
X는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이고;
A는 5 내지 20 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고;
B는 5 내지 20 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고;
cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 0-1 개의 아미노산을 포함하고;
M은 거대분자이고;
DA 및 DB는 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 수용체 및 공여체 형광성 모이어티이고;
여기서, [cM-M]은 A 또는 X 상의 임의의 위치에 결합되고, [DA-cA]는 A의 임의의 아미노산 잔기에 결합되고, [cB-DB]는 B의 임의의 아미노산 잔기에 결합된다.
일부 실시양태에서, 본 개시된 화상화 방법에서 사용되는 RACPP(또는 비율계량 SDM 프로브)는 하기 구조식을 갖는 화학식 (II)의 분자를 포함한다:
[DA-cA]-A-[cM-M]-X-B-Y-[cB-DB] 화학식 (II)
상기 식에서,
X는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이고;
Y는 링커이고;
A는 5 내지 20 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고;
B는 5 내지 20 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고;
cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 0-1 개의 아미노산을 포함하고;
M은 거대분자이고;
DA 및 DB는 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 수용체 및 공여체 형광성 모이어티이고;
여기서, [cM-M]은 A 또는 X 상의 임의의 위치에 결합되고, [DA-cA]는 A의 임의의 아미노산 잔기에 결합되고, [cB-DB]는 B의 임의의 아미노산 잔기에 결합된다.
부분 A
일부 실시양태에서, A는 2 내지 20 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 약 2 내지 약 20 개의 산성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 약 5 내지 약 20 개의 산성 아미노산을 포함. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 9 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 8 개의 산성 아미노산. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 7 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 6 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 7 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 8 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 9 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 약 2 내지 약 20 개의 연속 산성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 약 5 내지 약 20 개의 연속 산성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 9 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 8 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 7 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 6 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 7 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 8 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 9 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 약 2 내지 약 20 개의 산성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 약 5 내지 약 20 개의 산성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 5 내지 9 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 5 내지 8 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 5 내지 7 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 5 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 6 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 7 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 8 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 9 개의 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 약 2 내지 약 20 개의 연속 산성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 약 5 내지 약 20 개의 연속 산성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 5 내지 9 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 5 내지 8 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 5 내지 7 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 5 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 6 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 7 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 8 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 아스파테이트 및 글루타메이트로부터 선택되는 9 개의 연속 산성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 약 2 내지 약 20 개의 글루타메이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 약 5 내지 약 20 개의 글루타메이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 9 개의 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 8 개의 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 7 개의 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 개의 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 6 개의 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 7 개의 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 8 개의 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 9 개의 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 약 2 내지 약 20 개의 연속 글루타메이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 A는 약 5 내지 약 20 개의 연속 글루타메이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 9 개의 연속 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 8 개의 연속 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 내지 7 개의 연속 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 5 개의 연속 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 6 개의 연속 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 7 개의 연속 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 8 개의 연속 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, A는 9 개의 연속 글루타메이트를 포함하는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 부분 A는 5 개의 연속 글루타메이트(즉, EEEEE 또는 eeeee). 일부 실시양태에서, 부분 A는 9 개의 연속 글루타메이트(즉, EEEEEEEEE 또는 eeeeeeeee)를 포함한다
산성 부분 A는 산성이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다. 산성 부분 A는 다른 모이어티, 예컨대, 음으로 하전된 모이어티를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 선택적 전달 분자의 실시양태에서, 산성 부분 A는 음으로 하전된 부분, 바람직하게, 아미노산을 포함하지 않는, 생리학적 pH에서 약 2 내지 약 20 개의 음전하를 갖는 것이다.
일부 실시양태에서, 부분 A 중의 음전하 양은 부분 B 중의 양전하 양과 대략적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 부분 A 중의 음전하 양은 부분 B 중의 양전하 양과 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 개선된 조직 흡수는 부분 A 중의 음전하 양은 부분 B 중의 양전하 양과 동일하지 않은 선택적 전달 분자에서 관찰된다. 일부 실시양태에서, 개선된 가용성은 부분 A 중의 음전하 양은 부분 B 중의 양전하 양과 동일하지 않은 선택적 전달 분자에서 관찰된다. 일부 실시양태에서, 더 빠른 조직 흡수는 부분 A 중의 음전하 양은 부분 B 중의 양전하 양과 동일하지 않은 선택적 전달 분자에서 관찰된다. 일부 실시양태에서, 더욱 큰 조직 흡수는 부분 A 중의 음전하 양은 부분 B 중의 양전하 양과 동일하지 않은 선택적 전달 분자에서 관찰된다.
부분 A는 L-아미노산 또는 D-아미노산이다. 본 발명의 실시양태에서, 면역원성 및 배경 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 비특이적 절단을 최소화하기 위해 D-아미노산이 바람직하다.
부분 A가 비표준 아미노산, 예컨대, 하이드록시리신, 데스모신, 이소데스모신 또는 다른 비표준 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 부분 A는 번역 후 변형된 아미노산, 예컨대, 예를 들어, 메틸화된 아미노산(예컨대, 메틸 히스티딘, 리신의 메틸화된 형태 등), 아세틸화된 아미노산, 아미드화된 아미노산, 포르밀화된 아미노산, 하이드록실화된 아미노산, 인산화된 아미노산 또는 다른 변형된 아미노산을 비롯한, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 부분 A는 비펩티드 결합에 의해 연결된 부분, 및 비아미노산 부분에 의해 연결되거나, 비아미노산 부분에 연결된 아미노산을 비롯한 펩티드 모방체 모이어티도 포함할 수 있다.
본원에 개시된 선택적 전달 분자는 A가 아미노 말단에 존재하거나, 또는 A가 카복시 말단에 존재하는 경우, 즉, 펩티드 결합의 어느 한 배향이 허용가능한 경우 효과적이다.
부분 B
일부 실시양태에서, B는 5 내지 15 개의 염기성 아미노산을 포함하는 서열을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 5 내지 약 20 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 5 내지 약 12 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 7 내지 약 9 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 7 내지 약 8 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 9 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 8 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 7 개의 염기성 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 5 내지 약 20 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 5 내지 약 12 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 7 내지 약 9 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 7 내지 약 8 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 9 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 8 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 7 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 약 5 내지 약 20 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 약 5 내지 약 12 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 약 7 내지 약 9 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 약 7 내지 약 8 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 9 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 8 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 7 개의 염기성 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 약 5 내지 약 20 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 약 5 내지 약 12 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 약 7 내지 약 9 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 약 7 내지 약 8 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 9 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 아르기닌, 히스티딘, 및 리신으로부터 선택되는 8 개의 연속 염기성 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 5 내지 약 20 개의 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 5 내지 약 12 개의 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 7 내지 약 9 개의 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 7 내지 약 8 개의 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 9 개의 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 8 개의 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 7 개의 아르기닌을 포함한다
일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 5 내지 약 20 개의 연속 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 5 내지 약 12 개의 연속 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 7 내지 약 9 개의 연속 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 약 7 내지 약 8 개의 연속 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 9 개의 연속 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 8 개의 연속 아르기닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 부분 B는 7 개의 연속 아르기닌을 포함한다.
염기성 부분 B는 염기성이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다. 염기성 부분 B는 다른 모이어티, 예컨대, 양으로 하전된 모이어티를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 염기성 부분 B는 양으로 하전된 부분, 바람직하게, 아미노산을 포함하지 않는, 생리학적 pH에서 약 5 내지 약 20 개의 양전하를 갖는 것이다. 일부 실시양태에서, 부분 A 중의 음전하 양은 부분 B 중의 양전하 양과 대략적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 부분 A 중의 음전하 양은 부분 B 중의 양전하 양과 동일하지 않다.
부분 B는 L-아미노산 또는 D-아미노산이다. 본 발명의 실시양태에서, 면역원성 및 배경 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 비특이적 절단을 최소화하기 위해 D-아미노산이 바람직하다. 올리고-D-아르기닌 서열의 세포 흡수는 올리고-L-아르기닌의 세포 흡수만큼 우수하거나, 그보다 더 우수한 것으로 공지되어 있다.
부분 B가 비표준 아미노산, 예컨대, 하이드록시리신, 데스모신, 이소데스모신 또는 다른 비표준 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 부분 B는 번역 후 변형된 아미노산, 예컨대, 예를 들어, 메틸화된 아미노산(예컨대, 메틸 히스티딘, 리신의 메틸화된 형태 등), 아세틸화된 아미노산, 아미드화된 아미노산, 포르밀화된 아미노산, 하이드록실화된 아미노산, 인산화된 아미노산 또는 다른 변형된 아미노산을 비롯한, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 부분 B는 또한 비펩티드 결합에 의해 연결된 부분, 및 비아미노산 부분에 의해 연결되거나, 비아미노산 부분에 연결된 아미노산을 비롯한 펩티드 모방체 모이어티도 포함할 수 있다.
X가 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드인 실시양태에서, X의 절단에 의해 생성된 새로운 아미노 말단이 B에 이미 존재하는 양전하에 추가되는 추가 양전하를 제공하도록 X의 C-말단을 B의 N-말단에 연결하는 것이 바람직할 수 있다.
접합 기(c)
일부 실시양태에서, 카르고(예컨대, DA 및 DB) 및 거대분자 캐리어(M)는 A-X-B에 간접적으로 부착된다.
일부 실시양태에서, 카르고(예컨대, DA 및 DB) 및 거대분자 캐리어(M)는 접합 기(cA, cB, 및 cM)에 의해 A-X-B에 간접적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 카르고(예컨대, DA 및 DB) 및 거대분자 캐리어(M)는 반응성 접합 기(cA, cB, 및 cM)에 의해 A-X-B에 간접적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 카르고(예컨대, DA 및 DB) 및 거대분자 캐리어(M)는 오르토고날 반응성 접합 기(cA, cB, 및 cM)에 의해 A-X-B에 간접적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 0-10 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 1 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 2 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 3 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 4 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 5 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 6 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 7 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 8 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 9 개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 10 개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 유도체화된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 카르고(D)는 유도체화된 아미노산 접합 기에 부착된다.
일부 실시양태에서, 접합 기는 수용체 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 자연적으로 발생된 아미노산 또는 비자연적으로 발생된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 D 아미노산, L 아미노산, α-아미노산, β-아미노산, 또는 γ-아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 유리 티올 기를 갖는 임의의 아미노산, 유리 아민 기를 갖는 임의의 아미노산, N 말단 아민 기를 갖는 임의의 아미노산, 및 하이드록실아민 또는 하이드라진 기와의 반응시 옥심 또는 하이드라존 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 임의의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 D-시스테인, D-글루타메이트, 리신, 및 파라-4-아세틸 L-페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, cB는 유리 티올 기를 갖는 임의의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cB는 D-시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA는 N 말단 아민 기를 갖는 임의의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cA는 D-글루타메이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, cA는 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, cM은 하이드록실아민 또는 하이드라진 기와의 반응시 옥심 또는 하이드라존 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 임의의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, cM은 파라-4-아세틸 L-페닐알라닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 자연적으로 발생된 아미노산 또는 비자연적으로 발생된 아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 D 아미노산, L 아미노산, α-아미노산, β-아미노산, 또는 γ-아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 각각 독립적으로 유리 티올 기를 갖는 임의의 아미노산, 유리 아민 기를 갖는 임의의 아미노산, N 말단 아민 기를 갖는 임의의 아미노산, 및 하이드록실아민 또는 하이드라진 기와의 반응시 옥심 또는 하이드라존 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 임의의 아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 D-시스테인, D-글루타메이트, 리신, 및 파라-4-아세틸 L-페닐알라닌으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, cB는 유리 티올 기를 갖는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, cB는 D-시스테인이다. 일부 실시양태에서, cA는 N 말단 아민 기를 갖는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, cA는 D-글루타메이트이다. 일부 실시양태에서, cA는 리신이다. 일부 실시양태에서, cM은 하이드록실아민 또는 하이드라진 기와의 반응시 옥심 또는 하이드라존 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, cM은 파라-4-아세틸 L-페닐알라닌이다.
화상화제(카르고)
일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자의 카르고 부분(D)은 화상화제, 예를 들어, 형광단 또는 염료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화상화제는 형광성 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 형광성 모이어티는 형광성 단백질, 형광성 펩티드, 형광성 염료, 형광 물질 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화상화제는 동일한 선택적 전달 분자에 부착된 형광 모이어티(예컨대, DA 및 DB)의 조합을 포함한다.
모든 형광성 모이어티가 "형광성 모이어티"라는 용어 범위 내에 포함된다. 본원에서 제공된 형광성 모이어티의 구체적인 예는 예시적이고, 본원에 개시된 표적화 분자와 함께 사용되는 형광성 모이어티를 제한하고자 하는 것은 아니다.
형광성 염료의 예로는 크산텐(예컨대, 로다민, 로돌 및 플루오레세인, 및 그의 유도체); 비만; 쿠마린 및 그의 유도체(예컨대, 움벨리페론 및 아미노메틸 쿠마린); 방향족 아민(예컨대, 댄실; 스쿠아레이트 염료); 벤조푸란; 형광성 시아닌; 인도카보시아닌; 카바졸; 디시아노메틸렌 피란; 폴리메틴; 옥사벤즈안트란; 크산텐; 피릴륨; 카보스틸; 페릴렌; 아크리돈; 퀴나크리돈; 루브렌; 안트라센; 코로넨; 페난트레센; 피렌; 부타디엔; 스틸벤; 포피린; 프탈로시아닌; 란타나이드 금속 킬레이트 착물; 희토류 금속 킬레이트 착물; 및 상기 염료의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
플루오레세인 염료의 예로는 5-카복시플루오레세인, 플루오레세인-5-이소티오시아네이트, 플루오레세인-6-이소티오시아네이트 및 6-카복시플루오레세인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
로다민 염료의 예로는 테트라메틸로다민-6-이소티오시아네이트, 5-카복시테트라메틸로다민, 5-카복시 로돌 유도체, 테트라메틸 및 테트라에틸 로다민, 디페닐디메틸 및 디페닐디에틸 로다민, 디나프틸 로다민, 로다민 101 술포닐 클로라이드(TEXAS RED®의 상표명 하에 시판됨)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
시아닌 염료의 예로는 Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, IR Dye680, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 750, IR Dye800CW, ICG를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
형광성 펩티드의 예로는 GFP(녹색 형광 단백질: Green Fluorescent Protein) 또느 GFP의 유도체(예컨대, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, ECFP, Cerulean, CyPet, YFP, Citrine, Venus, Ypet)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화상화제는 근적외선(근-IR) 화상화를 위한 근적외선 형광단, 생체발광 화상화를 위한 루시페라제(초파리, 박테리아 또는 강장동물) 또는 다른 발광 분자, 또는 초음파를 위한 과불화탄소 충전된 소포이다.
바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 RACCP 또는 비율계량 SDM은 형광 공여체 - 수용체 쌍으로 표지된다. 적합한 형광 공여체-수용체 쌍의 예로는 플루오레세인/로다민, 플루오레세인/Cy5, 로다민/Cy5, Cy5/Cy7, Cy5/IR Dye750, Cy5/IR Dye800, Cy5/ICG 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Cy5 및 Cy7의 긴 파장이 생체내 화상화에 이상적인 바 (여기서, 여기 및 방출 파장은 내재 헴의 강력한 흡광도는 회피하기 위해서는 600 nm를 훨씬 초과하여야 한다), Cy5 및 Cy7이 바람직한 형광 공여체 - 수용체 쌍의 한 예를 제공한다. Cy5/Cy 7 공여체-수용체 쌍의 경우, 약 610 nm 내지 630 nm의 파장 범위의 광으로 여기(Cy5 여기의 경우), 및 약 660 nm 내지 720 nm에서의 (Cy5 방출의 경우), 및 약 760 nm 내지 830 nm에서의 (Cy7 방출의 경우) 형광 방출의 수집을 통해, 내재 헴의 간섭은 회피하면서, 비율계량을 정확하게 측정할 수 있다.
거대분자 캐리어 (M)
"캐리어"라는 용어는 혈장 반감기, 가용성 또는 생체분포를 조절하는 불활성 분자를 의미한다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 본원에 개시된 선택적 전달 분자의 혈장 반감기를 조절한다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 본원에 개시된 선택적 전달 분자의 가용성을 조절한다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 본원에 개시된 선택적 전달 분자의 생체분포를 조절한다.
일부 실시양태에서, 캐리어는 비표적 세포 또는 조직에 의한 선택적 전달 분자의 흡수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 연골 내로의 선택적 전달 분자의 흡수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 표적 조직에 비해 관절 내로의 선택적 전달 분자의 흡수를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 캐리어는 표적 세포 또는 조직에 의한 선택적 전달 분자의 흡수를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 표적 조직에 비해 간 내로의 선택적 전달 분자의 흡수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 신장 내로의 선택적 전달 분자의 흡수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 암 조직 내로의 흡수를 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 림프 채널 및/또는 림프절 내로의 흡수를 증진시킨다.
일부 실시양태에서, 캐리어는 사구체 여과를 감소시킴으로써 혈장 반감기를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 대사 또는 프로테아제 분해를 증가 또는 감소시킴으로써 혈장 반감기를 조절한다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 종양 혈관구조의 증진된 투과성 및 보유(EPR: permeability and retention)로 인해 종양 흡수를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 캐리어는 선택적 전달 분자의 수용성을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 임의의 M은 독립적으로 A, B 또는 X에 직접적으로 또는 간접적으로(예컨대, cM을 통해) 결합된다. 일부 실시양태에서, 임의의 M은 독립적으로 n 말단 폴리글루타메이트에서 A에 결합된다. 일부 실시양태에서, 임의의 M은 독립적으로 공유 결합에 의해 A(또는 n 말단 폴리글루타메이트)에 결합된다. 일부 실시양태에서, 임의의 M은 독립적으로 c 말단 폴리아르기닌에서 B에 결합된다. 일부 실시양태에서, 임의의 M은 독립적으로 공유 결합에 의해 B(또는 c 말단 폴리아르기닌)에 결합된다. 일부 실시양태에서, 임의의 M은 독립적으로 X와 A, X와 B, B와 C/N 말단, 및 A와 C/N 말단 사이에서 링커에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 에테르 결합, 티오에테르 결합, 아민 결합, 아미드 결합, 옥심 결합, 탄소-탄소 결합, 탄소-질소 결합, 탄소-산소 결합 또는 탄소-황 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, M은 단백질, 합성 또는 천연 중합체 및 덴드리머로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, M은 덱스트란, PEG 중합체(예컨대, PEG5kDa, PEG12kDa, PEG20kDa, PEG30kDa, 및 PEG40kDa), 알부민, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, M은 PEG 중합체이다. 일부 경우에서, PEG는 다분산 또는 단분산 화합물이다. 일부 경우에서, 다분산 물질은 평균 중량(중량 평균) 크기 및 분산도에 의해 특징화되는, 물질의 상이한 분자량의 분산 분포를 포함한다. 다른 경우에, PEG는 하나의 분자량 크기를 포함하나는, 단분산 화합물이다.
일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 100,000 Da이다.
일부 경우에서, M의 분자량은 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 100,000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 200 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 300 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 400 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 500 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 600 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 700 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 800 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 900 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1100 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1200 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1300 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1400 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1450 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1500 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1600 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1700 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1800 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 1900 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2100 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2200 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2300 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2400 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2500 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2600 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2700 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2800 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 2900 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 3000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 3250 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 3350 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 3500 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 3750 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 4000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 4250 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 4500 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 4600 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 4750 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 5000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 5500 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 6000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 6500 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 7000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 7500 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 8000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 10,000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 12,000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 20,000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 35,000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 40,000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 50,000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 60,000 Da이다. 일부 경우에서, M의 분자량은 약 100,000 Da이다.
일부 실시양태에서, M의 평균 분자량은 50 내지 70 kD이다.
일부 실시양태에서, M은 이산성 PEG이며, 여기서 이산성 PEG는 1개 초과의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함하는 중합체 PEG이다. 일부 경우에서, 이산성 PEG(dPEG: discrete PEG)는 2 내지 60, 2 내지 50, 또는 2 내지 48 개의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 42, 48, 50개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 2개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 3개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 4개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 5개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 6개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 7개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 8개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 9개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 10개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 11개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 12개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 13개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 14개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 15개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 16개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 17개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 18개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 19개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 20개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 22개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 24개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 26개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 28개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 30개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 35개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 40개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 42개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 48개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 약 50개 이상의 반복 에탈렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에서, dPEG는 단계식 방식으로 순수한(예컨대, 약 95%, 98%, 99%, 또는 99.5%) 출발 물질로부터 단일 분자량 화합물로서 합성된다. 일부 경우에서, dPEG는 평균 분자량 이외의 비분자량을 갖는다. 일부 경우에서, 본원에 기술된 dPEG는 콴타 바이오디자인, LMD(Quanta Biodesign, LMD)로부터의 dPEG이다.
