KR20190117411A - 혈액 분석 장치 및 이를 이용한 혈액 분석 방법 - Google Patents
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- G01N2015/0065—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials biological, e.g. blood
Abstract
본 발명은 혈액 분석 장치 및 이를 포함하는 혈액 분석 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 적혈구의 농도 및 용적을 측정하는 혈액 분석 장치에 관한 것이고, 이를 이용하여 빈혈의 유무를 용이하게 판단할 수 있는 혈액 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 시료 내의 단일세포, 특히, 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 용이하게 측정할 수 있다.
특히, 적혈구의 농도 및 용적을 측정함으로써, 빈혈 또는 빈혈과 관련된 질병 등을 용이하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 시료 내의 단일세포, 특히, 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 용이하게 측정할 수 있다.
특히, 적혈구의 농도 및 용적을 측정함으로써, 빈혈 또는 빈혈과 관련된 질병 등을 용이하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 혈액 분석 장치 및 이를 포함하는 혈액 분석 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 적혈구의 농도 및 용적을 측정하는 혈액 분석 장치에 관한 것이고, 이를 이용하여 빈혈의 유무를 용이하게 판단할 수 있는 혈액 분석 방법에 관한 것이다.
적혈구(Red blood cell, RBCs)는 혈액세포 중에서 수적으로 가장 큰 비중을 차지하는 세포로 붉은 색의 납작한 원반 모양을 하고 있으며, 혈관을 통해 우리 몸의 조직에 산소를 공급하고 이산화탄소를 제거하는 역할을 한다.
한편, 적혈구의 비정상적인 사이즈 및 양과 관련된 질병을 빈혈이라 한다. 보다 구체적으로, 빈혈은 다량의 출혈, 방사선 피폭, 철분 결핍, 비타민 결핍, 암, 항암제 투여, 당뇨병 및 골수 이상 등으로 인하여 발생할 수 있다. 빈혈은 그 자체로 심각한 건강 문제를 일으킬 수 있으며, 뿐만 아니라 다른 복잡한 질병 등의 원인 되기도 한다. 그러나, 대부분의 빈혈과 관련된 질병은 일찍 발견하기 어렵기 때문에 치료 가능한 단계를 지나서야 발견하게 되는 경우가 대다수이다.
이에 따라, 빈혈의 조기 발견과 즉각적인 치료는 빈혈과 관련된 질병의 위험을 상당히 감소시킬 수 있어, 혈액 검사는 임상 진단을 위한 중요한 정보를 제공하고, 질병 진행 및 치료 중 환자 건강의 변화를 모니터링 함으로써 질병 예방에 도움이 될 수 있다.
병원에서는 혈액 분석기를 이용하여 혈액 분석을 수행하며, 혈액 분석을 통하여 CBC(complete blood count)를 제공한다. 예를 들어, CBC는 적혈구 수, 적혈구 용적률(HCT), Hb 수치, 평균적혈구혈용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균적혈구혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH) 및 평균적혈구혈색소량농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)를 제공한다.
그 중에서도 적혈구의 수, 적혈구의 용적 및 헤모글로빈 수치는 직접 측정할 수 있으며, MCV, MCH, MCHC는 적혈구의 수, 적혈구의 용적, 헤모글로빈 수치를 이용하여 계산되며, 특히, 적혈구의 수와 적혈구의 용적은 특정 빈혈진단의 주요지표로 사용될 수 있다.
그러나, 상술한 적혈구의 수, 적혈구의 용적 등을 측정하기 위한 장비(CBC는 장비)는 부피가 크고 비싸며, 숙련된 전문가만이 처리할 수 있는 문제가 있다. 아울러, 상술한 적혈구 수, 적혈구의 용적을 측정하기 위해서는 많은 양의 혈액(~10mL)이 필요하기 때문에, 정맥 주사를 통해 많은 양의 혈액을 얻는 과정은 환자에게 불편을 줄 수 있다.
따라서, 빈혈의 진단, 즉, 적혈구의 수와 용적을 용이하게 측정할 수 있는 현장진단(point of care) 장치가 필요한 실정이다.
지금까지 개발된 현장진단(point of care)용 혈액 검사 센서는 대략 광학센서 및 전기 화학센서로 분류할 수 있다. 이 중, 광학센서는 환자들이 사용하기 용이하며, 신속하게 측정가능하나, 헤모글로빈(Hb) 농도만 모니터링 할 수 있다. 따라서, 광학센서는 철 결핍으로 인한 빈혈의 유형을 예측하는 것은 이상적이지만 다른 유형의 빈혈에는 적합하지 않다.
아울러, 전기화학적 센서는 헤모글로빈(Hb)을 측정하기 위하여 두 가지 방법(철 또는 임피던스 측정)을 사용한다. 그러나, 이러한 방법으로는 적혈구와 관련된 빈혈(비정상적인 적혈구의 크기와 양)을 검출할 수 없는 문제가 발생하였다.
따라서, 종래의 빈혈센서(광학센서 및 전기화학적 센서)에서 제공하지 않는 적혈구의 농도와 용적에 직접 측정하고 이에 대한 정보를 제공할 수 있는 빈혈센서의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 초미세전극 표면에 대한 단일입자 충돌법을 활용하여 혈액 내의 적혈구의 농도 및 용적을 전기화학적으로 검출할 수 있는 혈액 분석 장치를 제공하고자 한다.
아울러, 본 발명은 상술한 혈액 분석 장치를 이용하여 빈혈을 유무를 용이하게 판단할 수 있는 혈액 분석 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 실시예에서,
산화환원종을 포함하는 반응 용액 및 시료가 포함되는 반응부;
반응부 내에 위치하며, 상대전극, 기준전극, 및 작업전극을 포함하는 전극부; 및
시료 내의 단일 세포가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 단일세포의 농도 및 용적을 측정하는 측정부; 를 포함하는 혈액 분석 장치를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에서,
산화환원종을 포함하는 반응 용액 및 시료를 상기 혈액 분석 장치의 반응부에 주입하는 단계; 및
시료 내의 단일 세포가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 단일세포의 농도 및 용적을 측정하는 단계; 를 포함하는 혈액 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 시료 내의 단일세포, 특히, 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 용이하게 측정할 수 있다.
특히, 적혈구의 농도 및 용적을 측정함으로써, 빈혈 또는 빈혈과 관련된 질병 등을 용이하게 진단할 수 있으며, 특히, 적혈구의 용적을 측정함으로써, 종래의 방법으로는 가능하지 않은 비정상적인 적혈구 크기와 관련된 다양한 유형의 빈혈을 감지할 수 있다.
