KR20190106663A

KR20190106663A - 루시퍼레이스를 이용한 단백질분해효소의 활성 분석 방법

Info

Publication number: KR20190106663A
Application number: KR1020190005222A
Authority: KR
Inventors: 김영필; 계명찬; 서주태; 이진오; 응웬두롱
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2019-09-18
Also published as: KR102121863B1

Abstract

본 발명은 루시퍼레이스를 사용하여 단백질분해효소의 활성을 측정하는 방법에 관한 것으로, 단백질분해효소가 활성을 갖는 경우 기질 펩티드가 분해되고, 루시퍼레이스가 해리되어 생물발광 신호가 감소하므로 단백질분해효소의 활성을 쉽게 측정할 수 있다.

Description

루시퍼레이스를 이용한 단백질분해효소의 활성 분석 방법{Method for Analyzing Proteinase Activity using luciferase}

본 발명은 루시퍼레이스를 사용하여 단백질분해효소의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.

세포는 주로 소포체(endoplasmic reticulum)와 골지(Golgi)를 매개한 전달을 통해 주변 세포 외액(extracellular fluids)에 효소를 분비한다. 세포외기질 금속단백분해효소(mtrix metalloproteinase, MMP)는 암세포 및 기질 세포(stromal cell)에서 분비되는 단백질분해효소이며 세포 이동, 전이 및 조직 리모델링에 중요한 효소이다. 여러 조직 또는 세포에서 MMP 활성의 정량적 평가는 정상 및 비정상 발달을 구별하는 중요한 단서를 제공하며, 새로운 질병 치료 전략 개발의 기초를 제공한다. 지금까지 자이모그래픽 기술(zymographic technique)은 MMP 활성을 분석하기 위한 표준 방법으로 오랫동안 사용되어 왔으며, 이는 선호 기질의 분해 및 분자량에 따라 서로 다른 MMP의 활성을 쉽게 측정한다. 그러나 자이모그래픽 기술은 단백질 풀림(unfolding) 및 재접힘(refolding) 과정에서 시간이 오래 걸리고, 전기영동 과정 동안 SDS(sodium dodecyl sulfate)가 MMP로부터 TIMPs(tissue inhibitor of metalloproteinase)를 해리시키기 때문에 실제 시료에서는 얼마나 많은 MMP가 TIMPs와 복합체 형태로 존재하는지 확인할 수 없는 단점이 있다. MMP 활성의 신속하고 직접적인 측정을 위해 형광 색소(fluorescent dyes), 단백질 및 나노 물질을 사용하는 비색법(colorimetry), 전기화학적 측정법(electrochemical measurement) 또는 고민감성 형광 측정법이 개발되었다. 그러나 실제 시료에서 사용시 비색법 또는 전기화학적 측정법은 측정 신호가 방해 받고, 형광 신호는 생물학적 시료에서 빛의 흡수 또는 산란에 의해 방해 받을 수 있다. 이러한 문제를 피하기 위해, 장파장 방출(long wavelength emission)을 나타내는 형광단(fluorophores) 및 나노물질이 생체 내(in vivo) 이미징에 사용되었지만 복잡한 합성 과정, 고가의 비용 및 낮은 양자 수율(low quantum yield)로 인해 실제 사용에 여전히 장애가 되고 있다.

지난 수십 년 동안 루시퍼레이스(luciferase)를 사용하는 생물발광 (bioluminescence, BL) 측정법은 광범위한 방출 범위와 부수적인 여기(incident excitation) 필요성이 없어 대부분의 세포 및 조직 유형의 표적을 민감하고 선택적으로 검출하는 데 사용되었다.

생물발광 기반 검출은 주로 세균 센서(bacterial sensor), 유전자 리포터 또는 단백질-단백질 상호 작용을 위한 생물발광 공명 에너지 전달(bioluminescence resonance energy transfer, BRET) 시스템과 같은 세포 내 센싱(intracellular sensing)에 사용된다. 그러나 루시퍼레이스의 다양한 응용 범위에도 불구하고, 실제 시료에서 생물발광 측정을 대용량 분석(throughput analysis) 방법으로 확장하기 위해서는 루시퍼레이스를 표면에 고정시킬 수 있어야 한다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 루시퍼레이스, 단백질분해효소의 기질 및 바이오틴이 융합된 컨쥬게이트를 제작하였고, 상기 컨쥬게이트를 바이오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 표면에 고정시켜 단백질분해효소의 활성을 측정할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. Jeftinija, S., J Cell Mol Med., 2006, 10, 273-2791 2. Page-McCaw, A. et.al., Nat Rev Mol Cell Bio., 2007, 8, 221-233 3. Snoek-van Beurden, P.A.M. et.al., Biotechniques., 2005, 38, 73-83 4. Kim, G.B. et.al., Biosens Bioelectron., 2013, 41, 833-839 5. Zhang, C.Q. et.al., Biochip J., 2016, 10, 198-207 6. Fernandez, A. et.al., Chem Soc Rev., 2016, 45, 1182-1196 7. Yang, J. et.al., Bba-Mol Cell Res., 2007, 1773, 400-407 8. Kim, Y.P. et.al., Anal Chem., 2008, 80, 4634-4641 9. Frangioni, J.V., Current opinionin chemical biology., 2003, 7, 626-634 10. Paley, M.A. et.al., MedChemComm., 2014, 5, 255-267 11. Kim, Y.P. et.al., Chem Commun., 2010, 46, 76-78 12. Dawson, P.E. et.al., Science., 1994, 266, 776-779

본 발명의 일 목적은 하기 단계를 포함하는 단백질분해효소의 활성 측정 방법을 제공하는 것이다:

⒜ 루시퍼레이스(luciferase)와 단백질분해효소 기질 펩티드의 융합 단백질을 링커를 통해 표면에 고정시키는 단계;

⒝ 상기 고정된 융합 단백질에 루시페린을 접촉시키는 단계; 및

⒞ 상기 ⒝의 결과물과 단백질분해효소의 활성을 검사하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계.

본 발명의 다른 목적은 루시퍼레이스와 단백질분해효소 기질 펩티드의 융합 단백질 및 상기 융합 단백질을 표면에 고정시키는 링커를 포함하는, 단백질분해효소의 활성 측정용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은

⒜ 루시퍼레이스와 단백질분해효소 기질 펩티드의 융합 단백질을 링커를 통해 표면에 고정시키는 단계;

⒞ 상기 ⒝의 결과물과 단백질분해효소의 활성을 검사하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 단백질분해효소의 활성 측정 방법을 제공한다.

본 발명에서, 시료에 단백질분해효소가 존재하고, 활성을 갖는 경우 상기 단백질분해효소의 기질 펩티드가 분해되고, 루시퍼레이스가 표면으로부터 해리된다. 해리된 루시퍼레이스는 세척에 의하여 제거되므로 생물발광 신호가 감소하고, 이 신호 변화를 확인하여 단백질분해효소의 활성을 측정할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, '루시퍼레이스(luciferase)'는 기질인 루시페린(luciferin)을 산화시켜 생물발광(bioluminescence)을 일으키는 산화효소를 말하며 포티너스 파이랄리스(Photinus Pyralis, 반딧불이), 레닐라 레니포미스 (Renilla reniformis, 바다 팬지), 가우시아 프린셉스(Gaussia Princeps), 오프로포러스 그라실리로트리스(Oplophorus gracilirostris, 바다 새우) 등에서 발견된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ⒜의 루시퍼레이스는 레닐라 레니포미스 유래의 레닐라 루시퍼레이스(Renilla luciferase), 가우시아 프린셉스 유래의 가우시아 루시퍼레이스(Gaussia luciferase), 오프로퍼러스 그라실리로트리스 유래의 오프로포러스 루시퍼레이스(Oplophorus luciferase) 및 포티너스 파이랄리스 유래의 반딧불이 루시퍼레이스(firefly luciferase)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어, '단백질분해효소(proteinase)'는 단백질의 펩티드 결합을 가수분해하여 아미노산이나 펩티드를 만드는 가수분해효소를 말한다. 동물과 식물의 조직 및 세포에 많이 포함되어 있으며, 분해 양상에 따라 엑소펩티데이스 (exopeptidase) 및 엔도펩티데이스(endopeptidase)로 분류된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 단백질분해효소는 세포외기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)일 수 있다. 세포외기질 금속단백분해효소는 세포외기질을 분해하는 엔도펩티데이스의 일종으로 활성 부위에 금속 원자를 포함하고 있다. 상기 세포외기질 금속단백분해효소는 MMP 1, MMP 2, MMP 3, MMP 7, MMP 8, MMP 9, MMP11, MMP 12, MMP 13, MMP 14, MMP15, MMP 16, MMP 17, MMP 24 및 MMP 25로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 MMP 7일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, '단백질분해효소의 기질 펩티드'는 단백질분해효소가 인식하여 절단하는 펩티드로서, 분석하고자 하는 목적 단백질분해효소가 인식하여 절단할 수 있는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 단백질분해효소의 기질 펩티드는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 6에 제시된 펩티드 서열(GGVPLSLTMGG)은 세포외기질 금속단백분해효소의 기질로 사용될 수 있으며, MMP-2 또는 MMP-9와 비교하여 MMP-7에 대해 10배 높은 kcat/K _M 값을 가지므로 특히 MMP-7 활성 측정에 유용하게 활용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, '링커(linker)'는 융합 단백질을 표면에 고정시키기 위한 매개체로 링커의 한 쪽 끝은 단백질분해효소의 기질 펩티드와 연결된다. 다른 한 쪽 끝은 표면에 고정되어 있는 링커에 특이적으로 결합하는 물질과 공유결합, 수소결합 등에 의하여 연결되므로 결과적으로 컨쥬게이트가 표면에 고정된다. 상기 링커에는 1종 또는 2종 이상의 물질이 사용될 수 있으며, 바이오틴(biotin), 글루타치온(glutathione), 히스티딘(histidine), 렉틴(lectine) 또는 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 링커로 바이오틴이 사용되는 경우, 표면에는 스트렙타비딘이 고정되어 있을 수 있다.

본 발명의 일 구체예예서, 상기 루시퍼레이스와 단백질분해효소 기질 펩티드의 융합 단백질은 링커와 상호 연결된 컨쥬게이트(conjugate) 형태일 수 있다. 예를 들어, 먼저 루시퍼레이스와 단백질분해효소 기질 펩티드의 융합 단백질 및 GyrA(인테인) 조합을 재조합 벡터를 사용하여 생산한다. 이후, 본 발명의 도 1에 개시된 바와 같이 GyrA와 바이오틴의 치환 반응을 수행함으로써 루시퍼레이스-단백질분해효소의 기질 펩티드-링커의 컨쥬게이트를 제작할 수 있다.

상기 인테인(intein)은 단백질이 완성된 형태의 모습으로 접히기(folding) 전에 단백질 스플라이싱(splicing) 과정에서 잘려져 나가는 영역으로, 일부 단백질에서는 번역 후 전구체 단백질이 자기촉매반응에 의해 그 일부가 잘려지고 나머지 부분이 재결합하여 성숙 단백질이 되는 것으로 알려져있다. 이때 잘려지는 영역을 인테인(intein), 성숙 단백질로 남는 영역을 엑스테인(extein)이라고 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 ⒝의 루시페린은 루시페린은 반딧불이 루시페린(firefly luciferin), 달팽이 루시페린(Latia neritoides luciferin), 박테리아 루시페린(Achromobacter fischerii luciferin) 및 코엘렌테라진 (coelenterazine)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 코엘렌테라진-h가 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 ⒞ 단계 이후 루시퍼레이스의 생물발광 신호의 변화를 검출하여 생물발광 신호가 감소하면 상기 시료 내에 단백질분해효소의 활성이 있고, 생물발광 신호가 유지되면 상기 시료 내에 단백질분해효소의 효소 활성이 없는 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 '시료'는 분석하고자 하는 단백질분해효소를 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양상은 루시퍼레이스와 단백질분해효소 기질 펩티드의 융합 단백질 및 상기 융합 단백질을 표면에 고정시키는 링커를 포함하는, 단백질분해효소의 활성 측정용 키트를 제공한다.

상기 키트는 루시퍼레이스의 생물발광을 위한 기질인 루시페린과 융합 단백질이 고정되는 마이크로플레이트를 추가로 포함할 수 있고, 상기 마이크로플레이트는 융합 단백질을 고정시킬 수 있도록 링커가 부착되어 있을 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 방법을 이용하면, 루시퍼레이스의 생물발광신호 변화를 측정하여 단백질분해효소의 활성을 쉽게 측정할 수 있다.

도 1의 A는 루시퍼레이스, 기질 펩티드 및 바이오틴이 연결된 융합 단백질(Rluc8-pep-Bio)을 제조하는 과정을 개략적으로 보여주고, 도 1의 B는 Rluc8-pep-Bio를 사용하여 단백질분해효소의 활성을 측정하는 방법을 개략적으로 나타낸다.
도 2의 A는 Rluc8-m7-GyrA에 각각 2-멀캅토에테인-술폰산(MESA) 단독 처리(레인 2), MESA와 CK-바이오틴 공동 처리(레인 3), 및 MESA와 L-시스테인을 공동 처리(레인 4)한 후 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타내며, 레인 5 및 6은 각각 정제한 Rluc8-m7-Bio 및 Rluc8-m7-C(C는 L-시스테인)을 SDS-PAGE로 분리한 결과를 나타낸다.
도 2의 B는 스트렙타비딘이 코팅된 마이크로플레이트 표면에 Rluc8-m7-Bio (바이오틴화된 융합 단백질) 또는 Rluc8-m7-C(비바이오틴화된 융합 단백질)을 로딩한 후 결합 두께(binding thickness)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 Rluc8-m7-Bio를 마이크로플레이트에 고정시켜 다양한 농도의 MMP-7과 반응시킨 결과(A), 반응시킨 후 생물발광 신호를 측정한 결과(B)및 생물발광 신호를 그래프로 표시한 결과(C)를 나타낸다.
도 4는 다양한 농도의 마우스 혈청(A), 세포 배양 배지(B) 및 세포 조직 추출물(C)에서 MMP-7의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

시약

활성화된 세포외기질 금속단백분해효소-7(matrix metalloproteinase-7; 이하, MMP-7로 기재함) 및 세포외기질 금속단백분해효소-2(이하, MMP-2로 기재함)는 Millipore Sigma (MA, USA)로부터 구입하였다. 코엘렌테라진-h(coelenterazine-h)는 Nanolight Technologies(AZ, USA)에서 구매하고, 니켈(Ⅱ)-니트릴로트리아세트산 (Ni(II)-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA) 레진과 뉴트리아비딘이 코팅된(NeutrAvidin(NA)-coated) 흰색 96-웰 플레이트는 Thermo Fisher Scientific Inc.(USA)에서 구입하였다. L-아라비노스(L-arabinose), 2-멀캅토에테인-술폰산(2-mercaptoethane-sulfonic acid, MESA) 및 L-시스테인(L-Cysteine, L-Cys)은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구매하였다. 또한, 시스테인-라이신-바이오틴(Cys-Lys-Biotin, CK-바이오틴)은 Peptron Inc.(대전, 대한민국)에서 합성하였고, RIPA 완충액 (radioimmunoprecipitation assay buffer)는 Cell Signaling Technology (MA, USA)에서 구입하였다.

R Luc8 -pep- GyrA 플라스미드 제작

레닐라 레니포미스(Renilla reniformis; 바다 팬지) 유래의 루시퍼레이스 변이체 8(luciferase mutant 8)을 코딩하는 RLuc8 유전자와 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi) 유래의 Mxe GyrA 인테인(intein)을 코딩하는 GyrA 유전자 사이에 MMP-7의 기질 서열(GGVPLSLTMGG, 서열번호 6; 이하, m7으로 기재함)을 삽입하기 위하여, pBAD-RLuc8-GyrA 플라스미드를 사용하여 m7pep-GyrA 유전자를 제작하였다. 제작 방법은 하기 5개의 프라이머를 이용한 연속 PCR(consecutive polymerase chain reaction)을 사용하였으며, 프라이머 서열은 하기와 같다.

(서열번호 1) 1st F-primer: 5′-ACA ATG GGT GGT GAA TTC TGC ATC ACG-3′

(서열번호 2) 2nd F-primer: 5′-TA CCT CTG TCA CTG ACA ATG GGT GGT G-3′

(서열번호 3) 3rd F-primer: 5′-C GAG GGA GGA GTA CCT CTG TCA CT-3′

(서열번호 4) 4th F-primer: 5′-CCG CTC GAG GGA GGA GTA CCT-3′

(서열번호 5) 공통 R-primer: 5′-ATGC GAA TTC ACC ACC GCT ACG CAG ACT TAC AAT ACC ACC CTG CTC GTT CTT CAG-3′

이후 PCR 산물을 XhoⅠ/HindⅢ 제한효소 조합으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단한 pBAD-RLuc8-GyrA 플라스미드와 라이게이션(ligation)하여 pBAD-RLuc8-m7-GyrA 플라스미드를 제작하였다.

R Luc8 -m7-Bio 및 R luc8 -pep-C 융합 단백질 제작

C-말단에 His₆-태그를 갖는 융합 단백질을 제작하기 위하여, 상기 pBAD-RLuc8-m7-GyrA 플라스미드를 E. coli TOP10 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포는 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 액체배지 (Luria-Bertani broth) 0.5 L에서 200 rpm/분 속도로 교반하면서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이후, 배지의 흡광도가 0.7에 도달하면 단백질 발현을 유도하기 위해 0.2% 아라비노스를 첨가하고, 37℃에서 5시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 끝나면 원심분리로 대장균 세포를 회수하고, 용해 완충액[10 mM 이미다졸(imidazole), 300 mM 염화나트륨(NaCl) 및 1 ㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme)을 포함하는 50 mM 인산염-완충 식염수(PBS), pH 8.0] 30 ㎖에 세포를 재현탁시켰다. 10초 온(on) 및 10초 오프(off) 사이클로 10분 동안 대장균 세포를 초음파분쇄(sonication)하고, 4℃에서 30분 동안 5,200xg로 원심분리하였다. 상등액(supernatant)만 회수하여 0.45 ㎛ 포어 사이즈의 주사기 필터(syringe filter; Minisart)로 필터링하였다. 필터링된 수용성 용해물(soluble lysate)은 용해 완충액으로 평형화된 50% Ni-NTA 아가로스 슬러리(Ni-NTA agarose slurry; Thermo Scientific) 1 ㎖과 혼합한 후 교반하면서 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 하단 유출구가 캡(cap)으로 막혀 있는 5 ㎖ 컬럼(Thermo Scientific)에 대장균 용해물-Ni-NTA 혼합물을 로딩하고, 하단 유출구의 캡을 제거한 후 컬럼을 통과하여 유출되는 샘플(flow-through sample)을 회수하였다. 상기 컬럼을 세척 완충액(20 mM 이미다졸 및 300 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM PBS, pH 8.0)으로 4회 세척하고, 용출 완충액(500 mM 이미다졸 및 300 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM PBS, pH 8.0)을 사용하여 컬럼으로부터 단백질을 용출시켰다. 용출된 단백질 분획은 PD-10 탈염 컬럼(desalting column; GE Healthcare)으로 추가로 정제하고, 정제된 단백질은 마이크로콘(Microcon, YM-50; Millipore)으로 농축한 후 100 mM PBS (pH 7.4)에 재현탁시켰다. 단백질 농도는 280 ㎚에서 흡광도를 측정한 후 91,010 M^-1 ㎝^-1의 흡광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 산출하였다.

Rluc8-m7-Bio(Rluc8-m7-바이오틴) 또는 비바이오틴화 형태인 Rluc8-m7-C (Rluc8-m7-시스테인)를 만들기 위하여, 아미노티올 유도체(aminothiol derivative)를 사용하여 RLuc8-m7-GyrA의 스플라이싱 과정을 수행하였다. 간략하게, MESA(40 ㎕ at 50 mM) 및 CK-바이오틴(20 ㎕ at 1 mM)과 정제된 Rluc8-m7-GyrA-His₆ 융합 단백질(40 ㎕ at 50 M)을 반응 완충액(0.1 mM PBS, pH 8.0)에서 혼합시켰다. 또한, Rluc8-m7-C 제작에는 CK-바이오틴 대신 L-Cys(20 ㎕ at 1 mM)를 사용하였다. 각각의 반응 혼합물은 어두운 곳에서, 가볍게 교반하면서 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 절단 산물을 정제하기 위하여, 반응 혼합물 200 ㎕와 50% Ni-NTA 아가로스 슬러리 100 ㎕를 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 혼합하였다. 상기 아가로스 혼합물을 원심분리한 후, 남아있는 MESA, CK-바이오틴 및 L-Cys를 제거하기 위하여 상등액의 단백질을 마이크로콘으로 추가로 정제하였다. 목적 산물(Rluc8-m7-Bio 또는 Rluc8-m7-C)은 SDS-PAGE로 확인하고, 280 ㎚에서 흡광도를 측정한 후 63,495 M^- ¹ ㎝^-1의 흡광 계수를 사용하여 농도를 확인하였다.

샘플 준비

HT-1080 (인간 섬유육종(fibrosarcoma) 세포, MMP-7 양성) 및 HT-29 (인간 결장 선암종(colorectal adenocarcinoma) 세포, MMP-7 음성) 세포는 T75 조직 배양 플라스크(SPL Life Science, Korea) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃에서 배양하였다. 2일 후, 세포 배양 배지를 무혈청 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하고, 멸균된 파이펫을 사용하여 배지를 15 ㎖ 튜브에 수거하였다. 수거한 배지는 원심분리(6,800xg, 10 분)한 후 센트리콘(centricon, Amicon Ultra-4 Centifugal Filters 10 K; Merck Millipore)으로 농축하였다.

마우스 조직 추출물은 1% 트리톤-X-100 및 1%(v/v) 단백질분해효소 저해제를 포함하는 PBS에 마우스 조직을 담그고, 4℃에서 5초 동안 초음파분쇄하여 제작하였다. 분쇄 후 수용성 분획은 장기 보관을 위해 -80℃에 보관하였다.

배양 배지 또는 마우스 조직 추출물 내의 총 단백질 농도는 브래드포드 방법을 사용하여 제조사의 지시에 따라 확인하였다.

융합 단백질의 바이오틴화 여부 확인

정제된 융합 단백질의 바이오틴화 여부를 확인하기 위하여, 바이오레이어 인터페로메트리(biolayer interferometry; BLItz instrument, Fortebio, USA)로 표면 분석을 수행하였다. 결합 측정 전에, 스트렙타비딘이 코팅된 광 프로브 (streptavidin-coated optical probe; #18-5019; Fortebio, USA)는 로딩 완충액(0.2 ㎎/㎖ BSA를 포함하는 PBS)에서 10분 동안 평형(equilibration)시켰다. 60초 동안 초기 베이스 라인을 측정한 후, 스트렙타비딘이 코팅된 센서 위에 Rluc8-m7-Bio (4 ㎕ at 1 μM in PBS)를 180초 동안 로딩하였다. 이후, 바이오센서에 PBS를 흘리면서 120초 동안 세척하고, 음성 대조군인 Rluc8-m7-C (4 ㎕ at 1 μM in PBS)으로 동일 과정을 반복하였다.

MMP 활성 측정

표면 패시베이션(surface passivation) 및 활성화(activation)를 위하여, NA가 코팅된 플레이트의 각 웰을 0.1% BSA 및 0.05% 트윈-20을 포함하는 TBS 완충액(pH 7.4)으로 전처리하였다. 반응 완충액(5 mM CaCl₂ 및 100 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris, pH 7.6)에 분산된 RLuc8-m7-Bio (90 ㎕ at 70 ㎍/㎖, 1.94 μM에 상응)와 MMP 효소(반응 완충액에 각 농도별로 분산된 용액 10 ㎕)를 혼합하였다.

실제 생물학적 샘플에서의 MMP 활성 측정을 위해서, 상기 반응 완충액에 분산된 RLuc8-m7-Bio(80 ㎕ at 70 ㎍/㎖)와 세포 배양 배지 또는 마우스 조직 용해물 20 ㎕ (단백질 농도는 50 ㎍/㎖)를 혼합하였다. 대조군으로는 동일 조건으로 반응 완충액에 분산된 RLuc8-m7-Bio를 BSA(bovine serum albumin) 20 ㎕(50 ㎍/㎖)와 혼합하였다.

RLuc8-m7-Bio와 MMP 효소, RLuc8-m7-Bio와 세포 배양 배지 또는 RLuc8-m7-Bio와 마우스 조직 용해물이 혼합된 용액 100 ㎕를 37℃에서 2시간 동안 동안 반응시키고, 이후 NA가 코팅된 플레이트의 각 웰에 상기 반응물 95 ㎕를 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에 1시간 동안 방치하여 바이오틴과 스트렙타비딘의 반응을 유도하고, 표면을 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 플레이트의 각 웰에 PBS 100 ㎕를 첨가하고, 코엘렌테라진-h (100 ㎕ at 2 ㎍/㎖ in PBS)을 첨가하였다. 생물발광 스펙트럼 (bioluminescence spectrum)은 다중 모드 플레이트 판독기(multimode plate reader; Varioskan, Thermo Scientific, Inc., USA)로 400 내지 650 ㎚에서 측정하였다. 생물발광 이미지는 화학발광/생물발광 이미지 수집 시스템 (Fusion SL, Vilber Lourmat, Torcy, France)을 사용하여 수득하였다.

실험 결과

R luc8 -pep-Bio 융합 단백질 생산

본 발명에 사용된 인테인 단백질인 GyrA는 합성 시스테인-라이신-바이오틴(CK-바이오틴)과 2-멀캅토에테인-술폰산(MESA)의 존재 하에 자가-스플라이싱(self-splicing) 과정을 거쳐 안정한 알파-티오에스터(α-thioester)를 생성한다. 결과적으로, Rluc8의 C-말단에 융합된 인테인으로 인하여 CK-바이오틴이 Rluc8의 C-말단으로 라이게이션된다. MESA는 인테인의 N-말단 절단을 촉진하기 위한 친핵성 화합물(nucleophilic compound)로 사용하였다.

MMP의 펩티드 기질을 포함하는 Rluc8-pep-GyrA 재조합 벡터(pep는 펩티드 기질을 나타냄)를 대장균에서 발현시켰고, 인테인 매개 라이게이션 과정을 통해 바이오틴화된 형태의 Rluc8-pep-Bio를 생산하였다(도 1의 A). 정제된 Rluc8-pep-Bio는 MMP 활성을 모니터하기 위해 사용되며, 실제 샘플에서 MMP와 반응한 후에는 펩티드 기질이 절단되므로 NA가 코팅된 마이크로플레이트 표면에 바이오틴이 남게 된다(도 1의 B). 생물발광 신호는 루시퍼레이스 기질인 코엘렌테라진-h의 존재 하에 마이크로플레이트의 표면에서 생성될 수 있고, 상기 생물발광 신호는 샘플 내에 존재하는 MMP의 양에 반비례한다.

R luc8 -m7-Bio 융합 단백질의 인테인 -매개 바이오틴화 확인

Rluc8-m7-GyrA 단백질에 서로 다른 조건으로 MESA 및/또는 바이오틴, 시스테인을 처리한 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과, 도 2의 A에 나타난 바와 같이 Rluc8-m7-GyrA 단백질(레인 1)에 MESA 단독 처리(레인 2), MESA와 CK-바이오틴 처리(레인 3), 및 MESA와 L-시스테인(레인 4))을 같이 처리하였을 때, 원래의 단백질(레인 1)과 비교하여 두 개의 스플라이싱 단백질 단편(레인 2 내지 4)이 생긴 것을 확인하였다. 바이오틴 모이어티(moiety)를 갖지 않는 L-시스테인은 인테인과 시스테인 유도체(L-시스테인)에서 트랜스-티오에스터화(trans-thioesterification) 과정을 통한 바이오틴의 부착을 비교하기 위해 음성 대조군으로 사용하였다. 상기 결과는 Rluc8-m7-GyrA 단백질에서 MESA에 의하여 GyrA가 절단되고, CK-바이오틴 또는 L-시스테인으로 대체(레인 3 및 4)된 것을 의미한다. 레인 3 및 4의 반응 혼합물에서 His₆가 태그된 GyrA 단백질을 제거하기 위해 Ni-NTA 아가로스 비드를 사용하여 산물을 정제하였다. 이후, 정제한 Rluc8-m7-Bio(레인 3 유래) 및 Rluc8-m7-C(레인 4 유래)를 SDS-PAGE로 분리한 결과 두 단백질의 젤 이동성에는 큰 차이가 없었다(도 2의 A에서 레인 5 및 6). 이는 두 단백질의 분자량이 거의 유사하기 때문일 것으로 추측된다.

바이오레이어 인터페로메트리 분석을 위해, 바이오틴화(Rluc8-m7-Bio) 및 비바이오틴화(Rluc8-m7-C) 단백질을 스트렙타비딘이 코팅된 마이크로플레이트의 표면에 로딩하였을 때 결합 두께(binding thickness)는 포화 곡선과 함께 4분까지 증가하였다. 이는 마이크로플레이트의 표면에 Rluc8-m7-bio가 표면에 강하게 결합한 것을 의미한다(도 2의 B에서 실선). 대조적으로, Rluc8-m7-C를 로딩한 경우 유의미한 결합이 나타나지 않았다(도 2의 B에서 점선). 이 실험 결과는 바이오틴 그룹이 인테인-매개 스플라이싱 과정을 통해 Rluc8-m7-GyrA의 C-말단에 성공적으로 도입되어 Rluc8-m7-Bio를 형성하는 것을 의미한다.

MMP -7 활성 측정

Rluc8-m7-Bio가 MMP-7의 활성을 측정할 수 있는지 확인하였다. 매트리리신 (matrilysin)으로도 알려진 MMP-7은 카제인, 젤라틴, 피브로넥틴 및 프로테오글리칸을 포함하는 세포외 매트릭스(extracellular matrix)의 다양한 기질에 대하여 넓은 특이성을 가지므로 모델 단백질분해효소로 선택하였다. 또한, MMP-7은 MMP-2 및 MMP-9가 관여하는 종양 침범(tumor invasion)을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

NA가 코팅된 마이크로플레이트 위에 Rluc8-m7-Bio를 고정시킨 후 다양한 농도 범위(0, 1, 10, 100 및 1000 ng/㎖)의 활성 MMP-7과 반응시켰다. 그 결과, 생물발광 이미지의 신호 강도는 활성 MMP-7의 농도가 증가함에 따라 현저하게 감소하였으며(도 3의 A), 이 결과는 Rluc8-m7-Bio의 생물발광 스펙트럼의 신호 변화와 일치하였다(도 3의 B). 반면, MMP-2는 동일한 농도 범위에서 유의미한 신호 감소를 나타내지 않았다(도 3의 C). 실험 결과, MMP-7 활성의 검출 한계는 1 내지 10 ng/㎖ 농도 범위인 것을 알 수 있었으며, 이 범위는 이전에 보고된 결과들과 유사하거나 다소 증가된 수치이다. 사용된 펩티드 기질(GGVPLSLTMG)은 MMP-2 또는 MMP-9와 비교하여 MMP-7에 대해 10배 높은 kcat/K _M 값을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 결과는 Rluc8-m7-Bio가 높은 특이성 및 높은 민감도로 MMP-7 활성의 정량적 측정에 이용될 수 있음을 의미한다.

Rluc8-m7-Bio가 실제 생물학적 샘플에서 작용하는지 확인하기 위하여, 활성 MMPs를 포함하지 않는 마우스 혈청을 Rluc8-m7-Bio와 혼합하여 반응시킨 후 생물발광 신호를 확인하였다. 그 결과, 혈청 농도에 따라 생물발광 신호가 약간 변하기는 하였으나 다양한 농도의 마우스 혈청에서 생물발광 신호의 유의미한 감소는 확인할 수 없었다(도 4의 A). 이 결과는 루시퍼레이스 프로브인 Rluc8-m7-Bio가 혈청에 대해 안정적이고, 마이크로플레이트 표면의 생물발광 신호 측정이 복합 물질의 모니터링에 유용하다는 것을 시사한다.

상기 방법으로 생물학적 샘플에서 MMP-7 활성을 검출할 수 있는지 추가로 조사하기 위해, HT-1080 세포(MMP-7 분비) 및 HT-29 세포(MMP-7 미분비)의 배양 배지(단백질 농도 50 ㎍/㎖)에서 동일한 실험을 진행하였다. 상대적 MMP 활성을 측정하기 위해, 상기 배양 배지의 단백질 농도와 동일한 농도의 BSA를 음성 대조군으로 사용하였다.

실험 결과, 대조군과 비교하여 HT-1080의 배양 배지에서 현저하게 감소된 생물발광 신호(높은 MMP-7 활성)가 나타났다. 대조적으로, HT-29의 배양 배지에서는 약간 감소된 신호(낮은 MMP-7 활성)를 확인할 수 있었다(도 4의 B). 또한, 뇌와 정소를 포함한 마우스 조직 추출물(총 단백질 농도는 50 ㎍/㎖)을 같은 방법으로 실험한 결과, HT-1080 배양 배지와 비교하여 MMP-7의 활성이 상대적으로 낮은 수준인 것을 알 수 있었다(도 4의 C).

지금까지의 결과를 통하여 Rluc8-m7-Bio을 이용한 방법이 생물학적 시료에서 다양한 단백질분해효소의 활성을 고효율 및 다중 방식으로 모니터링하고 비교하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 생물발광 기반의 방법은 다른 비색(colorimetric) 또는 형광 방법에 비해 많은 장점이 있다. 매우 안정적인 효소인 루시퍼레이스는 자가형광(autofluorescence)이나 다른 백그라운드 노이즈 없이 혈청 및 조직 추출물과 같은 복잡한 샘플에서 특정 효소의 활성을 검출할 수 있다. 또한, 바이오틴화된 루시퍼레이스는 생물발광 신호를 빠르게 판독할 수 있도록 표면 고정화 방법을 제공한다. 시간 소모적이고, 몇 종의 MMP로 제한된 젤 전기 영동에 기반한 고전적인 자이모그래피(zymography) 방법과는 다르게 펩티드 기질에 기반하는 본 발명의 방법은 광범위한 범위의 단백질분해효소의 활성을 간단하게 측정할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Method for Analyzing Proteinase Activity using luciferase <130> P18U10C0591_P20180269KR <150> KR 10-2018-0026770 <151> 2018-03-07 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st F-primer <400> 1 acaatgggtg gtgaattctg catcacg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd F-primer <400> 2 tacctctgtc actgacaatg ggtggtg 27 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3rd F-primer <400> 3 cgagggagga gtacctctgt cact 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4th F-primer <400> 4 ccgctcgagg gaggagtacc t 21 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common R-primer <400> 5 atgcgaattc accaccgcta cgcagactta caataccacc ctgctcgttc ttcag 55 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate peptides of MMP-7 <400> 6 Gly Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Gly 1 5 10

Claims

⒜ 루시퍼레이스(luciferase)와 단백질분해효소 기질 펩티드의 융합 단백질을 링커를 통해 표면에 고정시키는 단계;
⒝ 상기 고정된 융합 단백질에 루시페린을 접촉시키는 단계; 및
⒞ 상기 ⒝의 결과물과 단백질분해효소의 활성을 검사하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 단백질분해효소의 활성 측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 ⒞ 단계 이후 루시퍼레이스의 생물발광 신호의 변화를 검출하여 생물발광 신호가 감소하면 상기 시료 내에 단백질분해효소의 활성이 있고, 생물발광 신호가 유지되면 상기 시료 내에 단백질분해효소의 효소 활성이 없는 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 단백질분해효소의 활성 측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 ⒜의 루시퍼레이스는 레닐라 루시퍼레이스(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼레이스(Gaussia luciferase), 오프로포러스 루시퍼레이스(Oplophorus luciferase) 및 반딧불이 루시퍼레이스(firefly luciferase)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 단백질분해효소의 활성 측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 ⒜의 기질 펩티드는 서열번호 6의 펩티드 서열을 포함하는 것인, 단백질분해효소의 활성 측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 ⒜의 링커는 바이오틴(biotin), 글루타치온(glutathione), 히스티딘(histidine) 및 렉틴(lectin)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 단백질분해효소의 활성 측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질분해효소는 세포외기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)인 것인, 단백질분해효소의 활성 측정 방법.
제6항에 있어서, 상기 세포외기질 금속단백분해효소는 MMP 1, MMP 2, MMP 3, MMP 7, MMP 8, MMP 9, MMP11, MMP 12, MMP 13, MMP 14, MMP15, MMP 16, MMP 17, MMP 24 및 MMP 25로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 단백질분해효소의 활성 측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 루시페린은 반딧불이 루시페린(firefly luciferin), 달팽이 루시페린(Latia neritoides luciferin), 박테리아 루시페린(Achromobacter fischerii luciferin) 및 코엘렌테라진(coelenterazine)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 단백질분해효소의 활성 측정 방법.
루시퍼레이스와 단백질분해효소 기질 펩티드의 융합 단백질 및 상기 융합 단백질을 표면에 고정시키는 링커를 포함하는, 단백질분해효소의 활성 측정용 키트.