일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 알부민에 접합된다. 특정 경우에서, 알부민은 정상 생리학적 조건하에서 사구체 여과액으로부터 배제된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 알부민과 공유 접합체를 형성할 수 있는 반응성 기, 예컨대, 말레이미드를 포함한다. 알부민을 포함하는 선택적 전달 분자는 절단된 선택적 전달 분자가 절단 의존적 방식으로 종양에서 축적되는 것을 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 알부민 접합체는 우수한 약동학적 특성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 PEG 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 PEG 500Da 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 PEG 1kDa 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 PEG 2kDa 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 PEG 5kDa 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 PEG 10kDa 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 PEG 12kDa 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 PEG 20kDa 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 30kD PEG 접합체는 유리 펩티드에 비해 더 긴 반감기를 가졌다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 간 및 신장에서 제거되는, 20-40 kD PEG 중합체에 접합된다.
일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 덱스트란에 접합된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 70 kDa 덱스트란에 접합된다. 일부 실시양태에서, 분자량의 혼합물인 덱스트란 접합체는 재현가능하게 합성하고, 정제하기 어렵다.
일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 스트렙트아비딘에 접합된다.
일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 5세대 PAMAM 덴드리머에 접합된다.
일부 실시양태에서, 캐리어는 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 캐리어의 캡핑은 약동학을 개선시키고, 친수성을 증가시킴으로써 캐리어의 세포독성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 캡은 아세틸, 숙시닐, 3-하이드록시프로피오닐, 2-술포벤조일, 글리시딜, PEG-2, PEG-4, PEG-8 및 PEG-12로부터 선택된다.
부분 X(링커)
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산으로 구성된 링커를 사용하여 펩티드 서열 A(즉, 펩티드 B의 전달 작용을 억제하도록 디자인된 서열)와 펩티드 서열 B를 연결한다. 일반적으로, 펩티드 링커는 분자들을 연결하거나, 또는 그들 사이에 약간의 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외의 특정 생물학적 활성은 가지지 않을 것이다. 그러나, 링커의 구성성분 아미노산은 분자의 일부 특성, 예컨대, 폴딩, 순 전하 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다.
살아있는 세포에서, 본원에 개시된 무손상 선택적 전달 분자는 부분 A의 존재 때문에 상기 세포 내로 진입할 수 없다. 따라서, 세포 내로의 흡수를 방해하는 부분 A가 흡수되지 않을 것이고, 세포내 효소에 접근하지 않을 것이기 때문에, 건강한 세포에서 이러한 세포내 효소에 의해 효율적으로 절단되지 않을 것이므로, 엄밀히 말하면 X를 절단하는 세포내 프로세스는 건강한 세포에서 X를 절단하는 데 비효과적일 것이다. 그러나, 세포가 손상되거나, 이환된 경우(예컨대, 암성 세포, 저산소 세포, 허혈 세포, 아폽토시스 세포, 괴사 세포), 상기 세포내 효소는 상기 세포로부터 누출되고, A의 절단이 발생하여 상기 세포 내로의 부분 B 및/또는 카르고의 도입을 가능하게 함으로써 이웃 세포로의 부분 B 및/또는 카르고 D의 표적화된 전달을 수행할 것이다. 일부 실시양태에서, X는 세포외 공간에서 절단된다.
일부 실시양태에서, 모세관이 종양 및 다른 외상 부위 주변에서 누출된다는 사실이 고분자량 분자(예컨대, 약 30 kDa 이상의 분자량)이 간질 구획에 도달할 수 있는 능력을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, X 링커는 암성 조직에 인접한 위치에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 관련 프로테아제를 발현하지 않지만, 발현 세포에 바로 인접해 있는 세포는 X 링커의 절단이 전형적으로 세포외에 존재하기 때문에 선택적 전달 분자로부터 카르고를 가져간다. 일부 실시양태에서, 상기 방관자 표적화는 세포 표현형의 불균질성 및 가능한 높은 백분율의 의심 세포를 제거하고자 하는 희망 때문에 종양의 치료에 유리하다.
일부 실시양태에서, X는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, X는 프로테아제에 의해 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, X는 세포외 프로테아제에 의해 절단가능한 링커이다.
일부 실시양태에서, 링커는 가요성이다. 일부 실시양태에서, 링커는 강성이다.
일부 실시양태에서, 링커는 선형 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 비선형 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 분지형 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 사이클릭 구조를 포함한다.
링커는 직쇄 또는 분지형 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커, 펩티드 링커, 및 폴리에테르 링커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 링커는 임의로 아미드 결합, 술프하이드릴 결합, 또는 이종작용성 결합을 갖는다.
일부 실시양태에서, X의 길이는 약 5 내지 약 30 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 6 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 8 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 10 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 12 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 14 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 16 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 18 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 20 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 25 개의 원자 길이이다. 일부 실시양태에서, X의 길이는 약 30 개의 원자 길이이다.
일부 실시양태에서, 링커는 공유 결합에 의해 펩티드 부분 A(즉, 세포 흡수를 방해하는 펩티드 서열)를 펩티드 부분 B(즉, 전달 서열)에 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 에테르 결합, 티오에테르 결합, 아민 결합, 아미드 결합, 옥심 결합, 하이드라존 결합, 탄소-탄소 결합, 탄소-질소 결합, 탄소-산소 결합, 또는 탄소-황 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, X는 펩티드 결합을 포함한다. 펩티드 결합은 L-아미노산 및/또는 D-아미노산을 포함한다. 본 발명의 실시양태에서, 면역원성 및 배경 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 비특이적 절단을 최소화하기 위해 D-아미노산이 바람직하다. 올리고-D-아르기닌 서열의 세포 흡수는 올리고-L-아르기닌의 것만큼 우수하거나, 그보다 더 우수한 것으로 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, X 링커는 특정 조건 또는 특정 환경의 존재하에서의 절단을 위해 디자인된다. 바람직한 실시양태에서, X 링커는 생리학적 조건하에서 절단가능하다. 상기 X 링커의 절단은 예를 들어, 개선될 수 있거나, 카르고 전달이 요구되는 세포와 관련된 특정 병리학적 신호 또는 특정 환경에 의해 영향을 받을 수 있다. 특정 조건, 예컨대, 특정 효소에 의한 절단을 위한 X 링커의 디자인은 상기 조건이 수득되는 특정 위치로의 세포 흡수의 표적화를 가능하게 한다. 따라서, 선택적 전달 분자가 원하는 세포, 조직 또는 영역으로의 세포 흡수의 특이적 표적화를 제공하는 한 중요한 방식은 링커 부분 X가 상기 표적화된 세포, 조직 또는 영역 근처의 조건에 의해 절단되도록 디자인하는 것이다.
일부 실시양태에서, X는 pH 민감성 링커이다. 일부 실시양태에서, X는 염기성 pH 조건하에서 절단된다. 일부 실시양태에서, X는 산성 pH 조건하에서 절단된다. 일부 실시양태에서, X는 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 또는 이들의 조합에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, X는 환원제에 의해 절단된다.
일부 실시양태에서, X는 MMP에 의해 절단된다. 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 가수분해 활성은 전이성 종양 세포의 침윤성 이동에 연루되어 있다. 특정 경우에서, MMP는 염증 부위 근처에서 발견된다. 특정 경우에서, MMP는 뇌졸중(즉, 혈류의 감소 후 뇌 손상을 특징으로 하는 장애) 부위 근처에서 발견된다. 따라서, 본 발명의 특징을 갖는 분자의 흡수는 세포외 환경에서 활성 MMP를 갖는 특정 세포, 조직 또는 영역으로의 카르고(적어도 하나의 D 모이어티)의 세포 흡수를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, X 링커는 메탈로프로테이나제 효소 MMP-2, MMP-9, 또는 MMP-7(암 및 염증에 관여하는 MMP)에 의해 절단되는 아미노산 서열 PLG-C(Me)-AG(서열 번호 1), PLGLAG(서열 번호 2)를 포함한다.
일부 실시양태에서, X는 암성 세포 근처에서 발견될 수 있는 단백질분해 효소 또는 환원 환경에 의해 절단된다. 상기 환경 또는 상기 효소는 전형적으로 정상 세포 근처에서는 발견되지 않는다.
일부 실시양태에서, X는 트롬빈 및 카텝신을 포함하나, 이에 제한되지 않는 세린 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, X는 카텝신 K, 카텝신 S, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 W, 카텝신 F, 카텝신 A, 카텝신 C, 카텝신 H, 카텝신 Z, 또는 이들의 임의 조합에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, X는 카텝신 K 및/또는 카텝신 S에 의해 절단된다.
일부 실시양태에서, X는 저산소증을 앓고 있는 조직에서 또는 상기 조직 근처에서 절단된다. 일부 실시양태에서, 저산소 조직에서의 또는 상기 조직 근처에서의 절단은 암 세포 및 암성 조직, 경색 영역 및 다른 저산소 영역의 표적화를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, X는 디술피드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 디술피드 결합을 포함하는 링커는 저산소 영역에서 우선적으로 절단되고, 이로써, 카르고 전달을 상기 영역 내의 세포로 표적화한다. 저산소증은 암 세포가 방사선 및 화학요법에 대해 더 높은 내성을 갖게 하고, 혈관신생을 개시하게 하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 누출 또는 괴사 세포의 존재하에서 저산소 환경에서, 유리 티올 및 다른 환원제는 세포외에서 이용가능하게 되지만, 세포외 환경 산화를 정상적으로 유지하는 O2는 당연히 고갈된다. 일부 실시양태에서, 환원산화 균형에서의 이러한 이동은 X 링커 내의 디술피드 결합의 환원 및 절단을 촉진한다. 티올-디술피드 평형을 이용하는 디술피드 결합 이외에, 하이드로퀴논으로 환원될 때 분리되는 퀴논을 포함하는 결합이 저산소 환경에서 절단되도록 디자인된 X 링커에서 사용된다.
일부 실시양태에서, X는 괴사 환경에서 절단된다. 괴사는 종종 X 링커의 절단을 유발하는 데에 사용될 수 있는 효소 또는 다른 세포 내용물의 방출을 유도한다. 일부 실시양태에서, 괴사 효소(예컨대, 칼파인)에 의한 X의 절단은 카르고가 이환된 세포, 및 아직 완전히 누출되지 않은 이웃 세포에 의해 흡수될 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, X는 산 불안정성 링커이다. 일부 실시양태에서, X는 아세탈 또는 비닐 에테르 결합을 포함한다. 산증은 산화적 인산화로부터 혐기성 해당작용 및 젖산 생성으로의 바르부르크(Warburg) 이동으로 인해 손상된 또는 저산소 조직 부위에서 관찰된다. 일부 실시양태에서, 산증은 B 내의 아르기닌의 일부를, pH 7 미만에서만 양이온성을 나타내게 되는 히스티딘으로 치환함으로써 카르고 흡수의 유발자로서 사용된다.
본원에 개시된 링커는 비표준 아미노산, 예컨대, 예를 들어, 하이드록시리신, 데스모신, 이소데스모신 또는 다른 비표준 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본원에 개시된 링커는 번역 후 변형된 아미노산, 예컨대, 예를 들어, 메틸화된 아미노산(예컨대, 메틸 히스티딘, 리신의 메틸화된 형태 등), 아세틸화된 아미노산, 아미드화된 아미노산, 포르밀화된 아미노산, 하이드록실화된 아미노산, 인산화된 아미노산 또는 다른 변형된 아미노산을 비롯한, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 링커는 또한 비펩티드 결합에 의해 연결된 부분, 및 비아미노산 부분에 의해 연결되거나, 비아미노산 부분에 연결된 아미노산을 비롯한 펩티드 모방체 모이어티도 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커 X는 PLGLAG, PLG-C(me)-AG, RPLALWRS, ESPAYYTA, DPRSFL, PPRSFL, RLQLKL, 및 RLQLK(Ac)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 PLGLAG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 PLG-C(me)-AG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 PLGxAG(여기서, x는 임의의 아미노산(자연적으로 발생된 또는 비자연적으로 발생된 아미노산)이다)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 RPLALWRS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 ESPAYYTA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 DPRSFL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 PPRSFL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 RLQLKL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 X는 아미노산 서열 RLQLK(Ac)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커 X는 하기 펩티드들로부터 선택된 펩티드를 포함한다: PR(S/T)(L/I)(S/T)(여기서, 괄호 안의 문자는 표시된 아미노산 중 하나가 서열에서 그 위치에 존재한다는 것을 나타낸다); GGAANLVRGG; SGRIGFLRTA; SGRSA; GFLG; ALAL; FK; PIC(Et)F-F(여기서, C(Et)는 S-에틸시스테인(에틸 기가 티올에 부착되어 있는 시스테인)을 나타내고, "-"는 이 서열 및 후속 서열에서 전형적인 절단 부위를 나타낸다); GGPRGLPG; HSSKLQ; LVLA-SSSFGY; GVSQNY-PIVG; GVVQA-SCRLA; f(Pip)R-S(여기서, "f"는 D-페닐알라닌을 나타내고, "Pip"는 피페리딘-2-카복실산(6원 고리를 갖는 프롤린 유사체인 피페콜린산)을 나타낸다); DEVD; GWEHDG; RPLALWRS, 또는 이들의 조합.
일부 실시양태에서, X는 저산소 조건하에서 절단된다. 일부 실시양태에서, X는 디술피드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 퀴닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, X는 괴사 조건하에서 절단된다. 일부 실시양태에서, X는 칼파인에 의해 절단될 수 있는 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, X는 6-아미노헥산오일, 5-(아미노)-3-옥사펜탄오일, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 디술피드 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 알킬이다. 일부 실시양태에서, 링커는 헤테로알킬이다.
일부 실시양태에서, 링커는 알킬렌이다. 일부 실시양태에서, 링커는 알케닐렌이다. 일부 실시양태에서, 링커는 알키닐렌이다. 일부 실시양태에서, 링커는 헤테로알킬렌이다.
"알킬" 기는 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 알킬 모이어티는 알킬 또는 불포화된 알킬일 수 있다. 구조에 따라, 알킬 기는 일라디칼 또는 이라디칼(즉, 알킬렌 기)일 수 있다.
"알킬" 모이어티는 1 내지 10 개의 탄소 원자를 가질 수 있다(수치 범위, 예컨대, "1 내지 10"은 본원에 기재되어 있을 때마다 주어진 범위 내의 각각의 정수를 지칭한다; 예컨대, "1 내지 10 개의 탄소 원자"는 알킬 기가 1 개의 탄소 원자, 2 개의 탄소 원자, 3 개의 탄소 원자 등(최대 10개(10개 포함)의 탄소 원자)로 구성될 수 있다는 것을 의미하지만, 본 정의는 수치 범위가 표기되지 않은 "알킬"이라는 용어의 존재도 커버한다). 알킬 기는 1개 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 "저급 알킬"일 수도 있다. 본원에 기술된 화합물의 알킬 기는 "C1-C4 알킬" 또는 유사한 명칭으로서 표기될 수 있다. 예로서, "C1-C4 알킬"은 알킬 쇄 내에 1 내지 4 개의 탄소 원자가 존재한다는 것, 즉, 알킬 쇄가 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸 및 t-부틸로부터 선택된다는 것을 나타낸다. 전형적인 알킬 기로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실, 에테닐, 프로페닐, 부테닐 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 링커는 고리 구조(예컨대, 아릴)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "고리"라는 용어는 임의의 공유적으로 폐쇄된 구조를 지칭한다. 고리는 예를 들어, 카보사이클(예컨대, 아릴 및 사이클로알킬), 헤테로사이클(예컨대, 헤테로아릴 및 비방향족 헤테로사이클), 방향족(예컨대, 아릴 및 헤테로아릴), 및 비방향족(예컨대, 사이클로알킬 및 비방향족 헤테로사이클)을 포함한다. 고리는 임의로 치환될 수 있다. 고리는 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "아릴"이라는 용어는 고리를 형성하는 각각의 원자가 탄소 원자인 방향족 고리를 지칭한다. 아릴 고리는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 9개 초과의 탄소 원자에 의해 형성될 수 있다. 아릴 기는 임의로 치환될 수 있다. 아릴 기의 예로는 페닐, 나프탈레닐, 페난트레닐, 안트라세닐, 플루오레닐, 및 인데닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구조에 따라, 아릴 기는 일라디칼 또는 이라디칼(즉, 아릴렌 기)일 수 있다.
"사이클로알킬"이라는 용어는 고리를 형성하는 각각의 원자(즉, 골격 원자)가 탄소 원자인 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 비방향족 라디칼을 지칭한다. 사이클로알킬은 포화된, 또는 부분적으로 불포화된 것일 수 있다. 사이클로알킬 기는 3개 내지 10 개의 고리 원자를 갖는 기를 포함한다. 사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 고리는 사이클로알칸이다. 일부 실시양태에서, 고리는 사이클로알켄이다.
일부 실시양태에서, 고리는 방향족 고리이다. "방향족"이라는 용어는 4n+2π개(여기서, n은 정수이다)의 전자를 함유하는 비편재된 π-전자 시스템을 갖는 평면 고리를 지칭한다. 방향족 고리는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 9개 초과의 원자로부터 형성될 수 있다. 방향족은 임의로 치환될 수 있다. "방향족"이라는 용어는 카보사이클릭 아릴(예컨대, 페닐) 및 헤테로사이클릭 아릴(또는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족") 기(예컨대, 피리딘), 둘 모두를 포함한다. 용어는 모노사이클릭 또는 융합된 고리 폴리사이클릭(즉, 인접한 탄소 원자의 쌍을 공유하는 고리) 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 고리는 헤테로사이클. "헤테로사이클"이라는 용어는 각각 O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 함유하는 헤테로방향족 및 헤테로지환족 기로서, 여기서 각각의 헤테로사이클릭 기는 그의 고리 시스템 내에 4 내지 10 개의 원자를 갖되, 단, 상기 기의 고리는 2 개의 인접한 O 또는 S 원자를 함유하지 않는 것인 기를 지칭한다. 비방향족 헤테로사이클릭 기는 그의 고리 시스템 내에 단 3 개의 원자를 갖는 기를 포함하지만, 방향족 헤테로사이클릭 기는 그의 고리 시스템 내에 적어도 5 개의 원자를 가져야 한다. 헤테로사이클릭 기는 벤조 융합된 고리 시스템을 포함한다. 3원 헤테로사이클릭 기의 예는 아지리디닐이다. 4원 헤테로사이클릭 기의 예는 (아제티딘으로부터 유도된) 아제티디닐이다. 5원 헤테로사이클릭 기의 예는 티아졸릴이다. 6원 헤테로사이클릭 기의 예는 피리딜이고, 10원 헤테로사이클릭 기의 예는 퀴놀리닐이다. 비방향족 헤테로사이클릭 기의 예로는 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 테트라하이드로피라닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페리디노, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티옥사닐, 피페라지닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 1,2,3,6-테트라하이드로피리디닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H-피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로티에닐, 디하이드로푸라닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자비사이클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자비사이클로[4.1.0]헵타닐, 3H-인돌릴 및 퀴놀리지닐이 있다. 방향족 헤테로사이클릭 기의 예로는 피리디닐, 이미다졸릴, 피리미디닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 푸리닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐 및 푸로피리디닐이 있다. 상기 기들은 가능한 경우 C 부착, 또는 N 부착될 수 있다. 예를 들어, 피롤로부터 유도된 기로는 피롤-1-일(N 부착) 또는 피롤-3-일(C 부착)이 있다. 추가로, 이미다졸로부터 유도된 기로는 이미다졸-1-일 또는 이미다졸-3-일(둘 모두 N 부착) 또는 이미다졸-2-일, 이미다졸-4-일 또는 이미다졸-5-일(모두 C 부착)이 있다. 헤테로사이클릭 기로는 벤조 융합된 고리 시스템 및 1 또는 2 개의 옥소(=O) 모이어티로 치환된 고리 시스템, 예컨대, 피롤리딘-2-온을 포함한다. 구조에 따라, 헤테로사이클 기는 일라디칼 또는 이라디칼(즉, 헤테로사이클렌 기)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 고리는 융합된다. "융합된"이라는 용어는 2개 이상의 고리가 하나 이상의 결합을 공유하는 구조를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 고리는 이량체이다. 일부 실시양태에서, 고리는 삼량체이다. 일부 실시양태에서, 고리는 치환된다.
