KR20190112431A - 산초유를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
산초유를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 산초유를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 엑스펠라 착유법으로 착즙한 산초유가 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키는 효과가 있다는 것을 확인하였고, 특히 다양한 품종(조생종, 만생종, 한초) 중에서 한초 품종이 현저한 항염 효과가 있다는 것이 특징이다.
Description
본 발명은 산초유를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증(inflammation)은 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻한다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게 되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생하는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입 균의 세포 파괴물이 침입받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다. 염증에 의한 농양의 치료는 소염작용을 통하여 촉진될 수 있는데, 소염작용이란 항균제를 이용하여 침입 균의 증식을 억제하거나 농양 중에 축적된 이물질들을 탐식하는 대식세포(macrophage)를 활성화하여 상기 이물질들을 소화 및 배설하는 대식세포의 기능을 항진시키는 등의 염증치료 촉진작용이다.
일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입 균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 칭한다. 상기 염증질환은 외부자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환이다. 이와 같은 염증에 의해 발생하는 염증성 질환에는 천식, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염 등 다양한 질환이 포함된다.
한편, 염증성 질환 중에서 천식은 전 세계적으로 3억 명 이상의 환자가 있는 중요한 보건학적인 문제이며, 우리나라에서도 만성질환 중 질병부담이 6번째로 큰 질환으로 조사되었다. 천식의 유병률은 아직 많은 국가에서 지속적으로 증가하는 추세이다. 국내에서도 소아 천식은 이전에 보였던 빠른 유병률 증가가 꺾이면서 증가추세가 완화되어가고 있지만, 성인 천식은 지속적으로 증가하고 있으며, 이는 빠르게 고령화 사회에 진입하고 있는 우리나라에서 향후 천식이 지금보다도 더 큰 사회적 부담으로 다가올 가능성을 시사한다고 볼 수 있다.
천식은 가장 흔한 만성 기도 질환 중 하나로 호흡곤란, 천명, 가슴 답답함, 기침과 같은 증상이 가역적인 호기 기류제한과 함께 나타나는 것을 특징으로 한다. 천식은 유전적 요인과 환경적 요인이 복합적으로 작용해 생긴다. 환경적 요인으로는 집먼지 진드기, 꽃가루 등 원인 물질과 감기, 흡연, 공기오염, 황사 등이 있다. 완치가 어렵다고 알려진 천식은 반복적이고 발작적으로 증세가 나타나므로 지속적인 관리가 중요한 질환이다. 이런 천식은 계절 또는 악화 인자 등에 따라 다양하게 변화하며, 천식의 악화 인자로는 운동, 알레르겐(항원) 혹은 자극성 물질, 날씨 변화, 감기 같은 호흡기 바이러스 감염 등이 있다. 천식 급성 악화는 생명을 위협할 수도 있다. 천식은 대부분 직/간접적인 자극에 대한 기도과민성이나 기도의 만성 염증과 관련이 있고, 유사한 임상양상을 보이지만, 서로 다른 병태생리가 있는 질환이 섞여 있는 균일하지 않은 질환으로, 병의 완치보다는 증상의 완화와 발현 횟수를 줄이는 약재가 대부분이며, 따라서 천식 치료제 개발이 시급하다.
