KR20190075071A

KR20190075071A - 프래그먼트 항체 및 당해 프래그먼트 항체를 이용하는 단백질의 결정화 방법

Info

Publication number: KR20190075071A
Application number: KR1020197011774A
Authority: KR
Inventors: 준이치 다카기
Original assignee: 후지필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤; 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2019-06-28
Also published as: WO2018088403A1; JP7205825B2; EP3539992A1; WO2018088403A8; US20190276561A1; EP3539992B1; CN110036035A; US10513562B2; JPWO2018088403A1; EP3539992A4

Abstract

본 발명은 항원 결합 활성을 갖는 것으로서 간편하게 제조할 수 있는 것이며, 대장균 발현계에서 얻어지는 것이어도, Fv-clasp(v1)보다 그 자체 및 항원 분자와의 복합체의 결정화능이 높은, 프래그먼트 항체의 제공을 과제로 한다
본 발명은 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, VH 영역이 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VH(112C)-SARAH)와, 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, SARAH 도메인이 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 것인 펩타이드(VL-SARAH(37C))와의 복합체로 이루어지는 프래그먼트 항체에 관한 것이다.

Description

프래그먼트 항체 및 당해 프래그먼트 항체를 이용하는 단백질의 결정화 방법

본 발명은 프래그먼트 항체, 및 당해 프래그먼트 항체를 이용하는 단백질의 결정화 방법에 관한 것이다.

IgG를 비롯한 항체 분자는, 항원 분자에 결합하는 성질로부터, 연구나 치료, 진단의 분야에 있어서 이제 빼놓을 수 없는 도구가 되고 있다. 항체 분자는 일반적으로 분자량이 큰 멀티 도메인의 당단백질이며, 분자 내에 복수의 다이설파이드 결합(이하, S-S 결합이라고 약기하는 경우가 있음)이 있기 때문에, 동물 세포를 이용하여 발현시킬 필요가 있다. 그러나, 동물 세포를 이용한 단백질의 생산은, 박테리아를 이용한 생산에 비하여 일반적으로 비용이 많이 들고, 리콤비넌트(recombinant)의 항체 분자는 발현이 나쁜 경우가 많기 때문에, 생산성이 낮다는 문제가 있다.

상기의 항체 분자의 생산에 있어서의 문제점을 보완할 수 있도록, 분자량이 작은 프래그먼트 항체의 사용이 고안되고 있다. 프래그먼트 항체는, 조직 침윤성이 높은 등의 메리트가 있다.

대표적인 프래그먼트 항체로서는, variable 도메인(VH 영역 및 VL 영역)과 constant 도메인(CH1 영역 및 CL 영역)으로 구성되는 Fab를 들 수 있다. 그러나, Fab는 일반적으로 전장 항체를 정제 후, 그것을 효소 처리한 후 추가적인 정제를 거쳐 얻는 것이 통례이기 때문에, 생산 비용이 높다는 문제가 있다. 또, 다른 프래그먼트 항체로서는, VH 영역 또는 VL 영역의 C 말단과 다른 한쪽의 N 말단을 길고 플렉시블한 펩타이드 링커로 결합시킨 single-chain Fv(이하, scFv라고 약기하는 경우가 있음)가 알려져 있다(비특허문헌 1). 그러나, 길고 플렉시블한 펩타이드 링커가 있음으로써, scFv끼리의 응집이 발생하는 경우가 있었다. 또, 항체로서의 활성이 저하되거나, 불안정화되거나 하는 등의 문제도 있었다.

그래서, 본 발명자들은 종래의 프래그먼트 항체가 갖는 문제점을 해결하기 위하여, VH 영역 및 VL 영역의 C 말단끼리를, 역평행의 코일드 코일(coiled-coil)을 형성하는 인간 Mammalian sterile 20-like kinase 1(Mst1)의 SARAH 도메인의 다이머를 통하여 결합시킨 새로운 프래그먼트 항체(이하, Fv-clasp 제1 세대, 또는 Fv-clasp(v1)이라고 약기하는 경우가 있음)를 개발했다(비특허문헌 2).

이 Fv-clasp(v1)은, (a) 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 인간 Mst1의 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, 당해 인간 Mst1의 SARAH 도메인의 N 말단으로부터 35번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드와, (b) 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 인간 Mst1의 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, 당해 인간 Mst1의 SARAH 도메인의 N 말단으로부터 24번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드와의 복합체로 이루어지는 프래그먼트 항체로서, (c) 2개의 SARAH 도메인이, 변이시킨 시스테인 간의 다이설파이드 결합에 의하여 결합하고 있는 프래그먼트 항체이다.

비특허문헌 1: Robert E. Bird, 1988, Science, James S. Huston, 1988, PNAS 비특허문헌 2: 아리모리 다카오, 마치다 시오리, 후지이 유키, 기타고 유, 다카기 준이치, 신규 프래그먼트 항체 포맷 "Fv-clasp"의 디자인과 그 구조 해석, 제15회 일본 단백질 과학회 연회, 헤이세이 27년 6월 25일 비특허문헌 3: Chothia and Lesk, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol., 196, 901-917(1987) 비특허문헌 4: Al-Lazikani, B., Lesk, A. M. ＆ Chothia, C. (1997). Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 273, 927-948

본 발명자들은, 다양한 목적 항원 분자에 대한 Fv-clasp(v1)에 대하여, 동물 세포 또는 대장균을 이용한 유전자 재조합에 의한 발현, 정제, Fv-clasp(v1)의 결정화 및 Fv-clasp(v1)과 목적 항원 분자와의 복합체의 결정화를 시도했다. 그 결과, 특히 대장균 발현계에서 얻어지는 Fv-clasp(v1)에 있어서, Fv-clasp(v1)과 목적 항원 분자와의 복합체의 결정이 얻어지지 않는 경우나, 분해능이 낮은 결정밖에 얻어지지 않는 경우가 있는 것을 알 수 있었다.

그래서, 본 발명은 항원 결합 활성을 갖는 것으로서 간편하게 제조할 수 있고, 대장균 발현계에서 얻어지는 것이어도, Fv-clasp(v1)보다, 그 자체 및 항원 분자와의 복합체의 결정화능이 높은, 프래그먼트 항체의 제공을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위하여, (a) 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 인간 Mst1의 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드(이하, VH-SARAH라고 약기하는 경우가 있음) 중의 VH 영역에 시스테인의 변이를 넣은 펩타이드와, (b) 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 인간 Mst1의 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드(이하, VL-SARAH라고 약기하는 경우가 있음) 중의 SARAH 도메인에 시스테인의 변이를 넣은 펩타이드와의 복합체로 이루어지는 복수의 프래그먼트 항체에 대하여, 당해 프래그먼트 항체와 항원 분자와의 복합체의 결정화를 예의 연구했다.

그 결과, (a) 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, VH 영역이 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(이하, VH(112C)-SARAH라고 약기하는 경우가 있음)와, (b) 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(이하, VL-SARAH(37C)라고 약기하는 경우가 있음)와의 복합체로 이루어지는 프래그먼트 항체로서, (c) VH(112C)-SARAH와 VL-SARAH(37C)가, 상기 2개의 시스테인 간의 다이설파이드 결합에 의하여 결합하고 있는 프래그먼트 항체(이하, Fv-clasp 제2 세대, 또는 Fv-clasp(v2)라고 약기하는 경우가 있음)를 이용하면, 대장균 발현계에서 얻어진 Fv-clasp(v2)여도, 그 자체나 Fv-clasp(v2)와 항원 분자와의 복합체에 대한 결정화능을 갖는 것을 발견했다.

또한, Fv-clasp(v2)는, 결정화 조건의 최적화를 행하기 전의 스크리닝 단계로부터, Fv-clasp(v2)와 항원 분자의 복합체에 대하여 고분해능의 결정이 얻어지는 것도 발견했다. 또, 난결정화(難結晶化) 단백질의 결정화가 촉진된 점에서, Fv-clasp(v2)는 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체로서 작용하는 것도 발견했다. 또한, Fv-clasp(v2)는, Fv-clasp(v1)이나 scFv와 비교하여 열안정성이 높은 것을 발견하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

본 발명은 이하의 프래그먼트 항체, 및 당해 프래그먼트 항체를 이용하는 단백질의 결정화 방법에 관한 것이다.

[1] (a) 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, VH 영역이 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VH(112C)-SARAH)와, (b) 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, SARAH 도메인이 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VL-SARAH(37C))와의 복합체로 이루어지는 프래그먼트 항체로서, (c) VH(112C)-SARAH와 VL-SARAH(37C)가, 상기 2개의 시스테인 간의 다이설파이드 결합에 의하여 결합하고 있는 프래그먼트 항체.

[2] 상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 1~8로 나타나는 것으로부터 선택되는 것(배열 번호 1~8로 나타나는 것)이며, 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 9~16으로 나타나는 것인, [1]에 기재된 프래그먼트 항체.

[3] 상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 1~2로 나타나는 것이며, 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 9~10으로 나타나는 것인, [1]에 기재된 프래그먼트 항체.

[4] (a) 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, VH 영역이 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VH(112C)-SARAH)와, (b) 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, SARAH 도메인이 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VL-SARAH(37C))와의 복합체로 이루어지는 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체로서, (c) VH(112C)-SARAH와 VL-SARAH(37C)가, 상기 2개의 시스테인 간의 다이설파이드 결합에 의하여 결합하고 있는 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체.

[5] 상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 1~8로 나타나는 것이며, 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 9~16으로 나타나는 것인, [4]에 기재된 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체.

[6] 상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 1~2로 나타나는 것이며, 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 9~10으로 나타나는 것인, [4]에 기재된 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체.

[7] 상기 [1] 내지 [3]으로 나타나는 프래그먼트 항체를 이용하는, 단백질의 결정화 방법.

[1] 본 발명의 프래그먼트 항체는, 간편하게 제조할 수 있고, 또한 항원 결합 활성을 갖는다.

[2] 본 발명의 프래그먼트 항체는, 대장균 발현계에서 얻어지는 것이어도, 그 자체 및 항원 분자와의 복합체의 결정화능이 높다. 이로써, 본 발명의 프래그먼트 항체는, 종래의 프래그먼트 항체나 항체에서는 곤란했던 항원 결정 부위의 입체 구조 해석을 용이하게 할 수 있다.

[3] 또한, 본 발명의 프래그먼트 항체는, 단백질, 특히, 난결정화 단백질과의 복합체의 결정화를 촉진하여, 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체로서 작용한다. 또, 본 발명의 프래그먼트 항체에 의하면, 단백질과의 복합체와의 결정이 단기간에 양호한 재현성이 얻어진다.

[4] 본 발명의 프래그먼트 항체는, 종래의 항체나 프래그먼트 항체보다 내열성이 높고, 보다 안정적인 프래그먼트 항체이다.