"카보사이클릭" 또는 "카보사이클"이라는 용어는 고리를 형성하는 각각의 원자가 탄소 원자인 고리를 지칭한다. 카보사이클로는 아릴 및 사이클로알킬을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 고리 골격이 탄소와 상이한 적어도 하나의 원자(즉, 헤테로원자)를 함유하는 헤테로사이클("헤테로사이클릭")로부터 카보사이클을 구별시켜준다. 헤테로사이클로는 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬을 포함한다. 카보사이클 및 헤테로사이클은 임의로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커 X는 치환된다. "임의로 치환된" 또는 "치환된"이라는 용어는 언급된 기가 개별적으로 및 독립적으로 C1-C6알킬, C3-C8사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, C2-C6헤테로지환족, 하이드록시, C1-C6알콕시, 아릴옥시, C1-C6알킬티오, 아릴티오, C1-C6알킬술폭시드, 아릴술폭시드, C1-C6알킬술폰, 아릴술폰, 시아노, 할로, C2-C8아실, C2-C8아실옥시, 니트로, C1-C6할로알킬, C1-C6플루오로알킬, 및 C1-C6알킬아미노를 비롯한, 아미노, 및 그의 보호된 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 추가 기(들)로 치환될 수 있다는 것을 의미한다. 예로서, 임의적 치환기는 LsRs일 수 있고, 여기서 각각의 L은 독립적으로 결합, -O-, -C(=O)-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NH-, -NHC(=O)-, -C(=O)NH-, S(=O)2NH-, -NHS(=O)2-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)O-, -(C1-C6알킬)-, 또는 -(C2-C6알케닐)-로부터 선택되고; 각각의 R은 독립적으로 H, (C1-C4알킬), (C3-C8사이클로알킬), 헤테로아릴, 아릴, 및 C1-C6헤테로알킬로부터 선택된다. 임의로 치환된 비방향족 기는 하나 이상의 옥소(=O)로 치환될 수 있다. 상기 치환기의 보호 유도체를 형성할 수 있는 보호기는 당업자에게 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 링커 X는 제로-링커를 포함한다. 일부 경우에서, 제로-링커는 공유 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 에테르 결합, 티오에테르 결합, 아민 결합, 아미드 결합, 옥심 결합, 하이드라존, 탄소-탄소 결합, 탄소-질소 결합, 탄소-산소 결합, 또는 탄소-황 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커 X는 추가로 이작용성 링커를 포함한다. 일부 경우에서, 이작용성 링커는 제1 분자(예컨대, 선택적 전달 분자) 상의 기와 반응성인 한 작용기, 및 제2 분자(예컨대, 화상화 카르고) 상의 기와 반응성인 제2 작용기를 갖는다. 일부 경우에서, 이작용성 링커는 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 유도체화는 작용기를 제공하기 위해 수행된다. 따라서, 예를 들어, 펩티드 상의 유리 술프하이드릴 기 생성을 위한 방법 또한 공지되어 있다(미국 특허 제4,659,839호 참조). 링커 X는 대안적으로, 선택적 전달 분자와 상호작용할 수 있는 헤테로사이클릭 고리를 형성하는 2개 이상의 상이한 반응성 기를 포함하는 이종이작용성 가교제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이종이작용성 가교제, 예컨대, 시스테인은 아민 반응성 기를 포함할 수 있고, 티올 반응성 기는 유도체화된 선택적 전달 분자 상의 알데히드와 상호작용할 수 있다. 이종이작용성 가교제로 적합한 반응성 기의 추가 조합으로는 예를 들어, 아민 및 술프하이드릴 반응성 기; 카보닐 및 술프하이드릴 반응성 기; 아민 및 광반응성 기; 술프하이드릴 및 광반응성 기; 카보닐 및 광반응성 기; 카복실레이트 및 광반응성 기; 및 아르기닌 및 광반응성 기를 포함한다.
예시적인 동종이작용성 링커로는 로만트 시약(Lomant's reagent) 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(술포숙신이미딜 프로프리오네이트(DTSSP), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(술포숙신이미딜)수베레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디술포숙신이미딜 타르트레이트(술포 DST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜이미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴 할라이드 함유 화합물(DFDNB), 예컨대, 예로서, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠, 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐술폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술피드(BASED), 포름알데히드, 글루타르알데히드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디아이오도-p-크실렌 술폰산, N,N'-에틸렌-비스(아이오도아세트아미드), 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(아이오도아세트아미드)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 이종이작용성 링커로는 아민 반응성 및 술프하이드릴 가교제, 예컨대, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(술포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 술포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(술포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC), 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(술포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBs), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시술포숙신이미드 에스테르(술포-MBs), N-숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 술포숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(술포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 술포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(술포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMBs), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)술포숙신이미드 에스테르(술포-GMBs), 숙신이미딜 6-((아이오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((아이오도아세틸)아미노)헥산오일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 숙신이미딜 4-(((아이오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-((((4-아이오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 아이오도아세테이트(NPIA), 카보닐 반응성 및 술프하이드릴 반응성 가교제, 예컨대, 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH), 아민 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시술포숙신이미딜-4-아지도살리실산(술포-NHs-AsA), 술포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(술포-NHs-LC-AsA), 술포숙신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(술포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 술포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(술포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NOs), 술포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-술포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(술포-sADP), 술포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(술포-sAPB), 술포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 술포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(술포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 술프하이드릴 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(아이오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-아이오도아세트아미드, 벤조페논-4-말레이미드 카보닐 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, ρ-아지도벤조일 하이드라지드(ABH), 카복실레이트 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA), 및 아르기닌 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 링커 X는 반응성 작용기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응성 작용기는 링커 X를 본원에 기술된 카르고에 접합시킨다. 일부 경우에서, 반응성 작용기는 친전자성 기에 대해 반응성인 친핵성 기를 포함한다. 예시적인 친전자성 기로는 카보닐 기-예컨대, 알데히드, 케톤, 카복실산, 에스테르, 아미드, 에논, 아실 할라이드 또는 산 무수물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응성 작용기는 알데히드이다. 예시적인 친핵성 기로는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커 X는 말레이미드 기, 알킬 할라이드 기, 또는 아이오도아세트아미드 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커 X는 말레이미드 기를 포함한다. 일부 경우에서, 말레이미드 기는 또한 말레이미드 스페이서로서 지칭된다. 일부 경우에서, 말레이미드 기는 말레이미도카프로일(mc)을 형성하는 카프로산을 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 링커는 말레이미도카프로일(mc)을 포함한다. 일부 경우에서, 링커는 말레이미도카프로일(mc)이다. 다른 경우에, 말레이미드 기는 말레이미도메틸 기, 예컨대, 상기 기술된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC) 또는 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(술포-sMCC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 말레이미드 기는 자기 안정화 말레이미드이다. 일부 경우에서, 자기 안정화 말레이미드는 디아미노프로피온산(DPR)을 이용하여 말레이미드에 인접한 염기성 아미노 기를 도입하여 티오숙신이미드 고리 가수분해의 분자내 촉매작용을 제공하여 말레이미드에서 레트로-마이클(Michael) 반응을 통해 제거 반응이 일어나지 못하게 한다. 일부 경우에서, 자기 안정화 말레이미드는 문헌 [Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)]에 기술된 말레이미드 기이다. 일부 경우에서, 링커는 자기 안정화 말레이미드를 포함한다. 일부 경우에서, 링커는 자기 안정화 말레이미드이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 선택적 전달 분자는 단일 링커를 포함한다. 비 손상 트레이서 양을 사용한 화상화를 이용하여 후속 치료 용량이 표적 조직에서 정확하게 농축될 가능성이 있는지를 시험할 수 있기 때문에, 화상화 카르고 및 치료 카르고, 이 둘 모두의 흡수를 매개하는 단일 기전의 이용은 특히 가치가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 선택적 전달 분자는 복수의 링커를 포함한다. 본원에 개시된 선택적 전달 분자가 복수의 X 연결을 포함하는 경우, 분자의 나머지 부분으로부터의 부분 A의 분리는 모든 X 연결의 절단을 필요로 한다. 다수의 X 링커의 절단은 동시에 또는 후속적으로 이루어질 수 있다. 다수의 X 연결은 상이한 특이성을 갖는 X 연결을 포함할 수 있는 바, 분자의 나머지 부분으로부터의 부분 A의 분리를 위해서는 1 초과의 조건 또는 환경(예컨대, "신호" 또는 "세포외 신호")이 분자와 조우하여야 한다. 따라서, 다수의 X 링커의 절단은 상기 신호 또는 세포외 신호의 조합의 검출자로서 작용한다. 예를 들어, 선택적 전달 분자는 염기성 부분 B를 산성 부분 A와 연결하는 2 개의 링커 부분 Xa 및 Xb를 포함할 수 있다. 부분 B 및 카르고 모이어티 C(존재하는 경우)가 세포 내로 진입할 수 있도록 산성 부분 A가 염기성 부분 B로부터 분리되기 전에 Xa 링커 및 Xb 링커 둘 모두가 절단되어야 하다. 링커 영역이 존재할 수 있는 또 다른 링커와 독립적으로 염기성 부분 B 또는 카르고 모이어티 C에 연결될 수 있고, 원하는 경우, 2개 초과의 링커 영역 X가 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
2개 이상의 X 링커의 조합을 사용하여 원하는 세포, 조직 또는 영역으로의 분자의 표적화 및 전달을 추가로 조절할 수 있다. 원하는 경우, 신호 또는 세포외 신호들의 조합을 사용하여 X 링커의 절단의 특이성을 넓히거나, 좁힌다. 다수의 X 링커들이 병렬로 연결되는 경우, 부분 A가 분자의 나머지로부터 분리될 수 있기 전에 각각의 X 링커가 절단되어야 하기 때문에, 절단의 특이성은 좁아진다. 다수의 X 링커들이 직렬로 연결되는 경우, 어느 한 X 링커 상에서의 절단이 분자의 나머지로부터의 부분 A의 분리를 가능하게 하기 때문에 절단의 특이성은 넓어진다. 예를 들면, 프로테아제 또는 저산소증을 검출하기 위해(즉, 프로테아제 또는 저산소증의 존재하에서 X를 절단하기 위해), X 링커는 프로테아제 민감성 부위 및 환원 민감성 부위를 직렬로 배치하여 어느 하나의 절단이 산성 부분 A의 분리를 가능하게 하기에 충분하도록 디자인된다. 대안적으로, 프로테아제 및 저산소증 둘 모두의 존재를 검출하기 위해(즉, 프로테아제 및 저산소증 중 단 하나의 존재하에서 X를 절단하기 위해서가 아니라, 프로테아제 및 저산소증 돌 모두의 존재하에서 X를 절단하기 위해), X 링커는 서로 디술피드 결합된 적어도 하나의 시스테인 쌍 사이에 프로테아제 민감성 부위를 배치하도록 디자인된다. 이 경우, 프로테아제 절단 및 디술피드 환원 둘 모두가 부분 A의 분리를 가능하게 하기 위해 요구된다.
부분 Y 링커
일부 실시양태에서, Y는, 카르고(D)를 SDM의 나머지 부분에 연결하는 데 사용되는, 하나 이상의 아미노산으로 구성된 링커이다. 일부 실시양태에서, Y는, 카르고(D)를 부분 B에 연결하는 데 사용되는, 하나 이상의 아미노산으로 구성된 링커이다. 일반적으로, 펩티드 링커는 분자들을 연결하거나, 또는 그들 사이에 약간의 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외의 특정 생물학적 활성은 가지지 않을 것이다. 그러나, 링커의 구성성분 아미노산은 분자의 일부 특성, 예컨대, 폴딩, 순 전하 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, Y 링커는 공유 결합에 의해 D의 카르고 부분을 B의 펩티드 부분(즉, 전달 서열)에 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 에테르 결합, 티오에테르 결합, 아민 결합, 아미드 결합, 옥심 결합, 하이드라존 결합, 탄소-탄소 결합, 탄소-질소 결합, 탄소-산소 결합, 또는 탄소-황 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, Y 링커는 가요성이다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 강성이다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 선형 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 비선형 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 분지형 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 사이클릭 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, Y는 펩티드 결합을 포함한다. 펩티드 결합은 L-아미노산 및/또는 D-아미노산을 포함한다. 본 발명의 실시양태에서, 면역원성 및 배경 펩티다제 또는 프로테아제에 의한 비특이적 절단을 최소화하기 위해 D-아미노산이 바람직하다. 올리고-D-아르기닌 서열의 세포 흡수는 올리고-L-아르기닌의 것만큼 우수하거나, 그보다 더 우수한 것으로 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, Y 링커는 비절단가능한 링커이다.
일부 실시양태에서, Y 링커는 특정 조건 또는 특정 환경의 존재하에서의 절단을 위해 디자인된다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 세포내 프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, Y는 세포내 프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 리소좀 프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 세포내 프로테아제는 시스테인 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 세포내 프로테아제는 아스파르틸 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 세포내 프로테아제는 세린 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 시스테인 프로테아제는 카스파제, 카텝신, 칼파인, 파파인 또는 레구메인이다. 일부 실시양태에서, 세포내 프로테아제는 개시제 카스파제이다. 일부 실시양태에서, 세포내 프로테아제는 이펙터 카스파제이다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 카텝신 B, 카텝신 L, 카텝신 H, 카텝신 K, 카텝신 W, 카텝신 C, 카텝신 F, 카텝신 V, 카텝신 X, 카텝신 S, 카텝신 D, 카텝신 G, HCP-1, HCP-2, 디펩티딜-펩티다제 I, MEROPS C13, CED-3 펩티다제, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11; 카스파제 12, 카스파제 13, 및 카스파제 14 중에서 선택되는 프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 카텝신 B, 카텝신 L, 카스파제 3, 카스파제 7, 카스파제 8, 및 카스파제 9 중에서 선택되는 프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 카텝신 B 디펩티딜 카복시펩티다제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 링커는 P1 위치에 리신, 시트룰린, 또는 아르기닌 잔기, 및 P1' 위치에 큰 소수성 잔기를 갖는다.
일부 실시양태에서, Y 링커는 산성 민감성 화학적 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 산성 민감성 화학적 링커는 하이드라존 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 자가 희생적 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 희생적 스페이서의 길이는 SDM의 B 부분과 치료 카르고 사이의 입체 장애의 존재를 막는 데 충분한 길이이다. 일부 실시양태에서, Y는 p-아미노벤질 알콜(PABOH) 스페이서 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y는 p-아미노벤질 카보닐(PABC) 스페이서 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y는 분지형 비스(하이드록시메틸)스티렌(BHMS) 스페이서 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y는 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 또는 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서 Y는 2,6-비스하이드록시메틸-p-크레졸 또는 헤미티오아미날 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, Y 링커는 이작용성 링커를 포함한다. 일부 경우에서, 이작용성 링커는 제1 분자(예컨대, 선택적 전달 분자) 상의 기와 반응성인 한 작용기, 및 제2 분자(예컨대, 화상화 카르고) 상에서 반응성인 제2 작용기를 갖는다. 일부 경우에서, 이작용성 링커는 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커이다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 유도체화는 작용기를 제공하기 위해 수행된다. 따라서, 예를 들어, 펩티드 상의 유리 술프하이드릴 기 생성을 위한 방법 또한 공지되어 있다(미국 특허 제4,659,839호 참조). 링커는 대안적으로, 선택적 전달 분자와 상호작용할 수 있는 헤테로사이클릭 고리를 형성하는 2개 이상의 상이한 반응성 기를 포함하는 이종이작용성 가교제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이종이작용성 가교제, 예컨대, 시스테인은 아민 반응성 기를 포함할 수 있고, 티올 반응성 기는 유도체화된 선택적 전달 분자 상의 알데히드와 상호작용할 수 있다. 이종이작용성 가교제로 적합한 반응성 기의 추가 조합으로는 예를 들어, 아민 및 술프하이드릴 반응성 기; 카보닐 및 술프하이드릴 반응성 기; 아민 및 광반응성 기; 술프하이드릴 및 광반응성 기; 카보닐 및 광반응성 기; 카복실레이트 및 광반응성 기; 및 아르기닌 및 광반응성 기를 포함한다.
예시적인 동종이작용성 링커로는 로만트 시약 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(술포숙신이미딜 프로프리오네이트(DTSSP), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(술포숙신이미딜)수베레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디술포숙신이미딜 타르트레이트(술포 DST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜이미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴 할라이드 함유 화합물(DFDNB), 예컨대, 예로서, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠, 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐술폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술피드(BASED), 포름알데히드, 글루타르알데히드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디아이오도-p-크실렌 술폰산, N,N'-에틸렌-비스(아이오도아세트아미드), 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(아이오도아세트아미드)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 이종이작용성 링커로는 아민 반응성 및 술프하이드릴 가교제, 예컨대, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(술포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 술포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(술포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC), 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(술포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBs), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시술포숙신이미드 에스테르(술포-MBs), N-숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 술포숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(술포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 술포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(술포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMBs), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)술포숙신이미드 에스테르(술포-GMBs), 숙신이미딜 6-((아이오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((아이오도아세틸)아미노)헥산오일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 숙신이미딜 4-(((아이오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-((((4-아이오도아세틸)아미노)메틸)사이클로헥산-1-카보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 아이오도아세테이트(NPIA), 카보닐 반응성 및 술프하이드릴 반응성 가교제, 예컨대, 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH), 아민 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시술포숙신이미딜-4-아지도살리실산(술포-NHs-AsA), 술포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(술포-NHs-LC-AsA), 술포숙신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(술포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 술포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(술포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NOs), 술포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-술포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(술포-sADP), 술포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(술포-sAPB), 술포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 술포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(술포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 술프하이드릴 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(아이오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-아이오도아세트아미드, 벤조페논-4-말레이미드 카보닐 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, ρ-아지도벤조일 하이드라지드(ABH), 카복실레이트 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA), 및 아르기닌 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대, ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 링커 Y는 말레이미드 기를 포함한다. 일부 경우에서, 말레이미드 기는 또한 말레이미드 스페이서로서 지칭된다. 일부 경우에서, 말레이미드 기는 말레이미도카프로일(mc)을 형성하는 카프로산을 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 링커는 말레이미도카프로일(mc)을 포함한다. 일부 경우에서, 링커는 말레이미도카프로일(mc)이다. 다른 경우에, 말레이미드 기는 말레이미도메틸 기, 예컨대, 상기 기술된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC) 또는 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(술포-sMCC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 말레이미드 기는 자기 안정화 말레이미드이다. 일부 경우에서, 자기 안정화 말레이미드는 디아미노프로피온산(DPR)을 이용하여 말레이미드에 인접한 염기성 아미노 기를 도입하여 티오숙신이미드 고리 가수분해의 분자내 촉매작용을 제공하여 말레이미드에서 레트로-마이클 반응을 통해 제거 반응이 일어나지 못하게 한다. 일부 경우에서, 자기 안정화 말레이미드는 문헌 [Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)]에 기술된 말레이미드 기이다. 일부 경우에서, 링커는 자기 안정화 말레이미드를 포함한다. 일부 경우에서, 링커는 자기 안정화 말레이미드이다.
일부 실시양태에서, Y 링커는 리소좀에 의해 절단가능한 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 리소좀에 의해 절단가능한 디펩티드 Phe-Arg를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 리소좀에 의해 절단가능한 디펩티드 Phe-Lys를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 리소좀에 의해 절단가능한 디펩티드 Val-Cit(l-시트룰린)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 리소좀에 의해 절단가능한 테트라펩티드 Gly-Phe-Leu-Gly를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y 링커는 리소좀에 의해 절단가능한 테트라펩티드 Ala-Leu-Ala-Leu를 포함한다.
일부 실시양태에서, Y 링커는 리소좀에 의해 절단가능한 펩티드 및 자가 희생적 스페이서를 포함한다.
일부 실시양태에서, Y는 pH 민감성 링커이다. 일부 실시양태에서, Y는 산성 pH 조건하에서 절단된다. 일부 실시양태에서, Y는 리소좀의 산성 pH 조건하에서 절단된다.
본원에 개시된 Y 링커는 비표준 아미노산, 예컨대, 예를 들어, 하이드록시리신, 데스모신, 이소데스모신 또는 다른 비표준 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본원에 개시된 링커는 번역 후 변형된 아미노산, 예컨대, 예를 들어, 메틸화된 아미노산(예컨대, 메틸 히스티딘, 리신의 메틸화된 형태 등), 아세틸화된 아미노산, 아미드화된 아미노산, 포르밀화된 아미노산, 하이드록실화된 아미노산, 인산화된 아미노산 또는 다른 변형된 아미노산을 비롯한, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 링커는 또한 비펩티드 결합에 의해 연결된 부분, 및 비아미노산 부분에 의해 연결되거나, 비아미노산 부분에 연결된 아미노산을 비롯한 펩티드 모방체 모이어티도 포함할 수 있다.
추가 변형
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 선택적 전달 분자는 임의로 표지의 다원자가 및 친화력을 증가시키는 고분자량 분자에 접합된다. 일부 실시양태에서, 고분자량 분자는 수용성 중합체이다. 적합한 수용성 중합체의 예로는 펩티드, 당류, 폴리(비닐), 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카복실산) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리옥시알킬렌, 폴리시알산, 전분 또는 하이드록시에틸 전분이다. 펩티드를 수용성 중합체에 접합시키는 데 임의의 적합한 방법을 이용된다(문헌 [Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008] 참조).
