KR20190124268A - Nk 세포의 골수 호밍을 개선시키는 pm21 입자 - Google Patents
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Abstract
본원에 기재된 것은 NK 세포를, PM21 입자의 사용을 통해 골수로 지시하기 위한 조성물 및 방법이다.
Description
본 출원은 2017년 2월 28일자로 출원된 미국 가특허출원 62/464,747호의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
입양 천연 킬러 (NK) 세포 치료요법은 골수 악성 종양에 대한 것을 포함하는 전망있는 신규 중재법이다. 따라서, 입양적으로 사용될 NK 세포의 트래피킹 (trafficking)의 효율은 매우 중요하다. 요구되는 것은 NK 세포를 골수로 효율적으로 트래피킹할 수 있는 방법이다.
본 발명의 개요
본원에 개시된 것은 NK 세포를 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포 (feeder cell)와 접촉시킴을 포함하는, NK 세포를 골수로 트래피킹하는 것과 관련된 방법 및 조성물이다. 하나의 양상에서, 상기 방법은 NK 세포를 IL-2, IL-12, IL-18, 및/또는 IL-18로 자극시킴을 추가로 포함할 수 있다.
또한 본원에 개시된 것은 NK 세포를 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 접촉시키고 입양적으로 NK 세포를 대상체에 전달함을 포함하는, 골수 악성 종양 또는 골수 유래 악성 종양 (bone marrow born malignancies)을 치료하고/하거나 바이러스 감염 (예를 들어, 골수지향 바이러스 감염 또는 골수에 악영향을 미치는 바이러스 감염을 포함하는 골수 관련 바이러스 감염)을 치료하는 방법이다. 일부 양상에서, PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 NK 세포의 접촉은 NK 세포의 환자로의 전달 전에 일어날 수 있다. 또 다른 양상에서, PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 NK 세포의 접촉은 환자에서 일어날 수 있다.
본 명세서에 포함되어 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 다양한 구현예를 예시하며, 상세한 설명과 함께 기재된 조성물 및 방법을 도해한다.
도 1은 PM-21 입자가 세포독성 NK 세포를 효율적으로 그리고 선택적으로 확장시킴을 보여준다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 백혈구 공급원으로부터 단리하였고 10% FBS, 2 mM Glutamax 및 50 U/mL IL-2가 보충된 SCG에서 0.1 x 106 NK 세포/mL로 씨딩하였다. PBMC는 27일 동안 200 μg/mL로 PM15 (□, 검정) 또는 PM21 (○, 청색) 입자를 사용하여 자극하였고, 세포 내용물은 2 내지 3일 마다 시험하였고 NK 세포 확장 (A) 및 현탁 세포의 백분율 (B)의 상대적 배수를 나타낸다. PM21-입자 (825 ± 188 배수, N=13, 4 공여자) (청색)는 NK 세포 확장 (C)에 대해 14일 데이터의 누적 분석을 기반으로, PM15-입자 (425 ± 71, N=35, 9 공여자) (검정)와 비교하여 NK 세포 확장에 대해 보다 효율적이다. 차도 중에 있는 3명의 AML 환자로부터 단리된 PBMC는 14일 동안 PM21-입자 (200 μg/mL)로 배양하고, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 50 U/mL IL-2와 함께 SCGM 중에 0.5 x 106 NK 세포/mL로 씨딩하였다. 1차 PBMC (D) 및 림프구 내용물 (E) (CD56+CD3- NK 세포 (●, 적색), CD56-CD3+ T 세포 (■, 청색) 및 CD56+CD3+ NKT 세포 (▲, 검정))로부터의 NK 세포 확장의 배수를 나타낸다. 환자 F021로부터의 PBMC는 16일 동안 이전에 상기된 바와 같이 배양고 동일 환자 기원의 AML 종양에 대한 자가 세포독성을 분석하였다 (F). 확장된 PM21-NK 세포는 TFL4로 표지시키고, 활성 질환 동안에 동일 환자 기원의 AML 세포와 지정된 E:T의 비율로 동시-항온처리 (2시간)하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 자발적으로 죽은 표적 세포의 양은 "단독 표적" 대조군을 사용하여 결정하였다. 각각의 데이터 포인트는 2회 결정하였다.
도 2는 비선택된 PBMC의 PM21-입자를 사용한 사전 활성화가 생체내 NK 세포 확장을 유도함을 보여준다. NSG 마우스에 i.p.로 비-활성화된 PBMC (A 및 B) 또는 PM21-입자 및 100 U/mL IL-2로 2일 동안 생체외 사전 활성화된 PBMC (PM21-PBMC) (C 및 D)의 2 x 106 세포를 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 마우스 그룹에 또한 주당 2회 i.p.로 400 μg의 PM21-입자를 주사하였다 (B 및 D). 말초 혈액은 순차적 볼 출혈로 채혈하였고 6일째 개시하여 주마다 2회 hCD45+ 인간 림프구에 대해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. NK, T 및 B 세포 양은 hCD3, hCD56, hCD19에 대한 염색을 기준으로 결정하였다. 각각의 실험 그룹 내 좌측 플롯은 PB의 μL당 hNK 세포의 농도를 보여준다. 우측 플롯은 총 hCD45+ 세포의 분획물로서 hNK 세포 (○, 적색) 및 T 세포(▽, 검정)의 백분율을 보여준다.
도 3은 증식 분석이 PM21-PBMC로부터 생체내 NK 세포 확장을 입증함을 보여준다. 새롭게 해동시키거나 PM21-입자 및 100 U/mL IL-2로 2일 동안 사전 할성화된 PBMC (PM21-PBMC)는 세포 추적(CT) 바이올렛으로 표지시켰다. 2x106의 비활성화된 PBMC (A 및 B) 또는 PM21-PBMC (C 및 D)는 i.p.로 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 마우스 그룹 중 2개에 또한 주당 2회 i.p.로 400 μg의 PM21-입자를 주사하였다 (B 및 D). 각각의 그룹으로부터 2마리 마우스는 6일 째에 안락사시키고 복막 세척은 hCD45+, hCD3-, hCD56+ NK 세포의 CT 바이올렛 형광성에 대한 유동 세포측정에 의해 분석하였다. CT 바이올렛 형광성의 히스토그램은 FlowLogic 내 증식 분석 스위트를 사용하여 곡선 피팅을 통해 분석하였다.
도 4는 PM21의 생체내 적용이 말초 혈액 내 NK 세포의 증가를 가능하게 함을 보여준다. PBMC는 2일 동안 PM21-입자 및 100 U/mL IL-2로 생체외 사전 활성화하였다. 0.2x106의 생존 NK 세포를 함유하는 양 중 PM21-PBMC는 i.p.로 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 마우스에 또한 주당 2회 i.p.로 0 (A), 400 (B), 800 (C), 1,600 μg (D)의 PM21-입자를 주사하였다. 말초 혈액은 5일 째에 개시하여 주당 2회 hCD45+ 림프구에 대한 유동 세포측정에 의해 분석하였고 hNK, hT 및 hB 세포 양은 hCD3, hCD56, hCD19에 대한 염색을 기반으로 결정하였다. 각각의 실험 그룹 내 좌측 플롯은 PB의 μL당 hNK 세포의 농도를 보여준다. 우측 플롯은 총 hCD45+ 세포의 분획물로서 hNK 세포 (○, 적색) 및 T 세포(▽, 검정)의 백분율을 보여준다. PM21-PBMC의 i.p. 초기 주사 후 12일 째로부터 PB 샘플의 분석은 생체내 PM21-입자 용량 (E 좌측)과 관련하여 PB hNK 세포의 용량 의존성 증가를 보여주고 총 CD3+ T 세포 중에 어떠한 유의적 용량 의존성 증가도 관찰되지 않았다 (E 우측).
도 5는 생체내 확장된 K 세포가 주요 생리학적 부위로 생분배되고 NK 세포 생분배가 PM21-입자의 생체내 적용과 함께 증가됨을 보여준다. PM21-입자 및 100 U/mL IL-2로 2일 동안 생체외 사전 활성화된 PM21-PBMC의 일부로서 NK 세포 (0.2 x 106 세포)는 i.p.로 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 마우스에 또한 주당 2회 i.p.로 0 또는 800 μg의 PM21-입자를 주사하였다. 마우스는 PM21-PBMC의 i.p. 초기 주사 후 16일 째에 희생시켰다. 안락사 일자에, 골수(대퇴골), 비장, 폐, 뇌 및 간을 수거하였고, 기관은 관류시키고 대퇴골을 세척하여 세포를 회수하였다. 세포는 유동 세포측정 분석을 위해 hCD3, hCD45, hCD56, hCD19에 대한 항체로 염색시켰다. 골수, 비장, 뇌, 폐 및 간 (좌측 내지 우측)에 대한 데이터는 hCD45+hCD56+hCD3- NK 세포 (각각의 기관에 대한 상부 플롯)의 양과 함께 나타내고 hCD45+hCD56+hCD3- NK 세포 (○, 적색), hCD45+hCD3+ T 세포 (□, 청색) 및 hCD45+, hCD56-hCD3- 다른 림프구 (△, 검정)에 대한 백분율을 나타낸다 (각각의 기관에 대해 하부 플롯). 각각에 대한 두꺼운 막대는 평균을 나타낸다.
도 6은 상이한 공여자 공급원으로부터 생체내 NK 세포 확장이 일정함을 보여준다. PM21-입자 자극된 생체내 NK 세포 확장의 일관성은 건강한 공여자로부터 수득된 3개의 상이한 PBMC를 사용하여 시험하였다. PBMC는 2일 동안 PM21-입자 및 2일 동안 100 U/mL의 IL-2로 생체외 사전 활성화하고 (PM21-PBMC) i.p.로 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 말초 혈액은 5일 째에 개시하여 주당 2회 hCD45+ 림프구에 대한 유동 세포측정에 의해 분석하였고 hNK, hT 및 hB 세포 양은 hCD3, hCD56, hCD19에 대한 염색을 기반으로 결정하였다. i.p. 후 12일째 혈중 hNK 세포의 농도 둘 다 PBMC 주사 (A) 및 i.p. 후 14일째 복강의 세척에서 수거된 NK 세포의 양 PBMC 주사 (C)는 상이한 NK 세포 공급원 (PB에 대해 p=0.84 및 p=0.69)이 주사된 상이한 그룹 간에 유사하였다. hNK 세포 (○, 적색), hT 세포 (□, 청색) 및 다른 hCD45+ 세포 (△, 검정)의 상응하는 세포 내용물은 또한 말초 혈액 (B) 및 복부 (D)에서 상이한 PBMC 공급원이 주사된 그룹 간에 일관성이 있었다. 각각에 대한 두꺼운 막대는 평균을 나타낸다.
도 7은 자극 0, 1, 7, 및 10일 째에 가용성 사이토킨으로 처리된 NK 세포의 HECA-452 염색을 보여준다.
도 8은 자극 0, 12 및 14일 후 K562 피더 세포로 배양된 NK 세포의 HECA-452 염색을 보여준다.
도 9는 자극 10일 후 다양한 조건하에서 자극된 NK 세포의 HECA-452 염색 비교를 보여준다.
도 10은 자극 10일 후 다양한 조건하에서 배양된 NK 세포에 대한 HECA-452 염색을 보여준다.
도 11은 자극 10일 후, 나머지 3일 후의 NK 세포의 HECA-452 염색을 보여준다.
도 12는 PM21 입자의 14일 확장 후, 사전- 및 이후-동결 해동의 HECA-452 염색을 보여준다.
도 13은 STAT3이 인간 NK 세포에서 FUT7 유전자 발현의 IL-21 매개된 조절에 관여함을 보여준다. (A) ChIP-seq는 IL-21 자극된 순수 세포 및 SATA3에 대한 항체로 확장된 인간 NK 세포에 대해 수행하였다. 화살표는 전사 방향을 지적한다. 스케일은 유전자 및 아이슬란드에 대해 일정하고; (B) RNA-seq는 IL-21 자극에 응답하는 FUT7 유전자 발현의 차등적 조절을 밝히고; (C) IL-21은 확장된 NK 세포에서 FUT7 유전자의 STAT3 결합을 증진시키고, (D) IL-21은 확장된 NK 세포에서 FUT7 유전자 발현을 상향조절한다.
도 1은 PM-21 입자가 세포독성 NK 세포를 효율적으로 그리고 선택적으로 확장시킴을 보여준다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 백혈구 공급원으로부터 단리하였고 10% FBS, 2 mM Glutamax 및 50 U/mL IL-2가 보충된 SCG에서 0.1 x 106 NK 세포/mL로 씨딩하였다. PBMC는 27일 동안 200 μg/mL로 PM15 (□, 검정) 또는 PM21 (○, 청색) 입자를 사용하여 자극하였고, 세포 내용물은 2 내지 3일 마다 시험하였고 NK 세포 확장 (A) 및 현탁 세포의 백분율 (B)의 상대적 배수를 나타낸다. PM21-입자 (825 ± 188 배수, N=13, 4 공여자) (청색)는 NK 세포 확장 (C)에 대해 14일 데이터의 누적 분석을 기반으로, PM15-입자 (425 ± 71, N=35, 9 공여자) (검정)와 비교하여 NK 세포 확장에 대해 보다 효율적이다. 차도 중에 있는 3명의 AML 환자로부터 단리된 PBMC는 14일 동안 PM21-입자 (200 μg/mL)로 배양하고, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 50 U/mL IL-2와 함께 SCGM 중에 0.5 x 106 NK 세포/mL로 씨딩하였다. 1차 PBMC (D) 및 림프구 내용물 (E) (CD56+CD3- NK 세포 (●, 적색), CD56-CD3+ T 세포 (■, 청색) 및 CD56+CD3+ NKT 세포 (▲, 검정))로부터의 NK 세포 확장의 배수를 나타낸다. 환자 F021로부터의 PBMC는 16일 동안 이전에 상기된 바와 같이 배양고 동일 환자 기원의 AML 종양에 대한 자가 세포독성을 분석하였다 (F). 확장된 PM21-NK 세포는 TFL4로 표지시키고, 활성 질환 동안에 동일 환자 기원의 AML 세포와 지정된 E:T의 비율로 동시-항온처리 (2시간)하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 자발적으로 죽은 표적 세포의 양은 "단독 표적" 대조군을 사용하여 결정하였다. 각각의 데이터 포인트는 2회 결정하였다.
