KR20190117495A

KR20190117495A - 타이핑 방법

Info

Publication number: KR20190117495A
Application number: KR1020197021527A
Authority: KR
Inventors: 어로울 셀밤 라마다스; 이완 헌터; 알렉상드르 아쿨리츠체프
Original assignee: 옥스포드 바이오다이나믹스 리미티드
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2019-10-16
Also published as: CA3047888A1; JP7045086B2; US11535893B2; EP3559254A1; CN110225981B; JP2020513748A; WO2018115802A1; AU2016433121A1; AU2016433121B2; US20190309367A1; MY191260A; CN110225981A

Abstract

본 발명은 신경 퇴행성 질환에 대한 후생적 검사와 관련된 후생적 염색체 상호작용을 검출하는 방법을 제공한다.

Description

타이핑 방법

본 발명은 염색체 상호작용을 검출하는 것에 관한 것이다.

현재 신경 퇴행성 질병(neurodegenerative disease)의 진단은, 특히 초기 단계에서 어렵다. 보통 진단은 정신 능력의 저하와 같은 증상이 나타나기 시작할 때 발생한다.

발명자는 염색체 상호작용이 신경 퇴행성 질환(condition)과 관련된 게놈의 영역을 확인하였다. 본 발명자는 염색체 상호작용을 기반으로 하는 상이한 신경 퇴행성 특징을 갖는 서브그룹에서 개체의 타이핑을 허용한다.

따라서, 본 방법은 서브그룹 사이를 구별하는 신경 퇴행성 질환에 대한 후생적 검사와 관련한 후생적 염색체 상호작용(epigenetic chromosome interaction)을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 서브그룹으로부터의 제1 핵산 세트를 염색체 상호작용의 인덱스 개체군(index population)을 나타내는 제2 핵산 세트와 접촉시키는 단계, 및 상보적 서열을 하이브리드화 되도록 허용하는 단계를 포함하고, 상기 제1 및 제2 핵산 세트의 핵산은 후생적 염색체 상호작용에서 함께 모인 염색체 영역 양쪽으로부터의 서열을 포함하는 결찰된 생성물(ligated product)을 나타내고, 상기 제1 및 제2 핵산 세트 사이의 하이브리드화 패턴은 후생적 염색체 상호작용이 상기 개체군에서 서브그룹에 특이적인지를 결정할 수 있게 하며, 상기 서브그룹은 임의로 상기 질환의 진단, 예후, 발달 가능성 및/또는 성향으로부터 선택된 상기 질환과 관련하여 적어도 하나 이상의 특징이 상이하다.

본 발명은 또한 개체에서 신경 퇴행성 질환의 특징을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 상기 방법에 의해 동정된 적어도 하나 이상의 염색체 상호 작용을 타이핑하는 단계, 및/또는 (b) 신경 퇴행성 질환의 특징과 연관된 적어도 하나 이상의 염색체 상호 작용을 타이핑하는 단계를 포함하며, 상기 특징은 임의로 상기 질환의 진단, 예후, 발달 가능성, 성향 및/또는 조기 전-증상 검출로부터 선택되고, 상기 연관성은 상기 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재일 수 있다. 상기 질환은 바람직하게는 치매 또는 인지 기능 장애(cognitive impairment)이며, 바람직하게는 알츠하이머 질병(Alzheimer’s disease)이다.

본 발명은 몇몇 상이한 양태를 가지며, 그 중에서도 하기를 포함한다:

- 상이한 서브그룹에 관련된 후생적 염색체 상호작용을 동정하는 방법.

- 특정한 특징을 가진 서브그룹을 선택하는 방법, 및/또는 개체의 서브그룹을 동정하는 방법.

- 신경 퇴행성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있는 약물을 동정하는 방법.

신경 퇴행성 질병(Neurodegenerative Disease)과 관련된 영역

본 발명은 신경 퇴행성 질환과 관련된 질병-연관된 또는 후생적으로 활성인 영역에서 염색체 상호작용의 타이핑(tying)에 관한 것이다. 그러한 영역에서, 염색체 상호작용이 발생하여, 상기 질환의 양태에 영향을 미친다. 상기 염색체 상호작용은 상기 질환 또는 예후(결과와 관련됨)에 영향을 받기 쉽거나 연관되거나 영향을 미칠 수 있다. 따라서 상기 염색체 상호작용은 진단 또는 상기 질병이 발달할 가능성과 관련이 있을 수 있다. 신경 퇴행성 질환과 관련된 특이적 염색체 상호작용, 유전자 및 영역은 본원의 표에 기재되어 있다.

상기 타이핑된 염색체 상호작용은 유전자(코딩 서열 포함) 및 프로모터(promoter)와 같은 조절 영역 사이에서 발생하는 것일 수 있고, 발생하는 것이 아닐 수도 있다. 상기 타이핑된 염색체 상호작용은 예를 들어, 유전자 영역의 유전된 각인된 특징이 유전된 것일 수도 아닐 수도 있다. 상기 염색체 상호작용은 두 가지 조절 영역, 예를 들어 인핸서(enhancer) 및 프로모터(promoter) 사이에서의 상호작용 또는 프로모터 및 다른 프로모터 사이에서의 상호작용이 발생하는 것일 수 있고, 발생하는 것이 아닐 수도 있다. 상기 염색체 상호작용은 유전자의 조절완화, 예를 들어, 인핸서에서 활성(증가 또는 감소와 같음)의 변화와 연관될 수 있다.

예후(Prognosis)

본원에서 사용된 예후는 하나 이상의 결과와 같이, 의학적 질환의 가능성 있는 경로를 예측하는 것에 관련한 것이다. 예후 인자(prognostic factor)는 객관적으로 측정할 수 있고, 상기 신경 퇴행성 질환의 가능한 결과에 대한 정보를 제공하는 전형적으로 임상적 또는 생물학적 특징이다.

후생적 상호작용(Epigenetic Interactions)

본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 ‘후생적(epigenetic)’ 상호작용은 전형적으로 염색체 상에서 유전자 좌위(locus)의 말단 영역(distal region) 사이에서 상호작용을 의미하며, 상기 상호작용은 역동적이고 염색체의 영역의 상태에 따라 변형(altering), 형성(forming), 또는 파괴(breaking)된다.

특히 본 발명의 방법에서, 염색체 상호작용은 상호작용의 부분인 염색체의 두 개 영역으로부터의 서열을 포함하는 결찰된 핵산을 먼저 생성함으로서 검출된다. 이러한 방법에서, 상기 영역은 임의의 적절한 수단에 의해 가교-결합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 상호작용은 포름알데히드를 사용하여 가교-결합되나, 임의의 알데하이드 또는 D-바이오티노일-e-아미노카프로익 산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(D-Biotinoyl-e-aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide ester) 또는 디그옥시제닌-3-0-메틸카르보닐-e-아미노카프로익 산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(Digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-e-aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide ester)에 의해 가교-결합될 수 있다. 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)가 사용될 수 있으며 4 옹스트롬(Angstroms) 떨어진 DNA 사슬을 가교 결합시킬 수 있다.

염색체 상호작용은 예를 들어, 전사되거나 억제되는 경우에 상기 염색체의 영역의 상태를 반영할 수 있다. 본원에 지정된 바와 같이 서브그룹에 특이적인 염색체 상호작용은 안정적인 것으로 밝혀졌으며, 따라서 상기 두 개 서브그룹 사이의 차이점을 측정하는 것의 신뢰할 수 있는 수단을 제공한다.

또한, 특징에 특이적인 염색체 상호작용은 예를 들어 메틸화 또는 히스톤 단백질에 결합에 대한 변화와 같은 다른 후생적 마커와 비교하여 일반적으로 생물학적 프로세스 초기에 발생한다. 따라서 본 발명의 방법은 생물학적 프로세스의 초기 단계를 검출할 수 있다. 이는 더 효과적인 결과일 수 있는 초기 개입(예를 들어, 치료)을 허용한다. 그러므로, 동일한 서브그룹 내에서 개체들 사이의 관련 염색체 상호작용에는 거의 변화가 없다. 본 발명에서, 염색체 상호작용의 타이핑은 초기 및/또는 전-증상 진단을 가능하게 한다, 특정 실시양태에서, 이는 증상 발달 전 적어도 1, 5, 10, 20 또는 40년 이상의 상기 질환의 특성의 검출을 허용한다(상기 연도는 365일로 정의됨).

후생적 상호작용의 위치 및 원인

후생적 염색체 상호작용은 인코딩 관련 또는 기재되지 않은 유전자를 나타내는 염색체의 영역을 포함하거나 중첩될 수 있으나, 동등하게 유전자 사이의 영역에 있을 수 있다. 본 발명자들은 모든 영역에서 후생적 상호작용이 상기 염색체 유전자 좌위의 상황(status)을 결정하는데 동등하게 중요하다는 것을 발견하였다. 이러한 상호작용은 특히 상기 유전자 좌위에 위치한 유전자의 코딩 영역에서 반드시 있지 않으며, 유전자 사이의 영역에 있을 수 있다. 이러한 상호작용은 유전자 및 이의 조절 구성 요소 사이에서 긴 범위의 상호작용일 수도 있거나 아닐 수도 있다. 이러한 상호작용은 프로모터-프로모터 상호작용 및/또는 프로모터-인핸서 상조작용을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에서 검출된 염색체 상호작용은 환경적인 요인, DNA 메틸화, 비-코딩 안티센스 RNA 전사체(non-coding antisense RNA transcripts), 비-돌연변이성 발암원(non-mutagenic carcinogens), 히스톤 변형, 염색질 재구성(chromatin remodelling) 및 특정 로컬 DNA 상호작용에 의하여, 근본적인 DNA 서열의 변화에 의해 야기될 수 있다. 염색체 상호작용을 야기하는 변화는 근본적인 핵산 서열에 대한 변화에 의해 유발될 수 있으며, 그 자체가 유전자 생성물 또는 유전자 발현의 모드(mode)에 직접적으로 영향을 미치지 않는다. 그러한 변화는 예를 들어, 유전자의 내부 및/또는 외부의 SNP, 유전자 융합 및/또는 유전자 간 DNA, 마이크로 RNA, 및 비-코딩 RNA의 결실일 수 있다. 예를 들어, 이는 거의 20%의 SNP는 비-코딩 영역에 있는 것으로 알려져 있으므로, 상기 기재된 바와 같은 방법은 비-코딩 상황에서 또한 유용하다. 하나의 실시양태에서, 상기 상호작용을 형성하기 위해 모인 염색체의 영역은 동일한 염색체에서 5 kb, 3 kb, 1 kb, 500 염기쌍 또는 200 염기쌍 미만으로 떨어져 있을 수 있다. 상호 작용을 형성하기 위해 모인 염색체의 영역은 동일한 염색체에서 5 kb, 10 kb, 50 kb, 100 kb, 200kb, 500kb, 또는 800 kb 이상 떨어져 있을 수 있으며, 예를 들어 800 kb 내지 1,500 kb 떨어져 있을 수 있다.

상기 검출된 염색체 상호작용은 바람직하게는 본원의 표에 기재된 임의의 유전자 내에 존재한다. 그러나, 이는 상기 유전자의 상류 또는 하류, 예를 들어, 상기 유전자 또는 상기 코딩 서열로부터 최대 50,000, 최대 30,000, 최대 20,000, 최대 10,000 또는 최대 5,000 염기 상류 또는 하류에 있을 수 있다.

임상적 상황의 유형(Types of Clinical Situation)

본 발명의 목적은 개체군 내의 서브그룹을 정의하는 특성과 관련된 염색체 상호작용의 검출을 허용하는 것이다. 예를 들어 이러한 기술은 특이적 표현형(예를 들어, 신경 퇴행성 질환과 관련됨)에 대한, 즉, 특정 염색체 형태 시그니처(chromosome conformation signature) 및/또는 특정 시그니처에서의 변화를 인식하는 것으로서 바이오마커를 기반으로 한 계층화(stratification)를 허용한다.