비율계량 화상화를 위한 예시적인 선택적 전달 분자
도 1은 개시된 비율계량 형광 화상화 방법에 사용하기 위한 선택적 전달 분자(즉, SDM-25 또는 AVB-620)의 한 비제한적인 예의 구조를 보여주는 것이다. SDM-25는 (a) 관심 조직을 SDM-25와 접촉시키는 단계(예컨대, SDM-25를 개체에게 정맥내로 투여하는 단계), 및 (b) 화상화제 중 적어도 하나를 시각화하는 단계를 포함하는, 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 형광 공여체 및 수용체 모이어티(즉, 화상화제)(예를 들어, Cy5 및 Cy7)를 관심 조직으로 전달하는 형광 화상화 방법에서 사용된다.
도 2b는 공여체 및 수용체를 인접하게 유지시키고 있는 링커의 절단시의, Cy5/Cy7 공여체-수용체 쌍으로 표지된 비율계량 SDM-25에 대한 형광 방출 스펙트럼의 이동을 도시한 것이다. 무손상 프로브의 경우, 620 nm 광에 의해 여기되었을 때, Cy5 공여체 분자에 의해 흡수된 에너지의 Cy7 수용체로의 FRET 기반 전달은 대략 780 nm에서의 강한 형광 방출을 일으킨다. 절단시, 두 형광단의 분리는 FRET 기반 에너지 전달을 제거하여 780 nm에서의 Cy7 형광 방출을 감소시키고, 670 nm에서의 Cy5 형광 방출을 증가시킨다.
도 3a-도 3c는 인간 유방암 종양 조직 및 정상 조직에서 SDM-25(AVB-620)에 대하여 관찰된 상이한 절단율, 및 인간 유방암 조직의 비율계량 형광 화상화 기반 검출에서 SDM-25의 사용에 대한 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 도시한 데이터의 예를 제공하는 것이다. 도 3a: 25 개의 쌍별 인간 유방암 환자 조직 균질물에서의 SDM-25 절단율(분당 절단된 것의 nM). 암 양성 종양 조직(적색 다이아몬드 표시) 및 암 음성 인접한 조직(청색 삼각형 표시)이 제시되어 있다. 쌍별 샘플이 선으로 연결되어 있다. 쌍별 t 검정 결과, 종양과 정상 사이에는 P < 0.0001로 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다. 도 3b: 평균 ± 95% 신뢰 수준하의 동일한 데이터의 산점도. 도 3c: 본 도면은 정상 조직 대비 종양 조직의 SDM-25 절단율 검출에 대한 ROC 곡선을 보여주는 것이다.
도 3a-도 3b에 나타난 바와 같이, 정상적인 인간 유방 및 암성 인간 유방 조직 균질물을 Cy5/Cy7 표지된 SDM-25와 함께 인큐베이션시켰을 때, 효소 활성 및 SDM-25 절단은 정상적인 인간 유방 조직에 비하여 암성 인간 유방 조직에서 유의적으로 더 큰 것으로 관찰되었다.
도 4a-도 4b는 비악성 유방 조직 및 종양 균질물에서의 MMP 활성의 정량화를 위한 SDM-25의 사용을 도시한 데이터의 예를 제공하는 것이다. 도 4a: 그의 데이터가 도 3a-도 3c에 제시되어 있는 25명의 환자로부터 선택된 3 개의 대표적인 인간 유방암 샘플 및 쌍별 정상 조직으로부터의 균질물을 10% 젤라틴 지모그람에서 분석하였다. 재조합 활성 MMP2 및 MMP9는 표준으로서 제시되었다(레인당 2 ng). 도 4b: 도 4a에 제시된 3 개의 쌍을 포함하는, 5 개의 대표적인 인간 유방암 샘플(적색) 및 쌍별 정상 조직(청색)에서의 6 개의 MMP의 ELISA 정량화. 오차 막대는 표준 편차이다. ND = 검출불가.
일부 경우에서, 생물 표본에 Cy5/Cy7 표지된 SDM-25(또는 다른 비율계량 지시약)를 주입함으로써 높은 화상 조영비로 관심의 대상이 되는 생물학적 활성을 보이는 영역과, 그러한 활성을 보이지 않는 영역을 구별할 수 있다. 예를 들어, 생물 표본에 Cy5/Cy7 표지된 SDM-25(또는 다른 비율계량 지시약)를 주입함으로써 암과 상관관계가 있는 프로테아제 활성을 보이는 영역과, 그러한 활성을 보이지 않는 영역 사이에 적어도 1.25:1, 1.5:1, 1.75:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 20:1, 또는 그 초과의 형광 비율 화상 또는 형광 강도 화상 조영비를 제공할 수 있다.
사용 방법
상기 언급된 바와 같이, 개시된 비율계량 형광 지시약 및 화상화 방법은 내의, 관심의 대상이 되는 생물학적 활성을 보이는 영역을 검출 및/또는 시각화하는 데 사용될 수 있다. "생물 표본"의 예로는 "배양된 세포 샘플, 1차 세포 샘플(예컨대, 세포외 기질이 개별 세포로 유리되어 현탁액으로 분해 또는 용해된 조직 샘플), 혈액 샘플 또는 그의 분획, 생체외 조직 샘플(예컨대, 생검 샘플 또는 절제된 외과적 샘플), 생체내 조직 샘플(예컨대, 외과적 절차 동안 노출된 종양 조직 또는 변연부 조직) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생물 표본은 다양한 유기체, 예컨대, 원핵생물, 진핵생물, 진균, 식물, 동물, 또는 인간 중 임의의 것으로부터 수집될 수 있다. 일부 경우에서, 생물 표본은 환자 샘플이다. "생물학적 활성"의 예로는 이온 농도 또는 수송 활성 변화(예컨대, Ca2+ 이온 축적 또는 방출, 또는 국부 pH 변화), 흥분성 세포의 막전위 변화, 증진된 프로테아제 활성(예컨대, 세포외 프로테아제 활성) 부위, 비율계량 형광 지시약을 사용하여 모니터링되는 다른 생화학적 또는 생리적 프로세스의 변화, 또는 이들의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 검출 및 시각화하고자 하는 생물학적 활성은 각종 질환 상태, 예컨대, 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 암, 유방암, 전암, 악성 조직, 응고(혈액 응고), 염증, 또는 이들의 임의 조합과 상관관계가 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 비율계량 형광 지시약은 생체외 조직 샘플(예컨대, 생검 샘플 또는 절제된 외과적 샘플)에서 암을 검출 및 진단하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 개시된 비율계량 형광 지시약 및 화상화 방법은 관심 조직의 시각화를 필요로 하는 개체(예컨대, 환자)에서 관심 조직을 시각화하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 비율계량 화상화 방법은 (a) 비율계량 형광 지시약, 예컨대, 비율계량 ACPP, 예컨대, Cy5/Cy7 공여체-수용체 쌍으로 표지된 SDM-25를 개체에게 투여하는 단계, 및 (b) 형광성 종 중 적어도 하나를 시각화하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 비율계량 형광 지시약의 표적화된 전달은 의학 전문가가 특정 조직(예컨대, 암성 조직)을 시각화/화상화할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 관심 조직(예컨대, 암성 조직)을 제거(또는 외과 수술에 의해 절제)할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 관심 조직(예컨대, 암성 조직)을 제거(또는 외과 수술에 의해 절제)할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 수술 변연부를 감소시키면서, 관심 조직(예컨대, 암성 조직)을 제거(또는 외과 수술에 의해 절제)할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 종양/암성 조직을 제거(또는 외과 수술에 의해 절제)할 수 있게 하고, 종양/암성 조직 중 일부가 제거되지 않을 확률을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 종양/암성 조직을 최대로 감축시킬 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 암성 유방 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 불필요한 수술 및 재수술의 확률을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 암의 변연부(cancer margin) 상태는 수술중에 평가된다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 관심 조직(예컨대, 암성 조직)을 더욱 정확하게 샘플링(예컨대, 생검(예컨대, 절제 생검, 절개 생검, 흡입 생검 또는 바늘 생검))할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 건강한 조직을 함유하는 절제된 조직 내에서 특정 조직(예컨대, 암성 조직)을 시각화/화상화할 수 있게 한다. 표적 조직(예컨대, 암성 조직)의 확인의 가능은 병리학자를 병리학적 평가를 위해 조직 샘플을 절개할 위치로 가이드할 수 있고, 병리학자가 건강하지 않은 조직(예컨대, 암성 조직)을 누락시키고, 위음성을 나타낼 수 있는 건강한 조직을 샘플링할 확률을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 화학식 (II)의 화합물의 사용 후 제거된 조직(예컨대, 암성 조직)은 병리학 절편 또는 슬라이드를 제조하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 화학식 (II)의 화합물의 사용 후 제거된 암성 조직은 조직을 악성 또는 양성으로 진단하는 데에 사용되는 병리학 절편 또는 슬라이드를 제조하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 암성 유방 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 암을 정확하게 병기 분류하여 의학적 치료를 결정할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 암성 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 종양(암성 조직)의 크기 또는 암성 조직의 확산(예컨대, 전이성 병변)을 관찰할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직으로의 화상화제의 표적화된 전달은 의학 전문가가 효과적인 치료 요법을 디자인할 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 화상화제를 포함하는 화학식 (I)에 따른 선택적 전달 분자(예컨대, 형광 공여체-수용체 쌍으로 표지된 선택적 전달 분자)는 유도 수술에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 프로테아제 활성이 상향조절된 암성 또는 다른 병리학적 조직(예컨대, 염증 반응을 겪는 조직)에 우선적으로 국재화된다. 일부 실시양태에서, 화상화제를 포함하는 화학식 (I)에 따른 선택적 전달 분자는 암성 조직, 예컨대, 결장직장암을 제거하는 유도 수술에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자를 사용하는 유도 수술은 외과의가 건강한(즉, 비암성) 조직 조직을 가능한 적게 절제할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자를 사용하는 유도 수술은 외과의가, 외과의가 선택적 전달 분자의 부재하에 절제할 수 있을 암성 조직보다 더 많은 암성 조직을 시각화하고, 절제할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 수술은 형광 유도 수술이다.
일부 실시양태에서, 화상화제를 포함하는 화학식 (II)에 따른 선택적 전달 분자(예컨대, 형광 공여체-수용체 쌍으로 표지된 선택적 전달 분자)는 유도 수술에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자는 프로테아제 활성이 상향조절된 암성 또는 다른 병리학적 조직(예컨대, 염증 반응을 겪는 조직)에 우선적으로 국재화된다. 일부 실시양태에서, 화상화제를 포함하는 화학식 (II)에 따른 선택적 전달 분자는 암성 조직, 예컨대, 결장직장암을 제거하는 유도 수술에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자를 사용하는 유도 수술은 외과의가 건강한(즉, 비암성) 조직 조직을 가능한 적게 절제할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 선택적 전달 분자를 사용하는 유도 수술은 외과의가, 외과의가 선택적 전달 분자의 부재하에 절제할 수 있을 암성 조직보다 더 많은 암성 조직을 시각화하고, 절제할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 수술은 형광 유도 수술이다.
일부 실시양태에서, 관심 조직은 유방암 조직, 결장암 조직, 편평세포 암종 조직, 전립선암 조직, 흑색종 조직, 육종 조직, 갑상선암 조직, 결장직장암 조직, 피부암 조직, 난소암 조직, 암성 림프절 조직, 자궁경부암 조직, 폐암 조직, 췌장암 조직, 두경부암 조직, 또는 식도암 조직이다. 일부 실시양태에서, 관심 조직은 유방암 조직이다. 일부 경우에서, 관심 조직은 결장암 조직이다. 일부 경우에서, 관심 조직은 폐암 조직이다. 일부 경우에서, 관심 조직은 전립선암 조직이다.
일부 실시양태에서, 암은 AIDS 관련 암(예컨대, AIDS 관련 림프종), 항문암, 기저세포암종, 담관암(예컨대, 간외 담관암), 방광암, 골암(골육종 및 악성 섬유 조직구종), 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암(예컨대, 자궁암), 뇌실막종, 식도암, 안암(예컨대, 안구내 흑색종 및 망막아세포종), 위암(gastric cancer)(위암(stomach cancer)), 생식세포 종양(예컨대, 두개외, 생식샘외, 난소), 두경부암, 백혈병, 구순암 및 구강암, 간암, 폐암(예컨대, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평암종), 난소암, 췌장암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 신장암, 육종, 피부암, 소장암, 편평세포암, 고환암, 인후암, 갑상선암, 요도암, 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD: post-transplant lymphoproliferative disorder)이다.
일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 경우에서, 유방암은 침윤성 관 암종(IDC: invasive ductal carcinoma), 침윤성 소엽 암종(ILC: invasive lobular carcinoma), 유관 상피내암종(DCIS: ductal carcinoma in situ), 염증성 유방암, 소엽성 상피내암(LCIS: lobular carcinoma in situ), 남성 유방암, 유방암의 분자 아형, 유두 파제트병, 유방 엽상 종양, 및 전이성 유방암을 포함한다. 일부 경우에서, IDC는 유방의 관상 암종, 유방의 수질 암종, 유방의 점액성 암종, 유방의 유두상 암종, 및 유방의 사상형 암종으로 추가로 세분된다. 일부 경우에서, 유방암의 분자 아형은 루미날 A, 루미날 B, 삼중 음성/기저양, HER2 풍부, 또는 정상양 유방암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 림프암(예컨대, 림프종)이다.
일부 실시양태에서, 암은 B 세포 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 전구체 B 세포 암(예컨대, 전구체 B 림프아구성 백혈병/림프종) 및 말초 B 세포 암(예컨대, B 세포 만성 림프구성 백혈병/전구림프구성 백혈병/작은 림프구성 림프종(작은 림프구성(SL: small lymphocytic) NHL), 림프형질세포성 림프종/면역세포종, 맨텔 세포 림프종, 소포 중심 림프종, 소포성 림프종(예컨대, 세포학적 등급: I(소세포), II(혼합된 소세포 및 대세포), III(대세포) 및/또는 아형: 미만성 및 주로 소세포 유형), 저등급/소포성 비호지킨 림프종(NHL: non-Hodgkin's lymphoma), 중간 등급/소포성 NHL, 변연부 B 세포 림프종(예컨대, 림프절외(예컨대, MALT 타입 +/- 단핵구양 B 세포) 및/또는 림프절(예컨대, +/- 단핵구양 B 세포)), 비장 변연부 림프종(예컨대, +/- 융모 림프구), 모발 세포 백혈병, 형질세포종/형질세포 골수종(예컨대, 골수종 및 다발성 골수종), 미만성 거대 B 세포 림프종(예컨대, 원발성 종격(흉선) B 세포 림프종), 중간 등급 미만성 NHL, 버킷 림프종, 고등급 B 세포 림프종, 버킷 유사 고등급 면역아구성 NHL, 고등급 림프아구성 NHL, 고등급 비절단된 소세포 NHL, 벌키 질환 NHL, AIDS 관련 림프종 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증)이다.
일부 실시양태에서, 암은 T 세포 및/또는 잠정 NK 세포 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 전구체 T 세포 암(전구체 T 림프아구성 림프종/백혈병) 및 말초 T 세포 및 NK 세포 암(예컨대, T 세포 만성 림프구성 백혈병/전구림프구성 백혈병, 및 거대 과립 림프구 백혈병(LGL: large granular lymphocyte leukemia)(예컨대, T 세포 타입 및/또는 NK 세포 타입), 피부 T 세포 림프종(예컨대, 균상식육종/세자리(Sezary) 증후군), 비특정된 원발성 T 세포 림프종(예컨대, 세포학적 등급(예컨대, 중간 크기 세포, 혼합된 중간 세포 및 대세포), 대세포, 림프상피양 세포, 아위형 간비장 γδ T 세포 림프종, 및 피하 지방층염 T 세포 림프종), 혈관신생면역모세포성 T 세포 림프종(AILD: angioimmunoblastic T-cell lymphoma), 혈관신생중심성 림프종, 간질 T 세포 림프종(예컨대, +/- 장병증 관련), 성인 T 세포 림프종/백혈병(ATL: adult T-cell lymphoma/leukemia), 역형성 대세포 림프종(ALCL: anaplastic large cell lymphoma)(예컨대, CD30+, T 세포 및 널 세포 타입), 역형성 대세포 림프종, 및 호지킨 등)이다.
일부 실시양태에서, 암은 호지킨 질환이다.
일부 실시양태에서, 암은 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 암은 암은 만성 골수구성 I(과립세포성) 백혈병, 만성 골수성 및 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia), 급성 림프아구성 백혈병(ALL: acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 및 급성 골수구성 백혈병(예컨대, 골수아구성, 전구골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병)이다.
일부 실시양태에서, 암은 액형 종양 또는 형질세포종이다. 일부 실시양태에서, 암은 골수외 형질세포종, 고립 골수종 및 다발성 골수종이다. 일부 실시양태에서, 형질세포종은 다발성 골수종이다.
일부 실시양태에서, 암은 폐암이다.
일부 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 선암종이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 육종, 신경내분비 종양, 소세포암, 관암 또는 림프종이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 A 기 전립선암(상기 암은 직장 검사 동안 감지될 수 없음)이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 B 기 전립선암(즉, 종양이 전립선 내의 보다 많은 조직에 영향을 미치고, 직장 검사 동안 감지될 수 있거나 높은 PSA 수준 때문에 수행되는 생검에서 발견됨)이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 C 기 전립선암(즉, 암이 전립선 외부의 근처 조직까지 확산됨)이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 D 기 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 안드로겐 비의존적 전립선암(AIPC: androgen independent prostate cancer)이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 안드로겐 의존적 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 호르몬 요법에 대해 불응한다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 호르몬 요법에 대해 실질적으로 불응한다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 화학요법에 대해 불응한다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 전이성 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 개체는 전립선암과 연관된 유전자, 유전적 돌연변이 또는 다형성(예컨대, RNASEL/HPC1, ELAC2/HPC2, SR-A/MSR1, CHEK2, BRCA2, PON1, OGG1, MIC-1, TLR4, 및 PTEN)을 가지거나, 전립선암과 연관된 유전자의 하나 이상의 추가 카피를 갖는 인간이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 HER2 양성이다. 일부 실시양태에서, 전립선암은 HER2 음성이다.
일부 실시양태에서, 암은 전이되어 있고, 순환 종양 세포를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 관심 조직은 프로테아제 활성이 상향조절된 조직(예컨대, 염증 반응을 겪는 조직)이다.
약학 조성물
특정 실시양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 바와 같은 SDM 중 임의의 것을 포함하는 약학 조성물을 개시한다. 일부 실시양태에서, SDM을 포함하는 약학 조성물은 화학식 I 또는 화학식 II 중 임의의 것인 SDM 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본원의 약학 조성물은 약학적으로 사용되는 제제로의 활성 물질의 프로세싱을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용함으로써 제제화된다. 적절한 제제화는 선택된 투여 경로에 의해 좌우된다. 약학 조성물의 요약은 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975]; [Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)]에서 살펴볼 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제(들), 부형제(들) 또는 담체(들)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 다른 의약 또는 약제, 담체, 애주번트, 예컨대, 보존제, 안정화제, 습윤화제 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절용 염, 및/또는 완충제를 포함한다. 추가로, 약학 조성물은 또한 다른 치료적으로 가치있는 물질도 함유한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 약학 조성물은 비경구(정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 혈관내, 경막내, 유리체내, 주입 또는 국소) 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 투여 경로에 의해 피험체에게 투여된다.
근육내, 피하, 종양주위 또는 정맥내 주사에 적합한 제제는 생리학적으로 허용가능한 멸균 수성 또는 비수성 액제, 분산제, 현탁제 또는 에멀젼, 및 멸균 주사용 액제 또는 분산제으로 재구성되는 멸균 분제를 포함한다. 적합한 수성 담체 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예에는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 크레모포르 등), 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브유) 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트가 포함된다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산제의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 피하 주사에 적합한 제제는 또한 임의적 첨가제, 예컨대, 보존제, 습윤화제, 유화제 및 분산제도 함유한다.
정맥내 주사의 경우, 활성제는 임의로 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용가능한 완충제, 예컨대, 행크 용액, 링커 용액 또는 생리학적 식염수 완충제에서 제제화된다.
비경구 주사는 임의로 볼루스 주사 또는 연속 주입을 수반한다. 주사용 제제는 임의로 첨가된 방부제를 포함하는 단위 투여 형태, 예컨대, , 앰플 또는 다회 투약 용기 내에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 멸균 현탁제, 액제또는 에멀젼으로서 비경구 주사에 적합한 형태로 존재하고, 제제화제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유한다. 비경구 투여용 약학 제제는 수용성 형태의 활성제의 수용액을 포함한다. 추가로, 현탁제는 임의로 적절한 유성 주사 현탁제로서 제조된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 정확한 투여량의 1회 투여에 적합한 단위 투여 형태로 존재한다. 단위 투여 형태에서, 제제는 적절한 양의 본원에 개시된 활성제를 함유하는 단위 용량으로 분할된다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 상이한 양의 제제를 함유하는 포장물의 형태로 존재한다. 비제한적인 예는 포장된 정제 또는 캡슐제, 및 바이알 또는 앰플 내의 분제이다. 일부 실시양태에서, 수성 현탁 조성물은 1회 용량 재밀폐불가능한 용기 내에 포장된다. 대안적으로, 다회 용량 재밀폐가능한 용기가 사용되고, 이 경우, 전형적으로 보존제가 조성물에 포함된다. 오직 예로서만, 비경구 주사용 제제는 첨가된 보존제를 갖는 단위 투여 형태(앰플을 포함하나, 이에 제한되지 않음) 또는 다회 용량 용기 내에 제공된다.