도 2는 비선택된 PBMC의 PM21-입자를 사용한 사전 활성화가 생체내 NK 세포 확장을 유도함을 보여준다. NSG 마우스에 i.p.로 비-활성화된 PBMC (A 및 B) 또는 PM21-입자 및 100 U/mL IL-2로 2일 동안 생체외 사전 활성화된 PBMC (PM21-PBMC) (C 및 D)의 2 x 106 세포를 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 마우스 그룹에 또한 주당 2회 i.p.로 400 μg의 PM21-입자를 주사하였다 (B 및 D). 말초 혈액은 순차적 볼 출혈로 채혈하였고 6일째 개시하여 주마다 2회 hCD45+ 인간 림프구에 대해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. NK, T 및 B 세포 양은 hCD3, hCD56, hCD19에 대한 염색을 기준으로 결정하였다. 각각의 실험 그룹 내 좌측 플롯은 PB의 μL당 hNK 세포의 농도를 보여준다. 우측 플롯은 총 hCD45+ 세포의 분획물로서 hNK 세포 (○, 적색) 및 T 세포(▽, 검정)의 백분율을 보여준다.
도 3은 증식 분석이 PM21-PBMC로부터 생체내 NK 세포 확장을 입증함을 보여준다. 새롭게 해동시키거나 PM21-입자 및 100 U/mL IL-2로 2일 동안 사전 할성화된 PBMC (PM21-PBMC)는 세포 추적(CT) 바이올렛으로 표지시켰다. 2x106의 비활성화된 PBMC (A 및 B) 또는 PM21-PBMC (C 및 D)는 i.p.로 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 마우스 그룹 중 2개에 또한 주당 2회 i.p.로 400 μg의 PM21-입자를 주사하였다 (B 및 D). 각각의 그룹으로부터 2마리 마우스는 6일 째에 안락사시키고 복막 세척은 hCD45+, hCD3-, hCD56+ NK 세포의 CT 바이올렛 형광성에 대한 유동 세포측정에 의해 분석하였다. CT 바이올렛 형광성의 히스토그램은 FlowLogic 내 증식 분석 스위트를 사용하여 곡선 피팅을 통해 분석하였다.
도 4는 PM21의 생체내 적용이 말초 혈액 내 NK 세포의 증가를 가능하게 함을 보여준다. PBMC는 2일 동안 PM21-입자 및 100 U/mL IL-2로 생체외 사전 활성화하였다. 0.2x106의 생존 NK 세포를 함유하는 양 중 PM21-PBMC는 i.p.로 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 마우스에 또한 주당 2회 i.p.로 0 (A), 400 (B), 800 (C), 1,600 μg (D)의 PM21-입자를 주사하였다. 말초 혈액은 5일 째에 개시하여 주당 2회 hCD45+ 림프구에 대한 유동 세포측정에 의해 분석하였고 hNK, hT 및 hB 세포 양은 hCD3, hCD56, hCD19에 대한 염색을 기반으로 결정하였다. 각각의 실험 그룹 내 좌측 플롯은 PB의 μL당 hNK 세포의 농도를 보여준다. 우측 플롯은 총 hCD45+ 세포의 분획물로서 hNK 세포 (○, 적색) 및 T 세포(▽, 검정)의 백분율을 보여준다. PM21-PBMC의 i.p. 초기 주사 후 12일 째로부터 PB 샘플의 분석은 생체내 PM21-입자 용량 (E 좌측)과 관련하여 PB hNK 세포의 용량 의존성 증가를 보여주고 총 CD3+ T 세포 중에 어떠한 유의적 용량 의존성 증가도 관찰되지 않았다 (E 우측).
도 5는 생체내 확장된 K 세포가 주요 생리학적 부위로 생분배되고 NK 세포 생분배가 PM21-입자의 생체내 적용과 함께 증가됨을 보여준다. PM21-입자 및 100 U/mL IL-2로 2일 동안 생체외 사전 활성화된 PM21-PBMC의 일부로서 NK 세포 (0.2 x 106 세포)는 i.p.로 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 마우스에 또한 주당 2회 i.p.로 0 또는 800 μg의 PM21-입자를 주사하였다. 마우스는 PM21-PBMC의 i.p. 초기 주사 후 16일 째에 희생시켰다. 안락사 일자에, 골수(대퇴골), 비장, 폐, 뇌 및 간을 수거하였고, 기관은 관류시키고 대퇴골을 세척하여 세포를 회수하였다. 세포는 유동 세포측정 분석을 위해 hCD3, hCD45, hCD56, hCD19에 대한 항체로 염색시켰다. 골수, 비장, 뇌, 폐 및 간 (좌측 내지 우측)에 대한 데이터는 hCD45+hCD56+hCD3- NK 세포 (각각의 기관에 대한 상부 플롯)의 양과 함께 나타내고 hCD45+hCD56+hCD3- NK 세포 (○, 적색), hCD45+hCD3+ T 세포 (□, 청색) 및 hCD45+, hCD56-hCD3- 다른 림프구 (△, 검정)에 대한 백분율을 나타낸다 (각각의 기관에 대해 하부 플롯). 각각에 대한 두꺼운 막대는 평균을 나타낸다.
도 6은 상이한 공여자 공급원으로부터 생체내 NK 세포 확장이 일정함을 보여준다. PM21-입자 자극된 생체내 NK 세포 확장의 일관성은 건강한 공여자로부터 수득된 3개의 상이한 PBMC를 사용하여 시험하였다. PBMC는 2일 동안 PM21-입자 및 2일 동안 100 U/mL의 IL-2로 생체외 사전 활성화하고 (PM21-PBMC) i.p.로 NSG 마우스에 주사하였다. 모든 그룹 내 마우스에 주당 3회 1,000 U의 IL-2를 i.p.로 투여하였다. 말초 혈액은 5일 째에 개시하여 주당 2회 hCD45+ 림프구에 대한 유동 세포측정에 의해 분석하였고 hNK, hT 및 hB 세포 양은 hCD3, hCD56, hCD19에 대한 염색을 기반으로 결정하였다. i.p. 후 12일째 혈중 hNK 세포의 농도 둘 다 PBMC 주사 (A) 및 i.p. 후 14일째 복강의 세척에서 수거된 NK 세포의 양 PBMC 주사 (C)는 상이한 NK 세포 공급원 (PB에 대해 p=0.84 및 p=0.69)이 주사된 상이한 그룹 간에 유사하였다. hNK 세포 (○, 적색), hT 세포 (□, 청색) 및 다른 hCD45+ 세포 (△, 검정)의 상응하는 세포 내용물은 또한 말초 혈액 (B) 및 복부 (D)에서 상이한 PBMC 공급원이 주사된 그룹 간에 일관성이 있었다. 각각에 대한 두꺼운 막대는 평균을 나타낸다.
도 7은 자극 0, 1, 7, 및 10일 째에 가용성 사이토킨으로 처리된 NK 세포의 HECA-452 염색을 보여준다.
도 8은 자극 0, 12 및 14일 후 K562 피더 세포로 배양된 NK 세포의 HECA-452 염색을 보여준다.
도 9는 자극 10일 후 다양한 조건하에서 자극된 NK 세포의 HECA-452 염색 비교를 보여준다.
도 10은 자극 10일 후 다양한 조건하에서 배양된 NK 세포에 대한 HECA-452 염색을 보여준다.
도 11은 자극 10일 후, 나머지 3일 후의 NK 세포의 HECA-452 염색을 보여준다.
도 12는 PM21 입자의 14일 확장 후, 사전- 및 이후-동결 해동의 HECA-452 염색을 보여준다.
도 13은 STAT3이 인간 NK 세포에서 FUT7 유전자 발현의 IL-21 매개된 조절에 관여함을 보여준다. (A) ChIP-seq는 IL-21 자극된 순수 세포 및 SATA3에 대한 항체로 확장된 인간 NK 세포에 대해 수행하였다. 화살표는 전사 방향을 지적한다. 스케일은 유전자 및 아이슬란드에 대해 일정하고; (B) RNA-seq는 IL-21 자극에 응답하는 FUT7 유전자 발현의 차등적 조절을 밝히고; (C) IL-21은 확장된 NK 세포에서 FUT7 유전자의 STAT3 결합을 증진시키고, (D) IL-21은 확장된 NK 세포에서 FUT7 유전자 발현을 상향조절한다.
본원의 화합물, 조성물, 제품, 장치 및/또는 방법을 개시하고 기재하기 전, 이들은 달리 특정되지 않는 경우 특정 합성 방법 또는 특정 재조합 생물공학 방법, 또는 달리 특정되지 않는 경우 특정 시약으로 제한되지 않고 물론 다양할 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기재할 목적을 위한 것이고 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야만 한다.
A. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥에 명백히 달리 지시하지 않는다면, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "약제학적 담체"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 담체의 혼합물 등을 포함한다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값에서 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 상기 범위가 표현되는 경우, 또 다른 구현예는 하나의 특정 값에서 및/또는 다른 특정 값 까지를 포함한다. 유사하게, 값이 대략적인 것으로 표현되는 경우, 선행된 "약"을 사용하여 특정 값이 또 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해된다. 추가로, 범위 각각의 종점은 다른 종점과 관련하여 둘 다 유의적이고 다른 종점과는 무관하게 이해된다. 또한, 다수의 값이 본원에 기재되고, 각각의 값은 또한 값 자체에 추가로 특정 값에 대해 "약"으로서 본원에 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시된 경우, "약 10"이 또한 개시된다. 또한, 값이 개시된 경우 상기 값 "이하", "상기 값 이상" 및 상기 값 사이의 가능한 범위가 또한 당업자에 의해 적절히 이해되는 바와 같이 개시된 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시된 경우, "10 이하" 뿐만 아니라 "10 이상"도 개시다. 또한, 본원 전반에 걸쳐, 데이터는 다수의 상이한 포맷으로 제공되고 상기 데이터는 종점 및 출발점, 및 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 15가 개시된 경우, 10 내지 15 뿐만 아니라, 10 및 15의 초과, 이상, 미만, 이하 또는 동일한이 개시된 것으로 고려되는 것으로 이해된다. 또한, 2개의 특정 수 (unit) 사이의 각각의 수가이 또한 기재된 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시된 경우, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된다.
후속하는 본 명세서 및 청구항에서, 하기의 의미를 갖는 것으로 정의되는 다수의 용어를 언급한다.
"임의의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기재된 이벤트 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않을 수 있고 상기 설명은 상기 이벤트 또는 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
B. 상기 조성물을 사용하는 방법
입양 천연 킬러 (NK) 세포 치료요법은 골수 악성 종양 및 골수 유래 악성 종양에 대한 것을 포함하고; 상기를 위한 수의학적 적용을 포함하는 종양학에 대해 전망있는 신규 중재법이다. 또 다른 양상에서, 입양 NK 세포는 예를 들어, 재생불량성 빈혈을 유발하는 파르보바이러스를 포함하는 골수 거주 바이러스의 치료를 위해 치료학적으로 사용될 수 있다. 따라서, 입양적으로 사용될 NK 세포의 트래피킹의 효율은 매우 중요하다. 특히, 세포가 이들이 효과적일 수 있는 골수로의 전달을 구동시키는 방법이 매우 중요하다.
골수 호밍의 결정요인 중에는 셀렉틴 결합을 위한 리간드가 있다. L-셀렉틴의 결합을 위해, 주요 결정인자는 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1 (PSGL-1)에 부착된 시알릴 루이스 x (sLex) 탄수화물 쇄의 푸코실화 상태이다. 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 PM21 입자 및/또는 IL-21 및/또는 41bbl (K562.mb21.41bbl)의 조작된 막 결합된 형태를 발현하도록 형질전환된 K562 세포로부터 제조된 FC21 피더 세포를 사용한 NK 세포의 자극이 NK 세포의 효율적인 특이적 확장을 유도하고 sLex의 완전한 푸코실화를 유도하는 것으로 고려된다.
따라서, 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 NK 세포를 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 접촉시키고 NK 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 입양적으로 전달함을 포함하는, NK 세포를 골수로 트래피킹하는 것과 관련된 방법 및 골수 악성 종양 또는 골수 유래 악성 종양을 치료하는 방법이다. 하나의 양상에서, 상기 방법은 생체외 또는 생체내 (환자 내) NK 세포를 IL-2, IL-12, IL-15 IL-18, 및/또는 IL-18로 자극시킴을 추가로 포함할 수 있다.