이에 따라, 이러한 방법은 여러 종류의 빈혈을 용이하게 진단하고 빈혈 관련 질환의 진행을 모니터링하기 위한 POC(point-of-care) 빈혈 센서에 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 혈액 분석 장치의 일 실시예를 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 혈액 분석 장치를 나타내는 블록도이다.
도 3은 K2EDTA가 처리된 적혈구 및 K2EDTA가 처리되지 않은 적혈구의 현미경 사진이다(K2EDTA가 처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (A) 0시간, (B) 3시간 후, 미처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (C) 0시간, (D) 3시간 후).
도 4는 50mV/s 의 스캔 속도에서 Pt UME (직경 25㎛)를 포함하는 PBS 용액 중의 400mM 페로시안화합물의 순환 전압-전류곡선(cyclic voltammogram)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 초미세전극 표면에서의 산화환원종(페로시안화 이온)의 산화 모식도, 및 적혈구 충돌에 의한 산화환원종의 산화 중단 및 그에 의한 전류의 변화 개요를 나타낸다.
도 6은 초미세전극의 표면에서 적혈구 충돌의 전류-시간(i-t) 곡선을 나타낸다((A) 혈장, (B) 3.3fM 적혈구, (C) 8.3fM 적혈구, (D) 41fM 적혈구 및 (E) 79fM 적혈구).
도 7의 (a)는 다양한 적혈구 농도에서의 충돌 빈도, (b)는 충돌 빈도에 따른 RBC(적혈구) 수/㎕의 회귀 도표를 나타낸다(오차 막대는 적어도 세 번의 측정에 대한 표준 편차를 나타냄).
도 8의 (a)는 UME 에서 적혈구 충돌에 의한 계단 전류 감소 분석 시뮬레이션 이미지이고, (b)는 UME 에서 적혈구의 착지점(landing position)에 따른 전류 감소 정도(■: 6.0㎛, △: 7.5㎛, ▼: 8.5㎛, ○: 10.0㎛, 및 ●: 12.0㎛의 직경을 갖는 적혈구가 사용됨)를 나타낸 그래프이며, (c)는 UME 에서 적혈구가 충돌한 후 예상된 평균 전류 감소 정도를 나타낸 그래프이고, (d)는 직경이 증가함에 따른 적혈구의 부피를 나타낸 그래프이며, 및 (e)는 계단 전류 감소 정도에 기반한 적혈구의 부피를 나타내는 그래프이다.
도 9는 6개의 정상 혈액 샘플로부터 계산된 MCVc 를 나타내는 도표이다(Δi 는 CA 가 측정한 전류 감소 정도를 나타내며(세번째 열), 하나의 RBC 의 부피는 Δi의 값을 삽입함으로써 얻어진다(네번째 열). 아울러, 네번째열의 빨간색 수직선은 적혈구가 해당 부피를 기준으로 정렬될 때 충돌의 50%를 나타낸다. MCVC는 적혈구의 상위 50% 부피의 평균을 나타낸다(다섯번째 열)).
도 10은 UME와 적혈구 충돌의 3D 시뮬레이션 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 혈액 분석 장치를 나타내는 블록도이다.
도 3은 K2EDTA가 처리된 적혈구 및 K2EDTA가 처리되지 않은 적혈구의 현미경 사진이다(K2EDTA가 처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (A) 0시간, (B) 3시간 후, 미처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (C) 0시간, (D) 3시간 후).
도 4는 50mV/s 의 스캔 속도에서 Pt UME (직경 25㎛)를 포함하는 PBS 용액 중의 400mM 페로시안화합물의 순환 전압-전류곡선(cyclic voltammogram)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 초미세전극 표면에서의 산화환원종(페로시안화 이온)의 산화 모식도, 및 적혈구 충돌에 의한 산화환원종의 산화 중단 및 그에 의한 전류의 변화 개요를 나타낸다.
도 6은 초미세전극의 표면에서 적혈구 충돌의 전류-시간(i-t) 곡선을 나타낸다((A) 혈장, (B) 3.3fM 적혈구, (C) 8.3fM 적혈구, (D) 41fM 적혈구 및 (E) 79fM 적혈구).
도 7의 (a)는 다양한 적혈구 농도에서의 충돌 빈도, (b)는 충돌 빈도에 따른 RBC(적혈구) 수/㎕의 회귀 도표를 나타낸다(오차 막대는 적어도 세 번의 측정에 대한 표준 편차를 나타냄).
도 8의 (a)는 UME 에서 적혈구 충돌에 의한 계단 전류 감소 분석 시뮬레이션 이미지이고, (b)는 UME 에서 적혈구의 착지점(landing position)에 따른 전류 감소 정도(■: 6.0㎛, △: 7.5㎛, ▼: 8.5㎛, ○: 10.0㎛, 및 ●: 12.0㎛의 직경을 갖는 적혈구가 사용됨)를 나타낸 그래프이며, (c)는 UME 에서 적혈구가 충돌한 후 예상된 평균 전류 감소 정도를 나타낸 그래프이고, (d)는 직경이 증가함에 따른 적혈구의 부피를 나타낸 그래프이며, 및 (e)는 계단 전류 감소 정도에 기반한 적혈구의 부피를 나타내는 그래프이다.
도 9는 6개의 정상 혈액 샘플로부터 계산된 MCVc 를 나타내는 도표이다(Δi 는 CA 가 측정한 전류 감소 정도를 나타내며(세번째 열), 하나의 RBC 의 부피는 Δi의 값을 삽입함으로써 얻어진다(네번째 열). 아울러, 네번째열의 빨간색 수직선은 적혈구가 해당 부피를 기준으로 정렬될 때 충돌의 50%를 나타낸다. MCVC는 적혈구의 상위 50% 부피의 평균을 나타낸다(다섯번째 열)).
도 10은 UME와 적혈구 충돌의 3D 시뮬레이션 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 혈액 분석 장치 및 이를 포함하는 혈액 분석 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 적혈구의 농도 및 용적을 측정하는 혈액 분석 장치에 관한 것이고, 이를 이용하여 빈혈의 유무를 용이하게 판단할 수 있는 혈액 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 시료 내의 단일세포, 특히, 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 용이하게 측정할 수 있다.