일부 실시양태에서, 제공되는 SDM의 양은 인자, 예컨대, 특정 화합물, 피험체의 아이덴티티(예컨대, 중량), 투여 경로, 및 시각화가 요구되는 화합물의 지속 기간에 의존하여 달라진다. 예시적인 용량은 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 15 mg, 18 mg, 20 mg, 25 mg, 또는 30 mg을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 1 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 2 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 4 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 6 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 8 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 10 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 12 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 15 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 20 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 25 mg이다. 일부 경우에서, 피험체에게 투여되는 SDM의 용량은 30 mg이다.
일부 경우에서, SDM은 수술 전 약 30분 내지 약 24시간에 투여된다. 일부 경우에서, SDM은 수술 전 약 1시간 내지 약 22시간, 약 1시간 내지 약 20시간, 약 2시간 내지 약 22시간, 약 2시간 내지 약 20시간, 약 2시간 내지 약 18시간, 약 2시간 내지 약 16시간, 약 2시간 내지 약 14시간, 약 2시간 내지 약 12시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 2시간 내지 약 8시간, 약 4시간 내지 약 18시간, 약 4시간 내지 약 16시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 4시간 내지 약 8시간, 약 6시간 내지 약 20시간, 약 6시간 내지 약 18시간, 약 6시간 내지 약 12시간, 약 8시간 내지 약 18시간, 또는 약 8시간 내지 약 12시간에 투여된다. 일부 경우에서, SDM은 수술 전 약 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 또는 24시간에 투여된다.
일부 실시양태에서, SDM은 주입을 통해 피험체에게 투여된다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 또는 그 초과이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 20분이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 30분이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 40분이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 50분이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 1시간이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 50분이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 1.5시간이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 50분이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 2시간이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 50분이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 4시간이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 50분이다. 일부 경우에서, 주입 기간은 약 6시간이다.
형광 검출 및 화상화 시스템
다양한 형광 검출 장치 및 화상화 시스템 중 임의의 것이 본 개시내용의 화상화제, 예컨대, 비율계량 형광 지시약, 화상화 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 연구를 위해, 세포 기반 검정법을 수행하는 데 종래 분광형광계가 사용될 수 있다. 생체외 조직 샘플 화상화를 위해, 여기 및 방출 필터 및 하나 이상의 CCD 카메라로 이루어진 적절한 세트가 장착된 에피형광 현미경이 사용될 수 있다. 생체내 화상화 적용을 위해, 더욱 정밀화된 화상화 시스템이 사용될 수 있다. 예컨대, 결장경 검사와 같이, 전문화된 생체내 화상화 적용을 위해, 형광 화상이 2개(또는 2개 이상의) 방출 파장에서 수집될 수 있도록 허용하는 변형된 내시경이 사용될 수 있다.
일반적으로, 상기 형광 검출 및 화상화 시스템은 (i) 하나 이상의 여기 광원, (ii) 여기 및 방출 필터 세트(또는 파장 세팅 및 대역 통과를 조정하기 위한 다른 컴포넌트), (iii) 하나 이상의 검출기, 및 (iv) 광학 시스템을 통과함에 따라 전광 빔의 경로를 조작하기 위한 다른 광학 컴포넌트를 포함할 것이다. 일부 경우에서, 형광 검출 및 화상화 시스템은 하나 이상의 프로세서, 컴퓨터 데이터 저장(메모리) 컴포넌트, 오퍼레이팅 시스템 소프트웨어, 장치 제어 소프트웨어(예컨대, 화상 획득 소프트웨어), 및/또는 데이터 프로세싱 및 디스플레이 소프트웨어(예컨대, 화상 프로세싱 및 디스플레이 소프트웨어)를 추가로 포함한다.
도 5는 2 개의 상이한 카메라에서 2 개의 상이한 파장에서 형광 방출을 화상화하는 화상 스플리터 광학 컴포넌트(예컨대, 이색성 반사장치)를 이용하는 비율계량 형광 화상화 시스템의 한 비제한적인 예를 개략적으로 도시한 것이다. 예를 들어, 현미경 대물렌즈 주변의 환형 관원에 의해 제공된 여기광이 명시된 여기 파장에서 조직 샘플에 조사하는 데 사용된다. 방출된 형광은 광학 화상화 시스템에 의해 수집되고, 화상 스플리터 컴포넌트로 유도되고, 여기서 화상은 화상 스플리터의 방출 파장 컷오프에 따라 2 성분 화상으로 분리되고, 2 개의 상이한 카메라의 화상 센서 칩 상에서 따로따로 화상화된다. 일부 실시양태에서, 두 화상이 동시에 포착된다. 일부 실시양태에서, 두 화상이 순차적으로 포착된다.
아크 램프, 텅스텐 할로겐 램프, 레이저(예컨대, 아르곤 이온 레이저, 헬륨-네온(HeNe) 레이저 등), 다이오드 레이저, 발광 다이오드(LED: light emitting diode), 경량 엔지 등 또는 이들의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 광원 중 임의의 것이 여기 광원으로서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 형광 검출 또는 화상화 시스템은 적어도 하나의 광원, 적어도 2 개의 광원, 적어도 3 개의 광원, 적어도 4 개의 광원, 적어도 5 개의 광원 또는 그 초과의 광원을 포함한다.
여기 및 방출 필터 세트는 광학 유리 필터(예컨대, Schott 광학 필터), 장파장 통과형 필터, 단파장 통과형 필터, 간섭 필터, 이색성 반사장치, 노치 필터 등 또는 이들의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 광학 필터 중 임의의 것을 포함한다. 일부 경우에서, 여기 및/또는 방출 파장(또는 대역 통과)은 시스템의 광로에서 하나 이상의 광학 필터를 교체함으로써 세팅 및/또는 조정된다. 일부 실시양태에서, 여기 및/또는 방출 파장(또는 대역 통과)은 다른 컴포넌트, 예컨대, 회절 격자, 모노크로메이터, 음향광학 변조기, 조정식 액정 필터 등을 사용하여 세팅 및/또는 조정된다.
일부 경우에서, 형광 검출 또는 화상화 시스템을 위한 여기 또는 방출 파장 세팅은 독립적으로 조정되고, 약 350 nm 내지 약 900 nm 범위이다. 일부 경우에서, 여기 또는 방출 파장은 약 350 nm, 375 nm, 400 nm, 425 nm, 450 nm, 475 nm, 500 nm, 525 nm, 550 m, 575 nm, 600 nm, 625 nm, 650 nm, 675 nm, 700 nm, 725 nm, 750 nm, 775 nm, 800 nm, 825 nm, 850 nm, 875 nm, 또는 900 nm로 세팅된다. 당업자라면, 여기 또는 방출 파장은 예컨대, 약 620 nm와 같이, 상기 범위 내의 임의의 값으로 세팅될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 경우에서, 여기광 및 방출광의 대역폭은 독립적으로 조정되고, 언급된 여기 또는 방출 파장 ± 2 nm, ± 5 nm, ± 10 nm, ± 20 nm, ± 40 nm, ± 80 nm, 또는 그 초과로서 언급된다. 당업자라면, 여기 또는 방출 대역폭은 예컨대, 약 ± 55 nm와 같이, 상기 범위 내의 임의의 값으로 세팅될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
포토다이오드, 어발란체 포토다이오드, 포토다이오드 어레이, 광전자 증배관, CCD 또는 CMOS 화상 센서 및 카메라 등 또는 이들의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 검출기 및 화상 센서 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 형광 검출 또는 화상화 시스템은 적어도 하나의 검출기, 적어도 2 개의 검출기(예컨대, 2 개의 상이한 방출 파장에서의 형광 화상의 동시 포착을 위해), 적어도 3 개의 검출기, 적어도 4 개의 검출기, 적어도 5 개의 검출기 또는 그 초과의 검출기를 포함한다. 일부 광학 디자인에서, 형광 검출 또는 화상화 시스템은 예컨대, 화상 포착 단계 사이에 형광 방출 필터를 교체함으로써 2개(또는 2개 이상의) 상이한 방출 파장에서 순차적으로 형광 강도 화상을 포착하도록 구성된다. 일부 광학 디자인에서, 형광 검출 또는 화상화 시스템은 예컨대, 방출광 광로에 적절한 이색성 반사장치를 포함시키고, 각 방출 파장에 대해 상이한 검출기를 사용함으로써 2개(또는 2개 이상의) 상이한 방출 파장에서 동시에 형광 강도 화상을 포착하도록 구성된다.
형광 검출 및 화상화 시스템에서 사용될 수 있는 다른 광학 컴포넌트의 예로는 렌즈 또는 렌즈 시스템, 프리즘, 빔 스플리터, 미러, 광섬유, 색수차 보정을 위한 회절 광학계 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 컴포넌트는 당업자에게 공지된 다수의 광학 장치 중 임의의 것에서 광원, 여기 및 방출 필터(또는 파장 세팅 및 대역 통과를 조정하기 위한 다른 컴포넌트), 및 검출기와 함께 구성된다.
화상 프로세싱 알고리즘
본원에서는 또한 화상화된 생물 표본 내의 생물학적 활성을 검출하고, 시각화하는 것의 정확도를 개선시키기 위해 비율계량 형광 화상화 방법과 함께 사용하기 위한 화상 프로세싱 알고리즘도 개시한다. 형광 비율 화상 및 그 안의 관심 영역(ROI)을 생성하고, 디스플레이하기 위한 개시된 알고리즘을 통해 생물 표본 내의, 관심의 대상이 되는 특이적인 생물학적 활성 또는 구조를 보이는 부위에 상응하는 ROI를 자동, 반자동 또는 수동으로 확인할 수 있다. 일부 예에서, ROI는 형광 비율 화상으로부터 생성된다. 일부 예에서 ROI는 형광 비율 화상 및/또는 형광 강도 화상의 조합으로부터 생성된다.
도 6은 하드웨어 컴포넌트 및 소프트웨어 컴포넌트, 둘 모두를 포함하는 형광 화상화 시스템의 개략도를 제공하는 것이다. 상기 기술된 바와 같이, 일부 경우에서, 시스템의 하드웨어 컴포넌트는 화상 획득 하드웨어(예컨대, 상기 기술된 바와 같이, 광원, 여기 및 방출 필터 또는 등가물, 및 검출기) 뿐만 아니라, 하나 이상의 프로세서, 컴퓨터 저장 장치(메모리) 컴포넌트, 화상 디스플레이 컴포넌트, 다른 장치 제어 모듈(예컨대, 온도 제어 장치) 및/또는 통신 하드웨어를 포함한다. 일부 경우에서, 시스템의 소프트웨어 컴포넌트는 그 안에서 하나 이상의 화상 획득, 화상 프로세싱, 및/또는 화상 디스플레이 소프트웨어 모듈 뿐만 아니라, 다른 임의적 장치 제어 장치 및 통신 소프트웨어 모듈에 대한 프로그램화된 명령화가 실행되는 오퍼레이팅 시스템을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 개시된 비율계량 형광 화상화 방법의 일부 실시양태에서, 화상 프로세싱 소프트웨어 모듈의 명령어 세트 내에서 코딩되는 하나 이상의 화상 프로세싱 알고리즘은 분석된 화상 내의, 생물 표본 내의, 관심의 대상이 되는 특이적인 생물학적 활성 또는 구조를 보이는 부위에 상응하는 ROI의 자동, 반자동 또는 수동 확인을 가능하게 하는 데 사용된다.
도 7은 형광 비율 화상 및/또는 상응하는 형광 강도 화상 내의 높은 형광 비율 및/또는 형광 강도 값을 보이는 관심 영역(ROI)을 확인하는 데 사용된 화상 프로세싱 알고리즘을 도시한 것이다. 2 개의 상이한 방출 파장에서의 형광 강도 화상을 사용하여 형광 비율 화상을 계산한다. 일부 경우에서, 강도 화상은 비를 계산하기 전 화상을 포착하는 데 사용된 노출 시간이 감산되고/거나, 노출 시간으로 정규화된 배경이다. 각각의 형광 비율 및 형광 강도 화상에 대해, 비 또는 강도의 임계값의 값들을 사용하여 마스크 화상을 생성한다(즉, 원래의 화상이 임계값 이하인 비 또는 강도 값을 갖는 각 픽셀은 값 0으로 설정되고, 원래의 화상이 임계값 초과인 비 또는 강도 값을 갖는 각 픽셀은 값 1로 설정되는, 상응하는 이항 화상 파일). ROI는 논리 AND 연산을 실행하여 3 개의 마스크 화상을 조합함으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, 생성된 ROI는 임의로 ROI가 최소 크기 요건을 충족시키는지 확인하기 위해 (즉, ROI가 확실하게 생물학적 관련성이 있도록 하기 위해 단일 픽셀 잡음 또는 다른 검출 아티팩트를 제거하기 위하여) 평가된다. 최소 ROI 설정은 화상화 시스템의 광학 해상도와 관련이 있으며, 위양성 확인을 회피하기 위해 화상화 시스템의 해상도를 초과하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 전자동 방식으로 실행된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 반자동 방식으로 실행된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 수동 방식으로 실행된다. 일부 경우에서, ROI 내의 형광 비율 및/또는 형광 강도에 대한 평균 값을 측정함으로써 생물학적 활성을 정성적으로 측정할 수 있다. 일부 경우에서, ROI 내의 형광 비율 및/또는 형광 강도에 대한 평균 값을 측정함으로써 생물학적 활성을 정량적으로 측정할 수 있다.
도 10은 (i) 형광 비율 화상 및/또는 상응하는 형광 강도 화상 내의 높은 형광 비율 및/또는 형광 강도 값을 보이는 관심 영역(ROI)을 확인하고, (ii) 생물학적 활성에 대한 양성 또는 음성 예측이 화상을 제작하는 데 사용되는 비율계량 형광 지시약에 의해 표시되도록 하는 데 사용되는 화상 프로세싱 알고리즘을 도시한 것이다. 2 개의 상이한 방출 파장에서 형광 강도 화상(F1 및 F2)을 사용하여 형광 비율 화상을 계산한다. 일부 경우에서, 강도 화상은 비를 계산하기 전 화상을 포착하는 데 사용된 노출 시간이 감산되고/거나, 노출 시간으로 정규화된 배경이다. 일부 경우에서, 형광 비율 화상은 ROI의 검출에 사용된다. 일부 경우에서, 형광 비율 화상 및 두 형광 강도 화상 중 하나는 ROI의 검출에 사용된다. 일부 경우에서, 형광 비율 화상 및 두 형광 강도 화상 모두 ROI의 검출에 사용된다. 선택된 각각의 형광 비율 및/또는 형광 강도 화상에 대해, 비 및/또는 강도의 임계값의 값(들)을 사용하여 마스크 화상을 생성한다(즉, 원래의 화상이 임계값 이하인 비 또는 강도 값을 갖는 각 픽셀은 값 0으로 설정되고, 원래의 화상이 임계값 초과인 비 또는 강도 값을 갖는 각 픽셀은 값 1로 설정되는, 상응하는 이항 화상 파일). 형광 비율 화상 및 적어도 하나의 형광 강도 화상, 둘 모두가 사용되는 경우, ROI는 논리 AND 연산을 실행하여 2개 이상의 마스크 화상을 조합함으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, 생성된 ROI는 임의로 ROI가 최소 크기 요건을 충족시키는지 확인하기 위해 (즉, ROI가 확실하게 생물학적 관련성이 있도록 하기 위해 단일 픽셀 잡음 또는 다른 검출 아티팩트를 제거하기 위하여) 평가된다. 최소 ROI 설정은 화상화 시스템의 광학 해상도와 관련이 있으며, 위양성 확인을 회피하기 위해 화상화 시스템의 해상도를 초과하도록 선택된다. 입증된 ROI의 존재를 사용하여 연구 중인 생물 표본 내의 언급된 생물학적 활성에 대해 양성으로 예측한다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 전자동 방식으로 실행된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 반자동 방식으로 실행된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 수동 방식으로 실행된다. 일부 경우에서, ROI 내의 형광 비율 및/또는 형광 강도에 대한 평균 값을 측정함으로써 생물학적 활성을 정성적으로 측정할 수 있다. 일부 경우에서, ROI 내의 형광 비율 및/또는 형광 강도에 대한 평균 값을 측정함으로써 생물학적 활성을 정량적으로 측정할 수 있다.
도 11은 사용자가 선택한 ROI가 생물학적 활성에 대한 양성 또는 음성 예측이 화상을 제작하는 데 사용되는 비율계량 형광 지시약에 의해 표시되도록 하는 데 사용되는 화상 프로세싱 알고리즘을 도시한 것이다. 2 개의 상이한 방출 파장에서 형광 강도 화상(F1 및 F2)을 사용하여 형광 비율 화상을 계산한다. 일부 경우에서, 강도 화상은 비를 계산하기 전 화상을 포착하는 데 사용된 노출 시간이 감산되고/거나, 노출 시간으로 정규화된 배경이다. 일부 경우에서, 형광 비율 화상은 사용자가 선택한 ROI의 검출에 사용된다. 일부 경우에서, 형광 비율 화상 및 두 형광 강도 화상 중 하나는 사용자가 선택한 ROI의 검출에 사용된다. 형광 비율 화상 및 두 형광 강도 화상 모두 사용자가 선택한 ROI의 검출에 사용된다. 사용자가 선택한 ROI가 확인되는 각각의 형광 비율 및/또는 형광 강도 화상에 대해, 사용자가 선택한 ROI 내의 비 및/또는 강도 값의 평균 값을 계산하고, 형광 비율 및/또는 강도 임계값(들)과 비교하여 마스크 화상을 생성한다(즉, 원래의 화상이 임계값 이하인 비 또는 강도 값을 갖는 각 픽셀은 값 0으로 설정되고, 원래의 화상이 임계값 초과인 비 또는 강도 값을 갖는 각 픽셀은 값 1로 설정되는, 상응하는 이항 화상 파일). 2개 이상의 마스크 화상이 생성되는 경우, 이어서, 논리 AND 연산을 실행함으로써 마스크 화상을 조합하여 모든 임계값을 초과하는 ROI를 확인한다. 일부 실시양태에서, 생성된 ROI는 임의로 ROI가 최소 크기 요건을 충족시키는지 확인하기 위해 (즉, ROI가 확실하게 생물학적 관련성이 있도록 하기 위해 단일 픽셀 잡음 또는 다른 검출 아티팩트를 제거하기 위하여) 평가된다. 최소 ROI 설정은 화상화 시스템의 광학 해상도와 관련이 있으며, 위양성 확인을 회피하기 위해 화상화 시스템의 해상도를 초과하도록 선택된다. 입증된 ROI의 존재를 사용하여 연구 중인 생물 표본 내의 언급된 생물학적 활성에 대해 양성으로 예측한다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 전자동 방식으로 실행된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 반자동 방식으로 실행된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 수동 방식으로 실행된다. 일부 경우에서, ROI 내의 형광 비율 및/또는 형광 강도에 대한 평균 값을 측정함으로써 생물학적 활성을 정성적으로 측정할 수 있다. 일부 경우에서, ROI 내의 형광 비율 및/또는 형광 강도에 대한 평균 값을 측정함으로써 생물학적 활성을 정량적으로 측정할 수 있다.