본 발명의 방법은 진단, 예후, 질병 경과의 모니터링 및/또는 질병 경향(predisposition)의 확인과 같이, 질병과 관련한 특이적 특성의 문맥에서 사용될 수 있다. 그러므로, 상기 방법은 특이적 질환의 존재를 진단하기 위해 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있다. 본 발명의 방법은 질병의 매커니즘이 알려지지 않은, 명백하지 않은 또는 복합적인 유전자 좌위를 타이핑하는데 사용될 수 있다. 염색체 상호작용의 검출은 조절의 상이한 수준에서 변화를 따르는 효과적인 방법을 제공하며, 그 중 몇몇은 복합적이다. 예를 들어, 몇몇 케이스에서 약 37,000 비-코딩 RNA가 단일 충격(single impulse)에 의해 활성화될 수 있다.

서브그룹 및 개별적인 치료(Subgroups and Personalised Treatment)

본원에서 사용된 바와 같이, ‘서브그룹(subgroup)’은 바람직하게는 개체군 서브그룹(개체군에서 서브그룹), 보다 바람직하게는 특정 동물의 개체군, 예를 들어 특정 진핵생물 또는 포유동물(예를 들어, 인간, 비-인간, 비-인간 영장류, 또는 설치류, 예를 들어 마우스(mouse) 또는 랫(rat))을 의미한다. 가장 바람직하게는, ‘서브그룹(subgroup)’은 인간 개체군에서 서브그룹을 의미한다.

본 발명은 개체군 내에서 특정 서브그룹을 검출하는 것 및 치료하는 것을 포함한다. 그러한 서브그룹 내에서, 본원에서 논의된 특성(인지 기능 결손(cognitive deficit), 또는 신경 퇴행성 질환의 진단)은 존재 또는 부존재일 것이다. 염색체 상에서 후생적 상호작용 차이점은 일반적으로 말하면, 게놈 수준에서 존재하는 구조적인 차이이다. 본 발명은 주어진 개체군 내에서 부분 집합(예를 들어, 두 개 또는 적어도 두 개 이상의 부분 집합) 사이에서 상이하다는 것을 발견하였다. 이러한 차이점을 확인하는 것으로서 의사는 그들의 환자를 상기 방법에 기재된 바와 같이 개체군의 하나의 부분 집합의 부분으로서 분류할 수 있다. 본 발명은 의사가 환자의 후생적 염색체 상호작용을 기반으로 환자에 대하여 약을 개별화하는 방법을 제공하고, 대안적인 보다 효과적인 치료 요법(treatment regime)을 제공한다.

다른 실시양태에서, 어느 정도까지 대상이 하나의 서브그룹으로 정의되고 상기 개체군 중 하나로 정의되지 않는지를 결정하기 위한 임계 수준(threshold levels)이 적용된다. 전형적으로 서브그룹은 일반적인 개체군의 적어도 1%, 5%, 10%, 30%, 50% 또는 80% 이상일 수 있다.

결찰된 핵산 생산(Generating Ligated Nucleic Acids)

본 발명의 특정 실시양태는 결찰된 핵산, 특히 결찰된 DNA를 이용한다. 이들은 염색체 상호작용에서 함께 모인 영역 모두의 서열을 포함하므로, 상기 상호작용에 대한 정보를 제공한다. 본원에 기재된 EpiSwitch^TM 방법은 염색체 상호작용을 검출하기 위해 그러한 결찰된 핵산의 생산을 사용한다.

따라서, 본 발명의 방법은 결찰된 핵산(예를 들어, DNA)을 생성하는 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(i) 염색체 유전자 좌위에 존재하는 후생적 염색체 상호작용의 생체 외(in vitro)에서 가교-결합하는 단계;

(ii) 상기 염색체 유전자 좌위로부터 임의로 상기 가교-결합된 DNA를 분리하는 단계;

(iii) 상기 가교-결합된 DNA를, 예를 들어 적어도 한번 이상 절단하는 효소(특히 상기 염색체 유전자 좌위 내에서 적어도 한번 이상 절단하는 효소)로 제한 분해(restriction digestion)하여 절단하는 단계;

(iv) 상기 가교-결합 및 절단된(cleaved) DNA 말단(특히 DNA 루프(loop)를 형성)을 결찰시키는 단계; 및

(v) 특히 PCR(polymerase chain reaction)과 같은 기술을 사용하여, 상기 결찰된 DNA 및/또는 상기 DNA 루프의 존재를 확인하여, 특이적 염색체 상호작용의 존재를 확인하는 단계.

임의의 적절한 기술은 상기 결찰된 핵산을 검출하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, PCR(중합 효소 연쇄 반응, polymerase chain reaction)은 상기 결찰된 핵산을 검출 또는 동정하는데 사용될 수 있다. 이 경우에, 상기 PCR 생성물의 크기는 존재하는 특이적 염색체 상호작용을 나타낼 수 있으며, 상기 유전자 좌위의 상태를 확인하는데 사용될 수 있다. PCR은 대조군에 비해 특정 표현형 서브그룹에 특이적인 바이오마커를 검출 및 선택하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 PCR 프라이머 또는 프라이머 쌍은 동일한 결찰된 핵산을 증폭시킬 수 있는 단편 및/또는 상동체(homologous)와 같이 사용되거나 변이체일 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 임의의 프로브는, 동일한 결찰된 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브의 단편 및/또는 상동체가 사용될 수 있다.

당업자는 관심 있는 염색체 유전자 좌위 내에서 DNA를 절단하는데 사용될 수 있는 수많은 제한 효소를 인식할 것이다. 상기 사용된 특정 효소는 상기 연구된 유전자 좌위 및 그 안에 위치한 DNA의 서열에 의존할 것이 명백할 것이다. 본 발명에 기재된 바와 같이 DNA를 절단하는데 사용될 수 있는 제한 효소의 비-제한적인 실시예는 TaqⅠ이다.

EpiSwitch ^TM 기술과 같은 실시양태

EpiSwitch^TM 기술의 일부분은 후생적 염색체 형태 시그니처의 검출에서 마이크로어레이 EpiSwitch^TM 마커 데이터의 사용과 관련이 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 EpiSwitch^TM 어레이 플랫폼(array platform)이 사용될 수 있으나, 본 발명은 이 어레이 플랫폼에 제한되지 않는다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 PCR-기반 기술만을 사용하여 수행된다.

본원에 기재된 방식으로 결찰된 핵산을 이용하는 EpiSwitch^TM 과 같은 실시양태는 몇 가지 장점을 갖는다. 예를 들어 본 발명의 제1 핵산 세트로부터의 핵산 서열은 제2 핵산 세트와 하이브리드화 또는 하이브리드화 실패로 인하여, 이들은 스토캐스틱 노이즈(stochastic noise)의 낮은 수준을 갖는다. 이것은 후생적 수준에서 복합 매커니즘을 측정하는 상대적으로 간단한 방법을 허용하는 바이너리 결과(binary result)를 제공한다. EpiSwitch^TM 기술은 또한 빠른 프로세싱 시간 및 낮은 비용을 갖는다. 하나의 실시양태에서 상기 프로세싱 시간은 3 내지 6시간이다.

샘플 및 샘플 치료

샘플은 상기 개체의 DNA를 함유한다. 이는 일반적으로 세포를 함유할 것이다. 하나의 실시양태에서, 샘플은 최소한으로 침습 수단으로 수득되며 예를 들어 혈액일 수 있다. DNA는 추출되어, 표준 제한 효소로 절단할 수 있다. 염색체 구조가 유지될 수 있고 EpiSwitch^TM 플랫폼으로 검출될 수 있는 지를 미리 결정할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 샘플은 환자로부터 이전에 수득된 혈액 샘플이며, 상기 기재된 방법은 상기 절차가 최소한으로 침습이기 때문에 장점이다. 수평적 이동을 포함하는 조직 및 혈액 사이에서 염색체 상호작용의 동기화로 인해, 혈액 샘플은 질병에 관련된 조직과 같은 조직에서 염색체 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 핵산의 특성(protperties)

본 발명은 핵산에 관련된다. 이들은 본원에서 언급된 제1 및 제2 핵산과 동일하거나 임의의 특성을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산은 전형적으로 상기 염색체 상호작용에서 함께 모이는 염색체의 두 개 영역 중 하나의 서열을 포함하는 각각 두 개 부위를 포함한다. 전형적으로 각 부위는 적어도 8개, 10개, 15개, 20개, 30개 또는 40개 이상의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 10 내지 40개 뉴클레오티드 길이이다. 바람직한 핵산(제1 및/또는 제2 핵산 세트를 포함)은 임의의 표에 기재된 임의의 유전자의 서열을 포함한다. 바람직한 핵산은 임의의 표에 기재된 특이적 프로브 서열 및/또는 임의의 프라이머 서열을 포함하거나, 그러한 서열의 상동체 및/또는 단편을 포함한다. 바람직한 결찰된 핵산(제1 또는 제2 핵산 세트를 포함)은 본원에 기재된 임의의 프로브, 프라이머 또는 프라이머 쌍에 의해 검출(예를 들어, 특이적으로 결합)될 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA이다. 특이적 서열이 정의되는 경우, 본 발명은 특정 실시양태에서 요구된 바와 같이 상보적 서열을 사용할 수 있는 것으로 이해된다.

제2 핵산 세트 - ‘인덱스(Index)’ 서열

핵산 서열의 제2 세트는 인덱스(index) 서열 세트의 기능을 가지며, 필수적으로 서브 그룹 특이적 서열을 확인하는데 적절한 핵산 서열 세트이다. 그들은 ‘배경(background)’ 염색체 상호작용을 나타낼 수 있으며 몇몇 방식으로 선택되거나 선택되지 않을 수 있다. 그들은 일반적으로 가능한 모든 염색체 상호작용의 부분 집합이다.

상기 제2 핵산 세트는 임의의 적절한 방법에 의해 유도될 수 있다. 그들은 계산적으로 유도될 수 있거나 개체에서 염색체 상호작용을 기반으로 할 수 있다. 그들은 전형적으로 제1 핵산 세트보다 더 큰 개체군 그룹을 나타낸다. 하나의 특정 실시양태에서, 상기 제2 핵산 세트는 유전자의 특정 세트에서 가능한 모든 후생적 염색체 상호작용을 나타낸다. 다른 특정 실시양태에서, 상기 제2 핵산 세트는 본원에 기재된 개체군에 존재하는 가능한 모든 후생적 염색체 상호작용의 큰 개체군을 나타낸다. 하나의 특정 실시양태에서, 상기 제2 핵산 세트는 적어도 20개, 50개, 100개 또는 500개 이상의 유전자, 예를 들어 20 내지 100개 유전자 또는 50 내지 500개 유전자에서 후생적 염색체 상호작용의 적어도 50% 이상 또는 적어도 80% 이상을 나타낸다.

상기 제2 핵산 세트는 개체군에서 질병 상태/표현형을 임의의 방식으로 조정, 조절 또는 변경하는 적어도 100개 이상의 가능한 후생적 염색체 상호작용을 전형적으로 나타낸다. 상기 제2 핵산 세트는, 예를 들어, 사이토카인(cytokine), 키나아제(kinase)를 인코딩하는 핵산 서열 또는 임의의 질병 상태, 질병에 대한 경향 또는 질병 표현형과 관련 있는 조절제를 포함하는 종(species)에서 질병의 조건에 영향을 미치는 염색체 상호작용을 나타낼 수 있다. 상기 제2 핵산 세트는 전형적으로 상기 서브그룹을 정의하는 특성과 관련이 없거나 관련 있는 후생적 염색체를 나타내는 서열을 포함한다.

하나의 특정 실시양태에서, 상기 제2 핵산 세트는 개체군에서 자연적으로 발생한 서열로부터 적어도 부분적으로 유도되며, 전형적으로 인 실리코(in silico) 방법으로 수득된다. 상기 핵산은 자연적으로 발생한 핵산에서 존재하는 핵산의 상응하는 부위와 비교하여 단일 또는 다중 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기쌍의 결실(deletion), 치환(substitutions) 및/또는 첨가(addition)를 포함한다. 하나의 특정 실시양태에서, 상기 제2 핵산 세트는 자연적으로 발생하는 종에 존재하는 핵산의 상응하는 부위에 대하여 적어도 70% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 상동체(homologue) 및/또는 상동유전자(orthologue)를 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 자연적으로 발생하는 종에서 존재하는 핵산의 상응하는 부위와 적어도 80% 이상의 서열 동일성 또는 적어도 90% 이상의 서열 동일성이 제공된다.