특히, 적혈구의 농도 및 용적을 측정함으로써, 빈혈 또는 빈혈과 관련된 질병 등을 용이하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포"는 생명체를 구성하는 구조적인 기본단위로, 본 발명에서 농도 및 용적 측정의 대상이 되는 대상을 의미하며, 적혈구(RBC)를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시료"는 상기 세포인 함유하는 것이라면 어떠한 유형도 가능하나, 적혈구를 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 시료는 본 발명에 따른 반응부에 투입되기 전에 정제 또는 농축되지 않은 상태로 사용할 수 있으며, 시료에 따라 입자가 지나치게 큰 경우, 예를 들어 수 십 또는 수 백㎛이상의 크기를 가지는 입자가 포함되어 있는 경우, 적절한 필터를 여과함으로써 큰 입자를 제거할 수 있다.
본 발명에서, 단일입자 충돌법을 이용한 적혈구의 검출은 1) 전기영동적 이동 및 2) 전기활성화 영역의 차단이라는 두 순차적 전략에 따라 수행된다. 용액 중의 산화환원종인 페로시안화 이온이 작업전극 표면에 산화되는 경우, 정상 상태 전류 흐름에 의하여 작업전극 표면 근처의 양의 전기장이 발생하므로, 음으로 하전된 적혈구 개체는 전기영동적 이동을 통하여 작업전극 표면으로 끌려간다. 전류 수준은 충돌 사건이 일어날 때까지 방사상 확산에 의하여 유지된다. 적혈구 개체가 활성전극 표면에 충돌하여 부착되면, 산화환원종의 흐름이 부착된 적혈구에 의하여 차단되기 때문에, 정상 상태 전류의 수준은 즉시 감소된다.
아울러, 본 발명에서 헤모글로빈 농도 측정수단은 헤모글로빈의 햄(HEME) 기에 포함된 Fe2+의 가역적 산화환원반응(Reversible Redox)에 의해 형성된 상기 작업전극과 보조전극 사이의 전류측정을 통해 헤모글로빈 농도를 측정할 수 있으며, 구체적으로, 헤모글로빈의 햄(HEME)기에 포함된 Fe2+와 전자전달 매개체에 혼합된 Fe3+ 와의 가역적 산화, 환원 반응에 의해 두 전극 사이에 흐른 전류의 크기로 헤모글로빈 농도를 측정할 수 있다.
본 발명은 일 실시예에에서,
산화환원종을 포함하는 반응 용액 및 시료가 포함되는 반응부;
반응부 내에 위치하며, 상대전극, 기준전극, 및 작업전극을 포함하는 전극부; 및
시료 내의 단일 세포가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 단일세포의 농도 및 용적을 측정하는 측정부; 를 포함하는 혈액 분석 장치를 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 혈액 분석 장치의 일 실시예를 도식적으로 나타낸 도면이며, 도 2는 본 발명에 따른 혈액 분석 장치를 나타내는 블록도이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 반응부(100), 전극부(110), 측정부(200) 및 분석부(300)를 포함하여 구성된다.
반응부(100)는 본 발명에서 활용하는 사건인 작업전극(113)과 시료 중의 단일입자 간의 충돌이 발생하는 곳으로, 검출 대상인 단일 세포가 일정 기간 동안 반응부(100) 내의 반응 용액 중에 저장되면서 작업전극(113)과 충돌을 일으키는 공간을 제공한다. 상기 반응부(100)의 형상은 원통, 플레이트, 정육면체, 직육면체, 정다면체, 다각기둥, 구일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 원통, 다각기둥인 것이 바람직하다. 상기 반응부(100)의 크기에는 제한이 없으나, 한 면의 길이가 0.5cm 이상인 것이 바람직하다.
작업전극(113)은 전극 반응에 직접 참가하여 반응을 일으키는 전극을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 작업전극(113)은 반응 용액 중의 산화환원종이 산화 반응을 일으키는 전극을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 초미세전극(UME)은 탄소 섬유, 인듐 산화주석, 불소도핑 산화주석, 보론도핑 다이아몬드, 금, 은, 백금, 구리, 니켈 등 금속 및 비금속 전도성 물질로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 작업전극(113) 표면의 형상은 원형, 타원형, 삼각형, 사각형, 오각형 등 다각형, 구형, 반구형 또는 비정형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 원형, 구형, 반구형인 것이 바람직하다. 이는 원형이 전극 중심으로부터 전극 가장자리까지의 최대거리가 일정한 것에 기인한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 작업전극(113)은 초미세전극으로 이루어질 수 있으며, 전극 표면의 최대 대각선 길이가 10 내지 500μm인 것이 바람직하다. 일 예로, 25μm일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 반응부(100)에 장착되는 작업전극(113)은 1개, 또는 작업전극(113)의 표면의 최대대각선 길이가 상이한 2개 이상일 수 있으며, 작업전극(113)의 최대대각선 길이를 달리 하는 2개 이상의 작업전극(113)을 장착함으로써 상이한 크기를 갖는 적혈구의 존재 여부, 그의 농도 또는 부피를 동시에 검출할 수 있다.
기준전극(112)은 전위 측정 시 단극전위가 일정하여 기준이 될 수 있는 전극을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 기준전극(112)은 은(Ag)으로 이루어질 수 있으며, Ag/AgCl(3M KCl)일 수 있다.
상대전극(111)은 작업전극(113) 또는 기준전극(112)과 짝지어 전극반응을 일으키는 전극을 의미한다. 본 발명의 일 실시예 에 따르면, 상기 상대전극(111)은 백금(Pt), 금(Au) 산화이리듐(IrO2) 등으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 작업전극의 면적보다 5배 이상 큰 면적을 가지는 다양한 형태의 전극일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상대전극(111) 및 기준전극(112)은 작업전극(113)의 형상 및 크기와 동일하거나 다르게 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 작업전극(113), 상대전극(111) 및/또는 기준전극(112)이 반응부(100) 내에 장착되는 위치에는 제한이 없으나, 반응부(100) 벽에 부착되는 것보다는 반응부(100) 벽과 이격되어 장착된 것이 바람직하다. 또한, 기준전극(112)과 작업전극(113) 간의 거리에는 제한이 없으나, 1cm 이내에 배치되는 것이 바람직하다.
이에 더하여, 본 발명의 측정부(200)는 시료 내의 단일 세포가 작업전극(113)의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 단일세포의 농도, 용적 또는 농도와 용적 모두를 측정하기 위한 것으로, 단일세포의 농도를 측정하는 농도측정수단(210)과 단일세포의 용적을 측정하는 용적측정수단(220)을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 단일세포가 작업전극(113) 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화값을 측정부(200)로 전달하여 단일세포의 농도 또는 용적을 측정할 수 있다.
한편, 적혈구의 수(적혈구의 농도)를 측정할 때, 하기의 계산식 1에 의해서 ㎕당 적혈구의 수를 도출할 수 있다.