산초나무는 운향과에 속하며 열매에서 추출한 정유물질은 주로 식·약용으로 사용하고 있다. 산초과실에는 리모닌(Limonene, 58%), 시트로네랄(Citronellal, 22%), 베타-페란드렌(β-Phellandrene, 6.4%), 시네올(Cineol, 2.2%), 디펜텐(Dipentene, 1.2%) 등의 정유물질이 함유되어 있다. 대부분의 산초유는 30여 종의 지방산으로 포화지방산과 불포화지방산으로 구분되고 있으며, 그 중 불포화지방산은 단가불포화지방산과 다가불포화지방산으로 구성되어 있다. 산초기름의 성분(수분 10.5%, 조단백 9%, 조지방 37.8%, 조섬유 14.5%, 조회분 8%, 기타 20.3%) 중에 지방함량이 약 38%로서 그 중 리놀산(Linoleic, 26%)과 리놀렌산(Linolenic, 29.2%), 오레인산(Oleic, 35%) 등 대부분의 불포화지방산으로 구성되어 있으며, 회분(8%)의 함량은 참깨(5.3%), 호두(2.3%), 은행(1.2%)보다 많이 함유하고 있다. 또한, 상온에서 항상 액체상태로 존재하므로 상시 이용할 수 있는 기능적 특성을 지니고 있다. 특히 산초기름은 지용성 비타민인 A, D, E, K 등의 운반체 역할을 하는 다가불포화지방산인 리놀산과 리놀렌산이 45% 이상 함유되어 있어 복용 후 체내에서 필수지방산 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
산초유 관련 기술로서, 한국공개특허 제2017-0091804호에 알레르기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0132394호에 산초나무에서 단리한 콜리닌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 항결핵 약학 조성물 및 그 제조방법에 대해 개시되어 있으나, 본 발명의 산초유를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서 개시된 바는 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 산초유를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 본 발명에 따른 엑스펠라 착유된 한초 품종의 산초유가 염증성 사이토카인의 발현을 현저하게 감소시키고, 천식이 유도된 동물모델에서 기관지 폐포 세척액에서의 염증세포 수의 감소, 기도 과민성의 감소 및 폐 조직의 형태학적 변화를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 천식 또는 아토피 피부염 개선용 의약외품을 제공한다.
본 발명은 산초유를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 엑스펠라 착유된 한초 품종의 산초유가 염증성 사이토카인의 발현을 현저하게 감소시키고, 천식이 유도된 동물모델에서 기관지 폐포 세척액에서의 염증세포 수의 감소 및 기도 과민성을 감소시키며, 폐 조직의 형태학적 변화를 유도하는 효과가 있는 것이다.
도 1은 품종 및 착유법 별 산초유를 처리한 A549 세포에서의 염증성 사이토카인(IL-25)의 발현량 변화를 확인한 것이다. (A)는 조생종이고, (B)는 만생종이며, (C)는 한초 품종의 산초이다. sample 1, 4 및 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 2, 5 및 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 3, 6 및 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 2는 품종 및 착유법별 산초유를 처리한 A549 세포에서의 염증성 사이토카인(IL-33)의 발현량 변화를 확인한 것이다. (A)는 조생종이고, (B)는 만생종이며, (C)는 한초 품종의 산초이다. sample 1, 4 및 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 2, 5 및 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 3, 6 및 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 3은 품종 및 착유법별 산초유를 처리한 A549 세포에서의 염증성 사이토카인(IL-5)의 발현량 변화를 확인한 것이다. (A)는 조생종이고, (B)는 만생종이며, (C)는 한초 품종의 산초이다. sample 1, 4 및 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 2, 5 및 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 3, 6 및 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 4는 품종 및 착유법별 산초유를 처리한 A549 세포에서의 염증성 사이토카인(TSLP; thymic stromal lymphopoietin)의 발현량 변화를 확인한 것이다. (A)는 조생종이고, (B)는 만생종이며, (C)는 한초 품종의 산초이다. sample 1, 4 및 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 2, 5 및 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 3, 6 및 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 5는 착유법별 한초 품종의 산초유를 처리한 원발성 기관지 상피 세포(primary tracheal epithelial cells) 세포에서의 염증성 사이토카인(IL-25, IL-33, IL-5, TSLP)의 발현량 변화를 확인한 것이다. sample 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 6은 천식 유도 동물모델 확립 및 본 발명에 따른 산초유의 효능을 확인하기 위한 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 한초 품종의 산초유를 투여한 천식 유도 동물 모델의 기관지 폐포 세척액(BAL fluids)에서 염증 세포를 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 한초 품종의 산초유를 투여한 천식 유도 동물 모델의 폐 조직에서의 사이토카인(IL-4 및 IL-13)의 발현량 변화를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 한초 품종의 산초유를 투여한 천식 유도 동물모델의 기도 과민성 변화를 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 한초 품종의 산초유를 투여한 천식 유도 동물모델의 폐 조직의 형태학적 분석결과이다.