제2 핵산 세트의 특성

하나의 특정 실시양태에서, 제2 핵산 세트에서 적어도 100개 이상의 상이한 핵산 서열이 있고, 바람직하게는 적어도 1,000개, 2,000개 또는 5,000개 이상의 상이한 핵산 서열이 존재하며, 최대 100,000개, 1,000,000 또는 10,000,000개의 상이한 핵산 서열이 존재한다. 전형적인 수는 1,000 내지 100,000개의 상이한 핵산 서열과 같이, 100 내지 1,000,000개일 것이다. 이 중 모든 또는 적어도 90% 이상 또는 적어도 50% 이상이 상이한 염색체 상호작용에 상응할 것이다.

하나의 특정 실시양태에서, 상기 제2 핵산 세트는 적어도 20개 이상의 상이한 유전자 좌위 또는 유전자, 바람직하게는 적어도 40개 이상의 상이한 유전자 좌위 또는 유전자, 및 보다 바람직하게는 100 내지 10,000개의 상이한 유전자 좌위 또는 유전자와 같이, 적어도 100개 이상, 적어도 500개 이상, 적어도 1,000개 이상 또는 적어도 5,000개 이상의 유전자 좌위 또는 유전자에서 염색체 상호작용을 나타낸다. 제2 핵산 세트의 길이는 제1 핵산 세트에 대한 왓슨-크릭 염기쌍(Watson Crick base pairing)에 따라 특이적으로 하이브리드화하여 서브그룹에 특이적인 염색체 상호작용을 확인하는데 적절하다. 전형적으로 상기 제2 핵산 세트는 상기 염색체 상호작용에 함께 모이는 두 가지 염색체 영역에 서열에 상응하는 두 개 부위를 포함할 것이다. 상기 제2 핵산 세트는 전형적으로, 적어도 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 및 여전히 바람직하게는 30개 염기(뉴클레오티드)의 길이인 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 핵산 서열은 거의 500 염기쌍, 바람직하게는 거의 100개 염기쌍, 여전히 바람직하게는 거의 50개 염기쌍 길이일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 핵산 서열은 거의 500 염기쌍, 바람직하게는 거의 100개 염기쌍, 여전히 바람직하게는 거의 50개 염기쌍 길이일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 제2 핵산 세트는 17 내지 25개 염기쌍의 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 제2 핵산 세트의 적어도 100% 이상, 80% 이상 또는 50% 이상은 상기 기재된 바와 같은 길이를 갖는다. 바람직하게는, 상기 상이한 핵산은 임의의 중첩 서열(overlapping sequence)을 갖지 않으며, 예를 들어 적어도 100% 이상, 90% 이상, 80% 이상 또는 50% 이상의 핵산은 적어도 5개 이상 지속적인 뉴클레오티드에 대해 동일한 서열을 갖지 않는다.

제2 핵산 세트가 ‘인덱스’로서 작용할 때, 상기 동일한 제2 핵산 세트는 상이한 특성에 대한 서브그룹을 나타내는 상이한 제1 핵산 세트와 함께 사용될 수 있으며, 즉, 상기 제2 핵산 세트는 상이한 특징과 관련있는 염색체 상호작용을 확인하는데 사용될 수 있는 핵산의 ‘보편적인(universal)’컬렉션(collection)을 나타낼 것이다.

제1 핵산 세트

제1 핵산 세트는 일반적으로 본원에 기재된 임의의 그러한 특징과 같이, 동반 진단과 관련한 특징의 존재 또는 부존재에 의해 정의된 두 개 이상의 개별 서브그룹에 존재하는 것으로 알려져 있다. 상기 제1 핵산은 본원에 기재된 제2 핵산 세트의 임의의 특징 및 특성을 가질 수 있다. 상기 제1 핵산 세트는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 치료 및 프로세스 단계, 특히 EpiSwitch^TM 가교-결합하는 단계 및 절단하는 단계를 갖는 개체로부터의 샘플로부터 유래된다. 전형적으로 상기 제1 핵산 세트는 개체로부터 얻은 샘플에 존재하는 염색체 상호작용의 모든 또는 적어도 80% 이상 또는 50% 이상으로 존재한다.

전형적으로, 상기 제1 핵산 세트는 상기 제2 핵산 세트에 의해 나타나는 염색체 상호작용과 비교하여, 제2 핵산 세트에 의해 나타나는 유전자 좌위 또는 유전자를 가로지르는 염색체 상호작용의 더 작은 개체군을 나타내며, 즉, 상기 제2 핵산 세트는 유전자 좌위 또는 유전자의 정의된 세트에서 상호작용의 배경 또는 인덱스 세트를 나타낸다.

핵산(Nucleic Acids)

본원에 기재된 핵산은 ‘제1’ 또는 ‘제2’핵산과 같이, 본 발명의 적어도 200개 이상, 적어도 500개 이상, 적어도 1,000개 이상, 적어도 5,000개 이상 또는 적어도 10,000개 이상의 상이한 핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 최대 100,000 또는 500,000개 상이한 핵산을 포함하는 핵산의 라이브러리(library) 형태일 수 있다. 상기 라이브러리는 어레이(array)에 결합된 핵산의 형태, 예를 들어, 상보적인 서열에 하이브리드화 하는 것을 허용하는 방식일 수 있다.

하이브리드화(Hybridisation)

본 발명은 제1 핵산 세트 및 제2 핵산 세트로부터 전체적으로 또는 부분적으로 상보적인 핵산 서열이 하이브리드화되도록 하는 수단을 요구한다. 하나의 실시양태에서, 모든 제1 핵산 세트는 단일 분석, 즉, 단일 하이브리드화 단계에서 모든 제2 핵산 세트와 접촉한다. 그러나 임의의 적절한 분석을 사용할 수 있다. 본원에 기재된 실시양태에서, 핵산의 결합은 전체 또는 부분적으로 상보적인 서열 사이에서, 전형적으로 왓슨-크릭 염기쌍(하이브리드화)에 의해 특이적인 결합일 수 있다는 것을 이해되어야 한다.

라벨링된 핵산 및 하이브리드화의 패턴

본원에 기재된 핵산은, 예를 들어, 검출 가능한 라벨을 사용하여 라벨링될 수 있고, 성공적인 하이브리드화의 검출을 돕는 형광 물질(형광 분자) 또는 방사성 라벨과 같은 독립적인 라벨을 사용하여 라벨링될 수 있다. 특정 라벨은 자외선(UV light)하에서 검출될 수 있다. 본원에 기재된 어레이상의 하이브리드화 패턴은 두 개 서브그룹 사이에서 후생적 염색체 상호작용의 차이를 나타내며, 후생적 염색체 상호작용을 비교하는 방법 및 후생적 염색체 상호작용이 본 발명의 개체군 내의 서브그룹에 특이적인지를 결정하는 방법을 제공한다.

상기 용어 ‘하이브리드화의 패턴(pattern of hybridisation)’은 제1 및 제2 핵산 세트 사이에서 하이브리드화의 존재 및 부존재를 포괄적으로 포함하며, 즉, 제1 세트로부터 특이적 핵산이 제2 세트로부터의 특이적 핵산과 하이브리드화 되고, 이는 제한되지 않으며 임의의 특정 분석 또는 기술, 또는 ‘패턴(pattern)’이 검출될 수 있는 표면 또는 어레이를 가질 필요성이 있다.

특정 시스템 특징을 가진 서브그룹 선택

본 발명은 개체 내에서 특징의 존재 또는 부존재를 결정하기 위해서, 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재, 전형적으로 1 내지 5, 또는 5 내지 20, 또는 5 내지 500 개의 그러한 상호작용, 바람직하게는 10 내지 20, 또는 20 내지 300 또는 50 내지 100 개의 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 염색체 상호작용은 본원에 기재된 임의의 유전자에서의 상호작용이다. 하나의 실시양태에서, 상기 타이핑된 염색체 상호작용은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 관련된 표에서 핵산에 의해 나타난다.

바람직하게는, 본원에 기재된 임의의 관련된 유전자, 예를 들어 임의의 표에 기재된 유전자 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 14, 15개 이상, 최대 모든 유전자 내에서 임의의 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재가 검출된다. 바람직하게는, 본원에 기재된 임의의 특이적 프라이머 및/또는 프로브 서열에 의해 나타난 염색체 상호작용의 존재 또는 부존재가 상기 방법에서 결정된다. 전형적으로, 3, 5, 7 또는 10개와 같이 하나 이상의 본원에 기재된 임의의 특이적 프라이머 및/또는 프로브 서열에 의해 나타난 염색체 상호작용의 존재 및 3, 5, 7 또는 10개와 같이 하나 이상의 본원에 기재된 임의의 특이적 프라이머 및/또는 프로브 서열에 의해 나타난 염색체 상호작용의 부존재는 본 방법에서 결정된다. 이러한 유전자 또는 염색체 상호작용의 수는 본원에 기재된 임의의 상이한 실시양태에서 사용될 수 있다.

특이적 질환(Specific Conditions)

본 발명의 방법은 본원에 기재된 임의의 특이적 질환 또는 특징의 존재를 검출하는데 사용될 수 있으며, 바람직하게는 신경 퇴행성 질병 또는 질환에 대한 발달 가능성 및/또는 경향을 검출하는데 사용되고, 바람직하게는 알츠하이머 질병, 경증 인지 기능 장애(mild cognitive impairment), 혈관성 치매(vascular dementia), 루이소체치매(dementia with Lewy bodies), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 또는 가장 바람직하게는 알츠하이머 질병을 유도하는 베타-아밀로이드 응집체(beta-amyloid aggregate)와 같은 치매를 검출하는데 사용될 수 있다.

바람직하게는 표에 기재된 임의의 관련된 유전자 내에서 임의의 염색체 상호작용의 존재 및/또는 부존재가 검출된다. 예를 들어, 상기 유전자의 적어도 1, 3, 5, 10, 14, 15, 또는 20, 또는 30, 또는 42개 이상이 표 중 임의의 하나에 기재되어 있다. 바람직하게는 표에서 프로브 서열에 의해 나타난 염색체 상호작용의 존재 및/또는 부존재는 상기 방법에서 결정된다. 이러한 수의 유전자 또는 염색체 상호작용은 본원에 기재된 임의의 상이한 실시양태에서 사용될 수 있다.

검사된 개체

검사된 개체는 본원에 기재된 임의의 질환 또는 특징의 임의의 증상을 갖거나 갖지 않는다. 상기 개체는 임의의 그러한 질환 또는 특징의 위험에 있을 수 있다. 상기 개체는 바람직하게는 영장류, 인간, 비-인간 포유동물 또는 설치류와 같은 포유동물이다. 상기 개체는 남성 또는 여성일 수 있다. 상기 개체는 30세 이상일 수 있다. 상기 개체는 29세 이하일 수 있다.

바람직한 유전자 영역, 유전자 좌위, 유전자 및 염색체 상호작용

본 발명의 모든 양태에 있어서, 바람직한 유전자 영역(예를 들어, 특정 포지션 번호로 정의됨), 유전자 좌위, 유전자 및 염색체 상호작용은 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법에서 염색체 상호작용은 표에 열거된 유전자와 관련하여 적어도 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30 또는 42 개 이상으로부터 검출된다. 바람직하게는 본원의 표 중 임의의 하나에서 상기 프로브 서열에 의해 나타나는 관련된 특이적 염색체 상호작용의 적어도 1, 3, 5, 10, 15, 20, 또는 30 또는 42개 이상의 존재 또는 부존재가 검출된다. 바람직하게는 표 중 임의의 하나에서 상기 프라이머 서열에 의해 나타나는 관련된 특이적 염색체 상호작용의 적어도 1, 3, 5, 10, 15, 20, 또는 30 또는 42개 이상, 예를 들어 13, 14, 20, 30 또는 42개 이상의 존재 또는 부존재가 검출된다. 하나의 실시양태에서, 다른 염색체 상호작용은 검출되지 않는다.

상기 영역은 본원에 기재된 임의의 유전자의 상류 또는 하류, 예를 들어 코딩 서열로부터 50kb 상류 또는 20kb 하류일 수 있다.