도 1은, 비교예 1에서 SDS-PAGE에 의하여 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)이 얻어진 것을 확인한 도이다.
도 2는, 비교예 2에서 SDS-PAGE에 의하여 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)이 얻어진 것을 확인한 도이다.
도 3은, 비교예 3에서 SDS-PAGE에 의하여 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)이 얻어진 것을 확인한 도이다.
도 4는, 비교예 5에서 행한 P20.1 항체의 Fv-clasp(v1)과 C8 펩타이드와의 복합체의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.
도 5는, 비교예 6에서 행한 12CA5 항체의 Fv-clasp(v1)과 HA 펩타이드와의 복합체의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.
도 6은, 실험예 1에 있어서, 비교예 7-9 및 실시예 1에서 얻은, 2H5 항체의 Fv-clasp(S-S 없음), 2H5 항체의 Fv-clasp(v1'), 2H5 항체의 Fv-clasp(v1''), 및 2H5 항체의 Fv-clasp(v2)의 S-S 결합 형성능을 SDS-PAGE에 의하여 확인한 도이다.
도 7은, 실시예 2에서 SDS-PAGE에 의하여 P20.1 항체-Fv-clasp(v2)가 얻어진 것을 확인한 도이다.
도 8은, 실시예 3-10에서 SDS-PAGE에 의하여 각종 Fv-clasp(v2)가 얻어진 것을 확인한 도이다.
도 9는, 실험예 2에서 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 각종 Fv-clasp(v2)가 항원 결합 활성을 갖는 것을 확인한 도이다.
도 10은, 실험예 2에서 바이오 레이어 간섭법에 의하여 각종 Fv-clasp(v2)가 항원 결합 활성을 갖는 것을 확인한 도이다.
도 11에 있어서, 도 11(A)는, 실시예 11에서 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)에 대하여 얻어진 결정의 현미경 사진이다. 도 11(B)는, 실시예 11에서 행한 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.
도 12에 있어서, 도 12(A)는, 실시예 12에서 P20.1 항체-Fv-clasp(v2)와 항원 분자의 복합체에 대하여 얻어진 결정의 현미경 사진이다. 도 12(B)는, 실시예 12에서 행한 P20.1 항체-Fv-clasp(v2)와 항원 분자의 복합체의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.
도 13에 있어서, 도 13(A)는, 실시예 13에서 12CA5 항체-Fv-clasp(v2)와 항원 분자의 복합체에 대하여 얻어진 결정의 현미경 사진이다. 도 13(B)는, 실시예 13에서 행한 12CA5 항체-Fv-clasp(v2)와 항원 분자의 복합체의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.
도 14에 있어서, 도 14(A)는, 실시예 14에서 NZ-1 항체-Fv-clasp(v2)와 항원 분자의 복합체에 대하여 얻어진 결정의 현미경 사진이다. 도 14(B)는, 실시예 14에서 행한 NZ-1 항체-Fv-clasp(v2)와 항원 분자의 복합체의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.
도 15에 있어서, 도 15(A) 및 (B)는, 실시예 15에서 93201 항체-Fv-clasp(v2)와 Vps10p의 복합체에 대하여 얻어진 결정의 현미경 사진이다. 도 15(C)는, 실시예 15에서 행한 93201 항체-Fv-clasp(v2)와 Vps10p의 복합체의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.
도 16에 있어서, 도 16(A) 및 (B)는, 실시예 16에서 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)와 인테그린 α6β1의 복합체에 대하여 얻어진 결정의 현미경 사진이다. 도 16(C)는, 실시예 16에서 행한 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)와 인테그린 α6β1의 복합체의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.
도 17에 있어서, 도 17(A)는, 실시예 17에서 t1E4 항체-Fv-clasp(v2)와 HGF의 복합체에 대하여 얻어진 결정의 현미경 사진이다. 도 17(B)는, 실시예 17에서 행한 t1E4 항체-Fv-clasp(v2)와 HGF의 복합체의 X선 결정 구조 해석의 결과이다.

본 발명의 프래그먼트 항체는,

(a) 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, VH 영역에 있어서 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VH(112C)-SARAH)와,

(b) 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VL-SARAH(37C))와의 복합체로 이루어지는 프래그먼트 항체로서,

(c) VH(112C)-SARAH와 VL-SARAH(37C)가, 상기 2개의 시스테인 간의 다이설파이드 결합에 의하여 결합하고 있는 프래그먼트 항체이다.

또한, 비특허문헌 3 및 4는, Chothia법에 의한 항체 잔기 번호의 결정법에 관한 문헌이다.

[VH(112C)-SARAH]

SARAH 도메인은, N 말단 측의 짧은 헬릭스 (h1)과 C 말단 측의 긴 헬릭스 (h2)에 의하여 구성되는 통상 42~54개, 바람직하게는 43~49개, 보다 바람직하게는 47~49개, 특히 바람직하게는 49개의 아미노산 잔기로 이루어지는 도메인(펩타이드)이며, 다른 SARAH 도메인과, 각각의 h2 사이에서 역평행 코일드 코일을 형성하는 성질을 갖는 것이다. 또한, h1은 바람직하게는 5~7개, h2는 바람직하게는 38~42개의 아미노산 잔기로 이루어진다.

여기에서 이용되는 SARAH 도메인으로서는, 상기한 바와 같은 성질을 갖는 것이면 되고, 그 중에서도 2개의 SARAH 도메인이 h2 사이에서 역평행 코일드 코일을 형성할 때에, 2개의 SARAH 도메인의(2개의 h1의) 양 N 말단의 사이의 거리가 35Å~45Å이 되는 것이 바람직하고, 39Å~41Å이 되는 것이 보다 바람직하며, 40Å이 되는 것이 특히 바람직하다.

이와 같은 SARAH 도메인으로서는, 구체적으로는, 예를 들면 인간 Mammalian sterile 20-like kinase 1(Mst1)의 SARAH 도메인, 인간 Mammalian sterile 20-like kinase 2(Mst2)의 SARAH 도메인, 초파리의 Hippo의 SARAH 도메인, 초파리 RASSF의 SARAH 도메인, 인간 RASSF5의 SARAH 도메인, 인간 RASSF1의 SARAH 도메인, 인간 WW45의 SARAH 도메인, 초파리 Sav의 SARAH 도메인 등을 들 수 있으며, 또한 이들 중 하나(바람직하게는 인간 Mst1의 SARAH 도메인)와 통상 85% 이상의 배열 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 배열 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 배열 상동성을 갖는 것 등을 들 수 있다.

보다 구체적으로는, 예를 들면 배열 번호 1로 나타나는 것(Mst1의 SARAH 도메인), 배열 번호 2로 나타나는 것(Mst2의 SARAH 도메인), 배열 번호 3으로 나타나는 것(Hippo의 SARAH 도메인), 배열 번호 4로 나타나는 것(RASSF의 SARAH 도메인), 배열 번호 5로 나타나는 것(RASSF5의 SARAH 도메인), 배열 번호 6으로 나타나는 것(RASSF1의 SARAH 도메인), 배열 번호 7로 나타나는 것(WW45의 SARAH 도메인), 배열 번호 8로 나타나는 것(Sav의 SARAH 도메인) 등이 바람직하고, 배열 번호 1~2로 나타나는 것이 보다 바람직하며, 배열 번호 1로 나타나는 것이 특히 바람직하다. 또한, 상기한 성질을 갖는 것이면, 배열 번호 1~8로 나타나는 것은, 그 배열 중 하나 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 것이어도 된다. 여기에서, 몇 개란 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 2개 이하의 자연수를 나타낸다. 이와 같은 것으로서는, 예를 들면 배열 번호 1~8에 있어서, C 말단으로부터 26번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)되어 있는 것 등을 들 수 있다.

상기 SARAH 도메인은, 천연에 존재하는 단백질에서 유래하는 SARAH 도메인이어도, 천연에 존재하는 단백질에서 유래하는 SARAH 도메인을 기초로 인공적으로 디자인한 것이어도 어느 쪽이어도 된다.

천연에 존재하는 단백질에서 유래하는 SARAH 도메인은, 통상, 당해 단백질을 갖는 생물종에 상관없이, 본 발명의 프래그먼트 항체를 의약으로서 이용하는 경우에는, 항원성의 면에서, 실제 이용할 때에 투여하게 되는 동물과 동일한 생물종에서 유래하는 것이 바람직하다.

여기에서 이용되는 VH 영역으로서는, 적어도 특정 항원을 인식하여 특이적인 친화 결합성을 갖는 데에 충분한 부위를 갖고, 또한 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기가 시스테인인 것이다.

또한, 상기 시스테인의 위치는, Chothia법에 의하여 결정되는 위치이지만, 당해 아미노산 잔기와 동일한 위치이면, Chothia법 이외의 방법, 예를 들면 Kabat법, IMGT법에 의하여 정의한 것도 포함된다.

본 발명에 있어서의 VH 영역은, 구체적으로는, 목적으로 하는 항원 분자에 대한 항체의 중쇄에 있어서의 3개의 CDR1~3과 Chothia법에 의하여 결정되는 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기가 시스테인인 프레임워크 영역 (FR)4를 적어도 포함하는 것이며, 바람직하게는, 목적으로 하는 항원 분자에 대한 항체의 중쇄에 있어서의 3개의 CDR1~3과 FR1~3 및 Chothia법에 의하여 결정되는 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기가 시스테인인 FR4를 적어도 포함하는 것이다.

그 중에서도, Chothia법에 의하여 결정되는 항체 잔기 번호 1~112의 아미노산 배열 또는 항체 잔기 번호 1~113의 아미노산 배열로 이루어지는 것으로서, 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기가 시스테인인 것이 보다 바람직하고, Chothia법에 의하여 결정되는 항체 잔기 번호 1~113의 아미노산 배열로 이루어지는 것으로서, 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기가 시스테인인 것이 특히 바람직하다.

또한, CDR1~3은, Chothia법, Kabat법, IMGT법 또는 그 외의 방법에 따라, 혹은 이들을 종합적으로 고려하여 결정하면 된다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH는, 상기의 VH 영역의 C 말단과 상기의 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 것이다. VH 영역과 SARAH 도메인은, 직접 결합하고 있어도 되고, 링커 배열을 통하여 결합하고 있어도 되지만, VH(112C)-SARAH의 발현 효율이나 리폴드 효율이 높은 점에서, 링커 배열을 통하는 쪽이 바람직하다. 링커 배열의 길이로서는, 통상 1~4 아미노산 잔기, 바람직하게는 2 아미노산 잔기이다. 링커 배열로서는, 본 발명의 프래그먼트 항체의 성질에 악영향을 미치지 않는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 Gly-Ser, Gly-Gly, Ser-Ser 등을 들 수 있다.

이하에 본 발명의 VH(112C)-SARAH를 모식적으로 나타낸다.

(X는 아미노산 잔기, m은 0~4의 정수, -[X]m-은 링커 배열을 각각 나타낸다.)

[VL-SARAH(37C)]

여기에서 이용되는 SARAH 도메인은, N 말단 측의 짧은 헬릭스 (h1)과 C 말단 측의 긴 헬릭스 (h2)에 의하여 구성되는 통상 42~54개, 바람직하게는 43~49개, 보다 바람직하게는 47~49개, 특히 바람직하게는 49개의 아미노산 잔기로 이루어지는 도메인(펩타이드)이며, 다른 SARAH 도메인과, 각각의 h2 사이에서 역평행 코일드 코일을 형성하는 성질을 갖는 것이고, 또한 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인인 것이다. 또한, h1은 바람직하게는 5~7개, h2는 바람직하게는 38~42개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 그 중에서도 2개의 SARAH 도메인이 h2 사이에서 역평행 코일드 코일을 형성할 때에, 2개의 SARAH 도메인의(2개의 h1의) 양 N 말단의 사이의 거리가 35Å~45Å이 되는 것이 바람직하고, 39Å~41Å이 되는 것이 보다 바람직하며, 40Å이 되는 것이 특히 바람직하다

이와 같은 SARAH 도메인으로서는, 상기의 본 발명의 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것을 들 수 있다.

구체적으로는 예를 들면 인간 Mammalian sterile 20-like kinase 1(Mst1)의 SARAH 도메인, 인간 Mammalian sterile 20-like kinase 2(Mst2)의 SARAH 도메인, 초파리의 Hippo의 SARAH 도메인, 초파리 RASSF의 SARAH 도메인, 인간 RASSF5의 SARAH 도메인, 인간 RASSF1의 SARAH 도메인, 인간 WW45의 SARAH 도메인, 초파리 Sav의 SARAH 도메인 등을 들 수 있으며, 또한 이들 중 하나(바람직하게는 인간 Mst1의 SARAH 도메인)와 통상 85% 이상의 배열 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 배열 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 배열 상동성을 갖고, 또한 그 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것 등을 들 수 있다.

보다 구체적으로는, 예를 들면 배열 번호 9로 나타나는 것(Mst1의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것), 배열 번호 10으로 나타나는 것(Mst2의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것), 배열 번호 11로 나타나는 것(Hippo의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것), 배열 번호 12로 나타나는 것(RASSF의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것), 배열 번호 13으로 나타나는 것(RASSF5의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것), 배열 번호 14로 나타나는 것(RASSF1의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것), 배열 번호 15로 나타나는 것(WW45의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것), 배열 번호 16으로 나타나는 것(Sav의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)된 것) 등이 바람직하고, 배열 번호 9~10으로 나타나는 것이 보다 바람직하며, 배열 번호 9로 나타나는 것이 특히 바람직하다. 또한, 상기의 성질을 갖는 것이면, 배열 번호 9~16으로 나타나는 것은, 그 배열 중 하나 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 것이어도 된다. 여기에서, 몇 개란 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 2개 이하의 자연수를 나타낸다. 이와 같은 것으로서는, 예를 들면 배열 번호 9~16에 있어서, C 말단으로부터 26번째의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환(변이)되어 있는 것 등을 들 수 있다.

또, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인은, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인과 동일한 SARAH 도메인에서 유래하는 것이어도 되고, 다른 SARAH 도메인에서 유래하는 것이어도 되며, 역평행 코일드 코일을 형성하기 쉬운 것이면, 그 동일성은 상관없다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인과 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인과의 구체적인 바람직한 조합으로서는, 배열 번호 1로 나타나는 것과 배열 번호 13으로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 5로 나타나는 것과 배열 번호 9로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 1로 나타나는 것과 배열 번호 9로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 2로 나타나는 것과 배열 번호 10으로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 3으로 나타나는 것과 배열 번호 11로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 4로 나타나는 것과 배열 번호 12로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 5로 나타나는 것과 배열 번호 13으로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 6으로 나타나는 것과 배열 번호 14로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 7로 나타나는 것과 배열 번호 15로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 8로 나타나는 것과 배열 번호 16으로 나타나는 것과의 조합이 바람직하고, 배열 번호 1로 나타나는 것과 배열 번호 9로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 2로 나타나는 것과 배열 번호 10으로 나타나는 것과의 조합, 배열 번호 1로 나타나는 것과 배열 번호 13으로 나타나는 것, 배열 번호 5로 나타나는 것과 배열 번호 9로 나타나는 것과의 조합이 보다 바람직하다. 상기 배열 번호 1~16으로 나타나는 것은, 그 배열 중 하나 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 것이어도 된다. 여기에서, 몇 개란 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 2개 이하의 자연수를 나타낸다.

본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인은, 천연에 존재하는 단백질에서 유래하는 SARAH 도메인이어도, 천연에 존재하는 단백질에서 유래하는 SARAH 도메인을 기초로 인공적으로 디자인한 것이어도 어느 쪽이어도 된다.

본 발명에 있어서의 VL 영역으로서는, 적어도 특정 영역의 항원을 인식하여 특이적인 친화성을 갖는 데에 충분한 부위를 포함하고 있으면 되고, 예를 들면 목적으로 하는 항원 분자에 대한 항체의 경쇄에 있어서의 3개의 CDR1~3을 적어도 포함하는 것, 바람직하게는 목적으로 하는 항원 분자에 대한 항체의 경쇄에 있어서의 3개의 CDR1~3과 FR1~4를 적어도 포함하는 것을 들 수 있다.

그 중에서도, Chothia법에 의하여 결정되는 항체 잔기 번호 1~107의 아미노산 배열로 이루어지는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 VL-SARAH(37C)는, 상기의 VL 영역의 C 말단과 상기의 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 것이다. VL 영역과 SARAH 도메인은, 직접 결합하고 있어도 되고, 링커 배열을 통하여 결합하고 있어도 되지만, VL-SARAH(37C)의 발현 효율이나 리폴드 효율이 높은 점에서, 링커 배열을 통하여 결합하고 있는 쪽이 바람직하다. 링커 배열의 길이로서는, 통상 1~4 아미노산 잔기, 바람직하게는 2 아미노산 잔기이다. 링커 배열로서는, 본 발명의 프래그먼트 항체의 성질에 악영향을 미치지 않는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 Gly-Ser, Gly-Gly, Ser-Ser 등을 들 수 있다.

이하에 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 모식적으로 나타낸다.

(Y는 아미노산 잔기, l는 0~4의 정수, -[Y]l-은 링커 배열을 각각 나타낸다.)

[프래그먼트 항체]

본 발명의 프래그먼트 항체는, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH와 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)와의 복합체로 이루어지는 것이다.

보다 구체적으로는, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인의 h2와 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인의 h2가, 역평행의 코일드 코일을 형성함으로써 결합하고 있고, 또한 VH(112C)-SARAH에 있어서의 VH 영역의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 시스테인 잔기와 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합에 의하여 결합하고 있는 것이다.

본 발명의 프래그먼트 항체는, 이와 같은 특수한 결합 양식에 의하여 결합하고 있기 때문에, 항원 결합 활성을 갖고 있을 뿐만 아니라, Fv-clasp(v1)보다 내열성이 높고 안정적이며, 또 대장균 발현계에서 얻어지는 것이어도, Fv-clasp(v1)보다, 그 자체 및 항원 분자와의 복합체의 결정화능이 높다. 이로써, 본 발명의 프래그먼트 항체는, 종래의 프래그먼트 항체나 항체에서는 곤란했던 항원 결정 부위의 입체 구조 해석을 용이하게 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 프래그먼트 항체는, 당해 특수한 결합 양식에 의하여 결합하고 있기 때문에, 단백질, 특히, 난결정화 단백질과의 복합체의 결정화를 촉진하는 기능을 갖고 있어, 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체로서 특히 유용하다.

또한, 본 명세서에 있어서 "결정화능이 높다"란, 본 발명의 프래그먼트 항체를 이용하여 그 자체 또는 항원 분자와의 복합체의 결정화를 행한 경우에 있어서, 고분해능의 결정이 얻어지거나, 또는/및 이른바 스크리닝 단계에 있어서 보다 많은 결정이 얻어지는 것을 의미한다.

이하에 본 발명의 프래그먼트 항체를 모식적으로 나타낸다.

(도 중, X, Y, l, 및 m은 상기와 동일)

[본 발명의 프래그먼트 항체의 조제 방법]

본 발명의 프래그먼트 항체는, 그 아미노산 배열에 따라, 일반적인 화학적 제법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 플루오렌일메틸옥시카보닐법(Fmoc법), t-뷰틸옥시카보닐법(tBoc법) 등의 통상의 화학적 제법(화학 합성법)에 의하여, 본 발명의 프래그먼트 항체를 얻을 수 있다. 또, 시판 중인 펩타이드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

또한, 본 발명의 프래그먼트 항체는, 본 발명의 프래그먼트 항체를 코딩하는 핵산 분자를 적절한 플라스미드나 파지 등의 발현 벡터에 삽입하여, 숙주 세포를 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질 전환(또는 형질 도입)시키고, 얻어진 숙주 세포를 증폭시켜, 세포 내 또는 세포 밖으로 분비시키는 유전자 재조합 기술을 이용한 주지의 방법으로도 얻을 수 있다.

본 발명의 프래그먼트 항체의 조제 방법에 대하여, 유전자 재조합 기술에 의하여 조제하는 경우, 예를 들면 이하의 공정에 따라 조제하는 방법을 들 수 있다.

(1) 유전자 재조합·발현 공정

(2) 정제 공정

요약하면, (1) 유전자 재조합·발현 공정 후, 가용화(可溶化) 공정, 리폴딩 공정, 농축 공정 등을 행해도 된다.

[(1) 유전자 재조합·발현 공정]

(1) 유전자 재조합·발현 공정은, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터(이하, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터라고 약기하는 경우가 있음), 또는 본 발명에 관한 상기 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터(이하, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 발현용 재조합 벡터라고 약기하는 경우가 있음)를 숙주에 유전자 도입하고, 유전자 도입을 행한 숙주를 배양함으로써, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 포함하는, 조추출액(粗抽出液), 배양액(배양 상청) 또는 침전을 조제하는 공정이다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열은, 적어도 상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 VH 영역을 코딩하는 핵산 배열의 3' 말단과 상기 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열의 5' 말단이 결합한 핵산 배열을 갖고 있으면 되고, 스타트 코돈, 스톱 코돈, 링커 배열을 코딩하는 핵산 배열, 및 태그를 코딩하는 배열 등 유전자 공학의 분야에 있어서 단백질의 조제를 위하여 이용되는 핵산 배열 등을 포함하고 있어도 된다.

상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 VH 영역을 코딩하는 핵산 배열과 상기 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열은, 직접 결합하고 있어도 되고, 링커 배열을 통하여 결합하고 있어도 되지만, VH(112C)-SARAH의 발현 효율이나 리폴드 효율이 높은 점에서, 링커 배열을 통하여 결합하고 있는 쪽이 바람직하다.

링커 배열을 코딩하는 핵산 배열의 길이로서는, 통상 3~12염기, 바람직하게는 6염기이다. 링커 배열을 코딩하는 핵산 배열로서는, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 및 본 발명의 프래그먼트 항체의 성질에 악영향을 미치지 않는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 Gly-Ser을 코딩하는 핵산 배열, Gly-Gly를 코딩하는 핵산 배열, Ser-Ser을 코딩하는 핵산 배열 등을 들 수 있으며, Gly-Ser을 코딩하는 핵산 배열이 바람직하다.

본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열은, 적어도 상기 VL 영역을 코딩하는 핵산 배열의 3' 말단과 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열의 5' 말단이 결합한 핵산 배열을 갖고 있으면 되고, 스타트 코돈, 스톱 코돈, 링커 배열을 코딩하는 핵산 배열, 및 태그를 코딩하는 배열 등 유전자 공학의 분야에 있어서 단백질의 조제를 위하여 이용되는 핵산 배열 등을 포함하고 있어도 된다.

상기 VL 영역을 코딩하는 핵산 배열과 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 상기 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열은, 직접 결합하고 있어도 되고, 링커 배열을 통하여 결합하고 있어도 되지만, VL-SARAH(37C)의 발현 효율이나 리폴드 효율이 높은 점에서, 링커 배열을 통하여 결합하는 쪽이 바람직하다.

링커 배열을 코딩하는 핵산 배열의 길이로서는, 통상 3~12염기, 바람직하게는 6염기이다. 링커 배열을 코딩하는 핵산 배열로서는, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 및 본 발명의 프래그먼트 항체의 성질에 악영향을 미치지 않는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 Gly-Ser을 코딩하는 핵산 배열, Gly-Gly를 코딩하는 핵산 배열, Ser-Ser을 코딩하는 핵산 배열 등을 들 수 있으며, Gly-Ser을 코딩하는 핵산 배열이 바람직하다.

상기 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 발현용 재조합 벡터(이하, 당해 2개의 발현용 재조합 벡터를 아울러, 본 발명에 관한 발현용 재조합 벡터라고 약기하는 경우가 있음)는, 적어도 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터이며, 숙주 중에서 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 발현하고, 생산하는 기능을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터로서는, 예를 들면 상법의 클로닝 기술에 따라, 배열 번호 41, 배열 번호 45, 배열 번호 46, 배열 번호 47, 배열 번호 48, 배열 번호 49, 배열 번호 50, 배열 번호 51, 및 배열 번호 52 등의 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열을, 예를 들면 pET16b 벡터(Novagen사제), pcDNA3.1 벡터(써모 피셔 사이언티픽사제), pCAG-Neo 벡터(와코 준야쿠 고교(주)제) 등의 발현 벡터에 삽입한 벡터를 들 수 있다.

본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 발현용 재조합 벡터로서는, 예를 들면 상법의 클로닝 기술에 따라, 배열 번호 42, 배열 번호 53, 배열 번호 54, 배열 번호 55, 배열 번호 56, 배열 번호 57, 배열 번호 58, 배열 번호 59, 및 배열 번호 60 등의 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열을, 예를 들면 pET16b 벡터(Novagen사제), pcDNA3.1 벡터(써모 피셔 사이언티픽사제), pCAG-Neo 벡터(와코 준야쿠 고교(주)제) 등의 발현 벡터에 삽입한 벡터를 들 수 있다.

본 발명에 관한 발현용 재조합 벡터의 조제 방법으로서는, 최종적으로, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터가 얻어지는 방법이면, 유전자 재조합에 의한 발현용 재조합 벡터의 조제 방법에 관한 공지의 방법에 준하여 행하면 되고, 특별히 제한되지 않는다.

예를 들면, 발현 벡터에 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열을 유전자 도입하는 방법을 들 수 있다.

당해 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열은, 당해 핵산 배열의 전장을 한 번에 발현 벡터에 유전자 도입해도 되고, 복수 회로 나누어 유전자 도입해도 된다.

즉, 본 발명에 관한 발현용 재조합 벡터는, 미리 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열의 부분 배열, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열의 부분 배열을 도입한 발현용 재조합 벡터에, 추가로 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열의 나머지의 부분 배열, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열의 나머지의 부분 배열을 도입함으로써 얻어도 된다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열의 부분 배열, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열의 부분 배열과, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열의 나머지의 부분 배열, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열의 나머지의 부분 배열은, 최종적으로 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 발현하고, 생산하는 기능을 갖는 벡터가 얻어지면, 바탕이 되는 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열 중 어느 개소로 나눠도 된다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열의 부분 배열과 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열의 나머지의 부분 배열과의 조합으로서는, 예를 들면 [본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 VH 영역을 코딩하는 핵산 배열과, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 SARAH 도메인을 코딩하는 배열]의 조합, [본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 VH 영역 및 링커를 코딩하는 배열과, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열의 조합], [본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 VH 영역을 코딩하는 핵산 배열과, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 SARAH 도메인 및 링커를 코딩하는 배열]의 조합 등을 들 수 있다.