일부 양상에서, PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 NK 세포의 접촉은 NK 세포의 환자로의 전달 전에 일어날 수 있다. 또 다른 양상에서, PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 NK 세포의 접촉은 환자에서 일어날 수 있다.
하나의 양상에서, 본원에서 NK 세포 면역치료요법의 효능이 환자에게 투여되거나 생체내 확장을 통한 주입 후 도달되는 NK 세포의 용량에 의존하는 것으로 이해되고 고려된다. 현재 가용한 기술은 환자에서 치료학적 효과를 성취하는 것으로 요구되는 NK 세포 확장의 수준을 성취하는 이들의 무능력에 의해 제한된다. 보다 단순한 임상 확장 프로토콜의 부재는 NK 세포 기반 면역치료요법의 진전 및 광범위 보급에 대한 주요 장벽이다. 현재 생체외 확장 프로토콜은 고용량의 사이토킨과 백혈병-유래된 영양공급세포/자극인자 세포주 상에서 발현되는 활성화 리간드의 조합을 사용하고 이는 대부분의 센터에서 임상 세팅으로의 전달을 위해 상당한 단점을 부과하고 직접적인 생체내 확장을 위해 처리될 수 없다. 본원에 기재된 엑소좀을 포함하는 입자 기술의 사용은 자극인자 세포에 대한 필요성을 제거함에 따라서 상기 방법을 단순화시키고 입양 치료요법을 위한 생체외 확장을 가능하게 하거나 선택적 생체내 확장을 위해 생체내 적용된다. 따라서, 및 하나의 양상에서, 본원에 기재된 것은 NK 세포를, NK 세포 이펙터 제제를 포함하는 하나 이상의 소포체와 접촉시킴을 포함하는, KN 세포의 입양 전달을 통한 골수 악성종양 및 골수 유래 악성종양을 치료하기 위한 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법이다. 하나의 양상에서, 또한 개시된 것은 적어도 하나의 NK 세포를 적어도 하나 이상의 자극 사이토킨과 접촉시킴에 의해 생체내 NK 세포를 사전 활성화하거나 활성화시킴을 추가로 포함하는 골수 악성종양, 골수 유래 악성종양 및/또는 바이러스 감염 (골수 지향성을 갖는 바이러스를 포함하는)을 치료하는 방법이다. 따라서, 하나의 양상에서, PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포에 의해 또는 PM21 또는 FC21 피더 세포를 사용한 직접적인 생체내 자극으로 생체외 확장된 NK 세포를 사용하여 재생불량성 빈혈을 유발하는 골수 거주 바이러스 병태 또는 증후군 (예를 들어, 파르보바이러스)을 치료할 수 있다.
개시된 방법은 적어도 하나의 NK 세포를 적어도 하나 이상의 자극 사이토킨 (예를 들어, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 및/또는 IL-18)과 접촉시킴에 의해 NK 세포의 사전 활성화 또는 활성화를 성취한다. 따라서, 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 하나 이상의 NK 세포를 2 또는 3개의 자극 사이토킨과 접촉시킴을 포함하는, 하나 이상의 NK 세포를 IL-2, IL-12, IL-21, IL-15, 및/또는 IL-18, 또는 이의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 자극 사이토킨과 접촉시킴에 의해 NK 세포를 사전 활성화시킴을 포함하는, 골수 악성종양 및 골수 유래 악성종양을 NK 세포의 입양 전달을 통해 치료하는 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법이다. 예를 들어, 본원에 구체적으로 개시된 것은 사전 활성화 또는 활성화 단계가 NK 세포를 IL-2; IL-12; Il-15, IL-18, IL-12 및 IL-15; IL-12 및 IL-18; IL-15 및 IL-18; 또는 IL-12, IL-15, 및 IL-18과 접촉시킴을 포함하는 방법이다. 하나의 양상에서, NK 세포의 입양 전달을 통한 골수 악성종양 및 골수 유래 악성종양을 치료하는 개시된 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법은 추가로 NK 세포를 가용성 형태로 또는 PM21 입자 또는 FC21 피더 세포 형태로 4-1BBL, IL-2, IL-21, MICA/B, ULBP2, ICAM-1, 2B4, BCM1/SLAMF2, CD155, CD112, CCR7, DAP12, 노치 (Notch) 리간드 및/또는 DAP10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨과 접촉시킴을 포함할 수 있다.
본원에서 가용성 형태 또는 PM21 입자 또는 FC21 피더 세포 형태로 사전 활성화 또는 활성의 지속기간 (즉, NK 세포와 자극 사이토킨(예를 들어, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 및/또는 IL-18) 사이의 접촉 지속기간)은 NK 세포의 목적하는 사전 활성화 또는 활성화를 성취하는데 필요한 임의의 시간 길이에 대한 것일 수 있는 것으로 이해되고 고려된다. 예를 들어, 상기 접촉은 1분 정도로 적거나 7일 정도로 많은 기간 (예를 들어, NK 세포를 7일 동안 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 및/또는 IL-18의 존재하에 배양하는)일 수 있다. 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 하나 이상의 NK 세포를 IL-2, IL-12, IL-21, IL-15, 및/또는 IL-18과 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 또는 48시간 동안 접촉시킴에 의해 NK 세포를 사전 활성화시키거나 활성화시킴을 포함하는, NK 세포의 입양 전달을 통해 골수 악성종양 및 골수 유래 악성종양을 치료하는 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법이다. 본원에서 배양 중 사이토킨의 반감기는 목적하는 접촉 시간 미만일 수 있는 것으로 이해되고 고려된다. 따라서, 본원에 개시된 것은 하나 이상의 NK 세포가 접촉 기간 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간 마다 (예를 들어, 24시간 접촉 기간 내 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간 마다) IL-2, IL-12, IL-15, 및/또는 IL-18과 접촉되는 방법이다.
NK 세포와 접촉시키고 활성화시키고/시키거나 확장시키기 위해 하나 이상의 NK 세포 이펙터 제제 (즉, 자극 펩타이드, 사이토킨 및/또는 접착 분자)를 포함하는 세포질 막 (PM) 입자, 엑소좀 (EX), 또는 피더 세포 (FC)의 용도를 통해 사이토킨 독성과 관련된 많은 장애물이 극복된다. NK 세포 활성화제 및 자극 펩타이드의 예는 41BBL, IL-2, IL-12, IL-21, IL-18, MICA, LFA-1, 2B4, BCM/SLAMF2, CCR7, 노치 리간드 및/또는 다른 호밍 유도 신호전달 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사이토킨의 예는 IL-2, IL-12, IL-21, 및 IL-18을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 접착 분자의 예는 LFA-1, MICA, BCM/SLAMF2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 막 결합된 IL-21을 발현하는 피더 세포로부터 제조된 세포질막 (PM) 입자, 피더 세포 (FC) 또는 엑소좀 (EX) (각각 FC21 세포, PM21 입자 및 EX21 엑소좀). 막 결합된 IL-21 발현 FC21 세포, PM21 입자, 및 EX21 엑소좀은 추가의 하나 이상의 활성화제, 자극 펩타이드, 사이토킨 및/또는 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, MICA, LFA-1, 2B4, BCM/SLAMF2, CCR7 (예를 들어, PM21 입자, EX21 엑소좀, 또는 41BBL 및 막 결합된 인터류킨-21을 발현하는 FC 세포)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 접착 분자를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 NK 세포의 입양 전달을 통한 골수 악성종양 및 골수 유래 악성종양을 치료하는 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법이고, 상기 방법은 상기 세포를 NK 세포 이펙터 제제를 포함하는 적어도 하나의 소포체와 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 소포체를 포함하는 NK 세포 이펙터 제제는 하나 이상의 PM21 입자, EX21 입자 및/또는 F21 피더 세포의 임의의 조합이다. 예를 들어, 본원에 개시된 것은 NK 세포의 입양 전달을 통한 골수 악성종양 및 골수 유래 악성종양을 치료하는 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법이고, 상기 방법은 다른 단계 중에서도 상기 세포를 NK 세포 이펙터 제제를 포함하는 적어도 하나의 소포체와 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 소포체를 포함하는 NK 세포 이펙터 제제는 PM21 입자; EX21 엑소좀; F21 피더 세포; PM21 입자 및 EX21 엑소좀; PM21 입자 및 FC21 피더 세포; EX21 엑소좀 및 FC21 피더 세포; 또는 PM21 입자, EX21 엑소좀, 및 FC21 피더 세포를 포함한다.
일부 양상에서, PM21 입자, EX21 엑소좀 또는 FC21 피더 세포의 이펙터 제제는 막-삽입 펩타이드와 커플링된 하나 이상의 자극 펩타이드 (예를 들어, Fc, GPI, 막관통 T-세포 수용체, 또는 pHLIP)를 포함한다. 막-삽입 펩타이드는 막으로의 삽입을 촉진시키는 분자일 수 있다. 막-삽입 펩타이드는 지질 이중층에 대한 친화성을 갖는 CD4 또는 IgG의 분절을 포함할 수 있다. 추가로, 또 다른 막-삽입 펩타이드는 인간 Fc, GPI, 막관통 T-세포 수용체, 또는 pHLIP를 포함할 수 있다. 막 자가-삽입 펩타이드는 세포 막에 삽입하는 것으로 공지된 임의의 펩타이드일 수 있다. 막 자가-삽입 펩타이드 접합체의 용도에 의존하여, 특정 막 자가-삽입 펩타이드는 무엇보다 양호한 선택일 수 있다. 당업자는 어떠한 막 자가-삽입 펩타이드가 상이한 상황하에서 이상적인지를 이해할 것이다. 예를 들어, 생체내 사용을 위해, pHLIP 막 자가-삽입 펩타이드가 적합할 수 있다. pHLIP 막 자가-삽입 펩타이드는 단지 낮은 pH의 조건하에서 막에 삽입된다. 따라서, pHLIP 접합체는 정상의 생리학적 조건하에서 세포막에 삽입하지 않는다. 그러나, 종양 환경으로의 주사 시, pHLIP 접합체는 종양 환경이 정상 생리학적 조건 보다 더 산성이기 때문에 종양 세포의 세포 막에 삽입될 수 있다. 종양 환경으로의 상기 삽입은 종양 영역에서 NK 세포의 활성화를 가능하게 한다. 따라서 pHLIP를 사용하면 무작위 세포막으로의 원치않는 삽입을 예방한다.
막-삽입 펩타이드는 다양한 방식으로 하나 이상의 자극 펩타이드에 커플링될 수 있고 펩타이드를 커플링시키기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 자극 펩타이드에 커플링된 막-삽입 펩타이드는 또한 막-삽입 펩타이드 접합체로서 언급될 수 있다. 일부 양상에서, 막-삽입 펩타이드에 커플링된 하나 이상의 자극 펩타이드는 재조합 DNA에 의해 암호화된 융합 단백질을 포함할 수 있고 상기 융합-단백질은 세균 세포에서 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 친지성 분자, 예를 들어, 소수성 펩타이드, GPI, 또는 리포좀 또는 세포 막으로 부착시키기 위한 인간 Fc에 접합되거나 커플링된 하나 이상의 자극 펩타이드로 이루어질 수 있다. 이들 융합 단백질에 대한 cDNA 벡터는 세균 (이. 콜라이), 곤충 또는 포유동물 세포에서 발현을 가능하게 하는 발현 플라스미드에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, cDNA 벡터는 FLAG- 또는 HIS-태그된 것일 수 있다. 세균 세포는 문헌 (참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기재된 것과 같은 표준 CaCl 형질감염 방법을 사용하여 형질감염시킬 수 있다. 세균 세포는 또한 LB 배지에 배양될 수 있고 프렌치 프레스를 사용하여 수거되고 용해될 수 있다 . 관심 대상의 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 용해물로부터 정제될 수 있다. 팔미테이트-접합된 단백질 A 및 정제된 Fc 융합 단백질은 4℃에서 1:2 (w/w)로 혼합함에 의해 문헌에 기재된 바와 같이 접합될 수 있다. 이어서, 접합체는 종양내로 직접 주사되거나 리포좀으로 혼입될 수 있다.
커플링하기 위한 유형 및 커플링하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "커플링시킨다"는 펩타이드 또는 단백질과 같은 또 다른 분자 실체에 접합되거나, 연결되거나 달리 연결되는 막 자가-삽입 펩타이드를 언급한다. 예를 들어, 자극 펩타이드에 커플링된 막-삽입 펩타이드는 융합 단백질일 수 있고, 여기서, 상기 막-삽입 펩타이드는 디설파이드 결합을 통해 또 다른 단백질에 커플링된다. 커플링 또는 접합은 막 자가-삽입 펩타이드와 NK 세포 이펙터 제제 간에 화학적 연결이 있음을 의미할 수 있다.