도 2는 품종 및 착유법별 산초유를 처리한 A549 세포에서의 염증성 사이토카인(IL-33)의 발현량 변화를 확인한 것이다. (A)는 조생종이고, (B)는 만생종이며, (C)는 한초 품종의 산초이다. sample 1, 4 및 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 2, 5 및 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 3, 6 및 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 3은 품종 및 착유법별 산초유를 처리한 A549 세포에서의 염증성 사이토카인(IL-5)의 발현량 변화를 확인한 것이다. (A)는 조생종이고, (B)는 만생종이며, (C)는 한초 품종의 산초이다. sample 1, 4 및 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 2, 5 및 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 3, 6 및 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 4는 품종 및 착유법별 산초유를 처리한 A549 세포에서의 염증성 사이토카인(TSLP; thymic stromal lymphopoietin)의 발현량 변화를 확인한 것이다. (A)는 조생종이고, (B)는 만생종이며, (C)는 한초 품종의 산초이다. sample 1, 4 및 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 2, 5 및 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 3, 6 및 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 5는 착유법별 한초 품종의 산초유를 처리한 원발성 기관지 상피 세포(primary tracheal epithelial cells) 세포에서의 염증성 사이토카인(IL-25, IL-33, IL-5, TSLP)의 발현량 변화를 확인한 것이다. sample 7은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 10% 포함된 것이며; sample 8은 유압압착으로 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이고; sample 9는 엑스펠라 착유한 것으로, 껍질이 포함되지 않은 것이다.
도 6은 천식 유도 동물모델 확립 및 본 발명에 따른 산초유의 효능을 확인하기 위한 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 한초 품종의 산초유를 투여한 천식 유도 동물 모델의 기관지 폐포 세척액(BAL fluids)에서 염증 세포를 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 한초 품종의 산초유를 투여한 천식 유도 동물 모델의 폐 조직에서의 사이토카인(IL-4 및 IL-13)의 발현량 변화를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 한초 품종의 산초유를 투여한 천식 유도 동물모델의 기도 과민성 변화를 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 한초 품종의 산초유를 투여한 천식 유도 동물모델의 폐 조직의 형태학적 분석결과이다.
본 발명은 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 산초유는 한초 품종의 산초유인 것이 특징이며, 한초10호, 한초5호, 한초15호 및 한초930호 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 염증성 질환은 염증반응을 유발하는 사이토카인 분비가 증가하여 발생되는 질환으로, 구체적으로는 천식, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환, 아토피성 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염 중에서 하나 이상인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 천식, 알레르기성 염증 또는 아토피 피부염이지만 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 산초유는 한초 품종의 산초유인 것이 특징이며, 한초10호, 한초5호, 한초15호 및 한초930호 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 따른 산초유을 포함하는 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 제형인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 산초유 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 산초유을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명의 산초유의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 산초유을 포함하는 약학조성물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 천식 또는 아토피 피부염 개선용 의약외품에 관한 것이다.
상기 의약외품은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액, 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예
1.
in vitro
염증성 사이토카인의 발현량 변화 분석
원발성 기관지 상피 세포(primary tracheal epithelial cells)와 A549 세포에, DMSO로 10배 희석한 산초유 시료를 최종 0.01%(v/v)이 되도록 처리하고, 1시간 후, 50ng/㎖의 TNF-α 및 100㎍/㎖의 LPS로 11시간 동안 자극하였다. 산초유 처리 후, 12시간째에 분해완충액(lysis buffer)으로 세포 분해물을 획득하여 브래드포드법으로 단백질을 정량하고, 웨스턴 블랏을 수행하여 단백질의 발현량 변화를 확인하였다.
본 발명의 실시예에서는 3가지 품종인 조생종, 만생종 및 한초 산수유 품종에 대하여, 유압압착 또는 엑스펠라 착유를 통해 획득한 9가지 경우에 대한 시료에 대하여 염증성 사이토카인(IL-25, IL-33, IL-5 및 TSLP)의 발현량 변화를 분석하였다.