도 12는 비율계량 형광 지시약이 주입된 생물 표본에서 생물학적 활성(예컨대, 암과 상관관계가 있는, 증진된 세포외 효소 활성)의 존재를 측정하는 데 있어 형광 비율 및/또는 강도 임계값의 가장 정확한 조합을 확인하는 데 사용된 화상 프로세싱 알고리즘의 한 비제한적인 예를 도시한 것이다. 2 개의 상이한 방출 파장에서 형광 강도 화상을 사용하여 복수의 생물 표본, 즉, 비율계량 형광 지시약이 주입된 조직 표본, 각각에 대한 형광 비율 화상을 계산한다. 일부 경우에서, 강도 화상은 비를 계산하기 전 화상을 포착하는 데 사용된 노출 시간이 감산되고/거나, 노출 시간으로 정규화된 배경이다. 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 형광 비율 임계값, 또는 이들의 임의 조합에 대한 출발 값이 제공되고; 각각의 생물 표본에 대하여, i) 화상 분석 알고리즘(예컨대, 도 7, 도 10, 또는 도 11에 도시된 알고리즘)을 사용하여 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합을 프로세싱하는 단계로서, 화상 분석 알고리즘은 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합을 사용하여 형광 비율 화상의 마스크 화상 및 형광 강도 화상(들)을 생성하고, 마스크 화상에 대해 AND 논리 연산을 실행하고, 2개 이상의 마스크 화상애 생성된 경우, 임의로, 언급된 형광 비율 또는 강도 임계값(들)을 초과하는 형광 비율 또는 강도 값을 보이는 임의의 검출된 관심 영역이 명시된 최소 크기보다 큰지 체크하고, 생물 표본을 언급된 생물학적 활성(예컨대, 암)에 대해 양성 또는 음성으로 분류하는 것인 단계; ii) 화상 분석 알고리즘에 의해 제공된 분류를 생물 표본에 대한 병리학적 검사 시험 결과와 비교하여 분류가 진양성, 위음성, 진음성, 또는 위양성인지의 여부를 결정하는 단계; 및 iii) 진양성, 위음성, 진음성, 또는 위양성 결과를 저장하는 단계를 반복한다. 이어서, 화상 프로세싱 알고리즘에 의해 모든 생물 표본이 음성인 것으로 분류될 때까지, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 형광 비율 임계값의 증가된 값을 이용하면서, 나머지 다른 임계값은 고정 상태로 유지시키면서, 상기 단계를 반복한다. 수신자 작동 특성(ROC) 곡선은 임상적 감도(또는 "진양성률") 대 (1 - 임상적 특이도)(또는 "위양성률")를 플롯팅하고, 이는 통상 진단 시험의 감도 및 특이도를 측정하는 데 사용된다. 수신자 작동 특성(ROC) 곡선은 형광 비율 및 강도 임계값의 값들의 각 세트에 대하여 저장된 분류 결과를 사용하여 계산되고; ROC 곡선하 면적을 형광 비율 및 강도 임계값의 값들의 각 세트에 대하여 비교하여 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합의 값에 대한 최적의 설정을 결정한다.
생물 표본 세트에 대한 병리학적 검사 데이터(또는 생물학적 활성의 다른 독립 측정값)와의 화상화 데이터의 비교에 기초하여 가장 정확한 임계값을 생성하기 위해, 한 임계값(즉, 형광 비율 임계값 또는 형광 강도 임계값)은 가변적인 반면, 이때, 나머지 다른 것(들)은 고정된다. 상이한 형광 비율 및/또는 강도 임계값에서의 화상 분석으로부터의 예측을 예를 들어, 병리학적 검사 결과와 비교함으로써 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 작성한다.
일부 실시양태에서, 알고리즘은 전자동 방식으로 실행된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 반자동 방식으로 실행된다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 수동 방식으로 실행된다.
본원에 기술된 알고리즘은 비율계량 형광 지시약을 사용하여 관심의 대상이 되는 생물학적 활성을 검출하는 개시된 비율계량 화상화 방법의 임상적(또는 비임상적) 감도(또는 "진양성률"), 특이도(또는 "진음성률"), 및 전체 예측 정확도 개선을 위해, 개별적으로 또는 조합하여 사용된다. 일부 경우에서, 감도는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 일부 경우에서, 특이도는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 당업자라면, 감도 및 특이도는 각각 개별적으로 상기 범위 내의 임의의 값을 가질 수 있고, 예를 들어, 감도는 92%일 수 있고, 특이도는 94%일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 경우에서, 감도 및/또는 특이도는 검출하고자 하는 생물학적 활성(또는 상관관계가 있는 질환 상태)의 유형에 의존한다. 예를 들어, 감도 및/또는 특이도는 검출되는 특정 암 유형에 따라 달라질 수 있다.
하기 기술된 실시예에서, 본원에 개시된 화상 프로세싱 알고리즘은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 개발된 공개 소스 이미지J(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 실행되었지만, 당업자가 이해하는 바와 같이, 이는 또한 다양한 다른 프로그래밍 언어(예컨대, C, C++, Java, Fortran, Lua, Visual Basic 등을 포함하나, 이에 제한되지 않음) 및 소프트웨어 패키지 (예컨대, Cell Profiler, Icy, LabVIEW, MatLab(Mathworks: 미국 매사추세츠주 네이킥 소재) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않음) 중 임의의 것을 사용하여 실행될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 화상 프로세싱 알고리즘은 잠재적으로는 더욱 빨리 실행되고, 컴퓨터 메모리를 덜 사용하고, 저렴한 프로세서로 실행될 수 있도록 하는 등 그러한 목적을 위해 알고리즘의 성능을 촉진시키는 커스텀 소프트웨어 코드를 이용하여 실행될 수 있다.
컴퓨터 시스템
하나 이상의 프로세서는 본원에 개시된 화상 프로세싱 방법 및 알고리즘을 실행하는 데 사용된다. 하나 이상의 프로세서는 하드웨어 프로세서, 예컨대, 중앙 처리 장치(CPU: central processing unit), 그래픽스 처리 장치(GPU: graphic processing unit), 범용 처리 장치, 또는 컴퓨팅 플랫폼을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 각종의 적합한 집적 회로, 마이크로프로세서, 로직 디바이스 등으로 구성될 수 있다. 비록 본 개시내용은 프로세서를 참조로 하여 기술되었지만, 다른 유형의 집적 회로 및 로직 디바이스 또한 적용가능하다. 프로세서는 임의의 적합한 데이터 연산 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, 프로세서는 512 비트, 256 비트, 128 비트, 64 비트, 32 비트, 또는 16 비트 데이터 연산을 실행할 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 싱글 코어 또는 멀티 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위해 구성된 복수의 프로세서일 수 있다.
하나 이상의 프로세서, 또는 형광 화상화 시스템 그 자체는 더욱 큰 컴퓨터 시스템의 일부일 수 있고/거나, 화상 데이터 및 예측 결과의 전송 및 공유가 용이하게 이루어질 수 있도록 통신 인터페이스 지원하에 컴퓨터 네트워크("네트워크")에 작동적으로 연결될 수 있다. 네트워크는 근거리 통신망, 인트라넷 및/또는 엑스트라넷, 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷일 수 있다. 일부 경우에서, 네트워크는 전기통신 및/또는 데이터 네트워크일 수 있다. 네트워크는, 일부 경우에서, 예컨대, 클라우드 컴퓨팅과 같이, 분산 컴퓨팅이 가능한 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 컴퓨터 시스템의 지원하의 네트워크는 컴퓨터에 연결된 장치가 클라이언트 또는 서버로서 가동될 수 있도록 하는 피어-투-피어식 네트워크를 실행할 수 있다.
컴퓨터 시스템은 또한 메모리 또는 메모리 위치(예컨대, 랜덤 액세스 메모리, 판독 전용 메모리, 플래쉬 메모리), 전자 저장 장치(예컨대, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과의 통신을 위한 통신 인터페이스(예컨대, 네트워크 어댑터), 및 주변 장치, 예컨대, 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함할 수 있다. 메모리, 저장 장치, 인터페이스 및 주변 장치는 예컨대, 마더보드 상에서 발견되는 것과 같은 통신 버스를 통해 하나 이상의 프로세서, 예컨대, CPU와 통신한다. 저장 장치(들)는 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 장치(들)(또는 데이터 저장소)일 수 있다.
하나 이상의 프로세서, 예컨대, CPU는 프로그램(또는 소프트웨어)로 구현된, 기계 판독 명령어 순서로 실행된다. 명령어는 메모리 위치에 저장된다. 명령어는 CPU로 지시되고, 이어서, 프로그램 또는 다른 것은 CPU가 본 개시내용의 방법을 실행하도록 설정한다. CPU에 의해 실행되는 연산의 예로는 페치, 해독, 실행, 및 라이트 백을 포함한다. CPU는 회로, 예컨대, 집적 회로의 일부일 수 있다. 시스템의 하나 이상의 다른 컴포넌트가 회로에 포함될 수 있다. 일부 경우에서, 회로는 특정 용도의 집적 회로(ASIC: application specific integrated circuit)이다.
저장 장치는 파일, 예컨대, 드라이브, 라이브러리, 및 저장된 프로그램을 저장한다. 저장 장치는 사용자 데이터, 예컨대, 사용자 지정 선호 및 사용자 지정 프로그램을 저장한다. 일부 경우에서, 컴퓨터 시스템은 예컨대, 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템과 통신하는 원격 서버에 위치하는 것과 같은, 컴퓨터 시스템 외부의 하나 이상의 추가 데이터 저장 장치를 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 화상 프로세싱 방법, 예컨대, 개시된 화상 프로세싱 알고리즘의 일부 측면은 컴퓨터 시스템의 전자 저장 위치에, 예컨대, 예를 들어, 메모리 또는 전자 저장 장치에 저장된 기계(예컨대, 프로세서) 실행 코드에 의해 실행된다. 기계 실행 또는 기계 판독 코드는 소프트웨어 형태로 제공된다. 사용시, 코드는 하나 이상의 프로세서에 의해 실행된다. 일부 경우에서, 코드는 저장 장치로부터 검색되고, 하나 이상의 프로세서에 의해 레디 액세스용 메모리에 저장된다. 일부 상황하에서, 전자 저장 장치는 방지되고, 기계 실행 명령어가 메모리에 저장된다. 코드가 프리컴파일링되고, 코드 실행을 위해 하나 이상의 프로세서가 적용된 기계를 이용한 사용을 위해 설정되거나, 실행 시간에 컴파일링될 수 있다. 코드는 코드가 프리컴파일링 또는 컴파일링 방식으로 실행될 수 있도록 선택된 프로그래밍 언어로 제공될 수 있다.
기술의 다양한 측면은 전형적으로 기계 판독 매체 타입으로 저장되는 기계(또는 프로세서) 실행 코드 및/또는 연관 데이터 형태로 "제품" 또는 "제조 물품"으로서 생각될 수 있다. 기계 실행 코드는 전자 저장 장치, 예컨대, 메모리(예컨대, 판독 전용 메모리, 랜덤 액세스 메모리, 플래쉬 메모리)에, 또는 하드 디스크에 저장된다. "저장" 타입 매체로는 컴퓨터, 프로세서 등의 임의의 또는 모든 유형 메모리, 또는 본원에 개시된 화상 프로세싱 방법 및 알고리즘을 코딩하는 소프트웨어에 대해 어느 시점에서든 비일시적인 저장을 제공할 수 있는, 그의 연관 모듈, 예컨대, 각종 반도체 메모리 칩, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등을 포함한다.
소프트웨어 모두 또는 그의 일부는 종종 인터넷 또는 각종의 다른 전기 통신 네워크를 통해 통신할 수 있다. 상기 통신은 예를 들어, 한 컴퓨터 또는 프로세서에서 또 다른 것으로의, 예를 들어, 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터에서 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로의 소프트웨어의 로딩을 가능하게 한다. 따라서, 소프트웨어 코딩된 명령어를 전달하는 데 사용되는 다른 타입의 매체로는 광학파, 전자파 및 전자기파, 예컨대, 로컬 장치 사이의 물리적 인터페이스 간에, 와이어 및 광학 지상 통신선 네트워크를 통해, 및 다양한 대기 링크에서 사용되는 것을 포함한다. 상기 파를 전달하는 물리적 요소, 예컨대, 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등도 또한 본원에 개시된 방법을 실행하기 위한 소프트웨어 코딩된 명령어를 전달하는 매체로 간주된다. 본원에서 사용되는 바, 비일시적인, 유형 "저장" 매체로 제한되지 않는 한, 예컨대, 컴퓨터 또는 기계 "판독 매체"라는 용어는 명령어를 실행 프로세서에 제공하는 데 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
컴퓨터 시스템은 전형적으로 예를 들어, 화상화 장치에 의해 포착된 화상을 제공하는 전자 디스플레이를 포함하거나, 또는 그와 통신할 수 있다. 디스플레이는 또한 전형적으로 사용자 인터페이스를 제공할 수 있다. UI의 예로는 그래픽 사용자 인터페이스(GUI: graphical user interface), 웹 기반 사용자 인터페이스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
실시예
본 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되는 것이며, 본원에서 제공되는 청구범위의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1 - 인간에서의 비율계량 화상화
연구 디자인: 수술을 받은 원발성, 비재발성 유방암을 앓는 여성에서 1상, 개방 표지, 용량 증량 연구의 일부로서 비율계량 화상화를 수행하였다. 본 연구는 1 mg의 용량으로 시작하는 3 + 3 코호트 확장 디자인을 사용하는 용량 증량 단계에 대한 5 개의 용량 코호트, 이어서, 각 용량 군에서 관찰되는 형광 및 안전성 데이터의 특징에 기초한 6번째의 추가 코호트를 포함하였다. 추가 코호트는 수술 및 화상화 이전에 상이한 SDM-25(AVB-620) 투여시 형광 특징을 비교하였다. 환자는 종괴 절제술/유방 절제술 및 감시 절 생검/겨드랑이 절개 수술을 받기 전 2 내지 20시간 전에 SDM-25를 주입받았다. 화상화 분석은 수술실로부터 입수한 화상 뿐만 아니라, 노출된 원발성 종양을 포함한 절제후 외과적 표본에 대해 수행하였다. 화상화 결과와 조직병리 데이터와의 상관관계를 알아보기 위해 병리 기록을 입수하였다. 정맥내(IV) 주입을 통해 SDM-25를 투여한 후, 이어서, 생리식염수를 플러싱하였다. 코호트 1 내지 4로 등록된 피험체는 외과적 절차 전 12 내지 20시간 전에 (이전일) 복강내(IP) 주사를 맞았다. 확장 코호트의 피험체는 외과적 절차 이전 2 내지 12시간 (동일) 또는 12 내지 20시간 (이전일) 전에 SDM-25를 받았다.
화상 포착: 화상화 시스템은 연구 스폰서에 의해 제공받았고, 이는 공간적으로 기록되는 3 개의 화상을 동시에 기록하는 3 카메라 시스템을 이용하였다. 첫 번째 것은 컬러 카메라이고, 나머지 다른 2 개의 카메라는 형광을 화상화하는 데 사용된다. 화상화 시스템은 4 개의 실시간 화상: 컬러 명시야 화상, Cy5 염료 형광 화상, Cy7 염료 형광 화상, 및 Cy5/Cy7 비-두 형광 화상으로부터 생성된 화상을 디스플레이한다. 배경 화상(여기광 전원이 꺼졌을 때)은 표본 화상화 이전에 촬영하였다. 화상 노출 시간을 용량에 따라 달리하였고, 카메라 센서의 동작 범위를 필링할 수 있도록 조정하였다. 생체내 화상은 초기 수술실, 잔류 종양 베드, 및 겨드랑이 내용물로부터 얻었다. 외과적 절제후, 원발성 종양, 변연부 표본 및 다 각도로 모든 림프절로부터 다수의 화상을 수집하였다.
화상 분석: 수술 후 절제된 조직의 저장된 화상을 분석하였다. Cy5 및 Cy7 화상에서 배경을 감산하였고, 이를 사용하여 Cy5/Cy7 비 화상을 생성하였다. 종양 영역(즉, 관심 영역(ROI))은 높은 형광 비율을 보이는 부위로서 확인되었다. 관심 조심을 함유하는 화상 부위만이 분석될 수 있도록 ROI를 이끌어 내었다. 정량화 및 코호트 간의 비교를 위해, 형광 강도 판독값을 노출 기간에 의해 정규화하였다. ROI로부터의 노출 보정된 형광 강도 값을 사용하여 최종 ROI 비 화상을 생성하였다.
ROI는 도 7에 제시된 바와 같이, 사용자 정의 임계값에 기초하여 자동으로 생성된다. 대안적으로, 사용자는 Cy5/Cy7 형광 비율 및/또는 강도에 기초하여 ROI를 수동으로 선택한다.
인간 조직 샘플의 병리 분석: 상이한 연구 사이트의 병리 부서에서는 지방 부처 프로토콜에 따라 외과 수술에 의해 절제된 조직을 연구하였다. 조직학적 분류(예컨대, 침윤성 관, 침윤성 소엽, 관 암종 등)를 비롯한, 종양 크기, 등급, 결절 상태에 대한 데이터 뿐만 아니라, 에스트로겐 수용체(ER: estrogen receptor), 프로게스테론 수용체(PR: progesterone receptor) 및 HER2 수용체 상태에 대한 데이터를 수집하였다. 최종 병리 보고서로부터의 데이터를 상기 기술된 화상 분석으로부터 도출된 결과에 매칭시킴으로써 화상화 및 병리의 상관관계를 나타내었다.
결과: 도 8a-도 8b에 제시된 바와 같이, 절제된 종괴 절제술 조직 및 림프절, 둘 모두에서, Cy5 및 Cy7 형광 강도, 둘 모두는 SDM-25 용량에 따라 증가하였다. 도 8a: 원발성 종괴 절제술 표본; 절제된 원발성 표본 조직 대 용량에 대한 평균 Cy5 및 Cy7 강도의 플롯. 값은 전체 절제된 표본으로부터 생성된 것이었다. 도 8b: 음성 림프절 패킷; 본 연구에서 각 코호트의 음성 림프절에 대한 평균 Cy5 및 Cy7 강도의 플롯. 값은 전체 절제된 표본으로부터 생성된 것이었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 오직 형광 비율 데이터만을 사용하였을 때, 악성 원발성 종양에 대한 형광 비율 데이터는 SDM-25 투약과 동일자 및 그 이전일, 둘 모두에서 인접한 조직에 대한 형광 비율 데이터와 유의적으로 상이하였다(도 9).
실시예 2 - 형광 임계값에 기초한 진단 방법
실시예 1에 기술된 바와 같이 수집된 원발성 표본 화상에 대해 Cy5/Cy7 형광 비율 및 Cy5 강도가 높게 나타난 부위를 선택함으로써 암이 발생할 수 있는 위치를 화상 분석 기반으로 예측하였다. 미국 국립보건원에 의해 개발된 공개 소스 이미지J 소프트웨어를 사용하여, 임계값의 값들 초과의 부위에 대한 최소 크기 측정과 함께 조합하여 Cy5/Cy7 비 임계값 및/또는 Cy5 강도 임계값 사용에 기초한 자동 예측을 생성하였다. 도 10에 제시된 프로세스는 화상 분석을 사용하여 ROI를 생성하였다. 대안적으로, 도 11에 제시된 바와 같이, 사용자가 선택한 ROI를 사용하여 Cy5/Cy7 형광 및/또는 Cy5 강도에 기초하여 예측을 생성할 수 있다. Cy5/Cy7 비 및/또는 Cy5 강도의 임계값이 주어진 경우, 양성 또는 음성을 예측할 수 있다. 도 11은 형광 비율 및 개별 강도 화상으로부터 ROI를 생성하는 프로세스를 개략적으로 나타낸 흐름도를 보여주는 것이다. 본 방법을 통해 형광 비율 임계값 및/또는 형광 비율 임계값 및 개별 형광 강도 임계값의 조합에 기초하여 화상 마스크가 생성된다. 이어서, 화상 마스크의 조합된 조합을 사용하여 ROI를 생성한다.
실시예 3 - 형광 비율 및 강도 값, 둘 모두를 이용한 진단 성능 개선
ROC 곡선 분석: 예측 정확도를 개선시키기 위한 목적으로 최적의 Cy5/Cy7 형광 비율 임계값, 개별 형광 강도 임계값, 및 조합된 형광 강도 및 비 임계값을 측정하는 데 수신자 작동 곡선(ROC) 분석을 사용하였다. ROC 곡선은 임상적 감도(또는 "진양성률") 대 (1 - 임상적 특이도)(또는 "위양성률")를 플롯팅하고, 이는 통상적으로 진단 시험의 임상적 감도 및 특이도를 측정하는 데 사용된다. 도 12의 흐름도에 제시된 바와 같이, 화상화된 조직 샘플이 암에 대하여 양성인지 또는 음성인지를 시험하는, 상기 기술된 화상 분석 예측을 이용하여 ROC 곡선을 작성하였다.
원발성 종양 예: 도 11 및 도 12에 제시된 바와 같이, 사용자가 선택한 ROI를 사용한 원발성 표본 화상의 화상 분석으로부터의 예측과, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 조직 절편의 병리학자 평가를 포함한, 최적 표준 병리 시험 결과를 비교함으로써 ROC 곡선을 작성하였다. ROI에서의 Cy5/Cy7 비 및 Cy5 강도를 상이한 임계값에서 비교하여 병리 예측을 생성하였다. 조합된 높은 형광 비율 및 높은 강도 부위(양성인 것으로 가정 - 예측 진양성 또는 위음성) 및 원발성 표본의 더 낮은 Cy5/Cy7 비 및 더 낮은 Cy5 강도 인접한 부위(음성인 것으로 가정 - 예측 진음성 또는 위양성)에 대한 임계값 기반 병리 예측으로부터 ROC 곡선을 작성하였다. 상기 가정은 병리학적 검사 시험과 일치하였다. 결과는 도 13a-도 13c에 제시되어 있으며, 이는 최고 예측 정확도(ROC 곡선에 대한 최고 "곡선하 면적"(AUC: area under the curve)는 Cy5/Cy7 형광 비율 및 Cy5 강도를 사용하였다는 것을 나타낸다(도 13c). 도 13a: 형광 비율 임계값을 달리함으로써 계산된 ROC 곡선. 모든 투약 시점(즉, 동일자, 이전일)에 대한 화상 데이터를 종합적으로 분석하였다. 곡선하 면적(AUC) = 0.86. 도 13b: 형광 강도 임계값은 값 I = 80으로 고정시키면서, 형광 비율 임계값을 달리함으로써 계산된 ROC 곡선; AUC = 0.98. 원래의 8 비트 강도 화상을 16 비트 화상으로 확장시켜 강도를 노출 500 ms로 정규화시켰다. 도 13c: 형광 비율 임계값은 값 R = 60으로 고정시키면서, 형광 강도 임계값을 달리함으로써 계산된 ROC 곡선(0 내지 255의 8 비트 화상 데이터 스케일 기준); AUC = 0.99. 이러한 경우, 최고 정확도는 형광 비율 및 강도 임계값 조합을 사용하였을 때 달성되었다.