일부 양상에서, 하나 이상의 자극 펩타이드는 동일계 자가-어셈블리를 위해 막 자가-삽입 펩타이드 또는 GPI 앵커에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 41-BBL 및 IL-21은 산성 조건하에서 자체가 세포 막으로 삽입하여 종양에 인접하여 자극 리간드의 세포로의 앵커링을 가능하게 하는 pHLP 펩타이드에 커플링될 수 있다. 자극 펩타이드 41BBL, IL-2, IL-12, IL-21, BCM/SLAMF2, CCR7 및/또는 다른 호밍 수용체는 세균 세포에서 제조될 수 있거나 상업적으로 시판되는 공급원으로부터 구입할 수 있고 이들 단백질에 대한 cDNA 벡터는 임의로 세균 (이. 콜라이), 곤충, 또는 포유동물 세포에서의 발현을 가능하게 하는 pTriEX 발현 플라스미드에 연결될 수 있다. cDNA 벡터는 FLAG- 또는 HIS- 태그의 발현을 암호화할 수 있다. 세균 세포는 표준 CaCl 형질감염 방법을 사용하여 형질감염시킬 수 있고 LB 배지 상에서 배양될 수 있다. 세포는 수거될 수 있고 프렌치 프레스를 사용하여 용해될 수 있고 관심 대상의 단백질은 이어서 친화성 크로마토그래피에 의해 용해물로부터 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, pHLIP는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 화학물질을 사용한 고형상 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있고 생성물은 역상 칼럼크로마토그래피에 의해 C18 컬럼 상에서 정제될 수 있다. 이어서, pHLIP는 벤조페논-4-요오도아세트아미드와 같은 가교결합제로 항온처리함에 의해 자극 인간 단백질 리간드에 접합될 수 있다. 수회 세척 후, 접합된 pHLIP 단백질은 배지 (예를 들어, 식염수) 중에 재현탁시킬 수 있고 종양내 또는 정맥내로 주사될 수 있다. 선행 문헌으로부터의 입증 및 실험 결과에서 제공된 것을 기준으로, 상기 변형된 종양 세포의 표면 상에서 NK 세포와 IL-21 및 41-BBL과 같은 자극 리간드의 상호작용은 동일계 NK 세포 확장을 자극할 수 있고 종양에 대한 이들의 세포독성 반응을 유발할 수 있다. 이 유형의 자극 접근법은 난소암과 같은 고형 종양의 치료를 위해 사용될 수 있고, 여기서, 동일계에서 산성 pH 하에 세포에 삽입되는 NK 자극 리간드는 저용량의 IL-2 단독으로 또는 NK 세포와 함께 환자의 복막내 공간으로 주사될 수 있다. NK 세포와 같은 고수준의 FCγIII R (CD16)을 발현하는 세포독성 림프구가 치료학적 항체를 사용한 암 치료요법의 효능을 위해 중요하다는 강한 증거가 있다. 따라서, 상기 접근법은 또한 치료학적 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
본원에서 NK 세포와, 소포체 (즉, PM21 입자, EX21 엑소좀 및/또는 FC21 피더 세포)를 포함하는 NK 세포 이펙터 제제 간의 접촉 지속기간은 기억 NK 세포의 목적하는 확장을 성취하기 위해 필요한 임의의 시간 길이일 수 있는 것으로 이해되고 고려된다. 예를 들어, 상기 접촉은 1분 정도로 적거나 60일 정도로 많은 기간 (예를 들어, NK 세포를 7일 동안 PM21 입자, EX21 엑소좀 및/또는 FC21 피더 세포의 존재하에 배양하는)일 수 있다. 하나의 양상에서, NK 세포와, 소포체를 포함하는 NK 세포 이펙터 제제 간의 접촉은 약 6일 내지 약 60일일 수 있고, 보다 바람직하게, 접촉은 약 6일 내지 약 40일일 수 있다. 또한 본원에 개시된 것은 NK 세포의 입양 전달을 통해 골수 악성 종양 및 골수 유래 악성 종양을 치료하는 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법이고, 상기 방법은 NK 세포를 PM21 입자, EX21 엑소좀, 및/또는 FC21 피더 세포와 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 또는 72일 동안 접촉시킴을 포함한다. 본원에서, 일부 경우에, NK 세포와 PM21 입자, EX21 엑소좀, 및/또는 FC21 피더 세포의 다중 접촉이 요구될 수 있고 사용될 수 있는 것으로 이해되고 고려된다. 예를 들어, NK 세포는 PM21 입자, EX21 엑소좀, 및/또는 FC21 피더 세포와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24시간, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 마다 1회 접촉될 수 있다. 따라서, 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 NK 세포의 입양 전달을 통해 골수 악성 종양 및 골수 유래 악성 종양을 치료하는 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법이고, 상기 방법은 NK 세포를 PM21 입자, EX21 엑소좀, 및/또는 FC21 피더 세포와 1회 초과로 접촉시킴을 포함하고, 접촉은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24시간, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 마다 일어난다.
하나의 양상에서, 세포질막 입자, 피더 세포 또는 엑소좀은 NK 세포를 자극하는 피더 세포로부터 정제될 수 있다. 청구된 발명에 사용하기 위한, 본원에 개시된 세포질막 입자 또는 엑소좀을 제조하는데 사용하기 위한 NK 세포 자극 피더 세포는, 막 결합된 IL-21 및 41BBL로 형질감염된, 자가 또는 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 비조사된 자가 또는 PBMC, RPMI8866, HFWT, K562, SKOV3, 또는 EBV-LCL 세포를 포함하는, 조사된 자가 또는 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 비조사된 자가 또는 PBMC, RPMI8866, HFWT, K562, SKOV3, 또는 EBV-LCL 세포일 수 있다. 일부 양상에서, NK 세포 피더 세포는 막 결합된 IL-21 및 41BBL로 형질감염된 K562 세포일 수 있다.
개시된 조성물을 사용하여 비제어된 세포 증식이 일어나는 임의의 질환, 예를 들어, 암 및 특히 골수 내 영향을 미치거나 위치하는 악성 종양을 치료할 수 있다. 상이한 유형의 암의 비제한적인 목록은 다음과 같다: 림프종 (호지킨 및 비-호지킨), 백혈병, 암종, 고형 조직의 암종, 편평 세포 암종, 선암종, 육종, 신경교종, 고등급 신경교종, 모세포종, 신경모세포종, 형질세포종, 조직구종, 흑색종, 선종, 저산소 종양, 골수종, AIDS-관련 림프종 또는 육종, 전이성 암 또는 일반 암. 본원에 개시된 조성물이 치료하기 위해 사용될 수 있는 암의 대표적이지만 비제한적인 목록은 다음과 같다: 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상식육종, 호지킨 질환, 골수 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계 암, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종, 신장암, 폐암, 예를 들어, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 신경모세포종/교모세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 결장암, 자궁경부암, 자궁경부 암종, 유방암, 및 상피암, 신장암 (renal cancer), 비뇨생식기암, 폐암 (pulmonary cancer), 식도 암종, 두경부 암종, 대장암, 조혈암; 고환암; 결장 및 직장암, 전립선암, 또는 췌장암.
개시된 조성물은 또한 골수와 관련된 바이러스 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 바이러스 질환은 골수와 관련되고 골수가 바이러스를 함유한 바이러스 질환 (즉, 바이러스 감염(만성, 급성, 잠복기 및 지속적 감염을 포함하는) 또는 다르게는 골수에 대해 지향을 갖는) 또는 골수가 예를 들어, 파르보바이러스와 같은 재생불량성 빈혈을 유발하는 바이러스와 같은 바이러스에 의해 안좋은 영향을 받는 바이러스 질환 (일부 경우에, 골수에 안좋은 영향을 주는 질환 또는 병태는 골수의 바이러스 감염이다)을 언급한다. 따라서, 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법이고, 여기서, 상기 바이러스 감염은 골수와 관련되고 (예를 들어, 골수에 악영향을 미침), 상기 방법은 NK 세포를 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 접촉시키고 NK 세포를 바이러스 감염을 갖는 대상체에 전달함을 포함한다. 하나의 양상에서, 상기 바이러스는 재생불량성 빈혈을 유발할 수 있고/있거나, 골수에서 잠복기 또는 만성 감염을 확립하는 골수 지향성 감염 또는 바이러스 감염일 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스는 댕기 바이러스, 간염 바이러스 (A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 및 G형 간염 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 엡슈타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus) (또한 인간 헤르페스 바이러스 4로서 공지된), 사이토메갈로바이러스 (또한 인간 헤르페스 바이러스 5로서 공지된), 파르보바이러스 (파르보바이러스 B19를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
C. 조성물
본원에 개시된 것은 본원에 개시된 방법에서 사용될 조성물 자체 뿐만 아니라 개시된 조성물을 제조하기 위해 사용될 성분들이다. 이들 및 다른 재료가 본원에 개시되고, 조합되는 경우, 이들 재료의 서브셋, 상호작용, 그룹 등이 개시되고 이들 화합물의 각각의 다양한 개별 및 총체적 조합의 순서에 대한 특정 언급이 명백히 개시될 수 없고 각각이 구체적으로 본원에서 고려되고 기재된 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 PM21 입자 또는 FC21 피더 세포가 개시되고 논의되고 다수의 분자를 제조하기 위해 다수의 변형이 있을 수 있는 경우, 달리 반대로 구체적으로 지적되지 않는 경우 가능한 상기 변형 각각 및 모든 조합 및 순서가 구체적으로 고려된다. 따라서, 분자 D, E 및 F의 부류 및 조합 분자의 예뿐만 아니라 분자 A, B, 및 C의 부류가 기재된 경우, A 내지 D가 개시되고 이어서 심지어 각각이 개별적으로 언급되지 않아도 각각은 개별적으로 및 총체적으로 고려되고 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F가 기재된 것으로 고려된다. 또한, 이들의 임의의 서브세트 또는 조합이 또한 개시된다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F, 및 C-E의 서브그룹이 개시된 것으로 고려된다. 이러한 개념은 개시된 조성물을 제조하고 사용하는 방법에서의 단계를 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원의 모든 양상에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가의 단계가 있는 경우, 이들 추가의 단계 각각은 개시된 방법의 특정 구현예 또는 구현예의 조합으로 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
NK 세포의 입양 전달을 통한 골수 악성 종양 및 골수 유래 악성 종양을 치료하는 개시된 방법 및/또는 NK 세포를 골수로 트래피킹하는 방법은 예를 들어, PM21 입자, FC21 피더 세포, 및/또는 EX21 엑소좀과 같은 NK 세포 이펙터 제제를 포함하는 소포체와 조합된 하나 이상의 사이토킨 (예를 들어, IL-12, IL-15, 및/또는 IL-18)을 사용한다. 본원에서 사용자가 개시된 방법을 용이하게 수행하도록 하는 팩키지에 개시된 방법에 사용되는 성분들을 제공하는 것이 유리한 것으로 이해되고 고려된다.
따라서, 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 하나 이상의 사이토킨 (예를 들어, IL-2, IL-12, IL-15 및/또는 IL-18), 및 NK 세포 이펙터 제제를 포함하는 하나 이상의 소포체를 포함하는 NK 세포를 사용하여 골수 악성종양 및 골수 유래 악성종양을 치료하기 위한 키트이다. 하나의 양상에서, 소포체는 PM21 입자, EX21 엑소좀, 및/또는 FC21 피더 세포일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 키트는 IL-12 및 PM21 입자; IL-15 및 PM21 입자; IL-18 및 PM21 입자; IL-12 및 EX21 엑소좀, IL-15 및 EX21 엑소좀; IL-18 및 EX21 엑소좀; IL-12 및 FC21 피더 세포; IL-15 및 FC21 피더 세포; IL-18 및 FC21 피더 세포; IL-12, IL15, 및 PM21 입자; IL-12, IL-18, 및 PM21 입자; IL-15, IL-18, 및 PM21 입자; IL-12, IL-15, IL-18, 및 PM21 입자; IL-12, IL15, 및 EX21 엑소좀; IL-12, IL-18, 및 EX21 엑소좀; IL-15, IL-18, 및 EX21 엑소좀; IL-12, IL-15, IL-18, 및 EX21 엑소좀; IL-12, IL15, 및 FC21 피더 세포; IL-12, IL-18, 및 FC21 피더 세포; IL-15, IL-18, 및 FC21 피더 세포; IL-12, IL-15, IL-18, 및 FC21 피더 세포; IL-12, EX21 엑소좀, 및 PM21 입자; IL-15, EX21 엑소좀, 및 PM21 입자; IL-18, EX21 엑소좀, 및 PM21 입자; IL-12, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-15, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-18, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-12, FC21 피더 세포, 및 EX21 엑소좀; IL-15, FC21 피더 세포, 및 EX21 엑소좀; IL-18, FC21 피더 세포, 및 EX21 엑소좀; IL-12, FC21 피더 세포, PM21 입자, 및 EX21 엑소좀; IL-15, FC21 피더 세포, PM21 입자, 및 EX21 엑소좀; IL-18, FC21 피더 세포, PM21 입자, 및 EX21 엑소좀; IL-12, IL15, EX21 엑소좀, 및 PM21 입자; IL-12, IL-18, EX21 엑소좀, 및 PM21 입자; IL-15, IL-18, EX21 엑소좀, 및 PM21 입자; IL-12, IL-15, IL-18, EX21 엑소좀, 및 PM21 입자; IL-12, IL15, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-12, IL-18, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-15, IL-18, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-12, IL-15, IL-18, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-12, IL15, EX21 엑소좀, 및 FC21 피더 세포; IL-12, IL-18, EX21 엑소좀, 및 FC21 피더 세포; IL-15, IL-18, EX21 엑소좀, 및 FC21 피더 세포; IL-12, IL-15, IL-18, EX21 엑소좀, 및 FC21 피더 세포; IL-12, EX21 엑소좀, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-15, EX21 엑소좀, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-18, EX21 엑소좀, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-12, IL15, EX21 엑소좀, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-12, IL-18, EX21 엑소좀, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; IL-15, IL-18, EX21 엑소좀, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자; 또는 IL-12, IL-15, IL-18, EX21 엑소좀, FC21 피더 세포, 및 PM21 입자를 포함할 수 있다.