[시험군]
시료 1: 조생종+유압압착 (껍질 10% 포함)
시료 2: 조생종+유압압착 (껍질 불포함)
시료 3: 조생종+엑스펠라 착유 (껍질 불포함)
시료 4: 만생종+유압압착 (껍질 10% 포함)
시료 5: 만생종+유압압착 (껍질 불포함)
시료 6: 만생종+엑스펠라 착유 (껍질 불포함)
시료 7: 한초+유압압착 (껍질 10% 포함)
시료 8: 한초+유압압착 (껍질 불포함)
시료 9: 한초+엑스펠라 착유 (껍질 불포함)
그 결과, 도 1 내지 도 4에 개시한 바와 같이, LPS에 의해 자극된 A549 세포에서 산초유의 추출방법에 따른 효능을 보았을 때, LPS에 의해 자극된 A549 세포의 결과 분석에서 유압압착 방식보다 엑스펠라 착유시, LPS에 의해 자극된 A549 세포에서 증가된 염증 사이토카인(IL-25, IL-33, IL-5 및 TSLP) 발현을 감소시켰으며, 그 중에서도 한초 품종의 효능이 현저하게 나타났다.
또한, 상기 LPS에 의해 자극된 A549 세포에서의 결과를 기반으로, LPS에 의해 자극된 원발성 기관지 상피 세포(primary tracheal epithelial cells)에서의 한초 품종에 대한 염증성 사이토카인의 발현량 변화를 재확인한 결과, 한초의 엑스펠라 착유시료에서, LPS에 의해 자극된 원발성 기관지 상피 세포(primary tracheal epithelial cells)에서 증가된 사이토카인의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(도 5).
실시예
2. 천식 마우스 모델에서의
산초유
효능 확인
실시예 1의 결과를 기반으로, 본 발명의 엑스펠라 착유법으로 착유된 한초 품종을 OVA(ovalbumin)로 유도된 천식 마우스 모델에 경구투여하여 염증 세포 수, 염증에 관여하는 단백질 발현, 기도 과민반응 및 조직학적 분석을 실시하였다.
[실험동물]
동물은 C57BL/6 계통의 6주령 된 암컷 마우스를 Orientbio Inc.(성남, 한국)에서 구입하여 실험을 수행하였다. 천식 마우스모델 유도를 위해 saline에 10㎍/mouse의 OVA(ovalbumin)와 1mg의 Alum을 총 200㎕의 부피가 되도록 혼합하여, 0일과 14일에 복강투여로 감작시켰다. 첫 번째 감작 후, 21일, 22일, 23일째에 saline에 3% OVA(weight/volume)를 초음파 분무기를 이용하여 30분간 흡입시켰다 (Challenge).
산초유는 옥수수 오일(drug vehicle)을 넣어, 산초유 원액을 각 시료의 0.2%와 2%으로 희석하여 사용하였다. 옥수수 오일과 산초유는 마지막 3% OVA challenge 하기 1시간 전과, 마지막 3% OVA challenge 6시간 후에 경구 투여하였으며, 총 2회를 진행하였다.
산초유의 효능을 확인하기 위해, 마우스는 마지막 OVA challenge 후, 48시간째에 마우스를 희생시켜 실험을 수행하였다. 마우스 모델군은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군(SAL+VEH), ovalbumin을 처리한 OVA군 및 ovalbumin 처리 및 산초유(한초 0.2 또는 2%)으로 분류하였다(도 6).
(1)
기관지 폐포 세척액(
BAL
fluids)에서 염증 세포 분석
마우스를 경추 탈골법으로 희생을 시키고, 기관에 1㎖의 PBS를 넣어 폐를 세척하여, 기관지 폐포 세척액을 얻었다. 전체 세포 수는 NucleoCounter (ChemoMetec, Allerod, Denmark)를 이용하여 측정하였고, BAL 세포 도말은 cytospin(Thermo Eletronm Waltham, MA)으로 준비하였다. 세포 감별을 위해서 Diff-Quik solution(Dade diagnostics of P.R. Inc.Aguada, Puerto Rico)으로 염색 후, 400개의 세포를 세어 분석하였으며, 염증세포 분석에서 효능을 보이는 시료를 선별하였다.
그 결과, 도 7에 개시한 바와 같이 천식동물모델에서 총 세포 수, 호산구(eosinophil) 및 림프구(lymphocyte)를 포함한 염증 세포가 유의하게 증가하였으며, 한초 2%를 투여한 실험군에서 총 세포 수와 호산구의 세포 수가 감소하는 것을 확인하였다.
