KR20190099438A - 절지동물에 유익한 효모 - Google Patents

Abstract

절지동물에게, 구체적으로 먹이 조성물 중에 포함된 위커하미엘라 효모, 바람직하게 위커하미엘라 봄비필라 효모(칸디다 봄비필라라고도 공지됨) 또는 이에 의해 생산된 물질을 제공하는 단계를 포함하는, 절지동물, 구체적으로 수분매개 곤충을 사육하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 유리하게 상기 효모, 구체적으로 이 효모를 포함하는 먹이 조성물은 절지동물, 구체적으로 수분매개 곤충에게 제공될 때 절지동물의 적응도, 건강, 행동 및 활동을 개선한다.

Description

절지동물에 유익한 효모

본 발명은 절지동물을 사육하고/사육하거나 절지동물의 적응도(fitness), 건강(health) 및/또는 행동을 개선하는 방법을 제공하고, 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용되기 위한 먹이 또는 사료 조성물을 추가로 제공한다.

다수의 절지동물은 환경에서 중요한 역할을 담당하고 있으며, 인간에게도 다수의 양태로 중요한 존재이다. 예를 들어 절지동물은 분해자로서 해충의 생물학적 구제에 사용될 수 있거나, 또는 약물 성분, 실크 또는 밀납과 같이 인간에 의해 만들어지는 몇몇 제품의 생산에 사용될 수 있다. 더욱이, 몇몇 절지동물, 예컨대 갑각류(예컨대 새우, 참새우, 게, 바닷가재) 및 곤충은 인간의 식품으로서 사용하기 위해 양식되고 있다. 그러나 절지동물이 인간의 식품 공급에 있어서 가장 크게 기여하고 있는 것은 수분 봉사를 제공함으로써 절지동물에 의해 수분된 결과성 작물(fruit-bearing crop)의 성공적 생산을 보장하는 것이다.

절지동물 수분매개체, 구체적으로 곤충은 식물에게 타가 수분의 이점을 제공함으로 말미암아 식물의 생식과 생태계 작용에 중요한 역할을 하고 있다. 곤충은 대부분의 농작물과 야생 식물의 으뜸가는 수분매개체이다. 충매화 식물(속씨식물의 87%를 차지)에 있어서, 곤충에 의한 수분은 자가 수분의 경우보다 작물의 수확량, 개개의 과일의 품질과 양, 유통기간, 맛, 영양 조성 및 시장에서의 가치를 개선하는 것으로 확인된 바 있다. 결과적으로 수분매개체의 풍성함과 풍부함은 농업 생산성과 야생식물 공동체의 보존 두 가지 면에서 필수 요소이다. 결국 식물은 자신을 방문한 곤충에게 꽃의 주요 답례품인 화밀과 화분을 제공한다. 그러나 서유럽과 그 밖의 전 세계 여러 지역에 있어서, 지난 세기 동안 행하여진 전통적인 농사의 집약적 실시는 경관을 해쳤고, 이는 적합한 꽃 자원의 결실로 이어져 꽃에 의존하며 살아가는 다수 곤충의 서식지를 피폐하게 만들었다. 게다가 집약적인 농업 생산에 사용된 화학 살충제는 수분매개체들에게 심각한 부정적인 효과를 직간접적으로 미치는 것으로 보였다. 예를 들어 살진균제는 절지동물의 장내 세균에 영향을 미칠 수 있어서, 숙주의 건강 및/또는 먹이 소화 능력에 영향을 줄 수 있다. 마지막으로 임의의 곤충 수분매개체(벌)는 다수의 질병과 해충(진드기)에 취약하다. (종종 상호 영향을 미치는) 이러한 3가지 기작은 전 세계적으로 수분매개체인 곤충의 공동체 퇴락의 저변에 깔려있는 주요 요인들인 것으로 생각된다.

이러한 경향에 맞서고 수분매개체의 다양성과 적응도를 지속적으로 유지하기 위한 노력이 행하여지고 있다. 수분매개 곤충의 건강, 행동 및 수는, 예컨대 이 수분매개 곤충의 서식지 규모와 질을 높이거나, 대중의 의식을 환기시키거나, 수분매개체 유해성 살충제 사용을 금지시키거나, 양봉을 지원하는 등의 방법에 의해 개선될 수 있다. 그러나 재배 작물 및 야생 식물 둘 다의 앞으로의 수분을 보장하기 위해 수분매개체의 적응도와 건강을 개선시킬 필요성은 여전히 존재한다.

농사에 있어서 절지동물은 또한 해충의 생물학적 구제시 포식자 및 포식기생자로서 중요한 역할을 담당한다. 종 풍부 집단은 종 빈약 집단에 비하여 해충을 구제할 가능성이 더 높기 때문에, 이러한 맥락에서 생물다양성을 개선하는 것도 또한 중요하다.

따라서 유익 절지동물의 적응도와 건강의 개선을 허용하는 방법을 개선하는 것이 일반적으로 필요하게 되었다.

본원에는 절지동물에게 위커하미엘라(Wickerhamiella) 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(Wickerhamiella bombiphila) 효모(예전에는 칸디다 봄비필라(Candida bombiphila)라고도 공지됨), 예컨대 특정의 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 균주 및/또는 이 효모의 단편 또는 이 효모에 의해 생산되는 물질을 제공함으로써 절지동물, 구체적으로 수분매개 곤충을 사육하기 위한 방법 및/또는 이 수분매개 곤충의 적응도, 건강 및/또는 행동을 개선하기 위한 방법이 기술되어 있다. 본원에는 또한 절지동물, 구체적으로 수분매개 곤충에게 상기 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모를, 예컨대 구체적으로는 먹이 또는 사료 조성물, 즉 상기 효모 또는 이 효모에 의해 생산된 물질을 포함하는 먹이 또는 사료 조성물을 통해 제공하기 위한 다양한 방법이 기술되어 있다. 본 발명의 상이한 양태들과 구현예들은 유리하게 선행 기술의 문제점들 중 일부를 줄여준다. 구체적으로 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모를 절지동물, 구체적으로 수분매개 곤충에게 제공하는 것은, 이러한 절지동물의 적응도, 건상 및/또는 행동을 개선하여, 더욱 강하고 건강한 절지동물 집단을 초래하는 것으로 파악되었다. 수분매개체 공동체의 적응도 향상은 수분 활동의 증가에 기여하고, 결국에는 수분된 결과성 작물의 성공적 생산과 야생 식물의 성공적 생식을 보장한다.

따라서 본 출원은 절지동물을 사육하고/사육하거나 절지동물의 적응도를 개선하기 위한 방법으로서, 상기 절지동물에게 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라), 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 절지동물은 군락 형성 절지동물(colony forming arthropod)이다. 더욱 구체적으로 상기 방법은 절지동물 군락의 발달, 크기 및/또는 적응도를 개선하기 위한 방법이다.

본원에 구상되는 바와 같은 상이한 방법들에 관한 특정 구현예에 있어서, 상기 절지동물에는

(i) 상기 위커하미엘라 효모의 생세포;

(ii) 상기 위커하미엘라 효모의 사멸 세포; 또는

(iii) 상기 위커하미엘라 효모가 접종되어 배양되었던 성장 배지를 포함하는 조성물

로부터 선택되는 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모 물질이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 성장 배지는 상기 효모의 생세포 및/또는 상기 효모의 사멸한 세포를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 성장 배지는 효모의 (생 또는 비활성화) 세포가 배양된 다음에 제거된 배지이다. 그러므로 특정 구현예에서, 성장 배지는 더 이상 효모 세포를 포함하지 않게 되지만, 배지에서 배양이 이루어지는 동안에는 상기 위커하미엘라 효모에 의해 생산된 물질을 포함하고/포함하거나 효모 단편을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 출원은 개화하는 작물(flowering crop)을 절지동물에 의해 수분시키는 단계를 수반하고, 이 절지동물에는 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라), 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질이 제공되는, 결과성 작물을 재배하기 위한 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로 본 방법은 개화하는 결과성 작물을 제공하는 단계, 상기 작물에 수분매개 절지동물을 제공하는 단계[다만 상기 절지동물은 본원에 기술된 방법에 따라서 사육된 것임], 및 수분매개 절지동물에 의한 개화하는 작물의 수분을 허용하는 단계를 포함한다.

본 출원은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라), 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질의, 절지동물의 건강, 적응도 및/또는 행동을 개선 또는 향상시키기 위한 용도를 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)는 크리티디아 봄비(Crithidia bombi)의 장내 기생체를 감소시킨다.

본원에 제공된 용도에 관한 특정 구현예에서, 절지동물은 수분매개 비행곤충이다. 특정 구현예에서, 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라), 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질은 상기 절지동물의 비행 활동을 개선하는데 사용된다.

본원에 기술된 방법과 용도에 관한 특정 구현예에서, 상기 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라), 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질은 본원에 또한 기술된 바와 같은 먹이 조성물 중에 포함된다.

본원에 제공된 방법과 용도에 관한 특정 구현예에서, 상기 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)는 BCCM/LMG 배양 수집소에 승인 번호 MUCL 56142로 기탁된 위커하미엘라 봄비필라/칸디다 봄비필라 균주이다.

본 출원은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)를 포함하는, 절지동물용 먹이 조성물을 추가로 제공한다. 바람직하게 상기 절지동물용 먹이 조성물은 당 물 및/또는 화분과, 위커하미엘라 효모, 바람직하게 위커하미엘라 봄비필라, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 구상되는 바와 같은 절지동물용 먹이 조성물은 당 물 및/또는 화분과, (i) 상기 위커하미엘라 효모의 생세포; (ii) 상기 위커하미엘라 효모의 사멸 세포; 또는 (iii) 상기 위커하미엘라 효모가 접종된 성장 배지로서, 상기 효모의 생세포 또는 상기 효모의 사멸한 세포를 포함하거나, 상기 위커하미엘라 효모가 접종되어 항온처리된 후 이 효모 세포가 제거된 성장 배지를 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 먹이 조성물은 효모 세포 또는 이로부터 유래하는 생성물 이외에도 (i) 탄수화물 원, 바람직하게 당 또는 화밀이나 꿀 또는 이의 대체물; 및 (ii) 선택적으로는 하기 먹이용 성분들, 즉 질소 원, 비타민, 지질 또는 지방 및/또는 무기질을 포함한다. 특정 구현예에서, 탄수화물 원은 수크로스, 글루코스, 말토스, 덱스트로스, 프럭토스, 전화당, 옥수수 시럽 또는 글루코스 시럽, 그리고 이것들의 조합으로부터 선택되는 당이다.

본원에 제공된 방법, 용도 및 먹이 조성물에 관한 특정 구현예에서, 상기 절지동물은 곤충, 바람직하게 히메노프테라(Hymenoptera)이다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 히메노프테라는 아포크리타(Apocrita), 바람직하게 아포이데아에(Apoidea), 더욱 바람직하게 벌 또는 호박벌이다.

본 출원은 본원에 제공된 방법과 용도에 특히 적합한 위커하미엘라 봄비필라/칸디다 봄비필라 균주를 추가로 제공한다. 더욱 구체적인 구현예에서, 균주는 BCCM/LMG 배양 수집소에 승인 번호 MUCL 56142로 기탁된 균주 또는 이의 변이체이다.

이하 본 발명의 특정 구현예에 관한 도면의 설명은 사실상 단지 예시적인 것이지, 본 발명의 교시사항들, 이의 응용예 또는 용도를 제한하고자 하는 것은 아니다.
도 1. 본 발명의 특정 구현예에 따른 효모 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)의 생세포에 의한 호박벌 병원체인 크리티디아 봄비의 억제. 생세포 비율은 2가지의 상이한 대기 조건하에서 시험된 2개 종에 대해 보였다. 삼각형은 장내 기생체인 크리티디아 봄비 생세포의 평균 비율을 보이고, 원은 효모인 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 생세포의 평균 비율을 나타낸다. 생세포 비율은 단일 종 대조군(○ 및 △)과 2종 혼합군(● 및 ▲)에 대해 보이며, 여기서 막대는 표준 오차를 나타낸다. 상이한 문자들은 유의미하게 상이한 결과들을 보여주는데, 이 경우 P 값은 일반화된 선형 모델의 최소제곱법을 기반으로 산정된다.
도 2. 처리된 호박벌 군락들의 비행 활동에 대한 효모 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)의 영향. 대조군 군락(검정색) 및 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 처리 군락(흰색)에 대한 5분간의 계수 라운드당 벌집을 들어갔다가 나오며 비행하는 일벌의 모델 보정 평균 수. 비행하며 들어가는 일벌과 비행하며 나오는 일벌 둘 다의 개체수 합뿐만 아니라 전체 비행 활동도 제공되어 있다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. P 값과 Z 값은 일반화된 선형 혼합 모델의 최소제곱법을 기반으로 산정된다.
도 3. 대조군 처리(검정) 및 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 처리(흰색) 둘 다에 따른, 일벌인 개체 및 일벌이 될 개체(즉 번데기 및 일벌 모두)의 8주 기간이 지난 후 계수하여 모델 보정한 평균 수. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. P 값과 Z 값은 일반화된 선형 모델의 최소제곱법을 기반으로 산정된다.
도 4. 전체 군락 크기(모든 발달 단계에 있는 개체의 합), 브러드(brood)(알 및 유충) 및 일벌이 될 개체(번데기 및 우화한 일벌 모두)의 수에 대한 모델 보정 주간 평균 증가율은 대조군 처리(검정) 및 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)(Cbh) 처리(흰색)에 대해 보였다. 별표는 일반화된 선형 혼합 모델의 P 값을 기반으로 한 유의성 수준을 보여준다(* = P< .05).
도 5. 상이한 발달 단계(알, 번데기 및 우화하는 성체(일벌))에 도달하는데 소요되는 평균 시간(일 수)은 대조군 처리시(검정)와 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)(Cbh) 처리시(흰색)에 대해 보였다. 점선은 표준 오차를 나타낸다.
도 6. 전체 실험(12주)에 걸쳐 합산된 사멸 유충의 모델 보정 평균 수는 대조군 처리시(검정)와 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 처리시(흰색)에 대해 보였다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. P 값과 Z 값은 일반화된 선형 모델의 최소제곱법을 기반으로 산정된다.
도 7. 대조군(검정) 및 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 처리군(흰색)에 있어서 태어난 이성 개체(수컷 및 여왕벌)에 대한 모델 보정 평균 수. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. P 값과 Z 값은 일반화된 선형 모델의 최소제곱법을 기반으로 산정된다.
도 8. 본 발명의 한 구현예에 따라 당 물 중에 그 어떠한 효모도 함유하지 않았던 대조군 처리시와 비교되는, MUCL 56142 균주("Biobest 균주"라 명명) 및 "표준 균주(type strain)" CBS 9712T의 군락 발달에 대한 효과.
도 9. 대조군 조성물이 공급된 군락(검정 막대) 또는 씨. 봄비필라 보충 화분이 공급된 군락(흰색 막대)에 있어서, 5주 후 브러드 발달(좌측) 및 일벌로 예측되는 개체의 수(우측). 막대의 높이는 모델 보정된 평균 ± SE를 나타낸다. 상이한 문자들은 주어진 변수에 대하여 p<0.05에서 상이한 평균을 나타낸다.
도 10. 대조군, 즉 씨. 봄비필라가 보충되지 않은 화분이 공급된 군락(검정 막대) 및 씨. 봄비필라가 보충된 화분 브레드(pollen bread)가 공급된 군락(흰색 막대)가 공급된군락에 있어서, 8주 경과시 일벌의 수(좌측) 및 수컷의 수(우측). 막대의 높이는 모델 보정된 평균 ± SE를 나타낸다. 상이한 문자들은 주어진 변수에 대하여 p<0.05에서 상이한 평균을 나타낸다.
도 11. 5주차(상부 패널) 및 10주차(하부 패널)일 때, 대조군 처리시(검정) 및 4가지의 씨. 봄비필라(Cbh) 처리시[좌 → 우: 활성 효모 세포 처리시(처리 1); 3일 후 비활성화된 효모 세포 처리시(처리 2); 당 물에 첨가된 성장 배지로부터 단리된 비활성화 효모 세포 처리시(처리 3); 3일 후 효모 세포가 비활성화되어 효모 세포를 여과한 성장 배지 처리시(처리 4)]에 있어 일벌로 예측되는 개체(번데기 및 우화한 일벌 모두)의 모델 보정 평균 ± SE. 막대 위 상이한 문자들은 p<0.05에서의 유의미한 차이를 나타낸다.
도 12. 대조군(검정 막대) 대 씨. 봄비필라 처리 군락에 있어서 일벌이 처음 우화하기까지의 평균 경과 일수 ± SE. 상이한 막대는 상이한 씨. 봄비필라 투여 처리들을 나타낸다[좌 → 우: 활성 효모 세포 처리시(처리 1); 3일 후 비활성화된 효모 세포 처리시(처리 2); 당 물에 첨가된 성장 배지로부터 단리된 비활성화 효모 세포 처리시(처리 3); 3일 후 효모 세포가 비활성화되어 효모 세포를 여과한 성장 배지 처리시(처리 4)]. 파선은 기준선, 즉 대조군 조건에서 일벌이 가장 빨리 출현한 때를 나타낸다.
도 13. 16주의 기간이 경과한 후 대조군(검정 막대) 대 씨. 봄비필라 처리 군락에 있어서 군락마다 태어난 암컷 개체(여왕벌 및 일벌 모두)의 적응도. 상이한 막대는 상이한 씨. 봄비필라 투여 처리들을 나타낸다[좌 → 우: 활성 효모 세포 처리시(처리 1); 3일 후 비활성화된 효모 세포 처리시(처리 2); 당 물에 첨가된 성장 배지로부터 단리된 비활성화 효모 세포 처리시(처리 3); 3일 후 효모 세포가 비활성화되어 이 효모 세포를 여과한 성장 배지 처리시(처리 4)]. 상이한 문자들은 p<0.05에서 유의미하게 상이하였던 평균을 나타낸다.
도 14. 벨기에 상트롱(Sint-Truiden)에 있는 사과 과수원에 군락을 가져다 놓고 나서 1주 및 2주 후의 대조군 군락(검정 막대)의 비행 활동에 비한 씨. 봄비필라 처리 군락의 비행 활동(5분 간의 개체수 조사당 들어가는 벌과 나오는 벌 모두의 비행 활동). 상이한 막대들은 상이한 씨. 봄비필라 투여 처리들을 나타낸다[좌 → 우: 활성 효모 세포 처리시(처리 1); 3일 후 비활성화된 효모 세포 처리시(처리 2); 당 물에 첨가된 성장 배지로부터 단리된 비활성화 효모 세포 처리시(처리 3); 3일 후 효모 세포가 비활성화되어 이 효모 세포를 여과한 성장 배지 처리시(처리 4)]. 상이한 문자들은 p<0.05에서 유의미하게 상이하였던 평균을 나타낸다.
도 15. 처녀(naive) 비. 테레스트리스(B. terrestris) 일벌과, 대조군 당 물(검정 막대, 효모 불포함) 또는 씨. 봄비필라 생세포를 포함하는 당 물(흰색 막대)이 함유된 조화 16개를 사용하여 수행된 이중 선택 행동 시험(dual-choice behavioral test). 선호도는 각각의 처리시 총 방문 횟수(좌측) 또는 호박벌이 상기와 같은 조화를 탐색하는데 평균적으로 소요된 시간(우측)을 기록함으로써 평가되었다.