본원에서 소포체 (예를 들어, PM21 입자, EX21 엑소좀, 및/또는 FC21 피더 세포)에 포함되는 NK 세포 이펙터 제제가 4-1BBL, IL-2, IL-21, MICA/B, ULBP2, ICAM-1, 2B4, BCM1/SLAMF2, CD155, CD112, CCR7, DAP12, 노치 리간드 및 DAP10으로 이루어진 NK 세포 이펙터 제제의 그룹으로부터 선택될 수 있는 것으로 이해되고 고려된다.
본원에서 기재된 키트 또는 장치가 IL-12, IL-15, 및/또는 IL-18에 추가로 사이토킨을 포함할 수 있는 것으로 이해되고 고려된다. 따라서, 하나의 양상은 NK 세포의 입양 전달을 통한 골수 악성종양 및 골수 유래 악성종율을 치료하는 방법 및/또는 NK를 4-1BBL, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, MICA/B, ULBP2, ICAM-1, 2B4, BCM1/SLAMF2, CD155, CD112, CCR7, DAP12, 및 DAP10을 추가로 포함하는 골수로 트래피킹하는 방법을 위한 키트이다 .
하나의 양상에서, 본원에서는 기재된 키트 또는 장치가 말초 혈액 단핵 세포의 비선택된 집단으로부터 수득된 NK 세포를 포함하는 공여자 공급원으로부터 수득된 NK 세포와 함께 사용될 수 있는 것으로 고된다. 일부 경우에, 골수 악성 종양 및 골수 유래 악성 종양을 치료하기 위한 개시된 키트에 사용되는 NK 세포에 대한 공여자 공급원은 NK 세포에 대한 수용자일 수 있다. 따라서, NK 세포는 자가 공급원으로부터 기원할 수 있다. 다른 경우에, NK 세포에 대한 공여자 공급원은 반수체동종 또는 동종이계 공여자 공급원일 수 있다.
본원에서 추가로 키트 또는 장치에서 NK 세포를 제공하는 것이 이로울 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 하나의 양상에서, 본원에 개시된 것은 NK 세포 또는 NK 세포주를 추가로 포함하는, 골수 악성종양을 치료하기 위한 키트이다.
1. 약제학적 담체/약제학적 생성물의 전달
상기된 바와 같이, 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 생체내 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 다르게 바람직하지 못한 것이 아닌 재료를 의미하고, 즉, 상기 재료는 대상체에게 임의의 바람직하지 않을 수 있는 생물학적 효과를 유발하거나 이것이 함유된 약제학적 조성물의 다른 성분과 해로운 방식으로 상호작용하는 것 없이 핵산 또는 벡터와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 담체는 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 천연적으로 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 부작용을 최소화하기 위해 선택된다.
조성물은 경구로, 비경구로 (예를 들어, 정맥내로), 근육내 주사, 복막내 주사, 경피적으로, 체외로, 국소 비강내 투여 또는 ?입에 의한 투여를 포함하는 국소적으로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "국소 비강내 투여"는 콧구멍 중 하나 또는 둘 다를 통한 비강 및 비강 통로로 조성물의 전달을 의미하고 분무 기전 또는 소적 기전에 의해 또는 핵산 또는 벡터의 분무주입을 통한 전달을 포함할 수 있다. 흡입에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 소적 기전에 의한 전달을 통해 비강 또는 구강을 통한 것일 수 있다. 전달은 또한 직접적으로 삽관을 통해 호흡기 (예를 들어, 폐)의 임의의 영역에 직접 적용할 수 있다. 요구되는 조성물의 정확한 양은 대상체 마다 다양할 수 있고, 이는 대상체의 종, 연령, 체중 및 일반 조건, 치료받는 알레르기 장애의 중증도, 사용되는 특정 핵산 또는 벡터, 이의 투여 방식 등에 의존한다. 따라서, 모든 조성물에 대한 정확한 양을 구체화활 수 없다. 그러나, 적당한 양은 본원의 교시에 따라 단지 통상의 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
사용되는 경우 조성물의 비경구 투여는 일반적으로 주사를 특징으로 한다. 주사제는 통상적인 형태, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 전 액체 중 현탁액의 용액을 위해 적합한 고체 형태로서 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위해 보다 최근에 고안된 접근법은 일정한 용량이 유지되도록 서방출 또는 지연 방출 시스템의 사용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제3,610,795호를 참조하고 이는 본원에 참조로서 인용된다.
재료는 용액, 현탁액 (예를 들어, 마이크로입자, 리포좀 또는 세포에 혼입되는) 중에 존재할 수 있다. 이들은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형에 표적화될 수 있다. 하기의 문헌은 특정 단백질을 종양 조직에 표적화하기 위한 상기 기술의 용도의 예이다 (참조: Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); and Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). "스텔스 (stealth)" 및 다른 항체 접합된 리포좀 (결장 암종을 표적화하는 지질 매개된 약물을 포함하는)과 같은 비히클, 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개된 표적화, 림프구 지시된 종양 표적화 및 뮤린 신경교종 세포의 생채내 고도로 특이적 치료학적 레트로바이러스 표적화. 하기의 문헌은 특정 단백질을 종양 조직으로 표적화하는 상기 기술의 용도의 예이다 (참조: Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); and Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). 일반적으로, 수용체는 항상성으로 또는 리간드 유도된 세포내이입의 경로에 포함된다. 클라트린-코팅된 피트 내 이들 수용체 클러스터는 클라트린-코팅된 소포체를 통해 세포에 진입하고, 수용체가 분류된 산성화된 엔도좀을 통해 통과하고 이어서 세포 표면으로의 재활용은 세포내 분류되거나 리포좀 내에서 분류된다. 내재화 경로는 영양 섭취, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 소거, 바이러스 및 독소의 기회주의적 진입 및 리간드의 해리 및 분해 및 수용체-수준 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 많은 수용체는 세포 유형, 수용체 농도, 리간드 유형, 리간드 결합가 및 리간드 농도에 의존하여 하나 초과의 세포내 경로에 따른다. 수용체-매개된 세포내이입의 분자 및 세포 기전은 검토되었다 (참조: Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
a) 약제학적으로 허용되는 담체
항체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 치료학적으로 사용될 수 있다.
적합한 담체 및 이들의 제형은 문헌 (참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995)에 기재되어 있다. 전형적으로, 적당한 양의 약제학적으로-허용되는 염은 제형이 등장성이 되도록 제형 중에 사용된다. 약제학적으로-허용되는 담체의 예는 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용액의 pH는 바람직하게 약 5 내지 약 8이고, 보다 바람직하게 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지연 방출 제제를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들어, 필름, 리포좀 또는 마이크로입자 형태로 존재한다. 특정 담체가 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 조성물의 농도에 의존하여 보다 바람직할 수 있음은 당업자에게 명백할 거시다.
약제학적 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 이들 대부분은 전형적으로 생리학적 pH에서 멸균수, 식염수 및 완충 용액과 같은 용액을 포함하는, 약물의 인간으로의 투여를 위한 표준 담체이다. 상기 조성물은 근육내로 또는 피하내로 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자에 의해 사용되는 표준 과정에 따라 투여될 것이다.
약제학적 조성물은 선택된 분자에 추가로 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 항미생물제, 소염제, 마취제 등과 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지의 여부 및 치료될 영역에 의존하여 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적으로 (안과적으로, 질내, 직장으로, 비강내를 포함하는), 경구로, 흡입에 의해 또는 비경구로, 예를 들어, 정맥내 소적에 의해, 피하, 복막내 또는 근육내 주사일 수 있다. 개시된 항체는 정맥내, 복막내, 근육내, 피하로, 공동내로 또는 경피로 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 첨가액, 전해질 첨가액 (예를 들어, 링거 덱스트로스를 기반으로 하는 것들) 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항-산화제, 킬레이팅제 및 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
국소 투여를 위한 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 소적, 좌제, 분무제, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상의 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 염기, 증점제 등이 필요하거나 요구될 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 중에 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사쉐 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 요구될 수 있다.
조성물의 일부는 잠재적으로 약제학적으로 허용되는 산- 또는 염기-부가염으로서 투여될 수 있고, 상기 염은 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산과 같은 무기산 및 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 및 푸마르산과 같은 유기산과의 반응에 의해 형성되거나 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨과 같은 무기염기 및 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과 같은 유기 염기와의 반응에 의해 형성된다.
b) 치료학적 용도
조성물을 투여하기 위한 유효량 및 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있고 상기 결정의 단판은 당업자의 기술 범위내에 있다. 조성물의 투여를 위한 용량 범위는 장애의 증상에 발휘되는 목적하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 용량이다. 상기 용량은 원치않는 교차 반응, 과민성 반응 등과 같은 부작용을 유발할 정도로 크지 않아야 한다. 일반적으로, 상기 용량은 환자의 연령, 병태, 성별 및 질환 정도, 투여 경로 또는 다른 약물이 상기 용법에 포함되는지의 여부에 따라 다양하고 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 용량은 임의의 반증상의 경우에 개별 담당의에 의해 조정될 수 있다. 용량은 다양할 수 있고 하루 또는 수일 동안 하루 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 주어진 부류의 약제학적 제품에 대한 적당한 용량에 대한 지침은 문헌에 찾을 수 있다. 예를 들어, 항체에 대해 적당한 용량을 선택하는데 있어서의 지침은 항체의 치료학적 용도에 대한 문헌에서 찾을 수 있다(참조: 예를 들어, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389). 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 하루 용량은 상기 언급된 인자에 의존하여 하루 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 체중 이상의 범위일 수 있다.
D. 실시예
하기의 실시예는 당업자에게 본원에 청구된 화합물, 조성물, 제품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 만들어지고 평가되었는지에 대한 완전한 개시내용 및 기술을 당업자에게 제공하기 위해 제시되고 순전히 예시를 위한 것이고 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 수적인 것 (예를 들어, 양, 온도 등)과 관련된 정확도를 확신하기 위해 노력하였지만 일부 오차 및 편차가 설명되어야만 한다. 달리 지적되지 않는 경우, 부는 중량부이고, 온도는 ℃이거나 주위 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
1. 실시예 1: PM21-입자는 생체내 NK 세포 확장을 자극한다
천연 킬러 (NK) 세포는 선천적 면역계의 성분이고, CD56+CD3-인 것으로 동정되고 천연적으로 바이러스 손상되거나 악성인 세포를 인지하고 용해시킬 수 있다. NK 세포를 사용한 세포 치료요법은 암 치료제로서 전망이 있고 다수의 임상 시험이 수행되어 왔고 현재 다양한 암 (AML, 림프종, 유방암, 난소암, 신경모세포종, 비-소세포 폐 암종)의 치료를 위해 진행중에 있다. NK 세포를 사용한 효과적안 항-암 치료요법을 위해, 3개의 일반 양상이 고려되어야만 한다: 1) 충분히 큰 NK 세포의 용량이 전달되어야만 하고; 2) NK 세포는 고도로 세포 독성이어야만 하고; 3) NK 세포는 질환 부위에 도달하고, 능히 위치해야만 하고 지속적이고 종양 세포를 특이적으로 표적화해야만 한다.
AML 세팅에서 임상 효능을 위해, 밀러와 동료는 주입 후 2주 째에 말초 혈액 (PB) μL 당 적어도 100 NK 세포를 제공하는 용량을 달성할 것을 추천하였다. 입양 NK 세포 치료요법을 사용한 치료가 효과적인 일부 예에서, PB μL당 1,000 초과의 NK 세포가 관찰되었다. 이들 관찰은 전체 치료 효능을 위해 충분한 용량의 전달을 위한 능숙한 NK 세포 확장 방법의 중요성을 강조한다.
현재, 입양 세포 치료요법을 위한 NK 세포 확장을 위해 광범위하게 3개의 상이한 임상적으로 사용되는 전략이 있다. 첫번째로, 숙주 림프구고갈/조사와 조합된, IL-15 및 IL-2와 같은 사이토킨을 사용한 생체내 확장은 주사된 공여자 NK 세포의 상대적으로 낮은 양으로부터 생체내 확장을 자극할 수 있다. 두번째로, 주로 IL-2 및 IL-15를 사용하는 사이토킨을 사용한 생체외 방법은 NK 세포를 활성화시킬 수 있지만 확장은 비교적 낮고 가변적이다. 또한, 사이토킨을 사용한 생체외 활성화된 세포는 주입 후 사이토킨 철회를 진행하고 NK 세포는 아폽토시스를 진행한다. 세번째로, 생체외 NK 세포 확장을 위한 피더 세포 방법은 자극성인 다른 세포와의 동시-배양물을 사용한다. NK 세포 자극을 위한 피더 세포 방법은 엡슈타인-바르 바이러스-LCL 또는 조작된 종양 세포를 포함한다. 막 결합된 IL-15 (mb15) 및 4-1BB 리간드 (41BBL) (K562-mb15-41BBL)를 발현하는 K562 CML 세포와의 동시 배양물은 약 2주 내 NK 세포를 수백배 확장시킬 수 있지만 상기 방법에 의해 확장된 NK 세포는 노화를 경험한다. 추가로, IL-15를 사용하여 활성화된 NK 세포는 ADAM17의 단백질용해 활성에 의해 표면 CD16을 상실한다. 차라리, mb15 대신 mb21을 발현하는 K562 세포는 NK 세포 확장을 유의적으로 개선시키지만 텔로미어 감축 및 이에 따른 NK 세포 노화를 회피한다. K562-mb21-41BBL을 사용한 NK 세포의 확장은 매우 효율적이고 >85% 집적과 함께 평균 48,000배의 확장이 3주 내 성취되었다. 모든 이들 방법은 임상 시험에서 활성적으로 조사되었다.
