KR20190100220A - 약물 송달계용 엔도사이토시스 증강제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형광 단백질에 의해서 형성된 회합체로 이루어지는 엔도사이토시스 증강제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 형광 단백질은 백색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 및 녹색 형광 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광 단백질인 것이 바람직하다. 본 발명의 엔도사이토시스 증강제는 형광 단백질을 담지시킨 카르보실란 덴드리머로 형성된 미셀에 내포된 약물의 세포 내로 엔도사이토시스에 의한 도입을 증강할 수 있다.

Description

약물 송달계용 엔도사이토시스 증강제
본 발명은 약물 송달계에 있어서 사용할 수 있는 엔도사이토시스 증강제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 카르보실란 덴드리머 및 형광 단백질을 포함하는 약물 송달계용의 엔도사이토시스 증강제에 관한 것이다.
실롤기를 함유하는 덴드리머(이하, 본 명세서에 있어서는 「카르보실란 덴드리머」라고 한다.)는 통상 미셀을 형성하면 형광 발광하는 것이 알려져 있다. 당 등의 친수성 화합물을 담지시킨 카르보실란 덴드리머는 유기용매 중에서 AIE(aggregation-induced emission)에 의해 발광하지만, 친수기를 담지시킨 카르보실란 덴드리머로 형성된 미셀의 발광은 환경 의존이며, 강도도 약하다. 여기서, AIE란 발광성 화합물이 서로 응집한 특정 파장의 광을 조사함으로써 고효율 발광을 야기하는 현상을 말한다(비특허문헌 1 참조, 이하, 「종래 기술 1」이라고 한다.).
또한, 당을 담지시킨 카르보실란 덴드리머(이하, 「SCD」라고 하는 경우가 있다.)는 유기용매 중에서 용매 구동형 미셀을 형성하지만 수용성 용매에서는 미셀을 형성하지 않는 것이 알려져 있다(도 1 참조 및 도 2 참조). 그것에 대해, 단백질을 담지시킨 카르보실란 덴드리머(이하, 「PCD」 또는 「응집성 분자」라고 하는 경우가 있다.)는 단백질을 외측을 향한 상태에서 리포솜(이하, 「베시클」이라고 하는 경우가 있다.) 또는 미셀을 형성하는 것이 알려져 있다(도 3 참조). 이와 같이 해서 형성된 베시클 또는 미셀을 이하, 「PCD 미셀」이라고 하는 경우가 있다.
그리고, 카르보실란 덴드리머에 단백질을 제시시키면 AIE에 의해서 강한 형광 발광이 생기는 것이 알려져 있다(특허문헌 1 참조, 이하, 「종래 기술 2」라고 한다. 도 3 참조). 그리고, 제시되는 단백질을 형광 단백질로 대체하면 더욱 강한 형광 발광이 관찰된다.
현재에는 여러가지 형광을 발하는 형광 단백질이 생체 내에서의 표지를 위해서 범용되도록 되어 있다. 형광 표지로서의 사용이 시작된 초기에는 형광 단백질에 의해서 소망하지 않는 회합이 일어나, 소망의 관찰에 지장을 초래하는 경우가 종종 일어나고 있었다. 예들 들면, 4량체에서만 형광을 발하지 않는 dsRED와 같은 형광 단백질을 액틴에 추가하면 dsRED의 작용에 의해서 4개의 액틴 서브유닛이 회합해 버려, 세포 내에서 소망의 관찰이 가능하지 않게 되거나 하고 있었다.
이 때문에, 천연에는 4량체로 존재하는 형광 단백질에 수식을 추가하는 등 해서 단량체로서도 형광을 발하게 하거나, 또는 2량체여도 회합을 일으키지 않도록 변이시키거나 하는 조작을 행하여 형광 단백질을 응집시키지 않는 고안이 행해져 왔다. 그 결과, 현재 시판되고 있는 것은 2량체 또는 단량체이다(비특허문헌 2 참조).
그런데, 의약 제제를 투여하는 경우에는 치료를 요하는 질병과 약제의 성질에 따라 다르지만, 표적 부위에 얼마만큼의 유효 성분을 송달할 수 있을지가 부작용의 발생의 유무 및 주효율에 영향을 준다. 이 때문에, 의약 제제를 표적 부위에 적절하게 송달하기 위한 수단으로서 다양한 약물 송달 시스템(DDS: 드럭 딜리버리 시스템)의 개발이 활발하게 행해지고 있다.
그리고, DDS에 사용하는 담체로서, 예들 들면 리포솜, 합성 수지 입자, 덴드리머 등이 알려져 있으며, 바이러스나 세균에의 감염에 의해서 생기는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해서, 예들 들면 덴드리머를 이용한 담체의 개발이 행해지져 왔다(특허문헌 2 참조).
일본 특허 제5629888호 공보 WO2016/084979
Chem Commun(Camb). 2009 Aug 7;(29):4332-53. doi: 10.1039/b904665h. Epub 2009 May 13 https://pdbj.org/mom/174
투여된 약제 중, 90% 이상은 미변화체로서 생체에 의한 대사를 받지 않고 배출되기 때문에 일정량 이상의 투약량이 필요하다. 또한, 항체, 펩티드 그 밖의 차세대 의약이라고 하는 바와 같은 생체 고분자를 유효 성분으로 하는 의약의 경우에는, 그 자체에서는 표적 부위에 송달되기 전에 실활되어 버리기 때문에, 상기 CD 미셀 그 밖의 미셀에 내포할 필요가 있다(도 4 참조).
한편, 이러한 미셀에 내포된 약물이 약리 효과를 발휘하기 위해서는, 세포 내로의 도입이 필요하다. 그리고, 이러한 미셀에 내포된 약제의 도입은 엔도사이토시스에 의해서 행해지는 경우가 대부분이기 때문에 엔도사이토시스를 높일 필요가 있다.
또한, 엔도사이토시스를 증강하기 위해서는 어떠한 증강제가 필요하게 되지만, 이러한 증강제는 그것 자신에 생체 적합성이 있고, 상기 CD 미셀의 안정성을 손상시키지 않는 것이 아니면 안된다. 그러나, 지금까지 이러한 특성·성질을 갖는 엔도사이토시스 증강제는 종래 알려져 있지 않아, 이러한 특성·성질을 갖는 엔도사이토시스 증강제에 대한 강한 사회적 요청이 있었다.
또한, 엔도사이토시스가 증강되면 투약량의 감소로 이어진다. 그리고, 이 경우에는 미변화체의 배출량을 감소시킬 수 있기 때문에 환경에 대하여 화학물을 방출하는 것에 의한 환경 부하가 경감된다. 또한, 약제에 따라서는 부작용의 경감도 도모될 가능성이 있다.
이 때문에, 투약량을 감소시켜 표적 조직에의 송달이나 약제의 방출을 확인하면서 약제의 유효 투여량을 견적하는 도구로서 사용할 수 있으며, 미셀의 엔도사이토시스를 증강시키는 것이 가능한 증강제에 대한 강한 사회적 요청이 있었다.
본 발명자들은 티올과 할로겐화 알킬의 반응성을 이용하여 실롤 함유 카르보실란 덴드리머와, 표지 단백질을(예들 들면, 녹색 형광 단백질, 이하, (후술하는 녹색 이외의 형광을 발하는 형광 단백질를 포함하여 집합적으로 「GFP」라고 하는 경우가 있다.)을 수성 용매 중, 또는 상기 수성 용매와 유기용매의 혼합 용매 중에서 혼합한 결과, 상기 덴드리머와 단백질의 복합체인 응집성 분자(GFP를 제시한 카르보실란 덴드리머)가 형성되는 것, GFP 자신의 회합체가 발생하는 것, 및 이 회합 특성이 CD 미셀을 생성시키는 동력이 되고 있는 것을 발견했다.
그 후, 더욱 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 발명자들은 상기 응집성 분자의 작성 과정에서 발생되는 GFP 자신의 회합체가 상기 CD 미셀의 세포 내로의 엔도사이토시스를 현저하게 증강하는 것을 발견했다. 또한, GFP에 표적 결함성의 펩티드를 결합시키면 GFP의 회합 용이성이 변동되는 것도 발견하여, 본 발명을 완성한 것이다.
본 발명은 이상과 같은 상황 하에서 완성된 것이며, 카르보실란 덴드리머 및 형광 단백질을 포함하는 약물 송달계용의 엔도사이토시스 증강제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 이하의 형태를 포함하는 것이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서는 형광 단백질에 의해서 형성된 회합체로 이루어지는 엔도사이토시스 증강제이다. 여기서, 상기 형광 단백질은 백색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 및 녹색 형광 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광 단백질인 것이 바람직하다.
또한, 상기 회합체는 상기 형광 단백질이 2~10분자 응집한 것이 바람직하다. 상기 형광 단백질은 표적 인식 서열을 더 구비하는 것이 바람직하고, 세포 내로의 상기 회합체 자체의 도입을 증강하는 것이 바람직하다. 표적 인식 서열은 상기 형광 단백질의 회합체 형성을 조절할 수 있는 서열인 것이 바람직하다.
상기 표적 인식 서열은 기능성 펩티드로 구성되어 있는 것이 바람직하고, 상기 기능성 펩티드는 표적 조직에 발현되어 있는 표면 항원, 수용체, 게이트, 트랜스포터 및 채널로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표적 단백질과 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 상기 표적 인식 서열은 상기 형광 단백질의 회합체의 형성을 조절하도록 작용하는 것이 바람직하고, 상기 표적 인식 서열은 서열목록의 서열번호 1~3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드인 것이 바람직하다.
DMPGTVLPGG(서열목록의 서열번호 1)
VPTDTDYSGG(서열목록의 서열번호 2)
DMPGTVLPGG GGGSEGEWQ QQQHQWAKQE(서열목록의 서열번호 3)
또한, 상기 엔도사이토시스 증강제는 하기 식(I)으로 나타내어지는 골격 구조를 갖는 응집성 분자로 구성된 미셀의 엔도사이토시스에 의한 도입을 증강시키는 것이 바람직하다. 식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다.