[계산식 1]
여기서, NRBC는 ㎕당 적혈구의 수이고, NC는 충돌 빈도를 나타낸다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치를 이용하여 단일세포(적혈구)가 작업전극(113) 표면에 충돌 또는 흡착함으로써 발생하는 전류의 세기 변화값을 측정하여 충돌빈도를 측정하고, 상기 적혈구의 충돌 빈도를 이용하여, 상기 계산식 1에서 적혈구의 수(적혈구 농도)를 용이하게 도출할 수 있다.
아울러, 적혈구의 부피는 하기의 계산식 2에 의해서 적혈구의 부피를 도출할 수 있다:
[계산식 2]
여기서, VRBC는 전류 감소로부터 계산된 적혈구의 부피이며, Δi는 전류 감소의 크기를 나타낸다.
한편, 농도측정수단에서 도출된 적혈구의 농도값을 이용하여 빈혈을 진단할 수 있으나, 적혈구의 수(농도)만으로 빈혈을 진단하는 경우, 비정상적인 적혈구의 용적(부피)에 의해서 발생하는 빈혈을 진단 할 수 없게 된다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 상기 농도측정수단에서 측정한 적혈구의 농도와 용적측정수단에서 측정한 적혈구의 용적값을 이용하여 혈액을 분석함으로써, 보다 정확한 빈혈을 진단할 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 분석부(300)를 포함하며, 상기 분석부(300)는 각각의 농도측정수단(210) 및 용적측정수단(220)에서 측정한 단일세포의 농도 및 용적을 비교하고, 측정 대상 단일세포의 평균 개별 용적을 도출하여, 상기 단일세포의 농도에 따른 개별 용적을 분석하기 위한 비교분석수단(310)을 포함한다.
일 예로, 비교분석수단(310) 에서는 용적측정수단(220)에서 각각 측정한 개별 단일세포의 용적을 측정할 수 있고, 이를 평균값으로 도출하여 단일세포의 개별 용적을 도출할 수 있다.
한편, 적혈구의 농도(적혈구의 수)는 농도측정수단(210)에서 측정되고, 적혈구의 용적(부피)는 용적측정수단(220)에서 측정되지만, 이는 하나의 전극, 작업전극(113)에서 상기 단일세포의 충돌에 따른 전류 변화에 따라 측정될 수 있다
이에 더하여, 본 발명의 다른 실시예에서는 보다 정확한 빈혈진단을 하기 위하여, 측정부에 적혈구 내의 헤모글로빈의 농도를 측정할 수 있는 헤모글로빈 농도 측정수단을 더 포함할 수 있다. 헤모글로빈 농도 측정 수단은 통상적인 헤모글로빈의 수치를 측정하기 위한 장치일 수 있으며, 헤모글로빈의 헴(HEME)기에 포함된 Fe2+와 산화환원 반응 물질의 가역적 산화환원 반응에 의해 형성된 상기 작업전극과 보조전극 사이의 전류를 측정하여 헤모글로빈 수치를 측정할 수 있다. 일 예로, 헤모글로빈 농도 측정수단은 전압전류법을 이용하여, 작업전극과 보조전극간의 헤모글로빈의 산화환원에 의해 발생된 전류값을 측정할 수 있다.
이때, 헤모글로빈의 수치를 측정하기 위하여, 상술한 전극부(단일세포의 농도 및 용적 측정시 사용되는 전극부)와는 별도로 추가의 반응부(미도시, 작업전극 및 보조전극)를 포함할 수 있다.
아울러, 헤모글로빈 농도 측정 수단에서 측정한 헤모글로빈의 농도값은 상술한 단일세포의 농도 및 용적값, 구체적으로 적혈구의 농도 및 용적값과 비교될 수 있다. 이 또한, 상기의 비교분석수단(310)의 분석부(300)에서 이루어질 수 있으며, 각각의 측정한 값을 서로 비교함으로써, 빈혈여부를 측정할 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 혈액 분석 장치는 적혈구의 농도, 평균 혈구 용적 및 헤모글로빈의 농도(수치)를 측정하고, 이들의 조합에 의해서 정확한 빈혈을 진단할 수 있다.
전극부(110) 내의 세 전극은 연속적인 전해질 수용액 속에 담겨있어 전기적으로 연결되어 있어야 하며, 각 전극이 오염되는 것을 방지하기 위하여 분리막을 통해 전해질로 연결되어 사용할 수 있다.
아울러, 반응 용액은 전극 반응을 수행하기 위한 각종 이온 등 물질을 제공하는 역할을 하며, 측정하고자 하는 시료를 포함할 수 있고, 산화환원종을 포함할 수 있다. 한편, 상기 시료는 반응부 내에서 작업전극과의 충돌과정을 일으키는 동안 일정 시간 저장됨에 기인하여 추가의 저장부 내에 저장될 수 있으며, 검출대상인 적혈구에 알맞은 조건인 온도(예를 들어, 37℃) 또는 시간을 결정할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 시료는 적혈구를 포함하는 용액으로, 혈액 세포를 안정적으로 유지하고 형태를 유지하기 위하여 항응고제를 포함할 수 있다. 혈액에 첨가함으로써 응고를 저지하는 옥살산염, 시트르산과 같은 항응혈제를 첨가할 수 있으며, 일 예로, K2EDTA를 함유하는 완충용액에 측정하고자 하는 혈액을 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 반응 용액은 산화환원종으로서 페로시안화(ferrocyanide) 이온, 페리시안화(ferricyanide) 이온, 육아민화 루테늄(ruthenium, Ru) 이온, 하이드로퀴논(hydronquinone), 아스코르브산(ascorbic acid), 도파민(dopamine), 페로센메탄올(ferrocenemethanol), 페로센(ferrocene), 페로센다이메탄올(ferrocenedimethanol), α-메틸페로센메탄올, 페로센카복시산(ferrocene carboxylic acid), 페로센다이카복시산(ferrocene dicarboxylic acid), 페로센알데하이드(ferrocene aldehyde) 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
이에 더하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 혈액 분석 장치는 작업전극에서의 시간의 흐름에 따른 전류의 세기 변화를 표시하는 출력부를 더 포함할 수 있다.