NK 세포 확장 방법은 개선되었지만, 여전히 단점 및 도전 과제가 있다. 고독성 용량의 IL-2는 주입된 NK 세포의 생존을 위한 확장 방법과 상관 없이 요구되지만 NK 세포의 지속성은 제한되었다. 피더 세포를 사용한 생체외 방법은 대량의 NK 세포를 생성하기 위한 확장을 위해 효과적이지만, NK 세포의 장기 생체외 배양이 골수와 같은 질환 부위로의 호밍 능력의 상실을 유발한다는 것이 걱정 대상으로 부각되었다. 따라서, 생체내 대 생체외 확장의 전체 이득에 대해서는 논쟁이 있어왔다. 최적의 NK 세포 확장 과정은 생체외 피더 세포 기반 방법의 증식 능력을 갖는 방법이지만 생체외 또는 생체내 수행될 수 있다.
PB 단핵 세포 (PBMC)로 시작하는 세포독성 NK 세포의 신속하고 선택적인 확장을 위한 신규 PM21 입자 기반 방법. 폐쇄된 세포질막 소포체에 상응하는 입자는 K562-mb15-41BBL 세포의 세포질막 (PM15-입자)으로부터 제조되었고 14일 후 250배 및 17일 후 1,265배의 선택적 NK 세포 확장을 가능하게 하였고, 이는 동시-배양에서 K562-mb15-41BBL 피더 세포를 사용한 확장 효율에 상응할 수 있다. PM15-입자는 피더 세포 확장된 NK 세포와 유사한 NK 세포를 활성화시켰고 생체외 CML 및 AML 세포에 대해 고도로 세포독성이었다. 중요하게, 이들 입자는 피더 세포 방법 보다 많은 이점을 제공한다. 첫째로, 이들은 미리 제조될 수 있고, 1년 초과 동안 시험되고 저장되고 "제고품 (off-the-shelf) 시약"으로서 사용될 수 있고 입양 NK 세포 치료요법의 임상 로지스틱을 크게 개선시키는 단일 GMP 시설로 제한되지 않는다. 두번째로, 피더 세포 대신 NK 세포를 자극하기 위한 PM-입자의 사용은 피더 세포 조사와 같은 종양-유래된 피더 세포를 사용하고 최종 생성물에서의 이들의 존재 및 증식을 시험하는 경우 안전성 대책을 위해 요구되는 단계를 제거한다. 세번째로, 종양-유래된 피더 세포는 보조 치료요법으로서 주사될 수 없는 반면, PM-입자는 NK 세포의 생체내 확장을 자극하기 위해 주사될 수 있다. NK 세포 확장에 대한 PM-입자 기반 방법에 의해 제공된 이점은 상당한 임상적 이득을 가능하게 한다.
여기서, 상기 연구에서, K562-mb21-41BBL로부터 제조된 PM-입자의 효능은 임상 세팅에서 용이하게 수행될 수 있는 상대적으로 짧고 단순한 과정으로 사전-활성화된, 입양적으로 전달된 NK 세포의 생체내 확장에 대해 시험되었다. 상기 방법은 매우 최소의 생체내 NK 세포 확장 및 제한된 지속성을 단지 가능하게 하는 입양 NK 세포의 생체내 주입을 사용한 이전의 연구의 단점을 극복한다. 현재의 연구를 위해, 효능은 항온처리 및 PM21-입자에 의한 자극을 위해 동일계 부위로서 작용하는 것으로 의도된 복막 공동으로 주사된 비선택된 PBMC로부터의 NK 세포의 PM21-입자 자극된 생체외 및 생체내 확장에 대해 나타난다. 상기 방법은 치료학적 관련 양에서 NK 세포의 생체내 확장을 위해 유용한 것으로 예상되고 NK 세포-매개된 면역치료요법이 환자에게 보다 광범위하게 접근가능하게 하는 수단을 제공한다.
a) 재료 및 방법
(1) 인간 샘플
1차 백혈병 아세포는 환자로부터 수득하였고 상기 환자는 활성 질환 동안에 IRB-승인된 서면 동의서에 서명하였고 상응하는 PB는 차도 중에 있는 이들 환자로부터 수거하였다. 백혈병 공급원 (One Blood, Orlando, FL) 또는 IRB 승인된 서면 동의서에 서명한 건강한 지원자로부터 수거된 새로운 혈액은 건강한 샘플로서 사용하였다. PBMC는 Ficoll-Paque (GE Healthcare, Pittsburgh, PA)를 사용하여 단리하였다. 모든 샘플은 탈동정하였고 생존가능하게 냉동보존하였다.
(2) 시약 및 세포주
K562 세포주는 ATCC (Manassas, VA)로부터 수득하였다. 세포독성 검정을 위한 어넥신-V FITC 키트 및 제조원 (Beckman Coulter (Miami, FL))으로부터 구입한 나열 유동-계수 비드. 하기의 염료 접합된 항체는 표현형분류를 위해 사용하였다: CD16-FITC, NKG2A-PE, NKp46-PE, CD3-APC (Beckman Coulter); CD4-APC-Cy7, CD8-PE, CD56-BV421, CD94-APC (BD Biosciences); CD3-Alexa488, NKG2D-APC, CD62L-PE-Cy7, CD45-eFluor450, CD45-APC (eBiosciences); CD56-PE, KIR2D-APC (Miltenyi); NKG2C-PE NKp44-APC, TRAIL-PE (R&D Systems).
(3) 세포질 막 입자의 제조 및 특징 분석
PM-입자는 K562-mb21-41BBL 세포로부터 제조하였다. 세포는 5% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포는 원심분리 (1,000 x g, 10분)에 의해 수거하였고, 2 mM EDTA를 함유하는 DPBS로 세척하였다. 세포는 50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2 및 AEBSF, 아플티닌, 류펩틴 및 펩스타틴 A를 함유하는 용해 완충액 중에 재현탁시켰다. 세포는 4℃에서 30분 동안 300 psi에서 질소 공동현상에 의해 분쇄하였다 (Parr Instruments, Moline, IL). 세포 용해물을 원심분리 (1,000 x g, 10분)하고 상등액은 이어서 원심분리 (100,000 x g)하여 조 세포 막을 펠렛화하였다. 조 막은 슈크로스 농도 구배 원심분리에 의해 추가로 정제하고 폐쇄된 세포질 막 소포체에 상응하는 분획물을 수거하였다. 모든 과정은 무균 기술을 사용하여 수행하였고 생성물의 멸균성은 배양 중에 시험하였다. PM-입자 제제는 BCA 검정에 의한 단백질 농도에 의해 정량하였고 막 단백질/mL의 ㎍으로서 특정하였다. PM-입자에 대한 IL-21 및 41BBL의 존재는 ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.
(4) PBMC로부터 생체외 NK 세포 확장
PBMC로부터의 NK 세포는 PM21-입자를 사용하여 확장시켰다. 간략하게, PBMC는 10% FBS, 2 mM Glutamax, 100 U/mL IL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) 및 200 μg/mL PM21-입자가 보충된 SCGM (CellGenix, Portsmouth, NH)에서 0.1 x 106 NK 세포/mL로 씨딩하였다. 보충된 배지는 통상적으로 5일 후 2 내지 3일 마다 대체하였다.
(5) 자가 환자 NK 세포 세포독성 검정
자가 AML 종양 세포에 대한 환자 유래된 NK 세포의 세포독성 검정은 Annexin V (BD Bioscience)를 사용하여 검정하였다. 16일 동안 확장된 NK 세포 (NK 세포 함량 >90%)은 TFL4 염료로 염색시켰다. 표적 종양 세포는 37℃, 5% CO2 대기에서 2시간 동안 NK 세포와 1:1, 2:1, 5:1, 및 10:1의 E:T 비율로 0.5 x 106 CD34+ 세포/mL로 동시 배양하였다. 이어서, 상기 세포를 원심분리하고 Annexin V-FITC, 항-CD34-PE, 및 항-CD56-PC7을 함유하는 Annexin V 표지화 완충액 중에 재현탁시키고 4℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 표지된 항체는 250 μL로 희석시키고 Accuri 장치 (BD Bioscience) 상에서 유동 세포측정에 의해 분석하였다.
(6) MSG 마우스에서 NK 세포의 생체내 확장
새롭게 해동되거나 2일 동안 200 μg/mL PM21 및 100 U/mL IL-2로 사전 활성화된 PBMC는 2회 세척하고 페놀 레드-부재 RPMI 배지에 재현탁시켰다. 전체 PBMC 세포 현탁액 중 1 x 105 NK 세포를 i.p.로 NSG (NOD-scid IL-2Rgammanull) 마우스에 주사하였다. PM21-입자 (주마다 2회 도면 범례에 특정된 양) 및 IL-2 (주마다 3회, 1,000 U)는 또한 i.p.에 주사하였고 PB는 볼 채혈 또는 심장 천자에 의해 수거하였다. 기관을 부검시에 수거하였고 관류시켜 분석을 위해 단일 세포 현탁액을 수득하였다.
b) 결과
(1) 건강한 공여자 및 백혈병 환자로부터 유래된 NK 세포의 생체외 및 생체내 확장.
mbIL21을 발현하도록 조작된 K562 세포는 노화 없이 NK 세포 확장을 위해 보다 양호한 효율을 갖는 것으로 보고되었기 때문에, PM-입자는 K562-mb21-41BBL 세포로부터 제조하였고, PM21-입자로 지칭하였다. PM21-입자는 크기 분포, 및 mbIL21 내용물의 일관성을 특징으로 하였고 (도 S1), 이들의 NK 세포 확장 능력에 대해 시험하였다.
PBMC는 28일 동안 PM21-입자 (200 μg/mL)로 배양하였다. PM21-입자로 자극된 NK 세포를 확장시키고 NK 세포의 함량은 PM21-입자 자극된 NK 세포 배양물 c에서 14일까지 >90%에 도달하였다 (도 1ab). 배양 14±1일에 NK 세포 확장의 누적 분석은 PM21-입자 (평균 825 배수 확장, 범위 163-2,216, n=13)는 PM15-입자 (평균 424 배수, 범위 290-570, n=30)와 비교하여 상당히 (p=0.021) 보다 효과적임을 보여주었다 (도 1c). 추가로, PM21-입자로 자극된 NK 세포는 28일의 기간 동안에 대수적으로 확장하여 100,000 배수 초과의 확장에 도달하였고, 이는 노화로 인해 22일 배양으로 중지된 PM15-입자를 사용한 NK 세포 확장과는 대조적이다. 따라서, PM21-입자는 PM15-입자 보다 개선된 NK 세포 확장 능률을 갖고 PM21-입자를 사용한 NK 세포 확장은 PM21-입자가 유래된 K562-mb21-41BBL 피더 세포를 사용하여 보고된 것에 상응하였다. PM21-확장된 NK 세포는 또한 백혈병 세포주에 대해 세포독성이었다 (도 S2).
PM21-입자의 NK 세포 확장 능력은 추가로 차도중에 있는 백혈병 환자 기원의 PBMC를 사용하여 시험하였다. PM21-입자는 14일 배양 후 모든 3명의 환자 유래된 샘플로부터 상대적으로 효율적으로 NK 세포 확장을 유도하였다 (F021에 대해 113±7 배수, M038에 대해 810±81 배수, 및 M050에 대해 352±86 배수, 도 1d). 확장은 NK 세포에 특이적이었고, 여기서, 총 hCD45+ 세포에 대한 NK 세포의 백분율은 우선적으로 상승하였다 (도 1e). 샘플 F021에 대해, 확장된 NK 세포의 세포독성은 활성 질환 동안에 동일한 환자로부터 수득된 종양 아세포에 대한 자가 세팅에서 시험하였다 (도 1f). 1:1의 상대적으로 낮은 이펙터 대 표적 비율 (E:T)에서, 78±3%의 종양 세포는 아폽토시스성이었다. 따라서, 상기 방법은 자가 이식 세팅에서 사용될 수 있다.
PM-입자의 전례없는 능력은 주사가능하고 생체내 확장을 자극한다. PM21-입자가 생체내 NK 세포 확장을 자극하는지를 시험하고 생체외 사전 활성화가 요구되는지를 결정하기 위해, NSG 마우스에 비처리된 PBMC 또는 PM21-입자 사전-활성화된 PBMC (PM21-PBMC)의 일부로서 0.1 x 106 NK 세포를 i.p로 주사하였다. 비-활성화된 PBMC가 주사된 마우스는 PB에서 낮은 양의 인간 NK (hNK) 세포를 가졌고 단지 hT 세포가 주사 후 15일 초과로 총 hCD45+ 세포의 백분율로서 증가하였다 (도 2ab). 상당히 대조적으로, PM21-PBMC가 주사된 마우스의 PB는 i.p. 주사 후 12일에 최고가 되는 hNK 세포의 상승된 양을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 2cd). NK 세포 함량은 hCD45+ 세포의 53±8 %로 집적되었다. 동일한 실험에서, 효능은 보다 양호한 생체내 NK 세포 확장을 촉진시키기 위해 PM21-입자의 생체내 i.p. 적용을 위해 시험하였다. 정규적 PBMC가 주사된 마우스에 대해, 추가의 생체내 PM21-입자는 hNK 세포 확장을 자극하지 못하였다. 그러나, PM21-입자의 생체내 PM21-PBMC가 접목된 마우스로의 적용은 hNK 세포 양이 생체내 PM21-입자를 투여받지 못한 PM21-PBMC를 사용한 마우스와 비교하여 보다 높은 효과를 가졌다 (도 2d).
PM21-입자가 생체내 NK 세포 집단을 유도한다는 증거를 제공하기 위해, 분석은 i.p. 접종 후 6일 째에 생체내 확장하는 CT바이올렛 표지된 hNK 세포를 사용하여 수행하였다. 비-활성화된 PBMC가 주사된 마우스 기원의 세포는 CT바이올렛 형광성이 전혀 또는 거의 감소하지 않았고 이는 NK 세포의 분열이 없거나 거의 없음을 지적한다 (도 3 ab). PM21-PBMC가 주사된 마우스로부터의 hNK 세포는 CT바이올렛 형광성 강도에 대한 상당한 감소를 보여주었다 (도 3 cd). 형광 강도의 피팅은 상기 강도 감소가 6일 이내 생체내 7 세포 분열로 분열하는 주요 집단과 서로 관련됨을 보여주었다. PM21-입자의 i.p. 주사를 투여받은 마우스로부터 수득된 hNK 세포에 대해, 하나 더 많은 분열이 관찰될 수 있다. 생체내 PM21-입자의 투여를 사용한 상기 추가의 배가는 생체내 PM21-입자를 사용하여 PB 중에 관찰된 보다 높은 NK 세포 양과 서로 관련된다.
생체내 PM21-입자가 생체내 NK 세포 확장을 증진시키는지를 추가로 입증하기 위해, 생체내 PM21-입자의 용량 의존성을 연구하였다 (도 4). PB 중 hNK 세포에서 용량 의존성 증가는 주사 당 0 내지 800 μg의 PM21-입자인 것으로 관찰되었다 (도 4e). 800 μg (mbIL21의 약 100 ng에 상응하는)의 용량에서, PB의 μL 당 470±40 hNK 세포는 PM21-PBMC의 i.p. 주사 후 12일 째에 관찰되었다. PB 중 상기 NK 세포 농도는 AML 세팅에서 치료학적으로 효과적인 것으로 일반적으로 사료되는 농도 보다 5배 초과였다. 생체내 확장을 위한 용량 의존성 이펙터는 hNK 세포에 대해 특이적이었고 여기서, T 세포 양은 상당히 증가하지 않았다 (도 4e). 주사 당 1,600 μg의 보다 높은 양에서, PB hNK 세포 양은 감소하였고, 이는 생체외에서 관찰된 효과와 유사하였고, 여기서, ~200-400 μg/mL는 PM21-입자 또는 PM15-입자에 대해 최적이고 보다 높은 양이 NK 세포 확장을 약화시켰다.
PB 중 hNK 세포의 상당한 양의 관찰은 i.p. 주사된 PM21-PBMC에서 hNK 세포 확장이 복부 공동으로부터 PB로 이동할 수 있음을 보여준다. 입양적으로 전달된 hNK 세포가 질환의 잠재적 부위로 이동할 수 있는지를 입증하기 위해, 다양한 기관에서 hNK 세포를 정량하였다 (도 5). 인간 NK 세포는 조사된 모든 기관에서 밝혀졌고, 보다 높은 양의 hNK 세포는 800 μg의 PM21-입자로 생체내 처리된 마우스 기원의 기관에서 발견되었고, 간에서 제외하고는 상당히 유의적이었다 (p<0.05). 추가로, 800 μg의 PM21-입자로 처리된 마우스 기원의 기관은 총 hCD45+ 세포의 분획으로서 보다 높은 hNK 세포의 백분율을 가졌다.
기재된 마우스 기반 연구는 생체외 짧은 사전 활성화와 PM21-입자 및 PM21-입자의 생체내 투여를 조합하는 과정이 잠재적으로 치료학적으로 관련된 범위에서 유의적인 생체내 NK 세포 확장을 유도함을 보여주었다. 임상적 용도를 위해 필요한 일관성을 보여주기 위해, 상기 과정은 3개의 상이한 공여자 (다른 실험에 사용되는 것들과 상이한) 기원의 백혈구 공급원에 적용하였다 (도 6). PB 및 복부 세척 둘 다에서 hNK 세포의 평균 양은 백혈구 공급원 간에 상대적으로 일관성이 있었다. hNK, hT 세포 및 다른 hCD45+ 세포의 백분율은 또한 특정 백혈구 공급원 (n=3) 기원의 PM21-PBMC가 주사된 그룹 내 마우스에 대해서 및 또한 백혈구 공급원 L8과 L10 간에 매우 일관성이 있었다.
(2) PM21-입자로 확장된 NK 세포의 표현형.
NK 세포의 항-종양 세포용해 활성은 활성화 및 저해성 신호로부터의 자극의 균형에 의해 결정한다. 여기서, 세부적인 비교 조사는 1) 12일 동안 PM21로 생체외 확장되고, 2) 생체내 확장되고 PB로부터 단리되고, 3) 생체내 확장되고 복부 세척으로부터 단리된(AW) PM21-입자 자극된 NK 세포에 대해 수행하였다. 이들 비교는 세팅 모두에서 단일 공여자 기원의 세포를 사용하여 수행하였고 병행하여 수행하였다 (도 S3).
NK 세포 상에 CD16, Fcγ 수용체의 존재는 효과적인 항체 의존성 세포독성 (ADCC)을 위해 요구된다. 생체내 확장으로부터 거의 모든 NK 세포는 CD16의 발현을 보여준다 (각각 PB 및 AW에 대해 97% 및 87%). CD94는 NKG2C 또는 NKG2A와 이종이량체 복합체를 형성하는 표면 수용체이다. 생체외 확장된 NK 세포의 약 절반은 CD94 발현을 갖는다. 생체내 확장된 NK 세포에 대해, AW 기원의 세포 (64±9%)는 PB 기원의 NK 세포 (38±13%) 보다 높은 발현을 갖는다. 활성화 수용체로서 NKG2C 및 저해성 수용체로서 NKG2A를 포괄하는 NKG2 패밀리 수용체는 둘 다 CD94에 결합한다. 생체외 확장된 NK 세포는 NKG2C의 상대적으로 낮은 발현을 갖지만, AW 기원의 NK 세포는 보다 높았고 (53±8%) 여전히 PB로부터 NK 세포에 대해 보다 높았다 (61±2%). NKG2A를 발현하는 NK 세포의 분획은 PB (67±12%) 및 생체외 확장 (74%) 보다 AW (82±8%)에서 보다 높았다. NKG2D는 NK 세포상에서 발견되는 또 다른 중요한 활성화 수용체이고 이의 발현은 61±6%의 AW NK 세포, 26±3%의 PB 및 생체외 확장된 약 75%의 NK 세포상에서 발견되었다. 골수 호밍과 서로 관련된 것으로 공지된 CD62L의 발현은 PB 중 NK 세포 (63±10%)에서 보다 높았고, AW에서의 것(39±14) 보다는 낮았으며, 이는 이동된 세포 상에서 발현이 보다 높다는 것과 일관성이 있다. NKp44 및 NKp46은 천연 세포독성 수용체 패밀리의 구성원이고 NK 세포 매개된 세포용해에 특정 역할을 수행한다. NKp46은 PB (76±9%) 및 AW (89±5%) 둘 다로부터의 NK 세포 상에서 발현되었다. NKp44는 모든 공급원 기원의 이들 NK 세포에서 상대적으로 잘 발현되지 않았다. 한편, NKp46은 PB (89±5) 및 AW (76±9) 둘 다로부터 잘 발현되었다. TRAIL은 사멸 수용체 경로를 통해 표적의 아폽토시스를 유도하는 NK 세포 상의 리간드이다. TRAIL은 AW 기원의 NK 세포 36±6%, PB 20±4% 및 생체외 확장된 세포 26% 상에서 발현하였다. KIR2D는 킬러 면역글로불린-유사 수용체 (KIR) 2D 서브타입이고 생체내 또는 생체외 발현된 KIR2D로부터의 NK 세포의 소수 (약 1/3)이다. CD8 및 CD4 T 세포의 비율을 분석하였고 CD8 T 세포가 생체내 샘플 기원의 CD4 T 세포보다 더 풍부한 것으로 밝혀졌다. NK 억제성 Treg 세포의 존재가 또한 탐지되었고 매우 소수 (모든 CD3+ 세포의 <0.1%)가 생체내 샘플에서 관찰되었다.
c) 논의
(1) PM21-입자는 생체외 및 생체내 NK 세포 확장을 치료학적 관련 양으로 촉진시킨다.
입양 NK 세포 치료요법은 다양한 종양의 초기 치료 및 차도 유지를 위한 암 치료요법으로서 높은 전망을 유지한다. NK 세포의 치료학적 용도를 위한 요건은 안전하고, 단순하고 전체 치료확적으로 효과적인 신속하고 선택적인 NK 세포 확장을 위한 방법이다. 여러 사이토킨 및 피더 세포 기반 방법은 현재 임상적으로 연구되고 있고 K562-mb21-41BBL 세포주를 사용한 방법은 생체외 NK 세포 확장을 위해 가장 효과적인 것 중에 있다. 피더 세포 방법은 높은 초기 용량을 제공하기 위해 효과적이고 다중 용량을 가능하게 할 수 있지만, 백혈병 치료를 위해 중요한, 골수로의 호밍을 위한 생체외 확장된 NK 세포의 능력은 영향받을 수 있고 주입된 NK 세포의 생체내 지속성은 최적일 수 없다. 본원에 기재된 조합된 생체외 및 생체내 PM21-입자 기반 NK 세포 확장 방법은 NK 세포 입양 치료요법의 효능을 상당히 증진시킬 수 있다.
중요하게, PM21-입자는 생체내 확장 및 지속성을 촉진시키기 위한 생체내 자극을 위해 사용될 수 있다. 본원에서 개발된 방법은 짧은 2일 생체외 사전 활성화에 이어서 PM21-입자의 생체내 투여를 사용하였다. PM21-입자의 생체내 적용은 보다 높은 생체내 NK 세포 확장을 유도하였고, 용량은 생체내 적용된 PM21-입자에 의존한다. 현재의 최적화된 과정을 사용하여, PB NK 세포의 평균 360-배 생체내 증가는 PM21-PBMC의 i.p. 주사 후 5 내지 12일에서 관찰되었고, 아마도 복막내 공동에서 확장 배수를 초과한다. 비교를 위해, 최근 연구에서 1-2 x 106 NK 세포의 i.v. 주입 후, 혈액 μL 당 단지 약 5 내지 17 NK 세포는 주입 후 14일 째에 관찰될 수 있었다. 대조적으로, PM21-입자 자극을 사용한 이 연구에서, 2.0 x 106 PM21-PBMC (11%, 즉, 0.2 x 106 NK 세포)의 i.p.주입 후 12일째 >400 NK 세포/μL 혈액이 관찰되었다. 또한, 전자의 연구는 IL-2 또는 IL-15의 주사 (주당 3회) 당 5 μg (~50,000 U)을 사용한 반면 상대적으로 낮은 용량의 IL-2 (1,000 U/주사, 주당 3회)는 상기 연구에 사용되었다. 상이한 연구에서, K562-mb15-41BBL 피더 세포로 생체외 우선적으로 확장된 30 x 106의 NK 세포는 i.v. 주사하였고 이어서 항-CD45 항체 (항-CD56 및 항-CD3의 조합에 의해서 아닌)를 사용하여 주사된 인간 림프구를 추적하였다. 이들의 방법을 사용하여, 고용량의 i.p. 주사된 IL-2 (25,000 U/하루)는 림프구 지속성을 위해 요구되었고, NK 세포 농도는 결정되지 않았지만 차라리 암시되었다. 이들 이전의 방법과 비교하여, PM21-입자 자극된 생체내 NK 세포 확장의 정도는 전례가 없고 PM21-입자의 특유의 능력이다.
여기서, PM21-PBMC의 NSG 마우스로의 전달 경로는 이전의 임상전 연구와 유사한 i.p. 주사에 의한 것이었다. 이들 이전의 연구와 비교하여, PM21-입자 기반 방법은 여러 양상에서 유리하다. 첫번째로, PM21-입자와 조합된 생체외 사전 활성화 및 생체내 자극은 성분채집술에 이어서 NK 세포 집적에 대한 광범위 연구 프로세싱에 의한 대량의 림프구의 수거를 요구하는 단리된 NK 세포의 사이토킨 활성화와 비교하여 보다 소량의 선택되지 않은 PBMC의 사용을 가능하게 한다. 둘째로, PM21-입자 기반 방법은 단지 2주 배양 기반 확장 대신 짧은 2일 사전 활성화를 요구하고, 이는 생리학적 관련 기능의 보다 양호한 보존을 가능하게 할 수 있다. 세번째로, 현재 방법은 임상 독성과 관련된, 고용량 IL-2의 사용 없이 확장 또는 생체내 지속성을 가능하게 하지 않는 이전의 방법과 비교하여 보다 크 생체내 확장을 가능하게 한다. 복막내 종양에 대해, 현재 기재된 방법의 이점은 전체 항-종양 효과를 상당히 증진시킬 수 있다. 복막내 종양의 부재하에, 복막내 공동은 CT바이올렛을 사용한 증식 분석에 의해 명백히 보여지는, 양호한 생체내 확장을 발전시키기 위해 상기 용량으로 국한시킴에 의해 호의적일 수 있는 환경을 제공할 수 있고, 이어서 NK 세포는 상당한 양으로 PB 및 기관으로 이동할 수 있다. NK 세포는 PB에서 관찰되었을 뿐만 아니라, 기관에서 발견되었고 또한 PM21-입자의 생체내 적용이 보다 풍부하였다. 골수에서 측정된 NK 세포 양은 CD34+ 제대혈 줄기 세포로부터 생성된 NK 세포를 사용한 연구에서의 것들에 상응하였고, 이들 NK 세포가 골수 호밍을 위해 적격임을 지적한다.