본 발명의 범위는 오로지 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이므로, 본원에 사용된 용어는 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아님이 이해될 것이다.

달리 정의되지 않는 한 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법과 재료는 지금부터 기술된다.

특허청구범위내 임의의 참조 기호는 본 발명을 이해함에 있어서 지침으로서 잠재적으로 사용될 수 있지만, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안될 것이다.

본 명세서와 이에 첨부된 특허청구범위에 있어서, 단수 형태를 나타내는 "하나의(a)", "한(an)" 및 "본(the)"은 문맥 중 명백히 달리 명시되어 있지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "~를 포함하는(comprising)", "~를 포함하다(comprise)" 및 "~으로 구성된(comprised of)"이란 용어는, "~를 포함하는(including)", "~를 포함하다(include)" 또는 "~를 함유하는(containing)", "~를 함유하다(contain)"와 유의어이자, 포괄적이거나 조정가능한 개방형의 용어로서, 부가의 언급되지 않은 일원, 요소 또는 방법의 단계를 배제하지 않는다. "~를 포함하는", "~를 포함하다" 및 "~으로 구성된"이란 용어는 또한 "~로 이루어진(consisting of)"이란 용어를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "약"이란 용어는 개시된 발명에서 측정 가능한 값, 예컨대 매개변수, 양, 시간의 지속 등을 지칭할 때, 지정된 값의, 그리고 지정된 값으로부터의 ±10% 이하, 바람직하게 ±5% 이하, 더욱 바람직하게 ±1% 이하, 그리고 더욱더 바람직하게 ±0.1% 이하만큼의 변화가 적용되기 적합한 한, 이러한 변화를 포함하는 의미이다. 수식어 "약"이 지칭하는 어떤 값은 그 자체로서도 또한 구체적으로, 그리고 바람직하게 개시된다는 것이 이해될 것이다.

한계치들에 의한 수치 범위의 인용은 각각의 범위 내에 포함되는 모든 수와 소수뿐만 아니라, 인용된 한계치들을 포함한다.

본 발명의 상이한 양태들 또는 구현예들은 하기 단락들에 더욱 상세히 기술된다. 이처럼 기술된 각각의 양태 또는 구현예는 명백히 모순되도록 명시되지 않은 한 다른 임의의 양태(들) 또는 구현예(들)와 합하여질 수 있다. 구체적으로 바람직하거나 유리한 것으로서 명시된 임의의 특색은 바람직하거나 유리한 것으로서 명시된 또다른 임의의 특색 또는 특색들과 합하여질 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 "일 구현예", "한 구현예"에 대한 언급은, 해당 구현예와 관련하여 기술된 구체적인 특색, 구조 또는 특징이 본 발명의 구현예 적어도 하나에 포함됨을 의미한다. 따라서 본 명세서를 통틀어 여러 곳에서 "일 구현예에서" 또는 "한 구현예에서"란 어구의 출현은 동일한 구현예를 지칭할 수도 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 더욱이, 구체적인 특색, 구조 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서 본 개시내용으로부터 당업자에게 명백할 바와 같은 임의의 적합한 방식으로 합하여질 수 있다. 더욱이 본원에 기술된 몇몇 구현예는 다른 구현예에 포함된, 일부이되 다른 것은 아닌 특색들을 포함하는 반면, 상이한 구현예에 관한 특색들의 조합은 당 업자들에 의해 이해될 바와 같이 본 발명의 범위 안에 있고, 상이한 구현예들을 형성함을 의미한다. 예를 들어 첨부된 특허청구의범위에서 청구된 구현예들 중 임의의 것은 임의로 조합되어 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은"칸디다 봄비필라" 및 "위커하미엘라 봄비필라"란 용어는 호환되어 사용되는 것으로서, 동일한 효모 종을 지칭한다. 사실, 이 종의 균주 2개는 2004년에 Brysch-Herzberg에 의해 처음으로 기술된 것으로서, 이 종의 가장 가까운 사촌은 위커하미엘라 도메르퀴아에(Wickerhamiella domerquiae)인 것으로 밝혀졌다(Herzberg and Lachance, 2004, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 1857-1859). 그 당시 저자들은 이 종들을 접합시켜 유성 생식을 실현할 수 없었기 때문에, 상기 종들은 무성 계통군인 칸디다로서 기술되었는데, 이 명명법은 원래 불완전 또는 무성 효모를 명시하는데 사용되었던 방법으로서, 매우 다양한 종들에 적용되고 있다. 종에 관한 DNA 기반 계통 발생을 바탕으로 한 최근의 연구는, 예전에 "칸디다 봄비필라"로 공지되었던 종은 현재 위커하미엘라 봄비필라로 재명명되어야 한다고 제안하고 있다(de Vega etal, 2017, FEMS Yeast Research, Volume 17, Issue 5, 1 August 2017).

놀랍게도 본 발명자들은 임의의 효모는 유기체, 구체적으로 절지동물에 제공될 때, 더욱 구체적으로 효모가 상기 절지동물에 의해 섭식될 때, 이 유기체, 구체적으로 절지동물의 전반적인 적응도에 관한 다양한 양태들을 개선할 수 있음을 발견하였다. 구체적으로 본 발명자들은 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 또는 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질이, 예컨대 설탕 용액 중에 첨가되거나 화분을 통해 절지동물에게 제공될 때, 절지동물의 사육, 건강 및/또는 행동이 향상되고, 적응도가 개선됨을 발견하였다. 실제로 본 발명자들은, 호박벌에 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)가, 구체적으로 이 효모를 포함하는 먹이 조성물(설탕 용액 및/또는 화분)로서 제공되면, 호박벌 군락의 크기, 호박벌 군락의 브러드, 일벌의 수, 수컷인 이성 개체의 수 및/또는 일벌로 예측되는 개체의 수가 증가하고/증가하거나 사멸하는 유충의 수가 감소하는 것을 발견하였다. 게다가 본 발명자들은, 절지동물에 제공될 때 전술된 효과를 초래하는데 특히 효능이 있는 것으로 보였던 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)의 특이 균주를 단리하였다.

본 발명의 상이한 양태들과 구현예에 관한 내용 중 본원에 지칭된 바와 같은"절지동물"이란 용어는 곤충, 거미류, 다족류 및 갑각류를 포함하는 절지동물문에 속하는 임의의 절지동물일 수 있다. 바람직하게 절지동물은 동물, 예컨대 가축, 낙농 동물, 어류 및/또는 인간의 사료 또는 먹이(식품)로서 중요한 절지동물이거나, 또는 다른 제품, 예컨대 실크나, 또는 수분 및 해충의 생물학적 구제와 같은 봉사를 제공하는 절지동물이다. 특정 구현예에서, 절지동물은 곤충, 바람직하게 수분매개 곤충이다. 수분매개 곤충의 비 제한적 예들로서는 벌, 나비, 나방, 개미, 말벌, 파리, 각다귀, 모기 또는 딱정벌레가 있다. 특정 구현예에서, 절지동물은 벌, 바람직하게 호박벌 또는 꿀벌, 더욱 바람직하게 봄버스(Bombus) 속에 속하는 호박벌이다. 특정 구현예에서, 절지동물은 수분매개 군락 형성 곤충이다. 특정 구현예에서, 곤충은 히메노프테라, 예컨대 이포크리타 아목, 더욱 구체적으로 아포이데아 상과에 속한다. 특정 구현예에서, 절지 동물은 아피다에(Apidae)에 속한다. 추가의 특정 구현예에서, 곤충은 아캄프토퓸(Acamptopeum), 안테무르구스(Anthemurgus), 안테레노이데스(Antherenoides), 아칸토푸스(Acanthopus), 아프로멜렉타(Afromelecta), 아가판티누스(Agapanthinus), 아글라에(Aglae), 아글라오멜리사(Aglaomelissa), 알레피도셀레스(Alepidosceles), 알로시르테티카(Alloscirtetica), 아메길라(Amegilla), 안실라(Ancyla), 안실로셀리스(Ancyloscelis), 안토포라(Anthophora), 안토포룰라(Anthophorula), 아피스(Apis), 아포트리고나(Apotrigona), 아리소세블(Arhysoceble), 오스트로플레베이아(Austroplebeia), 악세스토트리고나(Axestotrigona), 봄버스(Bombus), 브라키멜렉타(Brachymelecta), 카에노노마다(Caenonomada), 카마르고이아(Camargoia), 카네포룰라(Canephorula), 세몰로버스(Cemolobus), 센트리스(Centris), 세팔로트리고나(Cephalotrigona), 칼레포제너스(Chalepogenus), 킬라말롭시스(Chilamalopsis), 클렙토트리고나(Cleptotrigona), 코엘리옥소이데스(Coelioxoides), 크테니오셸러스(Ctenioschelus), 크테노플렉트라(Ctenoplectra), 크테노플렉트리나(Ctenoplectrina), 쿠비탈리아(Cubitalia), 닥틸루리나(Dactylurina), 델토프틸라(Deltoptila), 다이아다시아(Diadasia), 다이아다시나(Diadasina), 덕케올라(Duckeola), 엘라프로포다(Elaphrophoda), 에페올로이데스(Epeoloides), 에피카리스(Epicharis), 에피클로푸스(Epiclopus), 에레마피스(Eremapis), 에리크로시스(Ericrocis), 유세라(Eucera), 유세리노다(Eucerinoda), 유프리에세아(Eufriesea), 유글로사(Euglossa), 율라에마(Eulaema), 엑사에레테(Exaerete), 엑소말롭시스(Exomalopsis), 플로리레구스(Florilegus), 프리에셀라(Friesella), 프리에세오멜리타(Frieseomelitta), 가에시쉬아(Gaesischia), 가에소키라(Gaesochira), 게니오트리고나(Geniotrigona), 게오트리고나(Geotrigona), 하브로포룰라(Habrophorula), 하브로포다(Habropoda), 하마토트릭스(Hamatothrix), 헤테로트리고나(Heterotrigona), 호모트리고나(Homotrigona), 호플리포라(Hopliphora), 하이포트리고나(Hypotrigona), 이세페올루스(Isepeolus), 란타노멜리사(Lanthanomelissa), 레이오포두스(Leiopodus), 레피도트리고나(Lepidotrigona), 레스트리멜리타(Lestrimelitta), 루로트리고나(Leurotrigona), 리오트리고나(Liotrigona), 리소트리고나(Lisotrigona), 로포티게이터(Lophothygater), 로포트리고나(Lophotrigona), 마르티나피스(Martinapis), 멜렉타(Melecta), 멜렉토이데스(Melectoides), 멜리필롭시스(Meliphilopsis), 멜리플레베이아(Meliplebeia), 멜리포나(Melipona), 멜리포눌라(Meliponula), 멜리소데스(Melissodes), 멜리소프틸라(Melissoptila), 멜리토마(Melitoma), 멜리토멜라(Melitomella), 멜리윌레아(Meliwilea), 메소셰이라(Mesocheira), 메소니치움(Mesonychium), 메소플리아(Mesoplia), 마이크로니캅시스(Micronychapsis), 미르나피스(Mirnapis), 모노에카(Monoeca), 모우렐라(Mourella), 난노트리고나(Nannotrigona), 나노라티무스(Nanorhathymus), 노구에이라피스(Nogueirapis), 노톨로니아(Notolonia), 오돈토트리고나(Odontotrigona), 오시리누스(Osirinus), 옥시트리고나(Oxytrigona), 파키멜루스(Pachymelus), 파키스바스트라(Pachysvastra), 파푸아트리고나(Papuatrigona), 파라테트라페디아(Paratetrapedia), 파라트리고나(Paratrigona), 파라트리고노이데스(Paratrigonoides), 파에페올루스(Paepeolus), 파리오트리고나(Pariotrigona), 파르타모나(Partamona), 페포납시스(Peponapsis), 플라티스바스트라(Platysvastra), 플라티트리고나(Platytrigona), 플레베이아(Plebeia), 플레베이엘라(Plebeiella), 플레베이나(Plebeina), 프로토시리스(Protosiris), 프틸로트릭스(Ptilothrix), 프틸로트리고나(Ptilotrigona), 라티머스(Rhathymus), 산티오가(Santioga), 스캅토트리고나(Scaptotrigona), 스카우라(Scaura), 슈바르지아나(Schwarziana), 슈바르줄라(Schwarzula), 시만테돈(Simanthedon), 시노멜렉타(Sinomelecta), 선다트리고나(Sundatrigona), 스바스트라(Svastra), 스바스트리데스(Svastrides), 스바스트리나(Svastrina), 신트리칼로니아(Syntrichalonia), 타피노탑시스(Tapinotapsis), 타피노타스포이데스(Tapinotaspoides), 타르살리아(Tarsalia), 테라토그나타(Teratognatha), 테트라고나(Tetragona), 테트라고닐라(Tetragonilla), 테트라고니스카(Tetragonisca), 테트라고눌라(Tetragonula), 테트랄로니아(Tetralonia), 테트랄로니엘라(Tetraloniella), 테트랄로니오이델라(Tetralonioidella), 테트라페디아(Tetrapedia), 테트리고나(Tetrigona), 티아가테르(Thygater), 티레오멜렉타(Thyreomelecta), 티레우스(Thyreus), 토로멜리사(Toromelissa), 트리코세라피스(Trichocerapis), 트리코트리고나(Trichotrigona), 트리고나(Trigona), 트리고니스카(Trigonisca), 트리고노페디아(Trigonopedia), 울루곰바키아(Ulugombakia), 제노글로사(Xenoglossa), 제로멜렉타(Xeromelecta), 자코스미아(Zacosmia), 아에탐모바테스(Aethammobates), 암모바테스(Ammobates), 바이아스테스(Biastes), 브라키노마다(Brachynomada), 카에노프로소피나(Caenoprosopina), 카에노프로소피스(Caenoprosopis), 키아스모그나투스(Chiasmognathus), 도에린지엘라(Doeringiella), 에페올루스(Epeolus), 헥세페올루스(Hexepeolus), 홀코파시테스(Holcopasites), 켈리타(Kelita), 멜라넴피스(Melanempis), 네올라라(Neolarra), 네오파시테스(Neopasites), 노마다(Nomada), 오디네롭시스(Odyneropsis), 오레오파시테스(Oreopasites), 파람모바토데스(Parammobatodes), 파라노마다(Paranomada), 파라시테스(Pasites), 슈데페올루스(Pseudepeolus), 리네페올루스(Rhinepeolus), 로게페올루스(Rhogepeolus), 로팔로렘마(Rhopalolemma), 슈미에데크넥티아(Schmiedeknectia), 스페코돕시스(Sphecodopsis), 스피노파시테스(Spinopasites), 탈레스트리아(Thalestria), 타운센디엘라(Townsendiella), 트리에페올루스(Triepeolus), 트리오파시테스(Triopasites), 알로다페(Allodape), 알로다풀라(Allodapula), 브라운사피스(Braunsapis), 크레아티나(Creatina), 콤프소멜리사(Compsomelissa), 에프락타피스(Effractapis), 유콘딜롭스(Eucondylops), 엑소뉴라(Exoneura), 엑소뉴를라(Exoneurlla), 엑소뉴리디아(Exoneuridia), 마크로갈레아(Macrogalea), 마누엘리아(Manuelia), 나수타피스(Nasutapis) 또는 자일로코파(Xylocopa) 속에 속하는 것이다. 바람직하게 절지동물은 벌 또는 호박벌, 구체적으로 봄버스 속에 속하는 호박벌, 예컨대 비. 테레스트리스(B. terrestris), 비. 이그니투스(B. ignitus), 비. 다이베르수스(B. diversus), 비. 옥시덴탈리스(B. occidentalis)와, 관련 종들 및 아종들이다. 특정 구현예에서, 절지동물은 비 테레스트리스; 예컨대 비. 테레스트리스 아프리카누스(B. terrestris africanus), 비. 테레스트리스 오닥스(B. terrestris audax), 비. 테레스트리스 칼라브리쿠스(B. terrestris calabricus), 비. 테레스트리스 카나리엔시스(B. terrestris canariensis), 비. 테레스트리스 달마티누스(B. terrestris dalmatinus), 비. 테레스트리스 루시타니쿠스(B. terrestris lusitanicus), 비. 테레스트리스 사사리쿠스(B. terrestris sassaricus), 비. 테레스트리스 테레스트리스(B. terrestris terrestris) 및 비. 테레스트리스 잔토푸스(B. terrestris xanthopus)이다. 다른 구현예에서, 상기 절지동물은 당 업자에게 공지된 바와 같이 해충, 예컨대 포식성 진드기, 기생 말벌 또는 포식성 곤충, 예컨대 무당벌레, 물결넓적꽃등에, 풀잠자리 또는 노린재류 벌레의 생물학적 구제를 위한 생물학적 구제용 제제이다.