이하, 초미세전극(ultra-microelectrode, UME)에서 적혈구의 전기 화학적 충돌을 이용하여, 적혈구의 수를 검출할 뿐만 아니라, 인간 혈액 내의 개별 적혈구의 용적(즉, 적혈구의 MCV)를 측정하기 위한 실시예 및 실험예를 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예>
제조예 1. 작업전극의 제조
작업전극을 제조하기 위하여 Pt-UME 를 통상적인 절차에 따라 제조하였다. 보다 구체적으로, 유리 모세관을 아세톤, 에탄올 및 증류수로 세척한 후, 직경 25㎛의 Pt 와이어를 모세관에 밀봉하였다. 그 후, 상기 전극을 경면(mirror finish)과 같이 되도록 다이아몬드 막(0.1㎛, Allied High Tech Products, Inc.)과 알루미나 분말(0.05㎛, Allied High Tech Products, Inc.)로 연마하였다.
그리고, Pt-UME 를 제조한 후, 상기 전극을 20mM 페로센 메탄올 용액 중의 표준 산화환원 전기화학으로 테스트 하였다.
각각의 실험 전에, 제조한 작업전극은 경면과 같은 표면이 관찰될 때까지 순차적으로 3㎛와 0.1㎛의 다이아몬드 래핑막으로 연마되었다.
<실험준비>
1. 시료준비
혈액 샘플은 익명의 기증자로부터 얻었다. 상기 혈액(약 150㎕)은 일회용 혈액 주사기를 사용하여 인덱스 또는 중지로부터 수집되었다.
아울러, 페로시안칼륨(Potassium ferrocyanide, 99.5%), 에틸렌디아민테트라아세트산 디칼륨염(ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dehydrate)(K2EDTA)(≥99.0%) 및 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline)(PBS; 0.01 M, pH 7.4)를 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에서 구입하였으며, 추가의 정제 없이 사용하였다.
상기 완충액은 밀리포어(Millipore) 수로 제조하였으며, Pt 와이어는 Goodfellow(Devon, PA)에 의해 공급되었다.
2. 전기화학적 측정장치
전기화학적 실험은 작업전극으로 25㎛ 직경의 백금 초미세전극(Pt UME), 상대전극으로 백금 와이어(Pt wire) 및 기준전극으로 Ag/AgCl 전극을 포함하는 3전극 셀로 구성된 CHI617B 퍼텐쇼스택(CH Instrument Inc., Austin, TX)의 전위차계로 수행되었다.
그리고, 각각의 요소들은 페러데이 케이지(Wuhan Corrtest Instrument Co., Ltd, Wuhan, China)에 넣었으며, 현미경 이미지는 Nikon Eclipse LV100ND 현미경(Nikon Imaging Korea, Seoul, Korea)을 사용하여 촬영하였다.
또한, 단일 적혈구 충돌의 이론적 전류 응답은 COMSOL Multiphysics® 5.2a를 사용하여 3D 시뮬레이션을 수행하였다.
3. 혈액샘플 준비
먼저, 사람의 혈액(150㎕)을 2.0㎖ 미세 원심 분리 튜브에 수집하였으며, 혈액의 응고를 방지하기 위하여, K2EDTA(2.0㎎/㎖ blood)를 함유하는 0.6㎖의 PBS 용액(pH 7)을 첨가하였다. 이때, 희석 계수는 5였다.
그리고, 희석된 적혈구 용액(CPBS)의 몰 농도는 아래의 식을 사용하여 추정하였다:
[계산식 3]
(여기서, Vbl은 혈액의 부피, Vs 는 PBS 용액의 부피, Cbl은 인체의 잔재 당 적혈구의 수(hemocytometer로 얻음) 이며, NA는 아보가드로의 상수이다.)
그리고, 혈액 세포의 세포 성분과 형태를 보존하기 위하여 K2EDTA를 항응고제로 사용하였다.
도 3은 K2EDTA가 처리된 적혈구 및 K2EDTA가 처리되지 않은 적혈구의 현미경 사진이다(K2EDTA가 처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (A) 0시간, (B) 3시간 후, 미처리된 PBS 용액 내의 적혈구; (C) 0시간, (D) 3시간 후).
K2EDTA로 처리한 혈액 샘플을 25℃에서 3시간동안 보관한 후 적혈구는 안정적이였으며, 응고되지 않았다.
그러나, 처리되지 않은 혈액 샘플은 3시간 이내에 상당히 빨리 응고된 것을 발견하였다. 따라서, K2EDTA가 실시예에서 항응고제로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
4. 크로노암페로메트리(chronoamperometry, CA) 방법을 이용한 적혈구의 전기화학측정
CA 측정을 수행하기 위하여, 혈장(적혈구 미포함), 3.3fM, 8.3fM, 41fM 및 79fM 적혈구(RBC)를 400mM 페로시안화합물을 함유하는 PBS 용액(pH 7.4)에 첨가하였다.
한편, 준비된 혈액 샘플에서의 적혈구를 검출하기 위한 크로노암페로메트리(CA)를 측정하기 전에, PBS (pH 7.4)에 용해된 400mM Fe(CN)6 4-에 대하여 순환 전압-전류곡선(cyclic voltammogram)을 기록하였으며, 그 결과(CV)는 정상 상태 전류 범위가 0.4V(vs Ag/AgCl)인 S자형 곡선을 보였다(도 4 참조).
도 4는 50mV/s의 스캔 속도에서 Pt UME (직경 25㎛)를 포함하는 PBS 용액 중의 400mM 페로시안화합물의 순환 전압-전류곡선(cyclic voltammogram)을 나타내는 그래프이다.
이 결과를 바탕으로, CA(chronoamperometry)는 전극 표면에서 Fe(CN)6 4-를 Fe(CN)6 3-로 완전히 산화시키는데 충분한 양의 전위인 0.6V 의 인가 전위에서 수행되었다.
구체적으로, CA 측정은 25㎛ 직경의 Pt UME로 +0.6V(vs Ag/AgCl)의 인가된 전위에서 250초 동안 수행되었다.
<실험예>
실험예 1. 초미세전극 표면에서의 적혈구의 검출
적혈구의 충돌을 관찰하기 위하여 산화환원종으로 사용된 페로시안화 칼륨을 초미세전극 표면에서 연속적으로 산화시킨 결과, 계단 전류 반응을 확인하였다(도 5 참조).
도 5는 초미세전극 표면에서의 산화환원종(페로시안화 이온)의 산화 모식도, 및 적혈구 충돌에 의한 산화환원종의 산화 중단 및 그에 의한 전류의 변화 개요를 나타낸다.
특히, 산화환원종인 페로시안화합물(ferrocyanide, Fe(CN)6 4-)은 전극 표면에서 지속적으로 산화되어 양극의 정상 상태 전류를 생성하고 동시에 양의 전계를 형성하고, 음전하의 적혈구(-15.7mV)는 이동을 통해 UME 표면으로 유인되어 충돌하게 된다.
