KR20190108811A

KR20190108811A - 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20190108811A
Application number: KR1020180030347A
Authority: KR
Inventors: 유지혜; 이소헌; 사영승; 이강혁; 이상일
Original assignee: 에스케이바이오랜드 주식회사
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2019-09-25
Also published as: KR102091923B1

Abstract

본 발명은 오리엔틴(orientin) 화합물을 유효성분으로 포함하는 부평초(Spirodela polyrhiza) 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 추출물은 벤조피렌에 의해 증가된 AhR 또는 CYP1A1 유전자 발현을 억제시키고, 중금속에 의한 피부 세포 손상 개선 및 피부 자극 완화를 통해 피부 보호에 우수한 효과를 발휘할 수 있어 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물 또는 약학 조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising extract of Spirodela polyrhiza for improvement of skin damage or skin-protection}

본 발명은 오리엔틴(orientin) 화합물을 유효성분으로 포함하는 부평초(Spirodela polyrhiza) 추출물을 함유하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다. 하지만, 아무리 외부로부터의 바이러스 침투를 막아내는 피부일지라도 과도한 자외선, 오염된 환경 등 외부로부터 받는 스트레스는 피부 자극을 유발하게 되고, 결국에는 피부 노화로 이어지게 된다.

이러한 외부 자극 중에서도 특히, 최근 중국의 산업화로 인해 발생하고 있는 중금속 등의 유해물질이 섞인 미세먼지, 황사, 스모그는 피부 노화 및 피부 트러블의 주요 원인으로 인식되고 있다. 중금속은 수은, 카드뮴, 납 및 구리 등과 같은 비중이 4 이상인 금속류를 말하며, 일반적으로 생체 내로 흡수되면 생체 내 물질과 결합하여 잘 분해 되지 않는 유기복합체를 형성하기 때문에, 몸 밖으로 빨리 배출되지 않고, 간장, 신장 등의 장기나 뼈에 축적된다. 중금속에 장기간 노출될 경우 후지 마비, 이상운동, 운동실조, 피부의 색소침착 및 각질화, 발톱 또는 발굽 및 모발의 위축결손, 생식기능장애, 기형출산, 성장 저하 및 면역기능저하 등의 증상이 나타난다. 환경 유해물질은 건강에 가장 유해한 환경문제의 하나로 인식되고 있으며, 피부질환과 관련성이 큰 것으로 보고 있다(Im et al., 2006). 피부에서는 유해 중금속 미세 분진들이 대기 중에서 화학반응을 일으켜 질소산화물(NO), 황산화물(SO) 등과 같은 유해물질을 추가로 생성해 피부의 염증성 물질인 사이토카인 등을 증가시키고, 아토피나 피부 트러블을 유발할 수 있다. 한편, 중금속 입자의 크기는 2 ㎛ 이하이기 때문에 일반먼지(평균 크기가 20 ㎛ 이상)보다 훨씬 작다. 이러한 중금속을 포함하는 미세먼지는 크기가 작기 때문에 피부모공 깊숙이 쉽게 침투할 수 있는데, 침투된 미세먼지를 깨끗이 제거하지 못하면 피부에 염증 및 트러블을 일으키는 경우가 많다.

현재 체내 중금속 제거 방법은 EDTA(ethylene diamine tetraacetate) 및 BAL(British Anti-Lewisite)과 같은 착화합물 형성물질을 주사하여 체내에 축적되어 있는 중금속과 결합하게 함으로써, 중금속을 체외로 배출 시키는 방법 또는 비타민 B1, 비타민 C 및 비타민 E를 복용하여 중금속의 체내 흡수를 막고, 배출시키는 방법 등이 있다. 하지만, 효과적이고 용이하게 중금속으로 부터 피부를 보호하는 방법은 알려진 바가 없다. 임상적으로 환경 유해물질이 직접 피부에 닿으면 알레르기 반응 및 자극을 일으켜 접촉성 피부염이 발생하기 쉬우며, 또 건조하고 세찬 황사바람은 피부의 수분을 앗아가 피부건조증, 각질, 가려움증, 황사여드름 및 아토피 등을 유발한다고 알려져 있지만, 이에 대한 치료나 대비책은 명확하지 않다.

중금속, 미세먼지, 황사 등과 같은 유해 물질들은 피부 내 스트레스를 야기하는데, 이러한 스트레스는 활성 산소에 의해 생성된다. 활성산소는 미토콘드리아 내 전자 전달체 및 백혈구 세포의 활성화 등 정상적인 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당하는 세포 내 신호전달 물질로 작용한다. 그러나 활성산소들은 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하게 된다(Jeong et al., 2008; Parfenova et al., 2006). 산화적 스트레스를 막아 줄 수 있는 항산화 물질에 대해서는 많은 연구가 진행되었고, 실제로 많은 항산화제가 개발되어 사용되고 있는데, 특히 비타민 C와 비타민 E는 널리 사용되고 있는 항산화제이다. 비타민 C는 수용성 항산화제이고, 비타민 E는 지용성 항산화제이다. 이들 항산화제들은 강력한 항산화 효과를 나타내지만, 불안정성으로 인하여 공기 중에 노출되면 쉽게 변질되기 때문에 사용하는데 많은 제약이 따른다.

중금속, 미세먼지, 황사 등과 같은 유해 물질들은 '환경스트레스유도물질(PAHS)'이라 하기도 하는데, 피부 세포 내 Aryl hydrocarbon receptor(이하, 'AhR') 유전자는 PAHS의 대표적인 agonist로 작용하며 유전자의 증가를 나타내고 핵 내로 이동하여 CYP(cytochromeP450)1A1의 발현을 증가시켜 염증 및 노화를 발생시킨다. 다시 말해, 이러한 환경오염원에 의하여 피부 내 면역체계가 공격받게 되고 아토피나 건선 등의 환경성 피부질환을 야기시킬 수 있다(C.Costa et al., 2010). 현재 이러한 염증성 질환을 치료하기 위해 스테로이드성 항염증 제제가 사용되고 있으나 스테로이드성 제제들은 여러 부작용을 나타내고 있어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

따라서 현재 환경성 피부질환으로부터 피부를 보호하는 효과가 있는 즉, 안티 폴루션 효과를 가진 제제를 개발할 필요성이 있다. 안티 폴루션 효과는 환경 공해로 인한 스트레스와 일상생활 속에서 환경적 요인의 자극으로 민감해진 피부를 진정시키고 보호하는 것이다.

부평초(Spirodela polyrhiza)는 개구리밥이라고도 하며 물 위에 떠 있는 풀이라는 뜻이다. 한방에서는 부평초를 7~9월에 채취하여 햇볕에 말린 것을 강장, 발한, 이뇨 및 해독제로 사용하며, 발열, 소변불리, 수종, 단독, 암종, 창선 등의 증상에 사용하는데, 탕, 환, 산제로 하여 복용한다. 외용약으로는 물로 달여 환처에 김을 쐬거나 그 물로 닦아낸다. 가루로 만들어 환처에 개어 붙이기도 한다.

본 발명자들은 최근 각광받고 있는 환경 유해인자들로부터 피부를 보호할 수 있는 새로운 천연 물질에 대해 연구 노력한 결과, 오리엔틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 부평초 추출물이 AhR(Aryl-hydrocarbon receptor) 또는 CYP1A1(Cytochrome P450, family 1, member A1) 유전자의 발현을 억제하고, 중금속으로 인한 피부 손상을 개선시킬 뿐만 아니라 피부 자극을 완화시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0132508호 (발명의 명칭 : 항산화용 및 황사에 의한 피부 유해영향 완화용 조성물, 출원인 : (주)아모레퍼시픽, 공개일 : 2013년12월04일) 대한민국 공개특허 제10-2016-0068317호 (발명의 명칭 : 아르간 트리 추출물을 함유하는 환경 스트레스에 대한 피부 보호 효능을 갖는 화장료 조성물, 출원인 : 코웨이 주식회사, 공개일 : 2016년06월15일) 대한민국 등록특허 제10-1499453호 (발명의 명칭 : 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백 및 피부노화 치료 및 예방용 조성물, 출원인 : 주식회사 이지함화장품, 등록일 : 2015년03월02일) 대한민국 등록특허 제10-0572003호 (발명의 명칭 : 부평초 추출물을 함유하는 조성물, 출원인 : 주식회사 엘지생활건강, 등록일 : 2006년04월11일)

Casper, Resveratrol has antagonist activity on the aryl hydrocarbon receptor: implications for prevention of dioxin toxicity. Mol Pharmacol, 1999, 56, 784-790. Costa C. et al., Exposure of human skin to benzo[a]pyrene:Role of CYP1A1 and aryl hydrocarbon receptor in oxidative stress generation. Exp Toxicology 2010, 271, 83-86. Im et al., Public perceptions of the risk of asian dust storms in seoul and its metropolitan area. J Prev Med Public Health. 2006, 39(3), 205-212, 2006. Parfenova et al., Glutamate induces oxidative stress and apoptosis in cerebral vascular endothelial cells: contributions of HO-1 and HO-2 to cytoprotection. Am J Physiol Cell Physiol, 2006, 290, 1399-1410. Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983, 65(1-2), 55-63. Jeong et al., Natural Product Sciences, 2008, 14, 156-160. Kim J etc. , Vitexin, orientin and other flavonoids from Spirodela polyrhiza inhibit adipogenesis in 3T3-L1 cells. Phytother Res. 2010, 24(10), 1543-1548.

본 발명은 오리엔틴(orientin) 화합물을 유효성분으로 함유하는 부평초(Spirodela polyrhiza) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다. 좀 더 구체적으로, 피부자극물질인 벤조피렌으로 인해 증가된 AhR(Aryl-hydrocarbon receptor) 또는 CYP1A1(Cytochrome P450, family 1, member A1) 유전자 발현을 억제시킬 뿐만 아니라 중금속으로 인한 피부 세포의 손상을 개선시키고, 피부 자극을 완화시키는 효과가 있는 오리엔틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 부평초(Spirodela polyrhiza) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 추출물에는 하기 화학실 1의 구조를 갖는 오리엔틴(orientin) 화합물이 유효성분으로 포함될 수 있다.

[화학식 1]

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 탄소수 1~6의 글리콜, 에틸아세테이트, 디에틸에테르 또는 클로로메탄 또는 이들의 혼합액을 추출용매로 하여 추출한 것, 또는, 이를 에틸아세테이트로 분획한 것일 수 있다.

상기 추출물은 환경 유해인자로 인해 증가된 AhR(Aryl-hydrocarbon receptor) 또는 CYP1A1(Cytochrome P450, family 1, member A1) 유전자 발현을 저해하는 안티폴루션 효능을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 추출물은 환경 유해인자로 인해 저하된 피부 세포의 생존율을 증가시키며, 상기 추출물은 환경 유해인자로부터 발생된 피부자극을 완화하는 효능을 가질 수 있다.

이에 바람직하게는 본 발명은 상기 부평초 추출물 또는 오리엔틴 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료를 제공할 수 있다. 상기 화장료에는, 화장료의 중량을 전체 100 중량% 기준으로 할 때, 본 발명의 추출물 또는 화합물이 0.1~20 중량%가 포함될 수 있다.

상기 화장료의 제형은 바람직하게는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 추출물에는 오리엔틴(orientin) 화합물이 유효성분으로 포함될 수 있다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 탄소수 1~6의 글리콜, 에틸아세테이트, 디에틸에테르 또는 클로로메탄 또는 이들의 혼합액을 추출용매로 하여 추출할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 추출물의 제조시 사용되는 추출용매는 혼합물 사용 중량 기준 1~50배 부피(1kg 기준 1~50ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~50배 부피를 사용할 수 있다. 상기 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.

또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다. 또한 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤, 헥산, 메틸렌클로라이드, 초산에틸 등)에 의한 추출, 헥산, 부탄올 등의 유기용매와 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.

상기 추출물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 7일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.

본 발명의 추출물 제조시, 추출액을 여과할 때, 상기 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로 면, 나일론, 종이 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 추출물 제조시의 추출 방법은 특별히 제한되지 않고 추출물의 종류와 추출하는 방법에 따라 예를 들어, 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 상온 추출, 열수 추출 등을 이용할 수 있다.

이렇게 제조된 추출물은 열풍건조, 감압건조, 동결건조, 진공건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.

또한, 상기 추출물은 칼럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

상기 과정을 통해 본 발명에서 제공될 수 있는 부평초 분획물은 부평초 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있으며, 바람직하게는 부평초 추출물을 물에 현탁한 후, 상기 현탁물에 에틸아세테이트를 가하여 얻은 에틸아세테이트 층의 농축물일 수 있다. 상기 물은 건조된 상태의 부평초 추출물 중량의 5~20배를 가할 수 있다. 에틸아세테이트는 추출물이 현탁된 액상 기준으로 1:0.5~8의 부피피로 가해질 수 있다. 에틸아세테이트층을 수거한 뒤 남은 물층에 다시 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세티이트 층을 회수하는 과정은 1~5회 반복될 수 있다. 부평초 추출물 또는 에틸아세테이트층을 제거하고 남은 물층에 에틸아세테이트를 가하는 시간은 1분~24시간인 것이 바람직하며, 이러한 과정은 실온(20~30℃)에서 수행되는 것이 좋다.

본 발명의 추출물 또는 화합물은 환경 유해인자로 인해 증가된 AhR 또는 CYP1A1 유전자 발현을 저해하는 안티폴루션 효능을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 추출물 또는 화합물은 환경 유해인자로 인해 저하된 피부 세포의 생존율을 증가시키며, 상기 추출물은 환경 유해인자로부터 발생된 피부자극을 완화하는 효능을 가질 수 있다. 상기 환경 유해인자는 벤조피렌 또는 중금속일 수 있다. 또한 상기 중금속은 비중이 4 이상인 금속류로서 수은(13.5), 카드뮴(8.7), 납(11.3), 구리(8.9) 등의 최대 23의 비중을 갖는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 추출물 또는 화합물이 함유된 화장료 조성물을 원료로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료를 제공할 수 있다. 상기 화장료에는, 화장료의 중량을 전체 100 중량% 기준으로 할 때, 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 화장료 조성물 원료가 0.1~20 중량%가 포함될 수 있다.

상기 화장료의 제형은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.

본 발명의 화장료에는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분이 추가로 포함될 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 또한 통상의 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수도 있다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP(폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 중량%로 배합될 수 있다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명은 오리엔틴(orientin) 화합물을 유효성분으로 포함하는 부평초(Spirodela polyrhiza) 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 피부 유해작용을 밝히기 위하여 대표적인 환경 스트레스 유도물질(PAHS 계열)인 벤조피렌과 중금속을 피부 조직의 최외각층에 존재하는 각질형성세포에 처리했을 때 발생하는 다양한 생물학적 반응들을 관찰한 바, 상기 추출물이 벤조피렌과 같은 다고리형 방향족 탄화수소(PAHs: Polycyclic aromatic hydrocarbons)에 의해 활성화되는 AhR(Aryl-hydrocarbon receptor) 유전자와 이를 통해 발현되는 세포내 산화효소 CYP1A1(Cytochrome P450, family 1, member A1) 유전자 발현을 모두 억제시키는 것이 확인되며, 중금속에 의한 피부 세포 손상 개선 또는 피부 자극 완화를 통해 피부 보호에 우수한 효과를 발휘할 수 있고 보습효과와 각질 완화 또한 우수함이 확인된다. 이에 본 발명의 조성물은 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물 또는 약학 조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0132508호에는 새로운 피부자극 완화제로서 고련피 및 연꽃잎 추출물을 함유하는 항산화용 및 황사에 의한 피부 유해영향 완화용 조성물에 대해 기재되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2016-0068317호에는 외부 환경 스트레스로 인한 손상으로부터 세포를 보호하는 것으로 알려진 LEA(Late Embryogenesis Abundant) 단백질을 활성화하여 자외선, 미세먼지, 황사, 담배연기, 매연 등의 환경 스트레스에 대한 저항성을 향상시키고 이로부터 피부 세포를 보호할 수 있는 화장료 조성물에 대해 기재되어 있다. 또한 대한민국 등록특허 제10-1499453호에는 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백, 노화 억제용 조성물, 대한민국 등록특허 제10-0572003호에 부평초 추출물이 여드름, 탈모, 지루성 피부염, 지루성 피부염에 의한 비듬 또는 피지 관련 질환의 치료용 조성물로서 이용가능함이 개시되어 있다. 그러나 이러한 선행기술들에는 부평초 추출물이 AhR 및 CYP1A1의 유전자 발현을 억제하여 피부 세포 보호 효과가 있음은 전혀 개시되어 있지 않다.

도 1은 본 발명의 실시예 1의 부평초 추출물을 농도별로 처리한 각질형성세포에서의 세포생존율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2의 부평초 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 처리한 각질형성세포에서의 세포생존율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3의 부평초 정제물(오리엔틴 화합물)을 농도별로 처리한 각질형성세포에서의 세포생존율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 내지 3의 부평초 유래 조성물이 각질형성세포에서의 AhR(Aryl-hydrocarbon receptor) 유전자 발현 저해 효과가 있는지를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1 내지 3의 부평초 유래 조성물이 각질형성세포에서의 CYP1A1(Cytochrome P450, family 1, member A1) 유전자 발현 저해 효과가 있는지를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1 내지 3의 부평초 유래 조성물과 크롬이 처리된 각질형성세포에서의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 내지 3의 부평초 유래 조성물과 카드뮴이 처리된 각질형성세포에서의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예 2 및 3의 부평초 유래 조성물과 비소가 처리된 각질형성세포에서의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1 내지 3의 부평초 유래 조성물과 벤조피렌이 처리된 각질형성세포에서의 세포 생존율을 확인한 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 부평초 추출물 제조>

건조된 부평초(Spirodela polyhiza)를 구입한 뒤 세절한 전초 3kg에 70(v/v)% 에탄올 45L를 가하여 50℃에서 2일 이상 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압 농축하여 부평초 추출물을 제조하였다.

<실시예 2. 부평초 추출물의 분획물 제조>

상기 실시예 1에서 제조한 부평초 추출물 중 200g을 2L 증류수로 현탁시킨 후 동량의 에틸아세테이트를 가하여 6회 반복 추출하고 분액깔대기에서 분획하여 에틸아세테이트층을 회수한 후 에틸아세테이트층을 감압농축하여 부평초의 에틸아세테이트 분획물 50g을 수득하였다.

<실시예 3. 부평초 추출물의 정제물 제조>

상기 실시예 2에서 제조된 분획물을 하기 표 1에 기재된 조건의 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 하기 물성치를 갖는 오리엔틴을 수득하였다.

화합물의 물성 분석을 위해 NMR 기기로 H¹-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 400 MHz), C¹³-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 100 MHz)로 분리된 화합물의 구조를 분석하였으며, DMSO(알드리치사)를 용매로 사용하였고, NMR 결과는 이미 발표된 자료와 일치함을 확인할 수 있었다.

컬럼(Column)	심팍 프렙-ODS(shim-Pak prep-ODS) 컬럼, 시마즈(Shimadzu)
컬럼온도(Column temperature)	12 mL/min
유속(Flowrate)	35℃
측정기(Detector)	UV 342nm
주입부피(Injection Volume)	400㎕
이동상(Mobile phase)	15% Acetonitrile(0.1% phosphoric acid)

오리엔틴 화합물의 물성

분자량 : 448.38g/mol

¹H-NMR(DMSO-d6): 7.53(1H, d), 6.86(1H, d), 7.49(1H, s), 6.64(1H, s), 6.28(1H, s), 3.25(1H, m), 3.26(1H, m), 4.68(1H, d), 3.84(1H, m), 3.38(1H, m), 3.80/3.57(2H, m)

¹³C-NMR(DMSO-d6) : 182.1, 164.2, 162.6, 160.5, 156.1, 149.7, 145.9, 122.1, 119.4, 115.7, 114.1, 104.6, 104.1, 102.5, 98.2, 82.1, 78.1, 73.5, 70.8, 70.7, 61.7

<실험예 1. 각 조성물 내의 오리엔틴 화합물 함량 분석>

상기 실시예 1 내지 3의 조성물에 대해 함량 분석을 하기 표 2에 기재된 조건의 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 순도 분석을 하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

컬럼(Column)	캅셀팍 C18 4.6 X 250mm 시세이도사
컬럼온도(Column temperature)	35℃
유속(Flowrate)	1.0 mL/min
측정기(Detector)	UV 342nm
주입부피(Injection Volume)	20㎕
이동상(Mobile phase)	15% Acetonitrile(0.1% phosphoric acid)

실험물질		오리엔틴 함량 (%)
실시예 1	부평초 추출물	8.15%
실시예 2	부평초 분획물	35.46%
실시예 3	부평초 정제물	94.9%

분석결과 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 정제물은 액체 크로마토그래피의 면적 대비 94.9%의 함량으로 정제가 되었음을 알 수 있다.

<실험예 2. 각질형성세포를 이용한 세포독성 측정>

실시예 1 내지 3에 대하여 각질형성세포(HaCaT)의 세포생존율을 MTT 어세이(Mosmann, 1983)를 이용해 측정하였다. MTT 어세이는 살아있는 세포의 수를 측정함으로써 세포증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로 살아있는 세포는 미토콘드리아 내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소(Succinate dehydrogenast 또는 mitochondrial dehydrogenase)에 의해 수불용성인 파란색의 포르마잔(Formazan) 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 포르마잔 유도체는 용해제(보통 Dimethylsulfoxide 사용)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다.

이를 위해 각질형성세포(HaCaT)를 10% FBS(Fetal bovine serum, Gibco)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium, Gibco)에 1.5×10⁵ 세포의 밀도로 24 well plate(Nunc)에 접종하고 5% CO₂, 37℃의 인큐베이터에서 하루동안 배양하였다. 그 후 10% FBS가 함유된 새로운 DMEM 배지로 교체 후 시료를 농도별로 처리하여 1일간 배양하였다. 1일 후 기존의 배지를 제거하고 0.25 ㎎/㎖의 MTT 용액 1 ㎖을 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 MTT 용액을 제거하고 DMSO(Dimethylsulfoxide) 1 ㎖을 첨가하여 MTT formazan을 용해시켜 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료를 투여하지 않고 실험하여 그것을 대조구로 하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 통계 처리하여 평균값을 구하였고, 그 결과는 하기의 표 4 및 도 1-3에 나타내었다.

세포 생존율 (%) = (A / B) × 100

A: 시료의 570 ㎚에서의 흡광도

B: 대조구의 570 ㎚에서의 흡광도

조건	실험농도 (㎍/㎖)	세포생존율
무처리군		100.00
실시예 1	1	101.97
	10	100.47
	25	100.98
무처리군		100.00
실시예 2	1	101.30
	10	101.87
	25	98.28
무처리군		100.00
실시예 3	25	97.78
	50	98.56
	100	98.14

표 4에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 3 조성물은 모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

<실험예 3. 각질형성세포를 이용한 환경유해인자 관련 유전자 발현 저해 효과 측정>

실시예 1 내지 3에 대하여 환경유해인자 관련 유전자 발현 저해 효과를 측정하였다. 이를 위해 각질형성세포(HaCaT)를 10% FBS을 첨가한 DMEM에 1×10⁶ 세포의 밀도로 6 well plate에 접종하고, 5% CO₂, 37℃의 인큐베이터에서 하루 동안 배양시켰다. 그 후, FBS가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지로 교체하고, 무처리군을 제외한 well에 벤조피렌(1㎍/㎖)을 처리하여 30분 배양한 후 FBS가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지로 교체하고 실시예 1 내지 3을 농도별(1~100㎍/㎖)로 처리하여 4시간 배양하였다. 이 후 배지를 제거한 세포를 PBS(Phosphate buffer saline) 2 ㎖로 세척하고, 트리졸(TriZol)을 1 ㎖ 처리하여 1.5 ㎖ 튜브(tube)에 옮기고 페놀/클로로포름 추출법과 에탄올 침전으로 순수 RNA를 얻었다. 그 후, 정량된 RNA와 'High Capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems)'을 사용하여 cDNA 합성과 실시간(Realtime) PCR을 실시하였다. 유전자 발현을 비교하는 항존유전자(housekeeping gene)로는 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였으며 실시간(Realtime) PCR에 사용된 AhR의 프라이머(primer)는 서열번호 1 및 서열번호 2, CYP1A1의 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되어 있고, GAPDH의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성되어 있으며, 이는 하기 표 5에 나타내었다.

또한, AhR 발현량 결과는 표 6 및 도 4에, CYP1A1 발현량 결과는 표 7 및 도 5에 나타내었다.

서열번호 1	5'-ATC ACC TAC GCC AGT CGC AAG-3'
서열번호 2	5'-ATC ACC TAC GCC AGT CGC AAG-3'
서열번호 3	5'-CAC AGA CAG CCT GAT TGA GCA-3'
서열번호 4	5'-GTG TCA AAC CCA GCT CCA AAG A-3'
서열번호 5	5'-CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC-3'
서열번호 6	5'-AAA TGA GCC CCA GCC TTC T-3'

조건	실시예 조성물 실험농도 (㎍/㎖)	AhR 발현량 (%)
무처리군		47.14
벤조피렌		100.00
벤조피렌 + 실시예 1	1	93.76
	10	87.32
	25	83.72
벤조피렌 + 실시예 2	1	87.50
	10	82.43
	25	75.79
벤조피렌 + 실시예 3	25	77.11
	50	65.21
	100	58.53
벤조피렌 + 레즈베라트롤	4.6	77.60

조건	실시예 조성물 실험농도 (㎍/㎖)	CYP1A1 발현량 (%)
무처리군		22.69
벤조피렌		100.00
벤조피렌 + 실시예 1	1	92.96
	10	81.63
	25	77.54
벤조피렌 + 실시예 2	1	88.35
	10	78.98
	25	68.34
벤조피렌 + 실시예 3	25	68.62
	50	56.27
	100	42.54
벤조피렌 + 레즈베라트롤	4.6	69.01

표 6, 표 7, 도 4 및 도 5을 참고하면, 본 발명의 실시예 1 내지 3은 AhR과 CYP1A1 발현을 저해시킴으로써 안티 폴루션 효능을 가지는 것으로 보이며, 양성대조군으로 사용된 레즈베라트롤(resveratrol)보다 AhR 및 CYP1A1 발현 저해능이 더 우수한 것으로 확인된다.

한편, 이 실험에서 양성대조군으로 사용된 레즈베라트롤은 식물 항균제 혹은 레드 와인에 존재하는 피토알렉신의 일종으로 AhR ligand의 경쟁적 저해제로 알려져 있으며, CYP1A1의 전사를 방지하는 항산화 물질이다(Casper, 1999).

<실험예 4. 환경유해인자인 중금속에 대한 각질형성세포의 세포생존율 측정>

실시예 1 내지 3의 환경유해인자인 중금속을 처리한 후 각질형성세포(HaCaT)의 MTT 어세이를 이용하여 세포생존율을 측정하였다.

이를 위해 각질형성세포(HaCaT)를 10% FBS(Fetal bovine serum, Gibco)를 첨가한 DMEM(Dulbeccos's modified eagle's medium, Gibco)에 1×10⁵ 세포의 밀도로 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂, 37℃의 인큐베이터에서 하루 동안 배양시켰다. 그 후, FBS가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지로 교체하고, 중금속인 크롬(3.5 ㎍/㎖), 카드뮴(4㎍/㎖), 비소(1.5 ㎍/㎖)와 실시예 1~3의 시료를 각각 농도별로 처리하여 하루동안 배양하였다. 1일 후 기존의 배지를 제거하고 0.25 ㎎/㎖의 MTT 용액 1 ㎖을 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 MTT 용액을 제거하고 DMSO(Dimethylsulfoxide) 1 ㎖을 첨가하여 MTT formazan을 용해시켜 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료를 투여하지 않고 실험하여 그것을 대조구로 하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 통계 처리하여 평균값을 구하였고, 그 결과는 하기의 표 8~10과 도 6~8에 나타내었다.

조건	실시예 조성물 실험농도 (㎍/㎖)	세포생존율 (%)
무처리군		100.00
K₂Cr₂O₇		75.68
K₂Cr₂O₇ + 실시예 1	1	81.91
	10	93.61
	25	96.35
K₂Cr₂O₇ + 실시예 2	1	82.22
	10	91.40
	25	95.71
K₂Cr₂O₇ + 실시예 3	25	82.24
	50	86.62
	100	89.28

조건	실시예 조성물 실험농도 (㎍/㎖)	세포생존율 (%)
무처리군		100.00
CdCl₂		75.62
CdCl₂ + 실시예 1	1	87.09
	10	93.60
	25	96.93
CdCl₂+ 실시예 2	1	88.51
	10	90.37
	25	95.99
CdCl₂ + 실시예 3	25	79.98
	50	86.41
	100	88.17

조건	실시예 조성물 실험농도 (㎍/㎖)	세포생존율 (%)
무처리군		100.00
As₂O₃		75.68
As₂O₃ + 실시예 2	1	86.66
	10	88.01
	25	96.48
As₂O₃ + 실시예 3	25	80.93
	50	84.92
	100	87.21

표 8~10과 도 6~8의 결과를 참고하면, 실시예 1 내지 3의 조성물이 중금속 처리시의 각질형성세포의 사멸을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.

또한 위 실험들과 같은 조건으로, 벤조피렌 2.5㎍/㎖을 처리한 조건에서의 실시예 1 내지 3의 조성물을 농도별로 처리하고 각질형성세포의 사멸 억제 효과를 확인하였고, 그 결과 하기 표 11과 같이 벤조피렌 처리 세포에서도 각질형성세포의 사멸 억제 효과가 나타남을 알 수 있다.

<실험예 4. 인체 피부 자극 완화 실험>

본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 피부자극 완화 효과를 평가하기 위해, 피부첩포 실험을 통해 소디움라우릴설페이트(Sodium Laurly Sulfate, SDS)에 의한 자극 유발과 이에 대한 피부 반응도를 측정하였다.

우선, 하기 표 12의 조성으로 에멀전 화장품을 제조하였다.

성분 함량(중량%)	제형예1	제형예2	제형예3	비교제형예	대조제형예
실시예 1	2.0	-	-	-	-
실시예 2	-	2.0	-	-	-
실시예 3	-	-	2.0	-	-
소듐 도데실 설페이트	0.5	0.5	0.5	0.5	-
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
프로필렌글리콜	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
토코페릴아세테이트	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
유동파라핀	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
트리에탄올아민	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
마카다미아너트오일	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
폴리솔베이트60	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
솔비탄세스퀴톨레이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
카르복실비닐포리머	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
계	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

상기 표 12에서 제형예 1 내지 3 및 비교제형예와 대조예로 계면활성제에 의한 피부 자극 완화 효과를 비교 측정하였다. 단, 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제를 복용하고 있는 사람은 본 실험에서 제외하고 피험자 20명을 대상으로 하였다.

피험자 20명의 시험부위를 70%(v/v) 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시킨 다음 제형예 1 내지 3 및 비교제형예와 대조예를 동량으로 Finn Chamber에 올린 paper disc에 적하 시킨 후 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시켰다. 첩포는 24시간 동안 도포하여 첩포를 제거한 후에는 Marking Pen으로 시험부위를 표시하여 각각 30분 경과 후, 24시간 경과 후, 48시간 경과 후에 시험부위를 관찰하였다. 판정은 첩포 제거 30분 경과 후, 24시간 경과 후, 48시간 경과 후에 행하며 피부반응은 하기 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group:ICDRG)의 판정기준에 따라 자극정도를 분류하였다. 평균피부반응도 계산공식에 따라 Mean score를 산정한 후 피부첩포시험(Patch Test)을 수행하였고, 표 13의 판정표에 따라 자극유무를 판정하였으며, 그 결과는 하기 표 14에 나타내었다.

시료명	ICDRG 판정기준
시료명	Mean score	판정
제형예 1	0.70	무자극
제형예 2	0.42	무자극
제형예 3	0.56	무자극
비교제형예	3.33	중자극
대조예	0.00	무자극

실험결과, 실시예 1 내지 3이 함유된 제형예 1 내지 3은 비교제형예에서 나타나는 자극을 완화시키는 효과가 있음을 확인하였다.

<화장료 제형예 4. 각종 화장료 제형>

실험예 4에서 제시된 에멀전 화장료 제형 외에 적용가능한 다양한 화장료를 하기와 같이 제시한다.

화장료 제형예 4-1. 유연 화장수

하기 표 15의 조성과 같이, 실시예 1에서 수득한 추출물을 함유한 유연 화장수(스킨, 100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
실시예 1 추출물	3.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유	1.0
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제	미량
색소	미량
향료	미량
정제수	잔량

화장료 제형예 4-2. 영양 화장수

하기 표 16의 조성과 같이, 실시예 1에서 수득한 추출물을 함유한 영양 화장수(로션, 100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
실시예 1 추출물	1.0
시토스테롤	1.7
폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
세테아레스	1.2
콜레스테롤	1.5
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라워오일	10.0
카르복시비닐폴리머	0.2
산탄검	0.3
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

화장료 제형예 4-3. 영양크림

하기 표 17의 조성과 같이, 실시예 1에서 수득한 추출물을 함유한 영양크림(100g)을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
실시예 1 추출물	5.0
시토스테롤	4.0
폴리글리세릴 2-올레이트	3.0
세라마이드	0.7
세테아레스-4	2.0
콜레스테롤	3.0
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라워오일	22.0
카르복시비닐폴리머	0.5
트리에탄올아민	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

화장료 제형예 4-4. 에센스

하기 표 18의 조성과 같이, 실시예 1에서 수득한 추출물을 함유한 에센스(100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
실시예 1 추출물	1.0
시토스테롤	1.7
폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
세테아레스-4	2.0
콜레스테롤	3.0
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라워오일	22.0
카르복시비닐폴리머	0.5
트리에탄올아민	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

화장료 제형예 4-5. 파운데이션

하기 표 19의 조성과 같이, 실시예 1에서 수득한 추출물을 함유한 파운데이션(100g)을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
실시예 1 추출물	1.0
밀납	2.0
사이클로메치콘	2.0
유동파라핀	5.0
스쿠알란	5.0
스테아린산	2.0
친유성 모노스테아린산 글리세린	3.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	3.0
부틸렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	1.0
알루미늄마그네슘실리케이트	0.5
안료	12.0
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

Claims

부평초(Spirodela polyrhiza) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물에는 하기 화학식 1의 화학구조를 갖는 오리엔틴(orientin) 화합물이 유효성분으로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 탄소수 1~6의 글리콜, 에틸아세테이트, 디에틸에테르 또는 클로로메탄 또는 이들의 혼합액을 추출용매로 하여 추출한 것, 또는, 이를 에틸아세테이트로 분획한 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 환경 유해인자로 인해 증가된 AhR 또는 CYP1A1 유전자 발현을 저해하는 안티폴루션 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 환경 유해인자로 인해 저하된 피부 세포의 생존율을 증가시키는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 환경 유해인자로부터 발생된 피부자극을 완화하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화장료 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료.
제7항에 있어서,
상기 화장료에 전체 100 중량% 기준으로 부평초 추출물이 0.1~20 중량%가 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료.
제7항에 있어서,
상기 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 그룹에서 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료.
하기 화학식 1의 구조를 갖는 오리엔틴(orientin) 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 손상 개선 또는 보호용 화장료 조성물.
[화학식 1]