본원에는 절지동물에게 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질을 제공하는 단계를 포함하는, 절지동물을 사육하고/사육하거나 절지동물의 건강, 행동 및/또는 적응도를 개선하기 위한 방법이 제공된다. 본원에는 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질의, 절지동물 사육 또는 상기 절지동물의 건강, 행동 및/또는 적응도를 개선하기 위한 용도도 제공된다.

효모의 이름이 함축할 수 있는 바와는 대조적으로, 효모 종 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)는 야생 호박벌에는 매우 드물게 존재한다. Brysch-Herzberg는, 43마리의 여왕벌과 92마리의 일벌뿐만 아니라, 9개의 하니팟(honey pot), 그리고 수백개의 꽃과 화밀 시료를 분석함으로써 식물-호박벌 간 상리공생에 관여하는 효모 공동체를 대상으로 광범위한 연구를 수행하였다(FEMS Microbiology Ecology 50 (2004) 87-100). 임의의 효모, 예컨대 메츠니코비아 류코피이(Metschnikowia reukaufii)가 분석 대상인 다수의 호박벌 시료에서 발견되었던 반면에, 씨. 봄비필라 효모는 호박벌의 꿀로부터 한번 또는 두 번만 단리되었을 뿐이다. 이처럼 매우 희박한 연계성은 효모 종 명명의 근간이 되었다. 결과적으로 저자는 이의 생태학으로부터 어떠한 결론도 도출될 수 없었다고 주장하였다. 전세계적으로 광범위하게 행하여진 연구들은 호박벌로부터 칸디다 봄비필라를 단리해낼 수 없었던 것으로 보아, 효모 종은 호박벌의 "입틀(tongue)"에 서식할 수 있으며, 결과적으로 화밀에 군락을 형성할 수 있다는 증거는 아직까지 존재하지 않는다. 뿐만 아니라 특히 실험 1에 상세히 기술된 바와 같이 본 발명자들은 더블유. 봄비필라/씨. 봄비필라는 몇몇 회사에 의해 상업적으로 사육된 호박벌에 아예 존재하지 않으며, 더블유. 봄비필라/씨. 봄비필라는 효모가 접종된 어미, 즉 여왕벌로부터 서식지 동료개체(nestmate)에 가끔씩 전달될 뿐임을 보였다. 상기 더블유. 봄비필라/씨. 봄비필라와 호박벌 또는 임의의 다른 절지동물들 사이의 매우 미미한 연계성으로 보았을 때, 절지동물, 특히 호박벌에 칸디다 봄비필라가 제공될 경우 상기 절지동물의 건강, 행동 및/또는 적응도가 개선된다는 발견은 매우 놀라운 것이다. 특정 구현예에서, 본원에서 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모는 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 균주 MUCL 56142이다(이하에 더욱 상세히 기술됨). 본원에 사용된 바와 같이 절지동물을 사육하는 내용과 관련하여 "사육"이란 용어는, 광범위하게는 절지동물의 번식에서부터 절지동물의 성장, 발달, 유지 및 생식을 지지하는 것을 지칭한다. 당업자는, 절지동물이 상이하다면 이에 따라 사육 방법이 상이할 것임을 이해할 것이다. 적합한 사육 방법 또는 유지 방법은 당 업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 호박벌(예컨대 비. 테레스트리스)은 어두운 양봉 상자(nest box) 내에서 표준 기후 조건(28℃ 및 상대습도 60%)에 방치될 수 있으며, 먹이는 통상적으로 자유급식으로 공급된다.

청구된 방법의 내용에서 사용된 바와 같은 "~에게 제공하는 것" 또는 "~에게 ~를 제공하는 것"이란 용어는 광범위하게, 예를 들어 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질을 먹이 원 또는 먹이의 일부로서 공급하여 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질을 절지동물이 이용가능하도록 만드는 것을 지칭한다. 더욱 구체적으로 본 발명은 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질을 절지동물에게 적극적으로 공급하는 단계를 수반하는 방법을 제공한다. 이는, 통상적으로 1 마이크로리터당 적어도 약 100개의 세포로부터 1 마이크로리터당 최대 60000개의 세포, 또는 이와 동등한 양만큼의 효모 단편 또는 효모로부터 유래하는 생성물을 포함하는 조성물이 절지동물에 제공됨을 암시한다. 통상적으로 공급 용액 중 조성물의 효모 세포 수는 저절로 증가할 것이다. 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질을 절지동물에 공급하는 것은, 이것들이 절지동물, 구체적으로 절지동물 장으로 운반되는 것을 허용한다. 더욱 구체적으로 본 발명자들은, 위커하미엘라 효모의 효과는 생세포에 의해 보장될 수 있을뿐만 아니라 비활성화 또는 사멸 세포, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질에 의해서도 보장될 수 있음을 발견하였다. 실제로, 위커하미엘라 효모가 배양되었던 배지는 효모 세포가 이 배지로부터 제거되었을 때조차도 여전히 절지동물에 대해 원하는 효과를 보장할 수 있음이 발견되었다. 따라서 해당 효과는 위커하미엘라 효모를 (생세포 또는 사멸 세포로서) 직접적인 방식으로, 또는 (이 효모 세포가 배양되었던 배지 (그리고 효모 세포가 추후 제거되었던 배지)를 통해) 간접적 방식으로 제공함으로써 보장될 수 있다. 특정 구현예에서, 효모 세포는 여과, 예컨대 공극 직경이 0.45 μm 이하, 예컨대 0.3 μm 또는 0.25 μm 이하인 필터를 사용하는 여과에 의해 배지로부터 제거될 수 있다. 그러므로 특정 구현예에서, 본원에 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질은 생세포로서, 사멸한 세포로서, 아니면 상기 위커하미엘라 효모가 접종되어 배양되었고, 상기 효모의 생세포, 또는 상기 효모의 사멸한 세포를 포함하거나, 또는 효모 세포가 접종되었던 성장 배지의 항온처리가 마쳐진 후 효모의 (생 또는 비활성) 세포가 제거되었던 성장 배지를 포함하는 조성물을 통해 절지동물에게 제공된다. 그러므로 이러한 배지는 간단하게 성장 배지 중에서 위커하미엘라 효모를 배양하고, 선택적으로는, 예컨대 공극 직경이 0.45 μm 이하, 예컨대 0.3 μm 또는 0.25 μm 이하인 필터를 사용하는 여과에 의해 이 성장 배지로부터 효모 세포를 제거함으로써 제조될 수 있다. 더욱 구체적으로 특정 구현예에서, 본원에서 구상되는 방법은 본원에 개시된 바와 같이 위커하미엘라 효모에 의해 생산되는 물질 및/또는 이 위커하미엘라 효모의 단편을 포함하는 성장 배지를 수득하는 단계 및 이 성장 배지를 절지동물에 제공하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에서 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질은 하기 추가로 논의되는 바와 같은 먹이 조성물의 형태로 제공된다. 특정 구현예에서, 하기 추가로 상세히 기술된 바와 같은 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질은 절지동물에 제공된다. 대안적으로 효모, 효모 단편 또는 효모 물질은, 이것들을 절지동물이 있는 환경에 넣어주어, 절지동물과 이것들의 직접적인 접촉을 보장함으로써 절지동물에 제공될 수 있다.

"위커하미엘라 효모", 구체적으로 "위커하미엘라 봄비필라"("칸디다 봄비필라")란 용어는, 그 자체로서 언급되거나 절지동물에 이 효모를 제공하는 내용에 사용된다고 언급될 때, 상기 효모의 효모 생세포, 또는 비활성화, 사멸 효모 세포를 지칭한다. 바람직하게 세포는 효모 생세포이다.

효모가 언급될 때 본원에 사용된 바와 같은 "단편"이란 용어는, 효모 세포로부터 유래하는 임의의 구성성분을 지칭한다. 이러한 단편의 비제한적 예들로서는 핵산, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 세포벽 또는 세포벽의 일부 또는 세포내 소기관이 있다. 이러한 단편은 추출물, 균질물 또는 단리된 구성성분으로서 제공될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "효모에 의해 생산된 물질"이란 용어는, 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)와 같은 효모 세포에서 발견되고/발견되거나, 이러한 효모 세포에 의해 생산되는 대사물질 및 기타 인자, 예컨대 효소를 지칭한다. 예를 들어 효모의 대사체 데이터베이스는, 효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerivisae)에 의해 생산된 대사물질을 기술하고 있다. 유사하게, 사카로마이세스 이외의 효모는 펙티나아제, 프로테아제, 글루카나아제, 리케나아제, β-글루코시다아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 아밀라아제, 설파이트 리덕타아제 및 리파아제와 같은 효소를 생산하는 것으로 보인다(Jolly et al, 2006, S. Afr. J. EnoLVitie., VoL 27, No.1: 15-39). 유사한 대사물질 및/또는 효소가 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)에 대해 동정될 수 있다. 이들 대사물질은 발효 동안에 생산될 수 있다. 대사물질에 관한 비제한적 예들로서는 지질, 스테롤, 비타민, 아미노산, 펩티드, 유기산, 당, 당단백 또는 이의 유도체, 유기 에스테르, 고급 알데히드 및 알코올, 이웃자리 디케톤(vicinal diketone; VDK), 휘발성 황을 포함한다. 특정 구현예에서, 대사물질은 당단백이다. 추가의 특정 구현예에서, 대사물질은 다른 효모 균주 및/또는 속에 독성이라는 점에서 "살해 인자(killer factor)"이다. 특정 구현예에서, 대사물질은 상청액 또는 추출물로서 제공된다. 추가의 구현예에서, 대사물질은 단리된 대사물질이다. 바람직하게 구상되는 바와 같은 효모에 의해 생산된 물질 및/또는 본원에 구상되는 바와 같은 효모의 단편은 위커하미엘라 효모가 배양되었던 성장 배지로서 제공될 수 있다. 상기 상세히 기술된 바와 같이, 이러한 배지는 본원에 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 효모가 적합한 성장 배지에서 성장하는 것을 허용한 후, 선택적으로 효모 생세포를 비활성화한 다음에, 이 효모 세포를 상기 성장 배지로부터, 예컨대 여과, 예컨대 공극 직경이 0.45 μm 이하, 예컨대 0.3 μm 또는 0.25 μm 이하인 필터를 사용하는 여과에 의해 제거함으로써 수득 가능하다. 이론에 의해 국한되기를 바라지 않을 때, 이러한 방법으로 위커하미엘라 효모 대사물질 및/또는 효모 단편을 포함하되 위커하미엘라 효모 세포는 포함하지 않는 배지가 수득된다. 성장 배지로부터 효모 세포를 제거하는데 유용한 필터는 당 분야에 공지되어 있다.

임의의 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 본원에 구상되는 바와 같은 먹이 조성물 중에 포함되는 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 바람직하게 칸디다 봄비필라 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질을 절지동물에게 제공함으로써 절지동물의 건강, 적응도 및/또는 행동을 개선하기 위한 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 절지동물은 수분매개 곤충 및/또는 군락 형성 곤충, 더욱더 바람직하게는 벌 또는 호박벌이다. 이론에 국한되지 않을 때, 효모는 임의의 구성성분, 예컨대 분해 생성물 및/또는 대사물질 또는 물질, 예컨대 비타민, 스테롤, 또는 필수 아미노산을 효모의 절지동물 숙주에게 제공할 수 있으며, 이로써 절지동물의 건강, 적응도 및/또는 행동이 개선될 수 있는 것으로 생각된다.

방법에 대한 내용에서 본원에 사용된 바와 같은 "건강 개선"이란 용어는, 절지동물의 전반적인 웰빙(well-being)을 증가시키는 것을 지칭한다. 절지동물의 건강은 조합하여 작용하거나 별도로 작용하는 몇 가지 인자들에 의해 영향받을 수 있다. 이러한 인자로서는 집약적인 농사 및 살충제 사용, 가뭄, 영양실조, 바이러스, 병원체 및 내부 또는 외부 기생체에 의한 공격, 그리고 환경 변화의 영향들을 포함한다. 가장 흔하게, 감소한 건강은 또한 부정적인 방식으로 절지동물의 행동에 영향을 미친다. 절지동물의 건강은 다른 무엇보다도 크기, 중량, 수명, 생식의 산출(reproductive output), 그리고 병원체 및 기생체에 의한 감염에 대한 저항성에 의해 평가될 수 있다. 구체적으로 절지동물, 특히 벌은 장내 기생체, 예컨대 노세마 봄비(Nosema bombi) 또는 크리티디아 종(Crithidia spp)에 특히 민감한 것으로 보인다. 특정 구현예에서, 선택적으로 본원에서 구상되는 먹이 조성물 중에 포함되는, 본원에서 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질이 사용되면, 절지동물의 면역 기능이 개선되고, 장내 기생체 수가 감소한다. 이론에 국한되지 않을 때, 기생체 및 병원성 세균 및 기타 진균이 효모에 미치는 영향은 경쟁 과정과 선착순 효과(priority effect)로 말미암을 수 있는데; pH 변화, 제일 처음에 도달한 유기체(즉 효모)에 의해 생산 및 대사되는 탄소원과 질소원은 환경을 후순위로 도달한 유기체에 적합하지 않도록 만든다. 추가로 또는 대안적으로, 몇몇 효모 종은 "살해 인자", 즉 공존하는 특정의 표적들에 대해서는 독성인 단백질을 생산하는 것으로 공지되어 있다.

그러므로, 본 발명은 또한 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 바람직하게 칸디다 봄비필라 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질(선택적으로는 본원에서 구상되는 먹이 조성물 중에 포함됨)을 절지동물에게 제공함으로써 이 절지동물의 면역 기능을 개선하는 방법에 관한 것이기도 하다. 바람직하게 상기 절지동물은 군락 형성 절지동물, 더욱 바람직하게 수분매개 곤충, 더욱더 바람직하게 벌, 가장 바람직하게는 봄버스 속 벌이다. 유리하게 절지동물의 면역 기능을 개선하는 상기 방법은 절지동물의 장내 기생체 감소, 구체적으로는 크리티디아 봄비의 감소를 초래한다.

유기체 또는 유기체 군이 언급될 때 본원에 사용된 바와 같은 "적응도"란 용어는, 유기체 또는 유기체 군(예컨대 군락 또는 집단)이 자신들이 발견되는 환경에서 생존하고 생식하는 능력을 지칭하는 것으로 의도된다. 이와 같은 생존 및 생식의 산출로서, 유기체 또는 유기체 군은 유전자를 다음 세대에 넘겨준다(Orr, Nature Reviews. Genetics,　10 (2009) 531-539). 적응도는 생존 자손을 생산하는 능력에 기여하는 여러가지 상이한 "적응도 구성요소"를 포함한다. 즉 "적응도"는 또한 생존능/수명 매개변수를 포함하는데, 이는 전반적인 건강 및 병원체에 대한 저항성과 연관될 뿐만 아니라, 교미 성공율 및 산란수(매일 산란수/생애 산란수)와도 연관된다. 군락 형성 종, 예컨대 비. 테레스트리스에 있어서, 실현되는 어미 여왕벌의 산란수는 군락내에 존재하는 개체들의 수를 통해 분명해질 것이다. 적응도란 용어는, 물리적 또는 생물학적 적응도를 지칭할 수 있는데, 보통 상기 두 가지는 서로 연관되어 있다. 물리적 적응도는 어떠한 활동, 예컨대 비행을 수행하는 물리적 능력으로서, 활동 수준을 평가함으로써 평가될 수 있는 반면에, 생물학적 적응도는 생식의 산출, 더욱 구체적으로 어떤 유기체가 특정의 환경에서 자손을 생산할 수 있는 정도이다. 물리적 적응도 및 생물학적 적응도 둘 다는 상기 명시된 바와 같은 군락 발달 및/또는 군락 발달 매개변수를 평가함으로써 평가될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한, 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 바람직하게 칸디다 봄비필라 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질(선택적으로 본원에서 구상되는 먹이 조성물 중에 포함됨)을 절지동물에게 제공함으로써, 절지동물의 생물학적 적응도, 물리적 적응도, 아니면 생물학적 적응도와 물리적 적응도 둘다를 개선하는 방법에 관한 것이기도 하다. 바람직하게 상기 절지동물은 군락 형성 절지동물, 더욱 바람직하게 수분매개 곤충, 더욱더 바람직하게 벌, 가장 바람직하게 봄버스 속 벌이다.