Figure pct00001
상기 식(I)으로 나타내어지는 응집성 분자는 하기 식(II)으로 나타내어지는 골격을 갖는 화합물인 것이 바람직하다.
Figure pct00002
상기 응집성 분자는 하기 식(III)~(VI)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식으로 나타내어지는 것이 바람직하다. 하기 식 중, GFP는 형광 단백질을 나타낸다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명의 엔도사이토시스 증강제는 상술한 응집성 분자로 형성된 미셀의 엔도사이토시스를 증강하는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 미셀은 수성 용매 중에서 단백질을 외측으로 해서 형성되고, FRET에 의한 형광을 발하는 직경 50~500㎚의 것이다.
또한, 상기 미셀은 분자량 20만 이하의 단백질, 핵산, 및 소수성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 분자를 내포할 수 있는 것이 바람직하며, 상기 분자량 20만 이하의 단백질은 면역 글로불린 G, 렉틴, 및 펩티드 호르몬으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면, 본 발명의 엔도사이토시스는 상술한 응집성 분자로 구성된 미셀의 세포에의 엔도사이토시스를 증강할 수 있는 엔도사이토시스 증강제를 제공할 수 있다. 여기서, 본 발명의 엔도사이토시스 증강제는 생체 내에 있어서도 검출·관찰이 가능한 강한 형광 강도를 갖고 있다.
도 1은 실롤 덤벨(1)6-Lac의 기본적인 형태(A) 및 미셀 형성을 나타내는 모식도(B)이다.
도 2는 아세톤/물의 혼합 용매 중에 있어서의 실롤 덤벨(1)6-Lac가 형성하는 미셀의 입자지름과 형광 강도의 관계(A) 및 형광 파장의 변화를 나타내는 도면(B)이다.
도 3은 GFP와 결합한 카르보실란 덴드리머를 나타내는 모식도(A)이다. 도면 중에서, 형광 단백질은 검은 직사각형으로 나타내고, 상세한 구조를 사각형 설명선 안에 모식적으로 나타내고 있다. GFP를 제시한 카르보실란 덴드리머(응집 분자)가 응집하기 전의 상태를 나타내는 도면(B)이다. 상기 응집성 분자가 응집한 상태를 나타내는 도면(C)이다.
도 4는 상기 응집성 분자에 내포시킬 수 있는 생체 고분자의 모식도(A) 및 단백질 구동형의 응집을 나타내는 모식도(B)이다. 도 4(B)에서는 도 3과 마찬가지로 GFP를 사각형 설명선 안에 모식적으로 나타내고, 또한 마찬가지로 면역 글로불린 G을 모식적으로 나타냈다.
도 5는 본 발명의 응집성 분자 및 본 발명의 엔도사이토시스 증강제의 제조 및 그것에 수반하는 형광 파장의 변화를 나타내는 모식도이다.
도 6은 카르보실란 덴드리머에 상기 형광 단백질을 제시시킨 후의 미셀의 형성과, 형광 단백질의 회합체(GFP 잔량)의 양이 다른 획분을 나타내는 형광 검출의 결과이다. (A)는 형광 단백질의 회합체의 함유량이 적은 것, (B)는 중간 정도의 것, (C)는 많은 것을 각각 나타낸다.
도 7은 본 발명의 응집성 분자에 의해서 형성된 미셀 입자의 형상을 나타내는 주사형 전자 현미경 사진(A), 입자지름 분포 및 발광 특성의 변화를 나타내는 그래프((B) 및 (C))이다. 도 7(B) 중, TPS는 내포 분자가 없는 입자를, 또한 GDS 미셀은 내포 분자가 있는 미셀을 나타낸다.
도 8은 저온 저진공 주사형 전자 현미경을 이용하여 형성된 입자가 미셀인지, 베시클인지를 판정하기 위해서 관찰했을 때의 전자 현미경 상이다. 도면 중, 흰색 원 및 흰색 화살표로 나타낸 구조물은 염의 결정이라고 생각된다. 또한, 검은색 원 및 검은색 화살표로 나타낸 구조물은 베시클과 같은 물질이라고 생각된다.
도 9는 사용한 표적 펩티드 중에 포함되는 회합체를 조사한 겔 전기영동 결과를 나타내는 도면이다. (A)는 형광 검출 결과를, 또한 (B)는 CBB(쿠마시 브릴리언트 블루) 염색 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 형성된 회합체를 검토한 겔 전기영동 상을 나타내는 도면이다. (A) 및 (B)는 FITC 염색 결과(레이저 475 및 PMT500)이다. 또한, (C) 및 (D)는 CBB 염색 후에 탈색한 결과이다(그 1).
도 11은 형성된 회합체를 검토한 겔 전기영동 상을 나타내는 도면이다. (A) 및 (B)는 FITC 염색 결과(레이저 475 및 PMT500)이다. 또한, (C) 및 (D)는 CBB 염색 후에 탈색한 결과이다(그 2).
도 12는 사용한 회합체 중에 포함되는 표적 펩티드에 의해서 세포 중 미셀의 도입이 어떻게 변화되는지에 대한 결과를 나타내는 그래프이다(그 1).
도 13은 사용한 회합체 중에 포함되는 표적 펩티드에 의해서 세포 중 미셀의 도입이 어떻게 변화되는지에 대한 결과를 나타내는 그래프이다(그 2).
도 14는 사용한 회합체 중에 포함되는 표적 펩티드에 의해서 세포 중 미셀의 도입이 어떻게 변화되는지에 대한 결과를 나타내는 그래프이다(그 3).
도 15은 사용한 회합체 중에 포함되는 표적 펩티드에 의해서 세포 중 미셀의 도입이 어떻게 변화되는지에 대한 결과를 나타내는 그래프이다(그 4).
도 16은 50mM의 Tris-HCl 버퍼(pH8.0)를 이용했을 때에 형성된 미셀의 입도 분포를 나타내는 도면이다. (A)는 미셀 획분액, (B)는 미반응 미셀 획분액이다.
도 17은 50mM의 HEPES 버퍼(pH7.6)를 이용했을 때에 형성된 미셀의 입도 분포를 나타내는 도면이다. (A)는 미셀 획분액, (B)는 미반응 미셀 획분액이다.
도 18은 50mM의 구연산나트륨 버퍼(pH7.6)를 이용했을 때에 형성된 미셀의 입도 분포를 나타내는 도면이다. (A)는 미셀 획분액, (B)는 미반응 미셀 획분액이다.
도 19는 50mM의 탄산-중탄산나트륨 버퍼(pH8.36)를 이용했을 때에 형성된 미셀의 입도 분포를 나타내는 도면이다. (A)는 미셀 획분액, (B)는 미반응 미셀 획분액이다.
도 20은 50mM의 Tris-HCl 버퍼(pH8.0)를 이용했을 때에 형성된 미셀의 형광 특성을 나타내는 도면(조제 직후)이다.
도 21은 50mM의 HEPES 버퍼(pH7.6)를 이용했을 때에 형성된 미셀의 형광 특성을 나타내는 도면이다. (A)는 조제 직후의 형광 특성, (B)는 1일 후의 형광 특성을 각각 나타낸다.
도 22는 50mM의 구연산 버퍼(pH7.6)를 이용했을 때에 형성된 미셀의 형광 특성을 나타내는 도면이다. (A)는 조제 직후의 형광 특성, (B)는 1일 후의 형광 특성을 각각 나타낸다.
도 23은 50mM 탄산나트륨 버퍼(pH8.36)를 이용했을 때에 형성된 미셀의 형광 특성을 나타내는 도면이다. (A)는 조제 직후의 형광 특성, (B)는 1일 후의 형광 특성을 각각 나타낸다.
이하에, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명은 상술한 바와 같은 형광 단백질에 의해서 형성된 회합체로 이루어지는 엔도사이토시스 증강제이다. 본 발명의 엔도사이토시스 증강제를 구성하는 형광 단백질은 특별히 한정되지 않지만, 녹색 형광 단백질 및 그 변이체를 포함하는 형광 단백질인 것이 바람직하다. 상기 GFP가 회합하여 회합체가 되었을 때에 강한 형광을 발하는 것, 및 형성된 회합체가 세포 표면 가까이에 존재하는 물질을 세포 내로 도입하는 엔도사이토시스를 증강하는 효과를 발휘한다. 또한, 이것과 함께 이 회합체 자신도 대량으로 세포 내에 도입되도록 되기 때문이다.
본 발명에 있어서 사용할 수 있는 GFP로서는 상기 단백질은 백색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 및 녹색 형광 단백질 등을 예시할 수 있으며, 회합체를 형성하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예들 들면, 서열목록의 서열번호 7에 나타내는 GFP, 서열번호 8에 나타내는 GFP, 서열목록의 서열번호 9에 나타내는 BFP(청색 형광 단백질), 서열목록의 서열번호 10에 나타내는 TFP 등 외에 Clontech Laboratories, Inc. 등으로부터 시판되고 있는 CFP나 RFP 그 밖의 GFP 유도체를 예시할 수 있다.
또한, 이들 이외에도 서열목록의 서열번호 5에 나타내는 디스코소마 유래의 형광 단백질 등도 사용할 수 있다. 또한, MBL사로부터 시판되고 있는 Azami-Green이나 그 밖의 색변이체도 적합하게 사용 가능한 것은 구조 상의 특성으로부터 상정할 수 있다. 이러한 형광 단백질은 검출할 수 있는 파장의 범위가 넓고, 형광 강도가 높기 때문에 적합하게 사용할 수 있다. 여기서, 상기 청색 형광 단백질은 블루 또는 사이언의 형광을 나타내는 것이 모두 포함된다.
본 발명에서 사용하는 GFP는 상술한 바와 같이, 2량체 이상의 회합체를 용이하게 형성하는 성질을 갖는 것이 바람직하고, 형광의 강도 및 회합체를 형성하기 쉬우므로, 서열목록의 서열번호 7에 나타내는 GFP를 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 GFP는 공지의 방법(예들 들면, Biochim. Biophys. Acta 1679(2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330(2005) 454-460 등을 참조하기 바란다.)을 이용하여 생산해도 좋고, 이러한 GFP의 제조 수탁을 행하고 있는 기업에 의뢰하여 제작한 것을 사용해도 좋다.