하나의 실시양태에서, 상기 검출된 염색체 상호작용은 표에 표시된 임의의 영역(4kb 영역 포함) 또는 임의의 포지션에 존재한다. 상기 결찰된 생성물이 상기 방법에서 검출되는 경우, 임의의 표에서 임의의 프로브 서열에 표시된 서열이 검출될 수 있다. 따라서, 전형적으로 상기 프로브의 두 영역(즉 염색체 상호 작용의 두 사이트)으로부터 서열이 검출될 수 있으며, 바람직하게는 접합 서열(junction sequence)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 프로브는 임의의 표에 표시된 프로브에 대하여 동일하거나 상보적인 서열을 포함하거나 구성되는 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 프로브는 표에 표시된 임의의 프로브 서열에 대한 상동체인 서열을 포함하여 사용된다. 결찰된 생성물이 상기 PCR에 의한 방법에서 검출되는 경우, 임의의 표에서 임의의 프로브 서열에 표시된 서열이 검출될 수 있다. 프라이머는 검출할 수 있거나 표에 기재된 프로브 위치 및 연관된 영역 내에서 하이브리드화 되도록 디자인될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 프라이머 쌍은 임의의 표에 표시된 프라이머 쌍에 대하여 동일하거나 상보적인 서열을 포함하거나 구성되는 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 표에 표시된 임의의 프라이머 서열의 상동체 및/또는 단편에 서열을 포함하여 사용된다.

염색체 상호작용의 특정 조합물은 검출될 수 있으며(즉, 부존재의 존재를 결정함), 본원의 표에 기재된 모든 상호작용 또는 표로부터 선택된 것(본원에서 정의된 임의의 그러한 선택)을 나타낸다. 본원에 기재된 바와 같이, 특정 개수의 상호작용은 개체 표로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 임의의 표(표 3 포함)에 기재된 상호작용의 적어도 10% 이상, 20% 이상. 30% 이상, 50% 이상, 70% 이상 또는 90% 이상이 검출될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 표 3에 나타난 q-값의 최소 50%(즉, 0에 가까움)로 표시된 특이적 염색체 상호작용에 관하여 적어도 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20개 이상의 존재 또는 부존재가 검출된다.

하나의 실시양태에서, 표 3에 나타난 q-값의 최소 50%로 표시된 특이적 염색체 상호작용에 관하여 적어도 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 존재 또는 부존재가 검출되며, 표 3에 나타난 q-값의 최소 50%로 표시된 특이적 염색체 상호작용에 관하여 적어도 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 알츠하이머 질병과 연관된 상호작용의 존재 및/또는 부존재가 검출되고 상기 상호작용의 부존재는 알츠하이머 질병과 연관된다.

하나의 실시양태에서, 0 내지 0.003의 q-값을 갖는 표 3에 나타난 임의의 또는 모든 상호작용이 검출될 수 있다. 다른 실시양태에서, 0.003 내지 0.006의 q-값을 갖는 표 3에 나타난 임의의 또는 모든 상호작용이 검출될 수 있다. 다른 실시양태에서, 0.006 내지 0.01의 q-값을 갖는 표 3에 나타난 임의의 또는 모든 상호작용이 검출될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 임의의 또는 모든 상호작용이 검출된다. 상기 방법은 서열번호 11 내지 20으로 표시되는 임의의 또는 모든 상호작용이 검출되는 방법일 수 있다. 상기 방법은 서열번호 21 내지 30으로 표시되는 임의의 또는 모든 상호작용이 검출되는 방법일 수 있다. 상기 방법은 서열번호 31 내지 42로 표시되는 임의의 또는 모든 상호작용이 검출되는 방법일 수 있다.

상기 검출된 상호작용은, 예를 들어 본원에서 임의의 표와 같이 본원에서 정의된 특정한 특징의 존재 또는 부존재에 상응할 수 있다. 상기 상호작용의 조합물이 검출되면, 상기 특징의 존재에 모두 상응하거나, 상기 특징의 부존재에 모두 상응할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 검출된 상호작용의 조합물은 상기 특징의 존재에 관련된 적어도 2, 5, 또는 10개 이상의 상호작용 및 상기 특징의 부존재에 관련된 적어도 2, 5, 또는 10개 이상의 다른 상호작용에 상응한다.

상기 방법의 하나의 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 특정 상호작용 또는 본원에 기재된 임의의 특정 선택은 상기 방법에서 검출되지 않는다. 따라서, 상기 방법은 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 상호작용이 검출되지 않는 방법일 수 있다. 상기 방법은 서열번호 11 내지 20으로 표시되는 상호작용이 검출되지 않는 방법일 수 있다. 상기 방법은 서열번호 21 내지 30으로 표시되는 상호작용이 검출되지 않는 방법일 수 있다. 상기 방법은 서열번호 31 내지 42로 표시되는 상호작용이 검출되지 않는 방법일 수 있다.

본원에서 제공된 표

본원에서 상기 표는 질환(첫 번째 기재된 그룹)에서 존재 및 대조군에서 부존재, 또는 질환에서 부존재 및 대조군에서 존재하는 염색체 상호작용을 표시하는 프로브(Episwitch^TM 마커) 데이터 또는 유전자 데이터를 나타낸다. 상기 프로브 서열은 염색체 상호작용에 함께 모이는 유전자 영역의 모든 사이트로부터 생산된 결찰된 생성물을 검출하는데 사용될 수 있는 서열을 나타내며, 즉, 상기 프로브는 상기 결찰된 생성물에서 서열에 상보적인 서열을 포함할 것이다. 시작-끝 포지션(Start-End positions)의 제1 두 개 세트(A)는 프로브 포지션을 나타내며, 시작-끝 포지션의 제2 두 개 세트(B)는 관련된 4kb 영역을 나타낸다(표 2b).

상기 유전자 표 데이터는 관련 염색체 상호작용이 발생하는 것으로 밝혀진 유전자를 나타낸다.

표 3은 각각의 명명된 프로브 및 프라이머 세트에 대하여 계산된 q-값을 나타낸다. 상기 검사의 q-값은 특정 검사가 중요하다고 할 때 발생된 양성 오류(false positive)의 비율(오류 발견률(false discovery rate)이라고도 함)을 측정한다. 상기 프로브는 질환을 갖는 서브그룹에서 일반적인 마커, 또는 질환을 갖는 서브그룹에서 부존재이나 대조군에서 존재하는 마커를 나타낼 수 있다.

표 4는 본 발명의 방법에서 사용되기 위해 바람직한 마커를 열거한다. 이러한 마커는 예를 들어, 증폭 반응에서 직접적으로 상기 마커와 연관된 프라이머를 사용하거나, 상기 프로브 서열을 사용함으로서 검출될 수 있다. AD-P 마커는 알츠하이머 환자에게 존재하나 대조군 환자에게는 존재하지 않는다. AD-N 마커는 대조군 환자에서는 일반적이나 알츠하이머 환자에게는 일반적이지 않다.

상기 프로브는 TaqI 사이트로부터 30bp 떨어져 디자인되었다. PCR의 경우에서, PCR 프라이머는 또한 결찰된 생성물을 검출하도록 디자인되었으나 TaqI 사이트로부터 이들의 위치는 다양하다.

프로브 위치(Probe location):

시작 1 - 단편 1에서 TaqⅠ사이트의 30 염기(base) 상류(upstream)

끝 1 - 단편 1에서 TaqⅠ 제한 사이트

시작 2 - 단편 2에서 TaqⅠ 제한 사이트

끝 2 - 단편 2에서 TaqⅠ사이트의 30 염기 하류(downstream)

4kb 서열 위치:

시작 1 - 단편 1에서 TaqⅠ사이트의 4,000 염기(base) 상류(upstream)

끝 1 - 단편 1에서 TaqⅠ 제한 사이트

시작 2 - 단편 2에서 TaqⅠ 제한 사이트

끝 2 - 단편 2에서 TaqⅠ사이트의 4,000 염기 하류(downstream)

샘플 제조(Sample preparation) 및 염색체 상호작용 검출을 위한 바람직한 실시양태

샘플 제조 및 염색체 상호작용 검출 방법은 본원에 기재되어 있다. 예를 들어 이 섹션에서 기재된 바와 같이, 이러한 방법의 최적화된(비-일반적) 버전이 사용될 수 있다.

전형적으로 상기 샘플은 적어도 2×10⁵ 이상의 세포를 함유한다. 상기 샘플은 최대 5×10⁵ 세포를 함유할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 샘플은 2×10⁵ 내지 5.5×10⁵ 세포를 함유한다.

상기 염색체 유전자 좌위에 존재하는 후생적 염색체 상호작용의 가교-결합은 본원에 기재되어 있다. 이는 세포 용해(cell lysis)가 일어나기 전에 수행될 수 있다. 세포 용해는 3 내지 7분, 4 내지 6분 또는 약 5분 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해는 적어도 5 분 이상 및 10 분 미만 동안 수행된다.

제한 효소로 DNA를 분해하는 것은 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, DNA 제한효소 분해는 약 20분과 같이, 약 10 내지 30분의 기간 동안, 약 65℃와 같이, 약 55℃ 내지 약 70℃에서 수행된다.

바람직하게는, 빈번한 커터 제한 효소(frequent cutter restriction enzyme)를 사용하여 최대 4,000개 염기쌍의 평균 단편 크기를 갖는 결찰된 DNA의 단편을 야기한다. 임의로, 상기 제한 효소는 약 256개 염기쌍과 같이, 약 200 내지 300개 염기쌍의 평균 단편 크기를 갖는 결찰된 DNA의 단편을 야기한다. 하나의 실시양태에서, 상기 전형적인 단편 크기는 약 200 염기쌍 내지 4,000개 염기쌍, 400 내지 2,000개 염기쌍 또는 500 내지 1,000개 염기쌍이다.

EpiSwitch 방법의 하나의 실시양태에서, DNA 침전 단계(DNA precipitation step)는 DNA 제한효소 분해 단계(DNA restriction digest step) 및 DNA 결찰 단계(DNA ligation step) 사이에서 수행되지 않는다.

DNA 결찰(DNA ligation)은 본원에 기재되어 있다. 전형적으로, 상기 DNA 결찰은 약 10분과 같이, 5 내지 30분 동안 수행된다.

상기 샘플 중의 단백질은 예를 들어, 단백질 분해효소(proteinase), 임의로 프로테아제 K(Proteinase K)를 사용하여 효소적으로 분해될 수 있다. 상기 단백질은 약 30분 내지 1시간의 기간, 예를 들어 약 45분 동안 효소적으로 분해될 수 있다. 상기 단백질의 분해, 예를 들어, 프로테아제 K 분해 후 하나의 실시양태에서, 가교-결합 반전(cross-link reversal) 또는 페놀(phenol) DNA 추출 단계는 없다.

하나의 실시양태에서, PCR 검출은 결찰된 핵산의 단일 카피를 검출할 수 있고, 바람직하게는 상기 결찰된 핵산의 존재/부존재에 대한 바이너리 판독(binary read-out)으로 검출할 수 있다.

본 발명의 방법 및 용도

본 발명의 방법은 상이한 방식으로 기재될 수 있다. 이는 결찰된 핵산을 제조하는 방법으로 기재될 수 있으며, 상기 방법은 (i) 염색체 상호작용에 함께 모인 염색체 영역의 시험관 내(in vitro) 가교-결합하는 단계; (ii) 상기 가교-결합된 DNA를 효소로 제한효소 분해 절단하는 단계; 및 (iii) 상기 가교-결합된 절단된 DNA 말단을 결찰시켜 결찰된 생성물을 형성하는 단계를 포함하며, 상기 결찰된 핵산의 검출은 유전자 좌위에서 상기 염색체 질환을 결정하는데 사용될 수 있고, 바람직하게는;

- 상기 유전자 좌위(locus)는 본원에서 기재된 임의의 유전자 좌위, 영역 또는 유전자일 수 있으며

- 및/또는 상기 염색체 상호작용은 본원에 기재된 임의의 염색체 상호작용이거나 표에 기재된 임의의 프로브에 상응하는 것일 수 있으머, 및/또는

- 상기 결찰된 생성물은 본원에 기재된 임의의 프로브 서열에 대하여 동일하거나 상동체인 (i) 서열, 또는 (ii)에 상보적인 (ii) 서열을 갖거나 포함할 수 있다.