본 발명의 임의의 구현예는 본원에 제공된 바와 같은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 바람직하게 칸디다 봄비필라 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질(선택적으로 본원에 기술된 먹이 조성물 중에 포함됨)을 절지동물에게 제공함으로써, 이 절지동물, 구체적으로 수분매개 곤충의 행동 또는 활동을 개선하는 방법에 관한 것이다. 절지동물, 구체적으로 수분매개 곤충의 행동은 절지동물 또는 수분매개 곤충에 의해 수행되는 통상의 활동에서 분명해진다. 이러한 활동은 상이한 종류의 수분매개 곤충에 대해서, 그리고 군락 형성 곤충인지 아니면 단독 수분매개 곤충(solitary pollinating insect)인지에 따라 상이하다. 예를 들어 중심지 먹이찾기개체들은 자신들의 공동서식지/집을 떠나서 먹이를 찾으러 가고, 먹이 찾는데에 성공하면 되돌아온다. 그러므로 군락을 떠나거나 되돌아오는 "왕래활동"은 수분매개 곤충의 일반적인 행동 또는 활동에 대한 척도로서 사용될 수 있다. 대안적으로 비행 행동 및 먹이찾기의 성공은 수분매개 (비행) 곤충의 적응도에 대한 척도로서 사용될 수 있으며, 만일 수분매개 곤충이 군락 형성 곤충이라면, 군락의 적응도를 연구하는데 사용될 수 있다. 적응 군락(fit colony)은 먹이를 구하기 위해 다수 회 비행하는 다수의 수분매개 곤충에 의해 특징지어진다. 비행 활동 및 화분/화밀 수집의 증가는 또한 개화하는 작물의 더욱 집약적이고 더욱 효율적인 수분을 초래할 것이다. 군락 형성 및/또는 수분매개 곤충의 행동 및 적응도를 평가하기 위하여 연구될 수 있는 다른 활동의 비제한적 예들로서는 페로몬에 대한 반응, 온도 반응, 분봉 행동, 달라기 행동(running behavior), 교미 행동 및/또는 횟수, 그루밍(grooming) 및/또는 위생상의 행동, 먹이 저장 행동, 보초 행동 및 표류 행동(drifting behavior)이 있다.

특정 구현예에서, 상기 행동 또는 활동을 개선하는 방법은 수분매개 곤충, 바람직하게 벌, 더욱 바람직하게 호박벌, 더욱더 바람직하게 봄버스 속 벌, 구체적으로 비. 테레스트리스의 비행 및 먹이찾기 활동을 개선하기 위한 방법이다. 본원에 사용된 바와 같은 "비행 활동"이란 용어는, 임의의 기간에 걸쳐 집에 들어갔다가 나오며 비행하는 수분매개 절지동물의 수 및/또는 수분매개 절지동물이 집에 들어갔다가 나오며 비행하는 횟수를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "먹이찾기 활동"이란 용어는, 먹이를 찾기 위한 비행을 하여 방문한 꽃의 수 및/또는 수집한 화분 또는 화밀의 양을 지칭한다.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 절지동물은 군락 형성 절지동물이고, 상기 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라), 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질(이하 추가로 상세히 기술된 바와 같이 선택적으로 먹이 조성물 중에 포함되기도 함)은 군락 발달 및/또는 군락 발달 속도를 개선한다. 그러므로 특정 구현예에서, 본 발명은 군락 형성 절지동물, 구체적으로 수분매개 군락 형성 절지동물의 군락 발달 및/또는 군락 발달 속도를 개선하기 위한 방법으로서, 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질을 절지동물에 제공하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것인데, 바람직하게 상기 효모는 본원에 논의된 바와 같이 칸디다 봄비필라 효모 균주 MUCL 56142이고, 상기 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모는 선택적으로 본원에서 구상되는 바와 같이 먹이 조성물 중에 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "군락 발달"이란 용어는, 함께 서식하는 공동서식지에서 함께 살고/살거나 성장하는 동일 종 절지동물의 구체적인 군, 바람직하게 완전 사회성 절지동물의 발전(advancement)을 지칭한다. 더욱 구체적으로 군락 형성 절지동물의 군락은 브러드를 함께 돌보고, 성체 군락 내 중복되는 세대들이 존재하며, 생식능이 있는 군 및 생식능이 없는 군 사이에 분업/분장이 이루어지는, 고도로 조직화된 동물 사회이다. 임의의 절지동물 군락들에는 알과 유충을 돌보고 먹이를 찾으며/찾거나 군락을 보호하는 다수의 일벌과, 자손을 생산하는 여왕벌 한 마리 또는 번식용 암컷 한 마리가 존재한다. 예를 들어 벌 또는 호박벌 군락은 수정란을 집에 낳는 어미 여왕벌에 의해 처음 형성된다. 여왕벌은, 다음 세대 자손 군에게 먹이를 먹이고 먹이찾기를 관리하는 일벌로 발달하게 될 수정란을 낳음으로써 군락을 형성하기 시작한다. 군락이 점점 더 크게 커짐에 따라 수컷 벌/호박벌과 새로운 여왕벌이 또 태어난다. "군락 발달 속도"란 용어는, 군락 발달이 진행되는 속도를 지칭한다. 통상적으로 본원에 사용된 바와 같은 "속도"란 용어는, 바람직하게 시간 단위로 변하는 변화의 속도를 지칭한다.

군락 발달 및/또는 군락 발달 속도는 당업자에게 공지된 상이한 매개변수에 의해 평가될 수 있다. 군락 크기와 관련된 모든 매개변수, 즉 에그 컵(egg cup), 유충, 번데기, 일벌 및 이성의 개체(수컷 및 여왕벌)의 수를 비롯하여 유성생식 시 군락 크기를 평가하는 것과 같이, 예를 들어 처음 알을 산란하는 시간, 알에서 성체로의 발달 지속기간, 또는 임의의 시간 간격을 둔 개체의 수가 평가될 수 있다. 시간 간격 또는 유성생식 시간은 군락 형성 절지동물의 종류별 발달 기간에 따라서 상이할 것이다. 일벌이 될 개체 수, 군락 크기 및/또는 브러드의 임의의 시간 프레임 내에서의 증가 및/또는 기준값에 비한 증가는 개선된 콜로니 발달의 지표가 된다. 바람직하게 상기 기준값은 동일한 처리가 되지 않은(즉 본 발명에 따른 방법에 따라서 사육되지 않았거나, 본원에 기술된 바와 같은 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질이 공급되지 않은) 절지동물 군락에 대해 수득된 값이다. 임의의 구현예에서, 본 발명은 절지동물에게 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질(선택적으로 본 발명에 따른 먹이 조성물 중에 포함됨)을 제공함으로써, 이 절지동물 군락 중 일벌로 예측되는 개체의 수, 브러드 및/또는 군락 크기를 (기준 군락 중 일벌로 예측되는 개체의 수, 브러드 및/또는 군락 크기에 비해) 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직하게 상기 절지동물은 군락 형성 절지동물, 더욱 바람직하게 수분매개 곤충, 더욱더 바람직하게 벌, 가장 바람직하게 봄버스 속 벌이다.

본 출원은 본원에 기술된 바와 같은 효모 물질을 절지동물에게 제공하는 단계를 수반하는 농업상의 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 유익한 절지동물을 사용하는 것을 수반하는 임의의 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 1가지 이상의 절지동물에 의한 수분 및/또는 생물학적 해충 구제를 수반하는, 작물을 재배하는 방법이다.

개화하는 결과성 작물의 수분은 대부분 수분매개 곤충에 의존하므로, 당업자는, 보다 적은 수의 수분매개 곤충, 또는 덜 활동적이거나 덜 적응성인/덜 건강한 수분매개 곤충이 존재하면 곤충이 수분을 매개하였던 작물의 수분에 부정적인 영향이 미치고, 이로 말미암아 수분된 꽃의 수가 감소하며, 이는 수확될 수 있는 열매 수의 감소로 이어짐을 이해한다. 그러므로 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 바람직하게 칸디다 봄비필라 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질(선택적으로 본원에서 구상되는 먹이 조성물 중에 포함됨)이 절지동물, 구체적으로 수분매개 곤충에 제공되고, 이로써 수분매개 곤충의 건강 및/또는 적응도 및/또는 행동이 증가하며/증가하거나 (선택적으로) 군락 발달이 증가하게 되면, 결과성 작물의 수확량은 증가할 수 있다. 따라서 본 발명은 결과성 작물을 재배하기 위한 방법을 추가로 제공하는데, 이때 개화하는 작물이 제공되고, 이 개화하는 작물은 절지동물에 의해 수분되며, 이 절지동물은 본 발명에 따라서 사육되거나, 또는 상기 절지동물에는 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 바람직하게 칸디다 봄비필라 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질(선택적으로 본원에서 구상되는 먹이 조성물 중에 포함됨)이 제공된다. 바람직하게 상기 절지동물은 군락 형성 절지동물, 더욱 바람직하게 수분매개 곤충, 더욱더 바람직하게 벌, 가장 바람직하게 봄버스 속의 벌이다.

특정 구현예에서, 작물의 재배는 1가지 이상의 절지동물에 의한 생물학적 해충 구제를 수반한다. 생물학적 구제가 절지동물의 존재에 달려있는 경우, 당 업자는, 더 적은 수의 포식성 절지동물, 또는 덜 활동적이거나 덜 적응성인/덜 건강한 포식성 절지동물은 생물학적 해충 구제에 부정적인 영향을 미치는 것을 이해한다. 그러므로 본 발명은 결과성 작물을 재배하기 위한 방법을 추가로 제공하는데, 여기서 절지동물은 생물학적 해충 구제를 보장하는데 사용되고, 상기 절지동물은 본 발명의 방법에 따라서 사육된다.

본원에 사용된 바와 같은 "작물"이라는 용어는, 이익 또는 생존을 위해 생육 및 재배되는 식물 또는 농산물 모두를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은"결과성 작물"이란 용어는, 다년생의 식용 작물로서, 식용 생산물은 식물학상 참과(true fruit)이거나 이로부터 유래되는 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 "개화하는 작물"이란 용어는, 꽃이 피는 작물, 더욱 구체적으로 수정이 가능하기 위해서는 수분을 필요로 하는 작물을 지칭한다. 비제한적 예들로서는 사과, 배, 마르멜로, 마가목, 비파, 체리, 자두, 살구, 아몬드, 복숭아, 딸기, 라즈베리, 보리수나무, 산자나무, 유럽 호두나무, 피칸, 헤이즐넛, 피스타치오, 올리브, 감, 무화과, 뽕, 석류, 페이조아, 탄제린귤, 오렌지, 레몬, 포도, 시트론, 커런트, 구스베리, 유럽 헤이즐, 다래나무, 오미자, 인동, 불두화, 매자나무, 아보카도, 대추야자, 망고, 빵나무, 파파야, 바나나, 토마토, 후추, 멜론, 오이, 호박(squash), 콩 및 목화 등이 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "수분하다" 또는 "수분"이라는 용어는, 화분이 식물의 암 생식기관에 운반되어, 수정이 일어나게 할 수 있는 과정을 지칭한다. 수분 과정을 성공시키기 위해서, 다른 꽃의 수 부분(male part)에 의해 생산된 화분 알맹이는 암술머리, 즉 동일 종 식물 꽃의 암 부분(female part)에 운반되어야 한다. 본원에 언급된 바와 같은 수분은, 바람직하게 타화 수분(cross-pollination)인데, 즉 하나의 식물에 핀 어떤 꽃으로부터 유래한 화분은 동일 종의 또다른 식물에 핀 꽃의 암술머리에 수분매개 곤충에 의해 운반된다.

특정 구현예에서, 본 출원은 절지동물을 직접 수반하는 방법, 예컨대 해충 구제 방법 또는 꿀 생산 방법에 관한 것이다. 실제로 당 업자는, 본원에 언급된 바와 같은 절지동물이 꿀벌일 때, 꿀벌을 사육하기 위한 방법 및/또는 꿀벌의 건강, 적응도, 행동 및/또는 활동을 개선하기 위한(예컨대 본원에 기술된 비행 활동을 증가시키기 위한) 방법은 화밀 수집량의 증가를 초래할 것이고, 결과적으로는 꿀 생산량의 증가를 초래할 것임을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명은 또한 본원에서 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 바람직하게 칸디다 봄비필라 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질(선택적으로 본원에서 구상되는 바와 같은 먹이 조성물 중에 포함됨)을 꿀벌에 제공함으로써 꿀을 생산하기 위한 방법에 관한 것이기도 하다. 추가의 구현예에서, 본 출원은, 포식성 절지동물, 예컨대 진드기에 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질을 제공함에 의한 생물학적 해충 구제 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 절지동물에는 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질이 자유급식형태로 제공된다. 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질(선택적으로 이하에 추가로 기술된 바와 같은 먹이 조성물 중에 포함됨)은, 절지동물 공동서식지/집 또는 절지동물의 천연 먹이 원에 가까이(예컨대 내부 또는 외부와 멀지 않은 곳)에 두어, 절지동물이 자유롭게 접근할 수 있도록 할 수 있다. 집은 자연상의 것이거나 인공적인 것일 수 있고, 절지동물은 군락 형성 절지동물이며, 집은 통상 절지동물 여러 세대를 수용한다.

절지동물에게 본원에서 구상되는 바아 같은 효모를 제공하기 위한 방법으로서 용이하고도 바람직한 방법은, 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모를 포함하는 먹이 조성물을 통한 방법이다. 그러므로 본 발명은, 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모, 바람직하게 칸디다 봄비필라 균주 MUCL 56142, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질을 포함하는 절지동물용 먹이 또는 사료 조성물을 추가로 제공한다.

"사료 조성물"이라고도 지칭되는, 본원에 사용되는 바와 같은"먹이 조성물"이란 용어는, 일반적으로 유기체에 해를 입히지 않고 유기체에 의해 섭식될 수 있는 요소들의 조합을 지칭한다. 바람직하게 상기 요소의 적어도 일부는 유기체, 구체적으로 절지동물에 의해 섭식되어 동화됨으로써 에너지를 발생시키고, 성장을 촉진하며/촉진하거나 생명을 유지시킬 수 있는 필수 및/또는 불필수 영양소이다. 더욱더 바람직하게 상기 먹이 조성물은 인공적으로 생산된다.

임의의 구현예에서, 본원에서 구상되는 바와 같은 먹이 조성물은 본원에 추가로 논의되어 있는 바와 같은 위커하미엘라 효모 물질, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(또는 칸디다 봄비필라) 효모 물질, 바람직하게 칸디다 봄비필라 효모 균주(승인 번호 MUCL 56142로 기탁)를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에서 구상되는 바와 같은 절지동물용 먹이 조성물은 (i) 상기 위커하미엘라 효모의 생세포; (ii) 상기 위커하미엘라 효모의 사멸한 세포; 또는 (iii) 상기 위커하미엘라 효모를 처음 접종하여 항온처리한 후 (선택적으로 효모 세포를 비활성화시킨 후) 이 효모 세포를 제거한 성장 배지의 군으로부터 선택되는 효모 물질을 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 먹이 조성물은 먹이 조성물 1 mg 또는 1 ml당 10²개 내지 10⁸개, 바람직하게 10⁴개 내지 10⁵개의 효모 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 먹이 조성물은 본원에서 구상되는 바와 같은 효모 물질을 1 ml당 10²개 내지 10⁸개, 바람직하게 10⁴개 내지 10⁵개 효모 세포만큼 포함하는 액체 먹이 조성물이다. 특정 구현예에서, 위커하미엘라 효모 세포, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(또는 칸디다 봄비필라) 효모 세포는 먹이 조성물 중에 살아있다. 특정 구현예에서, 조성물 중 효모 세포의 수는 조성물이 절지동물에 제공되는 기간이 경과함에 따라 저절로 증가한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 바와 같은 먹이 조성물을 1일 내지 30일의 기간, 예컨대 5일 내지 20일, 예컨대 7일 동안 절지동물에 공급하는 단계를 수반한다. 상기 기간 이내에 먹이 조성물 중 효모 세포의 농도는 증가할 수 있다. 예를 들어 특정 구현예에서, 먹이 조성물은 효모 세포를 1 마이크로리터당 100개 포함하고, 7일 안에 이 세포는 1 마이크로리터당 60000개까지 증가하게 된다. 칸디다 봄비필라는 효모로서, 당 업자에게 공지된 효모 번식을 위한 임의의 방법에 따라 번식될 수 있다. 예를 들어 효모 세포는 약 24℃에서 24 시간 내지 48 시간 동안 진탕 플랫폼(예컨대 80 rpm ~ 100 rpm) 상에 놓여 액체 성장 배지, 예컨대 효모 맥아 원액, 바람직하게는 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 글루코스 및 아가를 포함하는 효모 맥아 원액 중에서 생육될 수 있다. 액체 배지, 예컨대 액체 성장 배지 중 효모 세포의 농도는 표준 기술, 예컨대 분광광도계를 사용하여 효모 세포를 함유하는 용액의 광학 밀도를 산정하거나, 염색된 세포의 세포 개수를 혈구계산기 내에서 측정(현미경 배율: 40배)함으로써(예를 들어 메틸렌 블루가 사용되면 세포의 생존여부의 분간이 허용될 것임) 측정될 수 있다.