병행 생체외 또는 생체내 (도 S3)에서 확장된 NK 세포의 표현형 분류는 수득한 세포가 상기 접근법과 상관 없이 유사하였음을 지적하였다. 흥미있는 차이는 생체외 세팅에서 아니라 생체내 확장된 NK 세포와 함께 대부분 관찰된 NKG2A- 및 NKG2C+ 서브집단의 확장과 관련하여 관찰되었다. NKG2C+ NK 세포 집단은 바이러스 재활성화 동안에 관찰되었고, 이는 "기억-유사" 반응과 관련되었고 최근에 IL-12의 생성을 위해 단핵구에 의존하는 것으로 나타났다. AML에 대한 줄기 세포 이식 후 CMV 재활성화를 갖는 환자에서 NKG2C+ NK 세포의 존재는 또한 보다 양호한 결과 및 적은 재발과 관련되었다. 또한, HLA-E 유도된 억제에 내성인 NKG2A- NK 세포의 유의적 집단의 존재는 다중 골수종 호나자의 치료에서 중요할 수 있고, 여기서, 세포는 HLA 부류 I를 하향조절하지만 NK 세포 반응을 회피하기 위해 HLA-E를 발현한다. NKG2A의 하향조절을 겨냥한 접근법은 NK 세포 세포독성 및 따라서 이들의 치료학적 잠재력을 개선시키기 위한 수단으로서 제안되었다. 생체외 확장된 세포는 대부분 NKG2A+이기 때문에, 후속적 생체내 확장을 사용한 생체외 배양물의 시간을 감축시키는 것이 표적에 대해 보다 큰 표현형 다양성 및 잠재적으로 양호한 세포독성을 갖는 NK 세포의 생성이 추가의 이득을 제공할 수 있다.
(2) PM21-입자의 잠재적 임상적 용도.
NK 세포 확장을 위한 PM21-입자의 능력은 암 치료를 위한 그리고 또한 잠재적으로 다른 병에 대한 입양 NK 세포 치료요법을 보다 광범위하게 사용할 수 있게 한다. PM21-입자는 현재 임상적 시험에 사용되는 피더 세포를 용이하게 대체하여 로지스틱을 완화시키고 위험을 경감시킬 수 있다. 종양 유래된 피더 세포의 사용이 금지되거나 승인을 받기가 어려운 규제 관리를 위해, PM21-입자는 생체외 확장 및 활성화를 위한 이미 해결책이다. 동종이계 세팅에서 생체외 확장을 위한 PM21-입자의 용도를 위해, T 세포 고갈은 생체외 NK 세포 확장 전 수행될 수 있다. K562-mbIL21과 함께 성장한 NK 세포의 현재 임상 시험은 GvHD를 유발할 수 있는 동종이계 T 세포를 제거하기 위한 NK 세포 확장 전 T 세포 고갈을 사용한다. 더욱이, PM21-입자의 생체내 투여는 추가로 생체외 NK 세포를 확장시킬 수 있고, 전례없는 능력으로 능히 T 세포 확장을 감소시켜 GvHD를 경감시킨다. 지속적 난소 상피 암 또는 섬유조직형성 소형의 둥근 세포 종양에서와 같이 복막 암 및 다른 복막내 종양의 치료를 위해, 상기 NK 세포 확장 방법은 임상적으로 해독될 수 있다. 복막내 종양의 제거를 위한 항-종양 효능 실험은 현재 진행 중에 있다. 자가 치료를 위한 PM21-PBMC 및 PM21-입자의 사용이 가능하고 T 세포 고갈을 혼입하는 방법은 동종이계 세팅에서 적용을 위해 개발되고 있다.
중요하게, 이 방법에 의해 확장된 NK 세포는 복부 공동으로부터, 다양한 다른 암의 잠재적 부위인 말초 혈액 및 다중 기관으로 생분포시킨다. 주사의 i.p. 경로는 조혈학적 악성종양의 치료를 위해 통상적이지 않지만, 이 i.p. 경로에 의한 NK 세포의 전달은 AML 치료를 위해 적절한 NK 세포의 PB 농도를 유발한다.
NK 세포 특이적 신호전달을 위한 입자 기반 접근접은 호밍, 항-종양 세포독성 및 지속성을 증진시키기 위해 NK 세포의 추가의 표적화된 자극의 팩키징된 전달을 위한 다른 신호 전달 분자 또는 심지어 비히클을 포함하는 플랫폼일 수 있다. PM21-입자는 개발되고 있는 모든 혁신적인 NK 세포 특이적 면역치료요법 방법 (관문 저해제, 이특이적 인게이저 (BiKE), Treg 고갈을 위한 DT 융합된 IL-2, 등) 및 NK 세포의 PM21-자극으로의 생체내 확장시 혼용되는 이로운 효과와 상호 보완적일 수 있다. 심지어 예비-임상 용도로서, 현재 기재된 방법은 상기 조합 방법을 연구하기 위해 전례없는 방법을 가능하게 할 수 있다. 물론, 뮤린 모델이 있지만, 유의적 지속기간을 위해 생체내 존재할 수 있는 인간 NK 세포를 연구하기 위한 다른 방법이 없다.
요약하기 위해, PM21-입자를 사용한 상기 과정은 피더 세포와 함께 생체외 확장을 사용하지만 독성인 피더 세포 또는 높은 사이토킨 용량과 함께 세포를 배양할 필요 없이 성취되는 전형적인 수준에서 생체내 우선적 NK 세포 확장을 가능하게 한다. 추가로, PM21-입자의 생체내 전달과 함께 PM21-PBMC는 자가 세팅에 사용하여 NK 세포 기능 상에 다른 면역 세포의 이로운 상승작용 효과를 이용할 수 있고 추가로 항-KIR 항체 또는 BiKE와 같은 다른 전략과 조합하여 NK 세포 세포독성을 최대화할 수 있다. 따라서, 이 방법은 잠재적 치료학적 효능을 위해 NK 세포의 생성을 위한 기준을 충족하고 임상 해독을 위해 보다 단순하고 처리할 수 있으며, 암 또는 다른 병의 치료를 위해 영향받을 수 있다.
2. 실시예 2: PM21 입자에 의한 푸코실화의 자극을 통한 NK 세포의 골수 트래피킹
IL-21 및 41bbl의 조작된 막 결합된 형태 (K562.mb21.41bbl)를 발현하도록 형질전환된 K562 세포로부터 제조된 PM21-입자는 NK 세포의 효율적인 특이적 확장을 유도한다. NK 세포와의 동시-배양물에서 피더 세포 (FC21)로서 사용되는 PM21-입자 또는 K562.mb21.41bbl에 의해 제공된 자극은 유동 세포측정으로 HECA-452 mBb 결합에 의해 관찰되는, sLex의 모든 형광성을 유도할 수 있다.
NK 세포는 PM21 또는 FC21에 의해 확장되었고 HECA452 mAb로 염색시키고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. HECA452는 PSGL-1, CD44 및 다른 E-셀렉틴 리간드의 푸코실화된 형태를 특이적으로 인지한다. PM21 또는 FC21로 자극된 NK 세포는 비처리된 NK 세포, 가용성 사이토킨으로 처리된 NK 세포, 또는 단지 mbIL21 (그러나 41bbl이 아닌)을 갖는 NK 세포 처리된 피더 세포와 비교하여 유동 세포측정 분석에 의해 유의적으로 보다 높은 MFI를 가졌다. 이것은 고도로 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포를 사용한 자극이 NK 세포의 골수로의 트래피킹을 구동할 수 있고 PM21 또는 FC21을 사용한 자극을 통해 생성된 치료학적 NK 세포의 골수 트래피킹이 골수를 개선시킬 수 있고 골수 유래 악성 종양을 개선시킬 수 있음을 지적한다.
도 7은 자극의 0, 1, 7 및 10일 후 NK 세포의 HECA452 염색에 대한 가용성 사이토킨의 효과를 보여준다. 입자 또는 피더 세포 자극의 효과는 도 8에 나타내고, 여기서, NK 세포는 K562 세포 또는 막 결합된 IL-21 및 41BBL을 갖는 K562 세포 (FC21 세포 또는 PM21 입자)를 10, 12, 또는 14일 동안 자극하였고 HECA452는 염색되었다. K562 유래된 FC21 피더 세포 또는 PM21 입자로 자극된 NK 세포는 IL-21 없이 K562 피더 세포로 자극된 NK 세포에 상대적으로 현저한 활성화를 보여주었다. 도 9 및 10은 NK 세포에 대한 다양한 조건을 사용한 배양 10일의 효과를 보여준다. NK 세포는 나타낸 바와 같은 다양한 조건과 함께 10일 동안 배양하였다. NK 세포는 푸코실화된 형태의 SLex를 검출하는 FITC 접합된 HECA 452 mAb로 탐지하였다. 배양물로부터의 세포는 HECA452-FITC로 염색시키고 CD56+CD3-상에 게이팅함에 의해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. (CSTX2 = CytoSen's K562.mb21.41bbl; FC=피더 세포; PM21=CSTX2로부터 제조된 세포질 막 입자).
거주 기간이 자극된 NK 세포 상에 미치는 효과를 알기 위해 (도 11), NK 세포는 CSTX2-PM21-입자 (상부)로 10일 동안 항온처리하고 이어서 PM21-입자를 제거한 후 3일 동안 배양물 중에 "거주"시켰다 (하부). NK 세포는 푸코실화된 형태의 SLex를 검출하는 FITC 접합된 HECA 452 mAb로 탐지하였다. 배양물로부터의 세포는 HECA452-FITC로 염색시키고 CD56+CD3-상에 게이팅함에 의해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. (CSTX2 = CytoSen's K562.mb21.41bbl; FC=피더 세포; PM21=CSTX2로부터 제조된 세포질 막 입자).
PM21 입자로 차극된 NK 세포는 안정하고 세포에 대한 어떠한 감지할만한 효과 없이 동결 해동 프로세스에서 살아남았다 (도 12). NK 세포는 PBMC (상부)로부터 단리하고, 이어서 CSTX2-PM21-입자 (중앙)로 10일 동안 항온처리하고 이어서 냉동보존하고 해동시켰다 (하부). NK 세포는 푸코실화된 형태의 SLex를 검출하는 FITC 접합된 HECA 452 mAb로 탐지하였다. 배양물로부터의 세포는 HECA452-FITC로 염색시키고 CD56+CD3-상에 게이팅함에 의해 유동 세포측정에 의해 분석하였다. (CSTX2 = CytoSen's K562.mb21.41bbl; FC=피더 세포; PM21=CSTX2로부터 제조된 세포질 막 입자).
E. 참조문헌
Claims (10)
- NK 세포를 하나 이상의 PM21 입자 및 FC21 피더 세포 (feeder cell)와 접촉시킴을 포함하여, 상기 NK 세포를 골수로 트래피킹 (trafficking)하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 방법이 상기 NK 세포를 IL-2, IL-12, 및/또는 IL-18로 자극시킴을 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 상기 NK 세포의 접촉이 상기 NK 세포의 환자로의 전달 전에 일어나는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 상기 NK 세포의 접촉이 상기 NK 세포의 환자로의 전달 후에 일어나는, 방법.
- 청구항 1, 3 또는 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 NK 세포 내 세포 기전을 유도하여 상기 NK 세포 표면 상에 PSGL-1의 푸코실화를 유도하는, 방법.
- 청구항 1, 3 또는 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 NK 세포 표면 상의 PSGL-1의 푸코실화와 서로 관련된 NK 세포 내 FUT7의 발현을 유도하는, 방법.
- NK 세포를 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 접촉시키고 상기 NK 세포를 대상체에게 입양적으로 전달함을 포함하는, 상기 대상체에서 골수 악성종양 또는 골수 유래 악성 종양 (bone marrow born malignancy)을 치료하는 방법.
- NK 세포를 하나 이상의 PM21 입자 및 FC21 피더 세포와 접촉시키고 상기 NK 세포를 대상체에게 입양적으로 전달함을 포함하여, 상기 대상체에서 골수와 관련된 바이러스 감염을 치료하는 방법.
- 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 상기 NK 세포의 접촉이 상기 NK 세포의 환자로의 전달 전에 일어나는, 방법.
- 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 PM21 입자 및/또는 FC21 피더 세포와 상기 NK 세포의 접촉이 상기 NK 세포의 환자로의 전달 후에 일어나는, 방법.
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