상동체(Homologues) 및 단편(fragment)

임의의 실시양태에서, 특이적 서열의 상동체 및/또는 단편을 대신 사용할 수 있고, 임의로, 이들은 원래의 서열과 동일한 결합 특징을 가질 것이다.

폴리뉴클레오티드/핵산(예를 들어, DNA)의 상동체는 본원에 언급된다. 이러한 상동체는 전형적으로 예를 들어 적어도 10, 15, 20, 30, 100 개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 부위에 걸쳐 또는 상기 염색체 상호작용에 관여하는 상기 염색체의 영역으로부터의 상기 핵산의 부분을 가로지르는, 적어도 70% 이상의 상동성(homology), 바람직하게는 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90％ 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 97% 이상, 적어도 98% 이상 또는 적어도 99% 이상의 상동성을 가진다. 상기 상동성은 뉴클레오티드 동일성(때로는 ‘경질 상동성(hard homology)’으로 지칭됨)에 기초하여 계산될 수 있다.

따라서, 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드/핵산(예를 들어, DNA) 서열의 상동체는 %서열 동일성을 참조하여 본원에서 언급된다. 전형적으로, 그러한 상동체는 예를 들어 적어도 10, 15, 20, 30, 100 개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 부위에 걸쳐 또는 상기 염색체 상호작용에 관여하는 상기 염색체의 영역으로부터의 상기 핵산의 부분을 가로지르는, 적어도 70% 이상의 상동성(homology), 바람직하게는 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90％ 이상, 적어도 95% 이상, 적어도 97% 이상, 적어도 98% 이상 또는 적어도 99% 이상의 상동성을 가진다.

예를 들어, UWGCG 패키지(Package)는 상동성 및/또는 % 서열 동일성을 계산하는데 사용될 수 있는(예를 들어, 디폴트 설정에서 사용됨) BESTFIT 프로그램을 제공한다(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들어, Altschul S. F. (1993) J MoI Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J MoI Biol 215:403-10. 에 기재된 바와 같이, 상동성 및/또는 % 서열 동일성 및/또는 라인 업 서열(line up sequence)을 계산하는데(동등하거나 상응하는 서열(전형적으로 그들의 디폴트 설정에서)을 확인하는 것) 사용될 수 있다.

BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공식적으로 이용할 수 있다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬될 때 몇몇 양성-값 임계 점수(positive-valued threshold score) T와 일치 또는 만족하는 쿼리 서열(query sequence)에서 길이 W인 짧은 단어를 확인하는 것에 의한 첫 번째 높은 점수 서열 쌍(high scoring sequence pair, HSPs)을 확인하는 단계를 포함한다. T는 인접 단어 점수 임계 값(neighbourhood word score threshold)을 의미한다(Altschul et al, supra). 이러한 초기 인접 단어는 그들을 함유하는 HSPs를 찾기 위하여 검색을 시작하기 위한 씨앗(seed)으로서 활용된다. 상기 단어 히트(word hit)는 누적 정렬 점수(cumulative alignment score)를 증가시킬 수 있는 한, 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 각 방향의 단어 히트에 대한 확장(extension)은 다음의 경우에 중단된다: 상기 누적 정렬 점수는 최대 달성 값으로부터 정량 X만큼 떨어지는 경우; 상기 누적 점수는 하나 이상의 음성-점수 잔기 정렬(negative-scoring residue alignments)의 누적으로 인해 0 이하가 되는 경우; 또는 두 개 서열 중 말단에 도달하는 경우. 상기 BLAST 알고리즘 파라미터 W5 T 및 X는 상기 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. 상기 BLAST 프로그램은 11의 단어 길이(word length, W), 50의 BLOSUM62 점수 매트릭스 정렬(B)(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 참조), 10의 기댓값(expectation, E), M=5, N=4 및 두 개 스트랜드(strand)의 비교값을 디폴트로서 사용한다.

상기 BLAST 알고리즘은 두 개 서열 사이에서 유사성에 대한 통계 분석을 수행한다(Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 참조). 상기 BLAST 알고리즘에 의하여 제공되는 유사성의 하나의 측정은 두 개 폴리뉴클레오티드 서열의 일치가 우연히 발생할 수 있는 확률의 지표를 제공하는 가장 작은 합계 확률(sum probability, P(N))이다. 예를 들어, 제1 서열과 제2 서열의 비교에서 가장 작은 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 서열은 다른 서열과 유사하다고 고려된다.

상기 동족체 서열은 전형적으로 10, 15 또는 20개 미만의 염기와 같이, 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 염기로 서로 상이하다(뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음). 이러한 변화는 동족체 및/또는 % 서열 동일성의 계산과 관련하여 상기 기재된 임의의 영역을 가로질러 측정될 수 있다.

단편 또는 서열의 부분은 전형적으로 원래 서열의 적어도 80% 이상, 90% 이상, 또는 100% 이상과 같이, 적어도 70% 이상을 포함하며, 전형적으로 적어도 10, 20 또는 30 염기쌍의 길이이다.

어레이(Array)

상기 제2 핵산 세트는 어레이에 결합될 수 있고, 하나의 실시양태에서 어레이에 결합한 적어도 15,000, 45,000, 100,000 또는 250,000개 이상의 상이한 제2 핵산 세트가 있으며, 바람직하게는 적어도 300, 900, 2,000 또는 5,000개 이상의 유전자 좌위를 나타낸다. 하나의 실시양태에서, 제2 핵산의 하나 또는 그 이상, 또는 모든 상이한 개체군은 상기 어레이의 하나 이상의 별개의 영역에 결합하며, 실제로 어레이상에서 반복되어 오류 검출을 허용한다. 상기 어레이는 Agilent SurePrint G3 Custom CGH 마이크로어레이 플랫폼을 기반으로 할 수 있다. 어레이에 제1 핵산의 결합의 검출은 이중 컬러 시스템(dual colour system)에 의해 수행될 수 있다.

치료용 제제(therapeutic agents)

치료용 제제는 본원에 기재되어 있다. 본 발명은 관련 조건의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제제를 제공한다. 이는 이를 필요로 하는 개체에 치료학적 유효량의 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제(medicament)의 제조에서 상기 제제의 용도를 제공한다. 본 발명의 방법은 치료를 위하여 개체를 선택하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법, 및 특히 예후 동반 후생적 테스트를 수행하기 위한 방법은, 상기 방법으로 확인된 사람이 관련 질환을 예방 또는 치료하는 제제를 투여될 수 있는 치료 단계를 포함할 수 있다.

상기 제제의 제형은 상기 제제의 본질에 따를 것이다. 상기 제제는 상기 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 함유하는 약학적 조성물의 형태로 제공될 것이다. 적절한 담체 및 희석제는 등장성 식염수, 예를 들어 인산염-완충 식염수(phosphate-buffered saline)를 포함한다. 전형적으로 경구 투여 조성물은 태블릿(tablet), 캡슐(capsules). 액체 용액 및 액체 현탁액을 포함한다. 상기 제제는 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경피 또는 경구 투여용으로 제형화될 수 있다.

제제의 투여량은 다양한 파라미터에 따라, 특히 사용된 기질; 치료받을 개체의 연령, 체중 및 질환; 투여 경로; 및 요구한 요법에 따라 결정될 수 있다. 의사는 임의의 특정 제제에 대하여 요구된 투여 경로 및 투여량을 결정할 수 있다. 그러나 적절한 투여량은 0.1 내지 100 mg/kg 체중, 1 내지 40 mg/kg 체중일 수 있으며, 예를 들어 1일 1 내지 3회 복용하는 것이 바람직하다.

본원에 기재된 기질(Substance)의 형태

본원에 기재된, 핵산 또는 치료용 제제와 같은 임의의 기질은 정제되거나 분리된 형태일 수 있다. 이는 자연에서 발견되는 것과 상이한 형태일 수 있으며, 예를 들어 자연에서 발생하지 않는 다른 기질과 조합하여 존재할 수 있다. 상기 핵산(본원에 정의된 서열의 부위를 포함)은 자연에서 발견된 것과 상이한 서열, 예를 들어, 상동성에 대한 섹션에 기재된 바와 같은 서열에서 적어도 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 변화를 갖는 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 5′ 또는 3′말단에서 이종 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 자연에서 발견된 것으로부터 화학적으로 상이할 수 있으며, 예를 들어 몇몇 방식으로 변형될 수 있으나, 바람직하게는 여전히 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairing)일 수 있다. 적절하게 상기 핵산은 이중 스트랜드 또는 단일 스트랜드 형태로 제공될 것이다. 본 발명은 단일 또는 이중 스트랜드 형태로 본원에 기재된 모든 특이적 핵산 서열을 제공하며, 기재된 임의의 서열에 대한 상보적 스트랜드를 포함한다.

본 발명은 또한 특정 서브그룹과 연관된 염색체 상호작용의 검출을 포함하는 본 발명의 임의의 프로세스를 수행하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본 발명의 프로세스에 의해 생산된 결찰된 핵산을 검출할 수 있는 제제로서 관련 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 특이적 결합 제제를 포함할 수 있다. 상기 키트에 존재하는 바람직한 제제는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 PCR 반응에서 상기 결찰된 핵산을 증폭시킬 수 있으며, 상기 결찰된 핵산 또는 프라이머 쌍에 대해 하이브리드화 할 수 있는 프로브를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 관련 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 장치(device)를 제공한다. 상기 장치는 바람직하게는 본원에 기재된 임의의 제제, 프로브 또는 프라이머 쌍과 같이, 염색체 상호작용을 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍, 임의의 특정 결합 제제를 포함한다.

본 발명에서 특정 질환에서 사용하기 위한 바람직한 치료제

A. 경증(Mild) 내지 중등도(moderate)의 알츠하이머 질병 치료(MMAD)

콜린에스테라아제(Cholinesterase) 억제제는 경증 내지 중등도의 알츠하이머 질병 치료에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 약제로는 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine) 및 도네페질(donepezil)을 포함한다.

B. 중등도 내지 중증의(severe) 알츠하이머 치료

중등도 내지 중증의 알츠하이머 질병을 치료하기 위해 N-메틸 D-아스파르테이트 길항제(N-methyl D-aspartate antagonist)를 처방될 수 있으며, 예를 들어 메만틴(Memantine)은 알츠하이머 질병의 치료를 위하여 FDA의 승인을 받은 NMDA 길항제이다.

NMDA 길항제는 콜린에스테라아제(Cholinesterase) 억제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 메만틴(memantine) 및 도네페질(donepezil)의 조합물인 아리셉트(Aricept)와 남자릭(Namzaric)은 중등도 내지 중증의 알츠하이머 질병의 치료를 위해 FDA의 승인을 받았다.

통상의 기술자는 해당 분야에서 다른 신경 퇴행성 질환에 대한 적절한 치료용 제제를 확인할 수 있을 것이다.

특정 실시양태

상기 EpiSwitch™ 플랫폼 기술은 유전자 좌위(loci)에서 정상 및 비정상 상태 사이의 규제 변화에 대한 후생적 조절 시그니처(epigenetic regulatory signatures)를 검출한다. 상기 EpiSwitch™ 플랫폼은 염색체 구조 시그니처(chromosome conformation signature)로 알려진 인간 염색체의 조절 고차원 구조(regulatory high order structures)와 연관된 유전자 조절의 근본적인 후생적 수준을 확인하고 모니터한다. 염색체 시그니처는 유전자 조절 완화 단계에서 명백히 중요한 단계이다. 이들은 DNA 메틸화(methylation) 및 RNA 프로파일링(profiling)과 같은 후발 후생적 및 유전자 발현 바이오 마커를 사용하는 바이오마커 플랫폼에 대한 고유한 장점을 가진 고차원 바이오마커이다.

EpiSwitch™ 어레이 분석

맞춤형 EpiSwitch™ 어레이-스크리닝 플랫폼은 15K, 45K, 100K 및 250K의 네 가지 밀도의 고유한 염색체 형태(chromosome conformation)로 제공되며, 각 키메라 단편(chimeric fragment)은 어레이에서 4번 반복되어 각각 60K, 180K, 400K 및 1백만의 유효 밀도를 만든다.