임의의 구현예에서, 먹이 조성물은 적어도 하나의 탄수화물 원을 포함한다. 탄수화물은 다수 절지동물 공급먹이의 필수 부분을 이룬다. 탄수화물은 주로 근육 활동을 위한 에너지, 체열 및 임의의 장기 및 선의 생체유지 기능을 생산 및 발휘하는데 사용된다. 뿐만 아니라, 탄수화물, 예컨대 당은 절지동물의 먹이섭취 자극제로서 작용할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 탄수화물 원은 효모의 성장 기질로서 작용을 할 수 있다. 그러므로 특정 구현예에서, 먹이 조성물은 탄수화물 원으로서 당 또는 당 알코올을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 먹이 조성물은 탄수화물 원으로서 화밀, 꿀 또는 이의 대체물을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "당"이란 용어는, 가용성 탄수화물, 예컨대 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 수크로스, 말토스, 락토스, 갈락토스, 만노스, 라피노스, 덱스트린, 이눌린, 람노스, 자일로스, 아라비노스, 트레할로스 또는 멜레지토스, 및 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 수크로스, 말토스, 락토스, 갈락토스, 만노스, 라피노스, 덱스트린, 이눌린, 람노스, 자일로스, 아라비노스, 트레할로스 또는 멜레지토스를 함유하는 배합물/생산물, 예컨대 당밀, 사탕무우 당, 사탕수수 당 및 가수분해된 전분(이에 한정되는 것은 아님)을 지칭한다. 적합한 당 알코올은 솔비톨과 만니톨을 포함할 수 있었다. 특정 구현예에서, 먹이 조성물은 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 덱스트로스 또는 이것들의 조합을 포함한다. 예를 들어 총 당량의 20% 내지 70%는 수크로스이고, 총 당량의 5% 내지 50%는 글루코스이며, 총 당량의 5% 내지 50%는 프락토스이다. 효모 배양에 적합한 당은 글루코스, L-소르보스, D-리보스 및 만니톨, 그리고 당 알코올로서 글리세롤 및 글루시톨 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 관점에서 먹이 조성물은 부가적으로 또는 대안적으로 효모에 의해 분비되는 탄수화물, 예컨대 네오-케스토스, 6-케스토스 및 비푸르코스 및 만노트리오스(이에 한정되는 것은 아님)를 포함할 수 있음에 주목한다.

특정 구현예에서, 본원에서 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모를 포함하는 먹이 조성물은 액체, 바람직하게는 수성의 먹이 조성물이다. 바람직하게 본원에서 구상되는 바와 같은 먹이 조성물은 당 또는 당 알코올을 적어도 10 wt% 또는 적어도 20 wt% 포함하는 당 용액이다. 더욱 바람직하게, (액체) 먹이 조성물의 당 또는 당 알코올 농도는 20 wt%, 25 wt% 또는 30 wt% 내지 50 wt%, 60 wt% 또는 70 wt%의 범위이다. 당(들)의 양은 당 분야에 공지된 방법, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 또는 수크로스 당량을 Brix로 검출하는 굴절계에 의해 측정될 수 있다. 당은, 예를 들어 물, 우유 또는 과일 주스 중에 용해될 수 있으며, 바람직하게는 물에 용해될 수 있다. 임의의 구현예에서, 상기 먹이 조성물 중 영양소 적어도 80 wt% 또는 85 wt%, 더욱 바람직하게 적어도 90 wt% 또는 95 wt%, 예컨대 97 wt%, 98 wt%, 99wt% 또는 100 wt%는 본원에서 구상되는 바와 같이 당 또는 당 알코올이다. 추가의 특정 구현예에서, 당 물의 농도는 30%인데, 다만 당은 (건조 중량을 기준으로) 50% ~ 70% 수크로스, 10% ~ 20% 글루코스 및 10% ~ 20%의 프럭토스로 이루어져 있다. 더욱 구체적인 구현예에서 당 물 중 당은 건조 중량을 기준으로 66%의 수크로스, 16.6%의 글루코스 및 16.6%의 프럭토스로 이루어져 있다.

특정 구현예에서, 본원에서 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모를 포함하는 먹이 조성물은, 바람직하게 탄수화물 원 이외에도 질소 원을 포함한다. 적합한 질소 원은 화분 또는 이의 적합한 대체물, 아미노산 또는 단백질을 포함한다. 화분은 자연 발생된 것일 수 있거나, 또는 합성 공급 먹이는 단백질 원으로서의 역할을 하는 화분 대체물(예컨대 적어도 30% 또는 적어도 40%의 단백질 포함)로서 사용될 수 있다. 화분은 본원에서 구상되는 바와 같은 먹이 조성물의 특히 적합한 구성성분인데: 화분은 아미노산, 예컨대 아르기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린을 포함하고, 다수의 비타민, 무기질 및 지질을 함유한다. 화분 중, 예를 들어 대두 가루, 토룰라 효모 또는 양조 효모의 형태로 제공되는 단백질 함량은, 바람직하게 적어도 10%, 적어도 20%이다. 단백질은 또한, 예를 들어 대두 가루, 토룰라 효모 또는 양조 효모의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명자들은, 효모 세포가 화분이 포함되어 있거나 포함되어 있지않은 당 물을 포함하는 조성물 중에서 10일 넘게 생존할 수 있음을 발견하였다. 특정 구현예에서, 먹이 조성물은 화분과 당 물로 제조되었으며, 위커하미엘라, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)를 포함하는, 화분볼(pollen ball)이다. 특정 구현예에서, 화분볼은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)를 포함하는 5% ~ 20%, 바람직하게 10% 당 물로 제조된다. 추가의 특정 구현예에서, 당 물은 1 마이크로리터당 적어도 100개의 효모 세포를 함유한다.

선택적으로 다른 영양소, 예컨대 지질 또는 지방, 비타민 및/또는 무기질(이에 한정되는 것은 아님)도 또한 본원에서 구상되는 바와 같은 먹이 조성물 중에 존재할 수 있다. 비타민은 당 업자에게 공지된 임의의 비타민, 예컨대 비타민 B, 예컨대 티아민, 리보플라빈, 니코틴아미드(니아신, 니코틴산), 피리독신, 판토테네이트(판토텐산), 엽산 및/또는 바이오틴; 및/또는 비타민 C(아스코르브산), 및/또는 비타민 D 및/또는 비타민 E일 수 있다. 지질 또는 지방은 식이 지질, 예컨대 지방산, 스테롤 및 인지질일 수 있다. 지질은 에너지, 저장 지방 합성 및 세포막 기능발휘를 위해 사용될 수 있다. 무기질은 당 업자에게 공지된 임의의 식이 무기질, 예컨대 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 염소, 인, 철, 구리, 요오드, 망간, 코발트, 아연 및/또는 니켈(이에 한정되는 것은 아님)일 수 있다.

임의의 구현예에서, 영양소, 예컨대 탄수화물(예컨대 화밀, 꿀, 당), 단백질, 지질 또는 지방, 무기질, 비타민 및 물을 포함하는 먹이 조성물은 절지동물의 전반적인 영양 요구조건을 충족시킬 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 먹이 조성물은 충분히 영양가가 높고, 소화가 용이한 영양소의 복합 혼합물로서, 성장, 발달, 유지 및 생식을 뒷받침하기에 효과적인 비율과 양만큼의 영양소 복합 혼합물을 절지동물에게 제공하는데 사용될 수 있다. 그러므로 특정 구현예에서, 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모를 포함하는 먹이 조성물은 절지동물용 사료로서 사용되기에 특히 적절하다.

임의의 구현예에서, 본원에서 구상되는 바와 같은 먹이 조성물은 본원에서 구상되는 바와 같은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라) 효모 이외에도 다른 유기체를 포함할 수 있지만, 상기 효모가 주요 유기체인데, 이 말은 상기 효모가 가장 많은 양으로 존재한다는 것을 의미한다. 추가의 구현예에서, 먹이 조성물은 임의의 다른 유기체를 포함하지 않는다. 본원에 구상되는 바와 같은 먹이 조성물의 성분들은 당 업자에게 공지된 표준 방법에 따라서 혼합될 수 있다.

유리하게 특정 구현예에서, 본원에서 구상되는 바와 같은 먹이 조성물은 본원에서 구상되는 바와 같은 효모가 첨가되기 전에 유통기한을 늘리기 위하여 당 업자에게 공지되어 있고 당 업자에 의해 수행되는 바와 같이 멸균 또는 저온살균될 수 있거나, 아니면 본 먹이 조성물은 효모 생세포를 포함하는 것으로 구상되지 않고, 오히려 효모 단편이나 효모 세포로부터 유래하는 생성물을 포함하도록 구상된다. 이는, 예를 들어 살균 자외선 조사에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로나 추가로, 본 먹이 조성물은, 먹이 원 조성물의 부패를 막고, 자체의 유통기한을 늘리기 위해 적합한 보존제 또는 항미생물 제제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제 또는 항미생물 제제는, 바람직하게 먹이 조성물 중 효모에 유해하지 않은 것으로서, 당 분야에 공지되어 있는 것이다.

대안적 구현예에서, 본 먹이 조성물은 효모 생세포를 포함한다. 곤충의 장내에 생존하는 효모는 자신의 곤충 숙주에 분해 생성물, 비타민 B, 스테롤 또는 필수 아미노산을 제공하는 것으로 보인다(Jones 1984, Douglas 1998, Vega & Dowd 2005, Lee et al 2014). 따라서, 효모 세포에 의한 필수 대사물질의 생산은 곤충, 더욱 구체적으로 영양면에서 불량하거나 균형이 이루어지지 않는 기질, 예컨대 꽃의 화밀(Douglas 1989, Pozo et al 2014) 또는 화분(Roulston& Cane 2000)에 의존하는 절지동물에게 적응도에 관한 이점을 제공한다고 추측하는 것은 합리적이다. 그러므로 특정 구현예에서, 효모 세포는 천연 먹이 원을 소화시키는 것을 도울 수 있다. 실제로 여러 방면의 증거는, 화분 유래 영양소들이 신속하게 사용될 수 없어서, 몇몇 곤충은 갖 생성된 특정 유형의 미가공 화분을 소모할 수 없다고 말해준다. 더욱 구체적으로 꿀벌은 전분을 잘 소화하지 못해서, 전분 함량이 높은 유형의 화분을 소화하는데 어려움이 있는 것으로 공지되어 있다.

추가의 대안적 구현예에서, 본 먹이 조성물은 효모 생세포와 효모 사멸 세포, 그리고/또는 효모 세포로부터 유래하는 단편이나 생성물을 모두 포함한다.

본 먹이 조성물은 당 업자에게 공지된 임의의 형태의 먹이공급 장치에 의해 절지동물에 제공될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같은 먹이 조성물은 액체, 페이스트 또는 건조/분말 형태를 가질 수 있는데, 액체 형태인 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 본 먹이 조성물은 액체 먹이 조성물, 구체적으로 수성 먹이 조성물이다. 유리하게 액체 먹이 조성물은 용기 안에 담겨/담기거나 다공성 물체 또는 섬유상 물체, 예컨대 코튼볼(cotton ball) 또는 모세관 심지(capillary wick)에 적용된 후, 집 가까이 또는 양봉 상자 내부에 놓일 수 있으며, 모세관 작용을 통해 절지동물이 이용가능하게될 수 있다. 절지동물이 수분매개 곤충이면, 본 발명에 따른 먹이 조성물은 또한 개화 작물상에 제공, 즉 분사될 수 있다. 바람직하게 본 먹이 조성물은 실질적으로 무취의 것이거나, 만일 먹이 조성물이 냄새를 가진다 하더라도 그 냄새는 절지동물에게 악취로서 느껴진다든지 절지동물이 기피하는 냄새여서는 안된다.

본 출원은 본원에 기술된 바와 같이 절지동물을 기르기 위한 먹이 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 당 물 조성물에 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)를 접종하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)를 포함하는 당 물과 화분을 혼합하여, 이 효모의 농도를 1 μl당 적어도 100개 세포 또는 1 μg당 적어도 100개 세포, 또는 효모 단편 또는 효모에 의해 생산된 생성물 이와 동등한 양만큼으로 만드는 단계를 포함한다. 더욱 구체적으로 본 방법은 당 물 중에 농축 효모 접종물을 접종하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 당 물은 5% 내지 40%, 예컨대 10% 내지 30%를 차지한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 당 물과 화분을 혼합하여 화분볼을 만드는 단계를 추가로 포함한다. 본 방법의 추가 구현예는 본원에 기술된 바와 같은 먹이 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명자들은 봄버스 테레스트리스 일벌의 장으로부터 칸디다 봄비필라/위커하미엘라 봄비필라 특이 균주를 단리하였다. 유리하게, 본원에서 구상되는 바와 같은 효모의 이러한 특이 균주를 절지동물, 더욱 구체적으로 벌, 더욱더 구체적으로 비. 테레스트리스에게 제공하는 것은, 해당 절지동물의 군락 발달과 비행 활동에 괄목할만한 긍정적 효과를 보였다. 이와 같은 유익한 효과는 위커하미엘라 효모, 구체적으로 위커하미엘라 봄비필라(칸디다 봄비필라)를 전혀 투여받지 않은 절지동물에서는 보이지 않았다.

따라서, 본원은 칸디다 봄비필라/위커하미엘라 봄비필라 효모, 더욱 구체적으로 2016년 6월 21일자로 BCCM/MUCL(벨기에 1348 루뱅-라-뇌브 복스 L7.05.06 크로아 뒤 쉬드 2에 소재하는 루뱅 카톨릭대학교 벨기에 조합 미생물 수집소(BCCM), 루뱅 카톨릭대학교 균류수집소(MUCL))에 승인번호 MUCL 56142로 기탁된 칸디다 봄비필라/위커하미엘라 봄비필라 균주 균주 또는 이의 변이체나 유도물질을 추가로 제공한다(표 A 참조). 이들 균주 또는 이의 변이체나 유도물질은 이하에 추가로 기술된 바와 같이, 유리하게 절지동물, 바람직하게 수분매개 곤충을 사육하고/사육하거나 이 절지동물의 건강, 행동 및/또는 전반적인 적응도를 개선하는데 사용될 수 있다.

[표 A]

본원에 언급된 바와 같은 "변이체"란 용어는, 미생물 변이체, 예컨대 칸디다 봄비필라/위커하미엘라 봄비필라 MUCL 56142의 돌연변이, 삽입 및 결실 변이체뿐만 아니라, 전체 게놈 서열 동일성이 적어도 90%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 예를 들어 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9%인 미생물 변이체를 지칭한다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위하여 제공되는 것이지, 본 발명의 범위를 한정하는 의미를 결코 가지지 않으며, 그와 같이 해석되어서도 안될 것이다.

실시예

본 섹션에서 현재 위커하미엘라 봄비필라로 공지된 효모 종(de Vega et al, 2017, FEMS Yeast Research, Volume 17, Issue 5, 1 August 2017)은 주로 예전에 승인되었던 명칭인"칸디다 봄비필라"로 지칭된다.

실시예 1: 칸디다 봄비필라의 단리 및 분류학상 정보와 생태학

본 발명자들은 신규의 씨. 봄비필라 균주를 비. 테레스트리스 일벌의 장으로부터 단리하였다. 벨기에 히버리(Heverlee)에서 채집된 야생 여왕벌에 의해 형성개시된 군락으로부터 기원한 이 일벌이 실험실에서 군락 형성을 개시하도록 허용하였다. 상기 균주는 본 발명자들이 보았던 종들 중 가장 빨리 성장하는 균주였다. 본 발명자들은 상기 씨. 봄비필라 균주를 루뱅 카톨릭대학교의 벨기에 미생물 조합 수집소(BCCM)/균류수집소(MUCL)에 기탁하였으며, 이때 승인 번호 MUCL 56142를 부여받았다(상기 균주 기탁에 관한 추가의 상세한 설명은 상기 표 A를 참조함).