림프절 예: 임계값이 주어진 경우, 조직이 양성인지 또는 음성인지를 예측하기 위해 도 7, 도 10, 및 도 12에 도시된 화상 분석 프로세스를 이용하여 림프절 샘플에 대하여 도 14a-도 14b에 제시된 ROC 곡선을 작성하였다. 도 14a: 형광 비율 임계값을 달리함으로써 계산된 ROC 곡선; 강도 임계값 I≥10으로 고정; AUC = 0.83. 도 14b: 형광 비율 임계값을 달리함으로써 계산된 ROC 곡선; 강도 임계값 I≥60으로 고정; AUC = 0.95. 이러한 경우, 최고 정확도는 형광 비율 및 강도 임계값 조합을 사용하였을 때 달성되었다.
ROC 곡선은 또한 개별 환자 수준에서 작성된다. 개별 환자에 대한 ROC 곡선은 도 15a-도 15c에 제시되어 있고, 이는 임계값이 주어진 경우, 조직이 양성인지 또는 음성인지를 예측하기 위해 도 7, 도 10, 및 도 12에 도시된 화상 분석 프로세스 작업 흐름을 이용하여 작성되었다. 화상화된 생체외 조직 샘플은 원발성 표본, 림프절, 및 변연부를 포함하였다. 도 15a: 개별 환자에 대한 형광 비율 임계값 ROC 곡선(형광 강도 임계값 I≥5로 고정), AUC = 0.85. 도 15b: 형광 강도 임계값 ROC 곡선(형광 비율 임계값 R≥5로 고정), AUC = 0.83. 도 15c: 개별 환자에 대한 조합된 형광 비율 및 형광 강도 ROC 곡선; 형광 강도 임계값이 I = 85로 고정되었을 때, 형광 비율 임계값은 증가하였고, AUC = 1.00. 이러한 경우, 최고 정확도는 역시 형광 비율 및 강도 임계값 조합을 사용하였을 때 달성되었다.
임상 연구: 수술 전(DBD) 8 mg의 SDM-25를 환자에 투약하였다. 화상화 및 분석 방법은 상기 기술된 방법에 기초하였다.
임상 연구로부터의 종괴 절제술 표면 및 변연부 쉐이브 (Margin Shave) 예: ROC 곡선은 임계값이 주어진 경우, 조직이 양성인지 또는 음성인지를 예측하기 위해 도 7, 도 10, 및 도 12에 도시된 화상 분석 프로세스를 수술 체강으로부터 채취된 절제된 종괴 절제술 표면 및 쉐이브 변연부 샘플에 대해 작성하였다. 모든 표본 및 표면 데이터는 병리학적 결과와 상관관계가 있었다. 정확도의 척도인, ROC 곡선하 면적(AUC) 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00001
표 1에 예시된 상기 두 조직 표본 모두에서, 최고 진단 성능 또는 정확도는 형광 비율 및 강도 임계값 조합을 사용하였을 때 달성되었다.
실시예 4 - 화상 디스플레이가 SDM -25를 투약받은 환자로부터 절제된 인간 유방암에서 암성 활성을 예측하였다.
본 방법의 목적은 수술중 또는 수술 전후에 암의 존재를 시각적으로 나타내고자 하는 것이었다. 본 연구로부터의 예시적인 화상은 도 16에 제시되어 있다. Cy5/Cy7 비 및 Cy5 강도가 특정 임계값의 값들을 초과하는 화상의 영역을 상기 기술된 방법을 사용하였고, 이는 녹색으로 나타났다. 주입 후 당일 촬영된 화상에 대해 사용된 것과는 상이한 Cy5/Cy7 비 임계값의 값들이 주입과 동시에 촬영된 화상에 대하여 사용되었다. 비 및 강도 임계값의 값들, 둘 모두 카메라로부터 생성된 0 내지 255의 픽셀 값의 8 비트 화상 디스플레이에 기초한다. Cy5 강도 임계값의 값들은 디스플레이 소프트웨어에서 Cy5 임계값 슬라이더를 이동시킴으로써 변환 없이 입력될 수 있다. 비 임계값의 값들(8 비트)을 (100 x (임계값/255)) 백분율(%)로 변환시키고, 소프트웨어 뷰어에서 슬라이더 표지된 배경을 이동시킴으로써 입력하였다. Cy5 강도 임계값의 값들을 노출 또는 강도차에 대해 보정하지 않았다.
실시예 5 - 화상 디스플레이가 SDM -25를 투약받은 환자로부터 절제된 원발 성 종괴 절제술 표본에서 암성 활성을 예측하였다.
양성 종괴 절제술 표면 변연부 예. 병리에 의해 암종에 대해 양성인 것으로 입증된 외과 수술에 의해 제거된 원발성 종괴 절제술 표본의 표면의 예시적인 화상이 도 19a-도 19b에 제시되어 있다. 상기 기술된 방법을 사용함으로써 이미지J 소프트웨어를 사용하여 Cy5/Cy7 비 및 Cy5 강도가 명시된 임계값의 값들을 초과하는 화상의 영역을 측정하였고, 이는 다시 옅은 회색으로 표시된다. 화살표 표시는 병리에 의해 입증된 암을 갖는, 표면 면에 상응하는 임계값을 초과하는 영역을 나타낸다. 본 실시예에서, 이미지J 소프트웨어를 사용하여 Cy5 강도 임계값의 값들을 노출에 대해 보정하였다.
도 19a 및 도 19b는 8 mg 용량의 SDM-25를 투여받은 환자로부터의 원발성 표본 화상의 표면 변연부의 예를 제공하는 것이며, 여기서 화상화는 주입 후 당일 수행되었다. 옅은 회색 영역은 R≥170인 Cy5/Cy7 형광 비율 임계값 및 I≥50인 Cy5 강도 임계값을 나타낸다. 화살표 표시는 병리에 의해 입증된 암을 갖는, 표면 면에 상응하는 임계값을 초과하는 영역을 나타낸다. 임계값의 값들은 기술된 방법을 사용하여 측정하였다.
실시예 6 - 마우스 유방암 모델에서의 비율계량 화상화
생체내 마우스 모델: 흑색종 모델에 대하여 기술된 방법의 의 변형법에 기초하여 화상화제 평가를 위해 사용된 림프계 및 경부 림프절 전이의 마우스 귀 종양 모델을 개발하였다(문헌 [Hoshida, et al. (2006), "Imaging Steps of Lymphatic Metastasis Reveals That Vascular Endothelial Growth Factor-C Increases Metastasis by Increasing Delivery of Cancer Cells to Lymph Nodes: Therapeutic Implications", Cancer Res. 66:8065-75]). ATCC로부터의 전이성 4T1 종양 세포(CRL-2539™)를 DPBS/마트리겔™(1:1 vol) 중에서 성장시키고, 현탁시킨 후, 케타민-크실라진 마취하에 암컷 BALB/c 마우스의 귀 연골 위의 우측 귓바퀴 상에 피하로 주사하였다(4 x 105 개의 종양 세포/50 mL/마우스). 귀 종양 성장 후, 암 세포의 림프절로의 이동에 의해 경부 림프절 전이가 일어났다. 귀 종양 세포 이식 후 17 내지 20일째의 귀 종양 보유 마우스(4T1 종양 모델)를 이용하여 SDM-25를 시험하였다. 종양 보유 마우스를 무작위로 선택하고, 회전식 꼬리 주사기(Braintree Scientific, Inc.: 미국 매사추세츠주 소재)를 사용하여 제지시키고, SDM-25 용액을 정맥내로(꼬리 정맥) 투약하였다 (60 μM SDM-25; 100 /~20 grams 마우스, 즉, 1.8 mg/kg(체중)). 투약 후, 각각의 종양 보유 마우스를 그의 지정된 하우징 케이지로 복귀시키고, 연구 전에 제어식 환경 조건하에서 유지시켰다(먹이 및 식수 임의 제공). 총 30마리의 4T1 종양 보유 마우스를 SDM-25 투여 후 3 h째(N=9) 및 6 h째(N=21)에 연구하였다.
화상화 방법 및 하드웨어: 케타민 HCl/크실라진 HCl(100 mg/kg 케타민 - 10 mg/kg 크실라진) 혼합물을 복강내로 투여하여 종말 방식으로 마취된 귀 종양 보유 마우스에서 원발성 종양 및 경부 림프절을 화상화하였다. 각 마우스는 동측(귀 종양쪽) 및 반대측 경부 림프절의 비절개 박리를 받았다. 수술 후, 6 개의 주요 시각적 표피 경부 림프절(동측 및 반대측 결절, 둘 모두)을 확인하였고, 생리 식염수(0.9% Sodium Chloride Irrigation USP, B. Braun Medical Inc.: 미국 캘리포니아주 어빈 소재)로 수분을 제공하고, 하마마츠(Hamamatsu)(Hamamatsu Photonics, K.K., Hamamatsu Photonics, K.K., Systems Division: 일본 시즈오카현 소재)로부터의 화상 획득용 HC이미지(HCIamge) 소프트웨어 시스템에 연결된 SZX10 형광 입체현미경(Olympus Optical, CO, Ltd.: 일본 도쿄 소재); 및 화상 획득용 스폿(Spot) 소프트웨어 5.0(SPOT™ Imaging Solutions: 미국 미시간주 스털링 하이츠 소재)과 접속된 맞춤형 나비타르 화상화 시스템(Navitar Imaging System)(Navitar Inc.: 미국 뉴욕주 로체스터 소재)을 포함하는 다양한 시스템을 이용하여 화상화하였다. 상기 언급된 형광 화상화 시스템 모두에 Cy5 형광단을 여기시키기 위한 ~630 +/- 20 nm에서 방출하는 LED 광원, 및 동일 시야의 Cy5 및 Cy7 강도 화상을 따로 포착하기 위한 2 개의 방출 필터를 장착하였다.
진단 형광 화상 분석: 귀 종양 보유 마우스에서 SDM-25 투여 후 경부 림프절을 화상화하고, 분석하였다. 각각의 종양 보유 마우스에 대해, 동측 및 반대측 경부 림프절, 둘 모두를 함유하는 Cy5 및 Cy7 형광 화상을 수집하고, 이를 사용하여 Cy5/Cy7 형광 비율 화상을 만들었다. 화상화 프로세싱 프로그램 이미지J를 이용하여 Cy5 화상을 Cy7 화상으로 나눔으로써 비 화상을 만들었다. 일부 경우에서, 디스플레이 목적으로 강도 가중 의사 색채 비 화상을 반사광 화상과 조합하였다. 각 경부 림프절에 대해 타원형 또는 다각형 관심 영역(ROI)을 이끌어 내고, ROI 중의 개별 평균값의 형광 강도를 측정하였다. 비가 연구된 림프절에서 균일하였다면, 이때, 전체 림프절을 ROI에 대해 사용하였다. 화상화된 경구 림프절 상의 더 높은 형광 비율을 갖는 (림프절 부위의 >5%여야 함) 명확하게 한정되는 영역으로서 정의되는 "핫스폿"이 존재한다면, 이때 분석을 위해 더 작은 핫스폿을 선택하였다. 각 ROI로부터 평균 Cy5/Cy7 형광 비율을 계산하였다.
비 화상을 디스플레이하기 위해, 하기 나타낸 바와 같이, 노출 보정된 Cy5 파장 형광 화상을 화상화된 노출 보정된 Cy7 방출 파장으로 나누고, 비 화상에 대한 값이 8 비트 동작 범위를 필링하고, 0 내지 255에 이르게 하기 위해 15를 곱하였다. 이어서, 각 강도 수준에 대해 지정된 RGB 값을 갖는 순람표를 사용하여 의사 색채화하였다. 화상에서 생성된 Cy5 또는 Cy7 파장 형광 화상에 의해 의사 색채 화상을 중복시켜 의사 색채 비 화상을 형광 강도에 대하여 스케일링하였고, 여기서 색조 또는 색상은 비를 나타내고, 밝기는 형광 강도를 나타낸다.
디스플레이 비 화상 값 = 15*(ICy5/TCy5)/(ICy7/TCy7)
여기서,
ICy5 = Cy5 파장 형광 화상 강도
ICy7 = Cy7 파장 형광 화상 강도
TCy5 = Cy5 노출 시간
TCy7 = Cy7 노출 시간.
계산된 형광 방출 비, 및 염색된 경부 림프절 절편의 H&E 분석으로부터 측정된 림프절 병리 상태(암 세포의 존재/부재)의 비교를 사용하여 임상적 감도 및 특이도를 평가하였다. 이어서, 양성 중 진양성 분율(진양성률) 대 음성 중 위양성 분율(위양성률)을 플롯팅하는 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 구성하여 SDM-25의 임상적 감도 및 특이도를 측정하였다. ROC 곡선 분석을 위해, 형광 방출 비에 대한 임계값의 값들에 기초하여 데이터를 양성 및 음성인 이항 분류로 나누었다.
화상화된 자궁경부암 감시 림프절로부터의 형광 방출 비 데이터 및 임계값의 값들에 기초한 예측을 화상화된 경부 림프절의 H&E 염색된 조직 절편을 사용하여 병리학자에 의해 측정된 암 세포의 존재(양성) 또는 부재(음성)와 비교함으로써 진양성, 위양성, 진음성, 및 위음성을 측정하였다.
(1, 1) 또는 모두 양성 내지 (0, 0) 또는 모두 음성인 전체 ROC 곡선을 수득하기 위해 임계값의 값들을 낮은 값에서부터 높은 값으로 점진적으로 조정하였다. 실제로, 데이터를 분류하고, 연구된 각 림프절에 대한 실제 비 값 바로 위의 임계값의 값들을 사용하여 ROC 곡선을 작성하였다. 불(Boolean) 논리를 사용하여 엑셀 스프레드시트를 이용하여 ROC 곡선 중 각 지점에 대해 진양성, 위음성, 진음성 및 위양성을 계산하였다. 감도는 진양성률로서 계산된 반면, 특이도는 1-위양성률로 계산되었다.
조직병리 : 화상화 후, 각 마우스를 종말 방식으로 마취시키고, 경부 림프절을 수거하고, 10% 완충처리된 포르말린 중에서 고정시켰다. 종말 방식으로 마취된 마우스를 심장내 케타민-크실라진 과다투약에 의해 바로 안락사시켰다. 밤새도록 포르말린에서 고정시킨 후, 형광/암 상관관계에 대해 평가하기 위해 경부 림프절을 조직학상 프로세싱하였다. 경부 감시 림프절의 파리핀 섹션(5 ㎛)을 수득하고, 지아겐(Zyagen: 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 히스토톡스 랩스, 인크.(HistoTox Labs, Inc.: 미국 콜로라도주 볼더)에 의해 수행된 통상의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 프로세싱하였다. 경부 림프절 조직 중의 전이성 암의 존재/부재에 관한 고전적 측정인, 외과적 병리 평가를 VA 샌디에고 헬쓰 케어 시스템(VA San Diego Health Care System: 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 공인 해부 및 임상 병리학자에 의해 수행하였다. H&E 염색된 경부 림프절 섹션을 니콘 이클립스 현미경(Nikon Eclipse Microscope)(Tochigi Nikon Precision Co., Ltd.: 일본 도키기 소재)을 이용하여 맹검 검사하였다. 표준 조직병리 기준을 적용하여 H&E 섹션 중 전이성 암 세포의 존재 또는 부재에 대해 측정하였다.
실시예 7 - 뮤린 전이성 림프절 모델에서의 생체내 진단 화상화
생체내에서 활성화될 수 있고, 림프절 중 유방암을 시각화할 수 있는 SDM-25의 능력을 평가하기 위해, 림프절 모델에서 뮤린 전이성 유방암을 사용하였다. 실험 프로토콜의 개략도가 도 17a-도 17d에 제시되어 있다. 면역능력이 있는 마우스의 귀에 암 세포를 이식하였고, ~2주 경과 후, 경부 림프절로 전이되었다(도 17a). SDM-25를 투여하고, 3-6 h 경과 후, 마우스를 마취시키고, 경부 림프절을 외과 수술에 의해 노출시키고, 화상화하였다(도 17b-도 17c). 마지막으로, 화상화된 림프절을 제거하고, H&E 병리 평가를 위해 프로세싱하고, 화상화 및 병리학적 결과를 비교하였다(도 17d). 제1 모델에서, 귓바퀴 상에 전이성 4T1 유방암 종양을 보유하는, 30마리의 암컷 BALB/c 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내로 SDM-25(6 nmol)를 투약하였다. 용량 범위 연구로부터 화상화 용량은 2 내지 24 nmol/마우스인 것으로 확립되었다. 6 nmol 용량은 악성 림프절과 비악성 림프절 사이에 Cy5/Cy7 형광 비율의 가장 큰 차이를 일으키고, 동시에 Cy5 및 및 Cy7 화상, 둘 모두에서 허용가능한 형광 강도 신호-대-배경을 여전히 제공하였다. 3-6 h 후 마우스의 등, 앞쪽 뷰 및 외과 수술에 의해 노출된 경부 림프절의 수술 전 형광 화상화를 수행하였다. 수술 전 화상은 귀에 이식된 원발성 종양을 나타낸다. 형광 비율 화상이 중첩 및 중첩되지 않은 대표적인 검은색 및 백색 화상이 도 18a에 제시되어 있다. 화상은 병리로 확인된 원발성 종양이 남은 노출된 신체와 비교하여 높은 Cy5/Cy7 형광 비율 및 강도를 갖는다는 것으로 보여준다. 수술 후, 60 개의 림프절의 형광 비율 화상을 분석하고, 최적 표준 H&E 조직병리 검사 결과와 비교하여 화상화 정확도를 평가하였고, 그 결과는 도 18b에 제시되어 있다. 6.7-7.4인 비 임계값을 사용하였을 때, 진단 감도 및 특이도는 각각 96% 및 100%였고, 이를 통해 98%인 최고 전체 정확도를 얻었다. 마우스 1마리로부터의 대표적인 화상은 도 18c에 제시되어 있다.
SDM-25 투약 후 1 내지 48 h에 유리 및 전이성 림프절 사이의 Cy5/Cy7 형광 비율 차이의 동적 성질 및 안정성을 평가하였다. 결과는 도 18d에 제시되어 있다. 1 h째에 유의적인 형광 비율 차이가 관찰되지만(p< 0.02, t 검정), 3-6 h째에 가장 크고, 24 h까지 안정적이다. 상기 유용한 시간창은 0.24 h인 마우스에서의 SDM-25 혈장 반감기보다 훨씬 더 크다. 48 h째에 비 차이는 여전히 유의적이지만(p<0.01, t 검정), 대개는 병발되지 않은 림프절에서의 Cy5/Cy7 비 증가에 기인하여 감소된다. 이러한 결과는, 2시간째에 최대 조영을 보이고, 24시간째에 악성 조직과 비악성 조직 사이에는 어떤 차이도 보이지 않는 것인 r9e9 비율계량 ACPP에 대해 관찰되는 것과 매우 상이하다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고, 기술되었지만, 상기 실시양태는 단지 예로서 제공되었다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 이에, 당업자는 본 발명으로부터 벗어남 없이 다수의 변형, 변경, 및 치환을 진행할 수 있을 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 점을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하고, 이러한 청구범위의 범주 내에 포함된 방법 및 구조 및 그의 등가물이 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (59)

  1. 생물 표본 중의 생물학적 활성 영역을 검출하는 방법으로서,
    a) 생물 표본을 생물학적 활성의 비율계량(ratiometric) 형광 지시약과 접촉시키는 단계;
    b) 제1 방출 파장에서 생물 표본의 제1 형광 강도 화상을 포착하고, 제2 방출 파장에서 생물 표본의 제2 형광 강도 화상을 포착하는 단계;
    c) 제1 형광 화상과 제2 형광 화상을 조합하여 형광 비율 화상을 생성하는 단계;
    d) 화상 분석 알고리즘을 이용하여 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합을 프로세싱하여 생물학적 활성 영역을 검출하는 단계로서, 화상 분석 알고리즘은
    i) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합을 이용하여, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합을 생성하고,
    ii) 단계 (i)에서 2개 이상의 마스크 화상이 생성된 경우, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 및 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 화상에 대해 AND 논리 연산을 수행하고,
    iii) 생물 표본을 생물학적 활성에 대해 양성 또는 음성인 것으로 분류하며, 여기서 분류는 단계 (i)에서 사용된 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 조합의 값을 초과하는 형광 비율 값 또는 형광 강도 값을 나타내는, 단계 (i)에서 사용된 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 조합 내의 관심 영역의 검출에 기초하고,
    iv) 임의로, 분류 결과를 컴퓨터 메모리에 저장하는 것인 단계
    를 포함하는, 생물 표본 중의 생물학적 활성 영역을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합 내의 관심 영역을 디스플레이하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 생물 표본은 시험관내 생물 표본 또는 생체내 생물 표본인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 생물 표본은 세포 샘플, 생체외 조직 샘플, 또는 생체내 조직 샘플인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 검출하고자 하는 생물학적 활성은 질환과 상관관계가 있는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 질환은 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 암, 전암(pre-cancer), 또는 염증인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 암은 유방암인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 검출하고자 하는 생물학적 활성은 악성 조직 또는 응고(혈액 응고)와 상관관계가 있는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)는 소정의 시간 간격으로 2회 이상 반복되어, 시간 경과에 따른 생물학적 활성의 변화를 모니터링하기 위한 일련의 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 및 형광 비율 화상을 제공하는 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 관심 영역의 디스플레이는 실시간으로 제공되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 관심 영역의 디스플레이는 외과적 절차를 가이드하기 위해 수술중 환경에서 외과의에 의해 사용되는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 제1 형광 강도 화상 및 제2 형광 강도 화상은 내시경을 사용하여 포착되고, 관심 영역의 디스플레이는 내시경의 위치 결정을 가이드하는 데 사용되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 비율계량 형광 지시약은, 절단가능한 링커에 의해 분리되어 있는 형광 공여체 모이어티 및 형광 수용체 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 형광 공여체 모이어티 및 형광 수용체 모이어티는 각각 Cy5 및 Cy7인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 결합을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 프로테아제는 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 또는 시스테인 프로테아제인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 비율계량 형광 지시약은 하기 화학식 (I)의 분자를 포함하는 것인 방법:
    [DA-cA]-A-[cM-M]-X-B-[cB-DB] 화학식 (I)
    상기 식에서,
    X는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이고,
    A는 5 내지 20 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이며,
    B는 5 내지 20 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고,
    cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 0 내지 1 개의 아미노산 잔기를 포함하며,
    M은 거대분자이고,
    DA 및 DB는 서로 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 수용체 및 공여체 형광성 모이어티이며;
    [cM-M]은 A 또는 X 상의 임의의 위치에 결합되고, [DA-cA]는 A의 임의의 아미노산 잔기에 결합되며, [cB-DB]는 B의 임의의 아미노산 잔기에 결합된다.
  18. 제17항에 있어서, A는 5 내지 9 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드인 방법.
  19. 제17항에 있어서, B는 7 내지 9 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드인 방법.
  20. 제17항에 있어서, A는 5 또는 9 개의 연속 글루타메이트 잔기를 포함하는 펩티드 서열이고, B는 8 또는 9 개의 연속 아르기닌 잔기를 포함하는 펩티드 서열인 방법.
  21. 제17항에 있어서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 D 아미노산, L 아미노산, α-아미노산, β-아미노산, 또는 γ-아미노산으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제17항에 있어서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 유리 티올 기를 갖는 임의의 아미노산, N 말단 아민 기를 갖는 임의의 아미노산, 및 하이드록실아민 또는 하이드라진 기와의 반응시 옥심 또는 하이드라존 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 임의의 아미노산으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 제17항에 있어서, cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 D-시스테인, D-글루타메이트, 리신, 및 파라-4-아세틸 L-페닐알라닌으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제17항에 있어서, X는 PLGLAG, PLG-C(me)-AG, RPLALWRS, ESPAYYTA, DPRSFL, PPRSFL, RLQLKL, 및 RLQLK(Ac)L로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  25. 제17항에 있어서, X는 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 또는 시스테인 프로테아제에 의해 절단가능한 것인 방법.
  26. 제17항에 있어서, DA 및 DB는 Cy5 및 Cy7인 방법.
  27. 제17항에 있어서, DA 및 DB는 Cy5 및 IR Dye750인 방법.
  28. 제17항에 있어서, DA 및 DB는 Cy5 및 IR Dye800인 방법.
  29. 제17항에 있어서, DA 및 DB는 Cy5 및 ICG인 방법.
  30. 제17항에 있어서, 화학식 (I)의 분자는 SDM-25인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 오직 형광 비율 임계값만이 마스크 파일의 생성에 이용되는 것인 방법.
  32. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 형광 강도 화상은 형광 비율 화상의 생성 이전에 화상 노출 시간에 의해 정규화되는 것인 방법.
  33. 제1항에 있어서, 관심 영역 내의 평균 형광 비율 또는 평균 형광 강도 값이, 관심 영역 중의 생물학적 활성의 정성적 또는 정량적 척도를 제공하는 것인 방법.
  34. 제1항에 있어서, 화상 프로세싱 알고리즘은, 검출된 관심 영역이 명시된 최소 크기보다 큰지 체크하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  35. 생물 표본의 비율계량 형광 화상에서 생물학적 활성 영역을 검출하는 데 사용되는 형광 비율 및 형광 강도 임계값의 자동화된 최적화 방법으로서,
    a) 복수의 생물 표본을 제공하는 단계;
    b) 각각의 생물 표본을 생물학적 활성의 비율계량 형광 지시약과 접촉시키는 단계;
    c) 각각의 생물 표본에 대하여, 제1 방출 파장에서 제1 형광 강도 화상을 포착하고, 제2 방출 파장에서 제2 형광 강도 화상을 포착하는 단계;
    d) 각각의 생물 표본에 대하여, 제1 형광 화상과 제2 형광 화상을 조합하여 형광 비율 화상을 생성하는 단계;
    e) 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 형광 비율 임계값, 또는 이들의 임의 조합에 대한 출발 값을 제공하는 단계; 및
    f) 각각의 생물 표본에 대하여,
    i) 화상 분석 알고리즘을 이용하여 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합을 프로세싱하고, 여기서 화상 분석 알고리즘은
    형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합을 이용하여, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합을 생성하고,
    이전 단계에서 2개 이상의 마스크 화상이 생성된 경우, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 및 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 화상에 대해 AND 논리 연산을 수행하고,
    임의로, 형광 비율 화상, 제1 형광 강도 화상, 제2 형광 강도 화상, 또는 이들의 임의 조합 내의 검출된 관심 영역이 명시된 최소 크기보다 큰지 체크하고, 여기서 검출된 관심 영역은 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합의 값을 초과하는 형광 비율 또는 형광 강도 값을 보이는 영역이고,
    관심 영역이 검출된 경우, 생물 표본을 생물학적 활성에 대하여 양성인 것으로 분류하거나, 또는 관심 영역이 검출되지 않은 경우, 생물 표본을 생물학적 활성에 대하여 음성인 것으로 분류하고;
    ii) 화상 분석 알고리즘에 의해 제공된 분류를 생물 표본에 대한 병리학적 검사 시험 결과와 비교하여, 분류가 진양성, 위음성, 진음성, 또는 위양성인지의 여부를 결정하고;
    iii) 컴퓨터 메모리에 진양성, 위음성, 진음성, 또는 위양성 분류 결과를 저장하는 것인 단계; 및
    g) i) 화상 프로세싱 알고리즘에 의해 모든 생물 표본이 음성인 것으로 분류될 때까지, 제2 형광 강도 임계값 및 형광 비율 임계값을 고정 상태로 유지시키면서, 제1 형광 강도 임계값의 증분식으로 증가된 값을 이용하거나, 또는
    ii) 화상 프로세싱 알고리즘에 의해 모든 생물 표본이 음성인 것으로 분류될 때까지, 제1 형광 강도 임계값 및 형광 비율 임계값을 고정 상태로 유지시키면서, 제2 형광 강도 임계값의 증분식으로 증가된 값을 이용하거나, 또는
    iii) 화상 프로세싱 알고리즘에 의해 모든 생물 표본이 음성인 것으로 분류될 때까지, 제1 형광 강도 임계값 및 제2 형광 강도 임계값을 고정 상태로 유지시키면서, 형광 비율 임계값의 증분식으로 증가된 값을 이용하여
    단계 (f)를 반복하는 단계;
    h) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 및 제2 형광 강도 임계값의 값들의 각 세트에 대한 저장된 분류 결과를 이용하여 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 계산하는 단계; 및
    i) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 및 제2 형광 강도 임계값의 값들의 각 세트에 대한 ROC 곡선하 면적을 비교하여 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합에 대한 최적 설정을 결정하는 단계
    를 포함하는, 생물 표본의 비율계량 형광 화상에서 생물학적 활성 영역을 검출하는 데 사용되는 형광 비율 및 형광 강도 임계값의 자동화된 최적화 방법.
  36. 제35항에 있어서, 생물 표본은 세포 샘플, 생체외 조직 샘플, 또는 생체내 조직 샘플인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 검출하고자 하는 생물학적 활성은 질환과 상관관계가 있는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 질환은 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 암, 전암, 또는 염증인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 검출하고자 하는 생물학적 활성은 악성 조직 또는 응고(혈액 응고)와 상관관계가 있는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 암은 유방암인 방법.
  41. 제35항에 있어서, 비율계량 형광 지시약은, 절단가능한 링커에 의해 분리되어 있는 형광 공여체 모이어티 및 형광 수용체 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 형광 공여체 모이어티 및 형광 수용체 모이어티는 각각 Cy5 및 Cy7인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 결합을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 프로테아제는 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 또는 시스테인 프로테아제인 방법.
  45. 제35항에 있어서, 비율계량 형광 지시약은 Cy5 및 Cy7로 표지된 SDM-25인 방법.
  46. 암에 대하여 비율계량 형광 화상화 기반 진단 시험을 수행하는 방법으로서,
    a) 생물 표본을 비율계량 형광 지시약과 접촉시키는 단계;
    b) 생물 표본에 제1 여기 파장의 여기광을 조사하는 단계;
    c) 제1 방출 파장에서 생물 표본의 제1 형광 강도 화상을 포착하는 단계;
    d) 후속적으로 또는 동시에, 제2 방출 파장에서 생물 표본의 제2 형광 강도 화상을 포착하는 단계; 및
    e) 제1 형광 강도 화상과 제2 형광 강도 화상을 조합하여 생물 표본의 형광 비율 화상을 생성하기 위한 화상화 소프트웨어를 제공하는 단계로서, 화상 프로세싱 알고리즘이, 암성 생물학적 활성과 상관관계가 있는 생물 표본의 형광 비율 화상 내의 관심 영역을 검출하거나 디스플레이하는 데 이용되는 것인 단계
    를 포함하는, 암에 대하여 비율계량 형광 화상화 기반 진단 시험을 수행하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 제1 형광 강도 화상 및 제2 형광 화상은 형광 비율 화상의 생성 이전에 화상 노출 시간에 의해 정규화되는 것인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 화상 프로세싱 알고리즘은 암성 생물학적 활성과 상관관계가 있는 관심 영역을 검출하기 위해, 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합의 사용을 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 화상 프로세싱 알고리즘은 (i) 형광 비율 임계값, 제1 형광 강도 임계값, 제2 형광 강도 임계값, 또는 이들의 임의 조합을 이용하여, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합을 생성하는 단계, (ii) 단계 (i)에서 2개 이상의 마스크 화상이 생성된 경우, 형광 비율 화상의 마스크 화상, 제1 형광 강도 화상의 마스크 화상, 제2 형광 강도 화상의 마스크 화상, 또는 이들의 임의 조합에 대해 AND 논리 연산을 수행하는 단계, (iii) 임의로, 검출된 관심 영역이 명시된 최소 크기보다 큰지 체크하는 단계, 및 (iv) 관심 영역이 검출된 경우, 생물 표본을 암성 활성에 대하여 양성인 것으로 분류하거나, 또는 관심 영역이 검출되지 않은 경우, 생물 표본을 암성 활성에 대하여 음성인 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  50. 제46항에 있어서, 비율계량 형광 지시약은 하기 화학식 (I)의 분자인 방법:
    [DA-cA]-A-[cM-M]-X-B-[cB-DB] 화학식 (I)
    상기 식에서,
    X는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 링커이고,
    A는 5 내지 20 개의 산성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이며,
    B는 5 내지 20 개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하는 서열을 갖는 펩티드이고,
    cA, cB, 및 cM은 각각 독립적으로 0 내지 1 개의 아미노산 잔기를 포함하며,
    M은 거대분자이고,
    DA 및 DB는 서로 형광 공명 에너지 전달을 수행할 수 있는 한 쌍의 수용체 및 공여체 형광성 모이어티이며;
    [cM-M]은 A 또는 X 상의 임의의 위치에 결합되고, [DA-cA]는 A의 임의의 아미노산 잔기에 결합되며, [cB-DB]는 B의 임의의 아미노산 잔기에 결합된다.
  51. 제50항에 있어서, 비율계량 형광 지시약은 Cy5 및 Cy7로 표지된 SDM-25인 방법.
  52. 제46항에 있어서, 암성 생물학적 활성은 흑색종, 비흑색종 피부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 림프절암, 갑상선암, 신경교종암, 위장관암, 또는 육종과 연관된 것인 방법.
  53. 제46항에 있어서, 환자가 비율계량 형광 지시약을 주입받고, 본 방법은 절제후 외과적 표본에서 유방암을 검출하는 데 이용되는 것인 방법.
  54. 제46항에 있어서, 암 진단에 대한 임상적 감도가 70% 초과인 방법.
  55. 제46항에 있어서, 암 진단에 대한 임상적 특이도가 70% 초과인 방법.
  56. 제46항에 있어서, 환자가 비율계량 형광 지시약을 주입받고, 본 방법은 외과적 절차를 가이드하기 위해 수술중에 이용되는 것인 방법.
  57. 제46항에 있어서, 진단 또는 치료 결정을 하기 위해 의사 또는 의료 제공자에 의해 이용되는 시험 결과를 제공하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 시험 결과는 본 방법이 수행된 위치로부터 의사 또는 의료 제공자의 위치로 전달되는 것인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 변연부 상태가 수술중에 평가되는 것인 방법.
KR1020197033078A 2017-04-07 2018-04-05 비율계량 형광 화상화 방법 KR20190128746A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762483004P 2017-04-07 2017-04-07
US62/483,004 2017-04-07
PCT/US2018/026336 WO2018187629A1 (en) 2017-04-07 2018-04-05 Ratiometric fluorescence imaging methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190128746A true KR20190128746A (ko) 2019-11-18

Family

ID=63712695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197033078A KR20190128746A (ko) 2017-04-07 2018-04-05 비율계량 형광 화상화 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11293868B2 (ko)
EP (2) EP3876196A1 (ko)
JP (2) JP2020519851A (ko)
KR (1) KR20190128746A (ko)
CN (1) CN110741242B (ko)
EA (1) EA201992252A1 (ko)
WO (1) WO2018187629A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110741242B (zh) 2017-04-07 2023-07-07 艾维拉斯生物科学公司 比率荧光成像方法
EP3907497B1 (en) * 2020-05-08 2023-08-02 Leica Microsystems CMS GmbH Apparatus and method for displaying and/or printing images of a specimen including a fluorophore
EP4211468A2 (en) * 2020-09-11 2023-07-19 Glympse Bio, Inc. Ex vivo protease activity detection for disease detection/diagnostic, staging, monitoring and treatment
WO2022056642A1 (en) * 2020-09-18 2022-03-24 Stryker European Operations Limited Systems and methods for fluorescence visualization
WO2022081438A1 (en) * 2020-10-13 2022-04-21 Avelas Biosciences, Inc. Methods of using selective delivery molecules
CN112432934B (zh) * 2020-11-05 2021-07-06 北京中科生仪科技有限公司 发射光检测方法
WO2022147423A1 (en) * 2020-12-30 2022-07-07 Stryker Corporation Systems and methods of dual fluorophore ratiometric imaging
CN115575358B (zh) * 2021-06-21 2024-05-24 北京大学 一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法
CN113896708B (zh) * 2021-10-29 2024-03-12 南京碳硅人工智能生物医药技术研究院有限公司 甲醛荧光探针的设计、合成及活性研究
DE102021134368B4 (de) 2021-12-22 2023-09-21 Hochschule Reutlingen Körperschaft des öffentlichen Rechts Vorrichtung und Verfahren zur Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit
CN114533148B (zh) * 2022-02-15 2023-06-16 佳木斯大学 一种消化内科用于胃癌检测的取样系统

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4496542A (en) 1981-03-30 1985-01-29 Usv Pharmaceutical Corporation N-substituted-amido-amino acids
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
JP2001017379A (ja) * 1999-07-09 2001-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd 蛍光診断装置
WO2004005895A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Medispectra, Inc. Methods and apparatus for characterization of tissue samples
JP4568840B2 (ja) 2004-12-28 2010-10-27 国立大学法人金沢大学 アルツハイマー病の検査方法
US8078265B2 (en) 2006-07-11 2011-12-13 The General Hospital Corporation Systems and methods for generating fluorescent light images
JP5487534B2 (ja) * 2007-04-20 2014-05-07 株式会社ニコン 画像解析方法と、蛍光検出装置
US8492734B2 (en) * 2007-10-19 2013-07-23 Visen Medical, Inc. Imaging systems featuring waveguiding compensation
US20090226059A1 (en) * 2008-02-12 2009-09-10 Richard Levenson Tissue Processing And Assessment
JP5338573B2 (ja) * 2009-08-31 2013-11-13 ソニー株式会社 蛍光像取得方法、蛍光像取得装置及び蛍光像取得プログラム
ES2683377T3 (es) 2011-07-29 2018-09-26 Avelas Biosciences, Inc. Moléculas de suministro selectivo y métodos de uso
WO2013148458A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-03 Clarient Diagnostic Services, Inc. Methods for generating an image of a biological sample
WO2016049756A1 (en) * 2014-09-29 2016-04-07 Novadaq Technologies Inc. Imaging a target fluorophore in a biological material in the presence of autofluorescence
US10385380B2 (en) * 2014-10-02 2019-08-20 The Regents Of The University Of California Personalized protease assay to measure protease activity in neoplasms
SG11201701558WA (en) * 2015-03-19 2017-09-28 Histoindex Pte Ltd Method of detecting fibrous tissue in a biological specimen using co-localized images generated by second harmonic generation and two photon emission
CN108369734B (zh) * 2015-12-10 2022-04-26 凯杰有限公司 数字图像中的对象分类方法、系统及计算机可读介质
US10279585B2 (en) * 2017-01-31 2019-05-07 Xerox Corporation Method and system for aligning ejectors that eject clear materials in a printer
CN110741242B (zh) 2017-04-07 2023-07-07 艾维拉斯生物科学公司 比率荧光成像方法
US10724956B1 (en) * 2019-02-01 2020-07-28 Essen Instruments, Inc. Spectral unmixing

Also Published As

Publication number Publication date
US20200150041A1 (en) 2020-05-14
JP2023102271A (ja) 2023-07-24
WO2018187629A1 (en) 2018-10-11
CN110741242A (zh) 2020-01-31
EP3610243A1 (en) 2020-02-19
US11293868B2 (en) 2022-04-05
EP3610243A4 (en) 2020-12-16
EA201992252A1 (ru) 2020-04-02
EP3876196A1 (en) 2021-09-08
JP2020519851A (ja) 2020-07-02
CN110741242B (zh) 2023-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110741242B (zh) 比率荧光成像方法
US9999687B2 (en) Fluorescent imaging agents
US9695251B2 (en) Activatable cell penetrating peptides with quenched fluorophores
Gao et al. Fluorescent chemical probes for accurate tumor diagnosis and targeting therapy
ES2861528T3 (es) Colorantes del NIR dirigidos al PSMA y sus usos
CA3128911C (en) Selective delivery molecules and methods of use
US20040022731A1 (en) In vivo imaging of apoptosis
CN110199195B (zh) Psma靶向的nir染料及其用途
US20100267928A1 (en) Activatable diagnostic and therapeutic compound
JP2018521994A (ja) 治療用ペプチドおよびそれらの使用方法
KR20150128103A (ko) 엽산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물
CN107847554A (zh) 治疗性肽及其使用方法
Nagai et al. Design of a dendrimer with a matrix metalloproteinase-responsive fluorescence probe and a tumor-homing peptide for metastatic tumor cell imaging in the lymph node
JP2023510016A (ja) フルオロフォア標識ｕｐａｒ標的化ペプチドコンジュゲートを含む組成物
Uddin et al. Rational design of peptide ligands based on knob–socket protein packing model using CD13 as a prototype receptor
EP3999123A1 (en) A receptor-targeting conjugate with an effective pharmacokinetic profile
EP4277667A1 (en) Methods and compositions for visualizing a ureter in a surgical procedure

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right