또한, 구체적인 회합도로서, 상기 형광 단백질이 2~10분자가 응집된 것이 엔도사이토시스 증강 효과가 높기 때문에 바람직하고, 4량체 이상인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 엔도사이토시스 증강제는 상술한 형광 단백질의 회합도가 높을수록 엔도사이토시스 증강 효과가 높고, 또한 상기 회합체는 세포 내로의 상기 회합체 자체의 도입을 증강하는 것으로 된다.
상기 형광 단백질은 표적 인식 서열을 더 구비하는 것이, 상기 형광 단백질의 회합체가 형성하기 쉬워지기 때문에 바람직하다. 이러한 표적 인식 서열로서는 각종 조직에 발현되어 있는 표면 항원, 수용체, 게이트, 트랜스포터 및 채널로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표적 단백질과 특이적으로 결합하는 것 등을 예시할 수 있다. 이러한 표적 인식 서열을 갖지 않는 형광 단백질과 비교했을 때에 상기 형광 단백질이 회합하기 쉬워지기 때문이다.
보다 구체적으로는, 상기 기능성 펩티드는 서열목록의 서열번호 1~3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드를 예시할 수 있다. 이러한 펩티드를 GFP에 부가함으로써 상술한 GFP의 회합체의 형성을 조절할 수 있기 때문이다.
DMPGTVLPGG(서열목록의 서열번호 1)
VPTDTDYSGG(서열목록의 서열번호 2)
DMPGTVLPGG GGGSEGEWQ QQQHQWAKQE(서열목록의 서열번호 3)
상기 펩티드를 갖는 GFP는 구체적으로는 서열목록의 서열번호 4~6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 기재된 서열을 갖는 것 등을 예시할 수 있다.
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH(서열목록의 서열번호 4)
MASMTGGQQMGR VPTDTDYSGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF NDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNDKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH(서열목록의 서열번호 5)
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG GGGSEGEWQQQQHQWAKQE MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGTC ELYK GG HHHHHH(서열목록의 서열번호 6)
본 발명의 엔도사이토시스 증강제는 생리식염수 등의 단백질이 변성되지 않는 수성 용매 중에서 소망의 GFP를 용해시키고, 회합시킴으로써 얻을 수 있다. 또한, 도 5로 나타내어지는 반응에 의해서, 하기 식(II)으로 나타내어지는 골격을 갖는 화합물과 GFP를 결합시킬 때에 동시에 제조할 수 있다.
Figure pct00007
예들 들면, 상기 반응은 적당한 용매(예들 들면, 인산 완충 생리식염수(PBS), 생리식염수, Tris-HCl 버퍼, HEPES 버퍼, 구연산나트륨 버퍼, 탄산-탄산수소나트륨 버퍼 등의 수용성 용매) 중에서 행할 수 있다. 이 경우의 반응 조건은 사용하는 단백질에 따라서 다르지만, 반응 온도는 사용하는 단백질의 변성 온도를 하회하고만 있으면 좋고, 예들 들면 0~50℃, 바람직하게는 30℃~45℃, 보다 바람직하게는 37℃ 정도로 할 수 있다. GFP를 이용하면 42℃까지는 온도 의존적으로 반응성을 향상시킬 수 있다.
또한, 미셀을 형성시킬 때에 상기와 같은 버퍼를 사용하여 형성된 미셀을 분리할 때에, 예들 들면 1×PBS를 사용하면, 미셀에 내포된 버퍼와 미셀이 부유해 있는 버퍼가 다른 미셀 획분액을 얻을 수 있다. 이와 같이 함으로써, 미셀에 내포시키는 약제의 용해 등에 의해 적합한 미셀을 제작할 수 있다.
GFP는 DTT 등의 환원제로 미리 처리를 하여 -SH기가 산화되어 있지 않은 상태로 해서 두는 것이 바람직하다. 형광 단백질과 덴드리머의 혼합비(몰비)는 단백질을 1로 하고, 덴드리머가 예들 들면, 1~20으로 할 수 있으며, 바람직하게는 1:5~1:15, 보다 바람직하게는 1:10 정도이다. 단, 이 비율은 농도에 의존하여 최적의 값이 변동한다.
또한, 반응 시간은 반응 온도에 따라서도 다르지만, 예들 들면 1시간~24시간, 바람직하게는 10시간~19시간, 보다 바람직하게는 15시간~18시간 정도로 하는 것이 바람직하다. 이 정도의 반응 시간으로 함으로써, 사용된 티올기를 갖는 GFP가 상기 실롤 덴드리머에 결합함(이하, 「GFP-TPS」라고 하는 경우가 있다)과 아울러, 본 발명의 엔도사이토시스 증강제인 GFP의 회합체가 형성되기 때문이다. 이 반응에서는 1분자 이상의 GFP가 상기 실롤 덴드리머에 포함될 수 있다.
그 후, 상법에 따라 생성함으로써 상기 GFP-TPS를 포함하는 획분을 얻을 수 있다. 여기서, 상기 GFP-TPS를 포함하는 획분에는 일정한 범위의 농도의 GFP의 회합체가 포함된다. GFP의 회합체의 농도는 상술한 표적 펩티드의 유무 및 종류에 따라서 상위하고, GFP의 회합체의 함유량이 적은 것(미셀 A), 중간 정도인 것(미셀 B), 및 많은 것(미셀 C)의 3종류로 대별된다(도 6(A)~(C)를 참조하기 바란다).
상기 미셀을 포함하는 획분 중의 GFP의 함유량에 대해서는 여기 파장 488㎚, 검출 파장 510㎚로 함으로써 측정할 수 있고, GFP-TPS에 대해서는 여기 파장 370㎚, 검출 파장 510㎚에서 측정할 수 있다.
미셀이 붕괴하면 미셀의 FRET는 소실되기 때문에, 상기 담체(미셀)의 생체 내에 있어서의 상태를 FRET의 변화를 지표로 해서 모니터링할 수 있다. 또한, 이러한 모니터링이 가능해짐으로써 이러한 미셀이 수성 용매 중에 존재하는지, 세포 내에 도입되어 있는지, 또한 미셀이 파괴되어 있지는 않은지 등과 같은 상태를 추적할 수 있다. 한편, 회합체의 FRET는 잔존하기 때문에 미셀이 소광해도 회합체가 수성 용매 중에 존재하고 있는지, 예들 들면 세포막 상에 존재하고 있는지 등을 추적할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기와 같은 약물 송달용 엔도사이토시스 증강제를 제공할 수 있다.
실시예
이하의 실시예는 어디까지나 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1) 본 발명의 엔도사이토시스 증강제의 제작
본 실시예에 있어서는 엔도사이토시스 증강제 제작용의 단백질, 및 GFP-TPS 제작용의 단백질로서 서열목록의 서열번호 7에 나타내는 GFP를, 또한 덴드리머로서 실롤 덴드리머를 사용했다. 여기서, 사용된 GFP(서열목록의 서열번호 7)는 이미 발명자들이 보고한 방법에 따라서(Biochim.Biophys.Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330(2005) 454-460을 참조하기 바란다), 서열번호 ７에 나타내는 GFP의 아미노산 서열의 Ｃ말단 영역의 251번째의 아미노산을 시스테인으로 치환함과 아울러, 원래 존재하고 있던 시스테인(48번째 및 70번째)을 세린 및 발린으로 각각 치환한 것이다.
(1) DDS용 응집성 분자의 제작
본 실시예에 있어서, 할로겐기를 갖는 덴드리머로서 하기 화학식(I)에 나타내는 화합물을 사용하고, 티올기를 갖는 단백질로서 GFP(녹색 형광 단백질)(서열번호 7)를 사용했다.
Figure pct00008
먼저, 20μM 농도의 GFP 용액(PBS 중)에 최종 농도 1mM이 되도록 DTT를 첨가하고, 10분간 실온에서 처리하고, GFP 표면에 존재하는 시스테인의 환원을 행했다. 시스테인을 환원한 400~450μL의 20μM의 GFP 용액(PBS 중)에 최종 농도 10배몰 등량이 되도록 200μM의 상기 식(VI)에 나타내는 실롤 덴드리머 용액(DMSO 용매)을 10μL 첨가하고, 볼텍스에 의해 혼합했다.
혼합 후, 37℃에서 정치한 상태에서 하룻밤 인큐베이팅하여 GFP와 상기 실롤 덴드리머를 결합시키고, 계속해서 미셀을 형성시켰다. 이 때의 인큐베이팅 시간은 약 16~18시간이었다. 얻어진 미셀을 포함하는 용액 중의 미셀의 입자의 특성을 동적 광산란법(DLS; Dynamic light scattering)에 의해 측정했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00009
또한, 상기 반응액을 25℃에서 ZETASIZER NANO-S(Malvern Instruments Ltd.제)를 이용하여 레이저광의 파장을 532㎚로 하고, 입자지름을 측정했다. 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7(A)은 GDS 미셀의 전기 현미경 상이다. 도 7(B)에 GFP만으로 인큐베이팅하여 얻어진 산물의 입자지름 분포, 실롤 덴드리머만으로 인큐베이팅하여 얻어진 산물의 입자지름 분포를 조사한 결과, 및 GFP와 식(VI)의 실롤 덴드리머를 혼합하고, 인큐베이팅하여 얻어진 산물(GFP-TPS)의 입자지름 분포를 조사한 결과를 나타낸다. 가로축은 얻어진 산물의 입자지름(㎚)을, 세로축은 각 산물의 전체에서 차지하는 %(출원 빈도)를 나타낸다.
또한, 도 7(C)은 상기 3개의 산물의 형광 검출 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 파장(㎚)을, 세로축은 각 산물의 전체에서 차지하는 %(출원 빈도)를 나타낸다.
GFP와 상기 실롤 덴드리머를 인큐베이팅한 경우(상기 표 1 중, 「GFP-Silole only」로 표시.)에는 얻어진 미셀의 입자지름은 약 150㎚였다. 이것에 대해, GFP만을 인큐베이팅한 경우에 관찰된 입자지름은 약 4㎚, 상기 실롤 덴드리머만으로 인큐베이팅한 경우에 관찰된 입자지름은 약 650㎚였다.
이어서, 얻어진 미셀의 입자를 주사형 전자 현미경(SEM; Scanning Electron Microscope)으로 관찰한 결과, 입자지름이 약 100~500㎚인 다수의 입자와, 입자지름이 500㎚ 정도인 소수의 입자가 확인되었다(도 8(A)~(C) 참조).
이상의 결과로부터, 본 발명의 DDS용 응집성 담체를 이용하여 형성된 미셀의 입자지름은 약 100~500㎚이고, 약 100~200㎚ 정도의 입자 지름인 것이 많은 것으로 밝혀졌다. 또한, SEM을 이용한 전현미경 사진의 상으로부터 구형의 미셀 구조를 형성하고 있는 것도 확인되었다(도 7(A) 참조).
(2) 형광 공명 에너지 이동의 확인
본 실시예에 있어서 사용된 실롤 덴드리머는 소수성의 실롤의 코어 부분이 응집하면 발광하는(AIE 효과를 발휘하는) 성질을 갖고 있기 때문에, 미셀 구조를 취한 경우에도 발광하는 것이 확인되었다. 그래서, 실롤 덴드리머에 GFP를 결합시킨 GFP-실롤 덴드리머로 이루어지는 미셀을 제작한 경우에, 실롤과 GFP 사이에 있어서 형광 공명 에너지 이동(FRET: Fluorescence resonance energy transfer)이 발생되는지의 여부를 검토했다.
실롤 덴드리머만으로 인큐베이팅한 산물은 370㎚의 파장에서 여기하고(일점 쇄선), GFP만으로 인큐베이팅한 산물은 488㎚의 파장에서 여기하고(파선), GFP 및 실롤 덴드리머를 이용하여 인큐베이팅한 산물은 370㎚의 파장에서 여기하고(실선), 각각의 발광 파장의 특성을 조사했다(도 7(C) 참조). GFP-실롤 덴드리머 복합체로 이루어지는 미셀(GFP 및 식(X)의 실롤 덴드리머로 인큐베이팅하여 얻어진 산물)은 실롤으로부터 GFP로의 FRET에 의한 발광이 510㎚ 부근에서 관찰되었다.
도 7(C)에 나타내는 바와 같이, GFP의 발광은 510㎚ 부근에 샤프한 피크로서 관찰되며, 이것은 상기 실롤 덴드리머로부터 GFP에의 FRET에 의한 것이라고 생각되었다. 실롤 덴드리머의 발광 피크는 480㎚ 부근에서 관찰되었다. 또한, GFP와 실롤 덴드리머의 결합체의 발광에서는 샤프한 피크는 확인되지 않고, 510㎚ 부근에서 가장 높은 값을 나타냈다. 이것에 대해, 또한 미셀이 붕괴했을 때에, FRET에 기인하는 것으로 생각되는 발광도 소실되었다.
즉, AIE 효과를 갖는 덴드리머와, 형광 단백질 등의 회합성의 단백질과 결합시킨 분자(GFP-TPS)를 제작하면, 이러한 분자를 이용하여 미셀을 형성시키면, 미셀의 상태라도 덴드리머와 형광 단백질 사이에서 FRET가 발생하는 것, 미셀의 붕괴에 의해서 FRET가 소실되는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 엔도사이토시스 증강제 인 GFP의 회합체도 발광하는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 본 발명의 엔도사이토시스 증강제를 사용하면, 세포 내에 송달된 GFP-TPS 및 GFP의 회합체를 확인할 수 있는 것이 나타났다. 또한, 표적 조직·기관에 송달된 미셀이 붕괴된 후에도, 형광 단백질의 형광을 추적하는 것이 가능하고, 이것에 의해서 형광 단백질이 송달된 세포 내의 환경 등을 감지할 수도 있는 것이 나타났다.
(실시예 2) 표적 펩티드 서열 결합 형광 단백질의 조제
본원 발명의 미셀과 C말단에 결합하고, 또한 암세포의 표면에 발현하는 수용체와 결합하는 표적 펩티드와 N말단에 결합하는 표적 펩티드 서열 결합 형광 단백질을 이하와 같이 조제했다.
(1) 인버스 PCR
(1-1) 펩티드 서열의 선정
선정된 표적 결합 부위에 포함된 펩티드의 아미노산 서열을 하기 표 2에 기재했다. MCF 7-1은 하기 표 2에 나타내는 서열을 포함하는 인간 유선암 유래 세포인 MCF 7이고(이하, 「표적 타입 1형」이라고 하는 경우가 있다.), MCF-2는 하기 표 2에 나타내는 서열을 포함하는 MCF-1의 돌연체(이하, 「표적 타입 2형」이라고 하는 경우가 있다.)이다. 또한, MCF 7-1+α 스탠드는 하기 표 2에 나타내는 바와 같이, 상기 MCF 7-1에 α헬릭스 구조가 짧은 펩티드(이하, 「α 스탠드」라고 한다.)를 연결한 구조를 갖는 MCF 7-1의 다른 돌연체인(이하, 「타입 1 강화형」이라고 하는 경우가 있다.).
Figure pct00010
(1-2) 프라이머의 작성
표 2에 나타내어진 상기 펩티드 서열에 대해서 인버스 PCR을 행하기 위한 프라이머를 하기 표 3에 기재했다. 이들 프라이머는 서열목록의 서열번호 1 및 3에 대해서는 상기 펩티드 서열의 DM과 PGTVLP 사이에서, 서열번호 2에 대해서는 상기 펩티드 서열의 VP와 TDTDYSGG 사이에서 신장 반응이 개시되도록 설계했다. 이것은 인버스 PCR이 최적으로 행해지는 것을 감안하고 있다.
Figure pct00011
(1-3) 인버스 PCR용 템플릿 플라스미드의 조제
인버스 PCR용 템플릿 플라스미드는 이하의 논문에 기재된 방법에 의해 조제했다.
「Protease-sensitive signalling by chemically engineered intramolecular fluorescent resonance energy transfer mutants of green fluorescent protein.　 -Miho Suzuki, et al. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)- Gene Structure and Expression
Volume 1679, Issue 3, 17 September 2004, Pages 222-229」
(1-3-1) GFPuv5 돌연체의 플라스미드 구축
GFPuv5는 pGFPgcn4로부터 이하와 같이 해서 얻었다. 우선, I167T 돌연변이+포워드 프라이머 5'CATTGAAGATGGCTCCGTTCAA(서열번호 18) 및 리버스 프라이머 5'TTGTGGCGAGTTTTGAAGTTAG(서열번호 19)를 이용한 인버스 PCR을 이용하여 유전자 머니퓰레이션용의 마찬가지의 돌연변이를 발생시킨 PCR 산물을 얻고, 계속해서 이 PCR 산물을 환화 처리하여 제작되었다. 이상과 같이 해서 얻어진 컨스트럭트를 pGFPgcn5라고 명명했다.
그 후, GFPuv5의 cDNA를 pET21a(Novagen사제)에 클로닝하여 단백질을 발현시켰다. 여기서, 발현된 단백질을 정제하고, GFPuv5tag라고 명명했다. 그 코드 영역을 프라이머 5'CTCGACCAT[ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT] CGCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA(서열번호 20)(GFPuv5 시리즈의 N말단 방향의 T7 유전자의 10단백질용의 최초의 11아미노산의 에피토프 태그에 접착하는 접착 태그는 []로 나타냈다), 및 GFPuv5 시리즈의 C말단에 His 태그를 제공하는 5'TGACGTGAATTCATTA[GTGATGGTGATGGTGATG]TTTGTAGAGCTCATCCATGC(서열번호 21)(His 태그를 []로 나타낸다)를 이용하여 증폭시켰다.
서열번호 1~3에 나타낸 염기서열을 pET21a에 삽입하고, NdeI 및 EcoRI로 소화했다. 이 pGFPgcn 플라스미드를 유전자 머니퓰레이션에 사용하고, pET21a 플라스미드를 T7 프로모터의 제어 하에서의 단백질 발현에 사용했다. GFPuv5의 유전자 및 그 돌연변이체의 유전자의 염기서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인했다(ABI PRISM 3100 Genetic Analyser사제). 실험 중에, 3개의 마찬가지의 돌연변이가 더 발견되었다(Ser-30 agt가 agc로, His-78 cat가 cac로, Gln-183 caa가 cag로).
그것들의 돌연변이는 형광 단백질에 대해서는 유해하지 않기 때문에, 이들 돌연변이를 포함한 채 실험을 계속했다. 정제된 GFPuv5tag의 형광 강도는 GFPuv4tag의 약 1.9배였다. 그 후, 48위 또는 70위 중 어느 하나의 시스테인 잔기(이하, 「시스테인 48」 또는 「시스테인 70」이라고 한다)를 pGFPgcn5를 이용한 인버스 PCR에 의해서 랜덤화된 아미노산으로 치환했다.
올리고 뉴클레오티드인 5'CTTAAATTTATTNNKACTGGAAAAC(서열번호 22) 및 5'GGTAAGTTTTCCGTATGTTG(서열번호 23)를 시스테인 48의 돌연변이에 사용하고, 5'GTGTTCAANNKTTTTCCCGTTATCCG(서열번호 24) 및 5'CATACGTCAGAGTAGTGACAAG(서열번호 25)를 시스테인 70의 돌연변이에 사용했다. 대장균 BL21(DE3)의 배양물을 얻어진 플라스미드로 형질전환하고, 주광 여기 하에서 강한 형광에 대해서 스크리닝을 행하고, 한천 배지 상에서 선택했다. 48에서는 몇 가지의 강한 형광을 발하는 돌연체가 얻어졌다(Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val 및 Tyr 치환). 단, 70위의 아미노산을 치환한 돌연변이체는 C70V 시스테인 변이체만이 적절한 형광을 주었다.
강한 형광 강도를 갖는 이중 시스테인 돌연변이 GFPuv5를 제작하기 위해서, 단일 돌연변이를 갖는 플라스미드를 NcoI 및 EcoRI로 소화하고, 각각의 영역에 다시 라이게이션했다. 선택은 단일 돌연변이체로 행했다. UV5C0 tag(C48S/C70V)가 모든 조환체 중에서 가장 높은 형광 강도를 나타냈다.
이어서, 시스테인 6위 및 229위에 각각 인버스 PCR에 의해서 도입했다. 이 도입에는 C48S 돌연변이를 갖는 플라스미드와 이하의 프라이머의 세트를 각각의 돌연변이에 사용했다.
Glu 치환용: 5'TGTCTTTTCACTGGAGTTGTCCC(서열번호 26) 및 5'TTCTCCTTTACTCATTTTTTC(서열번호 27)
Ile 치환용: 5'TGCACACATGGCATGGATGAGCTC(서열번호 28) 및 5'CCCAGCAGCAGTTACAAACTC(서열번호 29)
트립신 표적 서열(Gln-Gly-Arg)로 이루어지는 3개의 프로테아제 태그는 다양한 스페이서 서열을 갖고(스페이서 없음, Thr 스페이서 또는 Gly-Thr 스페이서), 필요한 시스테인이 His-231과 Asp-234 사이에서 치환되어 있다. 이 컨스트럭트를 puvC48Stag와 얻어진 플라스미드(템플릿)와 하기 표 4에 나타내는 프라이머를 이용하여 얻었다.
Figure pct00012
(1-3-2) GFPuv5tag 돌연변이체의 정제
모든 플라스미드에서 대장균 BL21(DE3)을 형질전환했다. 암피실린(50Ag/ml) 및 IPTG(0.5mM)를 첨가한 LB 배지(38mL)에 정상기의 하룻밤 배양한 대장균(12ml)을 파종하고, 37℃에서 8시간 인큐베이팅했다. 2,500×g에서 20분간 원심하여 세포를 모으고, 10mL의 PBS에 재현탁했다. 세포의 펠렛을 50mM 트리스 및 8M 요소를 포함하는 10mL의 용해 버퍼(pH8.0) 중에서 15분간 실온에서 용해시키고, 볼텍싱했다. 1,200×g에서 15분간 원심하고, 상청을 PBS 중에 현탁한 Ni2+-NTA 수지(Qiagen Co. Ltd.제)와 혼합했다. 이 수지를 PBS 및 20mM의 이미다졸로 순서대로 세정한 후에, 결합된 GFPuv5tag 돌연변이체를 250mM의 이미다졸 용액으로 용출시켰다.
버퍼 교환을 위해서, 용출물을 10배 희석한 PBS로 평형화한 PD-10 겔 전기영동 여과 컬럼(Amersham Bioscience Co. Ltd.제)에 어플라이했다. 용출된 GFPuv5tag 돌연변이체 단백질을 모으고, 그것들의 농도를 쿠마시 단백 어세이 시약(Pierce사제)으로 정량했다. 정제된 GFPuv5tag 돌연변이체를 15% SDS-PAGE에 의해서 분석했다.
인버스 PCR용 템플릿 플라스미드의 염기서열을 서열번호 26에 나타냈다.
(1-4) PCR의 조건
하기 표 5에 나타내는 반응액을 조제하고, 하기 표 6의 조건에서 인버스 PCR을 행했다.
Figure pct00013
Figure pct00014
(1-5) 전기영동에 의한 확인
상기 PCR 반응액의 일부를 취해서 0.8% PAGE, 전압 100V, 인압 시간 30분간의 겔 전기영동을 행하고, 각 샘플 중에서 증폭된 펩티드를 확인했다. 영동 결과를 도 9에 나타낸다.
(2) 비의존적 A 서열의 제거 및 PCR 산물의 정제
하기 표 7의 반응액을 조제하고, 120℃에서 30분간 반응시키고, 상기 PCR에 의해서 생긴 비의존적 A 서열을 제거했다. 그 후, QIAquick(등록상표) PCR Purification Kit(QIAGEN사제)를 사용하고, 키트에 첨부된 설명서에 따라서 상기 PCR 산물을 정제했다.
Figure pct00015
(3) 라이게이션 반응
계속해서, 하기 표 8에 나타내는 반응액을 조제하고, 16℃에서 3시간 이상 반응시켜서 후술하는 대장균 DH5α의 형질전환용 환상 플라스미드를 제작했다. 돌연체에 따라서 25℃, 37℃ 등을 구분했다.
Figure pct00016
(4) 대장균 DH5α의 형질전환
대장균 DH5α의 컴피턴트 셀(BioDynamics Laboratory사제) 10μl를 사용 직전에 얼음 위에서 용해시켜 컴피턴트 셀 용액을 조제했다. 이 컴피턴트 셀 용액에 라이게이션 반응액을 1μL 첨가하고, 얼음 위에서 30분간 방치했다. 그 후, 42℃에서 30초간 인큐베이팅한 후에, 얼음 위에서 2분간 냉각했다. 여기에, SOC(TOYOBO Co., Ltd.제) 배지를 90μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 쉐이커 위에 있어서 반응시켰다. 그 후, 암피실린 함유 LB 선택 배지(TOYOBO Co., Ltd.제)에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치했다.
(5) 콜로니 PCR
상기 형질전환에 의해 얻어진 콜로니로부터 콜로니 PCR을 행하고, 상정되는 인서트를 확인했다.
(5-1) PCR용 반응액 용액의 조제
하기 표 9의 콜로니 PCR용 반응액을 조제했다.
Figure pct00017
상기 콜로니 PCR용 반응액을 PCR용 튜브에 넣고, 상기 암피실린 함유 LB 배지에서 증식한 대장균을 채취하고, 이것을 첨가했다. PCR은 하기 표 10에 나타내는 프로그램으로 행했다.
Figure pct00018
(5-2) 전기영동
상기 PCR 반응액의 1.2% 아가로오스 겔에서 인가 전압 100V, 시간 30분간의 전기영동을 행하여 증폭이 확인될 수 있었던 콜로니를 LB 액체 배지(TOYOBO Co., Ltd.제)가 들어간 배양 보틀에 이식하고, 37℃에서 인큐베이팅했다.
(6) 플라스미드의 정제
상기 LB 액체 배지에서 배양한 대장균 중의 상기 플라스미드를 Wizard Plus SV Minipreps. DNA Purification System(Promega Corporation제)을 이용하여 제품에 첨부된 설명서에 따라서 정제했다. 그 후, 정제한 플라스미드의 서열을 Eurofins Genomics K. K.에 의뢰하여 해석했다.
(7) 대장균 BL21(DE3)의 형질전환
대장균 BL21(DE3) 컴피턴트 셀(BioDynamics Laboratory사제) 10μL를 사용 직전에 얼음 위에서 용해시켜 컴피턴트 셀 용액을 조제했다. 이 컴피턴트 셀 용액에, 상기 시퀀스에 의해 목적으로 하는 서열이 들어간 것이 확인될 수 있었던 플라스미드액 1μl를 첨가하고, 얼음 위에서 30분간 방치했다.
그 후, 42℃에서 30초간 인큐베이팅 후, 얼음 위에서 2분간 냉각했다. 여기서, SOC(TOYOBO Co., Ltd.제) 배지를 90μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 쉐이커 위에 있어서 반응시켰다. 그 후, 암피실린 함유 LB 선택 배지에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치했다. 다음날, 형질전환되어 녹색의 형광을 발하고 있는 콜로니를 취해서 암피실린 함유 LB 액체 배지 1ml가 들어간 배양 보틀에 넣고, 37℃에서 하룻밤 정치하여 전배양을 행했다.
(8) 표적 펩티드 서열 결합 형광 단백질의 정제
(8-1) 콜로니의 배양
50mL 튜브에 암피실린 함유 LB 액체 배지 4mL를 넣고, 여기에 상기 전 배양액 290μL를 첨가한 것을 시료로 해서 4개 준비하고, 28℃에서 4시간 쉐이커 위에서 배양했다. 그 후, 100mM의 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)를 43μL 첨가하고, 28℃에서 하룻밤 쉐이커 위에서 배양했다.
(8-2) 단백질의 회수
다음날, 상기 4개의 튜브의 배양액을 1개의 튜브로 집약했다. 내용물을 옮긴 3개의 튜브를 각각 1ml의 PBS(-) 버퍼(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제)로 세정하고, 이 세정액도 모은 튜브에 첨가했다. 이상과 같이 배양물을 집약한 튜브를 실온에서 5,000rpm(원심기명: KUBOTA3740, 로터 번호 KUBOTA AF2018, KUBOTA SHOJI LTD.제)에서 5분간 원심했다.
그 후, (i) 상청을 버리고, 침전된 펠렛에 PBS(-) 버퍼를 3ml 추가하고, (ii) 잘 교반한 후, 5,000rpm에서 5분간 원심했다. 상기 (i)과 (ii)를 2회 반복했다. 침전된 펠렛에 B-PER Lysis Buffer(Reagent사제)를 4mL 첨가하고, 뚜껑을 닫고서 실온에서 하룻밤 쉐이커에서 교반했다.
(8-3) His-tag에 의한 정제
Ni-NTA Agarose(QlAGEN사제)를 15mL 튜브에 2mL 취하고, (i) 1,000rpm에서 1분간 원심하고, (ii) 상청을 버리고, 1×PBS 버퍼를 1mL 첨가하고, 잘 교반했다. 상기 (i)과 (ii)를 3회 반복하고, Ni-NTA 수지를 조제했다.
상기 B-PER Lysis Buffer 용액이 들어간 튜브를 12,000rpm에서 10분간, 실온에서 원심한 후, 상청을 15mL의 팔콘 튜브에 옮겼다. 여기서, 잘 교반한 상기 Ni-NTA 수지 400μL를 첨가하고, 회전 쉐이커에서 10분간, 실온에서 교반했다. 그 후, 1,000rpm에서 1분간, 실온에서 원심하고, 상청을 버렸다. 여기에, (iii) 1×PBS 버퍼를 4mL 첨가하여 잘 교반하고, (iv) 1,000rpm에서 1분간, 실온에서 원심하고, 상청을 버렸다. (iii)과 (iv)를 2회 반복했다.
그 후, (v) 20mM의 이미다졸(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제)을 4mL 첨가하여 잘 교반하고, (vi) 1,000rpm에서 1분간, 실온에서 원심하고, 상청을 버렸다. (v)와 (vi)을 2회 반복했다. 여기서, 250mM의 이미다졸을 500μL 첨가하고, 회전 쉐이커에서 10분간, 실온에서 교반했다. 그 후, 1,000rpm에서 1분간 원심하고, 녹색 형광을 발하고 있는 상청을 15mL의 팔콘 튜브에 넣고, 다음의 겔 여과용 단백질 정제 용액으로 했다.
(8-4) 겔 여과에 의한 정제
상기 단백질 정제 용액 중의 이미다졸과 PBS 버퍼를 대체하고, 정제하여 목적의 표적 펩티드 서열 결합 형광 단백질을 얻었다. 이상의 작업에서는 GE Healthcare Japan Corporation의 NAP5 컬럼을 사용하고, 제품에 첨부된 설명서에 따라서 정제를 행했다.
(9) 표적 펩티드 서열 결합 형광 단백질의 선택
상기 정제 작업에서 얻어진 표적 펩티드 서열 결합 형광 단백질 농도의 흡광도(280㎚), 및 발색단 농도(형성능)의 흡광도(488㎚)를 상법에 따라서 계측하고, A488/A280의 값이 1.5를 초과한 것을 목적의 표적 펩티드 서열 결합 형광 단백질로서 선택했다. 결과를 표 11에 나타냈다.
Figure pct00019
(실시예 3) 표적 펩티드 서열 결합 미셀(형광 단백질 회합 구동형 미셀)의 제작
미수식 GFP 대신에 실시예 2에서 조제한 표적 펩티드 서열 결합 GFP를 이용하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해 표적 펩티드 서열이 결합한 응집성 분자를 조제했다. 계속해서, 실시예 1과 마찬가지의 방법에 의해 미셀(형광 단백질 회합 구동형 미셀)을 작성하고, 미셀 획분 용액 중에 존재하는 회합체의 양을 조사했다.
(1) 발광 특성
상기와 같이 해서 반응시킨 미셀 획분 중의 응집체의 양이 표적 펩티드에 의해서 어떻게 상위한지를 실시예 1과 마찬가지로 해서 측정했다(도 6(A)~(C) 참조). 도 6(A)~(C) 중, 회합체를 파선으로, 또한 GFP-TPS를 실선으로 나타냈다. 세로축은 형광이 관찰된 입자수/50,000개, 가로축은 검출 파장(㎚)을 나타낸다. 표적 펩티드 서열 결합 미셀에서도, 실시예 1과 마찬가지로 510㎚ 부근에 발광의 피크가 관찰되었다.
(2) 회합체의 존재의 확인
이어서, 미셀 획분 중에 존재하는 본 발명의 엔도사이토시스 증강제(회합체)의 양을 표적 펩티드 서열 없음(MCF 7-0: 미표적형), 표적 펩티드 있음(MCF 7-1(표적 타입 1형) 및 MCF 7-2(표적 타입 2형)) 및 표적 펩티드+α 스탠드(MCF 7-1+α(표적 타입 1 강화형))의 4종류를 사용한 경우에 대해서 확인했다.
(3) 표적 펩티드와 결합된 GFP의 거동의 확인
(3-1) 상기 4개의 타입의 응집성 분자를 이용한 경우의 획분의 분류
상기와 같이 해서 제조한 GFP의 각각을, TPS와 몰비 10:1로 혼합하고 37℃에서 하룻밤 정치하고, 표적 펩티드가 있는 GFP(표적 펩티드는 MCF 7-0, MCF 7-1, MCF 7-2, MCF 7-1+α의 4종류)의 회합체 및 GFP-TPS를 얻었다.
이후, 여기 파장 370㎚-측정 파장 510㎚의 형광 강도와, 그리고 여기 파장 488㎚-측정 파장 510㎚의 형광 강도의 비(I0)로부터, 회합체의 함유량(이하, 「잔류 GFP양」이라고 하는 경우가 있다.)을 A(I0≤1.0(GFP 잔량이 적음)), B(1<I0≤2.0(GFP 잔량이 중간 정도), 및 (CI0≤2.0(GFP 잔량이 많음)이라고 하는 3개의 클래스로 분류했다(도 6(A)~(C) 참조).
이러한 분류는 이하의 이유에 의거해서 행했다. 우선, 상기와 같은 것에 대해서 카르보실란 덴드리머와 GFP를 도 6에 나타내는 바와 같이 하룻밤 반응시키면 단백질이 제시된 응집성 분자가 얻어지지만, 상기 응집성 분자 중에 파트로서 도입된 단백질(GFP)의 양에는 차가 있는 것을 알 수 있었다. 이것은 상기 식(II)으로부터 명백한 바와 같이, 실롤과 GFP의 결합 가능 부위는 6개 있기 때문이다.
여기서, 여기 파장 370㎚에서 여기된 형광 파형은 미셀의 FRET 효율이기 때문에, 이 파형 내의 480㎚(실롤 골격 응집 야기 발광체의 형광)와 510㎚(GFP의 형광)의 강도비가 높아진다고 하는 경우에는 GFP측의 형광 강도가 상승하고, FRET 효율이 양호해져 가는 경우를 나타낸다.
또한, 여기 파장 488㎚의 형광은 미셀 내의 GFP와는 관계없이 존재하고 있는 GFP의 총량을 계측하고 있는 것으로 된다. 왜냐하면, 이 형광량이 상기와 같은 FRET 효율과는 독립된 거동을 하고 있는 것, 잔류하고 있는 GFP이면 상정된 것, 및 실제로 미셀의 성분을 전기영동하면 회합한 GFP의 존재가 확인될 수 있었기 때문이다. 그 결과, 사용한 표적 펩티드에 의해서, 상기 3개의 클래스에 속하는 회합체의 양에 상위가 있는 것이 나타내어졌다.
Figure pct00020
*1: 488㎚에서 여기한 경우의 발광 강도와 370㎚에서 여기한 경우의 발광 강도의 비
*2: A≤1.0, 1.0<B<3, 3.0≤C
상기 표 12에 나타내어지는 바와 같이, MCF 7-2 및 MCF 7-1+α의 2종류의 표적 서열을 붙인 것의 쪽이 회합체의 생성률이 다른 서열을 붙인 것보다 유의하게 높아졌다.
(3-2) GFP 회합체 형성의 표적 펩티드에 의한 상위-1
이상과 같이 해서 얻어진 응집성 분자를 포함하는 각 용액에 대해서 하등의 처리를 하지 않고, 단백질 농도 5μM의 용액 10μL를 겔 전기영동에 제공하여 함유 되는 회합체를 확인했다. 결과를 도 9(A)~(B)에 나타낸다. (A)는 형광 검출 결과, (B)는 CBB 염색 결과이다.
이상으로부터, 회합체로서는 다이머, 테트라머 및 옥타머가 존재하고 있는 것이 확인되었다.
(실시예 4) DDS 리포솜 또는 미셀의 세포 도입 실험-2(회합체 공존시)
(1) 응집성 분자를 포함하는 미셀 용액의 표적 펩티드에 의한 상위-1
상기 실시예 3에서 얻어진 표적 서열 없는 GFP의 회합체를 회합체의 함량이 많은 것(미셀 C), 중간 정도(미셀 B), 적은 것(미셀 A)으로 나누어 샘플 용액으로 하고, 겔 전기영동을 행하여 형성된 회합체가 몇 량체인지를 검토했다. 12% 러닝 겔-4% 스태킹 겔에 SDS를 첨가하고(최종 농도 0.1%), 각 샘플의 형광 측정의 조건을 분광 광도계의 감도를 3×3으로 하고, 형광 강도의 Max를 500으로 맞추고, 미셀 C를 1로 했을 때에, 미셀 A는 그 2배량, GFP는 각각 5배량을 각각 어플라이하여 20mA에서 2시간의 조건에서 겔 전기영동을 행했다. 이 실험에서는 미셀 및 GFP는 모든 원액을 어플라이했다.
결과를 도 10(A)~(D)에 나타낸다. 여기서, (A) 및 (B)는 FITC 염색 결과(레이저 475 및 PMT500)이다. 또한, (C) 및 (D)는 CBB 염색 후에 탈색한 결과이다(레이저 635(cy5) 및 PMT500).
도 10(A) 및 (B)에 나타내는 바와 같이, 응집성 분자의 회합체의 함량이 높은 시료를 사용한 경우에는 모노머 및 다이머 이외에, 테트라머, 옥타머의 함유량이 많은 것이 확인되었다. 이 때, MCF 7-0에서는 상기 회합체의 농도가 낮은 것밖에 얻어지지 않았기 때문에 미셀 C는 겔 전기영동에 제공할 수 없었다. 또한, MCF 7-0의 미셀 A에서는 GFP만을 영동한 경우와 동 정도의 테트라머 및 옥타머가 관찰되었다. 도 10(C) 및 (D)는 모노머 및 다이머의 존재는 확인되었지만, 테트라머 및 옥타머에 대해서는 확인할 수 없었다.
(2) 응집성 분자를 포함하는 미셀 용액의 표적 펩티드에 의한 상위-2
이어서, 상기 실시예 2와 같은 겔 전기영동 조건 하에서 Amikon 100K에 의해 농축하여 회합시킨 GFP를 MCF 7-1 및 MCF 7-와 비교했다. 각 샘플의 형광 측정의 조건을 분광 광도계의 감도를 3×3으로 했다. MCF 7-1의 미셀 C·단백질(300μM)은 5μL 또는 20μL 어플라이했다. MCF 7-2의 미셀 C·단백질(300μM)에 대해서도 동량으로 어플라이했다. 형광 검출 및 염색도 상기 (1)에 준해서 행했다.
결과를 도 11(A)~(D)에 나타낸다. 도 11의 (A) 및 (B)는 형광 검출의 결과(FITC(Laser 635) 및 PMT 400)이다. 또한, (C) 및 (D)는 CBB 염색 결과(FITC(Laser 635(cy5)) 및 PMT 600)이다. 결과는 상기 (1)과 마찬가지였다.
(3) 단백질의 혼합물의 도입량과 회합 단백질의 양의 상관
상술한 표적 펩티드 없음 및 표적 펩티드 있음의 미셀을 각각 MCF-7 세포의 배양 웰에 50μL의 양으로 첨가하고, 세포 내로의 각 미셀의 도입량과, 같은 획분 중에 존재하는 회합체의 양의 관계를 검토했다.
1x109개/웰의 세포에 대하여, 상기 미셀과 응집성 분자의 회합체를 포함하는 시료를 50μL의 양으로 첨가하고, 37℃에서 9시간 인큐베이팅한 후에 FACS에서 형광을 검출했다.
FACS 데이터를 가로축을 잔류 단백질의 클래스 분류를 나타내는 형광 단백질의 발광 강도비(미셀과 종합)로 하고, 세로축을 FACS 데이터의 50,000개의 세포 중 명백한 형광 강도를 갖는 세포수의 비율(%)로 해서 정리했다. 결과를 도 12~15에 나타낸다.
도 12 및 13 중, 검은 동그라미는 미셀 A(회합체의 양이 적은 것), 검은 사각은 미셀 B(회합체의 함유량이 중간 정도인 것), 검은 삼각은 미셀 C(회합체의 함유량이 많은 것), 흰색 사각은 미셀에 GFP를 첨가한 경우의 도입량을 나타낸다. 응집성 분자의 회합체의 함유량이 많을수록 미셀의 세포 내로의 도입량이 증가하는 것, 즉 이들 사이에는 상관가 있는 것이 확인되었다.
도 14 및 15에, GFP에 결합시킨 표적 펩티드의 유무 및 표적 펩티드에 의한 상위를 나타낸다. 이 결과로부터, 표적 펩티드가 결합되어 있는 것이 도입량이 많은 것이 확인되었다. 형광 수명에 의거해서 당업자 형광 단백질 처리를 행한 결과도, 이 경향을 지지했다.
이상으로부터, 본 발명의 엔도사이토시스 증강제는 GFP를 제시하는 카르보실란 덴드리머에 의해서 형성된 미셀(또는 베시클)의 세포 내로의 도입을 크게 증강하는 것이 나타내어졌다.
(실시예 5) 미셀 제작용 버퍼의 검토
지금까지 MCF-7 미셀의 조제는 1×PBS와 같은 1종류의 버퍼 중에서만 행해져 왔다. 약물의 내포 실험을 실시함에 있어서 내포하는 다양한 약제의 용해성이나 안정성을 고려할 필요가 있었기 때문에 1×PBS 이외의 버퍼를 사용한 MCF-7 미셀의 조제의 여부를 검토했다.
(1) 사용하는 버퍼의 검토
분자 생물학의 분야에서 PBS에 가까운 pH7 부근에서 가장 많이 이용되고 있는 Tris-HCl 버퍼, 굿의 버퍼(1966년 Norman Good 등에 의해서 나타내어진 12종류의 완충제를 말한다) 중 하나인 HEPES 버퍼, 유기산 버퍼로서 구연산 버퍼, 및 무기산 버퍼로서 탄산 버퍼의 4종류를 조제하고, 각각의 버퍼 중에서 미셀을 형성시키고, 분리하여 미셀의 내측이 상기 4종류 중 어느 하나의 버퍼, 미셀의 외측이 PBS라고 하는 미셀 획분을 얻고, 형광 및 입도를 측정하여 단기 안정성(미셀 제작 후 1~2일간의 안정성)을 확인했다.
(2) 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0) 중에서의 미셀 형성
(2-1) 종래의 미셀 제작법
지금까지, 생체 내와 같은 이온종으로 구성되고, 등장이기 때문에 보다 생체 조건에 가깝다고 생각되는 1×PBS 중에서 미셀을 제작했다.
그러나, 미셀 내부는 상기 미셀을 형성시킨 버퍼로 채워지게 되기 때문에 약제와의 친화성이 좋은 버퍼 중에서의 미셀 제작을 검토하기로 했다. 일반적으로 사용되는 버퍼로서는 Tris-HCl 버퍼, Hepes 버퍼, MOPS 버퍼, CHAPS 버퍼 등을 들 수 있지만, 우선 50mM Tris-HCl(pH8.0)(이하, 단지 「트리스 버퍼」라고 하는 경우가 있다.) 중에서의 미셀 형성을 검토했다.
(2-2) 미셀 제작법의 변경
사용하는 버퍼를 모두 50mM의 Tris-HCl(pH8.0)로 하고, 이 버퍼로 NICK 컬럼을 미리 5회 세정하고, NICK 컬럼을 상기 트리스 버퍼로 평형화했다.
(2-3) 미셀의 제작
Amicon 10k Filter를 이용하여 14,000×g에서 15분간 원심하고, 219.2μL의 MCF-7 미셀용 형광 단백질을 농축했다. 트리스 버퍼로 99μL에 메스 업하고, 100mM의 DTT를 1μL 첨가하고, 10분간 정치하여 시료 혼합액으로 했다.
상기와 같이 트리스 버퍼로 평형화한 NICK 컬럼에 상기 시료 혼합액을 걸고, 365μL의 트리스 버퍼를 첨가하고, 그 후 380μL의 트리스 버퍼로 용출했다. 이 후, 10.28μL의 TPS를 용출된 용액에 첨가하고, 10분간 볼텍싱하고, 37℃에서 하룻밤 정치하여 미셀 반응액을 얻었다. 이 반응액 중에는 형성된 미셀(이하, 「MCF-7 미셀」이라고 한다.) 및 MCF-7 미셀용 형광 단백질의 회합체가 포함되어 있었다.
사용하는 트리스 버퍼는 1M의 Tris-HCl(pH 8.0)을 스톡 용액으로 해서 조정하고, 이것을 milliQ(Merk Millipore)로 20배 희석하여 사용했다.
(2-4) 미셀의 분리
이상과 같이 해서 얻은 미셀 반응액을 Amicon 100k Filter에 걸고, 14,000×g에서 10분간 원심하고, 필터 상액과 필터 하액으로 분리했다.
상액이 들어간 필터에 100μL의 1×PBS를 첨가하고, 14,000×g에서 10분간 원심하는 세정 조작을 3회 반복하고, 트리스 버퍼를 1×PBS로 교환했다. 버퍼 교환한 상액(미셀 획분액)을 탁상 원심기에서 원심하여 회수했다. 이어서, 빈 필터에 적당량의 1×PBS를 첨가하여 10분간 두고, 필터의 천지를 돌려 더 회수했다. 회수한 액을 1×PBS로 160μL에 메스 업했다. 이 액 5μL를 취하고, 1×PBS 95μL를 첨가하여 20배 희석(2.5μM)으로 해서 입도를 측정, 8μL를 취하고, 1×PBS 392μL를 첨가하고, 50배 희석(1μM)으로 해서 형광을 측정했다.
하액(미셀 미반응 획분) 5μL를 취하고, 20배 희석하여 100μL로 하고, 입도를 측정했다(도 16(A) 참조). 또한, 하액 16μL를 취하여 400μL로 희석하고, 형광을 측정했다(도 20 참조).
입도 측정에는 Zetasizer(Malvern제, 셀: ZEN0040)를 사용했다. 또한, 형광 측정에는 형광 광도계 RF-5300PC(Shimadzu Corporation제)를 사용하고, 여기 파장을 370㎚로 해서 488㎚에서 측정했다.
(3) 50mM HEPES 버퍼(pH7.6) 중에서의 미셀 형성
미셀 획분액은 50μM×160μL를 제작했다. 경과 농도는 20μM, 최종 농도 50μM였다. 미셀 제작용으로서 50mM의 HEPES 버퍼(pH7.6)로 한 점을 제외하고, 트리스 버퍼를 이용한 경우와 마찬가지로 해서 미셀을 제작했다. 미셀 분리시는 Amicon 100k Filter를 이용하여 트리스 버퍼의 경우와 마찬가지로, 1×PBS로 버퍼 교환을 행하고, 미셀 획분액을 얻었다.
미셀 획분액 및 미셀 미반응 획분액의 각 5μL를 취하고, 1×PBS 95μL를 첨가하여 20배 희석(2.5μM)으로 해서 입도를 측정했다(도 17 참조).
8μL의 미셀 획분액에 392μL의 1×PBS를 첨가하여 50배 희석(1μM)으로 하고, 형광을 측정했다. 16μL의 미반응 획분액에 384μL의 1×PBS를 첨가하여 25배 희석하고, 형광을 측정했다(도 21(A) 참조).
(4) 50mM 구연산 버퍼(pH7.6) 중에서의 미셀 형성
구연산나트륨 림을 사용하여 50mM의 구연산 버퍼(pH7.6)를 조제했다. 미셀 획분액은 50μM×160μL를 작성했다. 경과 농도는 20μM, 최종 농도는 50μM로 했다. 미셀 제작용 버퍼를 50mM 구연산 버퍼로 대신한 점을 제외하고, 트리스 버퍼를 사용한 경우와 마찬가지로 해서 미셀을 형성하여 분리했다. 5μL의 미셀 획분액에 95μL의 1×PBS를 첨가하여 시료(2.5μM)로 하고, 또한 5μL의 미셀 미반응 획분에 95μL의 1×PBS를 첨가하여 20배 희석하고, 각각 입도를 측정했다(도 18 참조).
미셀 획분액 및 미셀 미반응 획분액의 각 5μL를 취하고, 1×PBS 95μL를 첨가하여 20배 희석(2.5μM)으로 하고, 입도를 측정했다(도 18 참조).
8μL의 미셀 획분액에 392μL의 1×PBS를 첨가하여 50배 희석(1μM)으로 하고, 형광을 측정했다. 16μL의 미반응 획분액에 384μL의 1×PBS를 첨가하여 25배 희석하고, 형광을 측정했다(도 22(A) 참조).
(5) 50mM 탄산-중탄산 버퍼(pH8.36) 중에서의 미셀 형성
탄산수소나트륨을 이용하여 50mM의 탄산-중탄산 버퍼(pH8.36)를 조정했다. 미셀 획분액은 50μM×160μL를 작성했다. 경과 농도는 20μM, 최종 농도 50μM이었다. 미셀 제작용으로 버퍼를 50mM 탄산-중탄산염 버퍼(pH 8.36)로 대체한 것을 제외하고, 트리스 버퍼를 이용한 경우와 동일하게 해서 미셀을 제작했다. 미셀 분리시는 Amicon 100k Filter를 이용하고, 트리스 버퍼를 이용한 경우와 마찬가지로 해서 버퍼 교환하여 미셀 획분액을 얻었다.
미셀 획분액 및 미셀 미반응 획분액의 각 5μL를 취하고, 1×PBS 95μL를 첨가하여 20배 희석(2.5μM)으로 하고, 입도를 측정했다(도 19 참조).
8μL의 미셀 획분액에 392μL의 1×PBS를 첨가하여 50배 희석(1μM)으로 하고, 형광을 측정했다. 16μL의 미반응 획분액에 384μL의 1×PBS를 첨가하고, 25배 희석하여 형광을 측정했다(도 23(A) 참조).
(6) 결과
상기와 같이, 4종류의 버퍼 이용하여 최종 농도 50μM의 MCF-7 미셀을 조제 했다. 각각의 MCF-7 미셀의 입도 측정에 있어서, 어느 경우라도 1×PBS와 같은 100~200㎚ 부근에 입도 분포가 확인되었다(도 16~도 19). 또한, 여기 파장을 370㎚, 형광 파장 488㎚의 형광 광도계를 이용한 측정에 있어서도, 모든 버퍼에서 1×PBS와 마찬가지의 형광 스펙트럼이 관찰되었다(도 20~23). Tris-HCl 버퍼, HEPES 버퍼, 탄산 버퍼, 및 구연산 버퍼 중 어느 것을 사용한 경우라도 1×PBS와 마찬가지로 MCF-7 미셀의 조제가 가능한 것이 나타내어졌다.
또한, 각 버퍼를 사용하여 제작한 MCF-7 미셀 용액을 4℃에서 보존하고, 미셀 제작으로부터 1~4일 후에, 상기와 마찬가지의 조건에서 형광 분석을 행했다. 어느 버퍼를 사용한 경우라도, 형광 강도는 거의 변동없이 추이하여 단기의 안정성이 확인되었다(도 20(B)~도 23(B)).
(산업상 이용 가능성)
본원 발명은 의약 제제 분야, 특히 약물 송달의 분야에 있어서 유용하다.
(서열목록 프리텍스트)
서열번호 1: GFP에 포함되는 표적 인식 서열 펩티드(MCF 7-1)
서열번호 2: GFP에 포함되는 표적 인식 서열 펩티드(MCF 7-2)
서열번호 3: GFP에 포함되는 표적 인식 서열 펩티드(MCF 7-1+α 스탠드)
서열번호 4: MCF 7-1을 포함한 GFP
서열번호 5: MCF 7-2를 포함한 GFP
서열번호 6: MCF 7-1+α 스탠드를 포함한 GFP
서열번호 7: GFP의 아미노산 서열
서열번호 8: GFP의 아미노산 서열
서열번호 9: BFP의 아미노산 서열
서열번호 10: YFP의 아미노산 서열
서열번호 11: 디스코소마 유래의 형광 단백질의 아미노산 서열
서열번호 12: MCF 7-1의 증폭용 포워드 프라이머
서열번호 13: MCF 7-1의 증폭용 리버스 프라이머
서열번호 14: MCF 7-2 증폭용 포워드 프라이머
서열번호 15: MCF 7-2 증폭용 리버스 프라이머
서열번호 16: MCF 7-1+α 스탠드 증폭용 포워드 프라이머
서열번호 17: MCF 7-1+α 스탠드 증폭용 리버스 프라이머
서열번호 18: 인버스 PCR용 포워드 프라이머
서열번호 19: 인버스 PCR용 리버스 프라이머
서열번호 20: 인버스 PCR용 포워드 프라이머
서열번호 21: 인버스 PCR용 리버스 프라이머
서열번호 22: 올리고뉴클레오티드
서열번호 23: 올리고뉴클레오티드
서열번호 24: 올리고뉴클레오티드
서열번호 25: 올리고뉴클레오티드
서열번호 26: 인버스 PCR용 포워드 프라이머
서열번호 27: 인버스 PCR용 리버스 프라이머
서열번호 28: 인버스 PCR용 포워드 프라이머
서열번호 29: 인버스 PCR용 리버스 프라이머
서열번호 30: 인버스 PCR용 포워드 프라이머
서열번호 31: 인버스 PCR용 리버스 프라이머
서열번호 32: 인버스 PCR용 포워드 프라이머
서열번호 33: 인버스 PCR용 리버스 프라이머
서열번호 34: 인버스 PCR용 포워드 프라이머
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Leu Leu 195 200 205 Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro 210 215 220 Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala 225 230 235 240 Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly His His His 245 250 255 His His His <210> 11 <211> 236 <212> PRT <213> Actinia equina <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(236) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(236) <223> GFP <400> 11 Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val 35 40 45 Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln 50 55 60 Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val 85 90 95 Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser 100 105 110 Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn 115 120 125 Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu 130 135 140 Pro Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu 145 150 155 160 Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu 165 170 175 Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr 180 185 190 Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr 195 200 205 Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe 210 215 220 Leu Gly Thr Cys Gly Gly His His His His His His 225 230 235 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(45) <400> 12 cctggtactg ttcttcctgg tggtatgagt aaaggagaag aactt 45 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(27) <223> Primer <400> 13 catatcgcga cccatttgct gtccacc 27 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(45) <223> Primer for MCF7-1 <400> 14 actgatactg attatagtgg aggaatgagt aaaggagaag aactt 45 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(27) <223> Primer for MCF7-1 <400> 15 aggaacgcga cccatttgct gtccacc 27 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(51) <223> Primer for MCF7-2 <400> 16 caacaacaac aacatcaatg ggcaaaacaa gaaatgagta aaggagaaga a 51 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(42) <223> Primer for MCF7-2 <400> 17 ccattcacct tcactaccac caccaccacc aggaagaaca gt 42 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(22) <223> Primer for MCF7-1+alpha stand peptide <400> 18 cattgaagat ggctccgttc aa 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(22) <223> Primer for MCF7-1+alpha stand peptide <400> 19 ttgtggcgag ttttgaagtt ag 22 <210> 20 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for inverse PCR <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(70) <223> Primer for inverse PCR <400> 20 ctcgaccata tggctagcat gactggtgga cagcaaatgg gtcgcatgag taaaggagaa 60 gaacttttca 70 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(54) <223> Primer for inverse PCR <400> 21 tgacgtgaat tcattagtga tggtgatggt gatgtttgta gagctcatcc atgc 54 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(25) <223> Primer for inverse PCR <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 cttaaattta ttnnkactgg aaaac 25 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(20) <223> Primer for inverse PCR <400> 23 ggtaagtttt ccgtatgttg 20 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_binding <222> (1)..(26) <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 gtgttcaann kttttcccgt tatccg 26 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_binding <222> (1)..(22) <400> 25 catacgtcag agtagtgaca ag 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_binding <222> (1)..(23) <400> 26 tgtcttttca ctggagttgt ccc 23 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_binding <222> (1)..(21) <400> 27 ttctccttta ctcatttttt c 21 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(24) <223> Primer for inverse PCR <400> 28 tgcacacatg gcatggatga gctc 24 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(21) <223> Primer for inverse PCR <400> 29 cccagcagca gttacaaact c 21 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(33) <223> Primer for inverse PCR <400> 30 cagcgccgtt gtgagctcta caaataatga att 33 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(21) <223> Primer for inverse PCR <400> 31 tgtaatccca gcagcagtta c 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(21) <223> Primer for inverse PCR <400> 32 acatgtgagc tctacaaata a 21 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(18) <400> 33 acggccctgt gtaatccc 18 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(21) <223> Primer for inverse PCR <400> 34 ggaacatgtg agctctacaa a 21

Claims (15)

  1. 형광 단백질에 의해서 형성된 회합체로 이루어지는 엔도사이토시스 증강제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 형광 단백질은 백색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 및 녹색 형광 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 회합체는 상기 형광 단백질이 2~10분자 응집한 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 회합체는 세포 내로의 상기 회합체 자체의 도입도 증강하는 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  5. 제 4 항에 있어서,
    표적 인식 서열은 상기 형광 단백질의 회합체 형성을 조절할 수 있는 서열을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 형광 단백질의 회합체 형성을 조절할 수 있는 서열은 표적 인식 서열인 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 표적 인식 서열은 기능성 펩티드로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 기능성 펩티드는 각종 조직에 발현되어 있는 표면 항원, 수용체, 게이트, 트랜스포터 및 채널로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표적 단백질과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 기능성 펩티드는 서열목록의 서열번호 1~3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 식(I)으로 나타내어지는 골격 구조를 갖는 응집성 분자로 구성된 미셀의 엔도사이토시스에 의한 도입을 증강시키는 엔도사이토시스 증강제.
    [식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다]
    Figure pct00021
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 식(I)으로 나타내어지는 응집성 분자는 하기 식(II)으로 나타내어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
    Figure pct00022
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 응집성 분자는 하기 식(III)~(VI)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
    [하기 식 중, GFP는 형광 단백질을 나타낸다]
    Figure pct00023

    Figure pct00024

    Figure pct00025

    Figure pct00026
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    수성 용매 중에서 단백질을 외측으로 해서 형성되고, FRET에 의한 형광을 발하는 직경 50~500㎚의 미셀의 엔도사이토시스를 증강하는 엔도사이토시스 증강제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 미셀은 분자량 20만 이하의 단백질, 핵산, 및 소수성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 분자를 내포할 수 있는 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 분자량 20만 이하의 단백질은 면역 글로불린 G, 렉틴, 및 펩티드 호르몬으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 엔도사이토시스 증강제.
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