칸디다 봄비필라에 대해서는 2004년 Brysch-Herzberg 및 Lachance에 의해 2가지 균주에 관한 정보를 바탕으로 저술되었다(Int J SystEvolMicrobiol 54 (2004) 1857-1859). 표준 균주는 네덜란드 위트레흐트에 소재하는 균류수집중앙사무국(Centraal bureau voor Schimmelcultures)의 효모 분과에 균주 CBS 9712T (=NRRL Y-27640T=MH268T)로서 기탁되어 있다. 이는, 이른 봄에 봄버스 테레스트리스 여왕벌의 주둥이로부터 단리되었다. 사실, 저자들은 (호박벌 주둥이에서 얻어진) 135개의 시료 중 단 하나의 호박벌 시료에서 씨. 봄비필라를 발견하였던 반면에, 135개의 시료 중 103개의 시료에는 효모가 함유되어 있었다. 두 번째 종 CBS 9713(=X316.5)은 여름에 봄버스 파스큐오럼(Bombus pascuorum) 벌의 집에 제공된 꿀로부터 단리되었다. 상기 두 균주는 독일 마르부르크 소재 필립스 대학교의 신 식물 정원(New Botanical Garden)에서 단리되었다. 비록 이는, 종의 서식지가 호박벌과 이 호박벌이 제공하는 꿀일 것임을 암시하는 것으로 보이지만, 더욱 최근의 호박벌 표본 분석과 호박벌 먹이 원, 예컨대 꽃의 화밀 분석은 이 종들에 관하여 보고하지 않았다. 전술된 독일의 균주 보고 이후 10년이 경과하여, 2016년 9월 15일자로 체결된 제휴와 함께 제출된 추가의 서열 단 하나가 있었는데, 이 서열로부터 종이 확인되었다. 세번째 단리주(IMB11L4)는 곤충(숙주)으로부터 유래하였는데, 이는 Gouliamova, D.E.에 의해 채집되었으며, 미발표 논문인 "Biodiversity of yeasts in selected Bulgarian ecosystems"(2013년 제출)과 관련되어 있다. 뿐만 아니라, Brysch-Herzberg는, 씨. 봄비필라의 생태로부터 어떠한 결론도 도출될 수 없었다는 결론을 내렸다.

이 사실은, 본 발명자들이 자체적으로 행한 실험들에 의해 확인되었다. 2014년과 2016년 봄에 각각 총 31 마리 및 43 마리의 호박벌(비. 테레스트리스)의 여왕벌을 야생에서 채집하였다. 각 벌의 장, 작물 및 주둥이를 별도로 YGC(효모 글루코스 + 클로람페니콜) 아가 평판에 도말하였다. 이후 본 발명자들은 별개로 배양한 (즉 생) 효모 모두를 단리하고, Sanger 서열결정법과 BLAST(동일성 99%)를 사용하여 이 효모를 종의 수준으로 동정하였다. 본 발명자들의 분석은, 효모 종 칸디다 봄비필라는, 2014년과 2016년에 각각 여왕벌의 단지 4% 및 13%(모든 기질 포함)에서 단리되었고, 전반적으로 이 효모 종은 장내 단리 효모의 5%를 차지하였던 것으로 보아, 야생의 호박벌에서는 지극히 드물게 존재한다는 것을 보여주었다.

비록 이 효모 종은 호박벌의 입틀에 서식하면서, 결과적으로는 화밀에 군락을 형성할 수 있을 듯하였지만, 심지어 전세게적으로 철저한 연구가 행하여 졌음에도 불구하고 이 효모 종은 이 기질에서는 전혀 단리되지 않았다. 미생물이 서식하는 화밀에 관하여 발표된 기록들 모두에 관한 최근의 보고에서, 씨. 봄비필라는 화밀 서식 종으로 분류되지 않았다(Pozo, M. I., Lievens, B., &Jacquemyn, H. (2014). Impact of microorganisms on nectar chemistry, pollinator attraction and plant fitness. nectar: production, chemical composition and benefits to animals and plants. Nova Science Publishers, Inc., New York). 화밀 서식 미생물 연구 대부분이 지난 10년간 수행되었기 때문에, 분류군에 관한 비교적 최근의 저술은 이와 같은 지식의 틈을 설명하지 못하였다(Pozo et al, 2014).

이와 같은 조사와 함께, 본 발명자들은 전술된 방법(즉 실내 사육된 호박벌의 장내 세균, 더욱 구체적으로는 씨. 봄비필라가 원래 서식하던 어미 여왕벌로부터 다음 세대에 전달될 수 있었는지, 및/또는 딸 여왕벌(daughter queen)의 동면 후에도 전달될 수 있었는지를 평가하는 방법)을 이용하여 조사를 수행하였다. 본 발명자들이 얻은 결론은, 이 종은 상업적으로 사육되는 호박벌에 전혀 존재하지 않았음을 보여주었다(데이터는 보이지 않음). Bab'eva 및 Chernov에 따르면, 효모는 일반적으로 무척추동물 장 내에 서식하지만, 효모의 공생체는 인공 사육시 다음 세대에서 사멸된다고 한다(2004; Biology of Yeasts,　KMK, Moscow).

게다가, 본 발명자들은 별도의 실험, 즉 호박벌의 여왕벌 10마리에게 살아있는(당 물 중에서 성장하고 있는) 씨. 봄비필라를 1주일 간격으로 적극 공급하는 실험을 수행하였다. 이 10 마리의 호박벌(군락)이 표준 상업적 사육 조건에서 주기를 마칠 수 있도록 허용하였고, 이후에는 수 개의 군락 단계와 개체에 대해 주둥이, 작물 및 장 내 씨. 봄비필라의 수적 우세함을 시험하였다. 시험된 개체들은 군락확립개체(founder)인 여왕벌, 일벌 및 새로 태어난 여왕벌을 포함하였다. 새로 태어난 여왕벌은 동면 기간 전 후로 시험되었다. 본 발명자들이 얻은 결론은, 집 하나당 2마리의 딸 여왕벌 시료(동면 전에 처리)에는 이 효모 종이 전혀 없었음을 확실하게 보여준다. 흥미로운 점은, 동면 기간 이후에 처리한 20마리의 호박벌의 여왕벌 부표본에 대해서도 동일한 결과가 얻어졌다는 점이다.

표준 균주(CBS 9712T, 비. 테레스트리스의 입틀로부터 수집)의 rDNA 대형 서브유닛 D1/D2 서열은 치환이 57회 발생하였고, 갭이 3개 존재한다는 점에서 가장 가까운 관계에 있는 종, 즉 더블유. 도메르키아에(W. domercqiae)와 상이하다. 균주 CBS 9713(AJ620186)은 치환이 1회 발생하였고, 갭이 1개 존재한다는 점에서 표준 균주와 상이하다. Kurtzman외 다수는, 대부분의 경우 변별적 종들은 상기 서열에 1% 이상 차이가 있음을 보였다(Kurtzman et al. (1998) 73: 331. doi:10.1023/A:1001761008817).

다중 유전자 서열 분석, 예컨대 사카로마이세타세아에(Saccharomycetaceae)에 대한 다중 유전자 서열 분석은, 표현 형질로부터의 효모 속에 관한 한계지정은 종종 이들의 분자적 계통발생론을 기반으로 한 추론과 일치하지 않음을 보여주었다. 이와는 대조적으로, 무성 생식 효모의 분류는 분자적 계통발생론 연구에서 거의 다루어지지 않았는데, 그 이유는 이 무성 생식 효모가 칸디다 및 기타 무성세대 속(anamorphic genera)에 포함되면 오랜기간 통용되고 있는 규칙인 국제식물명명규약(International Code of Botanical Nomenclature)의 요구조건을 충족하였기 때문이다. 그러나 최근 다형성 진균 명명에 관한 규칙의 변화는, 현재 진균 종 또는 고등 분류군에 새 규약[조류, 진균류 및 식물에 관한 국제명명규약; International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants(Melbourne Code)]에 따라 오로지 하나의 유효 명칭이 부여되어야 함을 요구하고 있다(McNeill, et al. (2012). International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants (Melbourne Code). Regnum vegetabile, 154(1), 208)). 결과적으로, 어떤 속의 일원을 계통발생 친화력(phylogenetic affinity)과 일치하도록 만들기 위해 현재의 칸디다 종과 기타 무성 효모 속에 대하여 개정이 이루어져야 한다는 것이다. 현재 무성세대 명칭과 유성세대 명칭 둘 다를 가지고 있는 종의 경우, 어떤 명칭을 유지시킬지에 대한 결정이 내려져야 할 것이다. 예전 체계에서 유성세대 명칭이 우선적으로 사용되었지만, 새 규약은 관습적인 우선순위와 통상의 용법에 관한 원리를 적용하는 대신 두 명칭 모두를 동등한 입장에 놓고 재차 확인한다. Daniel외 다수에 따르면, 칸디다 봄비필라는 위커하미엘라 속(즉 더블류. 봄비필라)으로 옮겨져야 하는 것이다(Daniel, H. M., Lachance, M. A., & Kurtzman, C. P. (2014). On the reclassification of species assigned to Candida and other anamorphic ascomycetous yeast genera based on phylogenetic circumscription. Antonie van Leeuwenhoek, 106(1), 67-84). 실제로 종의 DNA 기반 계통발생을 바탕으로 하는 최근의 연구는, 예전에 "칸디다 봄비필라"로 공지되었던 종은 현재는 위커하미엘라 봄비필라로 재명명되어야 한다고 제안하고 있다(de Vega et al, 2017).

실시예 2: 칸디다 봄비필라(생세포)와, 이의 호박벌의 건강, 적응도, 행동 및 군락 발달에 대한 효과

재료 및 방법

씨. 봄비필라 효모, 더욱 구체적으로 씨. 봄비필라 균주 MUCL 56142의, 호박벌 벌떼의 발달과 적응도에 대한 영향력을 관찰하기 위해, 호박벌에게 상기 씨. 봄비필라 효모를 포함하는 먹이를 공급하였다. 대조군에는 동일하되, 씨. 봄비필라 효모를 포함하지 않는 먹이를 공급하였다. 각각의 처리에 있어서, 10개의 상이한 집을 복제품으로서 사용하였다. 모든 실험을 위하여, 땅 호박벌(earth bumblebee)(봄버스 테레스트리스)을 연구용 유기체로 사용하였다. 이 호박벌의 자연상 서식지(땅속)를 모의하기 위해, 호박벌을 온도 29℃ 및 상대습도 60%의 암실에 넣어두었다. 실험을 시작할 때, 인공 사육한 어미 여왕벌 60마리를 멸균 인공 양봉 상자에 옮긴 다음, 이틀 동안만 당 용액(Biogluc®Biobest)을 공급하였다. 이전의 연구는, 인공 사육 프로그램의 대상이었던, 월동 후의 여왕벌에는 효모가 없었음을 보인 바 있다. 여왕벌의 사멸을 감소시키기 위해, 각각의 여왕벌에 일벌(멸균 용기에 번데기 상태로 운반된 다음, 우화후 집에 투입함)을 공급하였다. 이 단계는, 일벌에도 또한 효모가 존재하지 않도록 보장한다. 전체 실험이 진행되는 동안 호박벌에는 단백질 원으로서 화분을 공급하였다. 이 화분은 고냉동된 것으로서, 역시 미생물이 존재하지 않도록 보장하기 위해 최소 13 kGy에서 최대 40 kGy의 감마 복사선으로 조사하였다.

에그컵 수, 첫번째 알이 산란된 날, 유충기(제1령 및 제2령(L1-L2) 및 제3령 및 제4령(L3-L4)), 일벌의 수, 수컷의 수, 그리고 얼마나 많은 벌(수컷, 암컷, 여왕벌)이 사멸하였는지를 평가함으로써 군락 발달에 대한 효모의 효과를 평가하였다.

효모 제조

본 실험의 첫 번째 단계는, 1차 도말 또는 모 도말(mother plating)로부터 얻은 효모 균주를 클로람페니콜 글루코스 아가(YGC) 평판 상에 접종하여 군락을 분리하는 단계로 이루어져 있다. 아가는 하기 성분들, 즉 1.0% 글루코스, 0.5% 펩톤, 0.3% 맥아 추출물, 0.3% 효모 추출물, 2.0% 아가 및 0.01% 클로람페니콜로 구성되었다. 그 다음 이를 평판에 접종하여(24℃ 및±2일) 효모 균주가 충분히 성장하도록 하였다.

두 번째 단계에서는, 효모 세포를 YGC 평판에서 분리한 다음, 접종용 루프를 사용하여 효모 맥아(YM, 0.5% 펩톤, 0.3% 효모 추출물, 0.3% 맥아 추출물, 1% 글루코스, 2% 아가) 원액 5 ml에 접종하였다. 접종용 루프를 사용하여 원 평판으로부터 세포 약간을 긁어낸 다음, 이 접종용 루프를 시험관 내부에 대고 스크래칭(scratching)하였다. 접종 후 시험관을 24℃에서 48시간 동안 진탕 플랫폼(80 rpm ~ 100 rpm) 상에서 항온처리하였다. 시료 관을 일정하게 회전시킴으로써 액체가 항상 공기와 접촉하도록 만들었다.

벌에 세포를 최종 밀도, 즉 1 마이크로리터당 100개 세포로 제공하였다. 이 값은, 스페인 동남부에서 자생하고 있는 60개의 상이한 식물 종 시료 하나의 화밀 1 마이크로리터당 발견된 세포의 평균 수로부터 도출된 값이다(Pozo et al., In: Peck et al. Nectar: production, chemical composition and benefits to animals and plants. Nova Science Publishers, Inc. NY, 2015).

농축 효모 접종물(OD=0.05)을 30% 당 물 조성물(당은 건조 중량을 기준으로 66% 수크로스, 16.6% 글루코스 및 16.6% 프럭토스로 이루어짐)에 첨가하여 농도를 100개 세포/μl로 만들었다. 본 발명자들은 20 mL들이 용기에 접종물 100 마이크로리터를 첨가하였다. 대조군 처리에는 동 부피의 멸균 YMB을 보충하였다. 효모는 용기 중 당을 고갈시켜, 벌의 적응도에 영향을 미칠 수 있을 것이므로, 멸균된 당 물(여기서 당은 건조 중량을 기준으로 66% 수크로스, 16.6% 글루코스 및 16.6% 프럭토스로 이루어짐)이 담긴 두 번째 용기를 첫 번째 용기 다음에 놓아두었다. 집이 있는 구역과 연결된 모세관 심지를 사용하여 벌로 하여금 이 용액을 가져가도록 하였다.

추가의 실험에서, 효모 원액을 (동일한 수의 세포를 포함하는) 당 물에 첨가한 다음, 이를, 화분 함량에 대한 백분율 10 %w/w 기준으로 화분과 혼합하였다.

10일 후 효모 세포는 완전히 생존한 채 남아서, 이 효모 세포를 호박벌에의 투여에도 또한 사용할 수 있었음에 주목한다.

벌떼의 활동 능력 평가

호박벌 벌떼의 발달

군락이 얼마나 빨리 커지고, 성장이 효모의 존재에 의해 어떻게 영향을 받는지를 관찰하기 위해, 매주 에그컵의 수를 계수하였고, 첫 번째 에그컵이 생긴 날을 확정하였으며, 유충기(L1 ~ L2, L3 ~ L4)를 평가하였고, 일벌의 수, 수컷의 수, 그리고 사멸한 벌(수컷, 암컷, 여왕벌)의 수를 계수하였다. 어미 여왕벌을 투입한 이래로 9 연속 여왕벌(consecutive queen) 동안 이 과정을 수행하였다.

데이터 분석

효모 세포의 존재가 벌떼의 발달에 영향을 미쳤는지 여부를 관찰하기 위하여, 변화의 혼합 모델 분석을 이용하였다. 3개의 상이한 변수, 즉 군락의 크기, 브러드, 그리고 일벌로 예측되는 개체의 수를 사용하여 벌떼의 발달을 평가하였다. 각각의 군락에 대해 측정이 반복되어 수행되었음을 진술하기 위하여, 처리를 각각의 종속 변수에 대해 고정 효과(fixed effect)로 사용하였고, 주중 집을 이룬 군락을 확률 변수(random variable)로 사용하였다. 혼합 모델을 운영하기 전에, 각각의 변수에 대해 데이터의 정규성 결여 여부를 검토하였으며, 이 경우 푸아송 분포는 일관되게 가장 적합한 분포로서 선택되었다. 그 다음, 어떤 처리가 군락 크기, 브러드 또는 일벌이 될 개체의 수에 유사한 영향력을 미쳤는지를 관찰하기 위해 사후 검정 비교를 수행하였다.

벌떼가 "경쟁 시점"에 이르기 전(제7주차(여왕벌이 투입된지 8주 후)), 일반화 선형 모델을 사용하고, 인공 기후실 내 군락의 위치를 부가 예측 변수로서 부가하여, 처리 간 일벌로 예측되는 개체의 수(실제 일벌의 수 + 번데기 수)를 비교하였다.

절지동물 건강을 향상시키기 위한, 칸디다 봄비필라의 용도

(봄버스 테레스트리스의 장에서 단리된) 생 효모 칸디다 봄비필라(Cbh)를, 호박벌 장내 기생체 크리티디아 봄비의 성장-억제 효과에 대해 시험하였다. 더욱 구체적으로 이 원생동물 병원체를 비. 테레스트리스 분변으로부터 단리하여, 문헌[Salathι et al 2012 (Salathι et al., PLoS ONE. 2012; 7(11):e49046]에 기술된 바와 같이 배양하였다. 두 유기체를 함께 액체 배지에 2가지 농도(즉 초기 세포 밀도인 10개 세포/μL 및 100개 세포/μL)로 혼입하였다. 온도를 27℃로 조절하면서, 2가지의 상이한 대기 조건, 즉 표준 호기 조건과, 호박벌 장내 조건에 근접한 조건인 미세 호기 조건(4% CO₂) 하에서 시험관 내 실험을 수행하였다. 선택된 배지 및 선택된 배양 조건에서의 정상적 세포 사멸을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 또한 액체 배지에 크리티디아 또는 효모를 별도로 접종하였는데, 이때에도 역시 상기와 동일하게 2가지 농도로 접종하였다. 2일의 항온 처리 기간 후, 본 발명자들은, 사멸한 세포만을 염색하는 특정의 염색 방법을 사용하여 상기 두 미생물의 생세포 및 사멸 세포의 비율을 확인하였다. 포름알데히드 고정 단계에서 세포를 고정시킨 후에, 염색된 세포(사멸 세포)와 염색되지 않은 세포(생세포)의 수를 Neubauer 계수 챔버에서 계수하였다.

결과는, 효모 칸디다 봄비필라가 액체 배지에 첨가되었을 때 기생체인 크리티디아 봄비의 생존율은 유의미하게 감소하였음을 보여주었으며, 이러한 결과는 두 가지 대기 조건 하에서 마찬가지였다(호기 조건: 승산비 0.32, Z = -4.6203826, P = 0.0001, 미세 호기 조건: 승산비 0.47, Z = -3.046, P = 0.048, 도 1). 흥미롭게도, 모든 처리에 있어서 효모 자체의 세포 사멸율은 낮았다. 미세 호기 조건 하에서 혼합-종 처리시에는 효모만의 처리시(대조군)에 비하여 효모 세포 생존율의 유의미한 감소는 없었으며, 혼합-종 처리시 효모 세포는 크리티디아 세포보다 생존율이 유의미하게 더 높았다(승산비 = 4.91, Z = 36.26, P <.0001). 그러나, 호기 조건하에서는 혼합-종 처리시 효모 세포 생존율이 대조 처리시에 효모 세포 생존율에 비하여 약간 감소하였지만(승산율 = 0.29, Z = -5.14, P <.0001), 크리티디아 세포 사멸율은 효모 세포 사멸율보다 여전히 훨씬 더 높았다(승산율 = 5.06, Z = 51.49, P <.0001). 종합하면, 이 결과는 장내 기생체 크리티디아 봄비의 생존율에 대해 효모 칸디다 봄비필라가 유의미하게 부정적인 효과를 발휘함을 말해준다.

절지동물의 활동을 향상시키기 위한, 칸디다 봄비필라 생세포의 용도

본 실험에서는 발달단계 전반에 걸쳐있는 군락에 칸디다 봄비필라를 공급한 이후 비. 테레스트리스 벌떼의 비행 활동을 추적하였다. 임의의 멸균 꿀벌 수집 화분과 50%의 당 물로 이루어진 표준 먹이를 군락에 공급하였다. 이 표준 먹이를 제공한 다음, 본 발명자들은 10개의 군락에 매일 30% 당 물 용액(1 μL당 씨. 봄비필라 세포 100개 함유)을 제공하였으며, 대조군으로서는 10개의 군락에 매일 30% 당 물 용액 + 효모 맥아 원액(YMB)을 제공하였다. 이 용액을, 브러드 박스(brood box) 벽에 부착된 작은 바이알에 투여하고 나서, 매일같이 교체하여 주어 오염되는 것을 막았다(효모의 경우, 본 발명자들이 매일같이 신선한 1일령 세포를 투여하였음을 의미함). 벌떼가 9주령에 달하였을 때, 본 발명자들은 각각의 처리가 이루어진 벌떼 4개를 선택하여, 벌떼들의 야외 활동을 추적하였다. 이 같은 선택은, 거의 동일한 수의 일벌과 브러드, 살아있는 어미 여왕벌의 존재, 그리고 어떠한 수컷도 존재하지 않는 것을 바탕으로 이루어졌다. 벌집을 무작위로 꽃밭에 가져다 놓은 후, 외부로 풀어놓기 직전, 씨. 봄비필라 효모(100개 세포/μL)를 포함하는 30% 당 물 용액 20 mL 또는 이 효모를 포함하지 않는(대조군 군락용) 30% 당 물 용액 20 mL가 담긴 작은 병 하나를 상기 벌집 안에 가져다 놓았다. 그 다음, 비행하여 들어가는 일벌과 비행하여 나오는 일벌의 수를 계수함으로써 비행 활동을 평가하였다. 각각 다른 날 나흘 동안 계수를 실시하였다(계수일 마다 5분간의 계수 라운드 2회 진행).

본 실험의 결과는, 칸디다 봄비필라 생세포를 함유하는 당 물 용액이 공급된 벌떼는 효모를 공급받지 않은 벌떼에 비하여 일벌의 비행 활동이 유의미하게 증가하였음을 보여주었다. 이러한 효과는 벌집 속으로 비행하여 들어가는 일벌과 벌집으로부터 비행하여 나오는 일벌의 수에 대해서도 발휘되었다(도 2).

절지동물 사육을 최적화하기 위한, 칸디다 봄비필라 효모 생세포의 용도

본 실험에서는 12주의 기간에 걸쳐 비. 테레스트리스 군락 발달을 진행시켰다. 20개의 군락을 표준 기후 조건(28℃ 및 상대습도 60%)에 두고, 군락들에 멸균 꿀벌 수집 화분과 50% 당 물 용액을 자유급식으로 공급하였다. 이 먹이를 공급한 다음, 10개의 군락에 (효모 맥아 원액과 함께) 1 μL당 칸디다 봄비필라 세포 100개를 함유하는 30% 당 물을 공급하였고, 또 다른 10개의 군락에는 동일하되 효모는 함유하지 않는 30% 당 물(+YMB)을 공급하였다. 이 용액을, 브러드 박스 아래에 있는 작은 용기에 투여한 다음, 매주 새 것으로 교체하였다(1주일의 기간에 걸쳐 효모가 성장할 수 있도록 허용함). 처음 산란하는 타이밍, 처음 번데기로 발달하는 타이밍, 그리고 처음 성체로 우화하는 타이밍을 추적함으로써 유충 발달 시간을 측정하였다. 처음 8주 동안은 일벌, 번데기, 유충, 사멸 유충 및 알의 수를 매주 계수하였다. 실험의 막바지(12주 후)에 이성 개체(수컷과 여왕벌)의 총 수도 또한 계수하였는데, 그 이유는 이것이 군락 적응도의 매개변수이기 때문이다.

결과는, 살아있는 칸디다 봄비필라의 투여는 비. 테레스트리스에 있어 군락 발달의 상이한 매개변수에 유의미하게 긍정적인 효과를 발휘한다는 것을 보여준다.

8주간의 발달 기간 후 행하여진 계수 결과는, 효모 처리를 받지않은 대조군 군락과 비교되었을 때 태어난 일벌의 수에 유의미한 증가가 있음을 보여준다(도 3). 이러한 효과는 또한 번데기와 일벌의 수를 모두 합하여 고려하여 보아도 명백하였는데, 이 합은 1주일이라는 시간 동안의 일벌의 예측 수이다.

임의의 시점에 대조군 처리시에 비하여 일벌로 예측되는 개체가 더 많이 존재한다는 사실은, 씨. 봄비필라가 공급된 군락이 더 빨리 발달함을 말해준다. 군락 크기(모든 발달 단계의 개체들 포함), 브러드(알 및 유충) 수 및 일벌이 될 개체의 주간 증가 속도는 또한 대조군 처리시에 비하여 씨. 봄비필라 처리시에 더 빨랐다(도 4).

더 빠른 군락의 발달은, 더 빠른 산란 속도, 더 빠른 유충의 발달 및/또는 더 높은 유충 생존율을 암시할 수 있었다. 본 발명자들은, 씨. 봄비필라의 투여가 이와 같은 효과들 중 적어도 2가지를 발휘하였음을 입증할 수 있었다. 첫 번째, 상이한 발달 단계에 도달하는 타이밍은 씨. 봄비필라가 투여되었을 때 약간 더 빨랐지만(도 5), 이 효과는 유의미하지 않았다. 두 번째, 유충의 사멸율은 씨. 봄비필라가 투여되었을 때 유의미하게 감소하였다(도 6).

씨. 봄비필라의 투여는 또한 12주의 기간 이후에 태어난 이성 개체들의 수에 대해 유의미하게 긍정적인 효과를 발휘하였다. 이 효과는 태어난 수컷의 수에 있어서는 분명하였지만, 해당 효과는 태어난 여왕벌의 수에 대해서는 유의미하지 않았다(도 7).

씨. 봄비필라의 존재 하에 또는 부재 하에 절지동물의 사육실태를 평가하기 위하여, 포식성 진드기 종과 물결넓적꽃등에로써 유사한 실험을 수행하였다.

균주 특이성

본 발명자들은 2개의 상이한 씨. 봄비필라 균주의, 군락 발달 및 비행 활동에 대한 효과에 대해 시험하였다.

첫 번째 균주는, 예전에 독일에서 야생 비. 테레스트리스 여왕벌 주둥이로부터 단리되어, 네덜란드 위트레흐트에 소재하는 균류수집중앙사무국의 효모 분과에 균주 CBS 9712T(=NRRL Y-27640T=MH268T)로서 기탁된 씨. 봄비필라 균주였다(Brysch-Herzberg M. and Lachance M. (2004)Int J SystEvolMicrobiol, 54, 1857-1859, DOI 10.1099/ijs.0.63139-0). 본 발명자들은 상기 씨. 봄비필라 표준 균주 CBS 9712T(이하 "표준 균주"라 칭함)를, 네덜란드 왕립 예술 및 과학 아카데미(Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences) 산하 기관인 CBS-KNAW 진균 생물다양성 센터(Fungal Biodiversity Centre)로부터 입수하였다.

두 번째 균주는, 루뱅 카톨릭대학교의 벨기에 조합 미생물 수집소(BCCM)/균류수집소(MUCL)에 본 발명자들에 의해 기탁되어 균주 번호 MUCL 56142를 부여받은 씨. 봄비필라 균주이다(균주 기탁에 관한 추가의 상세한 설명은 상기 명시되어 있음).

본 발명자들은, 두 가지 균주를 대상으로 시험하였으며, 호박벌 군락 발달 및 비행 활동에 대한 이 균주들의 효과를 비교하였다. 두 균주를 배양한 다음, 비. 테레스트리스 호박벌 먹이 원에 접종하고 나서, 상기 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다.

본 발명자들에 의해 얻어진 결과는, 대조군 처리(당 물 중에 그 어떠한 효모도 함유하지 않았던 처리)가 행하여졌을 때에 비하여, MUCL 56142 균주가 처리될 때에는 군락 발달에 강한 긍정적 효과를 발휘하였음을 보여주었다. 표준 균주 CBS 9712T 또한 대조군 처리가 행하여졌을 때에 비하여 군락 발달에 긍정적인 영향을 미쳤지만, 그 정도는 MUCL 56142 균주보다 약했다. 구체적으로 일벌로 예측되는 개체의 수는, MUCL 56412 균주 처리시 평균적으로 약 198.5 ± 29.5 마리(SD)였던 반면에, 표준 균주 CBS 9712T 처리시에는 평균적으로 166.2 ±16.2 마리(SD)였고, 대조군 처리시에는 평균적으로 144.2 ± 41.2 마리(SD)였다(도 8).

이러한 결과들은, 9주라는 기간 이내에 태어난, 일벌이 될 개체의 수에 대해 두 균주가 발휘가능한 긍정적 효과(GLM, N_군락 = 10)를 암시하지만, 이 긍정적 효과는 오로지 MUCL 56142 균주에 대한 경우에만 통계학적으로 유의미할 뿐이었다. 뿐만 아니라, MUCL 56142 균주 처리시에는 또한 대조군 처리시에 비하여 9주라는 기간 이내에 군락의 총 크기(군락의 모든 개체와 발달 단계에 있는 개체의 합)에 긍정적인 효과를 발휘하였다.

또한 본 발명자들은, 전체 발달기간 중 효모 용액을 공급받은 벌떼의 비행 활동에 대한 두 균주의 효과를 시험하였으며, 그 결과를 어떠한 효모도 함유하지 않는 대조군 용액을 공급받은 벌떼의 경우와 비교하였다. 본 발명자들이 얻은 결론은, 시험된 두 균주 처리시에는 벌떼가 야외에 놓였을 때 효모를 함유하지 않는 대조군 처리시에 비하여 비행 활동에 강한 긍정적 효과를 발휘하였음을 보여주었다(시험 개시시 존재하였던 일벌의 수가 공변량으로서 포함된 GLM, N_군락 = 4). 더욱 구체적으로 MUCL 56142 균주 처리시는 비행 활동에 대한 모델 보정 평균이 2.35였고, 표준 균주 CBS 9712T 처리시는 비행 활동에 대한 모델 보정 평균이 2.3이었던 반면에, 대조군 처리시는 비행 활동에 대한 모델 보정 평균이 2.1에 불과하였다(데이터는 보이지 않음).

선호도 시험

씨. 봄비필라 처리가 인공 화밀에 가하여졌을 때, 씨. 봄비필라 처리의 매력도(attractiveness)를 대조군 조건(즉 효모가 존재하지 않는 조건)의 경우와 비교하기 위한 행동 시험을 수행하였다. 대조군 먹이는 30% 당 물(수크로스(S) 2/3, 프럭토스(F) 1/6, 글루코스(G) 1/6) 및 멸균 효모 맥아 원액(YMB)을, 당 물 각각 1 ml당 50 마이크로리터의 비율로 포함하였다. 씨. 봄비필라 포함 먹이는 대조군 먹이와 동일하되, 이 중 YMB은 효모와 함께 항온처리된 것이었다(최종 농도 = 100개 세포/μl).

이전에 먹이를 통해 미생물과 접촉한 적이 없었던 실내 사육 비. 테레스트리스 군락 하나(10주령)를 Biobest 호박벌 제작부에서 선택하였다. 시험 시작 1일 전 벌떼가 Biogluc®에 접근하는 것을 차단함으로써 이 벌떼를 굶주리게 만들어 먹이에 대한 욕구가 증가하도록 하였다. 그 다음, 실험용 비행장(flying arena)이 설치된 온실 내부에 군락을 풀어 놓았다. 이 비행장에는 16개의 로봇 꽃과, 노랑색의 플라스틱 고리(착륙 플랫폼)가 4개의 군으로 나누어져 마련되어 있었다. 이 시스템은 Kuusela 및 Lamsa에 의해 기술된 시스템을 모방한 것이다(Ecology & Evolution, 2016, doi:10.1002/ece3.2062). 이 시스템은 제어 유닛, 별도의 꽃들, 그리고 퍼스널 컴퓨터를 포함한다. 제어 유닛의 역할은 꽃에 내장된 전자 장치를 다루고, 이로부터 데이터를 수집하며, 수집한 데이터를 컴퓨터에 전송하는 것이다. 로봇 조화 자체는 적외선(IR) 센서와 이와 연결된 전자 장치, 그리고 저장기로부터 소량의 당 용액(이하 "인공 화밀"이라 칭함)을 정확한 양으로 공급하는 전기기계 장치(서보)를 포함한다. 컴퓨터는 제어 유닛을 통해 재충전 속도(refilling rate)와 데이터 수집을 제어하는 소프트웨어를 운영한다. 이 시스템의 이론적 원리는, 조화에 호박벌이 들어가면 전압이 강하되고, 이것이 주문 제작 Java 인터페이스에 의해 기록되는 것이다. 방문 날짜와 시간, 꽃의 식별번호, 그리고 매 유효 방문당 탐색 시간이 기록된다. 야생화에 있어서의 "꽃 고갈(flower depletion)" 현상은 자동 재충전 기간을 10분으로 설정하여 모의하였던 관계로 당 물(인공 화밀)은 연속으로 공급되지 않았으며, 방문 속도는 야생화에 있어서의 탐색 시간을 모의하였다.

본 시험은, 16개의 조화(꽃의 절반은 대조군 처리가 되고, 나머지 절반은 씨. 봄비필라 처리가 됨)으로 구성되었다. 2일에 걸쳐 대조군 인공 화밀(효모 불포함)을 함유하는 조화와, 씨. 봄비필라 효모 세포를 함유하는 조화에의 유효 방문 횟수뿐만 아니라, 각각의 꽃 모형으로부터 화밀을 획득하는데 소모된 총 시간을 모니터링하였다.

처녀(naive) 호박벌이 전체적으로 씨. 봄비필라를 함유하였던 꽃에 다수 회 방문하였을 뿐만 아니라 더 오래 머물러 있었던 것으로 보았을 때, 결과는 처녀 호박벌이 씨. 봄비필라를 함유하였던 꽃을 선호하였음을 보여주었다(도 15).

실시예 3: 화분을 통한 칸디다 봄비필라의 투여

실시예 2는 당 물을 통해 씨. 봄비필라를 투여할 경우 포획되어 사육되었던 호박벌 군락(개체 내에 상기 효모 종을 가지지 않는 호박벌)의 적응도가 증가하였음을 입증하였다. 본 실시예에서는 효모(효모 생세포)가 화분을 통해 투여되었을 때에도 이 효과가 또한 얻어질 수 있는지에 대해 평가하였다. 40% 농축 당 물(수크로스 2/3, 글루코스 1/6, 프럭토스 1/6) 20 %(w/w 기준)을 첨가하여, 소시지 형태로 반죽함으로써 화분을 준비하였다. 이 조성물을 발달중인 호박벌 군락에 제공하였다. 먹이를 매주 교체하여 주었는데, 이 경우 효모는 4주 동안 화분 속에서 생존하였다(이에 대한 결과는 보이지 않음).

MUCL 56142 씨. 봄비필라 균주를 효모 맥아 원액에 현탁하였다. A600이 0.25인 접종물을 사용하였는데, 이는 추후 보존제를 포함하지 않은채 40% 당 물(수크로스 2/3, 글루코스 1/6, 프럭토스 1/6) 1 ml당 5 마이크로리터의 비율로 현탁되었다. 이 프로토콜은, 실시예 2의 당 물 투여에서 사용된 바와 같이, 화분 소시지(pollen sausage) 1 마이크로그램당 100개 세포가 투여되는 것을 보장할 것이다. 이와 같은 당 물과 효모 맥아 원액 접종물 믹스 총 20%를, 임의의 중량의 멸균(감마선 조사)된 호박벌 수집 화분에 첨가하였다.

이 화분 믹스가 공급된 15개 군락의 활동 능력을, 15개의 (상이한) 대조군 군락(즉 효모 균주가 공급되지 않은 군락)의 활동 능력과 비교하였다. 군락에는 탄수화물 원으로서 Biogluc®이 자유급식으로 공급되었다.

첫 일벌은, 대조군 군락에서는 36.4 ± 1.6일(평균 ± SE)에 출현하였고, 살아있는 씨. 봄비필라를 함유하는 화분이 공급된 군락에서는 33.6 ± 1.5일(평균 ± SE)에 출현하였다. 5주차에 접어들었을 때, 군락에 살아있는 씨. 봄비필라 균주 MUCL 56142가 화분을 통해 공급되자 군락의 발달은 유의미하게 더 빨라졌다. 이와 같이 발달에 대한 긍정적 효과는, 브러드 크기에서 볼 수 있었을 뿐만 아니라(에그컵과 유충 모두, 도 9 좌측 패널), 그 당시 일벌로 예측되는 개체의 수에서도 볼 수 있었다(도 9, 우측 패널).

8주차에 접어들면서, 군락 발달, 즉 전술된 군락 발달 매개변수 모두를 평가하였다. 그 결과는, 씨. 봄비필라가 화분에 첨가되면 군락 발달 매개변수 모두에 긍정적인 영향을 미쳤는데, 이는 군락의 시장성과 군락의 미래 야외 활동 능력에 영향을 미칠 것임을 보여주었다. 8주차에 우화된 일벌의 수는, 동일 시점에서 씨. 봄비필라를 포함하는 화분이 공급된 군락의 경우(32.6±2.0 마리)가 대조군 군락의 경우(22.8±1.6 마리)보다 유의미하게 더 많았다(도 10, 좌측 패널). 수컷의 수는 씨. 봄비필라가 보충된 군락의 경우가 더 적은 경향을 보였지만, 그 차이는 이와 같은 군락 발달 시점에서 통계학적 유의 수준에 도달하지 않았다(도 10, 우측 패널).

그러므로 실시예 2 및 3은, 액체 먹이 조성물, 즉 당 용액 또는 인공 화밀 용액, 또는 고체, 즉 화분 기반 먹이 조성물을 통해 유익한 효모가 제공될 수 있음을 입증하는 것이다.

실시예 4: 칸디다 봄비필라(세포, 단편, 생산된 물질)와, 이것이 호박벌의 건강, 적응도, 행동 및 군락 발달에 미치는 효과

절지동물 사육을 최적화하기 위한 칸디다 봄비필라(세포, 단편, 생산된 물질)의 용도

본 실험에서는 16주라는 기간에 걸쳐 비. 테레스트리스 군락의 발달을 진행시켰다.

총 60개의 군락을 표준 기후 조건(28℃ 및 상대습도 60%) 하에 두고, 이들에게 멸균 꿀벌 수집 화분과 50% 당 물 용액(수크로스(S) 2/3, 프럭토스(F) 1/6, 글루코스(G) 1/6)을 자유급식으로 공급하였다. 이처럼 먹이를 공급한 다음, 표 1에 명시된 바와 같이 모든 군락에게 2차로 먹이 공급을 실시하였다. 이하에 상세히 기술된 바와 같이, 이 2차 공급 먹이는 효모 생세포(처리 1), 사멸한 효모 세포/단편(처리 2 및 3; 각각은 접종물 배지를 포함하거나 포함하지 않음) 또는 효모 대사물질/단편(처리 4; 효모가 배양되었지만 추후 이 효모를 비활성화 및 여과한 접종물 배지)을 포함하였다.

대조군 군락(N = 12)에는 30% 당 물(전술된 조성물과 동일한 조성물 50%)과 멸균 효모 맥아 원액(YMB)을, 당 물 매 1 ml당 50 마이크로리터의 비율로 (자유급식) 공급하였다. 나머지 군락(N = 48)에도 또한 2차 공급 먹이 조성물(조성에 대해서는 표 1에 나열됨)을 당 물 공급기를 통해 (자유급식으로) 공급하였다. 모든 당 용액에는 보존제를 포함시키지 않았으며, 매주 교체하여 주었다. 이 당 용액들을, 브러드 박스 아래에 있는 2개의 별도 용기를 통해 투입하였다.

처음 산란하는 타이밍, 처음 번데기로 발달하는 타이밍 및 처음 성체로 우화하는 타이밍을 추적함으로써 유충 발달 시간을 측정하였다. 5주차와 10주차에는 일벌, 번데기, 유충, 사멸 유충 및 알의 수를 계수하였다. 11.5주차에는 발달이 끝난 군락(80마리를 초과하는 일벌이 포함된 군락)을 처리당 선택하여, 5주 더 추가로 발달하는 것이 허용되도록 더 큰 박스로 옮겼다. 시험의 막바지에(16주) 전술된 매개변수 모두를 평가하였다. 또한, 이성 개체(수컷과 여왕벌)의 총 수도 계수하였는데, 그 이유는 이것이 군락 적응도의 매개변수이기 때문이다. 번데기와 일벌 모두(이하 "일벌로 예측되는 개체"라 칭함)는 군락 행동 능력을 평가하기 위한 부가 변수로 사용하였다.

5주차 및 10주차 발달 기간 이후의 계수 결과는, 효모 처리가 이루어지지 않은 대조군 군락과 비교하였을 때 투여 방법과는 상관없이 일벌로 예측되는 개체 수에 있어서 유의미한 증가가 있었음을 보여주었다(도 11). 이 효과는 또한 주어진 기간에서 일벌의 실제 수가 고려되었을 때에도 분명하였다(그 결과는 보이지 않음).

초기 군락 발달과 군락의 확립(founding)을 반영하는 5주차에 접어들었을 때, 군락 발달에 대하여 가장 강한 긍정적 효과는 비활성화 세포를 함유하는 배지가 투여되었을 때(처리 2) 확인되었다(도 11, 상부 패널). 10주차에서의 계수 결과는, 모든 처리가 대조군 처리보다 결과가 훨씬 더 유의미하게 좋았지만, 생세포 첨가(처리 1)는 나머지 처리들보다 긍정적인 효과가 약간 덜하였음도 보여주었다. 이 점은, 개체수의 증가와 성장에 따른 기질의 고갈을 초래할 수 있는 효모 생세포의 증식으로 말미암을 수 있다. 이와 같은 결과는, 3일 후 성장 면에서 정체기에 도달하였을 때 비활성화된, 비활성화 세포를 1회 투여함으로써 효과가 최적화될 수 있음도 또한 암시한다. 이 점은, 효모 보충물이 시간이 경과함에 따라 안정한 특성을 보이도록 보장한다.

이러한 결과는, 씨. 봄비필라를 곤충에 공급할 때의 유익한 효과가 상이하고 비배타적인 경로, 즉

- 효모가 효모 생세포의 형태로 투여될 수 있는 경로(처리 1)[만일 효모 생세포가 배지, 즉 효모가 배양된 배지의 형태로 투여되면, 이 처리는 효모 대사물질도 또한 포함할 것임]

- 효모 또는 이의 단편이 사멸한 세포, 즉 사멸한 세포 그 자체(효모가 배양되었던 배지에서 벗어난 상태; 처리 3)의 형태, 또는 효모가 처음 배양된 후 비활성화된 배지로서 사멸한 세포가 제거되지 않은 형태(처리 2)로 투여될 수 있는 경로; 또는

- 효모, 구체적으로 효모 단편이나 이 효모에 의해 생산된 물질이, 효모 세포가 처음에 배양된 후 비활성화되어, 예컨대 여과에 의해 제거된 배지의 형태로 투여될 수 있는 경로(처리 4)

에 의해 얻어질 수 있음을 입증한다. 이론에 국한되기 바라지 않을 때, 이는 주로 효모 단편 및/또는 효모에 의해 생산되어 배지 중에 잔류하는 물질을 절지동물에게 제공할 것이다.

본원에 입증된 바와 같이, 이러한 처리 모두는 군락 발달에 대해 유사한 긍정적 효과를 보였으며, 그로 말미암아 대조군 처리시(즉 씨. 봄비필라 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질의 부재)에 비하여, 태어난 일벌 수의 증가를 동반하면서 더 빠른 발달을 초래하였다(도 11).

뿐만 아니라, 에그컵, 번데기 그리고 우화된 일벌의 첫 출현을 기록하기 위해 군락들을 대상으로 임의의 시점(5주차 및 10주차)에 행하여진 계수 결과에 대한 모니터링을 지속적으로 행하였다. 그 결과를 도 12에 도시하였는데, 이 도면은 (세포와 함께 아니면 세포 없이) 비활성화 씨. 봄비필라가 투여될 때, 더욱 빠른 일벌의 출현이 초래되는 것을 보여준다(도 12).

군락이 총 16주의 기간 동안 추가로 발달하도록 허용되었을 때, 모든 씨. 봄비필라 투여 처리는 태어난 일벌과 여왕벌의 수(암컷의 적응도 구성요소)에 유의미하게 긍정적인 효과를 보였다(도 13).

칸디다 봄비필라(세포, 단편, 생산된 물질)가 절지동물 행동(비행 활동)에 미치는 효과

벨기에 소재 Biobest NV에서 전술된 처리들을 조합 이용하여 5개의 잉여 군락을 별도로 사육하였다(N = 5*5 = 25개 군락, 실험 조건에 대해서는 표 1 참조). 하나의 "대조군" 처리의 경우와 하나의 "3일 후 비활성화시켜 여과한 cbh" 처리의 경우를 제외한 모든 경우에 완전한 브러드 발달을 진행시켰다. 일단 군락 중 일벌이 120마리를 초과하게 되었을 때, 모든 군락 발달 매개변수(브러드, 번데기, 일벌 등)를 평가하였으며, 그 다음 군락들을 벨기에 상트롱 소재 사과 과수원으로 옮겼다. 군락들을 2개 블록안에 넣은 다음, 과수원을 6개 열로 구분하여 각각의 열에 상기 블록들을 무작위로 가지고 가서, 블록 내부의 군락들을 풀어놓았다.

모든 군락의 등장은 동남쪽을 향하게 하였으며, 이때 벌집은 이른 봄의 저온 및 우천과 같은 조건에 대비하여 폴리스티렌 비 코트(bee coat)로 보호하였다. 본 발명자들은 5분이라는 기간 동안에 벌집을 비행하여 들어가는 일벌의 수와 비행하여 나오는 일벌의 수를 계수함으로써 비행 활동을 추적하였다. 이와 같은 5분 동안의 개체수 조사를 3가지의 상이한 시간대(이른 아침, 정오 및 오후)를 택하여 모든 군락에 대해 수행함으로써, 하루 동안의 전체 비행 활동을 조사하였다. 전반적으로, 군락들을 야외에 가져다 놓고 나서 2주(연속 주) 이내의 기간 중 불연속일 총 7일로 나누어 벌떼의 활동을 모니터링하였다.

군락들이 투입되고 나서 "3일 후 비활성화된" 씨. 봄비필라 처리가 된 군락들은, 다른 처리가 이루어진 군락들보다 더 많이 발달하였으므로, 본 발명자들은 일벌로 예측되는 개체(번데기 및 일벌)를 공변량으로서 통계학적 모델에 도입하여 군락 크기 측정기(colony sizer)상 차이에 대해 교정하였던 관계로, 크기 면에서 이상적으로 동등할 군락의 비행 활동을 평가하게 되었다. 군락의 전반적인 비행 활동(5분 동안의 개체수 조사당 비행하여 들어가는 벌과 비행하여 나오는 벌)은 시험 2주차가 더 활발하였는데, 이는 더 온화한 날씨 조건과 맞아떨어졌다. 주어진 모니터링 주간 동안, 본 발명자들은 일관되게, 2가지의 상이한 씨. 봄비필라 투여 처리들(즉 당 물에 존재하는 생세포 투여와 대조군 당 물에 존재하는 비활성화 세포 투여)이 유의미하게 더 활발한 군락의 야외 비행 활동을 초래하였음을 관찰하였다(도 14).

Claims (18)

1. 위커하미엘라 효모, 이의 단편 또는 이에 의해 생산되는 물질을 절지동물에 제공하는 단계를 포함하는, 절지동물을 사육하고/사육하거나 절지동물의 적응도를 개선하기 위한 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 위커하미엘라 효모는 위커하미엘라 봄비필라 효모인, 절지동물을 사육하기 위한 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 절지동물은 군락 형성 절지동물인, 절지동물을 사육하기 위한 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 방법은 절지동물 군락의 발달, 크기 및/또는 적응도를 개선하기 위한 방법인, 절지동물을 사육하기 위한 방법.
5. - 개화하는 결과성 작물을 제공하는 단계;
   - 수분매개 절지동물을 제공하는 단계[다만 상기 절지동물은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 사육된 것임];
   - 이 개화하는 작물의 수분매개 절지동물에 의한 수분을 보장하는 단계
   를 포함하는, 결과성 작물을 재배하기 위한 방법.
6. 위커하미엘라 효모, 바람직하게 위커하미엘라 봄비필라, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질의, 절지동물의 건강, 적응도 및/또는 행동을 개선 또는 향상시키기 위한 용도.
7. 제6항에 있어서, 절지동물의 면역 기능을 개선하기 위한 용도로서, 크리티디아 봄비와 같은 장내 기생체를 감소시키기 위한, 상기 위커하미엘라 효모, 바람직하게 위커하미엘라 봄비필라의 용도.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 절지동물은 수분매개 비행 곤충인 용도.
9. 제8항에 있어서, 비행 활동을 개선하기 위한 용도.
10. 당 물 및/또는 화분과, 위커하미엘라 효모, 바람직하게 위커하미엘라 봄비필라, 이의 단편 또는 이에 의해 생산된 물질을 포함하는 절지동물용 먹이 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 위커하미엘라 효모를 상기 먹이 조성물 1 μl 또는 1 μg당 적어도 100개의 세포만큼 포함하는 먹이 조성물.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 하기의 것들, 즉 탄수화물 원, 바람직하게 당, 또는 화밀이나 꿀, 또는 이의 대체물; 질소 원; 비타민; 지질 또는 지방; 무기질 중 하나 이상을 추가로 포함하는 먹이 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 탄수화물 원은 수크로스, 글루코스, 말토스, 덱스트로스, 프럭토스, 전화당, 옥수수 시럽 또는 글루코스 시럽, 그리고 이것들의 조합으로부터 선택되는 당인 먹이 조성물.
14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 의한 방법 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 용도로서, 상기 위커하미엘라 효모, 바람직하게 위커하미엘라 봄비필라는 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 의한 먹이 조성물 중에 포함되어 있는 방법 또는 용도.
15. BCCM/LMG 배양 수집소에 승인 번호 MUCL 56142로 기탁된 위커하미엘라 봄비필라 또는 칸디다 봄비필라, 또는 이의 변이체.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 의한 방법, 용도 또는 조성물로서, 상기 위커하미엘라 효모, 바람직하게 위커하미엘라 봄비필라는 제15항에 의한 균주 또는 이의 변이체인 방법, 용도 또는 조성물.
17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 의한 방법, 용도 또는 조성물로서, 상기 절지동물은 곤충, 바람직하게 히메노프테라인 방법, 용도 또는 조성물.
18. 제17항에 의한 방법, 용도 및/또는 먹이 조성물로서, 상기 히메노프테라는 아포크리타, 바람직하게 아포이데아, 더욱 바람직하게 벌 또는 호박벌인 방법, 용도 및/또는 먹이 조성물.

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