맞춤 디자인된 EpiSwitch™ 어레이

15K EpiSwitch™ 어레이는 EpiSwitch™ 바이오마커 발견 기술로 조사된 약 300개의 유전자 좌위를 포함하여 전체 게놈을 스크리닝 할 수 있다. 상기 EpiSwitch™ 어레이는 Agilent SurePrint G3 Custom CGH 마이크로 어레이 플랫폼 상에서 건설되었으며, 이 기술은 60K, 180K, 400K 및 1백만 프로브의 네 가지 밀도를 제공한다. 각 EpiSwitch ™ 프로브가 4 중으로 표시되는 것으로, 상기 어레이 당 밀도는 각 15K, 45K, 100K 및 250K로 감소하였으므로, 재현성의 통계적 평가가 허용된다. 유전적 유전자 좌위 당 잠재적인 EpiSwitch™ 마커의 평균 수는 50이며; 조사할 수 있는 유전자 좌위의 수는 300, 900, 2,000 및 5,000개 이다.

EpiSwitch™ 맞춤 어레이 파이프라인(Custom Array Pipeline)

EpiSwitch™ 어레이는 EpiSwitch™ 어레이 생산 후에, Cy5로 라벨링된 하나의 샘플 세트 및 Cy3로 라밸링된 비교/분석될 다른 샘플(대조군)을 갖는 이중 색상 시스템(dual colour system)이다. 상기 어레이는 Agilent SureScan Scanner를 사용하여 스캔하였고, 결과적 특징(resultant features)은 Agilent Feature Extraction 소프트웨어를 사용하여 추출하였다. 그 다음 상기 데이터는 R에서 EpiSwitch™ 어레이 프로세싱 스크립트를 사용하여 처리되었다. 상기 어레이는 R: Limma*에서 Bioconductor에서 표준 이중 색상 패키지(dual colour packages)를 사용하여 처리되었다.

상기 어레이의 정규화는 Limma*에서 정규화된 어레이 기능을 사용하여 수행되며, 이는 온 칩 (on chip) Agilent 양성 대조군 및 EpiSwitch™ 양성 대조군으로 수행된다. 배열의 정규화는 Limma*의 정규화 된 배열 기능을 사용하여 수행된다. 이 작업은 chip Agilent 양성 컨트롤 및 EpiSwitch™ 양성 컨트롤로 수행된다. 상기 데이터는 Agilent Flag 호출을 기반으로 필터링되고, 상기 Agilent 대조군 프로브가 제거되고 상기 기술 복제 프로브는 Limma*를 사용하여 분석되도록 평균화된다. 상기 프로브는 2가지 시나리오의 차이점을 기반으로 모델링되어 False Discovery Rate를 사용하여 비교되고 수정된다. 변이 계수(Coefficient of Variation, CV)<=30%인 프로브는 <=1.1 또는 => 1.1이며, p<=0.1 FDR p-값을 통과하면 추가 스크리닝에 사용된다. 프로브 세트를 감소시키기 위해 R에서 FactorMineR 패키지를 사용하여 다중 인자 분석(Multiple Factor Analysis)을 추가로 수행하였다.

*참고:　LIMMA는 마이크로어레이 실험(Microarray Experiments)에서 상이한 발현을 평가(Assessing Differential Expression)하기 위한 선형 모델(Linear Model) 및 실증적 베이스 프로세스(Empirical Bayes Processes)이다. Limma는 마이크로어레이 또는 RNA-seq에서 발생하는 유전자 발현 데이터의 분석을 위한 R 패키지이다.

프로브의 풀(pool)은 조정된 p-값. FC 및 CV<30%(임의적 컷 오프 포인트(cut off point)), 최종 피킹(picking)을 위한 매개변수(parameter)를 기반으로 초기에 선택된다. 추가 분석 및 최종 리스트는 처음 두 개 매개변수(adj. p-value; FC)를 기반으로 작성되었다.

통계 파이프라인(Statistical Pipeline)

EpiSwitch™ PCR 플랫폼 상에서 번역을 위해 높은 값의 EpiSwitch™ 마커를 선택하기 위하여, EpiSwitch™ 스크리닝 어레이는 R에서 EpiSwitch™ 분석 패키지(Analytical Package)를 사용하여 처리된다.

1단계. 프로브는 변형된 선형 회기 모델(linear regression model)의 생성물인 수정된 p-값(False Discovery Rate, FDR)을 기반으로 선택된다. p-값이 <= 0.1인 프로브를 선택하고, 후생적 비율(Epigenetic ratio, ER)에 의해 추가로 감소되면, 프로브 ER은 추가 분석으로 선택되기 위해 <= -1.1 또는 => 1.1를 갖는다. 마지막 필터는 변동 계수(CV)이며, 프로브는 <=0.3을 갖는다.

2단계. 통계 리스트의 상위 40개 마커는 PCR 번역을 위한 마커로서 선택하기 위해 ER을 기준으로 선택된다. 가장 높은 음성 ER 로드(load)를 갖는 상위 20개 마커 및 가장 높은 양성 ER 로드를 갖는 상위 20개 마커가 리스트를 형성한다.

3단계. 1 단계의 결과 마커, 상기 통계적으로 유의한 프로브는 초고속 농축(hypergeometric enrichment, HE)을 사용하여 농축 분석의 기초를 형성한다. 이 분석은 상기 유의한 프로브 리스트에서 마커를 감소시킬 수 있으며, 2단계로부터의 마커를 따라 EpiSwitch™ PCR 플랫폼으로 번역된 프로브의 리스트를 형성한다.

상기 통계적 프로브는 유전적 위치(genetic locations)가 후생적 차이의 허브(hub)인 것을 나타내는 통계적으로 유의한 프로브의 농축을 갖는 유전적 위치를 결정하도록 HE에 의해 처리되었다.

가장 유의하게 수정된 p-값을 기반으로 농축된 유전자 좌위는 프로브 목록 생산을 위해 선택된다. p-값이 0.3 또는 0.2 이하인 유전적 위치가 선택된다. 2 단계의 마커와 함께 이러한 유전적 위치에 매핑되는 통계적 프로브는 EpiSwitch™ PCR 번역을 위해 높은 값의 마커를 형성한다.

어레이 디자인 및 프로세싱(Array design and processing)

어레이 디자인

1. 유전적 유전자 좌위(genetic loci)는 SII 소프트웨어(현재 3.2버전)를 사용하여 다음과 같이 처리된다:

a. 이러한 특이적 유전적 유전자 좌위(상류로 50kb과 하류로 20kb를 갖는 유전자 서열)에서 게놈의 서열을 끌어냄.

b. 이 영역 내에서 서열이 CC에 관여할 가능성을 정의함.

c. 특이적 RE를 사용하여 서열을 절단함.

d. 특정 방향(specific orientation)에서 상호작용할 것 같은 제한효소 절단 단편을 결정함.

e. 서로 다른 CC가 상호작용할 가능성 랭크(Rank)함.

2. 어레이 크기 및 사용 가능한 프로브 포지선의 수(x)를 결정한다.

3. x/4 상호 작용을 끌어낸다.

4. 각 상호 작용에 대해 파트 1의 제한효소 인식부위에 대한 30bp의 서열 및 파트 2의 제한효소 인식부위에 대한 30bp의 서열을 정의한다. 제외된 경우에, 그러한 영역이 반복이 아닌지 확인하고 리스트에서 다음 상호작용을 실행한다. 두 가지 30bp를 연결하여 프로브를 정의한다.

5. 정의된 대조군 프로브가 추가된 x/4 프로브의 리스트를 형성하고 4번 복제하여 어레이에서 생성될 리스트를 형성한다.

6. 맞춤 CGH 어레이에 대한 Agilent Sure 디자인 웹사이트에 프로브 리스트를 업로드한다.

7. 프로브 그룹을 사용하여 Agilent 맞춤 CGH 어레이를 디자인한다.

어레이 프로세싱

1. 템플릿 생성물을 위한 EpiSwitch™ SOP를 사용하여 샘플을 프로세싱한다.

2. 어레이 프로세싱 실험실에서 에탄올 침전법으로 정제한다.

3. 혈액, 세포 또는 조직에 게놈 DNA 분석 효소 라벨링(Genomic DNA Analysis Enzymatic labelling)을 위한 CGH를 기반으로 하는 Agilent SureTag 완전한 DNA 라벨링 키트 -Agilent Oligonucleotide Array- 당 샘프을 프로세싱한다.

4. Agilent feature extraction 소프트웨어를 사용하고, Agilent C Scanner를 사용하여 스캔한다.

간행물(Publications)

본원에 기재된 모든 간행물의 내용은 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 발명과 관련된 특징을 추가로 정의하는데 사용될 수 있다.

도 1은 3C 추출 방법의 개략도이다. 3C는 염색질 구조 캡쳐(chromatin conformation capture) 또는 염색체 구조 캡쳐(chromosome conformation capture)를 의미한다.
도 2는 단일 샘플의 전기영동도(electropherogram)(A) 및 대조군 샘플과 비교하여 알츠하이머 질병 환자에서 일반적인 마커에 대하여, 다수의 샘플을 비교한 LapChip GX 시스템을 사용하여 생산된 가상의 겔 이미지(virtual gel image)(B)의 예이다. 상기 분석은 샘플당 50μl의 혈액을 사용하여 수행되었다. 상기 패널 (B)에서 각 컬럼의 상부에서 라벨(label)은 상기 샘플 유형(ALZ: 알츠하이머 환자(Alzheimer’s patient); CTL: 대조군 환자(Control patient)) 및 사용된 PCR 프라이머를 나타낸다. 프라이머 쌍: OBD140_061.063; 마커(Marker): 10_14270092_14271521_14310504_14315691_RR; 이 마커의 q-값(q value): 0.006191144.
도 3은 단일 샘플의 전기영동도(A) 및 알츠하이머 질병 환자와 비교하여 대조군 샘플에서 일반적인 마커에 대하여, 다수의 샘플을 비교한 LapChip GX 시스템을 사용하여 생산된 가상의 겔 이미지(B)의 예이다. 상기 분석은 샘플당 50μl의 혈액을 사용하여 수행되었다. 상기 패널 (B)에서 각 컬럼의 상부에서 라벨은 상기 샘플 유형(ALZ: 알츠하이머 환자(Alzheimer’s patient); CTL: 대조군 환자(Control patient)) 및 사용된 PCR 프라이머를 나타낸다. 프라이머 쌍: OBD140_005.007; 마커: 8_3184876_3186946_3214817_3221560_FR; 이 마커의 q-값은 0.005343515이다.

실시예

본 발명자들은 AD(Alzheimer’s disease) 양성 환자 및 연령이 일치하는 AD 음성 대조군을 살피는 것을 기반으로 하는 신경 퇴행성 질환을 갖는 환자의 후생적 프로파일(epigenetic profile)을 특징으로 한다. AD 마커가 확인된 유전자의 세부 사항은, 연관된 프로브 서열 및 위치(표 2)와 함께 표 1에 나타나 있다. 독창적인 EpiSwitch™ 추출 프로세스는 추출 반응 당 50㎕의 혈액을 사용하는 샘플에서 수행되었다. 간략하게는, 상기 샘플을 포름알데히드(formaldehyde)로 고정하였고, 15분 동안 배양하였으며, 글리신(glycine)으로 급랭(quenched)시켰다. 상기 샘플을 용해시켰고 밀도 쿠션 원심분리(density cushion centrifugation)를 사용하여 핵을 정제하였다. 근접 결찰(proximity ligation)은 제한 효소 TaqI 및 T4 DNA 리가아제(ligase)로 수행되었다. 각 추출에 대한 단백질 및 RNA 함량은 프로테아제 K(Proteinase K)를 통해 제거되었다.