(2)
웨스턴
블랏
및 밀도 분석(
densitometry
analysis)
염증세포 분석에서 선별된 시료의 마우스 폐 조직을 분해 완충액(lysis buffer)를 넣어 균질화를 시키고, 폐 조직의 단백질 분해물(lysates)를 획득하였다. 브래드포드 기법으로 단백질을 정량하여 전기영동, 멤브레인 트랜스퍼(transfer) 및 블로킹 과정을 거쳐, IL-4 및 IL-13 항체를 오버나잇(overnight)으로 인큐베이션(incubation)하였다. 다음날 블랏(blot)을 세척하고, 2차 항체를 반응시키고, ECL 반응을 시키고, LAS 장비를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 천식동물모델의 폐 조직에서 IL-4 및 IL-13 단백질이 증가하였으며. 본 발명의 한초 품종의 산초유를 투여한 동물모델에서는 증가했던 IL-4 및 IL-13 단백질이 감소하는 것을 확인하였다(도 8).
(3) 기도 저항성 측정
염증세포 분석에서 선별된 시료의 기도 과민성에 대한 효과를 평가하기 위하여 동물용 기도저항 측정기 Flexivent (Scientific Respiratory Equipment Inc., Montreal, Canada)을 이용하였다. 이는 Invasive method로 마우스의 마취상태에서, 메타콜린 (Methacholine) 농도(0, 5, 10, 25, 50 mg/㎖)의 변화에 따른 airway resistance (Rrs) 값을 측정하였다. 마우스는 메타콜린을 흡입시키기 전에 0.9% 생리식염수를 10초간 분무시켜 기저(Basal control) 기도 과민성을 측정하였고, 메타콜린에 대한 기도 반응의 차이를 확인하기 위하여 각 마우스에게 초음파분무기를 이용하여 메타콜린의 농도를 증가시키며 측정하였다. 각 농도의 메타콜린 투여 후, 3분간 Rrs 값을 측정하여 평균값을 사용하였다. 기도 기능의 변화 정도는 0.9% 생리식염수 흡입 후 얻어진 기저 Rrs 값을 기준으로 그 차이를 백분율로 표현하였다.
기도과민성 분석 결과, 천식동물모델 군은 음성대조군(SAL+VEH)에 비해, 메타콜린의 농도 의존적으로 기도 과민성의 증가를 보였으며, 증가된 기도 과민성은 한초 2%를 투여한 실험군에서 감소되는 것을 확인하였다(도 9).
(4)
조직학적 분석
염증세포 분석에서 선별된 시료의 조직학적 분석을 하기 위해, 마지막 OVA challenge 후 48 시간째에 마우스에서 폐 조직을 떼어내어, 4% 포르말린에 고정시켰다. 검체를 탈수시키고, 파라핀으로 고정하여, Leica model 2165 rotary microtome(Leica Microsystems NusslochGmbH, Nussloch, Germany) 장비로 4μm의 절편으로 슬라이드에 붙였다. 조직은 다시 탈 파라핀 과정과 함수과정을 거쳐 H&E 염색하였고, 조직학적으로 폐의 염증 정도를 평가하기 위해 염증(inflammatory) score를 분석하였다
그 결과, 천식동물모델의 병리조직 검사에서 상피세포층이 두꺼워졌으며 기관지와 혈관 주위에 염증세포의 침윤의 증가가 유의하게 나타났으며, 한초 2%를 처리한 실험군에서 병리적 변화가 유의하게 호전되는 것을 관찰할 수 있었다(도 10).
[통계 처리]
모든 결과는 평균과 표준 오차로 표시하였다. 통계분석은 정규성 검증 후, 정규성 검증에 따르면, one-way ANOVA를 이용하여 scheffe's 사후 검증을 진행하였고, p value<0.05 인 경우를 통계적 의의가 있는 것으로 해석하였다. 정규성 검증에 따르지 않으면, Kruskal-Wallis ANOVA test 후, Mann Whitney U test를 진행하였다.
Claims (7)
- 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 산초유는 한초 품종의 산초유인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환, 아토피성 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 엑스펠라(Ex pela)법으로 착유된 산초유를 유효성분으로 함유하는 천식 또는 아토피 피부염 개선용 의약외품.
- 제6항에 있어서, 상기 피부 외용제는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액, 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 천식 또는 아토피 피부염 개선용 의약외품.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |