KR20190104151A - 안구인두근위축증 (opmd)의 치료제 및 이의 사용 - Google Patents

안구인두근위축증 (opmd)의 치료제 및 이의 사용 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 안구인두근위축증 (OPMD)을 치료하기 위한 RNA 간섭 (RNAi) 시약, 예컨대 쇼트 헤어핀 microRNA (shmiR) 및 쇼트 헤어핀 RNA (shRNA), 이를 포함하는 조성물, OPMD로 고통받는 개체 또는 이에 걸리기 쉬운 개체를 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 OPMD의 치료를 위한 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 작제물과 같은 PABPN1 치환 시약과 함께 RNAi 시약의 용도, 이를 포함하는 조성물 및 OPMD로 고통받는 개체 또는 이에 걸리기 쉬운 개체를 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

안구인두 근이영양증(OPMD)의 치료용 시약 및 이의 용도
관련 출원의 교차-참조
이 출원은 2016년 12월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/434,312호의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본 명세서에서 그 전체가 참고로 인용된다.
기술 분야
본 개시내용은 안구인두근위축증 (OPMD)의 치료를 위한 RNA 간섭 (RNAi) 시약, 이를 포함하는 조성물, 및 OPMD를 앓고 있는 또는 이에 걸리기 쉬운 개인을 치료하기 위한 그의 용도 용도에 관한 것이다.
OPMD는 상염색체 우성 유전, 더딘 진행, 늦게 발병하는 퇴행성 근육 장애이다. 상기 질환은 주로 진행형 눈꺼풀 처짐 (하수증) 및 삼킴 어려움 (연하장애)을 특징으로 한다. 인두 및 윤상인두 근육은 OPMD의 특정 표적이다. 근위 사지가 약해지는 것은 질환 진행의 후기 단계에서 따라오는 경향이다. 상기 질환의 원인이 되는 돌연변이는 폴리(A) 결합 단백질 핵 1 (PABPN1) 유전자의 암호화 영역에서 (GCN)n 트리뉴클레오티드 반복의 비정상적 확장이다. 이 확장은 PABPN1 단백질의 N-말단에서 폴리알라닌 관(tract)을 확장시킨다: 10개의 알라닌은 정상 단백질에 존재하고, 돌연변이 형태 (expPABPN1)에서 11 내지 18개의 알라닌으로 확장된다. 이 질환의 주요 병리학적 특징(hallmark)은 expPABPN1의 핵 집합체이다. 확장된 PABPN1의 오폴링(misfolding)은 감염된 세포의 핵 내부에 불용성 폴리머 원섬유성 응집체를 축적시킨다. PABPN1은 응집 경향이 있는 단백질이고 OPMD에서의 알라닌-확장된 PABPN1 돌연변이는 야생형 정상 단백질보다 높은 응집 속도를 갖는다. 그러나, OPMD에서의 핵 응집체가 세포 방어 매커니즘의 결과로서 병리학적 기능적 또는 보호적인 역할을 갖는지는 아직 명확하지 않다.
약물학적 또는 기타 치료법은 현재 OPMD에서 이용될 수 없다. 증후의 외과적 개입은 부분적으로 하수증을 교정할 수 있고 중등도에서 중증의 환자에게 삼키는 것을 개선할 수 있다. 예를 들어, 윤상인두근절개술은 현재 이러한 환자에서 삼키는 것을 개선할 수 있는 유일한 치료법이다. 그러나, 이것은 인두 근육의 점진적 저하를 교정하지 못하며, 이는 종종 삼키는 것의 어려움 및 질식에 이어 사망으로 이어진다.
따라서, OPMD를 앓고 있는 환자 및/또는 이에 걸리기 쉬운 환자에서 이를 치료하는 치료제가 필요하다.
본 명세서에 포함된 문서, 작용, 물질, 장치, 물품 등의 논의는 이러한 사안들 중 일부 또는 전부가 선행 기술 기반의 일부를 구성하거나 첨부된 청구범위의 각각의 우선 날짜 이전에 존재했던 본 개시와 관련된 분야에서 일반적인 지식이었다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 개시내용은 OPMD의 치료를 위한 치료제가 현재 존재하지 않는다는 발명자의 인식에 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 개시내용은 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로 하는 RNAi 시약을 제공한다. 본 발명자들은 이들 RNAi 시약이 OPMD의 원인이 되는 돌연변이 PABPN1 단백질 즉, 확장된 폴리알라닌 관을 포함하는 PABPN1 단백질로 변역될 전사 변이체를 포함하는 PABPN1 mRNA 전사체의 전사 후 억제에 효과적임을 보여주었다. 예를 들어, 본원의 예시적인 RNAi 시약이 시험관내 PABPN1 단백질의 발현을 억제하거나 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, 본 개시내용은 본 개시의 RNAi 시약(이하 "PABPN1 치환 시약")에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 갖는 야생형 인간 PABPN1 단백질의 발현을 위한 시약을 제공한다. 본 발명자는 본 개시의 RNAi 시약과 함께 발현될 때, PABPN1 치환 시약이 RNAi 시약에 내성이고 기능적 PABPN1 단백질로 번역될 수 있는 PABPN1 전사체를 생성할 수 있음을 나타내었다. 본 발명자에 의한 이러한 발견은 OPMD의 치료에서 치료적 적용을 가질 수 있는 시약을 제공한다.
따라서, 본 개시내용 쇼트 헤어핀 마이크로 RNA (shmiR)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 상기 shmiR은 하기를 포함한다:
길이가 적어도 17 뉴클레오티드인 이펙터 서열;
이펙터 보체 서열;
스템루프 서열; 및
1차 마이크로 RNA (전구-miRNA) 백본;
상기 이펙터 서열은 하기 서열번호: 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적이다. 바람직하게, 상기 이펙터 서열은 길이가 30 뉴클레오티드 미만일 것이다. 예를 들어, 적합한 이펙터 서열은 길이가 17-29 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 바람직하게, 상기 이펙터 서열은 길이가 20 뉴클레오티드일 것이다. 보다 바람직하게, 상기 이펙터 서열은 길이가 21 뉴클레오티드일 것이고 상기 이펙터 보체 서열은 길이가 20 뉴클레오티드일 것이다.
상기 이펙터 서열은 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호: 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 비해 4 염기쌍 미스매치를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 이펙터 서열은 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호: 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 비해 3 염기쌍 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서, 상기 이펙터 서열은 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호: 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 비해 2 염기쌍 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서, 상기 이펙터 서열은 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인 서열번호: 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 비해 1 염기쌍 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 비해 100% 상보적이다. 미스매치가 존재하는 경우, shmiR의 시드 영역 즉, 이펙터 서열의 뉴클레오티드 2-8에 상응하는 영역 내에 위치하지 않는 것이 바람직하다.
서열번호: 1에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR2"라고 함).
서열번호: 2에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR3"라고 함).
서열번호: 3에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR4"라고 함).
서열번호: 4에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR5"라고 함).
서열번호: 5에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR6"라고 함).
서열번호: 6에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR7"라고 함).
서열번호: 7에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR9"라고 함).
서열번호: 8에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR11"라고 함).
서열번호: 9에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR13"라고 함).
서열번호: 10에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR14"라고 함).
서열번호: 11에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR15"라고 함).
서열번호: 12에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR16"라고 함).
서열번호: 13에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiR이 본원에 기술된다 (이하, "shmiR17"라고 함).
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 14에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 14에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR2);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 16에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 16에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR3);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 18에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 18에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR4);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 20에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 20에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR5);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 22에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 22에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR6);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 24에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 24에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR7);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 26에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 26에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR9);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 28에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 28에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR11);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 30에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 30에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR13);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 32에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 32에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR14);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 34에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 34에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR15);
shmiR은 하기를 포함한다:(i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 36에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 36에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR16); 및
shmiR은 하기를 포함한다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 38에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열(단, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 38에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있음); 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열 (shmiR17).
또 다른 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 15에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR2);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 17에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR3);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 19에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 19에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR4);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 21에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR5);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 23에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 23에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR6);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 25에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 25에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR7);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 27에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR9);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 29에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 29에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR11);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 31에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR13);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 33에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR14);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 35에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 35에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR15);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 37에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 37에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR16); 및
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 39에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 이의 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열 (shmiR17).
예를 들어, 본원에 기재된 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 상응하는 이펙터 서열에 대해 1, 2, 3 또는 4 미스매치를 포함하는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있지만, 동종 이펙터 및 핵산 보체 서열은 이합체 영역을 형성할 수 있다.
또 다른 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다:
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 14에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR2);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR3);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 19에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 18에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR4);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 20에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR5);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 23에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 22에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR6);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 25에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 24에 제시된 이펙터 보체 서열(shmiR7);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 26에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR9);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 29에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 28에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR11);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR13);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR14);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 35에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 34에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR15);
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 37에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 36에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR16); 및
shmiR는 하기를 포함한다: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR17).
본 개시의 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함할 수 있다:
상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열;
상기 이펙터 보체 서열;
상기 스템루프 서열;
상기 이펙터 서열; 및
상기 전구-miRNA 백본의 3 '측접 서열.
본 개시의 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함할 수 있다:
상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열;
상기 이펙터 서열;
상기 스템루프 서열;
상기 이펙터 보체 서열; 및
상기 전구-miRNA 백본의 3 '측접 서열.
적합한 루프 서열은 당 업계에 공지된 것들로부터 선택될 수 있다. 그러나, 예시적인 스템루프 서열은 서열번호: 40에 제시된다.
본 개시의 핵산에서 사용하기에 적합한 1차 마이크로 RNA (전구-miRNA 또는 전구-R) 백본은 당 업계에 공지된 것들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 전구-miRNA 백본은 전구-miR-30a 백본, 전구-miR-155 백본, 전구-miR-21 백본 및 전구-miR-136 백본으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 그러나, 상기 전구-miRNA 백본은 전구-miR-30a 백본이다. 상기 전구-miRNA 백본이 전구-miR-30a 백본인 실시예에 따라, 상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열은 서열번호: 41에 제시되고 및 상기 전구-miRNA 백본의 3' 측접 서열은 서열번호: 42에 제시된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 56-68 중 임의의 하나에 기재되는 서열로부터 선택되는 DNA 서열을 포함한다. 이 실시예에 따라, 본 개시의 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 43-55 중 임의의 하나에 기재되는 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 때른 핵산은 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사체를 표적으로 하는 다른 RNAi 제제와 같은 OPMD를 치료하기 위한 다른 치료제와 결합되거나 그와 결합하여 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 본 개시내용은 OPMD를 치료하기 위한 하나 이상의 다른 RNAi 제제와 조합하여 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 하기를 포함하여 제공된다:
(a) 본원에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 핵산; 및
(b) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 핵산
(i) 본원에 기재된 핵산에 따른 핵산; 또는
(ii) 길이가 적어도 17 뉴클레오티드인 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shmiR 또는 쇼트 헤어핀 RNA (shRNA)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 이펙터 서열은 안구인두근위축증 (OPMD)의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인, 핵산;
여기서 (a)에서 핵산에 의해 암호화된 상기 shmiR 및 (b)에서 핵산에 의해 암호화된 상기 shmiR 또는 shRNA는 상이한 이펙터 서열을 포함한다.
하나의 예에서, (b)(ii)에서 shmiR 또는 shRNA의 상기 이펙터 서열은 서열번호: 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적이다. 바람직하게, 서열번호: 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 (b)(ii)에서 shmiR 또는 shRNA의 상기 이펙터 서열은 길이가 30 미만 뉴클레오티드일 것이다. 예를 들어, shmiR 또는 shRNA의 적합한 이펙터 서열은 길이가 17-29 뉴클레오티드 범위일 수 있다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR4를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR5를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR6을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR7을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR9를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR11을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR13를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR15를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR16를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR17를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
본 개시내용에 따른 복수의 핵산은 각각이 shmiR2-7, shmiR9, shmiR11, 및 shmiR13-17와 같이 본원에 기재된 shmiR을 암호화하는 최대 10개 핵산, 예컨대 2개의 핵산 또는 3개의 핵산 또는 4개의 핵산 또는 5개의 핵산 또는 6개의 핵산 또는 7개의 핵산 또는 8개의 핵산 또는 9개의 핵산 또는 10개의 핵산을 포함할 수 있다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 2개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 또 다른 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 3개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 4개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 5개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 6개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 7개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 8개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 9개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본 개시의 10개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 본원에 기재된 실시예에 따라, 복수의 핵산 중 하나 이상은 본원에 기재된 바와 같이 shRNA를 암호화할 수 있다.
하나의 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 적어도 2개의 핵산을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17로 이루어진 군으로부터 선택된 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
본 개시의 하나의 예시적인 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 하나의 핵산 및 본원에 기재된 바와 같이 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또 다른 핵산을 포함한다.
본 개시의 또 하나의 예시적인 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 하나의 핵산 및 본원에 기재된 바와 같이 shmiR14을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또 다른 핵산을 포함한다.
복수의 핵산이 제공되는 실시에에 따라, 2개 이상의 핵산은 동일한 폴리뉴클레오티드의 별도의 부분을 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 복수의 핵산 중 2개 이상은 각각 상이한 폴리뉴클레오티드의 부분을 형성한다.
본 개시내용에 따른 상기 또는 각각의 핵산은 하나 이상의 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있거나 또는 이와 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 핵산은 shmiR을 암호화하는 서열의 3' 말단에 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 프로모터의 선택에 의존할 것이며, 당업자에게 공지될 것이다. 그러나, 본원의 핵산 또는 이의 복수에 따라 사용하기 위한 프로모터 및 전사 종결인자 서열의 적합한 선택이 본원에 기술된다.
대안적으로, 또는 또한, 본 개시내용에 따른 상기 또는 각각의 핵산은 전사 개시제 서열을 포함하거나 또는 이와 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 핵산은 shmiR을 암호화하는 서열의 5' 말단에 전사 개시제 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 당업자에게 공지될 것이다.
대안적으로, 또는 또한, 본 개시내용에 따른 상기 또는 각각의 핵산은 예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터 내로 핵산(들)의 클로닝을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 제한 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 핵산은 본 개시의 shmiR을 암호화하는 서열의 업스트림 및/또는 다운스트림의 제한 부위를 포함할 수 있다. 적합한 제한 효소 인식 서열은 당업자에게 공지될 것이다.
본 개시내용에 따른 핵산, 또는 본원에 기재된 복수의 핵산은 본 개시내용의 핵산(들)에 의해 암호화되는 하나 이상의 shmiR을 발현할 수 있는 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작제물의 형태로 제공되거나 또는 그를 포함할 수 있다.
하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본 개시의 적어도 2개의 핵산을 포함하며, 이로써 ddRNAi 작제물은 OPMD의 원인인 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사체를 표적으로하는 적어도 두개의 shmiR을 암호화하며, 이들 각각은 서로 상이하다.
하나의 예에서, ddRNAi 작제물의 적어도 2개의 핵산 중 각각은 하기 서열번호: 1, 2, 4, 7, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화한다. 따라서, 본 실시예에 따른 ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17로부터 선택되는 2개의 shmiR을 암호화한다.
본 개시의 ddRNAi 작제물의 하나의 실시예는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 핵산을 포함한다:
서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 15에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 14에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR2);
서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 17에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR3);
서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 21에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 20에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR5);
서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 27에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 26에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR9);
서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 31에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR13);
서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 33에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR14); 및
서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 39에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR17).
하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 핵산을 포함한다:
서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR2);
서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3);
서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR5);
서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR9);
서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산(shmiR13);
서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14); 및
서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
하나의 예에서, ddRNAi 작제물의 적어도 2개의 핵산 중 각각은 하기 서열번호: 2, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화한다. 따라서, 본 실시예에 따른 ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR3, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17로부터 선택된 2개의 shmiR을 암호화한다.
본 개시의 ddRNAi 작제물의 하나의 실시예는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 핵산을 포함한다:
서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 17에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열, 예를 들어, 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR3);
서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 31에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열, 예를 들어, 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR13);
서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 33에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열, 예를 들어, 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14); 및
서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 39에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열, 예를 들어, 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR17).
하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 핵산을 포함한다:
서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3);
서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13);
서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14); 및
서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
본 개시의 하나의 예시적인 ddRNAi 작제물은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR13); 및
(b) 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR17).
A 본 실시예에 따른 ddRNAi 작제물은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 서열번호: 64에 제시된 상기 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13); 및
(b) 서열번호: 68에 제시된 상기 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
본 개시의 또 다른 예시적인 ddRNAi 작제물은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR3); 및
(b) 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14).
본 실시예에 따른 ddRNAi 작제물은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 서열번호: 57에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR3); 및
(b) 서열번호: 65에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14).
하나의 예에서, 본원에 기재된 바와 같이 ddRNAi 작제물은 본 개시의 shmiR을 암호화하는 상기 또는 각각의 핵산에 작동가능하게 연결된 단일 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 본 개시의 shmiR을 암호화하는 각각의 핵산은 별도의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터(들)는 shmiR(들)을 암호화하는 각각의 핵산(들)의 업스트림에 위치한다.
ddRNAi 작제물이 다중 프로모터를 포함하는 실시예에 따라, 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 프로모터는 근육-특이적 프로모터, 예컨대 예를 들어, Spc512 및 CK8이다. 사용될 수 있는 다른 프로모터는 RNA pol III 프로모터, 예컨대 예를 들어, U6 및 H1 프로모터이다. 예시적인 U6 프로모터는 U6-1, U6-8 및 U6-9 프로모터이다.
본원에 기재된 바와 같이 복수의 핵산은 또한 복수의 ddRNAi 작제물의 형태로 제공되거나 이를 포함할 수 있으며, 각각은 본 개시내용의 핵산(들)에 의해 암호화되는 하나 이상의 shmiR을 발현할 수 있다. 예를 들어, 복수의 핵산 내의 각각의 핵산은 별도의 ddRNAi 작제물의 형태로 제공되거나 이를 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 복수의 ddRNAi 작제물은 적어도 2개의 ddRNAi 작제물을 포함하며, 각각은 본원에 기재된 복수의 핵산의 핵산을 포함하며, 이로써 종합해서, ddRNAi 작제물은 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사체를 표적으로 하는 적어도 2개의 shmiR을 암호화하며, 이들 각각은 서로 상이하다.
하나의 예에서, 적어도 2개의 ddRNAi 작제물 각각은 하기 서열번호: 1, 2, 4, 7, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화한다. 따라서, 본 실시예에 따른 복수의 ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17로부터 선택되는 2개의 shmiR을 총체적으로 암호화한다.
본 개시의 복수의 ddRNAi 작제물의 한 실시예는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 ddRNAi 작제물을 포함한다:
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 15에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 14에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR2);
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 17에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR3);
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 21에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 20에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR5);
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 27에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 26에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR9);
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 31에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR13);
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 33에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR14); 및
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 39에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR17).
하나의 예에서, 복수의 ddRNAi 작제물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 ddRNAi 작제물을 포함한다:
서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR2);
서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR3);
서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR5);
서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR9);
서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR13);
서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR14); 및
서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR17).
하나의 예에서, 적어도 2개의 ddRNAi 작제물 각각은 하기 서열번호: 2, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화한다. 따라서, 본 실시예에 따른 복수의 ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR3, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17로부터 선택되는 2개의 shmiR을 총체적으로 암호화한다.
본 개시의 복수의 ddRNAi 작제물의 한 실시예는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 ddRNAi 작제물을 포함한다:
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 17에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR3);
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 31에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR13);
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 33에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR14); 및
하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 39에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 및 그것과 이합체를 형성할 수 있는 예를 들어, 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR17).
하나의 예에서, 적어도 2개의 ddRNAi 작제물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR3);
서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR13);
서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR14); 및
서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR17).
본 개시의 하나의 예시적인 복수의 ddRNAi 작제물은 하기를 포함한다:
(a) 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR13); 및
(b) 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR17).
본 실시예에 따른 복수의 ddRNAi 작제물은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 서열번호: 64에 제시된 상기 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR13); 및
(b) 서열번호: 68에 제시된 상기 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR17).
본 개시의 또 다른 예시적인 복수의 ddRNAi 작제물은 하기를 포함한다:
(a) 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR3); 및
(b) 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR14).
본 실시예에 따른 복수의 ddRNAi 작제물은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 서열번호: 57에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR3); 및
(b) 서열번호: 65에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물 (shmiR14).
본원에 기재된 바와 같이 복수의 ddRNAi 작제물에서 각각의 ddRNAi 작제물은 그 안에 포함된 shmiR을 암호화된 상기 또는 각각의 핵산에 작동가능하게 연결되는 단일 프로모터를 포함한다. 복수의 ddRNAi 작제물에서 ddRNAi 작제물이 shmiR을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 경우, 각각의 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 또는 별도의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 복수의 ddRNAi 작제물을 기술하는 전술한 각각의 실시예에서, 프로모터(들)는 shmiR(들)을 암호화하는 각각의 핵산(들)의 업스트림에 위치한다.
사용될 수 있는 예시적인 프로모터는 근육-특이적 프로모터, 예컨대 예를 들어, Spc512 및 CK8이다. 사용될 수 있는 다른 프로모터는 RNA pol III 프로모터, 예컨대 예를 들어, U6 및 H1 프로모터이다. 예시적인 U6 프로모터는 U6-1, U6-8 및 U6-9 프로모터이다. 복수의 ddRNAi 작제물의 각각의 ddRNAi 작제물에 포함된 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 개시내용은 또한 하기를 포함하는 DNA 작제물을 제공한다:
(a) 본원에 기재된 바와 같이 ddRNAi 작제물; 및
(b) ddRNAi 작제물에 의해 암호화되는 shmiR(들)에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 갖는 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 PABPN1 작제물. 바람직하게, 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 그의 mRNA 전사체가 ddRNAi 작제물의 shmiR에 의해 표적화되지 않도록 코돈 최적화된다. 한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질은 예를 들어, 서열번호:74에 제시된 서열을 가지는 야생형 인간 PABPN1 단백질이다. 한 예에서 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열은 서열번호:73에 제시된다.
DNA 작제물은 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 본 개시의 DNA 작제물을 사용하기 위한 예시적인 프로모터는 근육-특이적 프로모터, 예컨대 예를 들어, Spc512 및 CK8이다.
한 실시예에 따르면, DNA 작제물은 PABPN1 작제물 및 ddRNAi 작제물에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터는 PABPN1 작제물 및 ddRNAi 작제물의 업스트림에 위치한다.
하나의 예에서, DNA 작제물은 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함한다:
(a) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512;
(b) ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 가지는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 PABPN1 작제물; 및
(c) 본원에 기재된 바와 같이 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 및 본원에 기재된 바와 같이 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물.
또 다른 예에서, 상기 DNA 작제물은 하기를 포함한다:
(a) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512;
(b) ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 가지는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 PABPN1 작제물; 및
(c) 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 및 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물.
또 다른 예에서, PABPN1 작제물 및 ddRNAi 작제물은 각각 DNA 작제물 내의 별도의 포로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, PABPN1 작제물과 작동가능하게 연결되는 프로모터는 그것에 포함된 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. ddRNAi 작제물과 작동가능하게 연결되는 상기 또는 각각 프로모터는 ddRNAi 작제물에 포함된 본 개시의 shmiR을 암호화하는 하나 이상의 핵산과 작동가능하게 연결될 것이다. 본 개시의 DNA 작제물을 사용하기 위한 예시적인 프로모터는 근육-특이적 프로모터, 예컨대 예를 들어, Spc512 및 CK8이다.
이 실시예에 따른 하나의 DNA 작제물은 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함한다:
(a) 본원에 기재된 바와 같이 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 및 본원에 기재된 바와 같이 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물의 업스트림에 위치하는 근육-특이적 프로모터 예를 들어, CK8 프로모터; 및
(b) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 가지는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본원에서 기술된 바와 같이 PABPN1 작제물의 업스트림에 위치한 Spc512 프로모터.
이 실시예에 따른 또 다른 DNA 작제물은 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함한다:
(a) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 및 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물의 업스트림에 위치한 CK8 프로모터; 및
(b) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 가지는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본원에서 기술된 바와 같이 PABPN1 작제물의 업스트림에 위치한 Spc512 프로모터.
본 개시의 DNA 작제물에 포함시키기 위한 shmiR13 및 shmiR17을 암호화하는 예시적인 ddRNAi 작제물은 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 31에 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13), 및 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 39에 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17)을 포함할 수 있다. 예를 들어, DNA 작제물의 이러한 예에 따른 ddRNAi 작제물은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13), 및 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17)을 포함할 수 있다.
본 개시의 DNA 작제물에 포함시키기 위한 shmiR3 및 shmiR14를 암호화하는 예시적인 ddRNAi 작제물은 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 및 서열번호:17에 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호:16에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3), 및 서열번호:33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호:33에 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호:34에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR14)을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, DNA 작제물의 이러한 예에 따른 ddRNAi 작제물은 서열번호:57에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3), 및 서열번호:65에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14)을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시의 ddRNAi 작제물, 또는 본 개시의 복수의 ddRNAi 작제물 또는 본 개시의 DNA 작제물을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 각각이 본개시의 ddRNAi 작제물을 포함하는 복수의 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 복수의 발현 벡터는 본원에 개시된 복수의 ddRNAi 작제물을 포함한다. 또 다른 예에서, 복수의 발현 벡터에서 각각의 발현 벡터는 본원에 개시된 복수의 ddRNAi 작제물을 포함한다. 추가의 예에서, 복수의 발현 벡터에서 각각의 발현 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 단일 ddRNAi 작제물을 포함한다. 본 단락의 전술한 방법 중 임의의 것에서, 복수의 발현 벡터는 본 개시에 따른 복수의 shmiR을 총체적으로 발현할 수 있다.
본 개시내용은 또한 하기를 포함하는 복수의 발현 벡터를 제공한다:
(a) 본 개시의 하나 이상의 ddRNAi 작제물을 포함하는 발현 벡터; 및
(b) ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR(들)에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 갖는 기능적 PABPN1 단백질을 암화화하는 DNA 서열을 포함하는 PABPN1 작제물을 포함하는 발현 벡터.
바람직하게, 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 그의 mRNA 전사체가 ddRNAi 작제물의 shmiR에 의해 표적화되지 않도록 코돈 최적화된다. 한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질은 예를 들어, 서열번호:74에 제시된 서열을 가지는 야생형 인간 PABPN1 단백질이다. 하나의 예에서, 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열은 서열번호: 73에 제시된다.
하나의 예에서, 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 PABPN1 작제물 내에 포함되고 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 암호화하는 DNA 서열의 업스트림에 위치되는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 예에서, PAPBN1 작제물을 포함하는 발현 벡터는 PABPN1 작제물의 업스트림 및 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 본 개시의 발현 벡터(들)에서 사용하기 위한 예시적인 프로모터는 근육-특이적 프로모터, 예컨대 예를 들어, Spc512 및 CK8이다.
하나의 예에서, 상기 또는 각각의 발현 벡터는 플라스미드 또는 미니서클이다.
하나의 예에서, 플라스미드 또는 미니서클 또는 발현 벡터 또는 ddRNAi 작제물은 양이온성 DNA 결합 중합체 예를 들어, 폴리에틸렌이민과의 복합체화된다.
또 다른 예에서, 상기 또는 각각의 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 (AdV) 및 렌티바이러스 (LV) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같이 ddRNAi 작제물 및/또는 복수의 ddRNAi 작제물 및/또는 발현 벡터 및/또는 복수의 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 예에서, 조성물은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 개체에서 OPMD의 원인인 PABPN1 단백질의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 작제물, 복수의 ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 또는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 OPMD로 고통받는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 작제물, 복수의 ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 또는 조성물을 갸체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 복수의 발현 벡터를 함께, 동시에 또는 연속적으로 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 하기를 포함하는 키트를 제공한다:
(a) OPMD의 원인인 PABPN1 단백질의 발현을 억제하기 위한 하나 이상의 제제로서, 상기 제제(들)은 본원에 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 작제물, 복수의 ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 또는 조성물로부터 선택되는, 하나 이상의 제제; 및
(b) (a)에서 제제에 의해 발현된 shmiR에 의해 표적화하지 않는 mRNA 전사체를 갖는 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
바람직하게, 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 그의 mRNA 전사체가 (a)에서 제제에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않도록 코돈 최적화된다. 한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질은 예를 들어, 서열번호: 74에 제시된 서열을 가지는 야생형 인간 PABPN1 단백질이다. 하나의 예에서, 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열 서열번호: 73에 제시된다.
기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 (b)에서 발현 벡터 내에 포함되고 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 업스트림에 위치한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. (b)에서 발현 벡터에서 사용하기 위한 예시적인 프로모터는 근육-특이적 프로모터, 예컨대 예를 들어, Spc512 또는 CK8 프로모터이다.
본 개시내용은 또한 별도의 성분으로 포장된 본원에 기재된 복수의 발현 벡터를 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 개시의 방법에 사용하기 위한 지침서로 포장된, 본원에 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 작제물, 복수의 ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 바와 같이 키트는 본원에 기재된 방법에 따라 OPMD를 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
본 개시내용은 또한 예를 들어, 개체에 OPMD를 치료하기 위한 것 및/또는 본원에 기재된 방법에서 의약의 제조에 있어서의 본원에 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 작제물, 복수의 ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 및/또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 작제물, 복수의 ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 및/또는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 핵산, 복수의 핵산, ddRNAi 작제물, 복수의 ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 조성물은 OPMD로부터 고통받거나 당해 질병의 성향이 있고/있거나 본원에 개시된 방법에서 당해 질병을 치료하기 위한 용도일 수 있다.
도 1은 5' 측접 영역, siRNA 센스 가닥; 스템/루프 접합 서열, siRNA 안티센스 가닥, 및 3' 측접 영역을 포함하는 대표적 shmiR 작제물의 예측된 2차 구조를 보여준다.
도 2는 HEK293 세포에서 psilencer 대조군에 비해 shmiR2-17로 명명된 shmiR의 안티센스 및 센스 서열을 가지는 shmiR의 wtPABPN1 억제 활성을 보여준다. 이 그래프는 shmiR11를 제외한 모든 shmiR이 wtPABPN1 루시페라아제 수용체로부터의 루시페라아제 발현 수준을 하향조절하였음을 보여준다.
도 3은 HEK293 세포에서 psilencer 대조군에 비해 shmiR 2-17로 명명된 shmiR의 안티센스 및 센스 서열을 가지는 shmiR의 optPABPN1 억제 활성을 보여준다. 이 그래프는 optPABPBN1 루시페라아제 수용체로부터의 발현의 하향조절이 없음을 보여준다.
도 4(a)는 shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14, shmiR16 또는 shmiR17을 암호화하는 플라스미드로 형질주입된 HEK293T 세포에서 발현된 Hsp90 단백질에 비해 FLAG-태그된 wtPABPN1 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블랏이다. 이는 선택된 shmiR 모두가 wtPABPN1의 발현을 낙다운(knocked down)시켰음을 나타낸다.
도 4(b)는 HEK293 세포에서 psilencer 대조군에 비해 FLAG-태그된 wtPABPN1 단백질의 억제 백분율을 보여준다. 이 그래프는 도 4(a)에서 웨스턴 블랏의 농도 분석에 의해 측정된 바와 같이, 선택된 shmiR 모두가 90% 초과의 억제 백분율로 wtPABPN1의 발현을 낙다운시켰음을 보여준다.
도 5(a)는 shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14, shmiR16 또는 shmiR17을 암호화하는 shmiR 플라스미드로 형질주입된 HEK293T 세포에서 발현된 Hsp90 단백질에 비해 FLAG-태그된 코돈 최적화된 PABPN1 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블랏이다. 이는 shmiR 중 어느 것도 코돈-최적화된 PABPN1 작제물의 발현 생성물의 억제를 초래하지 않았음을 나타낸다.
도 5(b)는 HEK293 세포에서 psilencer 대조군에 비해 FLAG-태그된 코돈 최적화된 PABPN1 단백질의 억제 백분율을 보여준다. 이 그래프는 도 5(a)에서 웨스턴 블랏의 농도 분석에 의해 측정된 바와 같이, shmiR 중 어느 것도 코돈-최적화된 PABPN1 작제물의 발현 생성물의 억제를 초래하지 않았음을 보여준다.
도 6은 qPCR 분석에 의해 측정된 바와 같이, shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14, shmiR16 또는 shmiR17에 의한 HEK293T 세포에서 내인성 wtPABPN1 발현의 억제 백분율을 보여준다. 이 그래프는 shmiR이 16.4% 내지 49.1%의 범위인 (평균 35.5%) 억제 백분율로 wtPABPN1의 발현을 하향조절하였음을 보여준다.
도 7은 qPCR 분석에 의해 측정된 바와 같이, shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14, shmiR16 또는 shmiR17에 의한 억제에 대하여 C2C12 세포에서 내인성 PABPN1 발현의 억제 백분율을 보여준다. 그래프는 shmiR 16 (43% 이하의 억제 백분율)을 제외한 모든 개별 shmiR이 psilencer 대조군에 비해 대략 80%의 평균 억제 백분율로 C2C12 세포에서 PABPN1의 발현을 하향조절하였음을 보여준다.
도 8은 qPCR 분석에 의해 측정된 바와 같이, 개별 shmiR13, shmiR17, shmiR3 및 shmiR14; shmiR17과 결합한 shmiR13 (shmiR13/17); 및 shmiR14와 결합한 shmiR3 (shmiR3/14)의 shmiR에 의한 C2C12 세포에서 PABPN1 발현의 억제 백분율을 보여준다. 이 그래프는 shmiR13/17 공동형질주입이 개별 shmiR13 및 shmiR17 각각의 92.5% 및 76.7%와 비교하여 84.4%의 PABPN1 발현의 억제 백분율을 초래하였고, shmiR3/14 공동형질주입이 개별 shmiR3 및 shmiR14 각각의 76.2% 및 80.4%와 비교하여 79.0% 억제 백분율을 초래하였음을 보여준다.
도 9는 qPCR 분석에 의해 측정된 바와 같이, 개별 shmiR13, shmiR17, shmiR3 및 shmiR14; shmiR17와 결합한 shmiR13 (shmiR13/17); 및 shmiR14와 결합한 shmiR3 (shmiR3/14)에 의한 ARPE-19 세포에서 PABPN1 발현의 억제 백분율을 보여준다. 그래프는 ARPE-19 세포에서 48 시간에서 72 시간 사이에 1.14 배 증가한 PABPN1 발현의 억제 백분율을 보여준다.
도 10(a)는 shmiR13, shmiR14 및 shmiR17로 형질주입된 C2C12 세포에서 발현된 shmiR의 총 수를 측정하는 qPCR에 의해 획득된 표준 곡선을 나타낸다.
도 10(b)는 shmiR3으로 형질주입된 C2C12 세포에서 발현된 shmiR의 총 수를 측정하는 qPCR에 의해 획득된 비선형 표준 곡선을 나타낸다.
도 11은 상기 shmiR을 발현하는 shmiR 벡터로 형질도입된 C2C12 세포에서 shmiR3, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17의 발현 수준을 보여준다.
도 12(a)는 pAAV2 벡터 백본에서 코돈 최적화된 PABPN1 전사체의 3' 비번역 영역으로 wtPABPN1을 표적으로 하는 2개의 shmiR을 서브클로닝함으로써 생성된 내인성 PABPN1의 동시 유전자 침묵(gene silence) 및 코돈 최적화된 PABPN1으로의 치환에 관한 작제물을 설명하는 도해이다.
도 12(b)는 optPABPN1의 서열 업스트림으로의 wtPABPN1을 표적으로 하는 2개의 shmiR을 서브클로닝함으로써 생성된 내인성 PABPN1의 동시 유전자 침묵 및 코돈 최적화된 PABPN1으로의 치환에 관한 작제물을 설명하는 도해이다.
도 13은 AAV9-eGFP을 주사한 후 마우스 사지에서의 생체 내(in vivo ) 형광을 나타낸다.
도 14는 pAAV2 벡터 백본에서 코돈 최적화된 PABPN1 전사체의 3' 비번역 영역으로 wtPABPN1을 표적으로 하는 2개의 shmiR(shmiR17 및 shmiR13)을 서브클로닝함으로써 생성된 내인성 PABPN1의 동시 유전자 침묵 및 코돈 최적화된 PABPN1으로의 치환을 위해 설계된 SR-작제물을 설명하는 도해이다.
도 15는 상기 침묵 및 치환 작제물 (이하 "SR-작제물")로 치료된 A17 마우스에서 PABPN1의 억제 백분율을 보여주고, 고용량 및 저용량 모두에서 달성된 PABPN1의 강력한 억제를 나타낸다.
도 16은 고용량 및 저용량 SR-작제물로 치료된 A17 마우스에서 야생형 PABPN1 (돌연변이 형태를 포함)에 비해 코돈 최적화된 PABPN1의 발현 수준을 보여준다.
도 17은 (i) 식염수로 치료된 A17 마우스, (ii) 식염수로 치료된 FvB 마우스, (iii) 고용량 및 저용량 SR-작제물로 치료된 A17 마우스로부터의 경골 전치(Tibialis anterior) (TA) 근육의 절편에서 PABPN1 및 라미닌 검출에 관한 면역형광 조직화학을 나타낸다. 고용량 및 저용량 모두에서 SR-작제물로 치료된 마우스의 근육에서 PABPN1 양성 핵내 봉입체(intranuclear inclusions, INIs)의 수가 유의적으로 감소하였다.
도 18은 (i) 식염수로 치료된 A17 마우스, (ii) 식염수로 치료된 FvB 마우스, (iii) 고용량 및 저용량 SR-작제물로 치료된 A17 마우스로부터의 경골 전치 (TA) 근육의 절편에서 INI를 함유하는 핵의 수준 (백분율로 표현됨)을 보여준다. 이 그래프는 고용량 및 저용량 모두에서 SR-작제물로의 치료는 식염수가 주입된 A17 근육과 비교하여 INI의 양이 약 10% 감소함을 보여준다.
도 19는 (i) 식염수로 치료된 A17 마우스, (ii) 식염수로 치료된 FvB 마우스, (iii) 고용량 및 저용량 SR-작제물로 치료된 A17 마우스로부터 절제된 경골 전치 (TA) 근육의 중량을 나타낸다. 이 그래프는 고용량 및 저용량 모두에서 SR-작제물로의 치료가 FvB 동물의 야생형 수준에 가깝게 근육 중량을 회복시켰음을 나타낸다. 모든 근육 측정은 주사 후 14 또는 20 주, 희생 당일에 수행되었다.
도 20은 (i) 식염수로 치료된 A17 마우스, (ii) 식염수로 치료된 FvB 마우스, (iii) 고용량 및 저용량 SR-작제물로 치료된 A17 마우스로부터 절제된 경골 전치 (TA) 근육의 등척 최대 근력을 나타낸다. 이 그래프는 고용량 및 저용량 모두에서 SR-작제물로의 치료가 FvB 야생형 동물에 비해 A17 마우스에서 언급된 감소된 강도 차이의 거의 66%를 회복시켰음을 나타낸다. 모든 근육 측정은 주사 후 14 또는 20 주, 희생 당일에 수행되었다. 통계는 A17 식염수 마우스에 비해 비쌍체 t-검정으로 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01.
서열 목록의 핵심
서열번호:1: PABPN1 mRNA 영역 2로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:2: PABPN1 mRNA 영역 3으로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:3: PABPN1 mRNA 영역 4로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:4: PABPN1 mRNA 영역 5로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:5: PABPN1 mRNA 영역 6으로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:6: PABPN1 mRNA 영역 7로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:7: PABPN1 mRNA 영역 9로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:8: PABPN1 mRNA 영역 11로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:9: PABPN1 mRNA 영역 13으로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:10: PABPN1 mRNA 영역 14로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:11: PABPN1 mRNA 영역 15로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:12: PABPN1 mRNA 영역 16으로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:13: PABPN1 mRNA 영역 17로 명명된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사체 내 영역의 RNA 서열.
서열번호:14: shmiR2로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:15: shmiR2로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:16: shmiR3으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:17: shmiR3으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:18: shmiR4로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:19: shmiR4로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:20: shmiR5로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:21: shmiR5로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:22: shmiR6으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:23: shmiR6으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:24: shmiR7로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:25: shmiR7로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:26: shmiR9로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:27: shmiR9로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:28: shmiR11로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:29: shmiR11로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:30: shmiR13으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:31: shmiR13으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:32: shmiR14로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:33: shmiR14로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열,
서열번호:34: shmiR15로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:35: shmiR15로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:36: shmiR16으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:37: shmiR16으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:38: shmiR17로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호:39: shmiR17로 명명된 shmiR에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호:40: shmiR를 위한 RNA 스템 루프 서열
서열번호:41: 상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열.
서열번호:42: 상기 전구-miRNA 백본의 3' 측접 서열
서열번호:43: shmiR2로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:44: shmiR3으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:45: shmiR4로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:46: shmiR5로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:47: shmiR6으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:48: shmiR7로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:49: shmiR9로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:50: shmiR11로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:51: shmiR13으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:52: shmiR14로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:53: shmiR15로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:54: shmiR16으로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:55: shmiR17로 명명된 shmiR에 대한 RNA 서열.
서열번호:56: shmiR2로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:57: shmiR3으로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:58: shmiR4로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:59: shmiR5로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:60: shmiR6으로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:61: shmiR7로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:62: shmiR9로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:63: shmiR11로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:64: shmiR13으로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:65: shmiR14로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:66: shmiR15로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:67: shmiR16으로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:68: shmiR17로 명명된 shmiR을 코딩하는 DNA 서열.
서열번호:69: Spc512의 조절 하에 근육 특이적 CK8 프로모터 및 코돈 최적화된 PABPN1의 조절 하에 shmiR3 및 shmiR14에 대한 이중 작제물 버전 1 코딩을 위한 DNA 서열
서열번호:70: Spc512의 조절 하에 근육 특이적 CK8 프로모터 및 코돈 최적화된 PABPN1의 조절 하에 shmiR17 및 shmiR13에 대한 이중 작제물 버전 1 코딩을 위한 DNA 서열
서열번호:71: Spc512의 조절 하에 shmiR3 및 shmiR14로 명명된 coPABPN1 및 shmiR에 대한 이중 작제물 버전 2 코딩을 위한 DNA 서열.
서열번호:72: Spc512의 조절 하에 shmiR17 및 shmiR13로 명명된 coPABPN1 및 shmiR에 대한 이중 작제물 버전 2 코딩을 위한 DNA 서열.
서열번호:73 인간 코돈-최적화된 PABPN1 cDNA 서열에 대한 DNA 서열.
서열번호:74 코돈-최적화된 인간 PABPN1 단백질의 아미노산 서열.
서열번호:75 FLAG-태그를 갖는 야생형 인간 PABPN1 단백질의 아미노산 서열.
서열번호:76 FLAG-태그를 갖는 코돈-최적화된 인간 PABPN1 단백질의 아미노산 서열.
서열번호:77 wtPABPN1-Fwd로 명명된 프라이머에 대한 DNA 서열
서열번호:78 wtPABPN1-Rev로 명명된 프라이머에 대한 DNA 서열
서열번호:79 wtPABPN1-프로브로 명명된 프로브에 대한 DNA 서열
서열번호:80 optPABPN1-Fwd로 명명된 프라이머에 대한 DNA 서열
서열번호:81 optPABPN1-Rev로 명명된 프라이머에 대한 DNA 서열
서열번호:82 optPABPN1-프로브로 명명된 프로브에 대한 DNA 서열
서열번호:83 shmiR3-FWD로 명명된 프라이머에 대한 DNA 서열
서열번호:84 shmiR13-FWD로 명명된 프라이머에 대한 DNA 서열
서열번호:85 shmiR14-FWD로 명명된 프라이머에 대한 DNA 서열
서열번호:86 shmiR17-FWD로 명명된 프라이머에 대한 DNA 서열
상세설명
일반
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되거나 달리 문맥상 요구되지 않는 한, 단일 단계, 특성, 물질 조성, 단계 군 또는 특성 또는 물질 조성의 군에 대한 언급은 이들 단계, 특성, 물질 조성, 단계 군 특성 또는 물질 조성의 군 중 하나 또는 복수 (즉 하나 이상)를 포함할 것이다.
당업자는 본 개시가 구체적으로 기술된 것 이외의 변이 및 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 개시는 모든 이러한 변이 및 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시는 또한 본 명세서에서 언급되거나 지시된 단계, 특성, 조성물 및 화합물을 개별적으로 또는 종합적으로, 및 임의의 및 모든 조합 또는 둘 이상의 상기 단계 또는 특성을 포함한다.
본 개시는 단지 예시의 목적을 위해 의도된, 본원에서 기술된 특정 예에 의해 범위가 한정되지 않는다. 기능적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 명백하게 본 개시의 범위 이내이다.
본원의 본 개시의 임의의 예는 달리 구체적으로 명시되지 않는 한 본 개시의 임의의 다른 예에 대해 준용(mutatis mutandis)하여 적용될 것이다.
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자 중 하나에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같이 동일한 의미를 가질 것이다 (예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학).
달리 지시되지 않는 한, 본 개시에서 사용된 재조합 DNA, 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 당업자에 공지된 표준 절차이다. 이러한 기술은 하기와 같은 정보원의 문헌 전체에 걸쳐 기술되고 설명된다: 문헌[J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A.Brown (editor), Essential Molecular Biology:A Practical Approach, Volumes 1 및 2, IRL Press (1991), D.M.Glover and B.D.Hames (editors), DNA Cloning:A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), 및 F.M.Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모든 업데이트 포함), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), 및 J.E.Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지 모든 업데이트 포함)].
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 문맥상 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변이는 명시된 단계 또는 요소 또는 정수 또는 단계 또는 요소 또는 정수의 군을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 군을 배제하지 않는 것을 암시하는 것으로 이해된다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"을 의미하는 것으로 이해될 것이며 의미 또는 의미 각각 모두에 대한 명시적인 지원을 제공하게 될 것이다.
선택된 정의
"RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보-푸라노오스 모이어티의 2' 위치에 수산기를 가지는 뉴클레오티드를 의미한다. 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 정제된 RNA와 같은 단리된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 합성된 RNA, 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어 siNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 본 개시의 RNA 분자의 뉴클레오티드는 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 디옥시뉴클레오티드와 같은 비표준 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 이러한 변형된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다.
용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 분자 세포의 세포질에서 이중 가닥 RNA (dsRNA)에 의해 개시되는 유전자 발현의 RNA-의존성 침묵을 일반적으로 지칭한다. dsRNA 분자는 표적 핵산 서열의 전사 생성물을 감소시키거나 억제함으로써, 유전자를 침묵시키거나 그 유전자의 발현을 감소시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 이합체 구조를 가지고 서로 유사한 길이를 가지는 이펙터(effector) 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA 분자를 지칭한다. 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열은 단일 RNA 가닥 또는 별도의 RNA 가닥에 존재할 수 있다. "이펙터 서열" (종종 "가이드 가닥"으로 지칭됨)은 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적이고 본 경우에, 이는 PABPN1 mRNA 전사체의 영역이다. "이펙터 서열"은 또한 "안티센스 서열"로 지칭될 수 있다. "이펙터 보체 서열"은 이펙터 서열에 대해 충분히 상보적이므로 이는 이합체를 형성하기 위해 이펙터 서열에 어닐링(anneal)할 수 있다. 이와 관련하여, 이펙터 보체 서열은 표적 서열의 영역에 대해 실질적으로 상동일 것이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 용어 "이펙터 보체 서열"은 또한 "이펙터 서열의 보체" 또는 센스 서열로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이합체"는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 페어링 또는 상보적 또는 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열 사이의 안정화된 이합체를 허용하는 임의의 다른 방식에 의해 염기 쌍을 서로 형성하는, 2개의 상보적 또는 실질적으로 상보적 핵산 (예를 들어, RNA), 또는 단일-가닥 핵산 (예를 들어, RNA)의 2개의 상보적 또는 실질적으로 상보적 영역에서의 영역을 지칭한다. 이합체 영역 내에서, 100% 상보성이 요구되지 않고; 실질적인 상보성이 허용된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 실질적인 상보성은 79% 이상의 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 19개의 염기 쌍으로 이루어진 이합체 영역에서의 단일 불일치(즉, 18개의 염기 쌍 및 하나의 불일치)는 이합체 영역을 실질적으로 상보적으로 보완하는, 94.7% 상보성을 야기한다. 또 다른 예에서, 19개의 염기 쌍으로 이루어진 이합체 영역에서의 2개의 불일치 (즉, 17개의 염기 쌍 및 2개의 불일치)는 이합체 영역을 실질적으로 상보적으로 보완하는, 89.5% 상보성을 야기한다. 또 다른 예에서, 19개의 염기 쌍으로 이루어진 이합체 영역에서의 3개의 불일치 (즉, 16개의 염기 쌍 및 3개의 불일치)는 이합체 영역을 실질적으로 상보적으로 보완하는, 84.2% 상보성을 야기한다.
dsRNA는 스템 루프로 칭해지는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 연결되는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하는 이합체 영역을 가지는, 헤어핀 또는 스템 루프 구조로 제공될 수 있다. dsRNA가 헤어핀 또는 스템 루프 구조로 제공되는 경우, 이는 "헤어핀 RNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNAi 제제" 또는 "shRNA"로 지칭될 수 있다. 헤어핀 또는 스템 루프 구조에서 제공되거나 이를 생기게 하는 다른 dsRNA 분자는 1차 miRNA 전사체 (전구-miRNA) 및 전구체 마이크로RNA (pre-miRNA)를 포함한다. Pre-miRNA shRNA는 스템-루프 구조를 형성하는 1차 miRNA 전사체의 영역을 인식하고 방출하는 효소 드로샤(Drosha) 및 파샤(Pasha)의 작용에 의해 전구-miRNA로부터 천연적으로 생성될 수 있다. 대안적으로, 전구-miRNA 전사체는 천연 스템-루프 구조를 인공/재조합 스템-루프 구조로 치환하도록 조작될 수 있다. 즉, 인공/재조합 스템-루프 구조는 천연 스템-루프 구조가 결여된 전구-miRNA 백본 서열로 삽입되거나 복제될 수 있다. 전구-miRNA 분자의 일부로서 발현되도록 조작된 스템루프 서열의 경우, 드로샤 및 파샤는 인공 shRNA를 인식하고 방출한다. 이러한 접근법을 사용하여 생산된 dsRNA 분자는 "shmiRNA", "shmiR" 또는 "마이크로RNA 프레임워크 shRNA"로 알려져 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 관한 용어 "상보적"은 구아닌 (G)은 사이토신 (C)과의 쌍, 및 아데닌 (A)은 우라실 (U) 또는 티민 (T)과의 쌍인 왓슨-크릭 염기 페어링에 의한 서열의 보체를 지칭한다. 서열은 또 다른 서열의 전체 길이에 대해 상보적일 수 있거나, 또 다른 서열의 부분 또는 길이에 상보적일 수 있다. 당업자는 U는 RNA에 존재할 수 있고, T는 DNA에 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, RNA 또는 DNA 서열 내의 A는 RNA 서열의 U 또는 DNA 서열의 T와 쌍을 이룰 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 상보적"은 핵산 서열 사이 예를 들어, 이펙터 서열과 이펙터 보체 서열 사이 또는 이펙터 서열과 표적 서열 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 정도의 상보성 또는 정확한 페어링을 지시하기 위해 사용된다. 핵산의 서열은 그의 표적 또는 보체의 서열과 100% 상보적일 필요가 없다는 것이 이해된다. 이 용어는 돌출부(overhang)을 제외하고 또 다른 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 서열은 1개 내지 2개의 불일치를 제외하고 다른 서열에 상보적이다. 일부 경우에서, 서열은 1개의 불일치를 제외하고 상보적이다. 일부 경우에서, 서열은 2개의 불일치를 제외하고 상보적이다. 다른 경우에서, 서열은 3개의 불일치를 제외하고 상보적이다. 또 다른 경우에서, 서열은 4개의 불일치를 제외하고 상보적이다.
본 개시의 shRNA 또는 shmiR의 맥락에서 사용되는 용어 "암호화된"은 DNA 주형으로부터 전사될 수 있는 shRNA 또는 shmiR을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 개시의 shRNA 또는 shmiR를 암호화하거나, 코딩하는 핵산은 각각 shRNA 또는 shmiR의 전사에 대한 주형으로서 역할을 하는 DNA 서열을 포함할 것이다.
용어 "DNA-지향 RNAi 작제물" 또는 "ddRNAi 작제물"은 전사시 RNAi를 유도하는 shRNA 또는 shmiR 분자 (바람직하게는 shmiR)를 생성하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. ddRNAi 작제물은 적어도 2개의 뉴클레오티드 즉, shRNA 또는 shmiR의 스템 루프에 의해 연결되는 이합체 영역을 가진 헤어핀 구조로 자가 어닐링이 가능한 단일 RNA로서, 또는 다중 shRNA 또는 shmiR을 가진 단일 RNA로서, 또는 각각 단일 shRNA 또는 shmiR로서 각각 폴딩될 수 있는 다중 RNA 전사체로서 전사되는 핵산을 포함할 수 있다. ddRNAi 작제물은 하나 이상의 추가 DNA 서열을 포함하는 더 큰 "DNA 작제물" 내에 제공될 수 있다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 그의 mRNA 전사체가 ddRNAi 작제물의 shmiR에 의해 표적화되지 않도록 코돈 최적화된 기능성 PABPN1 단백질을 코딩하는 추가 DNA 서열을 포함하는 DNA 작제물에 제공될 수 있다. ddRNAi 작제물 및/또는 이를 포함하는 DNA 작제물은 발현 벡터 내에 존재할 수, 예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "작동 가능한 연결" (또는 유사)은 조절 서열, 예를 들어, 프로모터에 코딩 서열의 발현을 촉진하는 방식으로 연결된, 또는 연관된 코딩 핵산 서열을 의미한다. 조절 서열은 당해 분야에서 인식되고 코딩 서열의 발현을 지시하도록 선택된 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다.
"벡터"는 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 운반체를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 벡터는 플라스미드, 파지미드(phagemid), 바이러스, 박테리아, 및 바이러스 또는 박테리아 공급원으로부터 유래한 운반체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "플라스미드"는 원형, 이중 가닥 DNA 분자이다. 본 개시에 맞게 사용하기에 유용한 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 이종 DNA 서열은 하나 이상의 바이러스 유전자 또는 그의 일부분을 결실시키기 위해 변형될 수 있는 바이러스 게놈에 삽입된다. 특정 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제가 가능하다 (예를 들어, 숙주 세포에서 기능하는 복제 원점을 가지는 벡터). 다른 벡터는 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있고, 이를 통해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터"는 본 개시의 RNA 분자를 발현 가능한 벡터를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
"기능성 PABPN1 단백질"은 야생형 PABPN1 단백질의 기능성 성질, 예를 들어, 포유류 세포에서 mRNA 폴리아데닐화 및/또는 인트론 스플라이싱 부위를 제어할 수 있는 능력을 가지는 PABPN1 단백질을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, "기능성 PABPN1 단백질"은 개체에서 발현되거나 존재하는 경우 OPMD의 원인이 아닌 PABPN1 단백질임이 이해될 것이다. 한 예에서, 본원에서 "기능성 PABPN1 단백질"에 대한 언급은 인간 야생형 PABPN1 단백질에 대한 언급이다. 인간 야생형 PABPN1 단백질의 서열은 NCBI RefSeq NP_004634에 제시된다. 따라서, 기능성 인간 PABPN1 단백질은 NCBI RefSeq NP_004634에 제시된 인간 PABPN1 단백질의 생체 내 기능성 성질을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는(treating)", "치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)" 및 이의 변이는, 임상 병리학의 과정 동안 치료되는 개인 또는 세포의 자연 과정을 변경시키도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질환(disease) 진행 속도 감소, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 차도(remission) 또는 개선된 예후를 포함한다. 결과적으로, OPMD의 치료는 개체에서 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 감소시키는 또는 억제하는 것 및/또는 개체에서 정상 길이의 폴리알라닌 잔기를 가지는 PABPN1 단백질을 발현시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, OPMD의 치료는 개체에서 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 감소시키는 또는 억제하는 것 및/또는 개체에서 폴리알라닌 잔기의 정상 길이를 가지는 PABPN1 단백질을 발현시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 치료 결과 중 하나 이상이 달성되는 경우 개인이 성공적으로 "치료된"다.
"치료학적 유효량"은 예를 들어, 개체에서 하수증(ptosis), 연하 장애(dysphagia) 및 근육 약화를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 OPMD의 하나 이상의 증상에서의 측정 가능한 개선과 같은, OPMD 상태의 측정 가능한 개선에 영향을 주기 위해 필요한 최소 농도 또는 양이다. 본원에서 치료학적 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자, 및 개인에서 원하는 반응을 유도하는 shmiR, 이를 암호화하는 핵산, ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 능력, 및/또는 개체에서 기능성 PABPN1 단백질을 발현하는 발현 벡터의 능력에 따라 달라질 수 있다. 또한 치료학적 유효량은 단독으로 또는 개체에서 기능성 PABPN1 단백질의 발현의 치료학적으로 유익한 효과와 결합하여 OPMD의 원인으로 고려되는 PABPN1 단백질의 발현을 억제, 진정 또는 감소시키는 shmiR, 이를 암호화하는 핵산, ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 치료학적으로 유익한 효과가 더 큰, shmiR, 이를 암호화하는 핵산, ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 임의의 독성 또는 유해한 효과 중 하나이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "개체" 또는 "환자"는 OPMD를 앓고 있거나 유전적으로 OPMD에 걸리기 쉬운 즉 , OPMD의 원인이 되는 PABPN1 유전자 변이체를 보유하는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. "비인간 동물"은 유인원, 가축 (예를 들어 양, 말, 소, 돼지, 당나귀), 반려 동물 (예를 들어 개 및 고양이와 같은 애완 동물), 실험실 시험 동물 (예를 들어 마우스, 토끼, 랫트, 기니피그, 초파리, 선충(C.elegans), 제브라피쉬), 공연 동물 (예를 들어 경주마, 낙타, 그레이하운드) 또는 포획된 야생 동물일 수 있다. 한 예에서, 개체 또는 환자는 포유류이다. 한 예에서, 개체 또는 환자는 인간이다.
용어 "감소된 발현", "발현의 감소" 또는 유사한 것은 표적 유전자 예를 들어, PABPN1 유전자로부터 단백질 및/또는 mRNA 생성물의 부재 또는 수준 상 관찰 가능한 감소를 지칭한다. 감소는 절대적일 필요가 없지만, 본 개시의 shmiR, 이를 암호화하는 핵산, ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물에 의해 영향을 받은 RNAi의 결과로서 측정 가능한 또는 관찰 가능한 변화가 존재하는 것이 충분한 부분적 감소일 수 있다. 감소는 shmiR이 결여된 세포, 이를 암호화하는 핵산, ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물에 비해 표적 핵산으로부터 mRNA 및/또는 단백질 생성물의 수준 감소를 측정함으로써 측정될 수 있고, 1%, 5% 또는 10% 만큼 작거나, 절대적 즉, 100% 억제일 수 있다. 감소의 효과는 외적 성질 즉, 세포 또는 유기체의 정량적 및/또는 정성적 표현형의 조사에 의해 측정될 수 있고, 본 개시의 shmiR, 이를 암호화하는 핵산, ddRNAi 작제물, DNA 작제물, 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여 후, 세포 또는 유기체에서 expPABPN1의 핵 응집체의 양의 존재 또는 변화의 검출을 또한 포함할 수 있다.
RNAi용 제제
하나의 예에서, 본 개시내용은 쇼트 헤어핀 마이크로 RNA (shmiR)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 제공하며, 상기 shmiR은 하기를 포함한다:
길이가 적어도 17 뉴클레오티드인 이펙터 서열;
이펙터 보체 서열;
스템루프 서열; 및
1차 마이크로 RNA (전구-miRNA) 백본;
상기 이펙터 서열은 하기 서열번호 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적이다. 바람직하게, 상기 이펙터 서열은 길이가 30 뉴클레오티드 미만일 것이다. 예를 들어, 적합한 이펙터 서열은 길이가 17-29 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 특히 바람직한 예에서, 상기 이펙터 서열은 길이가 21 뉴클레오티드일 것이다. 보다 바람직하게, 상기 이펙터 서열은 길이가 21 뉴클레오티드일 것이고 상기 이펙터 보체 서열은 길이가 20 뉴클레오티드일 것이다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 12에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 12에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 12에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 12에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 12에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 12에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 shmiR은 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 4개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 3개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 2개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 하기를 함유하는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적일 수 있고 이에 대해 1개의 미스매치 염기를 함유한다. 예를 들어, 상기 이펙터 서열은 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 100% 상보적일 수 있다.
본 개시의 shmiR의 상기 이펙터 서열은 본원에 기재된 PABPN1 miRNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적이고 이에 대해 1, 2, 3 또는 4 미스매치 염기(들)을 함유하는 실시예에 따라, 미스매치(들)가 shmiR의 시드 영역 즉, 상기 이펙터 서열의 뉴클레오티드 2-8에 상응하는 영역 내에 위치하지 않는 것이 바람직하다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 14에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 14에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 15에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 15에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 14에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR2"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 16에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 16에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 17에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 17에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 16에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR3"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 18에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 18에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 19에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 19에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 19에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 18에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR4"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 20에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 20에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 21에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 21에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 20에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR5"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 22에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 22에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 23에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 23에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 23에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 22에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR6"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 24에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 24에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 25에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 25에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 25에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 24에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR7"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 26에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 26에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 27에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 27에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 26에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR9"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 28에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 28에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 29에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 29에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 29에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 28에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR11"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 30에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 30에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 31에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 31에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 30에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR13"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 32에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 32에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 33에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 33에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 32에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR14"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 34에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 34에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 35에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 35에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 35에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 34에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR15"로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 36에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 36에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 37에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 37에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 37에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 36에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR16"으로 지칭된다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다: (i) 1, 2, 3 또는 4 염기 미스매치를 제외하고는 서열번호: 38에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로서, 단 상기 이펙터 서열은 서열번호: 38에 제시된 서열로 이합체를 형성할 수 있고; 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 shmiR은 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 39에 제시된 서열에 실질적으로 상보적이고 그것과 이합체를 형성할 수 있는 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호: 39에 제시된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열은 서열번호: 38에 제시된 서열일 수 있다. 본 실시예에 따른 shmiR은 이하 "shmiR17"로 지칭된다.
본원에 기재된 임의의 실시예에서, 본 개시의 핵산에 의해 암호화된 shmiR 은 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함한다:
상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열;
상기 이펙터 보체 서열;
상기 스템루프 서열;
상기 이펙터 서열; 및
상기 전구-miRNA 백본의 3 '측접 서열.
본원에 기재된 임의의 실시예에서, 본 개시의 핵산에 의해 암호화된 shmiR 은 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함한다:
상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열;
상기 이펙터 서열;
상기 스템루프 서열;
상기 이펙터 보체 서열; 및
상기 전구-miRNA 백본의 3 '측접 서열.
적합한 루프 서열은 당 업계에 공지된 것들로부터 선택될 수 있다. 그러나, 예시적인 스템루프 서열은 서열번호: 40에 제시된다.
본 개시의 핵산에서 사용하기에 적합한 1차 마이크로 RNA (전구-miRNA 또는 전구-R) 백본은 당 업계에 공지된 것들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 전구-miRNA 백본은 전구-miR-30a 백본, 전구-miR-155 백본, 전구-miR-21 백본 및 전구-miR-136 백본으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 그러나, 상기 전구-miRNA 백본은 전구-miR-30a 백본이다. 상기 전구-miRNA 백본이 전구-miR-30a 백본인 실시예에 따라, 상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열은 서열번호: 41에 제시되고 및 상기 전구-miRNA 백본의 3' 측접 서열은 서열번호: 42에 제시된다. 따라서, 본 개시의 shmiR을 암호화하는 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 shmiR-1 내지 shmiR-16)은 서열번호: 41에 제시된 서열을 암호화하는 DNA 서열 및 서열번호: 42에 제시된 서열을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 56-68 중 임의의 하나에 제시된 서열로부터 선택된 DNA 서열을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 43에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR2)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 44에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR3)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 58에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 45에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR4)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 46에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR5)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 60에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 47에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR6)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 61에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 48에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR7)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 49에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR9)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 63에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 50에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR11)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 51에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR13)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 52에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR14)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 66에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 53에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR15)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 67에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 54에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR16)을 암호화한다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 핵산은 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 55에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR (shmiR17)을 암호화한다.
본 개시의 예시적인 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17로부터 선택된 shmiR을 암호화한다. 본원에 기재된 바와 같이 shmiR3, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17로부터 선택된 shmiRs을 암호화하는 본 개시의 핵산이 특히 바람직하다.
본 개시내용에 따른 핵산은 OPMD의 원인인 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사체의 영역에 실질적으로 상보적인 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하는 shRNA 또는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 다른 핵산과 결합되거나 조합되어 사용될 수 있음을 당업자에 의해 이해될 것이다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 하기를 포함하여 제공된다:
(a) 본원에 기재된 바와 같이적어도 하나의 핵산; 및
(b) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 핵산:
(i) 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산; 또는
(ii) 본원에 기재된 바와 같이 동종 이펙터 및 shmiR의 핵산 보체 서열을 포함하는 쇼트 헤어핀 RNA (shRNA)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산;
여기서 (a)에서 핵산에 의해 암호화된 상기 shmiR 및 (b)에서 핵산에 의해 암호화된 상기 shmiR 또는 shRNA는 상이한 이펙터 서열을 포함한다.
따라서, 하나의 예에서 본 개시의 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화하는 2 이상의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화하는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개의 핵산을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시의 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 기재된 바와 같이 동종 이펙터 및 shmiR의 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 예를 들어, shmiR2의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA2"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR3의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA3"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR4의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA4"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR5의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA5"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR6의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA6"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR7의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA7"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR9의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA9"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR11의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA11"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR13의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA13"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR14의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA14"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR15의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA15"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR16의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA16"로 지칭된다. 예를 들어, shmiR17의 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shRNA는 이하 "shRNA17"로 지칭된다.
본원에 기재된 복수의 핵산 중의 하나 이상의 핵산이 shRNA를 암호화하는 임의의 예에 따르면, shRNA는 동종 이펙터 및 상기 이펙터 보체 서열 사이에 위치한 루프 또는 스템 루프 서열을 포함할 수 있다. 적합한 루프 서열은 당 업계에 공지된 것들로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 적합한 스템 루프가 새롭게 개발될 수 있다. 하나의 예에서, shRNA를 암호화하는 본원에 기재된 복수의 핵산은 상기 이펙터 서열 및 상기 이펙터 보체 서열을 각각 암호화하는 DNA 서열 사이에 위치한 스템 루프를 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR2을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR2를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 56 에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 43에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR2), 및 (ii) shmiR3-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR3을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 44에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3), 및 (ii) shmiR2, shmiR4-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR4를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR4를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 58에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 45에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 58에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR4), 및 (ii) shmiR2, shmiR3, shmiR5-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR5를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR5를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 46에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR5), 및 (ii) shmiR2-shmiR4, shmiR6-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR6을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR6을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 60에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 서열번호: 47에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 60에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR6), 및 (ii) shmiR2-shmiR5, shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR7을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR7을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 61에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 서열번호: 48에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 61에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR7), 및 (ii) shmiR2-shmiR6, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR9를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR9를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 49에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR9), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR11을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR11을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 63에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 및 서열번호: 50에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 63에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR11), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR13을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 51에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR14-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR14를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 및 서열번호: 52에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13, shmiR15-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR15를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR15를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 66에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 및 서열번호: 53에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 66에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR15), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR14, 또는 shmiR16-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR16을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR16을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 67에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 54에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 67에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR16), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR15, 또는 shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산, 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. shmiR17을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 서열번호: 55에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산 및 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 본 개시의 적어도 하나의 다른 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 복수의 핵산은 (i) 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR16 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 복수의 핵산의임의의 예에 따라, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 2 이상의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화하는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개의 핵산을 포함할 수 있으며, 단 상기 핵산의 적어도 하나는 본 개시의 shmiR을 암호화한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 2개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 3개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 4개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 5개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 6개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 7개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 8개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 9개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, 복수의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 10개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다.
본원에 기재된 복수의 핵산 중 하나의 예에서, 핵산 중 하나는 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 적합한 핵산은 예를 들어, shmiR2에 대해 본원에 기재된다.
본원에 기재된 복수의 핵산 중 하나의 예에서, 핵산 중 하나는 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 적합한 핵산은 예를 들어, shmiR3에 대해 본원에 기재된다.
본원에 기재된 복수의 핵산 중 하나의 예에서, 핵산 중 하나는 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 적합한 핵산은 예를 들어, shmiR5에 대해 본원에 기재된다.
본원에 기재된 복수의 핵산 중 하나의 예에서, 핵산 중 하나는 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 적합한 핵산은 예를 들어, shmiR9에 대해 본원에 기재된다.
본원에 기재된 복수의 핵산 중 하나의 예에서, 핵산 중 하나는 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 적합한 핵산은 예를 들어, shmiR13에 대해 본원에 기재된다.
본원에 기재된 복수의 핵산 중 하나의 예에서, 핵산 중 하나는 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 적합한 핵산은 예를 들어, shmiR14에 대해 본원에 기재된다.
본원에 기재된 복수의 핵산 중 하나의 예에서, 핵산 중 하나는 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 적합한 핵산은 예를 들어, shmiR17에 대해 본원에 기재된다.
본 개시의 예시적인 복수의 핵산은 적어도 2개의 핵산을 포함하고, 각각은 본 개시의 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 여기서 각 shmiR은 상이한 이펙터 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 각각의 상기 적어도 두개의 핵산은 하기 서열번호: 1, 2, 4, 7, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화한다. 서열번호: 1, 2, 4, 7, 9, 10 및 13에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 본 개시의 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 상기 적어도 두개의 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 14에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR2);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 20에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR5);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 26에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR9);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14); 및
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
하나의 예에서, 각각의 상기 적어도 두개의 핵산은 하기 서열번호: 2, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화한다. 서열번호: 2, 9, 10 및 13에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 본 개시의 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 상기 적어도 두개의 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14); 및
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
하나의 예에서, 복수의 핵산은 서열번호: 10에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 핵산 및 서열번호: 13에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 복수의 핵산은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13); 및
(b) 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
본 개시의 예시적인 복수의 핵산은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13) 및 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17)을 포함한다.
하나의 예에서, 복수의 핵산은 서열번호: 2에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 핵산 및 서열번호: 9에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 복수의 핵산은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열, 예를 들어, 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3); 및
(b) 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 65에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14).
본 개시의 예시적인 복수의 핵산은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13) 및 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17)을 포함한다.
복수의 핵산이 제공되는 실시에에 따라, 2개 이상의 핵산은 동일한 폴리뉴클레오티드의 별도의 부분을 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 복수의 핵산 중 2개 이상은 각각 상이한 폴리뉴클레오티드의 부분을 형성한다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 복수의 핵산은 다수의 성분, 예를 들어, 다수의 조성물로 제공된다. 예를 들어, 복수의 핵산의 각각은 개별적으로 제공될 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 3개 이상의 핵산이 제공되는 예에서, 핵산 중 적어도 하나는 개별적으로 제공될 수 있고 2개 이상이 함께 제공될 수 있다.
일부 예에서, 본 개시내용에 따른 상기 또는 각각의 핵산은 예를 들어, shmiR 또는 shRNA의 전사체를 용이하게 하기 위해 추가 요소를 포함하거나 추가 요소와 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 핵산은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전사 종결인자 및 개시제와 같은 다른 요소는 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재된다.
대안적으로, 또는 또한, 본 개시내용에 따른 상기 또는 각각의 핵산은 예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터 내로 핵산(들)의 클로닝을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 제한 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 핵산은 본 개시의 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 서열의 업스트림 및/또는 다운스트림의 제한 부위를 포함할 수 있다. 적합한 제한 효소 인식 서열 당업자에게 공지될 것이다 그러나, 하나의 예에서, 본 개시의 핵산(들)은 5' 말단 즉, shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 서열의 업스트림에 BamH1 제한 부위 (GGATCC) 및 3' 말단 즉, shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 서열의 다운스트림에 EcoR1 제한 부위 (GAATTC)를 포함할 수 있다.
ddRNAi 작제물
하나의 예에서, 본 개시의 상기 또는 각각의 핵산은 DNA-지향 RNAi (ddRNAi) 작제물의 형태로 제공되거나 DNA-지향 RNAi (ddRNAi) 작제물에 포함된다. 따라서, 하나의 예에서, 본 개시내용은 핵산 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 개시내용은 복수의 본원에 기재된 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 개시내용은 복수의 ddRNAi 작제물을 제공하며, 각각은 본원에 기재된 바와 같은 복수의 핵산을 포함한다 (즉, 이로써 복수의 핵산 모두가 복수의 ddRNAi 작제물을 나타냄). OPMD의 원인이 되는 PABPN1의 mRNA 전사체를 표적으로하는 이펙터 서열을 포함하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 개시의 핵산을 포함한다.
ddRNAi 작제물이 본원에 기재된 복수의 핵산을 포함하는 예에 따라, 핵산의 각각은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물의 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물의 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR2를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 1에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 43에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. ddRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산을 포함할 수 있으며, 예컨대 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR3-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR2), 및 (ii) shmiR3-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR3-shmiR7, shmiR9, shmiR11 및 shmiR13-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 2에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR3을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 44에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. ddRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2, shmiR4-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3), 및 (ii) shmiR2, shmiR4-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2, shmiR4-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17으로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR4를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 3에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR4를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 58에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 45에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. ddRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2, shmiR3, shmiR5-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 58에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR4), 및 (ii) shmiR2, shmiR3, shmiR5-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2, shmiR3, shmiR5-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR5를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR5를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 46에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. ddRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 shmiR2-shmiR4, shmiR6-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR5), 및 (ii) shmiR2-shmiR4, shmiR6-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR4, shmiR6-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR6을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 5에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR6을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 60에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 47에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. ddRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2-shmiR5, shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 60에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR6), 및 (ii) shmiR2-shmiR5, shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR5, shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR7을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 6에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR7을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 61에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 48에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. ddRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2-shmiR6, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 61에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR7), 및 (ii) shmiR2-shmiR6, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR6, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR9를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR9를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 49에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. ddRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 shmiR2-shmiR7, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR9), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR7, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR11을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 8에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR11을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 63에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 50에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. ddRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2-shmiR7, shmiR9 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 63에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR11), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9 또는 shmiR13-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR7, shmiR9 또는 shmiR13-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR13을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 51에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. DdRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR14-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR14-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR14-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 10에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR14를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 52에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. DdRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13, shmiR15-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13, shmiR15-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13, shmiR15-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR15를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR15를 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 66에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 53에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. DdRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR14, 또는 shmiR16-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 66에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR15), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR14, 또는 shmiR16-shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR14, 또는 shmiR16-shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR16을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 12에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR16을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 67에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 54에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. DdRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR15, 또는 shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 67에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR16), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR15, 또는 shmiR17 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR15, 또는 shmiR17로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 서열번호: 13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 갖는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR17을 암호화하는 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 및 서열번호: 55에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. DdRNAi 작제물은 PABPN1 mRNA 전사체의 영역을 표적으로하는 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 추가의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR16 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 ddRNAi 작제물은 (i) 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17), 및 (ii) shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR16 중의 하나 또는 이들 중 임의의 것에 상응하는 shRNA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산을 포함할 수 있다. shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 또는 shmiR13-shmiR16 로 명명된 shmiR을 암호화하는 예시적인 핵산이 본원에 기술되고 본 개시의 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
본원에 기재된 바와 같은 복수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물의 임의의 예에 따라, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 2 이상의 핵산, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개의 핵산을 포함할 수 있으며, 단 상기 핵산의 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다.
하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 2개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 3개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 4개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 5개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 6개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 7개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 8개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 9개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 본원에 기재된 shmiR 또는 shRNA을 암호화하는 10개의 핵산을 포함하나, 단 상기 핵산 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 shmiR을 암호화한다.
예시적인 본 개시의 ddRNAi 작제물은 적어도 2개의 핵산을 포함하고, 각각은 본 개시의 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 여기서 각 shmiR은 상이한 이펙터 서열을 포함한다. 하나의 예에서, ddRNAi 작제물의 적어도 2개의 핵산 중 각각은 하기 서열번호: 1, 2, 4, 7, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화한다. 서열번호: 1, 2, 4, 7, 9, 10 및 13에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 본 개시의 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 ddRNAi 작제물을 기재하는 본 개시의 이 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 핵산을 포함한다:
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 14에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR2);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 20에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR5);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 26에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR9);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14); 및
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
하나의 예에서, ddRNAi 작제물의 적어도 2개의 핵산 중 각각은 하기 서열번호 :2, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화한다. 서열번호: 2, 9, 10 및 13에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 본 개시의 예시적인 핵산은 본원에 기술되고 ddRNAi 작제물을 기재하는 본 개시의 이 실시예에 준용하여 적용되어야 한다.
하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 핵산을 포함한다:
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13);
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14); 및
핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
하나의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 서열번호: 10에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 핵산, 및 서열번호: 13에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13); 및
(b) 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
예시적인 본 개시의 ddRNAi 작제물은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13) 및 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17)을 포함한다.
하나의 예에서, ddRNAi 작제물은 서열번호: 2에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 핵산 및 서열번호: 9에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, ddRNAi 작제물은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열, 예를 들어, 서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3); 및
(b) 핵산은 하기를 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호: 65에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14).
예시적인 본 개시의 ddRNAi 작제물은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13) 및 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17)을 포함한다.
본 개시의 ddRNAi 작제물을 기술하는 각각의 전술한 예에서, 그 안에 포함된 또는 각각의 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같은 ddRNAi 작제물은 예를 들어, ddRNAi 작제물로부터 하나 이상의 shmiR 및/또는 shRNA의 발현을 유도하기 위해 그 안에 포함된 또는 각각의 핵산에 작동 가능하게 연결된 단일 프로모터를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, ddRNAi 작제물에 포함된 본 개시의 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 각각의 핵산은 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
다중 프로모터가 존재하는 예에 따라, 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 작제물은 본 개시의 상이한 핵산에 작동 가능하게 연결된 각각의 카피와 동일한 프로모터의 다중 카피를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 개시의 핵산에 작동 가능하게 연결된 각각의 프로모터는 상이하다. 예를 들어, 2개의 shmiR을 암호화하는 ddRNAi 작제물에서, shmiR을 암호화하는 2개의 핵산은 상이한 프로모터에 각각 작동 가능하게 연결된다. 동등하게, ddRNAi 작제물이 하나의 shmiR 및 하나의 shRNA를 암호화하는 예에서, shmiR 및 shRNA를 암호화하는 각각의 핵산은 상이한 프로모터에 각각 작동 가능하게 연결된다.
한 예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 프로모터에 대하여 언급하는 경우, 용어 "구성적"은 특정 자극 (예를 들어, 열 충격, 화학 물질, 빛 등)의 부재 하에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 의미한다. 전형적으로, 구성적 프로모터는 실질적으로 임의의 세포 및 임의의 조직에서 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있다. 본 개시의 핵산(들)으로부터 shmiR 또는 shRNA를 전사하는데 사용되는 프로모터는 RNA 중합효소 II에 의해 제어되는 유비퀴틴, CMV, β-액틴, 히스톤 H4, EF-1α 또는 pgk 유전자에 대한 프로모터, 또는 RNA 중합효소 I에 의해 제어되는 프로모터 요소를 포함한다.
한 예에서, CMV, SV40, U1, β-액틴 또는 혼성 Pol II 프로모터와 같은 Pol II 프로모터가 사용된다. 다른 적합한 Pol II 프로모터는 당업계에 공지되어 있고 본 개시의 실시예에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, Pol II 프로모터 시스템은 효소 드로샤 및 파샤의 작용에 의해 하나 이상의 shmiR로 가공되는, 전구-miRNA를 발현하는 본 개시의 ddRNAi 작제물에서 바람직할 수 있다. Pol II 프로모터 시스템은 단일 프로모터의 제어 하에 다수의 shRNA 또는 shmiR을 암호화하는 서열을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물에서 또한 바람직할 수 있다. Pol II 프로모터 시스템은 조직 특이성이 요구되는 경우 바람직할 수 있다.
또 다른 예에서, U6 프로모터 (U6-1, U6-8, U6-9), H1 프로모터, 7SL 프로모터, 인간 Y 프로모터 (hY1, hY3, hY4 (Maraia, et al., Nucleic Acids Res 22(15):3045-52(1994)를 참조) 및 hY5 (Maraia, et al., Nucleic Acids Res 24(18):3552-59(1994)를 참조), 인간 MRP-7-2 프로모터, 아데노바이러스 VA1 프로모터, 인간 tRNA 프로모터, 또는 5s 리보솜 RNA 프로모터와 같은, RNA 중합효소 III에 의해 제어되는 프로모터가 사용된다.
본 개시의 ddRNAi 작제물에서 사용하기에 적합한 프로모터는 미국 특허 제 8,008,468 호 및 미국 특허 제 8,129,510 호에 기재되어 있다.
한 예에서, 프로모터는 RNA pol III 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6 프로모터 (예를 들어, U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터)이다. 또 다른 예에서, 프로모터는 H1 프로모터이다.
본원에서 기술된 바와 같이, 다수의 shmiR을 암호화하는, 또는 하나 이상의 shmiR 및 shRNA를 암호화하는, 본 개시의 ddRNAi 작제물의 경우, ddRNAi 작제물에서 각각의 핵산은 U6 프로모터 예를 들어, 별도의 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
한 예에서, 작제물 내 프로모터는 U6 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6-1 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6-8 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6-9 프로모터이다.
일부 예에서, 가변 강도의 프로모터가 사용된다. 예를 들어, 둘 이상의 강한 프로모터 (예를 들어 Pol III-type 프로모터)의 사용은 예를 들어, 전사에 필요한 이용 가능한 뉴클레오티드 또는 다른 세포 구성 요소의 풀을 고갈시킴으로써 세포에 부담을 줄 것이다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 여러 강한 프로모터의 사용은 세포에서 RNAi 제제 예를 들어, shmiR 또는 shRNA의 발현의 독성 수준을 유발할 수 있다. 따라서, 일부 예에서 다중-프로모터 ddRNAi 작제물 중 하나 이상의 프로모터는 작제물 중 다른 프로모터보다 약하고, 또는 작제물 중 모든 프로모터는 최대 속도 미만으로 shmiR 또는 shRNA를 발현할 수 있다. 프로모터는 다양한 분자 기술을 사용하여, 또는 다른 방법으로, 예를 들어, 더 약한 수준 또는 더 강한 전사 수준을 달성하기 위한 다양한 조절 요소의 변형을 통해 변경될 수 있다.　감소된 전사를 달성하는 하나의 수단은 프로모터 활성을 제어하는 것으로 알려진 프로모터 내 서열 요소를 변경하는 것이다. 예를 들어, 인접 서열 요소 (Proximal Sequence Element, PSE)는 인간 U6 프로모터의 활성에 영향을 주는 것으로 공지되어 있다　(see Domitrovich,　et al.,　Nucleic Acids Res　31:　2344-2352　(2003). 인간 U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터와 같은, 강한 프로모터에 존재하는 PSE 요소를 인간 U6-7 프로모터와 같은, 약한 프로모터로부터의 요소로 치환하는 것은 혼성 U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터의 활성을 감소시킨다. 본 출원서에 기재된 실시예에서 이러한 접근법이 사용되었지만, 이러한 결과를 달성하기 위한 다른 수단이 당 업계에 공지되어 있다.
본 개시의 일부 예에서 유용한 프로모터는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. 프로모터에 적용되는 용어 "조직 특이적"은 상이한 유형의 조직 (예를 들어, 간)에서 관심있는 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현의 상대적 부재 하에 특정 유형의 조직 (예를 들어, 눈 또는 근육 조직)에 대해 관심있는 핵산의 선택적 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 프로모터에 적용되는 용어 "세포 특이적"은 동일한 조직 내에 상이한 유형의 세포에서 관심있는 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현의 상대적 부재 하에 특정 유형의 세포에서 관심있는 핵산의 선택적 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 한 예에 따르면, Spc512 또는 CK8와 같은 근육 특이적 프로모터가 사용된다. 그러나, 다른 근육 특이적 프로모터가 당업계에 공지되어 있고 본 개시의 ddRNAi 작제물에서 사용하기 위한 것으로 고려된다.
한 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 본원에서 기술된 핵산에 의해 암호화되는 shmiR 또는 shRNA의 발현을 증가시키기 위해 하나 이상의 인핸서를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 개시의 실시예에서 사용하기에 적절한 인핸서는 Apo E HCR 인핸서, CMV 인핸서 (Xia et al, Nucleic Acids Res 31-17(2003)), 및 당업자에 공지된 다른 인핸서를 포함한다. 본 개시의 ddRNAi 작제물에 사용하기에 적합한 인핸서는 미국 특허 제 8,008,468호에 기재되어 있다.
추가의 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 본 개시의 shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 핵산에 연결된 전사 종결자를 포함할 수 있다. 본원에서 기술된 다수의 핵산을 포함하는 즉, 다중 shmiR 및/또는 shRNA를 암호화하는 ddRNAi 작제물의 경우, 각각의 핵산에 연결된 종결자는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, RNA pol III 프로모터가 사용된 본 개시의 ddRNAi 작제물에서, 종결자는 4개 또는 이상 또는 5개 또는 이상 또는 6개 또는 이상의 T 잔기의 연속 구간일 수 있다. 그러나, 상이한 프로모터가 사용되는 경우, 종결자는 상이할 수 있고, 종결자가 유래된 유전자의 프로모터와 일치한다. 이러한 종결자는 SV40 폴리 A, AdV VA1 유전자, 5S 리보솜 RNA 유전자, 및 인간 t-RNA에 대한 종결자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 프로모터 및 종결자 조합은 당업계에 공지되어 있고 본 개시의 ddRNAi 작제물에 사용하기 위한 것으로 고려된다.
추가적으로, RNA pol II 프로모터 및 종결자로 일반적으로 행해지는 바와 같이 프로모터 및 종결자는 혼합되고 일치될 수 있다.
한 예에서, 다수의 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물의 각각의 핵산에 사용되는 프로모터 및 종결자 조합은 구성 요소 간 DNA 재조합 사건의 가능성을 감소시키기 위해 상이하다.
본 개시의 하나의 예시적 ddRNAi 작제물은 본원에서 기술된 바와 같이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산, 및 본원에서 기술된 바와 같이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 예시적 ddRNAi 작제물은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호:64에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산, 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호:68에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물을 포함한다. 한 예에서, shmiR을 암호화하는 ddRNAi 작제물의 각각의 핵산은 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 또 다른 예에서, shmiR을 암호화하는 ddRNAi 작제물의 각각의 핵산은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 프로모터는 U6 프로모터 예를 들어, U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 프로모터는 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512 또는 CK8 프로모터일 수 있다.
shmiR13 및 shmiR17을 암호화하는 ddRNAi 작제물의 핵산이 동일한 Spc512 프로모터에 작동 가능하게 연결된 실시예에 따라, ddRNAi 작제물은 서열번호:72에 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. shmiR13 및 shmiR17을 암호화하는 ddRNAi 작제물의 핵산이 동일한 CK8 프로모터에 작동 가능하게 연결된 실시예에 따라, ddRNAi 작제물은 서열번호:70에 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시의 또 다른 예시적 ddRNAi 작제물은 본원에서 기술된 바와 같이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산, 및 본원에서 기술된 바와 같이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 예시적 ddRNAi 작제물은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호:57에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산, 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호:65에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물을 포함한다. 한 예에서, shmiR을 암호화하는 ddRNAi 작제물의 각각의 핵산은 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 또 다른 예에서, shmiR을 암호화하는 ddRNAi 작제물의 각각의 핵산은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 프로모터는 U6 프로모터 예를 들어, U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 상기 또는 각각의 프로모터는 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512 또는 CK8 프로모터일 수 있다.
shmiR3 및 shmiR14를 암호화하는 ddRNAi 작제물의 핵산이 동일한 Spc512 프로모터에 작동 가능하게 연결된 실시예에 따라, ddRNAi 작제물은 서열번호:71에 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. shmiR3 및 shmiR14를 암호화하는 ddRNAi 작제물의 핵산이 동일한 CK8 프로모터에 작동 가능하게 연결된 실시예에 따라, ddRNAi 작제물은 서열번호:69에 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
또한 다수의 ddRNAi 작제물이 제공된다. 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR을 암호화하는 다수의 핵산은 다수의 ddRNAi 작제물 내에 제공될 수 있으며, 여기서 각각의 ddRNAi 작제물은 본원에서 기술된 하나 이상의 다수의 핵산을 포함한다. shmiR을 암호화하는 핵산의 조합이 기술되었고 본 개시의 예에 준용하여 적용될 것이다. 한 예에서, 본원에서 기술된 다수의 핵산 중 각각의 핵산은 그 자체 ddRNAi 작제물 내에 제공된다.
다수의 ddRNAi 작제물이 제공되는 임의의 예에 따라, 각각의 ddRNAi 작제물은 그 안에 포함된 shmiR(들)을 암호화하는 핵산(들)에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 또한 포함할 수 있다. 한 예에서, 각각의 ddRNAi 작제물은 shmiR을 암호화하는 단일 핵산 및 이에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 복수의 ddRNAi 작제물 중 하나 이상이 shmiR을 암호화하는 둘 이상의 핵산을 포함하는 예에 따라, 하나 이상의 ddRNAi 작제물에서 각각의 핵산이 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 복수의 ddRNAi 작제물 중 하나 이상이 shmiR을 암호화하는 둘 이상의 핵산을 포함하는 또 다른 예에서, 둘 이상의 핵산은 ddRNAi 작제물에서 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
본 개시의 하나의 예시적 다수의 ddRNAi 작제물은 본원에서 기술된 바와 같이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물, 및 본원에서 기술된 바와 같이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 예시적 다수의 ddRNAi 작제물은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호:64에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물, 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호:68에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물을 포함한다. 한 예에서, 프로모터는 예를 들어, U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터로부터 선택된 U6 프로모터이다. 또 다른 예에서, 프로모터는 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512 또는 CK8 프로모터이다.
본 개시의 또 다른 예시적 다수의 ddRNAi 작제물은 본원에서 기술된 바와 같이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물, 및 본원에서 기술된 바와 같이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 예시적 다수의 ddRNAi 작제물은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호:57에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물, 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호:65에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함하는 ddRNAi 작제물을 포함한다. 한 예에서, 프로모터는 예를 들어, U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터로부터 선택된 U6 프로모터이다. 또 다른 예에서, 프로모터는 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512 또는 CK8 프로모터이다.
추가적으로, 상기 또는 각각의 ddRNAi 작제물은 프로모터, shmiR 또는 shRNA를 암호화하는 핵산 및/또는 다른 조절자 요소가 용이하게 제거되고 치환되도록 전략적으로 위치하는 하나 이상의 다중 클로닝 부위 및/또는 고유 제한 부위를 포함할 수 있다. 상기 또는 각각의 ddRNAi 작제물은 전략적으로 위치한 제한 부위 및/또는 상보적 점착성 말단을 사용하여 더 작은 올리고뉴클레오티드 구성 요소로부터 조립될 수 있다. 본 개시에 따른 하나의 접근법에 대한 기본 벡터는 모든 부위가 고유한 (이것이 절대 요구 조건이 아니지만) 다중링커를 가지는 플라스미드를 포함한다. 연속적으로, 각각의 프로모터는 하나 이상의 프로모터를 가지는 기본 카세트를 생성하는 그 지정된 고유 부위 내로 삽입되고, 이들 모두는 가변 배향을 가질 수 있다. 연속적으로, 다시, 어닐링된 프라이머 쌍은 각각의 개별 프로모터의 다운스트림의 고유 부위에 삽입되고, 단일-, 이중- 또는 다중-발현 카세트 작제물을 생성한다. 삽입체는 단일-, 이중- 또는 다중-발현 카세트 삽입체 측접에 있는 2개의 고유 제한 효소 부위 (동일한 또는 상이한 것)를 사용하여 예를 들어, AdV 백본 또는 AAV 백본으로 이동될 수 있다.
상기 또는 각각의 ddRNAi 작제물의 생성은 PCR, 올리고뉴클레오티드 합성, 제한 엔도뉴클레아제 분해, 연결, 형질전환, 플라스미드 정제, 및 DNA 시퀀싱의 표준 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 유전 공학 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 상기 또는 각각의 작제물이 바이러스 작제물인 경우, 작제물은 예를 들어, ddRNAi 작제물을 표적 세포 게놈으로 통합할 수 있게 하는 바이러스 입자 및/또는 서열로 ddRNAi 작제물을 패키징하는데 필요한 서열을 포함한다. 일부 예에서, 상기 또는 각각의 바이러스 작제물은 복제 및 바이러스의 증식을 허용하는 유전자를 추가적으로 함유하지만, 이러한 유전자는 도중에 공급될 것이다. 추가적으로, 상기 또는 각각의 바이러스 작제물은 천연 형태에 통합된 또는 변형된 임의의 공지된 유기체의 게놈으로부터의 유전자 또는 유전자 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 작제물은 박테리아에서 작제물의 복제에 유용한 서열을 포함할 수 있다.
상기 또는 각각의 작제물은 또한 추가 유전자 요소를 함유할 수 있다. 작제물에 포함될 수 있는 요소의 유형은 임의의 방법으로 제한되지 않으며 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 추가 유전자 요소는 수용체 유전자, 예를 들어 GFP 또는 RFP와 같은 형광 마커 단백질에 대한 하나 이상의 유전자; 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 루시페라아제, 베타-글루투로니다제(beta-glucuronidase), 클로람페니콜 아세틸 전이효소(chloramphenical acetyl transferase) 또는 분비된 배아 알카라인 인산가수분해효소(embryonic alkaline phosphatase)와 같은 용이하게 검정되는 효소; 또는 호르몬 또는 사이토카인과 같은 면역검정을 용이하게 이용할 수 있는 단백질을 포함할 수 있다.
본 개시의 양태에서 용도를 발견할 수 있는 다른 유전자 요소는 아데노신 탈아미노효소(adenosine deaminase), 아미노글리코시드 인산전이효소(aminoglycodic phosphotransferase), 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase), 히그로마이신-B-인산전이효소(hygromycin-B-phosphotransferase), 약물 내성과 같은 세포에서 선택적 성장 이점을 부여하는 단백질에 대한 코딩, 또는 영양요구체(auxotroph)로부터 사라진 생합성 능력을 제공하는 단백질에 대한 유전자 코딩을 포함한다. 수용체 유전자가 상기 또는 각각의 작제물과 함께 포함되는 경우, 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosomal entry site, IRES) 서열이 포함될 수 있다. 한 예에서, 추가 유전자 요소는 독립적 프로모터/인핸서에 작동 가능하게 연결되고 이에 의해 제어된다. 추가적으로 박테리아에서 작제물의 증식을 위해 적합한 복제 원점이 사용될 수 있다. 복제 원점의 서열은 일반적으로 ddRNAi 작제물 및 다른 유전자 서열로부터 분리되어 있다. 이러한 복제 원점은 당업계에 공지되어 있고 pUC, ColE1, 2-미크론 또는 SV40 복제 원점을 포함한다.
발현 벡터
한 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물은 발현 벡터 내에 포함된다.
한 예에서, 발현 벡터는 예를 들어, 당업계에 공지된 플라스미드이다. 한 예에서, 적합한 플라스미드 발현 벡터는 pAAV 벡터 예를 들어, 자가-상보적 pAAV (pscAAV) 플라스미드 벡터 또는 단일 가닥 pAAV (pssAAV) 플라스미드 벡터이다. 본원에서 기술된 바와 같이, 플라스미드는 본 개시의 하나 이상의 shmiR의 발현을 유도하기 위한 하나 이상의 프로모터 (이의 적합한 예가 기술됨)를 포함할 수 있다.
한 예에서, 발현 벡터는 소형 고리 DNA이다. 소형 고리 DNA는 하기 미국특허 공보 제 2004/0214329호에 기술되어 있다. 소형 고리 DNA는 지속적으로 높은 수준의 핵산 전사에 유용하다. 원형 벡터는 발현-침묵 박테리아 서열이 없는 것에 의해 특징지어진다. 예를 들어, 소형 고리 벡터는 복제 원점이 결여되고, 박테리아 플라스미드에서 일반적으로 발견되는 약물 선택 마커, 예를 들어 β-락타마제, tet 등이 결여되었다는 점에서 박테리아 플라스미드 벡터와 상이하다. 결과적으로, 소형 고리 DNA는 크기가 더 작고, 더욱 효율적인 전달이 가능하게 된다.
한 예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.
임의의 적절한 바이러스에 기초한 바이러스 벡터가 본 개시의 ddRNAi를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 추가적으로, 혼성 바이러스 시스템이 유용할 수 있다. 바이러스 전달 시스템의 선택은 전달을 위해 표적화된 조직, 시스템의 형질도입 효율, 병원성, 면역학적 및 독성 우려 등과 같은 다양한 매개 변수에 의존적일 수 있다.
유전자 치료법에 사용되는 바이러스 시스템의 일반적으로 사용되는 클래스는 그의 게놈이 숙주 세포 염색질에 통합되는지 (온코레트로바이러스(oncoretroviruses) 및 렌티바이러스) 또는 염색체외 에피솜으로서 세포핵에 지배적으로 유지되는지 (아데노-관련 바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스)에 따라 2개의 그룹으로 분류될 수 있다. 한 예에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 숙주 세포의 염색질에 통합된다. 또 다른 예에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 숙주 세포의 핵에 염색체외 에피솜으로 유지한다.
한 예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 (AdV) 벡터이다. 아데노바이러스는 26-48 Kbp 사이의 선형 게놈을 가진 중간 크기, 이중 가닥, 비 외피성 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스는 수용체 매개 결합 및 내재화에 의해 표적 세포로의 진입을 획득하고, 비분할 및 분할 세포 모두의 핵을 관통한다. 아데노바이러스는 생존 및 복제를 위해 숙주 세포에 크게 의존하며, 숙주의 복제 기구를 사용하여 척추 세포의 핵에서 복제할 수 있다.
한 예에서, 바이러스 벡터는 파보바이러스(Parvoviridae) 패밀리로부터 유래한다. 파보바이러스는 대략 5000 뉴클레오티드 길이의 게놈을 가진 작은 단일 가닥, 비 외피성 DNA 바이러스의 패밀리이다. 패밀리 구성원 중에 아데노-관련 바이러스 (AAV)가 포함된다. 한 예에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 AAV이다. AAV는 생산적인 감염 사이클을 개시하고 지속하기 위해 또 다른 바이러스 (전형적으로 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)와의 동시 감염을 일반적으로 필요로 하는 의존성 파보바이러스이다. 이러한 헬퍼 바이러스가 부재인 경우, AAV는 수용체 매개 결합 및 내재화에 의해 표적 세포를 감염시키거나 형질도입할 능력이 여전히 있으며, 비분할 및 분할 세포 모두에서 핵을 관통한다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에 AAV 감염으로부터 후대 바이러스가 생산되지 않기 때문에, 형질도입의 정도는 바이러스에 의해 감염된 초기 세포로 제한된다. 이러한 특성이 AAV를 본 개시에 대한 바람직한 벡터로 만드는 것이다. 게다가, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 헤르페스 단순 포진 바이러스와 다르게, AAV는 인간병원성 및 독성이 결여된 것으로 보인다 (Kay, et al., Nature. 424:251 (2003)). 게놈은 정상적으로 2개의 유전자 만을 암호화하기 때문에, 전달 운반체로서, AAV가 4.5 단일 가닥 킬로베이스 (kb)의 패키징(packaging) 용량에 의해 제한된다는 것은 놀랍지 않다. 그러나, 이러한 크기 제한은 치환 유전자 요법을 위해 전달될 수 있는 유전자를 제한할 수 있지만, shmiR 및 shRNA와 같은 짧은 서열의 패키징 및 발현에 부정적으로 영향을 미치지 않는다.
본 개시의 ddRNAi 작제물과 함께 유용한 또 다른 바이러스 전달 시스템은 레트로바이러스 패밀리의 바이러스에 기초한 시스템이다. 레트로바이러스는 2개의 고유 특성에 의해 특징지어지는 단일 가닥 RNA 동물 바이러스를 포함한다. 첫째, 레트로바이러스의 게놈은 2배체이며, RNA의 2개의 카피로 이루어진다. 둘째, 이 RNA는 비리온-관련 효소 역전사효소에 의해 이중 가닥 DNA로 전사된다. 이 이중 가닥 DNA 또는 프로바이러스는 숙주 게놈에 통합될 수 있으며 숙주 게놈의 안정적으로 통합된 구성 요소로서 부모 세포에서 후대 세포로 전달될 수 있다.
일부 예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 종종 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스 당단백질 (VSV-G)와 위형화(pseudotyped)되고, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV); 양에서 뇌염(encephalitis) (비스나(visna)) 또는 폐렴(pneumonia)을 초래하는 비스나-메디(visan-maedi); 말에서 자가면역용혈빈혈(autoimmune hemolytic anemia) 및 뇌병증(encephalopathy)을 초래하는 말 전염성 빈혈(equine infectious anemia) 바이러스 (EIAV); 고양이에서 면역 결핍을 초래하는 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소에서 림프샘장애(lymphadenopathy) 및 림프구증가증(lymphocytosis)을 초래하는 소 면역결핍 바이러스 (BIV); 및 비인간 영장류에서 면역 결핍 및 뇌병증을 초래하는 원숭이(simian) 면역결핍 바이러스 (SIV)로부터 유래한다. HIV에 기초한 벡터는 일반적으로 부모 게놈의 5% 미만을 유지하고, 게놈의 25% 미만이 회귀 복제-가능 HIV의 생성 가능성을 최소화하는 패키징 작제물에 통합된다. 생물학적 안전성은 벡터 유동화에 필요한 패키징 신호의 전사를 제거하는, 다운스트림 긴 말단 반복 서열에서 조절 요소의 결실을 함유하는 자가 불활성화 벡터의 발달에 의해 더욱 증가되었다. 렌티바이러스 벡터 사용에 대한 주요 이점 중 하나는 형질도입된 세포의 세포 분할 이후에도 대부분의 조직 또는 세포 유형에서 유전자 도입이 지속된다는 것이다.
핵산 및 본 개시의 ddRNAi 작제물로부터 shmiR 및/또는 shRNA를 발현하는데 사용되는 렌티바이러스 기반 작제물은 렌티바이러스의 5' 및 3' 긴 말단 반복 서열(LTR)로부터의 서열을 포함한다. 한 예에서, 바이러스 작제물은 렌티바이러스로부터의 불활성화 또는 자가 불활성화 3' LTR을 포함한다. 3' LTR은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 자가 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 3' LTR의 U3 요소는 그의 인핸서 서열, 예를 들어, TATA 박스, Sp1 및 NF-kappa B 부위의 결실을 함유한다. 자가 불활성화 3' LTR의 결과로서, 숙주 게놈에 통합된 프로바이러스는 불활성화된 5' LTR을 포함할 것이다. LTR 서열은 임의의 종으로부터의 임의의 렌티바이러스로부터의 LTR 서열일 수 있다. 렌티바이러스 기반 작제물은 MMLV 또는 MSCV, RSV 또는 포유류 유전자에 대한 서열을 또한 통합할 수 있다. 추가적으로, 렌티바이러스 5' LTR로부터의 U3 서열은 바이러스 작제물의 프로모터 서열로 치환될 수 있다. 이는 패키징 세포주로부터 회수된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열이 또한 포함될 수 있다.
당업자에 공지된 다른 바이러스 또는 비 바이러스 시스템이 유전자-결실된 아데노바이러스-트랜스포존 벡터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 관심있는 세포에 본 발명의 ddRNAi 또는 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다 (Yant, et al., Nature Biotech.20:999-1004 (2002)를 참조); 신드비스 바이러스 또는 샘리키 산림열 바이러스로부터 유래된 시스템 (Perri, et al, J. Virol .74(20):9802-07 (2002)를 참조); 뉴캐슬 질환 바이러스 또는 센다이 바이러스로부터 유래한 시스템.
본 개시의 shmiR 또는 ddRNAi 작제물의 시험
세포 배양 모델
OPMD에 대한 세포 배양 모델로서 유용한 세포주의 예는 후자가 OPMD의 특징인, 정상 Ala10-인간PABPN1-FLAG (Ala10) 또는 돌연변이 Ala17-인간PABPN1-FLAG (Ala17)를 발현하는 벡터로 형질주입된 HEK293T 세포주 (HEK293T, ATCC, Manassas, USA)이다.
OPMD에 대한 세포 배양 모델로서 유용한 세포주의 추가 예는 예를 들어, 실시예 5에 기술된 바와 같은, ARPE-19 인간 망막 세포 및 C2C12 마우스 근육 세포이다.
OPMD에 대한 세포 배양 모델로서 유용한 세포주의 또 다른 예는 정상 Ala10-인간PABPN1-FLAG (Ala10) 또는 돌연변이 Ala17-인간PABPN1-FLAG (Ala17)를 발현하도록 안정적으로 형질주입된 1차 마우스 근아세포 (IM2) 세포주이다. 돌연변이 Ala17-인간PABPN1-FLAG (Ala17)를 안정적으로 발현하는 예시적 IM2 유래 세포주는 H2kB-D7e 세포주이다. H2kB-D7e 세포주는 또한 Raz et al., (2011) American Journal of Pathology,179(4):1988-2000에 기술되어 있다.
OPMD의 세포 배양 모델에 대해 적합한 다른 세포주는 당업계에 공지되었고, 예를 들어 Fan et al., (2001) Human Molecular Genetics, 10:2341-2351, Bao et al., (2002) The Journal of Biological Chemistry, 277:12263-12269, 및 Abu-Baker et al., (2003) Human Molecular Genetics ,12:2609-2623에 기술되어 있다.
본원에서 예시된 바와 같이, 본 개시의 shmiR의 활성은 shmiR을 암호화하는 핵산, 또는 이를 포함하는 ddRNAi 작제물 또는 발현 벡터를 세포에 투여하고 그 후에 PABPN1 유전자에 의해 암호화되는 RNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 측정된다. 예를 들어, PABPN1에 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 사용하여, 엄격한 조건 하에 RT-PCR, 정량적 PCR, 반정량적 PCR, 또는 제자리(in-situ)혼성화 중 임의의 하나 이상에 의해 세포내 PABPN1 유전자 발현을 검정할 수 있다. PABPN1 mRNA 또는 DNA는 PABPN1 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있는 PABPN1에 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 사용하여 PCR 또는 ELISA에 의해 또한 검정될 수 있다.
PABPN1 발현을 검출하기 위한 RT-PCR, 정량적 PCR 또는 반정량적 PCR 기술에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 공지되어 있고 시판 (Thermo Fisher)되고 있다. 그러나, PCR 기반 검출 방법에 유용한 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 방법 및/또는 소프트웨어를 사용하여 PABPN1에 대해 이용 가능한 서열 정보에 기초하여 설계될 수 있다. 한 예에서, PABPN1 mRNA의 존재 또는 부재는 당업계에 공지된 표준 방법론을 사용하는 RT-PCR을 사용하여 검출될 수 있다. 한 예에서, PABPN1 폴리펩티드 또는 단백질의 존재 또는 부재 또는 상대적 양은 당업계에서 이용 가능한 웨스턴 블로팅, ELISA, 또는 다른 표준 정량적 또는 반정량적 기술, 또는 그러한 기술의 조합 중 임의의 하나 이상을 사용하여 검출될 수 있다. PABPN1의 항체 인식에 의존하는 기술이 고려되고, 본원에서 예를 들어, 실시예 4에 기술된다. 한 예에서, PABPN1 폴리펩티드의 존재 또는 부재 또는 상대적 존재도는 PABPN1 폴리펩티드의 전기영동 분해능과 조합된 PABPN1 폴리펩티드의 항체 포획을 포함하는 기술, 예를 들어 Isonostic™ 검정 (Target Discovery, Inc.)를 사용하여 검출될 수 있다. 항체는 PABPN1 단백질에 대해 시판된다.
형질주입 또는 형질도입 효율 및 시료 회수의 차이를 정규화하기 위한 다양한 수단이 당업계에 공지되어 있다.
PABPN1에 의해 암호화되는 mRNA 발현 또는 단백질의 수준 또는 본 개시의 RNA의 부재 하 PABPN1 단백질의 핵 응집체의 양에 비해, PABPN1에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질의 발현을 감소시키는 또는 PABPN1 단백질의 핵 응집체의 존재를 감소시키는 본 개시의 핵산, ddRNAi 작제물 또는 발현 벡터는 예를 들어, 내인성 PABPN1의 발현을 감소시킴으로써 및 본원에서 기술된 바와 같이 OPMD의 원인이 아닌 PABPN1 단백질을 내인성 PABPN1의 전부 또는 일부로 치환함으로써 OPMD를 치료하는 치료적 적용에 유용한 것으로 간주된다.
동물 모델
OPMD를 연구하기 위해 이용 가능한 여러 소동물 모델이 존재하고, 이의 예는 문헌[Uyama et al., (2005) Acta Myologica, 24(2):84-88 및 Chartier and Simonelig (2013) Drug Discovery Today: technologies, 10:e103-107]에 기술되어 있다. 예시적 동물 모델은 문헌[Davies et al., (2005) Nature Medicine, 11:672-677 및 Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics, 19(11):2191-2207]에 이전에 기술된 A17.1 유전자이식 마우스 모델이다.
전술한 동물 모델 중 임의의 것이 PABPN1 유전자에 의해 암호화되는 RNA 또는 단백질의 발현을 낙다운시키는, 감소시키는 또는 억제하는 본 개시의 shmiR 또는 ddRNAi 작제물의 효능을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
PABPN1 유전자 발현을 검정하는 방법은 세포 모델과 관련하여 본원에서 기술되어 있으며 본 개시의 실시예에 대해 준용하여 적용될 것이다.
기능성 PABPN1의 치환을 위한 제제
한 예에서, 본 개시는 기능성 PABPN1 단백질을 예를 들어, 세포 또는 동물에 대해 치환하기 위한 제제를 제공한다. 기능성 PABPN1 단백질은 OPMD의 원인이 되지 않을 것이며, 본 개시의 shmiR(들) 또는 shRNA(들)에 의해 표적화되는 mRNA 전사체에 의해 암호화되지 않을 것이다.
한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 세포 또는 동물에 대해 치환하기 위한 제제는 핵산 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 또는 cDNA이다. 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산은 코돈 최적화 예를 들어, 야생형 PABPN1 핵산에 비해 하나 이상의 변성 또는 동요(wobble) 염기를 함유하지만 동일한 아미노산을 암호화하여, 기능성 PABPN1 단백질에 대한 상응하는 mRNA 서열 코딩이 본 개시의 shmiR(들) 또는 shRNA(들)에 의해 인식되지 않을 것이다. 예를 들어, 코돈 최적화된 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산은 본 개시의 shmiR(들) 또는 shRNA(들)에 의해 표적화된 영역 내 야생형 PABPN1 핵산에 비해 하나 이상의 변성 또는 동요 염기를 포함할 수 있다. 한 예에서, 하나 이상의 변성 또는 동요 염기는 본 개시의 shmiR 또는 shRNA의 이펙터 서열의 시드 영역 내에 존재한다.
한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산은 코돈 최적화되어 상응하는 mRNA 서열이 본 개시의 shmiR(들) 또는 shRNA(들)에 의해 인식되지 않는다. 바람직하게는, 코돈 최적화된 핵산 서열에 의해 암호화된 기능성 PABPN1 단백질은 서열번호:74에 제시된 아미노산 서열 즉, 야생형 인간 PABPN1 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 당업자는 다수의 뉴클레오티드 서열 조합이 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는데 사용될 수 있고, 뉴클레오티드 서열의 선택이 궁극적으로 shmiR(들) 또는 shRNA(들)의 이펙터 서열에 의존할 것 즉, 코돈-최적화된 핵산이 shmiR(들) 또는 shRNA(들)에 의해 인식되지 않을 것이라는 것을 인정할 것이다. 한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질의 치환을 위한 제제는 서열번호:73.한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산은 또한 코작(Kozak)) 서열을 포함할 수 있다.
한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 핵산은 기능성 PABPN1 단백질의 발현에 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 조직 또는 눈 또는 근육에서 기능성 PABPN1 단백질의 발현에 적합한 프로모터가 특히 적합할 수 있다. 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산과 사용하기에 적합한 하나의 예시적 프로모터는 Spc512 프로모터이다. 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산과 사용하기에 적합한 또 다른 예시적 프로모터는 CK8 프로모터이다. 그러나, 당업계에 공지된 임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산과 사용하기에 적합한 다른 프로모터는 US 20110212529 A1에 기술되어 있다.
본원에서 기술된 바와 같이, 본 개시의 일부 예에서 유용한 프로모터는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다.
한 예에서, 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산은 기능성 PABPN1 단백질 및 이의 상응하는 mRNA 전사체의 발현을 증가시키는 하나 이상의 인핸서를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 개시의 이러한 예에서 사용하기에 적절한 인핸서는 당업자에게 공지될 것이다.
기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 예시적 발현 벡터는 본 개시의 핵산 및 ddRNAi 작제물의 맥락에서 기술되었으며 이러한 예에 대해 준용하여 적용될 것이다.
따라서, 한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 세포 또는 동물에 대해 치환하기 위한 제제는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 발현 벡터는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 핵산 및 예를 들어, SpC512 프로모터 또는 CK8 프로모터에 대한 발현 프로모터를 포함할 수 있다. 한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산은 또한 코작 서열을 포함할 수 있다.
한 예에서, 본원에서 기술된 바와 같이 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산은 플라스미드 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 적합한 플라스미드 발현 벡터는 본원에서 기술되었고, 당업계에 공지될 것이다. 한 예에서, 적합한 플라스미드 발현 벡터는 pAAV 벡터 예를 들어, pscAAV 플라스미드 벡터 또는 pssAAV 플라스미드 벡터이다.
한 예에서, 발현 벡터는 소형 고리 DNA이다. 소형 고리 DNA 벡터는 본원에서 기술되어 있다.
한 예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 임의의 적절한 바이러스에 기초한 바이러스 벡터는 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 혼성 바이러스 시스템이 유용할 수 있다. 바이러스 전달 시스템의 선택은 전달을 위해 표적화된 조직, 시스템의 형질도입 효율, 병원성, 면역학적 및 독성 우려 등과 같은 다양한 매개 변수에 의존적일 수 있다.
세포 또는 동물에 대한 유전자 물질의 전달을 위한 예시적 바이러스 시스템은 본 개시의 RNA 및 ddRNAi 작제물의 맥락에서 기술되었고 이러한 예에 대해 준용하여 적용될 것이다.
한 예에서, 바이러스 벡터는 AAV이다.
한 예에서, 바이러스 벡터는 AdV 벡터이다.
한 예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다.
유전자-결실된 아데노바이러스-트랜스포존 벡터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 당업자에 공지된 다른 바이러스 또는 비바이러스 시스템이 관심있는 세포에 대해 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다 (Yant, et al., Nature Biotech.20:999-1004 (2002)를 참조); 신드비스 바이러스 또는 샘리키 산림열 바이러스로부터 유래된 시스템 (Perri, et al, J. Virol .74(20):9802-07 (2002)를 참조); 뉴캐슬 질환 바이러스 또는 센다이 바이러스로부터 유래한 시스템.
본원에서 기술된 바와 같이 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산이 본 개시의 핵산, ddRNAi 작제물 또는 발현 벡터와 함께 제공되는 예에 따라, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산은 핵산 또는 ddRNAi 작제물로서 동일한 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 따라서, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 및 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 작제물은 예를 들어, 발현 벡터 내에 단일 DNA 작제물로서 제공될 수 있다.
본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 및 본 개시의 핵산 또는 ddRNAi 작제물이 함께 제공되는 대안 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 및 핵산 또는 ddRNAi 작제물은 상이한 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 및 핵산 또는 ddRNAi 작제물이 상이한 발현 벡터 내에 포함되는 경우, 각각의 발현 벡터는 동일한 유형의 벡터 또는 상이한 유형의 벡터일 수 있다.
기능성 PABPN1의 시험
세포 배양 모델
OPMD의 예시적 세포 배양 모델은 실시예 예를 들어, 실시예 4 및 5를 포함하여 본원에서 기술되어 있다. OPMD의 이러한 세포 배양 모델은 내인성 PABPN1을 표적으로 하는 본 개시의 shmiR을 암호화하는 하나 이상의 핵산의 존재 하에 기능성 PABPN1 단백질을 치환하는 본 개시의 제제의 능력을 평가하는데 사용될 수 있다.
PABPN1 단백질의 존재 또는 부재 또는 상대적 양을 검출하는 예시적 방법이 또한 기술되어 있고 이러한 예에 대해 준용하여 적용된다. 예를 들어, PABPN1 단백질의 존재 또는 부재 또는 상대적 양은 당업계에 이용 가능한 웨스턴 블로팅, ELISA, 또는 다른 표준 정량적 또는 반정량적 기술, 또는 그러한 기술의 조합 중 임의의 하나 이상을 사용하여 검출될 수 있다. PABPN1의 항체 인식에 의존하는 기술이 고려되고 본원에서 기술된다. 돌연변이 및 기능성 PABPN1 단백질은 시판되는 적절한 항체를 사용하여 돌연변이 및 기능성 PABPN1 단백질의 분별 검출을 용이하게 하는 적절한 단백질 태그 예를 들어, myc 또는 플래그(flag) 태그와 발현될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 인간 PABPN1 단백질은 FLAG 태그와 발현될 수 있다. 이러한 방식으로, 돌연변이 및 기능성 PABPN1 단백질 모두의 존재 또는 부재 또는 상대적 양은 본 개시의 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들) 또는 발현 벡터(들)을 사용한 세포의 형질주입 또는 형질도입 및 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 치환하기 위한 제제 (본원에서 기술된 바와 같이 이는 개별적으로 또는 함께 제공될 수 있음) 이후에 세포에서 독립적으로 검출될 수 있다.
한 예에서, PABPN1 폴리펩티드의 존재 또는 부재 또는 상대적 존재도는 PABPN1 폴리펩티드의 전기영동 분해능과 조합된 PABPN1 폴리펩티드의 항체 포획을 포함하는 기술, 예를 들어 Isonostic™ 검정 (Target Discovery, Inc.)를 사용하여 검출될 수 있다. 항체는 PABPN1 단백질에 대해 시판된다.
본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들) 또는 발현 벡터(들) (본 개시의 하나 이상의 shmiR(들)을 발현함)의 존재 하에 세포에서 OPMD의 원인이 아닌 PABPN1 단백질을 발현하는 본 개시의 제제 OPMD를 치료하는 데 유용한 것으로 간주된다.
동물 모델
OPMD를 연구하기 위한 예시적 동물 모델이 기술되어 있다.
임의의 전술한 동물 모델은 본 개시의 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들) 또는 발현 벡터(들) (본 개시의 하나 이상의 shmiR(들)을 발현함)의 존재 하에 생체 내 기능성 PABPN1 단백질을 치환하기 위한 본 개시의 제제의 효능을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
PABPN1 발현을 검정하는 방법은 세포 모델에 관해 본원에서 기술되어 있고 본 개시의 이러한 예에 대해 준용하여 적용될 것이다.
한 예에서, 조직학적 및 형태학적 분석이 본 개시의 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들) 또는 발현 벡터(들) (본 개시의 하나 이상의 shmiR(들)을 발현함)의 존재 하에 생체 내 기능성 PABPN1 단백질을 치환하기 위한 본 개시의 제제의 효능을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 생체 내 기능성 PABPN1 단백질을 치환하기 위한 본 개시의 제제의 효능을 측정하기 위해 사용되는 추가 검정은 Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics , 19(11):2191-2207에 기술되어 있다.
ddRNAi 및 기능성 PABPN1의 치환을 위한 단일 DNA 작제물
본 개시는 본원에서 기술된 바와 같이 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산 및 본 개시의 하나 이상의 ddRNAi 작제물(들)을 포함하는 단일 DNA 작제물을 또한 제공한다. 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산 및 본 개시의 ddRNAi 작제물을 포함하는 예시적 DNA 작제물이 실시예 7에 기술되어 있다. 한 예에서, DNA 작제물은 본원에서 기술된 바와 같이 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산과 조합된 단일 ddRNAi 작제물을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, DNA 작제물은 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산과 조합된 다수의 ddRNAi 작제물을 포함할 수 있다. DNA 작제물의 각각의 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 코돈 최적화되어 이의 mRNA 전사체가 ddRNAi 작제물(들)의 shmiR(들)에 의해 표적화되지 않도록 한다.
한 예에서, 기능성 PABPN1 단백질은 예를 들어, 서열번호:74에 제시된 서열을 가지는 야생형 인간 PABPN1 단백질이다. 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열은 ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR(들)에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 즉, 변형될 PABPN1 mRNA 전사체 내 특정 코돈은 ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR(들)의 이펙터 서열(들)에 따라 달라질 수 있다. 한 예에서 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열은 서열번호:73에 제시된다.
DNA 작제물은 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질 및/또는 ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR의 발현을 유도하기 위한 하나 이상의 프로모터를 또한 포함할 수 있다. 본 개시의 일부 예에서 유용한 프로모터는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. 본 개시의 DNA 작제물에 사용하기 위한 예시적 프로모터는 근육 특이적 프로모터, 예를 들어, Spc512 및 CK8이다. 그러나, 당업계에 공지된 임의의 적합한 프로모터는 예를 들어, US 20110212529 A1에 기술된 것과 같이 본원에서 기술된 DNA 작제물에 사용되기 위해 고려된다.
DNA 작제물은 발현 벡터의 형태로 제공될 수 있거나 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 적합한 발현 벡터는 본원에서 기술되어 있고 당업계에 공지될 것이다.
한 예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 임의의 적절한 바이러스에 기초한 바이러스 벡터가 본 개시의 단일 DNA 작제물을 전달하기 위해 사용될 것이다. 추가적으로, 혼성 바이러스 시스템이 유용할 수 있다. 바이러스 전달 시스템의 선택은 전달을 위해 표적화된 조직, 시스템의 형질도입 효율, 병원성, 면역학적 및 독성 우려 등과 같은 다양한 매개 변수에 의존적일 수 있다.
또 다른 예에서, 적합한 플라스미드 발현 벡터는 pAAV 벡터 예를 들어, pscAAV 플라스미드 벡터 또는 pssAAV 플라스미드 벡터이다. 세포 또는 동물에 대해 유전 물질의 전달을 위한 다른 예시적 바이러스 시스템이 본 개시의 ddRNAi 작제물의 맥락에서 기술되어 있고 이러한 예에 대해 준용하여 적용될 것이다.
한 예에서, DNA 작제물은 5'에서 3' 방향으로 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512 프로모터, 본원에서 기술된 바와 같은 ddRNAi 작제물 및 본원에서 기술된 PABPN1 작제물을 포함하는 pAAV 발현 벡터의 형태로 제공되고, 예를 들어, 여기서 ddRNAi 작제물은 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산의 3' 비번역 영역 (UTR)에 위치한다. 이러한 예에 따른 DNA 작제물은 도 12a에 도시된다.
이러한 예에 따른 예시적 DNA 작제물은 5'에서 3' 방향으로 하기를 포함하는 pAAV 발현 벡터이다:
(a) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512;
(b) ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 가지는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 PABPN1 작제물; 및
(c) 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 및 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열 포함하는 핵산을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물.
이러한 예에 따른 DNA 작제물은 서열번호:72에 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
이러한 예에 따른 또 다른 예시적 DNA 작제물은 5'에서 3' 방향으로 하기를 포함하는 pAAV 발현 벡터이다:
(a) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512;
(b) ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 가지는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본원에서 기술된 바와 같은 PABPN1 작제물; 및
(c) 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 및 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물.
이러한 예에 따라, DNA 작제물은 서열번호:71에 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
또 다른 예에서, DNA 작제물은 5'에서 3' 방향으로, 제 1 근육 특이적 프로모터 예를 들어, CK8 프로모터, 본원에서 기술된 바와 같은 PABPN1 작제물, 제 2 근육 특이적 프로모터 예를 들어, Spc512 프로모터, 및 본원에서 기술된 바와 같은 ddRNAi 작제물을 포함하는 pAAV 발현 벡터의 형태로 제공되고, 여기서 제 1 및 제 2 근육 특이적 프로모터는 각각 PABPN1 작제물 및 ddRNAi 작제물과 작동 가능하게 연결된다. 이러한 예에 따른 DNA 작제물은 도 12b에 도시된다. 예를 들어, PABPN1 작제물과 작동 가능하게 연결된 프로모터는 그 안에 포함된 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결될 것이며, ddRNAi 작제물과 작동 가능하게 연결된 프로모터는 하나 이상의 본 개시의 shmiR을 암호화하는 핵산과 작동 가능하게 연결될 것이다. 이러한 예에 따른 DNA 작제물은 도 12a에 도시된다.
이러한 예에 따른 예시적 DNA 작제물은 5'에서 3' 방향으로 하기를 포함하는 pAAV 발현 벡터이다:
(a) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR17을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 및 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물의 업스트림에 위치한 CK8 프로모터; 및
(b) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 가지는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본원에서 기술된 바와 같이 PABPN1 작제물의 업스트림에 위치한 Spc512 프로모터.
이러한 예에 따른 DNA 작제물은 서열번호:70에 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
이러한 예에 따른 또 다른 예시적 DNA 작제물은 5'에서 3' 방향으로 하기를 포함하는 pAAV 발현 벡터이다:
(a) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR3을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 및 본원에서 기술된 바와 같이 shmiR14를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 본 개시의 ddRNAi 작제물의 업스트림에 위치한 CK8 프로모터; 및
(b) 근육 특이적 프로모터 예를 들어, ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 shmiR에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 가지는 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본원에서 기술된 바와 같이 PABPN1 작제물의 업스트림에 위치한 Spc512 프로모터.
이러한 예에 따른 DNA 작제물은 서열번호:69에 제시된 DNA 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시의 DNA 작제물에 포함시키기 위한 shmiR13 및 shmiR17을 암호화하는 예시적 ddRNAi 작제물은 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 31에 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호:30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13), 및 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호:39에 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호:38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17)을 포함한다. 예를 들어, DNA 작제물의 이러한 예에 따른 ddRNAi 작제물은 서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13), 및 서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17)을 포함할 수 있다.
본 개시의 DNA 작제물에 포함시키기 위한 shmiR3 및 shmiR14를 암호화하는 예시적 ddRNAi 작제물은 서열번호:17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호:17에 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호:16에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR3), 및 서열번호:33에 제시된 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 및 서열번호:33에 제시된 서열과 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열 예를 들어, 서열번호:34에 제시된 이펙터 보체 서열 (shmiR14)을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산을 포함한다. 예를 들어, DNA 작제물의 이러한 예에 따른 ddRNAi 작제물은 서열번호:57에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3), 및 서열번호:65에 제시된 DNA 서열을 포함하는 또는 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14)을 포함할 수 있다.
특정 예가 기술되었지만, 본 개시에 따른 DNA 작제물은 하나 이상의 shmiR을 암호화하는 본원에서 기술된 임의의 ddRNAi 작제물을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 실시예 1 내지 5에서 기술된 shmiR을 암호화하는 ddRNAi 작제물은 본 개시의 DNA 작제물에 포함시키기에 특히 적합할 수 있다.
조성물 및 담체
일부 예에서, 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들) 또는 발현 벡터(들)은 조성물 내에 제공된다. 일부 예에서, 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산은 조성물로 제공된다. 일부 예에서, 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들) 또는 발현 벡터(들)은 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산과 함께 조성물 내에 제공된다. 일부 예에서, 하나 이상의 핵산(들) 또는 ddRNAi 작제물(들) 및 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 핵산은 조성물 내 동일한 발현 벡터에서 제공된다.
본원에서 기술된 바와 같이, 발현 벡터는 본 개시의 ddRNAi 작제물을 단독 또는 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산과 결합하여 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 발현 벡터 및/또는 이를 포함하는 조성물에 대한 언급은 하기를 포함하는 것으로 이해될 것이다: (i) 본 개시의 ddRNAi 작제물을 포함하는 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물; (ii) 본 개시의 ddRNAi 작제물 및 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 모두를 포함하는 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물; 또는 (iii) 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물.
따라서, 본 개시의 조성물은 (i) 본 개시의 ddRNAi 작제물을 포함하는 발현 벡터, 및 (ii) 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 조성물은 본 개시의 ddRNAi 작제물 및 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 포함하는 단일 발현 벡터를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시의 ddRNAi 작제물을 포함하는 발현 벡터는 하나의 조성물로 제공될 수 있으며, 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터는 예를 들어, 함께 패키징된 또 다른 조성물 내에서 제공될 수 있다.
본 개시의 조성물은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 이에 투여 후 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)의 개체의 근육에 대한 전달에 적합한 담체를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 담체는 지질 기반 담체, 양이온성 지질, 또는 리포좀 핵산 복합체, 리포좀, 미셀, 바이로솜, 지질 나노입자 또는 이의 혼합물이다.
일부 예에서, 담체는 생분해성 중합체 기반 담체이며, 양이온성 중합체-핵산 복합체가 형성된다. 예를 들어, 담체는 본 개시의 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)를 근육 세포 또는 눈 조직에 전달하기에 적합한 양이온성 중합체 미세입자일 수 있다. 세포에 조성물을 전달하기 위한 양이온성 중합체의 사용은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Judge et al. Nature 25:457-462 (2005)에 기술되어 있고, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다. 예시적 양이온성 중합체 기반 담체는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 DNA 결합 중합체이다. 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)과의 복합체화 및 전달을 위해적합한 다른 양이온성 중합체는 폴리(L-라이신) (PLL), 키토산, PAMAM 덴드리머, 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트 (pDMAEMA)를 포함한다. 다른 중합체는 폴리 베타 - 아미노 에스테르를 포함한다. 다른 적합한 양이온성 중합체가 당업계에 공지되어 있고 Mastrobattista and Hennink, Nature Materials, 11:10-12 (2012), WO/2003/097107 및 WO/2006/041617에 기술되어 있고, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 담체 제형은 비경구 피하 주사, 정맥 내 주사 및 흡입을 포함하는 다양한 전달 경로를 위해 개발되었다.
추가의 예에서, 담체는 사이클로덱스트린 중합체-핵산 복합체와 같은 사이클로덱스트린 기반 담체이다.
추가의 예에서, 담체는 양이온성 펩티드-핵산 복합체와 같은 단백질 기반 담체이다.
또 다른 예에서, 담체는 지질 나노입자이다. 예시적 나노입자는 예를 들어, US7514099에 기술되어 있다.
일부 예에서, 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)은 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-C-DMA/DSPC (예를 들어, 40/48/2/10 비율), 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC (예를 들어, 40/48/2/10 비율), 또는 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG (예를 들어, 60/38/2 비율)을 포함하는 지질 나노입자 조성물과 제제화된다. 일부 예에서, 양이온성 지질은 DMA 중 옥틸 CL, DMA 중 DL, L-278, DLinKC2DMA, 또는 MC3이다.
또 다른 예에서, 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)은 WO 2010/021865; WO 2010/080724; WO 2010/042877; WO 2010/105209 또는 WO 2011/022460에 기술된 임의의 양이온성 지질 제형과 제제화된다.
또 다른 예에서, 본 개시의 핵산(들) 또는 ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)은 예를 들어, 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)의 전달을 용이하게 하기 위해 또 다른 화합물에 접합되거나 복합체화된다. 그러한 접합체의 비제한적인 예는 US 2008/0152661 및 US 2004/0162260에 기술되어 있다 (예를 들어, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG 등).
또 다른 예에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 본 개시의 RNA 또는 ddRNAi 또는 발현 벡터에 공유 결합된다. 부착된 PEG는 임의의 분자량, 예를 들어, 약 100 내지 약 50,000 달톤 (Da)일 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)은 예를 들어, WO 96/10391; WO 96/10390; 또는 WO 96/10392에 기술된 표면 변형된 리포좀 함유하는 폴리(에틸렌 글리콜) 지질 (PEG-변형된, 또는 장기 순환 리포좀 또는 스텔스(stealth) 리포좀)을 포함하는 담체와 제제화된다.
일부 예에서, 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)은 폴리에틸렌이민 또는 이의 유도체, 예를 들어 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-tri-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-triGAL) 유도체와 제제화되거나 복합체화될 수 있다.
다른 예에서, 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)은 미국특허 출원 공보물 제 2001/0007666호에 기술된 것과 같은 막 파열 제제와 복합체화된다.
다른 담체는 사이클로덱스트린 (예를 들어, Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem ., 10, 1068-1074; 또는 WO 03/46185를 참조), 폴리(락틱-코-글리콜)산 (PLGA) 및 PLCA 미세구 (예를 들어 US 2002130430을 참조)를 포함한다.
조성물은 바람직하게는 본 개시의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)의 생물학적 안정성을 증가시키는 물질 및/또는 편재화시키는 및/또는 근육 세포를 선택적으로 침투하는 조성물의 능력을 증가시키는 물질을 포함할 것이다. 본 개시의 치료학적 조성물은 투여 방식 및 경로, 및 표준 약제 실습에 기초하여 선택되는 약학적으로 허용 가능한 담체 (예를 들어, 생리 식염수)로 투여될 수 있다. 당업자는 본 개시의 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 또는 발현 벡터(들)을 포함하는 약제학적 조성물을 용이하게 제제화할 수 있다. 일부 경우에서, 등장성 제제가 사용된다. 일반적으로, 등장성 첨가제는 염화 나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토오스를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 인산 완충 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 일부 예에서, 혈관 수축 제제가 제형에 첨가된다. 본 개시에 따른 조성물은 무균으로 및 발열원 없이 제공된다. 적합한 약학적 담체 뿐만 아니라 약학적 제형에 사용하기 위한 약학적 필수품은 Remington:The Science and Practice of Pharmacy (formerly Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., 이 분야의 표준 참고 문헌, 및 USP/NF에 기술되어 있다.
약학적 조성물의 부피, 농도, 및 제형 뿐만 아니라 투여 요법은 세포 전달을 최대화하면서 염증 반응과 같은 독성을 최소화하도록 특별히 맞춤화될 수 있고, 예를 들어, 활성 성분의 상응하는 낮은 농도인 비교적 큰 부피 (5, 10, 20, 50 ml 또는 이상) 뿐만 아니라 코르티코스테로이드와 같은 항염증 화합물의 포함이 필요한 경우 활용될 수 있다.
본 개시의 조성물은 임의의 적합한 경로에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 투여 경로는 근육 내, 복강 내(intraperitoneal), 피내(intradermal), 피하, 정맥 내, 동맥 내(intraarterially), 안구 내(intraocularly) 및 경구 뿐만 아니라 경피 또는 흡입 또는 좌약을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예시적 투여 경로는 정맥 내 (IV), 근육 내 (IM), 경구, 복강 내, 피내, 동맥 내 및 피하 주사를 포함한다. 한 예에서, 본 개시의 조성물은 IM 투여를 위해 제제화된다. 이러한 조성물은 약학적 적용에 유용하고 적합한 무균, 비열원성 운반체, 예를 들어, 주사용, 비경구 투여 예를 들어, IM, 정맥 내 (정맥 내 주입을 포함), SC, 및 복강 내 투여를 위한 완충 식염수에서 용이하게 제제화될 수 있다. IM, IV 주사 또는 주입과 같은 일부 투여 경로는 근육 조직으로의 효과적인 전달 및 ddRNAi 작제물 및/또는 본 개시의 PABPN1을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산의 형질주입, 및 그 안의 RNA 및/또는 코돈-최적화된 핵산의 발현을 달성할 수 있다.
치료 방법
한 예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 것을 포함하는 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 발현 벡터(들) 또는 조성물(들)은 개체에서 OPMD의 원인인 PABPN1 단백질을 포함하는 내인성 PABPN1 단백질의 발현을 억제하기 위해 사용된다.
한 예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 것을 포함하는 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 발현 벡터(들) 또는 조성물(들)은 이로부터 고통받는 개체에서 OPMD를 치료하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에서 기술된 바와 같은 것을 포함하는 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 발현 벡터(들) 또는 조성물(들)은 이로부터 고통받거나 이에 걸리기 쉬운 개체에서 OPMD의 하나 이상의 증상의 발달 또는 진행을 예방하는데 사용될 수 있다.
각각의 전술한 예에서, 본 개시의 발현 벡터 및/또는 조성물은 본 개시의 ddRNAi 작제물 및 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 모두를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터 또는 조성물의 투여는 (i) OPMD의 원인인 확장된 ㅇ폴리알라닌 관을 포함하는 PABPN1 단백질을 포함하는, 내인성 PABPN1의 발현을 억제, 감소 또는 낙다운하는데 및 (ii) 내인성 PABPN1의 발현을 억제, 감소 또는 낙다운하는 shmiR 또는 shRNA에 의해 표적화되지 않는 기능성 PABPN1 단백질의 발현을 제공하는데 효과적일 수 있다. 따라서 본 개시의 조성물은 투여된 세포 또는 동물에서 PABPN1 단백질 기능 예를 들어, RNA의 전사후 가공을 회복시킬 수 있다.
또 다른 예에서, OPMD의 치료는 (i) OPMD의 원인인 PABPN1 단백질의 발현을 억제하기 위한 하나 이상의 제제, 및 (ii) 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 을 포함하는 발현 벡터 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 별도로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, OPMD의 원인인 PABPN1 단백질의 발현을 억제하기 위한 하나 이상의 제제는 핵산, ddRNAi 작제물, 발현 벡터 또는 본원에서 기술된 바와 같은 것을 포함하는 조성물 또는 다수의 이들의 임의의 하나 이상일 수 있다. 개체는 구성 요소 (i) 및 (ii)를 함께, 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
예를 들어, OPMD의 치료는 개체에 대한 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 개체는 OPMD의 원인이지만 코돈-최적화된 핵산의 발현을 억제하지 않는 PABPN1 단백질의 발현을 억제하기 위한 하나 이상의 제제가 사전에 투여된다. 예를 들어, 개체는 핵산, ddRNAi 작제물, 발현 벡터 또는 본원에서 기술된 바와 같은 것을 포함하는 조성물 또는 이들의 임의의 하나 이상 중 다수가 사전에 투여될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 투여 경로는 근육 내, 복강 내, 피내, 피하, 정맥 내, 동맥 내, 안구 내 및 경구 뿐만 아니라 경피 또는 흡입 또는 좌약에 의한 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예시적 투여 경로는 정맥 내 (IV), 근육 내 (IM), 경구, 복강 내, 피내, 동맥 내 및 피하 주사를 포함한다. IM, IV 주사 또는 주입과 같은 일부 투여 경로는 근육 조직에 대한 효과적인 전달 및 ddRNAi 작제물 및/또는 본 개시의 PABPN1을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산의 형질주입, 및 그 안에 shmiR 또는 shRNA 및/또는 코돈-최적화된 핵산의 발현을 달성할 수 있다.
당업자는 통상적인 실험을 통해, OPMD를 겪는 개체를 치료하기 위해 필요한 핵산, ddRNAi 작제물, 본원에서 기술된 바와 같이 이를 포함하는 발현 벡터 또는 조성물, 또는 이의 임의의 하나 이상 중 다수의 유효한, 비독성 양을 측정할 수 있을 것이다임의의 특정 환자에 대한 치료학적 유효량 수준은 하기를 포함하는 다양한 인자에 의존적일 것이다: 사용된 조성물; 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 환자의 식이; 투여 시간; 투여 경로; 핵산의 격리 속도, ddRNAi 작제물, 본원에서 기술된 바와 같이 이를 포함하는 발현 벡터 또는 조성물, 또는 이의 임의의 하나 이상 중 다수, 치료 지속 기간, 의학에서 충분히 공지된 다른 관련 인자를 포함.
OPMD의 원인인 PABPN1 단백질의 발현을 감소시키거나 억제하는 및 PABPN1 기능을 회복시키기에 충분한 양으로 OPMD의 원인이 아닌 기능성 PABPN1 단백질을 발현시키는, 핵산, ddRNAi 작제물, 발현 벡터 또는 본 개시의 이를 포함하는 조성물의 효능은 치료된 개체에서 근육 수축 성질 및/또는 연하곤란을 평가함으로써 측정될 수 있다. 연하능력 및 근육 수축 성질을 시험하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 연하곤란은 비디오투시검사(videofluoroscopy), UGI 내시경 또는 식도계측검사(oesophageal manometry) 및 임피던스 시험을 사용하여 평가할 수 있다. OPMD의 임상 특성을 평가하는 다른 방법은 R
Figure pct00001
egg et al,.(2005) Swiss Medical Weekly, 135:574-586에 기술되어 있다.
키트
본 개시는 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 발현 벡터(들) 또는 본 개시의 이를 포함하는 조성물을 키트의 형태로 또한 제공한다. 키트는 컨테이너를 포함할 수 있다. 키트는 그의, 또는 그것들의, 투여에 대한 지침이 있는 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 발현 벡터(들) 또는 본 개시의 것을 포함하는 조성물을 전형적으로 함유한다. 일부 예에서, 키트는 하나 이상의 핵산, ddRNAi 작제물, 발현 벡터 또는 본 개시의 것을 포함하는 조성물을 함유한다. 한 예에서, 키트는 (i) OPMD의 원인인 PABPN1 단백질의 발현을 감소시키거나 억제하기 위한, 하나 이상의 핵산(들), ddRNAi 작제물(들), 발현 벡터(들) 또는 본 개시의 것을 포함하는 조성물을 포함하는 제 1 키트 구성 요소, 및 (ii) 제 2 키트 구성 요소로서, 본 개시의 기능성 PABPN1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 이를 포함하는 조성물을 포함한다. 제 1 및 제 2 키트 구성 요소는 키트로 함께 패키징될 수 있다.
표 1 - PABPN1에서 표적화된 영역
Figure pct00002
표 2 - shmiR 이펙터 및 이펙터 보체 서열
Figure pct00003
표 3 - shmiR 서열
Figure pct00004
표 4 - 카세트를 암호화하는 Shmir
Figure pct00005
실시예 1 - PABN1을 표적화하는 shmiR의 설계
siRNA 작제물의 설계를 위한 잠재 표적을 나타내는 서열은 공개적으로 이용 가능한 siRNA 설계 알고리즘 (Ambion, Promega, Invitrogen, Origene 및 MWG를 포함)을 사용하여 PABPN1 mRNA 서열로부터 동정하였다: 선택된 서열은 인간, 비인간 영장류, 소 및 마우스 종에 보존되었다. 후보 siRNA를 암호화하는 서열을 하기를 생성하기 위해 pre-miR30a 스캐폴드에 통합하였다: 5' 측접 영역을 포함하는 짧은 헤어핀 마이크로RNA (shmiR)를 암호화하는 서열 (서열번호:41), siRNA 센스 가닥 서열 (이펙터 보체 서열), 스템/루프 접합 서열 (서열번호:40), siRNA 안티센스 가닥 (이펙터 서열), 및 3' 측접 영역 (서열번호:42). 대표적 shmiR의 예측된 2차 구조를 도 1에 나타낸다. 설계된 shmiR에 대한 PABPN1 mRNA 전사체의 표적 영역을 표 1에 나타내고 상응하는 shmiR 이펙터 서열 (안티센스 가닥)을 표 2에 나타낸다.
실시예 2 - 이중-루시페라아제 수용체 검정에서의 shmiR의 활성
PABPN1 전사체의 발현을 낙다운시키는 본 개시의 shmiR의 효능을 시험하기 위해, 이중-루시페라아제 수용체 검정을 HEK293 세포에서 수행하였다.
pGL3 루시페라아제 수용체 벡터를 제작하였다. 야생형 또는 코돈 최적화된 PABPN1 (wtPABPN1 또는 optPABPN1)의 완전한 코딩 서열을 pGL3-대조군 벡터 (Promega, Madison, WI)에 삽입함으로써 루시페라아제 수용체를 생성하였다. 삽입물을 FseI 및 XbaI 제한 효소 부위를 사용하여 루시페라아제 수용체 유전자의 3' UTR에 서브클로닝하였다. U6 pol III 프로모터에 의해 유도되는, PABPN1 표적 shmiR 서열 (표 3에 기재됨)을 함유하는 작제물을 DNA2.0 (Newark,CA)에서 합성하고 pSilencer 플라스미드 백본에 서브클로닝하였다.
HEK293 세포주는 ATCC (Manassas, VA)로부터 구입하였다. HEK293 세포는 10% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민, 페니실린 (100U/mL), 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)을 함유하는 DMEM 배지에서 5% CO2의 37℃ 습식 배양기에서 배양하였다. 간략하게, HEK293 세포를 형질주입 하루 전에 96-웰 배양 플레이트에 웰 당 2x104 세포의 밀도로 접종하였다.
PABPN1 shmiR 발현 작제물 및 그의 상응하는 안티센스 또는 센스 루시페라아제 수용체 및 레닐라(Renilla) 대조군 수용체 작제물을 제조자 지시에 따라 Fugene 6 (Promega, Madison, WI)을 사용하여 HEK293 세포에 공동형질주입하였다. 형질주입의 각 웰에 대해, 100ng의 하나의 PABPN1 shmiR, 10ng의 상응하는 루시페라아제 수용체 작제물 및 1ng의 레닐라 대조군 수용체 작제물 (형질주입 대조군으로 역할)을 0.3uL의 Fugene 6을 사용하여 공동형질주입하였다. 형질주입 48 시간 후, 세포 용해액을 수집하고 이중 루시페라아제 수용체 검정 시스템 (Promega, Madison, WI)을 사용하여 분석하였다. 반딧불(firefly)/레닐라 활성 비율을 각 웰에 대해 측정하고, shmiR의 억제 효율을 비-표적 siRNA, psilencer 대조군 (Thermo Fisher, USA)에 대해 정규화함으로써 계산하였다. psilencer 대조군에 비한 각각의 shmiR의 센스 및 안티센스 가닥에 대한 HEK293 세포에서 wtPABPN1 또는 optPABPN1 수용체 작제물의 억제 백분율을 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2 및 도 3에서 명백한 바와 같이, 표 2에서 지정된 하나의 예시적 shmiR (shmiR11)을 제외한 모두가 wtPABPN1 루시페라아제 수용체 벡터로부터 발현된 루시페라아제의 수준을 하향조절하였지만 (도 2), coPABPBN1 (도 3) 수용체로부터의 발현을 하향조절하지 않았다. 특히, shmiR-3, shmiR-4, shmiR-13, shmiR-14, shmiR-16, 및 shmiR-17은 PABPN1 표적 mRNA 서열에 대해 강력한 억제 활성 (음성 대조군으로서 관련되지 않은 shRNA로 치료된 세포에 비해 루시페라아제 활성의 70% 이상 억제로 정의됨)을 가지는 것으로 나타난 반면, 패신저 가닥에 의해 인식된 표적 서열을 함유하는 그의 동족 수용체에 대해 약한 활성 (35% 미만 억제)을 보유한다.
실시예 3- PABPN1 단백질 발현의 시험관 내(In vitro) 하향조절
상기 기술된 루시페라아제 활성 검정에 의해 측정된 PABPN1 발현의 하향조절에 기초하여, shmiR 2, 3, 5, 9, 13, 14, 16, 및 17을 추가 분석을 위해 선정하였다. 시험관 내 PABPN1을 하향조절하는 그들의 능력을 조사하기 위해, 실시예 2에 기술된 U6 프로모터에 의해 유도된 shmiR 함유 플라스미드를 2개의 추가 발현 플라스미드와 함께 사용하였다. FLAG-태그된 인간 wtPABPN1에 대한 하나의 코딩 (wt-PABPN1-FLAG; 서열번호:75), 및 FLAG 태그를 가진 인간 PABPN1에 대한 코돈 최적화된 서열 코딩을 포함하는 다른 하나 (co-PABPN1-FLAG; 서열번호:76).
세포
인간 배아 신장 세포 (HEK293T, ATCC, Manassas, USA)를 20mM HEPES, 2 mM 글루타민, 10% 소 태아 혈청 (FBS), 1X Penstrep을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 성장시켰다.
치료
간략하게, HEK293T 세포를 1x106 세포/웰에 접종하고 상기 기술된 하나의 shmiR 플라스미드 (300 ng/웰), 야생형 인간 PABPN1를 발현하는 플라스미드 (wt-PABPN1-FLAG) (100 ng/웰) (서열번호:75)와 함께 또는 없이, 또는 코돈-최적화된 PABPN1 (co-PABPN1-FLAG) (100 ng/웰) (서열번호:76)로 다음 날 형질주입시켰다. 대조군으로서, HEK293T 세포를 비표적 siRNA 서열을 발현하는 psilencer 대조군 플라스미드 (Thermo Fisher, USA)로 형질주입시켰다. HEK293T 세포를 37℃, 72 시간 동안 완전한 DMEM 배지에서 배양하였고, 이러한 시간 후 세포를 채취하였고 세포 용해액을 웨스턴 블랏에 의해 분석하였다.
웨스턴 블랏 분석
세포 용해액을 하기를 함유하는 RIPA 완충액 중에서 세포를 배양함으로써 제조하였다: NaCl 0.15M, 0.1% SDS, 50 mM 트리스(Tris) (pH8), 2 mM EDTA 및 10% 트리톤(Triton)-X-100과 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 (Complete, Roche Diagnostics).
단백질을 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (Invitrogen) 상에서 분리하고 iBlot 2 건식 블로팅 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 도입하였다. 블랏을 차단하고 iBind 웨스턴 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 1차 및 2차 항체로 프로브화하였다. 1차 항체 (안티-플래그 (GenScript) 및 안티-Hsp90 (Sigma))를 1:500의 희석비로 사용한 반면, 2차 AP-접합 항체 (안티- 마우스 및 안티-토끼, Sigma)를 1:6000의 희석비로 사용하였다. 밴드를 DDAO 염료를 사용하여 검출하고 FLA-3000 스캐너 (Fuji)를 사용하여 시각화하였다.
ImageJ를 사용한 대조군에 비한 PABPN1 발현의 억제 백분율의 결과 블랏 및 정량을 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4로부터 명백한 바와 같이, 실시예 3으로부터 선택된 shmiR 모두는 야생형 PABPN1의 발현을 90% 초과의 억제 백분율로 낙다운하였고, 시험된 8개의 shmiR 중 7개는 야생형 PABPN1 단백질의 발현을 95% 초과의 수준으로 억제하였다. 대조적으로, shmiR은 코돈 최적화된 PABPN1 작제물의 발현을 억제하지 않았다 (도 5).
실시예 4 - HEK293T 세포에서 PABPN1의 shmiR 표적 유전자 침묵
이 실시예는 시험관 내 PABPN1의 내인성 발현을 낙다운하는 PABPN1 shmiR 플라스미드의 능력을 입증한다.
세포
인간 배아 신장 세포 (HEK293T, ATCC, Manassas, USA)를 20mM HEPES, 2 mM 글루타민, 10% 소 태아 혈청 (FBS), 1X Penstrep을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 성장시켰다.
치료
간략하게, HEK293T 세포를 1x106 세포/웰에 접종하였고 실시예 2에 기술된 shmiR 플라스미드 중 하나를 다음날 형질주입시켰다(300 ng/웰). 대조군으로서, HEK293T 세포를 psilencer 플라스미드 발현 비표적 siRNA 서열 (Thermo Fisher, USA)로 형질주입시켰다. HEK293T 세포를 37℃, 72 시간 동안 완전한 DMEM 배지에서 배양하였고, 이러한 시간 후 세포를 채취하였고 RNA를 역전사 추출하였고 세포 용해액을 qPCR에 의해 분석하였다.
qPCR 분석
상기 기술된 shmiR에 의한 mRNA 수준에서 PABPN1의 억제 수준을 정량하기 위해 추출된 RNA 시료 상에서 qPCR 분석을 수행하였다.
코돈 최적화된 PABPN1와 야생형 PABPN1을 구별하기 위해, TaqMan 프라이머 및 프로브를 야생형 PABPN1 또는 코돈 최적화된 PABPN1를 특이적으로 증폭하도록 설계하였다. 프라이머는 GenScript TaqMan 프라이머 설계 도구 (https://www.genscript.com/ssl-bin/app/ primer)를 사용하여 설계하였다.
정량적 RT-PCR에 사용된 프라이머의 최종 서열은 하기와 같다:
wtPABPN1-Fwd 5'- ATGGTGCAACAGCAGAAGAG-3' (서열번호:77)
wtPABPN1-Rev 5'- CTTTGGGATGGCCACTAAAT-3' (서열번호:78)
wtPABPN1-Probe 5'- CGGTTGACTGAACCACAGCCATG-3' (서열번호:79)
optPABPN1-Fwd 5'- ACCGACAGAGGCTTCCCTA-3' (서열번호:80)
optPABPN1-Rev 5'- TTCTGCTGCTGTTGTAGTTGG -3' (서열번호:81)
optPABPN1-Probe 5'- TGGTCCGGGCTCTGTACCTAGCC -3' (서열번호:82)
총 RNA를 제조사 지시에 따라 Trizol (Invitrogen)을 사용하여 세포 용해액으로부터 추출하였다. RNA 시료를 ND-1000 NanoDrop 분광 광도계 (NanoDrop Technologies)를 사용하여 정량하였다. RNA (100 ng)를 제조사 지시에 따라 Multiscribe 역전사효소 (ABI)를 사용하여 역전사시켰다. cDNA를 총 10ul의 반응 부피에서 Taqman qPCR 마스터 믹스를 사용하는 정량적 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응을 하기와 같이 진행하였다: 50℃에서 2 분, 95℃에서 10 분 이어서 40 사이클: 95℃에서 15 초, 60℃에서 1 분.
각각의 mRNA의 발현 수준을 GAPDH에 대해 정규화하였다. 발현 수준을 표준 곡선에 의해 측정된 총 카피에 따라 계산하였고 psilencer 대조군에 비한 억제 백분율로 전환하였다.
HEK293 세포에서 예시된 shmiR에 의한 야생형 PABPN1 발현의 최종 억제 백분율을 도 6에 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, shmiR은 PABPN1의 발현을 16.4% 내지 49.1%의 범위의 억제 백분율 (평균 35.5%)로 하향조절한다.
실시예 5 - C2C12 마우스 근육 세포 및 ARPE -19 인간 망막 세포에서의 PABPN1의 shmiR 표적화 유전자 침묵
qPCR에 의해 측정된 HEK293 세포에서의 PABPN1 발현에 대한 예시된 shmiR에 의한 낮은 억제 백분율이 PABPN1의 유전자 발현의 세포주 변이로 인한 것인지 측정하기 위해, OPMD, 즉 C2C12 마우스 근육 및 ARPE-19 인간 망막 세포에 관련된 추가 세포주를 분석을 위해 선택하였다.
세포
C2C12 마우스 근육 세포를 20mM HEPES, 2 mM 글루타민, 10% 소 태아 혈청 (FBS), 1X Penstrep를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 성장시켰다.
ARPE-19 인간 망막 세포를 둘베코 변형 이글 배지/햄즈 영양 혼합물(Nutrient Mixture) F-12 (DMEM/F12), 10% 소 태아 혈청 (FBS), 1X Penstrep에서 성장시켰다.
치료
간략하게, 2x105 C2C12 세포를 네온 전기천공 시스템을 사용하여 전기천공시켰다 (펄스 전압:1650, 펄스 폭:10, 펄스 수:3). 상기 기술된 단일 shmiR 및 2개의 shmiR의 조합 모두 (2μg/웰)를 분석하였다. 대조군으로서, C2C12 세포를 pSilencer 플라스미드 발현 비표적 siRNA 서열 (Thermo Fisher, USA)로 전기천공시켰다. C2C12 세포를 24 시간 동안 완전한 DMEM 배지에서 37℃로 배양한 후, 형질주입되지 않은 세포의 성장을 늦추기 위해 50ug/mL 히그로마이신을 첨가하고, 전기천공 후 48 시간에 100 ug/mL을 추가로 첨가하였다. 72 시간에, 세포를 채취하였고 총 RNA를 qPCR을 위해 추출하였다.
5x106 ARPE-19 세포를 하기 조건을 사용하여 네온 전기천공 시스템으로 전기천공시켰다:펄스 전압:1350, 펄스 폭:20, 펄스 수:2. 24 시간에 50ug/mL의 히그로마이신을 첨가한 것을 제외하고 추가 첨가 없이 상기와 같이 C2C12 세포에 대해 세포를 치료하였다. ARPE-19 세포를 48 시간 및 72 시간 모두에서 RNA 추출 및 qPCR 분석을 위해 채취하였다.
qPCR 분석
실시예 3에서 선택된 shmiR에 의한 억제에 대응한 내인성 PABPN1의 발현을 측정하기 위해 사용된 wtPABPN1 프라이머 및 프로브를 사용하여 실시예 4의 HEK293 세포에 대해 기술된 바와 같이 역전사효소 qPCR을 수행하였다. qPCR을 C2C12 세포에서 shmiR 3, 13, 14, 17에 대해 3회 및 shmiR 2, 5, 9, 16에 대해 2회 수행하였다. 단일 측정은 ARPE-19 세포에 대해 두 시점 (48 시간 및 72 시간)에서 사용하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, shmiR 16 (~43%의 억제 백분율)을 제외한, 모든 개별 shmiR은 psilencer 대조군에 비해 C2C12 세포에서 대략 80%의 평균 억제 백분율로 PABPN1의 발현을 하향조절하였다.
PABPN1의 억제 백분율에 의해 측정된, 가장 우수한 shmiR을 조합된 그들의 PABPN1 발현 억제 능력을 분석하기 위해 선택하였다. shmiR 13/17 및 shmiR 3/14의 조합을 세포 내로 공동-전기천공시켰고 PABPN1의 발현을 개별 shmiR에 대해 상기 기술된 바와 같이 qPCR에 의해 측정하였다.
도 8은 이러한 shmiR의 조합이 C2C12 세포에서 PABPN1의 발현에 미치는 영향을 입증한다. shmiR 13/17 공동 형질주입은 개별 shmiR 13 및 17 각각의 92.5% 및 76.7%와 비교하여 84.4%의 PABPN1 발현의 억제 백분율을 초래하였다. shmiR 3/14 공동형질주입은 개별 shmiR 3 및 14 각각의 76.2% 및 80.4%와 비교하여 79.0%의 억제 백분율을 초래하였다.
상기와 같은 shmiR의 동일한 조합을 인간 세포주, 즉 ARPE-19 세포에서 PABPN1 발현을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 상기 기술된 바와 같이 치료된 세포 및 48 시간 및 72 시간에 qPCR에 의해 측정된 PABPN1 발현의 억제 결과를 도 9에 나타낸다. 72 시간 후, shmiR 13/17 공동형질주입은 개별 shmiR 13 및 17 각각의 83.9% 및 89.8%와 비교하여 87.9%의 PABPN1 발현 억제 백분율을 초래하였다. shmiR 3/14 공동형질주입은 개별 shmiR 3 및 14에 대한 82.2% 및 81.6%와 비교하여 87.4%의 억제 백분율을 초래하였다. 평균적으로, PABPN1 발현 억제 백분율은 ARPE-19 세포에서 48 시간에서 72 시간 사이에 1.14 배 증가하였다.
실시예 6 - qPCR에 의한 shmiR 발현의 측정
상기 기술된 바와 같이 가장 우수한 shmiR로 형질주입된 C2C12 세포에서 발현된 shmiR의 총 수를 측정하기 위해, miScript 검정을 개발하였다.
U6 shmiR 발현 작제물에 의한 shmiR 3, 13, 14, 및 17의 생산은 Qiagen's miScript PCR 시스템 (Valencia, CA)을 사용하여 측정하였다. 각각의 RT-qPCR 분석을 위해, 50 ng의 총 RNA를 Qiagen's miScript II RT 키트를 사용하여 cDNA로 변환시켰다. 그런 다음 shRNA의 정량적 PCR을 하기에 제시된 맞춤형 전향 프라이머를 가지는 Qiagen miScript SYBR 그린(green) PCR 키트를 사용하여 수행하였다:
shmiR3-FWD 5'- TTCATCTGCTTCTCTACCTCG -3' (서열번호:83)
shmiR13-FWD 5'- AGGGGAATACCATGATGTCGC -3' (서열번호:84)
shmiR14-FWD 5'- CTCATATTCATCTGCTTCTCT -3' (서열번호:85)
shmiR17-FWD 5'- ATTCATCTGCTTCTCTACCTC -3' (서열번호:86)
리버스 프라이머는 Qiagen miScript SYBR 그린 PCR 키트에 제공되었다. 하기 실시간 PCR 조건을 사용하였다: 95℃에서 15 분 동안의 초기 변성, 이어서 94℃에서 15 초 동안 40 사이클, 55℃에서 30 초 및 70℃에서 30 초.
이들 검정에 대한 표준 곡선은 선택된 shmiR의 알려진 양을 증폭함으로서 생성되었고, 도 10에 나타내었다. shmiR3 (도 10b)은 비선형 표준 곡선을 생성하였고 사용된 qPCR 완충액에 따라 달라졌다.
세포 당 RNA 카피 수는 333 C2C12 세포에서 10 ng 총 RNA 추정치에 기초하여 계산하였다. 세포 당 shmiR 카피는 개별적으로 발현된 경우 각각의 shmiR3, shmiR13, shmiR14 및 shmiR17에 대해 측정하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, shmiR 벡터로 형질도입된 C2C12 세포에서 개별 shRNA 발현 수준은 shmiR 3, 13, 14, 및 17 각각에 대해 세포 당 51,663, 13,826, 11,576, 및 14,791 카피로 추정되었다.
실시예 7 - 내인성 PABPN1의 동시 유전자 침묵 및 코돈 최적화된 PABPN1로의 치환을 위한 벡터의 생성.
내인성 야생형 PABN1 (wtPABN1)의 동시 유전자 침묵 및 코돈 최적화된 PABPN1 (coPABN1)로의 치환을 유도하기 위해, 발현 optPABPN1 서열과 결합하여 하나 이상의 선택된 shmiR을 발현하는 단일 가닥 아데노-관련 바이러스 유형 2 (ssAAV2) 플라스미드를 생성하였다. 2개의 대안 작제물을 도 12a 및 12b에 제시한다.
제 1 작제물, 버전 2, (도 12a)는 pAAV2 벡터 백본에서 wtPABPN1을 표적으로 하는 2개의 shmiR을 optPABPN1 전사체의 3' 비번역 영역으로 서브클로닝함으로써 생성된다. 단일 전사체에서 optPABPN1 및 2개의 shmiR 모두의 발현이 근육 특이적 프로모터 Spc512에 의해 유도된다. 제 2 작제물, 버전 1, (도 12b)은 wtPABPN1을 표적으로 하는 2개의 shmiR을 전사체의 서열 업스트림으로 서브클로닝함으로써 생성된다. 이 작제물에서, CK8 프로모터의 제어 하에 2개의 shmiR을 암호화하는 제 1 전사체 및 Spc512 프로모터 하에 optPABPN1을 암호화하는 제 2 전사체, 2개의 전사체가 발현된다.
재조합 위형화 AAV 벡터 스톡이 생성된다. 간략하게, HEK293T 세포는 10% FBS가 보충된 둘베코 변형 이글 배지의 세포 공장에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO2에서 배양한다. 이러한 실시예에서 기술된 바와 같은 pAAV-shmiR 바이러스 플라스미드 및 pAAV헬퍼 및 pAAVrepcap8 플라스미드 또는 pAAV헬퍼 및 pAAV repcap9 플라스미드를 제조사 지시에 따라 인산칼슘과 복합체화한다. 그런 다음 HEK293T 세포에서 pAAV헬퍼 및 pAAVrepcap8 또는 pAAVrepcap9와 결합하여 각각의 pAAV-shmiR 플라스미드를 사용하여 삼중 형질주입을 수행한다. HEK293T 세포를 72 시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양한 후, 세포를 용해시키고 각각의 바이러스 플라스미드에 대한 ssAAV shmiR-발현 입자를 아이오디사놀(iodixanol) (Sigma-Aldrich) 단계 구배 초원심분리 후 염화 세슘 초원심분리에 의해 정제한다. 벡터 게놈의 수를 정량적 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR)에 의해 정량하였다.
실시예 8 - OPMD의 마우스 모델에서의 생체 내 효능 연구.
동물
전임상 효능 연구를 OPMD의 가장 일반적인 마우스 모델, A17 마우스 모델에서 수행하였다. 이러한 마우스 모델을 소의 확장된 (17 알라닌 잔기) PABPN1을 과발현시킴으로써 FvB 배경에서 생성하였다. 골격근에서 이러한 돌연변이 PABPN1의 발현은 인간 알파 액틴 근육 특이적 프로모터 (HSA1)의 조절 하에 놓였다. 내인성 마우스 PABPN1 대립 유전자 모두가 기능적이고 정상 마우스 PABPN1를 발현한다. 따라서, 마우스 표현형은 정상 단백질에 비해 돌연변이 PABPN1의 과발현으로 인한 것이다. 가장 중요하게, A17 마우스는 핵내 봉입체 (INIs)의 존재, 섬유증(fibrosis), 및 근육 강도의 손실을 포함하는 다수의 OPMD의 임상 징후를 나타낸다. 생체 내 마우스 효능 연구는 마우스로부터 용이하게 조작 및/또는 단리될 수 있어, 표현형 개선을 관찰하기 더 용이하게 만드는 가장 큰 근육 중 경골 전치 (TA) 근육의 투약 및 분석에 중점을 둔다.
치료
아데노 관련 바이러스 항원형 9 (AAV9) 캡시드를 국소 근육 내 주사를 통한 재조합 발현 작제물의 투여를 위해 선택하였다. AAV9 이외에, AAV8, AAVRh74를 포함하는, AAV 캡시드의 다수의 상이한 항원형을 시험하였다. Spc512 합성 근육 프로모터 (AAV9-eGFP)의 제어 하에 형광 단백질 GFP를 발현하는 재조합 AAV9 작제물을 사용하여 근육 형질도입을 평가하였다. 모든 성별의 마우스에 각각의 TA 근육에 2e11 총 벡터 게놈의 용량으로 50 μl의 단일 가닥 벡터를 주입하였다. 20 일 후, 마우스를 희생시키고 주입된 사지를 생체 내 영상에 의해 검사하였다.
결과
도 13에 나타낸 바와 같이, TA 근육에 AAV9-eGFP 작제물의 직접 주사는 사지에서 검출되는 상당량의 국소 형광을 초래하며, 벡터 모두가 근육 세포를 형질도입시키는데 효과적이며 직접 주사 후 이식유전자 발현을 초래함을 제시한다.
실시예 9 - 내인성 PABPN1의 동시 유전자 침묵 및 코돈 최적화된 PABPN1으로의 치환을 위한 단일 "침묵 및 치환 작제물 "의 생성.
optPABPN1 서열과 결합하여 shmiR17 및 shmiR13(예를 들어, 표 3 및 4에 기술된 바와 같음)을 발현하는 단일 가닥 아데노-관련 바이러스 유형 2 (ssAAV2) 플라스미드 발현 를 생성하였다.
침묵 및 치환 작제물 (이하 "SR-작제물")을 pAAV2 벡터 백본 (pAAV-shmiR 바이러스 플라스미드)에서 optPABPN1 전사체의 3' 비번역 영역으로 shmiR17 및 shmiR13을 암호화하는 DNA 서열을 서브클로닝함으로써 생성하였다 (표 4에 기술된 바와 같음). 단일 전사체에서 optPABPN1 및 2개의 shmiR 모두의 발현이 근육 특이적 프로모터 Spc512에 의해 유도된다. SR-작제물의 도해를 도 14에 제공한다.
그런 다음 재조합 위형화 AAV 벡터 스톡을 생성하였다. 간략하게, HEK293T 세포를 10% FBS가 보충된, 둘베코 변형 이글 배지의 세포 공장에서 배양하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양한다. pAAV-shmiR 바이러스 플라스미드 및 pAAV헬퍼 및 pAAVrepcap8 플라스미드 또는 pAAV헬퍼 및 pAAV repcap9 또는 pAAV 헬퍼 및 pAAVRH74 플라스미드를 제조사 지시에 따라 인산 칼슘과 복합체화하였다. 그런 다음 HEK293T 세포에서 pAAV헬퍼 및 하기 캡시드; pAAVrepcap8, pAAVrepcap9 또는 pAAVRH74 중 하나와 결합하여 pAAV-shmiR 플라스미드로 삼중 형질주입을 수행하였다. 그런 다음 HEK293T 세포를 72 시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양한 후, 세포를 용해시키고 ssAAV shmiR-발현 입자를 아이오디사놀 (Sigma-Aldrich) 단계 구배 초원심분리 후 염산 세슘 초원심분리에 의해 정제하였다. 벡터 게놈의 수를 정량적 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR)에 의해 정량하였다.
실시예 10 - 단일 벡터 "침묵 및 치환" 접근을 사용한 생체 내 효능 연구.
치료
OPMD 관련 질환 모델에서 실시예 9에서 기술된 SR-작제물의 생체 내 효능을 시험하기 위해, SR-작제물을 10 내지 12 주령 A17 마우스의 TA 근육에 근육 내 주사를 통해, 고용량 및 저용량으로, 개별적으로 투여하였다. 저용량은 근육 당 1x1010 벡터 게놈으로 설정하였다. 고용량은 근육 당 6x1010 벡터 게놈으로 설정하였다. 식염수가 주입된 연령 일치 A17 마우스를 비치료군으로 사용하고, FVB 야생형 마우스를 또한 건강한 비교군으로 포함하였다. SR-작제물의 상이한 용량의 질환에 대한 영향을 조사할 뿐만 아니라, 상이한 시점에 관련된 효능을 평가하기 위해 치료 후 14 주 또는 20 주에 별도의 코호트의 마우스를 희생시켰다. 희생시, TA 근육을 채취하였고 RNA 및 단백질을 추출하였다.
qPCR 분석
PABPN1 수준의 낙다운을 확인하기 위해, TA 근육으로부터 단리된 RNA를 QPCR 분석에 의해 평가하였다. 사용된 QPCR 프라이머는 PABPN1와 돌연변이 PABPN1 전사체를 구별할 수 없었지만, 코돈 최적화된 PABPN1 종에 상응하는 서열을 인식하거나 증폭시키지 않았다. 고용량 및 저용량 모두에서 각각 88.3% 및 68.3%의 PABPN1 전사체의 감소를 초래하는 강력한 낙다운이 SR-작제물에서 관찰되었다 (도 15). 이들 조직으로부터의 추가 분석은 상이한 수준의 투여된 벡터와 일치하는 비율로 shmiR 이식유전자의 존재를 입증하였다.
유사하게, 코돈 최적화된 PABPN1 서열을 선택적으로 증폭하고 정상 야생형 및 돌연변이 PABPN1 서열을 구별할 수 있는 프라이머 세트를 사용한 QPCR 분석을 코돈 최적화된 PABPN1 모이어티의 발현을 확인하기 위해 사용하였다.
이러한 QPCR 분석은 SR-작제물이 투여된 동물이 고용량 및 저용량 각각의 FvB 마우스에서 평균적으로 정상 PABPN1 수준의 90.9% 및 13.7%의 코돈 최적화된 PABPN1 수준을 발현한다는 것을 입증하였다 (도 16).
종합하여, 분석은 단일 전사체가 A17 마우스 모델에서 돌연변이 형태를 포함하는 PABPN1 수준을 낙다운시키는 능력을 가진 기능성 shmiR을 생성할 수 있다는 것을 확인하였다. 유사하게, 이들 벡터는 PABPN1 기능을 회복하기 위한 치환물로서 적절한 수준의 코돈 최적화된 PABPN1을 동시에 생산한다.
핵내 봉입체 ( INIs )
핵내 봉입체 (INIs)의 지속에 대한 SR-작제물의 영향을 14 주 동물에서 시험하였다. 도 17로부터 명백한 바와 같이, A17 마우스의 거의 35%의 모든 TA 근육 세포는 INI를 나타내는 녹색 반점 염색을 나타냈다. 적색 라미닌 (근육 세포의 세포외 매트릭스에서 풍부한 단백질) 및 청색 DAPI 대비염색을 각각 세포 형태 및 핵을 정의하는데 사용하였다 (도 18). 연속 절편의 범위를 통해, SR-작제물의 고용량 및 저용량 모두를 사용한 치료는 INI의 유의한 감소를 입증하였다.
근육 중량
근육 중량의 회복에 대한 SR-작제물의 영향을 또한 20 주 동물에서 시험하였다.
A17 마우스로부터의 TA 근육 세포는 그들의 FvB 야생형 대조군의 유사한 근육보다 거의 25% 무게가 덜 나간다. 시험 투여량 모두에서, SR-작제물은 FVB 동물의 야생형 수준에 가까운 근육 중량의 유의한 회복을 나타냈다 (도 19).
근육 강도
마지막으로, 20 주 동물에서 근육 강도의 회복에 대한 SR-작제물의 영향을 최대 힘 측정에 의해 평가하였다.
보정점으로서 150 mHz 주파수를 사용하여, A17 마우스는 각각 1050 nm 대 1500 nm에서 야생형 FvB 대조군 보다 거의 30% 적은 최대 힘을 가졌다. SR-작제물 치료는 최대 힘에서 완만한 증가를 유도하여, A17 마우스 대 FVB 야생형 동물에서 알려진 강도 차이의 거의 66%를 회복시켰다 (도 20). 도 20의 통계는 A17 식염수 마우스에 비해 비쌍체 t-검정으로서 나타낸다 (*p<0.05, **p<0.01).
종합적으로, 이러한 생체 내 연구로부터 본원에서 제시된 데이터는 SR-작제물 치료가 A17 모델 시스템에서 OPMD 질환의 생리학적 특징에 영향을 미친다는 것을 입증한다.
당업계의 당업자는 본 개시의 넓은 일반적인 범위를 벗어나지 않으면서 상기 기술된 양태에 대해 다양한 변이 및/또는 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 양태는 모든 측접에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 고려되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Benitec Biopharma Limited <120> Reagents for treatment of oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD) and use thereof <130> 180511 <150> US 62/434,312 <151> 2016-12-14 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagaagcaga ugaauaugag uccaccuc 28 <210> 2 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaacgaggua gagaagcaga ugaauaug 28 <210> 3 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 gaagcugaga agcuaaagga gcuacaga 28 <210> 4 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 gggcuagagc gacaucaugg uauucccc 28 <210> 5 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 cugugugaca aauuuagugg ccauccca 28 <210> 6 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 gacuauggug caacagcaga agagcugg 28 <210> 7 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 cgagguagag aagcagauga auaugagu 28 <210> 8 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 cagugguuuu aacagcaggc cccggggu 28 <210> 9 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 agagcgacau caugguauuc cccuuacu 28 <210> 10 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 gguagagaag cagaugaaua ugagucca 28 <210> 11 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 auugaggaga agauggaggc ugaugccc 28 <210> 12 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggaggaagaa gcugagaagc uaaaggag 28 <210> 13 <211> 28 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 aacgagguag agaagcagau gaauauga 28 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR2 <400> 14 agcagaugaa uaugagucca 20 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR2 <400> 15 uggacucaua uucaucugcu u 21 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR3 <400> 16 gagguagaga agcagaugaa 20 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR3 <400> 17 uucaucugcu ucucuaccuc g 21 <210> 18 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR4 <400> 18 cugagaagcu aaaggagcua 20 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR4 <400> 19 uagcuccuuu agcuucucag c 21 <210> 20 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR5 <400> 20 uagagcgaca ucaugguauu 20 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR5 <400> 21 aauaccauga ugucgcucua g 21 <210> 22 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR6 <400> 22 gugacaaauu uaguggccau 20 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR6 <400> 23 auggccacua aauuugucac a 21 <210> 24 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR7 <400> 24 auggugcaac agcagaagag 20 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR7 <400> 25 cucuucugcu guugcaccau a 21 <210> 26 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR9 <400> 26 guagagaagc agaugaauau 20 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR9 <400> 27 auauucaucu gcuucucuac c 21 <210> 28 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR11 <400> 28 gguuuuaaca gcaggccccg 20 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR11 <400> 29 cggggccugc uguuaaaacc a 21 <210> 30 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR13 <400> 30 cgacaucaug guauuccccu 20 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR13 <400> 31 aggggaauac caugaugucg c 21 <210> 32 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR14 <400> 32 gagaagcaga ugaauaugag 20 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR14 <400> 33 cucauauuca ucugcuucuc u 21 <210> 34 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR15 <400> 34 aggagaagau ggaggcugau 20 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR15 <400> 35 aucagccucc aucuucuccu c 21 <210> 36 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR16 <400> 36 gaagaagcug agaagcuaaa 20 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR16 <400> 37 uuuagcuucu cagcuucuuc c 21 <210> 38 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shmiR17 <400> 38 agguagagaa gcagaugaau 20 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shmiR17 <400> 39 auucaucugc uucucuaccu c 21 <210> 40 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Stem loop <400> 40 acugugaagc agaugggu 18 <210> 41 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> 5' flanking sequence of the pri-miRNA backbone <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is u or a <400> 41 gguauauugc uguugacagu gagcgn 26 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> 3' flanking sequence of the pri-miRNA backbone <400> 42 cgccuacugc cucggacuuc aa 22 <210> 43 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR2 <400> 43 gguauauugc uguugacagu gagcguagca gaugaauaug aguccaacug ugaagcagau 60 ggguuggacu cauauucauc ugcuucgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 44 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR3 <400> 44 gguauauugc uguugacagu gagcgagagg uagagaagca gaugaaacug ugaagcagau 60 ggguuucauc ugcuucucua ccucgcgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 45 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR4 <400> 45 gguauauugc uguugacagu gagcgacuga 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acuucaa 107 <210> 50 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR11 <400> 50 gguauauugc uguugacagu gagcgagguu uuaacagcag gccccgacug ugaagcagau 60 gggucggggc cugcuguuaa aaccacgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 51 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR13 <400> 51 gguauauugc uguugacagu gagcgacgac aucaugguau uccccuacug ugaagcagau 60 ggguagggga auaccaugau gucgccgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 52 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR14 <400> 52 gguauauugc uguugacagu gagcgugaga agcagaugaa uaugagacug ugaagcagau 60 gggucucaua uucaucugcu ucucucgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 53 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR15 <400> 53 gguauauugc uguugacagu gagcgaagga gaagauggag gcugauacug ugaagcagau 60 ggguaucagc cuccaucuuc uccuccgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 54 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR16 <400> 54 gguauauugc uguugacagu gagcgagaag aagcugagaa gcuaaaacug ugaagcagau 60 ggguuuuagc uucucagcuu cuucccgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 55 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNA sequence encoding shmiR17 <400> 55 gguauauugc uguugacagu gagcgaaggu agagaagcag augaauacug ugaagcagau 60 ggguauucau cugcuucucu accuccgccu acugccucgg acuucaa 107 <210> 56 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding shmiR2 <400> 56 ggtatattgc tgttgacagt gagcgtagca gatgaatatg agtccaactg tgaagcagat 60 gggttggact catattcatc tgcttcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 57 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding shmiR3 <400> 57 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagagg tagagaagca gatgaaactg tgaagcagat 60 gggtttcatc tgcttctcta cctcgcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 58 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding shmiR4 <400> 58 ggtatattgc tgttgacagt gagcgactga gaagctaaag gagctaactg tgaagcagat 60 gggttagctc ctttagcttc tcagccgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 59 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding shmiR5 <400> 59 ggtatattgc tgttgacagt gagcgataga gcgacatcat ggtattactg tgaagcagat 60 gggtaatacc atgatgtcgc tctagcgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 60 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding shmiR6 <400> 60 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtga caaatttagt ggccatactg tgaagcagat 60 gggtatggcc actaaatttg tcacacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 61 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding shmiR7 <400> 61 ggtatattgc tgttgacagt gagcgaatgg tgcaacagca gaagagactg tgaagcagat 60 gggtctcttc tgctgttgca ccatacgcct actgcctcgg acttcaa 107 <210> 62 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA sequence encoding shmiR9 <400> 62 ggtatattgc tgttgacagt gagcgagtag agaagcagat gaatatactg tgaagcagat 60 gggtatattc atctgcttct ctacccgcct actgcctcgg 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tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc 420 cctcattcta ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagcgtcgat 480 cattgaagtt actattccga agttcctatt ctctagaatt cgccaccacg cgtggtatat 540 tgctgttgac agtgagcgag aggtagagaa gcagatgaaa ctgtgaagca gatgggtttc 600 atctgcttct ctacctcgcg cctactgcct cggacttcaa atcatctact ccatggccct 660 ctgcgtttgc tgaagacaga accgcaaagc aggacccgac aggattctcc ccgcctcttc 720 agagactatg tttacaagat atcggtatat tgctgttgac agtgagcgtg agaagcagat 780 gaatatgaga ctgtgaagca gatgggtctc atattcatct gcttctctcg cctactgcct 840 cggacttcaa gtcgacgcta gcaataaagg atcctttatt ttcattggat ccgtgtgttg 900 gttttttgtg tgcggttaat taaggtaccc gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgccc 960 tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt 1020 tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg 1080 ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc 1140 gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc 1200 tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg ccggcggcgg cccacgagct acccggagga 1260 gcgggaggcg ccaagctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgccac 1320 catggccgct gccgccgctg ctgctgccgc agccggcgct gccggcggaa gaggcagcgg 1380 ccctggcaga cggcggcatc tggtccctgg cgccggaggg gaggccggcg aaggcgcccc 1440 tggcggagcc ggcgactacg gcaacggcct ggaaagcgag gaactggaac ccgaggaact 1500 gctgctggaa cctgagcccg agccagagcc cgaggaagag ccccctaggc caagagcccc 1560 ccctggcgcc ccaggaccag gaccaggctc tggggcacca ggctctcagg aagaggaaga 1620 agagcccggc ctcgtcgagg gagacccagg cgatggcgct atcgaagatc ccgagctgga 1680 agccatcaag gccagagtgc gggagatgga agaggaggcc gaaaaattga aagagctgca 1740 gaacgaagtc gaaaaacaaa tgaacatgtc cccccctcct ggaaatgctg gccctgtgat 1800 catgagcatc gaggaaaaga tggaagccga cgcccggtct atctacgtgg gcaacgtgga 1860 ctacggcgcc accgccgaag aactggaagc ccactttcac ggctgtggca gcgtgaaccg 1920 ggtgaccatc ctgtgcgaca agttcagcgg ccaccccaag ggcttcgcct acatcgagtt 1980 cagcgacaaa gaaagcgtgc ggacctctct ggctctcgac gagtctctgt tcaggggaag 2040 gcagatcaag gtcatcccca agcggaccaa caggcccggc atcagcacca ccgacagagg 2100 cttccctagg gctaggtaca gagcccggac caccaactac aacagcagca gaagccggtt 2160 ctacagcggc ttcaattctc ggcctagagg cagagtgtac cggggcaggg ccagggccac 2220 ctcctggtac agcccctacg aacagaagct gatcagcgag gaagatctgt gatgagatat 2280 ctgatgacat atgacgcgtt taattaactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2340 gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2400 aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2460 tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2520 tgggctctat gg 2532 <210> 70 <211> 2532 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Double expression construct version 1 coding for shmiR17, shmiR13 and codon optimized PABPN1 <400> 70 cgatcgcgcg cagatctgtc atgatgatcc tagcatgctg cccatgtaag gaggcaaggc 60 ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 120 ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct gcatgccatg ttcccggcga agggccagct 180 gtcccccgcc agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg 240 ggcagcccat acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac 300 ggtgcccggg caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc 360 ccctcctggc tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc 420 cctcattcta ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagcgtcgat 480 cattgaagtt actattccga agttcctatt ctctagaatt cgccaccacg cgtggtatat 540 tgctgttgac agtgagcgaa ggtagagaag cagatgaata ctgtgaagca gatgggtatt 600 catctgcttc tctacctccg cctactgcct cggacttcaa atcatctact ccatggccct 660 ctgcgtttgc tgaagacaga accgcaaagc aggacccgac aggattctcc ccgcctcttc 720 agagactatg tttacaagat atcggtatat tgctgttgac agtgagcgac gacatcatgg 780 tattccccta ctgtgaagca gatgggtagg ggaataccat gatgtcgccg cctactgcct 840 cggacttcaa gtcgacgcta gcaataaagg atcctttatt ttcattggat ccgtgtgttg 900 gttttttgtg tgcggttaat taaggtaccc gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgccc 960 tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt 1020 tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg 1080 ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc 1140 gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc 1200 tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg ccggcggcgg cccacgagct acccggagga 1260 gcgggaggcg ccaagctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgccac 1320 catggccgct gccgccgctg ctgctgccgc agccggcgct gccggcggaa gaggcagcgg 1380 ccctggcaga cggcggcatc tggtccctgg cgccggaggg gaggccggcg aaggcgcccc 1440 tggcggagcc ggcgactacg gcaacggcct ggaaagcgag gaactggaac ccgaggaact 1500 gctgctggaa cctgagcccg agccagagcc cgaggaagag ccccctaggc caagagcccc 1560 ccctggcgcc ccaggaccag gaccaggctc tggggcacca ggctctcagg aagaggaaga 1620 agagcccggc ctcgtcgagg gagacccagg cgatggcgct atcgaagatc ccgagctgga 1680 agccatcaag gccagagtgc gggagatgga agaggaggcc gaaaaattga aagagctgca 1740 gaacgaagtc gaaaaacaaa tgaacatgtc cccccctcct ggaaatgctg gccctgtgat 1800 catgagcatc gaggaaaaga tggaagccga cgcccggtct atctacgtgg gcaacgtgga 1860 ctacggcgcc accgccgaag aactggaagc ccactttcac ggctgtggca gcgtgaaccg 1920 ggtgaccatc ctgtgcgaca agttcagcgg ccaccccaag ggcttcgcct acatcgagtt 1980 cagcgacaaa gaaagcgtgc ggacctctct ggctctcgac gagtctctgt tcaggggaag 2040 gcagatcaag gtcatcccca agcggaccaa caggcccggc atcagcacca ccgacagagg 2100 cttccctagg gctaggtaca gagcccggac caccaactac aacagcagca gaagccggtt 2160 ctacagcggc ttcaattctc ggcctagagg cagagtgtac cggggcaggg ccagggccac 2220 ctcctggtac agcccctacg aacagaagct gatcagcgag gaagatctgt gatgagatat 2280 ctgatgacat atgacgcgtt taattaactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2340 gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2400 aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2460 tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2520 tgggctctat gg 2532 <210> 71 <211> 1943 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Double expression construct version 2 coding for shmiR3, shmiR14 and codon optimized PABPN1 <400> 71 cgagctccac cgcggtggcg gccgtccgcc ctcggcacca tcctcacgac acccaaatat 60 ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg gtgaggaagg tgggcaggca 120 gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt tttagagcgg aggaatggtg 180 gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata tttgggtgtc cgccctcggc 240 cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg 300 gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc gccaagctct agaactagtg 360 gatcccccgg gctgcaggaa ttcgatgcca ccatggccgc tgccgccgct gctgctgccg 420 cagccggcgc tgccggcgga agaggcagcg gccctggcag acggcggcat ctggtccctg 480 gcgccggagg ggaggccggc gaaggcgccc ctggcggagc cggcgactac ggcaacggcc 540 tggaaagcga ggaactggaa cccgaggaac tgctgctgga acctgagccc gagccagagc 600 ccgaggaaga gccccctagg ccaagagccc cccctggcgc cccaggacca ggaccaggct 660 ctggggcacc aggctctcag gaagaggaag aagagcccgg cctcgtcgag ggagacccag 720 gcgatggcgc tatcgaagat cccgagctgg aagccatcaa ggccagagtg cgggagatgg 780 aagaggaggc cgaaaaattg aaagagctgc agaacgaagt cgaaaaacaa atgaacatgt 840 ccccccctcc tggaaatgct ggccctgtga tcatgagcat cgaggaaaag atggaagccg 900 acgcccggtc tatctacgtg ggcaacgtgg actacggcgc caccgccgaa gaactggaag 960 cccactttca cggctgtggc agcgtgaacc gggtgaccat cctgtgcgac aagttcagcg 1020 gccaccccaa gggcttcgcc tacatcgagt tcagcgacaa agaaagcgtg cggacctctc 1080 tggctctcga cgagtctctg ttcaggggaa ggcagatcaa ggtcatcccc aagcggacca 1140 acaggcccgg catcagcacc accgacagag gcttccctag ggctaggtac agagcccgga 1200 ccaccaacta caacagcagc agaagccggt tctacagcgg cttcaattct cggcctagag 1260 gcagagtgta ccggggcagg gccagggcca cctcctggta cagcccctac tgatgacata 1320 tgacgcgtgg tatattgctg ttgacagtga gcgagaggta gagaagcaga tgaaactgtg 1380 aagcagatgg gtttcatctg cttctctacc tcgcgcctac tgcctcggac ttcaaatcat 1440 ctactccatg gccctctgcg tttgctgaag acagaaccgc aaagcaggac ccgacaggat 1500 tctccccgcc tcttcagaga ctatgtttac aagatatcgg tatattgctg ttgacagtga 1560 gcgtgagaag cagatgaata tgagactgtg aagcagatgg gtctcatatt catctgcttc 1620 tctcgcctac tgcctcggac ttcaagtcga cgctagcaat aaaggatcct ttattttcat 1680 tggatccgtg tgttggtttt ttgtgtgcgg ttaattaact gtgccttcta gttgccagcc 1740 atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1800 cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1860 ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1920 tggggatgcg gtgggctcta tgg 1943 <210> 72 <211> 1943 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Double expression construct version 2 coding for shmiR17, shmiR13 and codon optimized PABPN1 <400> 72 cgagctccac cgcggtggcg gccgtccgcc ctcggcacca tcctcacgac acccaaatat 60 ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg gtgaggaagg tgggcaggca 120 gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt tttagagcgg aggaatggtg 180 gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata tttgggtgtc cgccctcggc 240 cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg 300 gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc gccaagctct agaactagtg 360 gatcccccgg gctgcaggaa ttcgatgcca ccatggccgc tgccgccgct gctgctgccg 420 cagccggcgc tgccggcgga agaggcagcg gccctggcag acggcggcat ctggtccctg 480 gcgccggagg ggaggccggc gaaggcgccc ctggcggagc cggcgactac ggcaacggcc 540 tggaaagcga ggaactggaa cccgaggaac tgctgctgga acctgagccc gagccagagc 600 ccgaggaaga gccccctagg ccaagagccc cccctggcgc cccaggacca ggaccaggct 660 ctggggcacc aggctctcag gaagaggaag aagagcccgg cctcgtcgag ggagacccag 720 gcgatggcgc tatcgaagat cccgagctgg aagccatcaa ggccagagtg cgggagatgg 780 aagaggaggc cgaaaaattg aaagagctgc agaacgaagt cgaaaaacaa atgaacatgt 840 ccccccctcc tggaaatgct ggccctgtga tcatgagcat cgaggaaaag atggaagccg 900 acgcccggtc tatctacgtg ggcaacgtgg actacggcgc caccgccgaa gaactggaag 960 cccactttca cggctgtggc agcgtgaacc gggtgaccat cctgtgcgac aagttcagcg 1020 gccaccccaa gggcttcgcc tacatcgagt tcagcgacaa agaaagcgtg cggacctctc 1080 tggctctcga cgagtctctg ttcaggggaa ggcagatcaa ggtcatcccc aagcggacca 1140 acaggcccgg catcagcacc accgacagag gcttccctag ggctaggtac agagcccgga 1200 ccaccaacta caacagcagc agaagccggt tctacagcgg cttcaattct cggcctagag 1260 gcagagtgta ccggggcagg gccagggcca cctcctggta cagcccctac tgatgacata 1320 tgacgcgtgg tatattgctg ttgacagtga gcgaaggtag agaagcagat gaatactgtg 1380 aagcagatgg gtattcatct gcttctctac ctccgcctac tgcctcggac ttcaaatcat 1440 ctactccatg gccctctgcg tttgctgaag acagaaccgc aaagcaggac ccgacaggat 1500 tctccccgcc tcttcagaga ctatgtttac aagatatcgg tatattgctg ttgacagtga 1560 gcgacgacat catggtattc ccctactgtg aagcagatgg gtaggggaat accatgatgt 1620 cgccgcctac tgcctcggac ttcaagtcga cgctagcaat aaaggatcct ttattttcat 1680 tggatccgtg tgttggtttt ttgtgtgcgg ttaattaact gtgccttcta gttgccagcc 1740 atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1800 cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1860 ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1920 tggggatgcg gtgggctcta tgg 1943 <210> 73 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human codon-optimized PABPN1 cDNA sequence <400> 73 atggccgctg ccgccgctgc tgctgccgca gccggcgctg ccggcggaag aggcagcggc 60 cctggcagac ggcggcatct ggtccctggc gccggagggg aggccggcga aggcgcccct 120 ggcggagccg gcgactacgg caacggcctg gaaagcgagg aactggaacc cgaggaactg 180 ctgctggaac ctgagcccga gccagagccc gaggaagagc cccctaggcc aagagccccc 240 cctggcgccc caggaccagg accaggctct ggggcaccag gctctcagga agaggaagaa 300 gagcccggcc tcgtcgaggg agacccaggc gatggcgcta tcgaagatcc cgagctggaa 360 gccatcaagg ccagagtgcg ggagatggaa gaggaggccg aaaaattgaa agagctgcag 420 aacgaagtcg aaaaacaaat gaacatgtcc ccccctcctg gaaatgctgg ccctgtgatc 480 atgagcatcg aggaaaagat ggaagccgac gcccggtcta tctacgtggg caacgtggac 540 tacggcgcca ccgccgaaga actggaagcc cactttcacg gctgtggcag cgtgaaccgg 600 gtgaccatcc tgtgcgacaa gttcagcggc caccccaagg gcttcgccta catcgagttc 660 agcgacaaag aaagcgtgcg gacctctctg gctctcgacg agtctctgtt caggggaagg 720 cagatcaagg tcatccccaa gcggaccaac aggcccggca tcagcaccac cgacagaggc 780 ttccctaggg ctaggtacag agcccggacc accaactaca acagcagcag aagccggttc 840 tacagcggct tcaattctcg gcctagaggc agagtgtacc ggggcagggc cagggccacc 900 tcctggtaca gcccctactg a 921 <210> 74 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human wildtype PABPN1 amino acid sequence <400> 74 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn 35 40 45 Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro 50 55 60 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly 100 105 110 Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu 115 120 125 Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu 130 135 140 Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile 145 150 155 160 Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val 165 170 175 Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe 180 185 190 His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe 195 200 205 Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu 210 215 220 Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg 225 230 235 240 Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr 245 250 255 Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn 260 265 270 Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro 275 280 285 Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser 290 295 300 Pro Tyr 305 <210> 75 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human wildtype PABPN1 amino acid sequence (with FLAG tag) <400> 75 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn 35 40 45 Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro 50 55 60 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly 100 105 110 Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu 115 120 125 Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu 130 135 140 Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile 145 150 155 160 Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val 165 170 175 Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe 180 185 190 His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe 195 200 205 Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu 210 215 220 Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg 225 230 235 240 Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr 245 250 255 Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn 260 265 270 Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro 275 280 285 Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser 290 295 300 Pro Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 305 310 <210> 76 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human codon-optimized PABPN1 amino acid sequence (with FLAG-tag) <400> 76 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn 35 40 45 Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro 50 55 60 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly 100 105 110 Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu 115 120 125 Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu 130 135 140 Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile 145 150 155 160 Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val 165 170 175 Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe 180 185 190 His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe 195 200 205 Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu 210 215 220 Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg 225 230 235 240 Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr 245 250 255 Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn 260 265 270 Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro 275 280 285 Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser 290 295 300 Pro Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 305 310 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> wtPABPN1-Fwd primer <400> 77 atggtgcaac agcagaagag 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> wtPABPN1-Rev primer <400> 78 ctttgggatg gccactaaat 20 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> wtPABPN1-Probe <400> 79 cggttgactg aaccacagcc atg 23 <210> 80 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> optPABPN1-For primer <400> 80 accgacagag gcttcccta 19 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> optPABPN1-Rev primer <400> 81 ttctgctgct gttgtagttg g 21 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> optPABPN1-Probe <400> 82 tggtccgggc tctgtaccta gcc 23 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> shmiR3-Fwd primer <400> 83 ttcatctgct tctctacctc g 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> shmiR13-Fwd primer <400> 84 aggggaatac catgatgtcg c 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> shmiR14-Fwd primer <400> 85 ctcatattca tctgcttctc t 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> shmiR17-Fwd primer <400> 86 attcatctgc ttctctacct c 21

Claims (50)

  1. 쇼트 헤어핀 마이크로 RNA (shmiR)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 shmiR은,
    길이가 적어도 17 뉴클레오티드인 이펙터 서열;
    이펙터 보체 서열;
    스템루프 서열; 및
    1차 마이크로 RNA (전구-miRNA) 백본을 포함하되,
    상기 이펙터 서열은 서열번호 1-13 중 임의의 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 shmiR은,
    서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 14에 제시된 이펙터 보체 서열;
    서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열;
    서열번호: 19에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 18에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 20에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 23에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 22에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 25에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 24에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 26에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 29에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 28에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 35에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 34에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR;
    서열번호: 37에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 36에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR; 및
    서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 shmiR은 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함하는, 핵산:
    상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열;
    상기 이펙터 보체 서열;
    상기 스템루프 서열;
    상기 이펙터 서열; 및
    상기 전구-miRNA 백본의 3 '측접 서열.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스템루프 서열은 서열번호: 40에 제시된 서열인, 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구-miRNA 백본은 전구-miR-30a 백본인, 핵산.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구-miRNA 백본의 5' 측접 서열은 서열번호: 41에 제시되고 상기 전구-miRNA 백본의 3' 측접 서열은 서열번호: 42에 제시되는, 핵산.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 shmiR은 서열번호: 43-55 중 임의의 하나에 기재되는 서열을 포함하는, 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 shmiR을 암호화하는 상기 DNA 서열은 서열번호: 56-68 중 임의의 하나에 제시되는, 핵산.
  9. 복수의 핵산으로서, 하기를 포함하는, 복수의 핵산:
    (a) 제1항 내지 제8항 중 임의의 한 항에 따른 적어도 하나의 핵산; 및
    (b) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 핵산:
    (i) 제1항 내지 제8항 중 임의의 한 항에 따른 핵산; 또는
    (ii) 길이가 적어도 17 뉴클레오티드인 이펙터 서열 및 핵산 보체 서열을 포함하는 shmiR 또는 쇼트 헤어핀 RNA (shRNA)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 이펙터 서열은 안구인두근위축증 (OPMD)의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사체에 실질적으로 상보적인, 핵산,
    여기서, (a)에서 핵산에 의해 암호화된 상기 shmiR 및 (b)에서 핵산에 의해 암호화된 상기 shmiR 또는 shRNA는 상이한 이펙터 서열을 포함하는, 복수의 핵산.
  10. 제1항 내지 제8항 중 임의의 한 항에 따른 핵산 또는 제9항에 따른 복수의 핵산을 포함하는, DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작제물.
  11. 제10항에 있어서, 제1항 내지 제8항 중 임의의 한 항에 따른 적어도 두개의 핵산을 포함하며, 각각의 상기 핵산은 상이한 shmiR을 암호화하는, ddRNAi 작제물.
  12. 제11항에 있어서, 각각의 상기 적어도 두개의 핵산은 서열번호: 1, 2, 4, 7, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는, ddRNAi 작제물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 적어도 두개의 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, ddRNAi 작제물.
    서열번호: 15에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 14에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산(shmiR2);
    서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR3);
    서열번호: 21에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 20에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR5);
    서열번호: 27에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 26에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR9);
    서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR13);
    서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14); 및
    서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR17).
  14. 제13항에 있어서, 상기 적어도 두개의 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, ddRNAi 작제물:
    서열번호: 56에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR2);
    서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3);
    서열번호: 59에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR5);
    서열번호: 62에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR9);
    서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13);
    서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14); 및
    서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 적어도 두개의 핵산은 하기 서열번호: 2, 9, 10 및 13 중 하나에 제시된 RNA 전사체에서 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는, ddRNAi 작제물.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 두개의 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, ddRNAi 작제물:
    서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR3);
    서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR13);
    서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14); 및
    서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR17).
  17. 제16항에 있어서, 상기 적어도 두개의 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, ddRNAi 작제물:
    서열번호: 57에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR3);
    서열번호: 64에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13);
    서열번호: 65에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR14); 및
    서열번호: 68에 제시된 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, ddRNAi 작제물:
    (a) 서열번호: 31에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 30에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR13); 및
    (b) 서열번호: 39에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 38에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR17).
  19. 제18항에 있어서, 하기를 포함하는, ddRNAi 작제물:
    (a) 서열번호: 64에 제시된 상기 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR13); 및
    (b) 서열번호: 68에 제시된 상기 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 (shmiR17).
  20. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, ddRNAi 작제물:
    (a) 서열번호: 17에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 16에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR3); 및
    (b) 서열번호: 33에 제시된 이펙터 서열 및 서열번호: 32에 제시된 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiR을 암호화하는 DNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14).
  21. 제20항에 있어서, 하기를 포함하는, ddRNAi 작제물:
    (a) 서열번호: 57에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR3); 및
    (b) 서열번호: 65에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 (shmiR14).
  22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, shmiR을 암호화하는 상기 또는 각각의 핵산의 업스트림에 RNA pol III 프로모터를 포함하는, ddRNAi 작제물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 또는 각각의 RNA pol III 프로모터는 U6 및 H1 프로모터로부터 선택되는, ddRNAi 작제물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 또는 각각의 RNA pol III 프로모터는 U6-9 프로모터, U6-1 프로모터 및 U6-8 프로모터로부터 선택되는 U6 프로모터인, ddRNAi 작제물.
  25. DNA 작제물로서,
    (a) 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 ddRNAi 작제물; 및
    (b) 상기 ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 상기 shmiR(들)에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 갖는 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 PABPN1 작제물을 포함하는, DNA 작제물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열은 그것의 mRNA 전사체가 상기 ddRNAi 작제물의 상기 shmiR에 의해 표적화되지 않도록 코돈 최적화되는, DNA 작제물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열은 서열번호: 73에 기재되는, DNA 작제물.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열은 상기 PABPN1 작제물 내에 포함되고 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열의 업스트림에 위치하는 프로모터에 작동가능하게 연결되는, DNA 작제물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 PABPN1 작제물 내에 포함되는 상기 프로모터는 근육-특이적 프로모터인, DNA 작제물.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 작제물은 5' 에서 3' 방향으로, 상기 ddRNAi 작제물 및 상기 PABPN1 작제물을 포함하는, DNA 작제물.
  31. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 작제물은 5' 에서 3' 방향으로, 상기 PABPN1 작제물 및 상기 ddRNAi 작제물을 포함하는, DNA 작제물.
  32. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 ddRNAi 작제물 또는 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 DNA 작제물.
  33. 복수의 발현 벡터로서,
    (a) 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 상기 ddRNAi 작제물을 포함하는 발현 벡터; 및
    (b) 상기 ddRNAi 작제물에 의해 암호화된 상기 shmiR(들)에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사체를 갖는 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 PABPN1 작제물을 포함하는 발현 벡터
    를 포함하는, 복수의 발현 벡터.
  34. 제33항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열은 그것의 mRNA 전사체가 상기 ddRNAi 작제물의 상기 shmiR에 의해 표적화되지 않도록 코돈 최적화되는, 복수의 발현 벡터.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열은 서열번호: 73에 제시되는, 복수의 발현 벡터.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열은 상기 PABPN1 작제물 내에 포함되고 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열의 업스트림에 위치하는 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 복수의 발현 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 상기 PABPN1 작제물 내에 포함되는 상기 프로모터는 근육-특이적 프로모터인, 복수의 발현 벡터.
  38. 제32항의 발현벡터 또는 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 복수의 발현 벡터에 있어서, 상기 또는 각각의 발현 벡터는 플라스미드 또는 미니서클인, 복수의 발현 벡터.
  39. 제32항의 발현벡터 또는 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 복수의 발현 벡터에 있어서, 상기 또는 각각의 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 (AdV) 벡터 및 렌티바이러스 (LV) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 벡터인, 복수의 발현 벡터.
  40. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 ddRNAi 작제물 또는 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 DNA 작제물 또는 제32항 또는 제38항 또는 제39항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터 또는 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 복수의 발현 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  42. 개체에서 안구인두근위축증 (OPMD)의 원인인 PABPN1 단백질의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 ddRNAi 작제물 또는 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 DNA 작제물 또는 제32항 또는 제38항 또는 제39항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터 또는 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 복수의 발현 벡터 또는 제40항 또는 제41항에 따른 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 안구인두근위축증 (OPMD)을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 ddRNAi 작제물 또는 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 DNA 작제물 또는 제32항 또는 제38항 또는 제39항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터 또는 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 복수의 발현 벡터 또는 제40항 또는 제41항에 따른 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 방법은 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 복수의 발현 벡터를 함께, 동시에 또는 연속적으로 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 키트로서,
    (a) OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 억제하기 위한 하나 이상의 제제로서, (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 핵산; 또는 (ii) 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 ddRNAi 작제물; 또는 (iii) 제32항 또는 제38항 또는 제39항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터; 또는 (iv) 제40항 또는 제41항에 따른 조성물로부터 선택되는, 상기 제제(들); 및
    (b) (a)에서 제제에 의해 발현된 shmiR에 의해 표적화하지 않는 mRNA 전사체를 갖는 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터
    를 포함하는, 키트.
  46. 제45항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열은 그것의 mRNA 전사체가 (a)에서 제제에 의해 암호화된 상기 shmiR에 의해 표적화되지 않도록 코돈 최적화되는, 키트.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열은 서열번호: 73에 제시되는, 키트.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 상기 발현 벡터 내에 포함되고 상기 기능적 PABPN1 단백질을 암호화하는 상기 DNA 서열의 업스트림에 위치하는 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 키트.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 복수의 발현 벡터를 포함하되, 상기 복수의 발현 벡터의 (a) 및 (b)는 상기 키트의 성분 (a) 및 (b)로서 제공되는, 키트.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항의 방법에 따라 OPMD를 치료할 때 사용되는, 키트.
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