단일 적혈구의 충돌한 다음 전극 표면의 흡착 후에는, 페로시안화합물의 산화플럭스가 차단되어 계단 전류가 감소하여 적혈구의 크기와 수에 대한 정량적인 정보를 제공할 수 있는 것으로 판단하였다.
실험예 2. 실험 결과에 대한 용액 중 불순물의 영향 확인
도 6은 초미세전극의 표면에서 적혈구 충돌의 전류-시간 (i-t) 곡선을 나타낸다 ((A) 혈장, (B) 3.3fM 적혈구, (C) 8.3fM 적혈구, (D) 41fM 적혈구 및 (E) 79fM 적혈구).
일반적으로, 사람의 혈액은 혈액 세포, 호르몬, 단백질 및 이온을 포함하는 많은 성분을 가지고 있다. 혈액 세포 이외의 구성 요소로부터 발생되는 신호는 적혈구 검출에 오류를 일으킬 수 있다.
참고로, 계단 전류 감소는 주로 전극 표면 상에 분석물의 부착으로부터 유래하나, 불순물의 흡착에 의해서도 계단 전류 감소를 야기할 수 있다. 따라서, 혈장만을 포함(적혈구가 없는)하는 용액을 이용하여 대조군 실험을 수행하였다(도 6(a)).
도 6(a)를 참조하면, 250초가 지나도록 의미 있는 계단 신호를 관찰할 수 없었다. 즉, 인간의 혈액 세포에는 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하나, 적혈구의 수는 백혈구나 혈소판의 수 보다 훨씬 많기 때문에, 본 실험예에서 실시한 계단 전류의 감소는 적혈구의 충돌 만에 의한 것이라고 가정하였다.
도 6을 참조하면, 충돌 신호는 적혈구를 포함하는 혈액샘플이 전기 화학 셀에 로드되었을 때 관찰될 수 있었다. 특히, 적혈구의 농도가 3.3fM 에서 79fM 으로 증가함에 따라 계단 전류도 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 충돌 빈도가 적혈구의 농도에 의존하는 것으로 판단하였다.
실험예 3. 충돌빈도에 따른 적혈구 농도 측정
도 7의 (a)는 다양한 적혈구 농도에서의 충돌 빈도를 나타낸다.
도 7을 참조하면, 3.3fM, 8.3fM, 41fM 및 79fM의 적혈구 농도에서 각각 0.6(±0.5), 3.3(±1.2), 9.7(±2.9) 및 14.3(±2.5)의 충돌 빈도가 관찰되었다.
본 실험예에서 측정된 적혈구 검출한계(3.3fM)는 혈액의 한 방울로도 적혈구 수를 측정할 수 있는 매우 적은 양이다.
결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 센서(적혈구의 농도 및 크기 분석장치)를 이용함으로써, 적은 양의 혈액으로도 적혈구의 수를 측정할 수 있어, 종래의 정맥 주사를 통한 혈액 샘플링을 피할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 상술한 초고감도 적혈구 검출은 이동 효과에 기인할 수 있다.
산화 전위를 전극에 가함으로써, 400mM Fe(CN)6 4-의 산화로 인하여 전극 표면 주위에 강력한 양의 전계가 생성되었다. 보다 구체적으로, 적혈구는 음전하를 띄고 있어, 전극 주변의 양의 전기장에 강하게 끌리게 된다.
상술한 실험예를 바탕으로 회귀 분석을 사용하여 아래와 같은 충돌 횟수를 혈액의 적혈구 수로 환산하는 방정식을 도출하였으며, 그 결과에 따른 회귀 도표를 도 7(b)에 나타내었다:
[계산식 1]
(여기서, NRBC는 ㎕당 적혈구의 수이고, NC는 충돌 빈도를 나타낸다.)
계산식 1은 충돌 횟수에서 적혈구 수를 계산하는데 사용할 수 있다.
따라서, 상기 계산식 1을 이용하여 비정상적인 적혈구의 수에 의해서 야기되는 질병 등(빈혈 등)을 진단할 수 있다.
통상적으로, 적혈구의 수가 정상보다 높으면 진성다혈구증(polycythemia vera), 변형적 혈구 증가증(poikilocytosis) 및 적혈구 증가증(erythrocytosis)과 같은 질병을 나타내며, 적혈구의 수가 정상보다 낮은 경우에는 척수형성이상증(myelodysplasia), 악성 빈혈(pernicious anemia), 골수무형성위기(aplastic crisis) 및 범혈구감소증(pancytopenia) 등과 같은 질병을 나타낸다.
그러나, 본 발명의 센서(적혈구의 농도 및 크기 분석장치)를 이용하여 충돌 횟수에 따른 적혈구 수를 계산함으로써, 질병 초기에 일부 유형의 빈혈 또는 적혈구 수에 의해서 야기되는 질병(빈혈)을 신속하고 용이하게 예측할 수 있다.
실험예 4. 충돌빈도에 따른 적혈구 용적 측정
4-1. 개별 적혈구의 용적을 측정하기 위하여 적혈구가 UME 표면에서 충돌할 때 발생하는 전류 감소의 크기를 분석
빈혈의 또 다른 중요한 현상은 적혈구의 비정상적인 크기이다.
통상적으로 정상적인 적혈구는 직경이 약 7~8㎛이고, 두께가 약 2㎛이다. 그러나, 일부 유형의 빈혈의 경우, 적혈구는 정상보다 높은(10㎛<) 또는 더 낮은(<6㎛) 직경을 보인다.
이러한 비정상적인 크기의 적혈구는 적혈구로써의 기능을 제대로 하지 못하기 때문에 심각한 건강 문제를 일으킬 수 있다. 이에 따라, 적혈구의 크기를 판별하는 것은 빈혈을 진단하는 데 매우 중요한 요소가 된다.
특히, 적혈구 크기는 적혈구의 평균 체적으로 정의되는 MCV에 반영된다.
실험예에서 개별 적혈구의 용적을 측정하기 위하여 적혈구가 UME 표면에서 충돌할 때 발생하는 전류 감소의 크기를 분석하였다.
보다 구체적으로, 동일한 실험 조건으로 시뮬레이션 하고, 서로 다른 적혈구의 착지점에서 UME 표면의 단일 적혈구의 충돌로 인한 전류 감소의 크기를 계산하였다. 그리고, 그 결과를 도 8(b)에 나타내었다.
도 8(b)는 UME 에서 적혈구의 착지점(landing position)에 따른 전류 감소 정도(6.0㎛(■), 7.5㎛(△), 8.5㎛(▼), 10.0㎛(○) 및 12.0㎛(●))의 직경을 갖는 적혈구가 사용됨)를 나타낸다. 여기서, Δi는 UME 에서 적혈구의 충돌 후 계단 전류 감소의 크기를 나타내며, Δr은 적혈구의 중심과 UME 중심 사이의 거리를 나타낸다.
도 8(b)를 참조하면, 전류 감소의 크기는 UME 상에 적혈구의 착지점(landing position) 위치에 따라 결정된 것을 확인할 수 있었다.
이는 적혈구에 의해 차단된 산화환원종(Fe(CN)6 4-)의 플럭스(flux)가 UME 의 착지점에 따라 달라지기 때문인 것으로 판단된다.
다음으로, 시뮬레이션 결과를 바탕으로, 전류 감소의 크기로부터 적혈구의 가장 가능성 있는 직경을 추정하였으며, 그 결과를 도 8(c)에 나타내었다.
아울러, 도 8(d)는 직경이 증가함에 따른 적혈구의 부피를 나타내는 그래프로, 도 8(d)를 참조하면, 단일 적혈구의 직경도 적혈구의 용적으로 변환될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
도 8(e)는 계단 전류 감소 정도에 기반한 적혈구의 부피를 나타내는 그래프이다. 도 8(e)를 참조하면, 적혈구의 부피는 충돌하는 동안 발생하는 전류 감소를 측정하여 추정할 수 있는 것으로 판단되었다. 참고로, 하기의 회기분석 [계산식 2]을 사용하여 전류 감소 크기와 적혈구 용적에 대한 방정식을 도출하였다:
[계산식 2]
VRBC(fL)은 전류 감소로부터 계산된 적혈구의 부피이고, Δi(nA)는 전류 감소의 크기이다. 여기서, 상기 적혈구의 중심이 전극 내부에 얹어졌을 때 얻은 시뮬레이션 데이터만 상기 계산식 2으로 도출하였다. 계산식 2에 나타낸 바와 같이, 가장 관련성 높은 지름과 관련된 가정은 동일한 적혈구로의 착지점에 따라 상이한 전류를 생성할 수 있어 단일 적혈구의 체적에 오차를 유발할 수 있다.
그러나, VRBC의 평균값은 여러 데이터 요소의 평균을 포함하기 때문에 오차 발생을 수정할 수 있는 정도이다. 그리고, VRBC의 평균값은 진단을 위해 사용될 것이다.
또한, 단일 적혈구를 분석함으로써, 거대한 전류 단계를 생성하는 비정상적으로 큰 적혈구를 스크리닝 할 수 있다. 따라서, 어떠한 큰 신호(>50nA)는 병원에서 완벽한 검사를 권장하는데 충분한 지표가 될 것으로 판단하였다.
4-2. 정상 혈액에서의 적혈구의 개별 용적 분석
정상혈액에서 충돌에 의한 적혈구의 부피를 분석하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서, Δi 는 CA 가 측정한 전류 감소 정도를 나타내며(세번째 열), 하나의 RBC 의 부피는 Δi의 값을 삽입함으로써 얻어진다(네번째 열). 아울러, 네번째열의 빨간색 수직선은 적혈구가 해당 부피를 기준으로 정렬될 때 충돌의 50%를 나타낸다. MCVC는 적혈구의 상위 50% 부피의 평균을 나타낸다(다섯번째 열).
보다 구체적으로, 분석은 79fM와 41fM 적혈구의 농도로 각각 3개의 혈액 샘플을 사용하였다. 도 9의 세번째 열에 표시된 것처럼 적혈구가 전극에 충돌했을 때 다른 값의 Δi 가 얻어졌다. 상기 Δi의 값은 상술한 계산식 2를 사용하여 단일 적혈구의 부피를 얻은 다음 크기에 따라 분류하였다.
그리고, 샘플에서는 20~130fL 의 적혈구가 검출되었으며, 모든 적혈구의 부피를 더하고, 이를 적혈구의 수(즉, 적혈구의 평균치)로 나눴다.
그 결과, 정상 크기의 적혈구를 가진 6가지의 실험에서 모든 MCVC 값이 정상범위(80~100fL)로 나타났으며, 이 방법이 적혈구의 MCV를 결정하는데 효과적임을 확인하였다(도 9).
그 결과 값은 병원에서 사용되는 MCV 와 거의 동일하였다.
이 실험에서 계산된 적혈구의 MCV는 MCVC (단일 적혈구 충돌 실험의 MCV)로 표시되며, 그 값은 도 9의 다섯번째 열에 표시된다. 그 결과, 정상 크기의 적혈구를 가진 6 가지 다른 실험에서, 모든 MCVC 값은 정상 범위에 있었고, 이 방법이 적혈구의 MCV의 측정에 효과적임을 확인하였다.
참고로, 정확한 데이터 수집을 위해 전극 주변에 떨어지는 적혈구는 무시되었다. 적혈구가 Pt 전극 표면에 부분적으로 접촉하지 않으면, 산화 환원 종의 전극으로의 물질 전달을 방해하여 작은 신호를 줄 수 있다. 따라서 작은 전류 신호는 시뮬레이션과 충돌 영역의 확률적 근사법을 기반으로 제외되었다. (도 9 참조).
한편, 지금까지 POC 빈혈 센서에서 적혈구 수와 MCV 수치를 동시에 계산할 수 있는 방법은 제시되지 않았다.
또한 이 방법을 이전에 개발 된 방법 (전기 화학적 Hb 또는 Hct 검출 센서)과 결합하여 모든 중요한 값 (RBC, Hct, MCV, MCH의 수)을 측정하는 POC 빈혈 센서를 개발하는 것이 가능하다. 이러한 POC 빈혈 센서는 빈혈 진행 진단 및 모니터링에 매우 유용할 것으로 판단되었다.
실험예 5. 충돌영역의 시뮬레이션과 확률적 근사법
5-1. UME 에서 적혈구 충돌시 전류 감소를 측정하기 위한 COMSOL 시뮬레이션
화학 반응 엔지니어링 모듈을 갖춘 COMCOL Multiphysics 5.2를 사용하여 적혈구(RBCs)가 UME 에 충돌하는 것을 시뮬레이션 하였다.
상기 시뮬레이션은 3D 공간에서 Fick's second 법칙을 풀음으로써 수행되었다. UME 반응이 페로시안 화합물의 전자산화를 포함한다고 가정하였다((Fe(CN)6 4- → Fe(CN)6 3- + e). 아울러, 용액 중의 Fe(CN)6 4- 확산은 식 3에 나타내었다:
[식 3]
5-2. 충돌영역의 시뮬레이션과 확률적 근사법
도 10은 적혈구(RBC)와 UME 의 충돌의 3D 시뮬레이션 결과를 나타내는 도면이다. 도 10을 참조하면, 전류 감소의 크기(Δi)는 RBC의 착지점(landing position) 위치를 기준으로 추정하였다. 아울러, Δr은 적혈구(RBC)의 중심(직경: 7.5㎛)과 UME 의 중심(반경: 12.5㎛) 사이의 거리를 나타낸다.
도 10을 참조하면, 시뮬레이션 결과는 RBC가 전극의 중심에서 가장자리로 이동할 때, Δi는 12.8~36.4nA (RBC가 UME와 충돌할 때, 예상되는 Δi 범위)의 범위를 가진다.
특히, Δr이 14.8㎛보다 클 때, Δi는 연속적으로 감소하고, Δr<14.8㎛ 인 경우 보다 항상 낮았다. 아울러, Δr이 20.8㎛ 보다 크면, Δi는 1nA (실험예에서 얻은 최소 Δi값) 보다 낮았다. 따라서, 유효 충돌 전극 범위(0~14.7㎛)를 초과하는 충돌 신호를 무시하였다.
Δi가 검출될 수 있는 총 충돌 전극 면적(>1nA)은 1359㎛2(디스크 전극의 반경은 20.8㎛ 임); MCV 를 계산할 수 있는 유효 충돌 전극 면적은 679㎛2(디스크 전극 반경은 14.7㎛)이었다.
이 값(679㎛2)은 총 면적(1359㎛2)의 50%에 해당된다. RBC의 착지점(landing position)의 무작위성을 고려할 때, 충돌 신호의 상반부(50.0%) 만이 전극 상에 생성되고 나머지 신호는 그 주위에 생성된다고 가정할 수 있다.
10: 혈액 분석 장치
100: 반응부
110: 전극부 111: 상대전극
112: 기준전극 113: 작업전극
200: 측정부
210: 농도측정수단 220: 부피측정수단
230: 헤모글로빈 농도측정수단
300: 분석부
310: 비교분석 수단
100: 반응부
110: 전극부 111: 상대전극
112: 기준전극 113: 작업전극
200: 측정부
210: 농도측정수단 220: 부피측정수단
230: 헤모글로빈 농도측정수단
300: 분석부
310: 비교분석 수단
Claims (12)
- 산화환원종을 포함하는 반응 용액 및 시료가 포함되는 반응부;
반응부 내에 위치하며, 상대전극, 기준전극, 및 작업전극을 포함하는 전극부; 및
시료 내의 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 측정하고,
적혈구 내의 헤모글로빈의 농도를 측정하는 헤모글로빈 농도 측정 수단을 구비하는 측정부;를 포함하는 혈액 분석 장치.
- 제1항에 있어서,
측정부는 단일세포의 농도를 측정하는 농도측정수단 및 단일세포의 용적을 측정하는 용적측정수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 장치.
- 제2항에 있어서,
농도측정수단은 전류 세기 변화량 및 전류 세기 변화 빈도 중 하나 이상을 측정하여 시료 내의 단일세포의 충돌 빈도를 도출하고, 하기 계산식 1을 이용하여 도출된 충돌 빈도로부터 시료 내 단일세포의 농도를 산출하는 혈액 분석 장치:
[계산식 1]
여기서, NRBC는 ㎕당 단일세포의 수이고, NC는 충돌 빈도를 나타낸다.
- 제2항에 있어서,
용적측정수단은 작업전극의 전류 감소량(Δi)을 측정하고 하기 계산식 2를 이용하여 측정된 전류 감소량으로부터 적혈구의 용적을 산출하는 용적측정수단을 구비하는 혈액 분석 장치:
[계산식 2]
여기서, VRBC는 전류 감소로부터 계산된 적혈구의 부피이며, Δi는 전류 감소의 크기를 나타낸다.
- 제2항에 있어서,
용적측정수단은 적혈구의 전극 표면에 대한 충돌 시뮬레이션을 통하여, 전류 감소 신호 중 적혈구와 전극 표면의 유효 충돌을 나타내는 상위 크기의 전류 감소 신호만을 평균 용적을 산출하는데 이용하는 혈액 분석 장치.
- 제2항에 있어서,
측정부는 각각의 농도측정수단 및 용적측정수단에서 측정한 적혈구의 농도 및 용적으로부터 측정 대상 적혈구의 평균 개별 용적을 도출하여, 상기 적혈구의 농도에 따른 개별 용적을 분석하는 비교분석 수단을 포함하는 분석부를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 장치.
- 제1항에 있어서,
헤모글로빈 농도 측정 수단은 헤모글로빈의 산화환원에 의해 발생된 전류값을 측정하여 헤모글로빈의 농도를 산출하는 혈액 분석 장치.
- 제1항에 있어서,
작업전극은 탄소 섬유, 인듐 산화주석, 불소도핑 산화주석, 보론도핑 다이아몬드, 금, 은, 백금, 구리 및 니켈로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 혈액 분석 장치.
- 제1항에 있어서,
반응 용액은 산화환원종으로서 페로시안화(ferrocyanide) 이온, 페리시안화(ferricyanide) 이온, 육아민화 루테늄(Ru) 이온, 하이드로퀴논(hydronquinone), 아스코르브산(ascorbic acid), 도파민(dopamine), 페로센메탄올(ferrocenemethanol), 페로센(ferrocene), 페로센다이메탄올(ferrocenedimethanol), α-메틸페로센메탄올, 페로센카복시산(ferrocene carboxylic acid), 페로센다이카복시산(ferrocene dicarboxylic acid) 및 페로센알데하이드(ferrocene aldehyde)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 장치.
- 제1항에 있어서,
작업전극에서의 시간의 흐름에 따른 전류의 세기 변화를 표시하는 출력부를 더 포함하는 혈액 분석 장치.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 혈액 분석 장치를 이용하여, 산화환원종을 포함하는 반응 용액 및 시료를 반응부에 주입하는 단계; 및
시료 내의 적혈구가 작업전극의 표면에 충돌 또는 흡착시 발생하는 전류의 세기 변화를 통하여 적혈구의 농도 및 용적을 측정하는 단계; 를 포함하는 혈액 분석 방법.
- 제11항에 있어서,
측정한 적혈구의 농도 및 용적을 비교하는 단계를 포함하며,
적혈구의 개별 용적을 분석하여 빈혈을 진단하는 것을 특징으로 하는 혈액 분석 방법.
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