중첩된 PCR은 주형으로 13㎕의 샘플 희석 시리즈를 사용하여 수행되었다. LabChip GX Touch HT (Perkin Elmer) 고 처리량 겔 전기영동 시스템(high throughput gel electrophoresis system)을 사용하여 PCR 생성물을 분석하였다. Perkin Elmer의 LabChip 시스템은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 사용하여 "랩 온 어 칩 (Lab on a Chip)"내부에서 겔 전기영동을 수행한다. 상기 PCR 생성물의 검출은 DNA 염색/레이저 자극 시스템(DNA Dye/laser excitation system) 및 알려진 표준 래더(ladder)에 대해 계산된 크기 및 농도 측정을 통한 것이다. 각각 검사된 래더 및 샘플은 상기 모세관 겔 전기영동이 수행되기 전에 혼합된 하부 및 상부 마커 화합물을 가지며, 상기 래더에 대한 올바른 정렬을 허용한다. LabChip GX 시스템의 출력(output)은 Y 축의 상대 형광 유닛(Relative fluorescent units)과 X 축의 시간의 전기영동도(electropherogram)의 형태이다(예를 들어, 도 2 및 3). Perkin Elmer 소프트웨어는 전형적인 겔 이미지를 나타내는 전기영동도(electropherogram)의 가상 겔 이미지를 창출한다. 검출된 각 DNA 피크(pek)의 크기 및 농도를 정량화하였고, 전기영동도(electropherogram)/가상 겔 이미지 및 알아낼 수 있는 표(exportable table)에 나타낸다.

올바른 크기(가능한 3C 상호작용을 기반으로 예상된 크기와 일치하는 것)로서 확인된 피크를 함유하는 상기 PCR 반응은 상기 생성물의 검출을 나타내는 “1”로 기록되는 반면, 검출되지 않은 생성물인 샘플은 “0”으로 기록된다. 이 판독 값(read out)은 EpiSwitch 중첩된 PCR 플랫폼에 대한 바이너리(binary) 판독 값을 제공한다. 대안적인 TaqI 사이트로 인해 각 프라이머 조합물에 대해 다중 크기의 피크가 예상되므로, 모든 예측된 피크 크기가 분석된다.

환자 진단

5명의 알츠하이머병 환자(중증 내지 중등도의 치매)로부터 유래된 결찰된 DNA를 갖는 샘플 및 5명의 연령-일치된 대조군(age-matched control)을 표 3에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다.

표 3은 상기 마커에 대한 q-값에 따라 대조군(AD-N)의 환자에 대한 EpiSwitch™ 프로브를 나타내며, 상기 마커는 알츠하이머 환자 코호트(cohort) 또는 대조군 코호트에서 일반적인지 여부를 나타낸다.

표 4는 AD에 대한 14가지 바람직한 마커의 세부사항을 제공하며, 알츠하이머 질병이 있는 개체 또는 알츠하이머 질병이 없는 개체에서 일반적일 것으로 예상되는지 여부를 포함한다.

샘플

현재 데이터를 산출하는 상기 혈액 샘플은 모두 러시아, 모스크바의 백인(Caucasians)으로부터 비롯되었다.

유전자	전체 명칭(Full Name)/별칭(Alias)	활성
ABL1	ABL 원-발암유전자 1(ABL Proto-Oncogene 1), 비-수용체 티로신 키나아제(Non-Receptor Tyrosine Kinase)	마그네슘 이온 결합(magnesium ion binding) 및 SH3 도메인 결합(SH3 domain binding)
AGAP1	GTPase 도메인(GTPase Domain), 안키린 반복(Ankyrin Repeat) 및 PH 도메인(PH Domain) 1을 가진 ArfGAP	막 트래피킹 (membrane trafficking), 세포골격 동역학(cytoskeleton dynamics)
ANKS1B	안키린 반복(Ankyrin repeat) 및 살균 알파 모티프 도메인 함유1B(Sterile Alpha Motif Domain Containing 1B)	에프린 수용체(ephrin receptor) 결합
CAMTA1	칼모듈린 결합 전사 활성화제 1 (Calmodulin Binding Transcription Activator 1)	단백질 코딩 유전자(Protein Coding gene)
CHN2	키메린(Chimerin) 2	세포 증식(proliferation) 및 이동(migration)
CNTNAP2	연관된 단백질-유사2와 접촉 (Contact in Associated Protein-Like 2)	세포 부착(cell adhesion)
CPNE4	코핀(Copine) 4	막 트래피킹, 분열(mitogenesis) 및 발달(development)
CSMD1	CUB 및 스시 다중 도메인(Sushi Multiple Domains) 1	단백질 코딩 유전자
CSMD2	CUB 및 스시 다중 도메인(Sushi Multiple Domains) 2	단백질 코딩 유전자
DIP2C	FYN 원-발암유전자(FYN Proto-Oncogene), Src 패밀리 티로신 키나아제(Src Family Tyrosine Kinase)	세포 성장 제어(control)
DLG2	디스크 대형 MAGUK 스캐폴드 단백질(Discs Large MAGUK Scaffold Protein)2	막-연관된 구아닐레이트 키나아제 (membrane-associated guanylate kinase)
DOCK4	사이토키네시스(Cytokinesis) 4의 데디케이터(Dedicator)	세포 사이에서 접착 접합부(adherens junctions)의 조절
EPHB1	EPH 수용체 B1 (EPH Receptor B1)	발달 프로세스(developmental processes), 신경계(nervous system)
FRMD4A	FERM 도메인 함유 4A (FERM Domain Containing 4A)	상피 세포의 극성(epithelial cell polarity)을 조절
FYN	FYN 원-발암유전자, Src 패밀리 티로신 키나아제	세포 성장 제어
GRIN2B	글루타메이트 이온성 수용체 NMDA 유형 서브유닛2B (Glutamate Ionotropic Receptor NMDA Type Subunit 2B)	이온성 글루타메이트 수용체(ionotropic glutamate receptor)
HECW1	HECT, C2 및 WW 도메인 함유 E3 유비퀴틴 단백질 리가아제(Ubiquitin Protein Ligase)1	유비퀴틴 단백질 리가아제(ubiquitin protein ligase) 활성
NAV2	뉴런 네비게이터 2 (Neuron Navigator 2)	헤파린 결합(heparin binding) 및 헬리케이즈 활성(helicase activity)
NRG1	뉴레굴린 (Neuregulin) 1	세포 - 세포 신호(cell-cell signaling), 성장 및 발달(growth and development)
NTM	뉴로트리민 (Neurotrimin)	단백질 결합(protein binding)
NTRK3	신경 영양적 수용체 티로신 키나아제 3 (Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 3)	고유감각 뉴런(proprioceptive neurons)의 세포분화 및 발달(cell differentiation and development)
PSD3	플렉스트린(Pleckstrin) 및 Sec7 도메인 함유3(Sec7 Domain Containing 3)	인지질 결합(phospholipid binding) 및 ARF 구아닐 - 뉴클레오타이드 교환 인자 활성(ARF guanyl-nucleotide exchange factor activity)
PTPRD	단백질 티로신 포스파타제(Protein Tyrosine Phosphatase), 수용체 유형(Receptor Type) D	세포 성장(growth), 분화(differentiation), 유사 분열주기(mitotic cycle) 및 발암 유전자 변형(oncogenic transformation)을 포함하는 프로세스
PTPRG	단백질 티로신 포스파타제 (Protein Tyrosine Phosphatase), 수용체 유형(Receptor Type) G	세포 성장, 분화 및 유사 분열을 조절
SMYD3	SET 및 MYND 도메인 함유 3 (SET And MYND Domain Containing 3)	RNA 중합 효소 II 복합체(RNA polymerase II complexes)의 기능
SND1	포도상구균 뉴클레아제(Staphylococcal Nuclease) 및 튜더 도메인 함유(Tudor Domain Containing) 1	전사 보조-활성제( transcriptional co-activator)
SORCS3	소르틸린 관련 VPS10 도메인 함유 수용체 3 (Sortilin Related VPS10 Domain Containing Receptor 3)	공포성 단백질 선별(vacuolar protein sorting) 10개 수용체 패밀리(family)의 멤버(member)
SPOCK1	Sparc/오스테오넥틴(Osteonectin), Cwcv 및 Kazal-유사 도메인 프로테오글리칸 (테스티칸(Testican)) 1	칼슘 이온 결합(calcium ion binding) 및 시스테인-유형 엔도펩디다아제 억제제 활성 (cysteine-type endopeptidase inhibitor activity)
SRGAP3	SLIT-ROBO Rho GTPase 활성화 단백질(Activating Protein) 3	GTPase 활성제 활성(GTPase activator activity) 및 Rac GTPase 결합(Rac GTPase binding)
TCF7L2	전사 인자 7 유사 2 (Transcription Factor 7 Like 2 )	Wnt 신호 전달 경로(signaling pathway)에서 핵심 역할을 하는 전사 인자(transcription factor)
TJP1	타이트 접합부 단백질 1 (Tight Junction Protein 1)	세포-세포 접합부(cell-cell junctions)에서의 신호 전달(signal transduction)
TRAPPC9	트래피μ 단백질 입자 복합체 9 (Trafficking Protein Particle Complex 9)	IKK 복합체(comples)의 증가된 인산화(phosphorylation)를 통한 NF-kappa-B의 활성제
VPS13B	공포성 단백질 선별 13 동종 B (Vacuolar Protein Sorting 13 Homolog B)	소포체-매개된 전달체(vesicle-mediated transport) 및 단백질 분류
ZNF536	징크 핑거 단백질 536 (Zinc Finger Protein 536)	레티놀 산-반응 요소 결합 (retinoic acid-responsive element binding)

프로브 (Probe)	Prev	유전자 좌위 (Locus)	전체 명칭(Full Name)/별칭(Alias)
12_13876814_13882582_14175710_14178153_FR	AD-P	GRIN2B	글루타메이트 이온성 수용체 NMDA 유형 서브유닛 2B (Glutamate Ionotropic Receptor NMDA Type Subunit 2B)
8_31516198_31523606_31818711_31822095_RR	AD-P	NRG1	뉴레굴린(Neuregulin) 1
8_31516198_31523606_31643705_31652690_RR	AD-P	NRG1	뉴레굴린 1
3_134760993_134763662_134867764_134877240_RR	AD-P	EPHB1	EPH 수용체 B1 (EPH Receptor B1)
8_18627026_18630239_18802479_18805120_RR	AD-P	PSD3	플렉스트린(Pleckstrin) 및 Sec7 도메인 함유 (Domain Containing) 3
10_14270092_14271521_14310504_14315691_RR	AD-P	FRMD4A	FERM 도메인 함유 4A
9_133594848_133596271_133727385_133729777_FF	AD-P	ABL1	ABL 원-발암유전자1 (ABL Proto-Oncogene 1), 비-수용체 티로신 키나아제(Non-Receptor Tyrosine Kinase)
11_19756575_19766996_19853230_19857899_RR	AD-N	NAV2	뉴런 네비게이터 2 (Neuron Navigator 2)
3_9052040_9055750_9145628_9152005_FF	AD-N	SRGAP3	SLIT-ROBO Rho GTPase 활성화 단백질 (Activating Protein) 3
7_111502152_111504459_111764240_111773350_FR	AD-N	DOCK4	사이토키네시스(Cytokinesis) 4의 데디케이터(Dedicator)
10_106933024_106936409_106987230_106996578_RF	AD-N	SORCS3	소르틸린(Sortilin) 관련 VPS10 도메인 함유 수용체(Domain Containing Receptor) 3
8_3184876_3186946_3453654_3461617_FF	AD-N	CSMD1	CUB 및 스시(Sushi) 다중 도메인(Multiple Domains) 1
7_43323285_43325660_43374545_43378939_RF	AD-N	HECW1	HECT, C2 및 WW 도메인 함유 E3 유비퀴틴 단백질 라이게이즈(Ubiquitin Protein Ligase) 1
8_3161496_3163915_3184876_3186946_RF	AD-N	CSDM1	CUB 및 스시(Sushi) 다중 도메인 (Multiple Domains) 1

<110> OXFORD BIODYNAMICS LIMITED <120> Typing Method <130> IP19-0025 <150> PCT/GB 2016/054076 <151> 2016-12-23 <160> 126 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcaggcaga ttacttgagg ttaggaattc gatgccgata gagtaaaaag cattctctgt 60 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tttattaaaa atcactgaat tatatggttc gatgaaaaat attctttaga tctaagacct 60 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aatgtaattg atctgggact ctgccacctc gaaaagagct gccctcccct ggctgctgtg 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 catacacaaa gcaatctgag atggattatc gaagtaaaaa tttttacaga ttctctaagt 60 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggcagttgga tcatttgagt ccaagagttc gacactctca ttctgattct gtttgaaccc 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agaggggcca agtgtgactc tcaggttttc gactccctta gaaacatgca gttgttgttt 60 60 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ttctagggtg ttacatttca aagaattttc gacttgaact tctgcctctc tatttgtatc 60 60 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 aagactgtct cccagatatc ttgctcattc gaagactgtc ttgctagaaa gaatattctt 60 60 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tttattaaaa atcactgaat tatatggttc gattcacagt ctcttcattt gatcagaatc 60 60 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 agcagggtgt ggtgatgaag aggctgactc gataaacagc aaagttcctt tcccagccta 60 60 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tttattaaaa atcactgaat tatatggttc gatttccagt acaactctat gaagaagtta 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 aaacagatgt gagatgatca gatttacatc gatagtatta tacgtggtca ttagcctcag 60 60 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gctgggggtc tcatcattct tcccctcctc gactcttctc tgtcacccat tattcaatct 60 60 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gaaaagaccc ttcaagcaga tggagagttc gagtcttcct agctctgtgt ccttgggcaa 60 60 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ccataaaagg agggcaatgg aagaagagtc gactatttta ttttttgtag agacgagatc 60 60 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gaaaagaccc ttcaagcaga tggagagttc gattacctca aacaaagagg aatagcacta 60 60 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 atgacaagtg aatgaagctg aatatgtatc gacttctctc tgccaccccc aactgtgagc 60 60 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gtagtatgta gtggttacag catgatcttc gacttctctc tgccaccccc aactgtgagc 60 60 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggcaggcaga ttacttgagg ttaggaattc gattctgact taagagacat aaacaaggaa 60 60 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 cctcatttac aaatgagaaa actaagagtc gaaagaaaat attcttcttt cctgaccatt 60 60 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gtgtggccta atcaagaacc aatcagagtc gaactcatca tcctccctcc ccgccccacc 60 60 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tgaatgagtc acttaatttg agtttgtatc gactcactgt actccagcct ggcaacagag 60 60 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 taccttcttt caatccggat attttcagtc gatgtaagag taacatatat tgttcaatat 60 60 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gaaacaggtg ggtcatgagg tcaagagatc gatttattta ttttttcatt catcttcata 60 60 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 attattttcc ttctgcctta atcctctttc gacgctcctc ttcctgtatg catggtttct 60 60 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ctgacaaacc acttagcttg tgtgatattc gactggctga caagtacccc cagaccagaa 60 60 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 acacgataaa agcttcaaag agaaaatgtc gatctggact ctgcctgccc ctacttcatc 60 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gaagataaaa agctcaaaat gaatgaactc gatgcctgcc tcccaccttt ctgagttgag 60 60 <210> 29 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gaaaagaccc ttcaagcaga tggagagttc gaaggaagca ttcagccatt attcactaag 60 60 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 taggtgggtg ggttacgagg ccagaagatc gatacaaact caaattaagt gactcattca 60 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 caagtgcatt cccatgtggg accttctttc gagcagggta gtgaatgttt ggggtagttt 60 60 <210> 32 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 cagggtgctg gaaaatgccc actttgcctc gagcttgcgt cactgcactc cagcctaggc 60 60 <210> 33 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 ttatactaca gggactcttt gatctgggtc gaaaaggtgc acaaatgaaa agggtaccgc 60 60 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 ctggcaagtc tcagctcttt gctagtcatc gactccttcc ctgtcctgct tccattgttt 60 60 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 gcctgcagga tccctgggca agcgtgcttc gaggcacccc atccccatcc ccactctgtc 60 60 <210> 36 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ctgtcagtta cagaggaaga ctgctgtgtc gacctcctcc tcctgcctca gctcccaagc 60 60 <210> 37 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 taccttcttt caatccggat attttcagtc gatgtatatc cgtgaacttt ggggtaacat 60 60 <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 agcaggcaga tcacttaagg acaagagttc gaaatcattt ctgatggaag 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20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 ggtggctcat accatagcac ca 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gctcactgcc atcctgcaac 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 attcgctcgc cacatctcct 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 gccatgcagt gtctgatagg t 21 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 attccattgt gtccctctgt tcct 24 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 ttgaattcct gggtgtgagt tttgc 25 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 ccaggcactt tctctcggtt tt 22 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 ccggattgtc cagcgtcact 20 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 ccgcaacagg acaattgcat ca 22 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 cagagaggct gtccctagca c 21 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 gactctggac agccggacc 19 <210> 72 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 catcaaataa accagcagac ag 22 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 gttattgtcg ctgctgtttg 20 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 cagttcacaa tggaggagaa g 21 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 gtctcatttc caccacctc 19 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 gtctctcaca gtcaagatgc 20 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 agagagaagg ctggacttg 19 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 gagacactca ggcttctttc 20 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 cggtggatca ttccattgt 19 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 acagggatgg atatttggtg gag 23 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 caggacttga gcttggaggg 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 gcagccacag aaatgagtag 20 <210> 83 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 acgtgctgcc caattaac 18 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 tagctttcaa ttccgtagcc 20 <210> 85 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 ggtctgatta tactgatttg gatgc 25 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 cagctagtgt tgaggtctta g 21 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 agaaagaaca gtgtctgtgg 20 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 gcctgcaaag cctaaatg 18 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 cccaacagag tacaggcacc 20 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 caggagatag aaatctggga attg 24 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 gaaatgaact gaagcatgat gg 22 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 ggccataaac tcaaacctag tg 22 <210> 93 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 ccactcaaac gctcatctc 19 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 acactgtaga ggagtggtta tc 22 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 gtatcttgtt cctcccactt tac 23 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 cactggccct aggatttaag 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 aggagagagt gtagtcaagg 20 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 ggtagactag gcactgcttc agg 23 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 gtggctgtaa ggacatgggt agaa 24 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 ttgaggccca gagcaacttc t 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 tgcttggagg cagataccct c 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 gtgcttggag gcagataccc t 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 ccaacagagt acaggcaccc a 21 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 cagaccccct tggggaacat 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 gcacctgggg gagtagaagg 20 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 gagtgttaaa caattgaggg gga 23 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 tttggggtcc cactttgagg g 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 agtccttggc aggtaggtag c 21 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 ggggaagagg gcttaccaat agag 24 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 agaacaccgc accgtctgtt 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 cgtgctgggt ggtgagtaac 20 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 ggccaacatg cccacattct ac 22 <210> 113 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 gatctagcaa atggccaagg ctta 24 <210> 114 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 ctgatgaagg agatgcatag ag 22 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 tccatctgtg tttctcaagt c 21 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 gagatggaaa gggaaggaaa g 21 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 catctactgg gatagaagtc aag 23 <210> 118 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 gtgcaaggaa tttatgaaag gg 22 <210> 119 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 aagaaagcca gggaggag 18 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 tctgtctgct tcagctttac 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 gggctctgaa ctgaatgtag 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 gcccactgac acaaagactc 20 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 ctgtgccaat aactctcagt gc 22 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 tcgcatgtag atccaacaaa g 21 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 tcaagtgtga catgctgaag 20 <210> 126 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 cactggtggt cccatttac 19

Claims

서브그룹 사이를 구별하는 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative condition)에 대한 후생적 검사(epigenetic test)와 관련한 후생적 염색체 상호작용(epigenetic chromosome interactions)을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은,
상기 서브그룹으로부터의 제1 핵산 세트를 염색체 상호작용의 인덱스 개체군(index population)을 나타내는 제2 핵산 세트와 접촉시키는 단계, 및
상보적인 서열이 하이브리드화 되도록 하는 단계를 포함하며,
상기 제1 및 제2 핵산 세트의 핵산은 후생적 염색체 상호작용에서 함께 모인 염색체 영역 양쪽으로부터의 서열을 포함하는 결찰된 생성물(ligated product)을 나타내고,
상기 제1 및 제2 핵산 세트 사이의 하이브리드화 패턴은 후생적 염색체 상호작용이 상기 개체군에서 서브그룹에 특이적인 지를 결정할 수 있게 하며,
상기 서브그룹은, 임의로 상기 질환의 진단, 예후, 발달 가능성 (likelihood of developing) 및/또는 성향으로부터 선택된, 상기 질환과 관련하여 적어도 하나 이상의 특징이 상이한 것인 후생적 염색체 상호작용을 결정하는 방법.
제1항에 있어서,
- 상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 질병(Alzheimer’s disease)이고/이거나,
- 상기 신경 퇴행성 질환은 치매 또는 인지 기능 장애(cognitive impairment)이고/이거나
- 상기 특성은 상기 질환의 조기 전-증상 검출(pre-symptomatic detection)이고/이거나
- 상기 서브그룹은 인간 개체군의 서브그룹이고/이거나,
- 상기 제1 핵산의 세트는 적어도 8 이상의 개체의 것이고/이거나,
- 상기 제1 핵산의 세트는 제1 서브그룹으로부터의 적어도 4 이상의 개체이고, 바람직하게는 제1 서브그룹과 겹치지 않는, 제2 서브그룹으로부터의 적어도 4 이상의 개체이고/이거나,
- 상기 제2 핵산 세트는 염색체 상호작용의 선택되지 않은 그룹을 나타내고/내거나,
- 상기 제2 핵산 세트는 지정된 위치에서 어레이에 결합되고/되거나,
- 상기 제2 핵산 세트는 적어도 100 개 이상의 상이한 유전자 또는 유전자 좌위(loci)에서의 염색체 상호 작용을 나타내고/내거나,
- 상기 제2 핵산 세트는 적어도 1000 개 이상의 상이한 후생적 염색체 상호 작용을 나타내는 적어도 1000 개 이상의 상이한 핵산을 포함하고/하거나,
- 상기 제1 핵산 세트 및 제2 핵산 세트의 핵산은 길이 10 내지 100개 뉴클레오티드 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 신경 퇴행성 질환의 특징을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 동정된 적어도 하나 이상의 염색체 상호작용을 타이핑(typing)하는 단계, 및/또는
(b) 신경 퇴행성 질환의 특징과 연관된 적어도 하나 이상의 염색체 상호작용을 타이핑하는 단계를 포함하며,
상기 특징은 임의로 상기 질환의 진단, 예후, 발달 가능성, 성향 및/또는 조기 전-증상 검출로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
- 제1항 또는 제2항의 제1 핵산 세트가 하기 방법에 의해 생산되고/되거나,
- 제3항의 염색체 상호작용의 타이핑은 하기 방법에 의해 수행되며,
방법은
(i) 가교-결합된 핵산을 형성하기 위해 염색체 상호작용에 함께 모인 염색체 영역의 시험관 내(in vitro) 가교-결합하는 단계;
(ii) 상기 가교-결합된 핵산을 효소로 제한효소 분해 절단하는 단계; 및
(iii) 상기 가교-결합된 절단된 핵산 말단을 결찰시켜 결찰된 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서,
- 상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 질병이고/이거나.
- 상기 적어도 5 내지 500개 이상, 바람직하게는 10 내지 300개 이상, 보다 바람직하게는 20 내지 100개 이상의 염색체 상호작용이 타이핑 되고/되거나,
- 상기 타이핑은, 바람직하게는 PCR 또는 프로브 하이브리드화 검출에 의해, 상기 상호작용에서 함께 모이는 염색체의 영역을 나타내는 결찰된 핵산의 검출을 포함하고/하거나,
- 상기 방법은 임상 시험, 바람직하게는 신경 퇴행성에 대한 후보 물질의 효과를 검사하는 임상 시험을 위한 개체를 선택하기 위해 수행되며/되거나,
- 상기 방법은 신경 퇴행성 질환과 관련된 특성을 기반으로 임상 시험에 참여한 개체를 계층화하기 위해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 동정된 개체에서 신경 퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방(prophylaxis)에 사용하기 위한 신경 퇴행성 질환 치료용 제제.
제1 상태에서 제2 상태로 신경 퇴행성 질환인 개체의 질병 상태를 변화시킬 수 있는 제제를 동정하는 방법으로서, 후보 제제가 제1 상태에 상응하는 염색체 상호작용을 제2 상태에 상응하는 염색체 상호작용으로 변화시킬 수 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제2 상태에서 개체는 신경 퇴행성 질환과 관련된 특징이 결여되어 있는 것인 방법.