본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열의 부분 배열과 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열의 나머지의 부분 배열과의 조합으로서는, 예를 들면 [본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 VL 영역을 코딩하는 핵산 배열과 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열]의 조합, [본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 VL 영역을 코딩하는 핵산 배열과 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 SARAH 도메인 및 링커를 코딩하는 핵산 배열]의 조합, [본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 VL 영역 및 링커를 코딩하는 핵산 배열과 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열의 조합] 등을 들 수 있다.

즉, 본 발명에 관한 발현용 재조합 벡터의 조제에 있어서는, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열의 부분 배열, 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열의 부분 배열을 갖는 벡터(이하, 중간체 벡터라고 약기하는 경우가 있음)를 얻어도 되고, 예를 들면 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 SARAH 도메인 및 링커를 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 SARAH 도메인 및 링커를 코딩하는 핵산 배열을 갖는 벡터 등을 들 수 있다. 이들 중간체 벡터는, 링커를 코딩하는 핵산 배열 또는 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열의 상류에 NdeI, NcoI 등의 제한 효소 배열을 포함하고 있어도 된다.

발현 벡터로서는, 예를 들면 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 pET16b 벡터(Novagen사제), pET28b 벡터(Novagen사제), pcDNA3.1 벡터(써모 피셔 사이언티픽사제), pCAG-Neo 벡터(와코 준야쿠 고교(주)제), pTrcHis2 벡터, pcDNA3.1/myc-His 벡터(Invitrogen사제), pUC119(다카라 슈조사제), Pqe-tri(Qiagen사제), pET, pGEX, pMAL 등의 플라스미드 벡터, pMEI-5 DNA(다카라 슈조사제), pLVSI-CMV NEO Vector(다카라 슈조사제) 등의 바이러스 벡터를 들 수 있다. 또, 대장균 유래의 플라스미드(예를 들면 pTrc99A, pKK223, pET3a) 외에, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo, p3×FLAG-CMV-14, pCAT3, pcDNA3.1, pCMV 등도 들 수 있으며, 그 중에서도 pET16b 벡터(Novagen사제), pET28b 벡터(Novagen사제), 및 pcDNA3.1 벡터(써모 피셔 사이언티픽사제)가 바람직하다.

예를 들면, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터를 조제하는 경우, 상기한 바와 같은 발현 벡터에, 당해 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열 중의 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열, 요약하면 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열의 상류에 링커를 코딩하는 핵산 배열을 도입하여, 중간체 벡터를 얻는다. 얻어진 중간체 벡터에 있어서, 도입한 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열, 또는 링커를 코딩하는 핵산 배열의 상류에, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열 중의 VH 영역(예를 들면, 목적으로 하는 항원 분자에 대한 항체의 중쇄에 있어서의 3개의 CDR1~3, FR1~3, 및 Chothia법에 의하여 결정되는 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기가 시스테인인 FR4)을 코딩하는 핵산 배열을 도입함으로써, 각종 항원 분자에 대한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터를 용이하게 조제할 수 있다.

보다 구체적으로는, 링커 핵산 배열(예를 들면 Gly-Ser) 및 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열을 도입한 상기한 바와 같은 발현 벡터(중간체 벡터)를 조제해 두면, 당해 발현 벡터의 링커 핵산 배열 및 SARAH 도메인을 코딩하는 핵산 배열의 상류에, 원하는 VH 영역 부분(예를 들면, 목적으로 하는 항원 분자에 대한 항체의 중쇄에 있어서의 3개의 CDR1~3과 FR1~3 및 Chothia법에 의하여 결정되는 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기가 시스테인인 FR4를 들 수 있음)을 도입함으로써, 각종 항원 분자에 대한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터를 용이하게 조제할 수 있다.

또한, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 발현용 재조합 벡터는, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터와 동일하게 조제할 수 있다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 또는/및 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)는, 태그 펩타이드나 다른 단백질과의 융합 단백으로서 발현시켜도 된다. 융합시키는 태그 펩타이드로서는 FLAG 태그, 3X FLAG 태그, His 태그(His tag, 예를 들면 6×His 태그) 등을 들 수 있다.

이어서, 발현용 재조합 벡터를 이용하여, 적절한 숙주 세포를 형질 전환(형질 도입)함으로써, 형질 전환체를 조제한다.

숙주 세포로서는, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 또는/및 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 발현하고, 생산하는 기능을 갖는 것이면 어느 것이어도 되고, 예를 들면 대장균(Escherichia coli)이나 바칠루스속균(B. subtilis, B. brevis, B. borstelenis) 등의 원핵생물, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 등을 들 수 있으며, 대장균, 동물 세포가 바람직하고, 대장균, 포유류 세포가 보다 바람직하며, 대장균이 특히 바람직하다. 포유류 세포로서는, 예를 들면 Expi293F 세포, HEK293T 세포, COS-7 세포, CHO-K1 세포, CHO-S 세포 등을 들 수 있다. 대장균으로서는, 예를 들면 BL21(DE3), K-12, DH1, DH5, DH5α, M15, HB101, C600, XL-1 Blue, JM109, JM105, JM127, XL1-Blue, VCS257, TOP10 등을 들 수 있다.

또, 플라스미드나 파지 DNA의 도입 효율이 보다 높은, 컴피텐트 셀(Competent Cell)을 이용해도 된다. 컴피텐트 셀로서는, 예를 들면 E. coli DH5α Competent Cell, E. coli JM109 Competent Cells(다카라 바이오사제) 등을 들 수 있다.

상기와 같이, 숙주 세포로서 대장균을 이용한 경우(이하, 대장균 발현계라고 약기하는 경우가 있음)에 의하여 얻어지는 Fv-clasp(v1)은, 항원 분자와의 복합체의 결정화능을 갖지 않는 것이 있고, 또 당해 결정화능을 갖는 경우여도, 결정화 조건의 최적화를 행하기 전의 이른바 스크리닝 단계에서는, 저분해능의 결정밖에 얻어지지 않는다.

한편, 본 발명의 프래그먼트 항체는, 대장균 발현계에서 조제한 경우여도, 본 발명의 프래그먼트 항체 자체나 특정 항원과의 복합체의 결정화능을 갖는 것이 얻어진다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터, 및 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 발현용 재조합 벡터는, 공발현시켜도 되고, 다른 숙주 세포에 발현시켜도 되며 어느 것이어도 되지만, 숙주 세포로서 대장균을 이용하는 경우에는, 다른 숙주 세포에 발현시키는 것이 바람직하고, 또 숙주 세포로서 동물 세포를 이용하는 경우에는, 공발현시키는 것이 바람직하다.

또한, 동물 세포에서 공발현시키는 경우에는, 본 발명의 프래그먼트 항체(본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH와 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)의 복합체)로서 발현되기 때문에 후술하는 리폴딩 공정은 불필요하지만, 다른 숙주 세포에 발현시키는 경우에는, 발현한 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH와 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 혼합 후, 후술하는 리폴딩 공정을 행할 필요가 있다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 발현용 재조합 벡터 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 발현용 재조합 벡터를 숙주 세포에 유전자 도입하는 방법으로서는, 예를 들면 "목적별로 선택할 수 있는 단백질 발현 프로토콜, 제3장 단백질 발현 프로토콜, ISBN978-4-7581-0175-2, 요도사" 등에 기재된 공지의 방법에 준하여 행하면 된다.

이어서, 형질 전환체를, 영양 배지 안에서 배양하여, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 또는 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 생성시킨다. 배양은 공지의 방법에 의하여 행해지고, 온도, 배지의 pH 및 배양 시간도 적절히 설정되면 된다.

숙주 세포가 대장균인 형질 전환체를 배양하는 경우는, 대장균을 배양하는 상법의 조건으로, 통상 이용되는 액체 배지에서 행하면 되고, 또 숙주 세포가 동물 세포인 형질 전환체를 배양하는 경우는, 동물 세포를 배양하는 상법의 조건으로, 통상 이용되는 액체 배지에서 행하면 된다. 또, 필요에 따라 예를 들면, 아이소프로필-β-D-싸이오갈락토피라노사이드(IPTG), 3β-인돌일아크릴산과 같은 약제를 첨가해도 된다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는, 배양액(배양 상청) 조추출액 또는 침전은, 상기 배양에 의하여 얻어지는 배양물로부터, 이하와 같이 하여 취득할 수 있다.

즉, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체가, 형질 전환체의 배양액 중에 분비되는 경우에는, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 배양액(배양 상청)을 얻는다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체가, 형질 전환체의 페리플라즘 또는 세포질 내에 존재하는 경우는, 여과 또는 원심 분리 등의 방법에 의하여 배양물로부터 균체 혹은 세포를 회수하여, 적절한 완충액에 재현탁한다. 그리고, 예를 들면 계면활성제 처리, 초음파 처리, 라이소자임 처리, 동결 융해 등의 방법으로, 회수된 세포 등의 세포벽 및/또는 세포막을 파괴한 후, 원심 분리나 여과 등의 방법으로, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 조추출액을 얻는다.

본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체가, 봉입체로서 발현하는 경우에는, 여과 또는 원심 분리 등의 방법에 의하여 배양물로부터 균체 혹은 세포를 회수하여, 적절한 완충액에 재현탁한다. 그리고, 예를 들면 계면활성제 처리, 초음파 처리, 라이소자임 처리, 동결 융해 등의 방법으로, 회수된 세포 등의 세포벽 및/또는 세포막을 파괴한 후, 원심 분리 등의 방법에 의하여, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 침전을 얻는다. 이 경우, 후술하는 가용화 공정을 행할 필요가 있다.

본 발명의 프래그먼트 항체의 조제 방법에 있어서는, 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정 후, 요약하면, 가용화 공정, 리폴딩 공정, 농축 공정 등을 행한다.

[가용화 공정]

가용화 공정은, 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체가 봉입체로서 발현한 경우에, 회수한 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 침전으로부터 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 가용화 방법을 이용하여, 이들을 함유하는 가용화제 용액을 얻는 공정이다.

가용화 방법은, 공지의 방법에 따르면 되고, 특별히 제한은 없다.

구체적으로는, 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 회수한 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 침전에, 가용화 용액을 첨가하여, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 또는 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 가용화제 용액을 얻으면 된다.

가용화 용액으로서는, 공정 (1)에서 얻어진 봉입체의 침전을 가용화하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 6M 염산 구아니딘이나 8M 요소 등을 포함하는 공지의 가용화 용액을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 6M 염산 구아니딘 가용화 용액[6M 염산 구아니딘, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl], 8M 요소 가용화 용액[8M Urea, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl] 등을 들 수 있다.

[리폴딩 공정]

리폴딩 공정은, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH, 및 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)를 다른 숙주에 발현시키는 경우에, 상기 가용화 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH의 가용화 용액, 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH의 조추출액, 또는 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH의 배양액(배양 상청) 중의 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH와,

상기 가용화 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)의 가용화 용액, 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)의 조추출액, 또는 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)의 배양액(배양 상청) 중의 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)와의 복합체를, 리폴딩 방법에 의하여 형성시키는 방법이다.

리폴딩 방법은, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH와 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)와의 복합체를 형성시킬 수 있으면, 공지의 방법에 따르면 되고, 특별히 제한은 없다.

구체적으로는, 상기 가용화 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH의 가용화 용액, 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH의 조추출액, 또는 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH의 배양액(배양 상청)과,

상기 가용화 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)의 가용화 용액, 상기 (1) 유전자 재조합 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)의 조추출액, 또는 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 얻어진 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)의 배양액(배양 상청)을 혼합하고, 얻어진 혼합액에 하나 또는 복수 종의 리폴딩 용액을 첨가하여, 본 발명의 프래그먼트 항체(본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH와 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 복합체)를 형성시켜, 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 리폴딩제 용액을 얻으면 된다.

리폴딩 용액으로서는, 예를 들면 리폴딩 용액 A[4M Urea, 0.4M L-Arg, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 375μM 산화형 글루타티온], 및 리폴딩 용액 B[0.4M L-Arg, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 375μM 산화형 글루타티온] 등을 들 수 있다.

[농축 공정]

농축 공정은, 상기 리폴딩 공정에서 얻어진 리폴딩제 용액을 농축하여, 농축액을 얻는 공정이다. 농축 공정은, 상기 리폴딩 공정 등에 의하여 단백질이 희석된 경우 등에 행하고, 이로써 그 후의 정제 공정을 용이하게 행할 수 있다.

농축 방법으로서는, 상기 리폴딩 공정에서 얻어진 리폴딩제 용액을 농축할 수 있는 방법이면 제한되지 않고, 예를 들면 염석법, 한외 여과법 등의 공지의 농축 방법을 들 수 있다.

[(2) 정제 공정]

정제 공정은, 상기 (1) 유전자 재조합·발현 공정에서 얻어진 배양액(배양 상청) 또는 조추출액, 혹은 농축 공정에서 얻어진 농축액으로부터, 본 발명의 프래그먼트 항체를 단리, 정제하는 공정이다.

본 발명의 프래그먼트 항체의 단리, 정제 방법으로서는, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 겔 여과 등 분자량의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

정제된 본 발명의 프래그먼트 항체는, 예를 들면 SDS-PAGE 등에 의하여 확인할 수 있다. 예를 들면, SDS-PAGE 등으로 분자량을 확인함으로써, 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH와 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C)가 헤테로다이머를 형성하여 올바른 입체 구조를 취하고 있는지, 즉 본 발명에 관한 VH(112C)-SARAH 중의 VH 영역에 있어서의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 시스테인 잔기와, 본 발명에 관한 VL-SARAH(37C) 중의 SARAH 도메인의 C 말단으로부터 13번째의 시스테인 잔기가 S-S 결합을 형성하고 있는지를 확인할 수 있다.

[단백질의 결정화 방법]

본 발명의 단백질의 결정화 방법은, 본 발명의 프래그먼트 항체의 존재하, 단백질(이하, 목적 단백질이라고 하는 경우가 있음)을 결정화하는 방법이다. 목적 단백질은, 본 발명의 프래그먼트 항체가 특이적으로 인식하는 단백질(항원)이다.

즉, 본 발명의 단백질의 결정화 방법은, 본 발명의 프래그먼트 항체의 존재하, 공지의 결정화 방법을 행하면 되고, 목적 단백질의 결정이 얻어지는 방법이면, 특별히 제한은 없다.

구체적인 결정화 방법으로서는, 예를 들면 배치(batch)법, 증기 확산법, 투석법, 자유 계면 확산법, 농축법, 광조사법, 진동법, 교반법 등을 들 수 있으며, 증기 확산법이 보다 바람직하다. 증기 확산법으로서는, 싯팅 드롭법, 행잉 드롭법, 샌드위치 드롭법 등을 들 수 있으며, 싯팅 드롭법이 보다 바람직하다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 단백질의 결정화 방법은, 이하의 공정을 포함한다.

(1) 목적 단백질을 함유하는 용액과 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 용액을 혼합하여, 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체와의 복합체를 형성시키는 공정(이하, 복합체 형성 공정이라고 약기하는 경우가 있음)

(2) 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체와의 복합체의 결정을 얻는 공정(이하, 결정화 공정)

[복합체 형성 공정]

복합체 형성 공정은, 목적 단백질을 함유하는 용액과 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 용액을 혼합하여, 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체와의 복합체를 형성시킴으로써 행해진다.

목적 단백질을 함유시키는 용매로서는, 일반적으로 단백질의 결정화에 있어서 이용되는 것이면 특별히 제한은 없고, 예를 들면 순수한 물, 완충액, 침전제 용액, 계면활성제 용액, 알코올 용액, 유기 용매, 킬레이트제 용액, 환원제 용액, 동결 보호제 용액, 이온 액체 및 이들의 혼합 용액을 들 수 있으며, 순수한 물, 및 완충액이 바람직하다. 완충액의 pH는, 통상 한정되지 않지만, 예를 들면 pH 4~9, 바람직하게는 pH 5~8이다. 구체적으로는, 예를 들면 인산 완충 생리 식염수(PBS), HEPES 완충액, 붕산 완충액, 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 굳완충액 등을 들 수 있다. 또, 이들 완충액의 완충제 농도로서는, 통상 5~100mM, 바람직하게는 5~20mM의 범위로부터 적절히 선택된다.

본 발명의 프래그먼트 항체를 함유시키는 용매로서는, 상기 목적 단백질을 함유시키는 용매와 동일하고, 바람직한 구체예도 동일하다.

목적 단백질을 함유하는 용액에 있어서의 목적 단백질의 양, 및 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 용액에 있어서의 본 발명의 프래그먼트 항체의 양은, 목적 단백질을 함유하는 용액과 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 용액의 혼합액에 있어서, 목적 단백질의 몰 당량이 본 발명의 프래그먼트 항체의 몰 당량과 동등 이상이며, 또한 당해 혼합액에 있어서의 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체의 복합체의 농도가, 통상 2mg/mL~100mg/mL, 바람직하게는 5mg/mL~30mg/mL, 보다 바람직하게는 10mg/mL~20mg/mL가 되는 양을 이용하면 된다.

목적 단백질을 함유하는 용액 및 본 발명의 프래그먼트 항체를 함유하는 용액의 혼합액(이하, 결정화 시료라고 약기하는 경우가 있음)은, 요약하면, 한외 여과 장치 등의 공지의 방법으로 농축해도 된다.

[결정화 공정]

결정화 공정은, 자체 공지의 결정화 방법, 예를 들면 상기한 바와 같은 구체적인 결정화 방법에 의하여, 복합체 형성 공정에서 형성시킨 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체와의 복합체의 결정을 얻는 공정이다.

결정화 공정은, 구체적으로는, 예를 들면 이하와 같이 행하면 된다.

복합체 형성 공정에서 얻어진 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체와의 복합체를 함유하는 혼합액(결정화 시료)을 1조건당 통상 0.05μL~2μL, 바람직하게는 0.1μL~0.5μL와, 스크리닝 키트에 부속되는 스크리닝 키트 용액을 이것과 등량 혼합하여 드롭을 제작하고, 결정화 시료와 동일한 조성의 리저버(침전제 용액) 통상 50μL~1000μL, 바람직하게는 80μL~150μL의 존재하, 싯팅 드롭법에 의하여 결정화를 행하여, 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체와의 복합체의 결정을 얻는다.

또한, 요약하면, 결정화 공정에 의하여 얻어진 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체와의 복합체의 결정을, 검출하는 공정, X선 회절 장치에 의하여 분석하는 공정 등 공지의 수법을 이용함으로써, 목적 단백질과 본 발명의 프래그먼트 항체와의 복합체의 입체 구조를 해석할 수 있다.

본 발명의 단백질의 결정화 방법에 의하면, 본 발명의 프래그먼트 항체를 이용함으로써, 고분해능의 결정이 얻어지고, 또 이른바 스크리닝 단계에 있어서 보다 많은 결정이 얻어진다.

산업상 이용가능성

본 발명의 프래그먼트 항체는, 동물 세포계보다 취급이 용이한 대장균 발현계에서 조제한 경우여도, 항원 결합 활성, Fv-clasp(v1)보다 높은 결정화능, 단백질의 결정화를 촉진하는 성질 등을 갖는 점에서, 간편하게 제조할 수 있는 당해 성질을 갖는 프래그먼트 항체로서, 창약(創藥) 등 단백질의 결정화를 하는 분야에 있어서 유용하다. 또, 본 발명의 프래그먼트 항체는, 열내성을 갖고 있으며, 안정성이 높은 점에서, 항체 의약의 분야에 있어서 유용하다.

실시예

이하, 실시예 및 비교예에 근거하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 의하여 한정되지 않는다.

<비교예 1 대장균 발현계를 이용한 P20.1 항체의 Fv-clasp(v1)의 조제>

이하의 방법에 의하여, 배열 번호 17로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C)(이하, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C)라고 약기하는 경우가 있음), 및 배열 번호 18로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)(이하, P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)라고 약기하는 경우가 있음)를, (1) 유전자 재조합·발현 공정 및 가용화 공정, (2) 리폴딩 공정, (3) 농축 공정, 및 (4) 정제 공정을 이용하여, P20.1 항체에 대한 Fv-clasp(v1)(이하, P20.1 항체-Fv-clasp(v1)이라고 약기하는 경우가 있음)을 얻었다.

또한, 얻어진 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)은, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C)의 SARAH 도메인 중의 N 말단으로부터 35번째의 시스테인 잔기와, P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)의 SARAH 도메인 중의 N 말단으로부터 24번째의 시스테인 잔기가 S-S 결합을 형성하도록 디자인한 것이다.

(1) 유전자 재조합·발현 공정 및 가용화 공정

(1)-1: P20.1 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C)의 조제

배열 번호 19로 나타나는, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C)를 코딩하는 핵산 배열을, 상법에 따라, pET28b(+) 벡터(Novagen사제)의 NcoI/HindIII 제한 효소 사이트에 도입하여, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C) 발현용 재조합 벡터를 조제했다. 얻어진 P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C) 발현용 재조합 벡터를, 대장균 BL21(DE3)주(Novagen사제)에 도입했다. P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C) 발현용 재조합 벡터를 도입한 대장균 BL21(DE3)주를, 1L의 LB 배지를 이용하여 37℃에서 배양했다. OD=0.6 부근에서, 종농도가 0.4mM이 되도록 IPTG를 배지에 첨가하여 유도를 행했다. 배양 개시로부터 4시간 후에, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C) 발현용 재조합 벡터를 도입한 대장균 BL21(DE3)주(균체)를 회수했다.

회수한 균체 중, 배지 0.5L에서의 배양에서 얻어진 만큼의 당해 균체를, 20mL의 TBS(20mL Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl)에 현탁하여, 현탁액을 얻었다. 얻어진 현탁액에, 균체 파쇄용 시약[Peptstatin(종농도가 1μM), Leupeptin(종농도가 10μM), PMSF(종농도가 250μM) 및 TurboNuclease(Accelagen사제, 3μL)]을 첨가하여 혼합하고, 초음파 발생기(TOMY사제)를 이용하여 균체를 파쇄한 후, 원심 분리 처리(25000xg, 4℃, 20min)하며, 상청을 제거하여 침전을 얻었다. 얻어진 침전에, 6mL의 가용화 용액[6M 염산 구아니딘, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl)]을 첨가하고, 때때로 피펫팅을 하면서, 37℃에서 2시간 인큐베이트를 행했다. 이어서, 원심 분리 처리(25000xg, 4℃, 20min)를 행하여, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C)를 포함하는 상청을 회수했다.

(1)-2: P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)의 조제

배열 번호 20으로 나타나는, P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)를 코딩하는 핵산 배열을, 상법에 따라, pET16b 벡터(Novagen사제)의 NcoI/XhoI 제한 효소 사이트에 도입하여, P20.1 항체-VL-SARAH(M24C) 발현용 재조합 벡터를 조제했다. 얻어진 P20.1 항체-VL-SARAH(M24C) 발현용 재조합 벡터를, 대장균 BL21(DE3)주(Novagen사제)에 도입했다.

발현 벡터의 대장균으로의 도입 이후에는, 상기 (1)-1과 동일한 방법에 의하여, P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)를 조제하여, P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)를 포함하는 상청을 회수했다.

(2) 리폴딩 공정

상기 (1)-1에서 회수한 P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C)를 포함하는 상청과, 상기 (1)-2에서 회수한 P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)를 포함하는 상청을 혼합하여, 혼합액을 얻었다. 얻어진 혼합액을 0.45μm의 필터로 여과하고, 얻어진 여과액이 25배 희석이 되도록, 리폴딩 용액 A[4M Urea, 0.4M L-Arg, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 375μM 산화형 글루타티온]를, 교반하면서, 여과액에 첨가한 후, 4℃에서 4시간 인큐베이트했다. 얻어진 인큐베이트 후의 혼합액이 2배 희석이 되도록, 리폴딩 용액 B[0.4M L-Arg, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 375μM 산화형 글루타티온]를, 교반하면서, 여과액에 첨가한 후, 4℃에서 하룻밤(Overnight으로) 인큐베이트하여, 리폴딩이 완료된 항체 용액을 얻었다.

(3) 농축 공정

상기 (2)에서 얻어진 리폴딩이 완료된 항체 용액에, 80% 포화가 되도록 갈아서 으깬 유안(硫安)을 조금씩 첨가하여 유안 침전을 행한 후, 4℃에서 3시간 교반을 하면서 인큐베이트했다. 얻어진 인큐베이트 후의 용액을, 원심 분리 처리(12000xg, 4℃, 60min)하고, 상청을 제거하여 침전을 얻었다. 얻어진 침전에, 리폴딩 용액[상기 리폴딩 용액 A와 상기 리폴딩 용액 B를 1:1로 혼합한 용액]을 첨가하고 현탁하여, 현탁액을 얻었다. 얻어진 현탁액을, 상법에 따라, 1L의 투석 용액[50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl]을 이용하여, 1회당 4-16시간으로, 합계 3회 투석했다. 투석 후의 현탁액을 회수 후, 원심 분리 처리(25000xg, 4℃, 20min)하여, 상청을 회수했다. 얻어진 상청을, 상법에 따라, 한외 여과에 의하여 농축하여, 농축액을 얻었다.

(4) 정제 공정

상기 (3)에서 얻어진 농축액을, 상법에 따라, HiLoad 16/600 Superdex 200 pg(GE사제), 및 겔 여과 정제용 용출 버퍼[50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl]를 이용하여, 유속 1.0mL/min으로 겔 여과 정제를 행했다. 분자량 마커로부터 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)로 추정되는 위치에 단분산의 피크가 얻어진 점에서, 당해 피크의 용출액을 회수했다.

이어서, 겔 여과 정제로 회수한 용출액을, 상법에 따라, SDS-PAGE를 행했다. 그 결과, P20.1 항체-Fv-clasp(v1)의 밴드에 더하여, 불순물의 밴드도 확인되었다.

그래서, 겔 여과 정제로 회수한 용출액으로부터 불순물을 없애기 위하여, 배열 번호 21로 나타나는 당해 프래그먼트 항체의 항원 분자인 C8 펩타이드(PRGYPGQV)를 고정화한 CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow(GE사제), 평형화 버퍼[20mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl], 용출 버퍼[0.5mg/mL C8, 20mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl]를 이용하여 정제하여, 용출액을 회수했다.

회수한 용출액에 대하여, 상법에 따라, 환원 조건하 또는 비환원 조건하에서 각각 SDS-PAGE를 행했다.

결과를 도 1에 나타낸다. 도면 중, 좌측의 레인이 환원 조건하에서의 전기영동도, 우측의 레인이 비환원 조건하에서의 전기영동도이다. 환원 조건하에서는, 18kDa 부근에 P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C), 16kDa 부근에 P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)의 밴드가 얻어졌다. 또, 비환원 조건하에서는, 35kDa 부근에 밴드가 얻어졌다. P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C)와 P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)는, 양자가 올바르게 헤테로다이머를 형성했을 때에만 S-S 결합이 형성되도록 Cys 잔기의 도입 위치를 디자인하고 있기 때문에, 이러한 결과로부터, 쇄 간의 S-S 결합이 올바르게 형성된 헤테로다이머인 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)이 얻어진 것을 알 수 있었다.

<비교예 2 동물 세포 발현계를 이용한 P20.1 항체의 Fv-clasp(v1)의 조제>

이하의 방법에 의하여, 배열 번호 22로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C)(N 말단에 마우스 나이트로젠의 시그널 배열을 포함함), 및 배열 번호 24로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)(N 말단에 마우스 나이트로젠의 시그널 배열을 포함함)를, (1) 유전자 재조합 공정, (2) 동물 세포 발현계를 이용한 재조합 단백질 발현 공정, 및 (3) 정제 공정을 이용하여, P20.1 항체의 Fv-clasp(v1)(이하, P20.1 항체-Fv-clasp(v1)이라고 약기하는 경우가 있음)을 얻었다.

(1) 유전자 재조합 공정

배열 번호 23으로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C)를 코딩하는 핵산 배열(N 말단에 마우스 나이트로젠의 시그널 배열을 코딩하는 배열을 포함함)을, 상법에 따라, pcDNA3.1 벡터(써모 피셔 사이언티픽사제)의 HindIII/PmeI 제한 효소 사이트에 도입하여, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C) 발현용 재조합 벡터를 조제했다. 또, 배열 번호 23으로 나타나는 핵산 배열 대신에, 배열 번호 25로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)를 코딩하는 핵산 배열(N 말단에 마우스 나이트로젠의 시그널 배열을 코딩하는 배열을 포함함)을 사용하여, P20.1 항체-VL-SARAH(M24C) 발현용 재조합 벡터를 조제했다.

(2) 동물 세포 발현계를 이용한 재조합 단백질 발현 공정

Expi293F 세포(써모 피셔 사이언티픽사제)를, 600mL의 Expi293 Expression Medium(써모 피셔 사이언티픽사제)을 이용하여, 세포가 3x10⁶cells/mL가 되도록 파종했다. 그 후, 상법에 따라, ExpiFectamine293 Reagent(써모 피셔 사이언티픽사제)를 이용하여, 각 400μg의 P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C) 발현용 재조합 벡터 및 P20.1 항체-VL-SARAH(M24C) 발현용 재조합 벡터를, Expi293F 세포에 유전자 도입했다. 유전자 도입 후, 37℃, 8% CO₂조건하, 125rpm으로 유전자 도입한 Expi293F 세포를 18시간 진탕 배양했다. 그 후, ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 1 및 ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 2(써모 피셔 사이언티픽사제)를 각각 3mL, 30mL 첨가하고, 37℃, 8% CO₂ 조건하, 125rpm으로 3일간 진탕 배양하여, 배양 상청을 회수했다.

(3) 정제 공정

(2)에서 회수한 배양 상청을, 비교예 1과 동일한 수법으로 C8 펩타이드를 고정화한 CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow(GE사제)를 이용하여 정제했다. 이어서, 그 용출 획분을, 상법에 따라, Superdex 200 Icrease 10/300 GL(GE사제), 및 겔 여과 정제용 용출 버퍼[20mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl]를 이용하여, 유속 0.5mL/min으로 겔 여과 정제를 행했다. 분자량 마커로부터 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)로 추정되는 위치에 단분산의 피크가 얻어진 점에서, 당해 피크의 용출액을 회수했다.

결과를 도 2에 나타낸다. 도면 중, 좌측의 레인이 환원 조건하에서의 전기영동도, 우측의 레인이 비환원 조건하에서의 전기영동도이다. 환원 조건하에서는, 18kDa 부근에 P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C), 16kDa 부근에 P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)의 밴드가 얻어졌다. 또, 비환원 조건하에서는, 35kDa 부근에 밴드가 얻어졌다. P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C)와 P20.1 항체-VL-SARAH(M24C)는, 양자가 올바르게 헤테로다이머를 형성했을 때에만 S-S 결합이 형성되도록 Cys 잔기의 도입 위치를 디자인하고 있기 때문에, 이러한 결과로부터, 쇄 간의 S-S 결합이 올바르게 형성된 헤테로다이머인 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)이 얻어진 것을 알 수 있었다.

<비교예 3 대장균 발현계를 이용한 12CA5 항체의 Fv-clasp(v1)의 조제>

배열 번호 19로 나타나는, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C) 코딩하는 핵산 배열 대신에, 배열 번호 26으로 나타나는, 12CA5 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C)를 코딩하는 핵산 배열을 사용하고, 또 배열 번호 20으로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)를 코딩하는 핵산 배열 대신에, 배열 번호 27로 나타나는, 12CA5 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)를 코딩하는 핵산 배열을 사용한 것 이외에는, 비교예 1과 동일한 방법에 의하여, 배열 번호 28로 나타나는, 12CA5 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C)(이하, 12CA5 항체-VH-SARAH(Y35C)라고 약기하는 경우가 있음) 및 배열 번호 29로 나타나는, 12CA5 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)(이하, 12CA5 항체-VL-SARAH(M24C)라고 약기하는 경우가 있음)를, (1) 유전자 재조합·발현 공정 및 가용화 공정, (2) 리폴딩 공정, 및 (3) 농축 공정을 이용하고, 또한 이하에 나타내는 (4) 정제 공정에 의하여, 12CA5 항체의 Fv-clasp(v1)(이하, 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)이라고 약기하는 경우가 있음)을 얻었다.

이하에, (4) 정제 공정의 결과에 대하여 나타낸다.

(3)의 농축 공정에서 얻어진 농축액을, 비교예 1과 동일한 방법에 의하여 겔 여과 정제를 행한 결과, 분자량 마커로부터 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)로 추정되는 위치에 단분산의 피크가 얻어진 점에서, 당해 피크의 용출액을 회수했다.

이어서, 회수한 용출액을, 상법에 따라, 비환원 SDS-PAGE를 행했다. 그 결과, 37kDa 부근의 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)의 밴드에 더하여, 15-18kDa 부근에 불순물의 밴드도 확인되었다. 12CA5 항체-VH-SARAH(Y35C)와 12CA5 항체-VL-SARAH(M24C)는, 양자가 올바르게 헤테로다이머를 형성했을 때에만 S-S 결합이 형성되도록 Cys 잔기의 도입 위치를 디자인했기 때문에, 이들 불순물의 밴드는, 각각의 호모다이머 혹은, 부분적으로 불완전한 리폴딩에 의한 미산화 상태의 헤테로다이머라고 생각되었다.

그래서, 겔 여과 정제로 회수한 용출액으로부터 불순물을 없애기 위하여, 상법에 따라, Mono Q5/50(GE사제), 이온 교환 크로마토그래피용 용출 버퍼[50mM to 300mM gradient of NaCl in Tris-HCl, pH 7.5]를 이용하여, 유속 1mL/min이고, 20mL로 기울기 용출 방식으로, 이온 교환 크로마토그래피를 행했다.

그 결과, 가장 큰 피크(이하, 피크 A라고 약기하는 경우가 있음) 이후에, 작은 피크가 2개(이하, 피크 B, C라고 약기하는 경우가 있음) 얻어졌다.

회수한 피크 A~C의 용출액에 대하여, 상법에 따라, 비환원 조건하와 환원 조건하에서 각각 SDS-PAGE를 행했다.

결과를 도 3에 나타낸다. 도면 중, 좌측의 겔이 환원 조건하에서의 전기영동, 우측의 겔이 비환원 조건하에서의 전기영동도이다. A~C의 레인명은 각각 겔 여과 정제로 회수한 피크 A~C의 각 용출액의 명칭에 대응한다.

비환원 조건하에서의 전기영동의 결과, A는 35kDa 부근에 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)의 밴드, B는 18kDa 부근에 12CA5 항체-VH-SARAH(Y35C)의 밴드와 16kDa 부근에 12CA5 항체-VL-SARAH(M24C)의 밴드, C는 16kDa 부근에 12CA5 항체-VL-SARAH(M24C)의 밴드가 각각 얻어졌다.

이러한 결과로부터, 피크 A에, 쇄 간의 S-S 결합이 올바르게 형성된 헤테로다이머인 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)이 얻어진 것을 알 수 있었다. 또한, 피크 B는 미산화 상태의 헤테로다이머 분자, 피크 C는 호모다이머 분자로 각각 생각되었다.

<비교예 4 대장균 발현계에서 얻어진 P20.1 항체의 Fv-clasp(v1)과 C8 펩타이드와의 복합체의 결정 구조 해석>

이하의 방법에 의하여, 비교예 1에서 대장균 발현계에 의하여 얻어진 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)을 이용하여, P20.1 항체-Fv-clasp(v1)과 당해 프래그먼트 항체의 항원 분자인 C8 펩타이드와의 복합체의 결정화를 행했다. P20.1 항체-Fv-clasp(v1)과 C8 펩타이드의 종농도가 각각 7mg/mL, 1mM이 되도록 양자를 혼합하여, 결정화 시료로 했다. 자동 결정화 장치 mosuquito(TTP LabTech사제), 각종 스크리닝 키트[Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건), Wizard Precipitant Synergy(Rigaku사제)(192조건), SaltRx(Hampton Research사제)(96조건)], 비오라모 단백 결정화 플레이트(96웰, 애즈원사제)를 이용하여, 1조건당 0.1μL의 결정화 시료와 0.1μL의 스크리닝 키트 용액(결정화 시약)을 혼합하여 드롭을 제작하고, 리저버에는 80μL의 결정화 시약을 이용하여, 싯팅 드롭 증기 확산법에 의하여 결정화의 스크리닝을 행했다.

상기와 같이, 4종류의 키트를 이용하여 합계 480의 스크리닝 조건을 검토했지만, 전혀 결정을 얻을 수 없었다. 대장균 발현계에서 얻어진 Fv-clasp(v1)은, 당해 프래그먼트 항체와 항원 분자와의 복합체에 있어서, 결정화능을 갖지 않는 것을 알 수 있었다.

<비교예 5 동물 세포 발현계에서 얻어진 P20.1 항체의 Fv-clasp(v1)과 C8 펩타이드와의 복합체의 결정 구조 해석>

비교예 2에서 동물 세포 발현계에 의하여 얻어진 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)을 이용하여, 비교예 4와 동일한 방법에 의하여, P20.1 항체-Fv-clasp(v1)과 당해 프래그먼트 항체의 항원 분자인 C8 펩타이드와의 복합체의 결정화를 행했다. 단, 스크리닝 키트는, Index(Hampton Research사제) 및 Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)를 이용했다.

그 결과, 스크리닝 단계에 있어서의 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)과 C8 펩타이드와의 복합체는, 192조건 중 7조건(3.6%)에서 결정이 얻어졌다. 이들 중 1조건에 대하여 더 조건을 최적화하여 얻어진 결정(Crystal-1)과, 스크리닝에 있어서 Crystal-1은 다른 조건에서 얻어진 결정(Crystal-2)에 대하여, 방사광 시설 SPring-8에서 X선 회절 실험을 실시했다. 그 결과, Crystal-1은 1.31Å 분해능, Crystal-2는 1.75Å 분해능으로 각각 X선 회절 데이터를 얻었다. 얻어진 X선 회절 데이터를 이용하여, P20.1Fab의 결정 구조(PDB ID: 2ZPK) 및 Mst1의 SARAH 도메인의 결정 구조(PDB ID: 4NR2)를 서치 모델로 하고, 분자 치환 프로그램 PHASER[McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674(2007)]을 사용한 분자 치환법에 의하여 위상을 결정했다. 그 후, REFMAC5[Murshudov, G. N., et al. REFMAC 5 for the refinement of macromole cularcrystal structures. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 355-367(2011)] 및 PHENIX[Adams, P., et al. Recent developments in the PHENIX software for automated crystallographic structure determination. J. Synchrotron. Radiat., 11, 53-55. (2004)]를 이용하여 구조의 정밀화를 행했다. 얻어진 P20.1 항체의 Fv-clasp(v1)과 C8 펩타이드와의 복합체(Crystal-1)의 X선 결정 구조 해석의 결과를 도 4에 나타낸다.

<비교예 6 대장균 발현계에서 얻어진 12CA5 항체의 Fv-clasp(v1)과 HA 펩타이드와의 복합체의 결정 구조 해석>

비교예 3에서 대장균 발현계에 의하여 얻어진 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)을 이용하여, 비교예 4와 동일한 방법에 의하여, 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)과 배열 번호 30으로 나타나는 항원 분자인 HA 펩타이드(YPYDVPDYA)와의 복합체의 결정화를 행했다. 단, 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)과 HA 펩타이드의 종농도가 각각 7mg/mL, 1mM이 되도록 양자를 혼합한 것을 결정화 시료로 하고, 스크리닝 키트는, Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), Classics II Suite(QIAGEN사제)(96조건), Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건)를 이용했다.

그 결과, 스크리닝 단계에 있어서의 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)과 항원 분자인 HA 펩타이드와의 복합체는, 상기의 3종류의 키트를 이용한 합계 288조건 중, 51조건(17.7%)에서 결정이 얻어졌다.

얻어진 복합체의 결정 중, 10종류의 결정에 대하여, 비교예 5와 동일한 방법에 의하여, X선 회절 실험을 실시한바, 대략 4~9Å과 같은 낮은 회절능을 나타냈다. 그래서, 이들 중 1종류에 대하여 결정화 조건의 검토, X선 회절 실험을 반복하여, 결정화 조건을 최적화한 결과, 2.2Å에서의 데이터 수집에 성공했다. 이 데이터에 대하여, 비교예 5와 동일한 방법에 의하여, 입체 구조를 결정했다(단, Fv 영역에 대한 분자 치환의 서치 모델은 PDB ID: 1HIL을 사용했다). 얻어진 12CA5 항체의 Fv-clasp(v1)과 HA 펩타이드와의 복합체의 구조를 도 5에 나타낸다.

대장균 발현계에서 얻어진 Fv-clasp(v1)은, 스크리닝 단계에 있어서 결정화능을 갖고 있어도, 후술하는 Fv-clasp(v2)보다, 결정이 얻어지는 스크리닝 조건의 수는 적고, 또 스크리닝으로 얻어지는 결정에서는 회절능이 낮은(결정화능이 낮은) 경향이 있는 것을 알 수 있었다.

이하의 비교예 7-9 및 실시예 1은, 비교예 5에서 얻어진 Fv-clasp(v1)의 구조를 바탕으로, Fv-clasp(v1)을 개량하기 위하여, Fv-clasp(v1)의 변이체(후술하는 Fv-clasp(S-S 없음), Fv-clasp(v1'), Fv-clasp(v1''), 및 Fv-clasp(v2)를 작성한 것이다.

각 변이체에 있어서의 S-S 결합의 위치를, 하기 표 1에 나타낸다.

[표 1]

<비교예 7 동물 세포 발현계를 이용한 2H5 항체의 Fv-clasp(S-S 없음)의 조제>

이하의 방법에 의하여, 배열 번호 31로 나타나는 2H5 항체에 대한 VH-SARAH(N 말단에 2H5 중쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 포함한다. 이하, 2H5 항체-VH-SARAH라고 약기하는 경우가 있음), 및 배열 번호 32로 나타나는 2H5 항체에 대한 VL-SARAH(N 말단에 2H5 경쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 포함한다. 이하, 2H5 항체-VL-SARAH라고 약기하는 경우가 있음)를, (1) 유전자 재조합 공정, (2) 동물 세포 발현계를 이용한 재조합 단백질 발현 공정, 및 (3) 정제 공정을 이용하여, 2H5 항체의 Fv-clasp(S-S 없음)(이하, 2H5 항체-Fv-clasp(S-S 없음)이라고 약기하는 경우가 있음)을 포함하는 배양 상청을 얻었다.

(1) 유전자 재조합 공정

배열 번호 23으로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C)를 코딩하는 핵산 배열(N 말단에 마우스 나이트로젠의 시그널 배열을 코딩하는 배열을 포함함) 대신에, 배열 번호 33으로 나타나는 2H5 항체에 대한 VH-SARAH를 코딩하는 핵산 배열(N 말단에 2H5 중쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 코딩하는 배열을 포함함)을 사용하고, 또 배열 번호 25로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)를 코딩하는 핵산 배열(N 말단에 마우스 나이트로젠의 시그널 배열을 코딩하는 배열을 포함함) 대신에, 배열 번호 34로 나타나는 2H5 항체에 대한 VL-SARAH를 코딩하는 핵산 배열(N 말단에 2H5 경쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 코딩하는 배열을 포함함)을 사용한 것 이외에는, 비교예 2와 동일한 방법에 의하여, 2H5 항체-VH-SARAH 및 2H5 항체-VL-SARAH의 발현용 재조합 벡터를 조제했다.

(2) 동물 세포 발현계를 이용한 재조합 단백질 발현 공정

P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C) 발현용 재조합 벡터 대신에 2H5 항체-VH-SARAH 발현용 재조합 벡터를 사용하고, 또 P20.1 항체-VL-SARAH(M24C) 발현용 재조합 벡터 대신에 2H5 항체-VL-SARAH의 발현용 재조합 벡터를 사용한 것 이외에는, 비교예 2와 동일한 방법에 의하여, 2H5 항체-Fv-clasp(S-S 없음)을 포함하는 배양 상청을 회수했다.

(3) 정제 공정

회수한 배양 상청 1mL로부터, 배열 번호 89로 나타나는 2H5의 항원 분자인 eTEV 펩타이드(RENLYFQGKDG)를 고정화한 CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow(GE사제) 20μL를 이용하여, 어피니티 크로마토그래피법에 의하여 침강 반응을 행하고, 담체에 결합한 단백질을 용출시켜, 용출액(이하, S-S 없는 용출액이라고 약기하는 경우가 있음)을 얻었다.

또한, 얻어진 2H5 항체-Fv-clasp(S-S 없음)은 2H5 항체의 Fv 영역 및 그것에 융합한 SARAH 도메인 배열 중에 새로운 시스테인 잔기를 갖지 않고, 분자 간에 S-S 결합을 형성하지 않도록 디자인한 것이다.

<비교예 8 동물 세포 발현계를 이용한 2H5 항체의 Fv-clasp(v1')의 조제>

비교예 7과 동일한 방법에 의하여, 배열 번호 35로 나타나는 2H5 항체에 대한 VH(11C)-SARAH(N 말단에 2H5 중쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 포함한다. 이하, 2H5 항체-VH(11C)-SARAH라고 약기하는 경우가 있음), 및 배열 번호 36으로 나타나는 2H5 항체에 대한 VL-SARAH(33C)(N 말단에 2H5 경쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 포함한다. 이하, 2H5 항체-VL-SARAH(33C)라고 약기하는 경우가 있음)를, (1) 유전자 재조합 공정, (2) 동물 세포 발현계를 이용한 재조합 단백질 발현 공정, 및 (3) 정제 공정을 이용하여, 2H5 항체의 Fv-clasp(v1')(이하, 2H5 항체-Fv-clasp(v1')이라고 약기하는 경우가 있음)을 포함하는 용출액(이하, v1' 용출액이라고 약기하는 경우가 있음)을 얻었다.

또한, 얻어진 2H5 항체-Fv-clasp(v1')은, 2H5 항체에 대한 VH(11C)-SARAH의 VH 영역 중의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 11의 시스테인 잔기와, 2H5 항체-VL-SARAH(33C)의 SARAH 도메인 중의 C 말단으로부터 17번째(N 말단으로부터 33번째)의 시스테인 잔기가 S-S 결합을 형성하도록 디자인한 것이다.

<비교예 9 동물 세포 발현계를 이용한 2H5 항체의 Fv-clasp(v1'')의 조제>

비교예 7과 동일한 방법에 의하여, 배열 번호 37로 나타나는 2H5 항체에 대한 VH(108C)-SARAH(N 말단에 2H5 중쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 포함한다. 이하, 2H5 항체-VH(108C)-SARAH라고 약기하는 경우가 있음), 및 배열 번호 38로 나타나는 2H5 항체에 대한 VL-SARAH(30C)(N 말단에 2H5 경쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 포함한다. 이하, 2H5 항체-VL-SARAH(30C)라고 약기하는 경우가 있음)를, (1) 유전자 재조합 공정, (2) 동물 세포 발현계를 이용한 재조합 단백질 발현 공정, 및 (3) 정제 공정을 이용하여, 2H5 항체의 Fv-clasp(v1'')(이하, 2H5 항체-Fv-clasp(v1'')이라고 약기하는 경우가 있음)을 포함하는 용출액(이하, v1'' 용출액이라고 약기하는 경우가 있음)을 얻었다.

또한, 얻어진 2H5 항체-Fv-clasp(v1'')은, 2H5 항체에 대한 VH(108C)-SARAH의 VH 영역 중의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 108의 시스테인 잔기와, 2H5 항체-VL-SARAH(30C)의 SARAH 도메인 중의 C 말단으로부터 20번째(N 말단으로부터 30번째)의 시스테인 잔기가 S-S 결합을 형성하도록 디자인한 것이다.

<실시예 1 동물 세포 발현계를 이용한 2H5 항체의 Fv-clasp(v2)의 조제>

비교예 7과 동일한 방법에 의하여, 배열 번호 39로 나타나는 2H5 항체에 대한 VH(112C)-SARAH(N 말단에 2H5 중쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 포함한다. 이하, 2H5 항체-VH(112C)-SARAH라고 약기하는 경우가 있음), 및 배열 번호 40으로 나타나는 2H5 항체에 대한 VL-SARAH(37C)(N 말단에 2H5 경쇄의 시그널 배열, C 말단에 His 태그 배열을 포함한다. 이하, 2H5 항체-VL-SARAH(37C)라고 약기하는 경우가 있음)를, (1) 유전자 재조합 공정, (2) 동물 세포 발현계를 이용한 재조합 단백질 발현 공정, 및 (3) 정제 공정을 이용하여, 2H5 항체의 Fv-clasp(v2)(이하, 2H5 항체-Fv-clasp(v2)라고 약기하는 경우가 있음)를 포함하는 용출액(이하, v2 용출액이라고 약기하는 경우가 있음)을 얻었다.

또한, 얻어진 2H5 항체-Fv-clasp(v2)는, 2H5 항체에 대한 VH(112C)-SARAH의 VH 영역 중의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 시스테인 잔기와, 2H5 항체-VL-SARAH(37C)의 SARAH 도메인 중의 C 말단으로부터 13번째(N 말단으로부터 37번째)의 시스테인 잔기가 S-S 결합을 형성하도록 디자인한 것이다.

<실험예 1 2H5 항체의 각종 Fv-clasp 버젼의 S-S 결합 형성능>

비교예 7-9 및 실시예 1에서 얻은 각 용출액에 대하여, 상법에 따라, 환원 조건하 또는 비환원 조건하에서 각각 SDS-PAGE를 행했다.

결과를 도 6에 나타낸다. 도면 중, 중앙의 마커의 레인을 사이에 두고 겔의 좌측(레인 1~4)이 환원 조건하에서의 전기영동도, 겔의 우측(레인 5~8)이 비환원 조건하에서의 전기영동도이다. 레인 1은 환원 조건하에 있어서의 비교예 7에서 얻어진 S-S 없는 용출액, 레인 2는 환원 조건하에 있어서의 비교예 8에서 얻어진 v1' 용출액, 레인 3은 환원 조건하에 있어서의 비교예 9에서 얻어진 v1'' 용출액, 레인 4는 환원 조건하에 있어서의 실시예 1에서 얻어진 v2 용출액, 레인 5는 비환원 조건하에 있어서의 비교예 7에서 얻어진 S-S 없는 용출액, 레인 6은 비환원 조건하에 있어서의 비교예 8에서 얻어진 v1' 용출액, 레인 7은 비환원 조건하에 있어서의 비교예 9에서 얻어진 v1'' 용출액, 레인 8은 비환원 조건하에 있어서의 실시예 1에서 얻어진 v2 용출액의 전기영동의 결과를 각각 나타낸다.

환원 조건하에 있어서, S-S 없는 용출액(레인 1), v1' 용출액(레인 2), 및 v2 용출액은, 각각 22kDa 부근에 2H5 항체-VH-SARAH, 또는 2H5 항체-VH-SARAH에 시스테인 잔기를 도입한 변이체의 밴드가 얻어지고, 또 각각 18kDa 부근에 2H5 항체-VL-SARAH, 또는 2H5 항체-VL-SARAH에 시스테인 잔기를 도입한 변이체의 밴드가 얻어졌다. 한편 v1'' 용출액(레인 3)은, 2H5 항체-VH-SARAH에 시스테인 잔기를 도입한 변이체나 2H5 항체-VL-SARAH에 시스테인 잔기를 도입한 변이체에 대응하는 밴드는 얻어지지 않았다.

또, 비환원 조건하에 있어서, S-S 없는 용출액(레인 5)은, 35-37kDa 부근에 예상되는 2H5 항체의 Fv-clasp 2량체의 밴드가 얻어지지 않고, v1' 용출액(레인 6)은, S-S 결합을 형성한 2H5 항체의 Fv-clasp(v1')의 밴드(35kDa 부근) 외에, 17kDa 부근에 S-S 결합이 형성되어 있지 않는 단독의 2H5 항체-VH-SARAH의 밴드 및 2H5 항체-VH-SARAH의 밴드가 얻어졌지만, v2 용출액(레인 8)은, S-S 결합을 형성한 2H5 항체의 Fv-clasp(v2)의 밴드(37kDa)만이 얻어졌다.

환원 조건하에서의 전기영동의 결과로부터, Fv-clasp(S-S 없음)(비교예 7), Fv-clasp(v1')(비교예 8), Fv-clasp(v2)(비교예 10)는, 숙주로부터 각각 발현하여 분비되어 있으며, 또 항원 분자로의 결합 활성이 유지되고 있는 것을 알 수 있었다. 한편, Fv-clasp(v1'')(비교예 9)은 발현 분비가 되어 있지 않았거나, 혹은 발현했지만 항원 결합능을 상실한 것을 알 수 있었다.

또한, 비환원 조건하에서의 전기영동의 결과로부터, Fv-clasp(v1')은 분자 간에 S-S 결합을 형성하지 않는 다이머, 혹은 호모다이머와 같은 불순물이 발생하는 한편, Fv-clasp(v2)만이 분자 간 S-S 결합을 100% 형성하는 능력을 갖는 것을 알 수 있었다.

비교예 5-6에 나타낸 Fv-clasp(v1)의 구조 해석의 결과로부터, VH-SARAH와 VL-SARAH가 보다 안정적인 헤테로다이머를 구성하도록, 본 발명자들은 Fv-clasp(v1'), Fv-clasp(v1''), 및 Fv-clasp(v2)의 3개가 다른 변이체를 고안했다.

즉, VH-SARAH와 VL-SARAH에 도입하는 시스테인 잔기의 위치의 조합으로서, 상기 표 1에 기재된 3개의 새로운 조합{[VH(11C)-SARAH의 VH 영역 중의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 11의 시스테인 잔기와, VL-SARAH(33C)의 SARAH 도메인 중의 C 말단으로부터 17번째(N 말단으로부터 33번째)의 시스테인 잔기(Fv-clasp(v1')]의 조합, [VH(108C)-SARAH의 VH 영역 중의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 108의 시스테인 잔기와, VL-SARAH(30C)의 SARAH 도메인 중의 C 말단으로부터 20번째(N 말단으로부터 30번째)의 시스테인 잔기(Fv-clasp(v1'')]의 조합, [VH(112C)-SARAH의 VH 영역 중의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 시스테인 잔기와, VL-SARAH(37C)의 SARAH 도메인 중의 C 말단으로부터 13번째(N 말단으로부터 37번째)의 시스테인 잔기(Fv-clasp(v2)]의 조합}을 고안하고, 그들에 대하여, S-S 결합 형성능을 실험예 1에서 검토했다.

그러나, 실험예 1에 나타내는 바와 같이, 의외로 이들 변이체 중 Fv-clasp(v1')은 분자 간에 안정적인 S-S 결합을 형성하지 않고, 또 Fv-clasp(v1'')은 양호한 발현량과 항원 결합능을 유지할 수 없었던 것을 알 수 있었다.

즉, Fv-clasp에 있어서 분자 내 가동성을 억제하고 헤테로다이머를 안정화함과 함께 결정화능을 개선하기 위해서는, 도입하는 헤테로다이머 간 S-S 결합의 위치는, VH(112C)-SARAH의 VH 영역 중의 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기와 VL-SARAH(37C)의 SARAH 도메인 중의 C 말단으로부터 13번째(N 말단으로부터 37번째)의 아미노산 잔기를 선택할 필요가 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 2 대장균 발현계를 이용한 P20.1 항체의 Fv-clasp(v2)의 조제>

배열 번호 19로 나타나는, P20.1 항체-VH-SARAH(Y35C)를 코딩하는 핵산 배열 대신에, 배열 번호 41로 나타나는, P20.1 항체에 대한 VH(112C)-SARAH를 코딩하는 핵산 배열을 사용하고, 또 배열 번호 20으로 나타나는 P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)를 코딩하는 핵산 배열 대신에, 배열 번호 42로 나타나는, P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(37C)를 코딩하는 핵산 배열을 사용한 것 이외에는, 비교예 1과 동일한 방법에 의하여, 대장균 발현계를 이용하여, 배열 번호 43으로 나타나는, P20.1 항체에 대한 VH(112C)-SARAH(이하, P20.1 항체-VH(112C)-SARAH라고 약기하는 경우가 있음), 및 배열 번호 44로 나타나는, P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(37C)(이하, P20.1 항체-VL-SARAH(37C)라고 약기하는 경우가 있음)를, (1) 유전자 재조합·발현 공정 및 가용화 공정, (2) 리폴딩 공정, (3) 농축 공정, 및 (4) 정제 공정을 이용하여, P20.1 항체에 대한 Fv-clasp(v2)(이하, P20.1 항체-Fv-clasp(v2)라고 약기하는 경우가 있음)를 얻었다.

결과를 도 7에 나타낸다. 도면 중, 좌측의 레인이 환원 조건하에서의 전기영동도, 우측의 레인이 비환원 조건하에서의 전기영동도이다. 환원 조건하, P20.1 항체-Fv-clasp(v2)는, P20.1 항체에 대한 VH(112C)-SARAH 및 P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(37C)의 밴드가 18kDa 부근에 겹쳐져 얻어지고, 비환원 조건하, 35kDa 부근에 P20.1 항체-Fv-clasp(v2)의 1개의 밴드가 얻어졌다. Fv-clasp(v2)는, 대장균 발현계에서도 VH(112C)-SARAH와 VL-SARAH(37C)의 사이에서 올바르게 헤테로다이머를 형성하여 S-S 결합을 형성한 재조합 단백질이 매우 고순도로 얻어지는 것을 알 수 있었다.

또, 얻어진 P20.1 항체-Fv-clasp(v2)는, 상기 정제의 과정에서 항원 분자인 C8 펩타이드를 고정화한 레진으로 정제하고 있으므로, 항C8 펩타이드 항체로서의 활성을 갖고 있는 것은 명확하다.

즉, Fv-clasp(v2)는, 발현시키는 숙주 세포의 종류에 상관없이, 간편하게 제조할 수 있을 수 있고, 또한 항원 결합 활성을 갖는 것을 알 수 있었다(실시예 1, 2).

<실시예 3-10 대장균 발현계를 이용한 Fv-clasp(v2)의 조제>

실시예 2와 동일한 방법에 의하여, P20.1 항체에 대한 VH(112C)-SARAH 대신에, 93201 항체, TS2/16 항체, SG/19 항체, t8E4 항체, 9E10 항체, 12CA5 항체, t1E4 항체, 및 NZ-1 항체에 대한 VH(112C)-SARAH, 및, P20.1 항체에 대한 VL-SARAH(37C) 대신에, 93201 항체, TS2/16 항체, SG/19 항체, t8E4 항체, 9E10 항체, 12CA5 항체, t1E4 항체, 및 NZ-1 항체에 대한 VL-SARAH(37C)를, 각각 (1) 유전자 재조합·발현 공정 및 가용화 공정, (2) 리폴딩 공정, (3) 농축 공정, 및 (4) 정제 공정을 이용하여, 각 항체에 대한 Fv-clasp(v2)(이하, 각 항체의 명칭-Fv-clasp(v2)라고 약기하는 경우가 있음)를 조제했다.

사용한 핵산의 배열 및 조제한 단백질의 배열을 하기 표 2 및 표 3에 각각 나타낸다.

[표 2]

[표 3]

결과를 도 8에 나타낸다. 도면 중, 좌측의 레인이 환원 조건하에서의 전기영동도, 우측의 레인이 비환원 조건하에서의 전기영동도이다. 8종류의 항체의 Fv-clasp(v2) 모두에 있어서, 실시예 2에서 얻어진 P20.1 항체-Fv-clasp(v2)와 동일하게, 환원 조건하에서는 각 항체에 대한 VH(112C)-SARAH 및 VL-SARAH(37C)에 상당하는 밴드가 18-20kDa 부근에 얻어지고, 또 비환원 조건하에서는 35-37kDa 부근에 각 항체에 대한 Fv-clasp(v2)의 밴드가 1개 얻어졌다.

즉, 대장균 발현계에서 조제한 이들 8종의 항체의 Fv-clasp(v2)는, 모두 VH(112C)-SARAH와 VL-SARAH(37C)의 사이에서 올바르게 헤테로다이머를 형성하여 S-S 결합을 형성하여, 높은 순도로 정제할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실험예 2 Fv-clasp(v2)의 항원 결합 활성의 확인>

실시예 3-10에서 얻어진 각종 항체에 대한 Fv-clasp(v2)가 항원 결합 활성을 갖는 것을, 겔 여과 크로마토그래피의 피크 시프트 또는 바이오 레이어 간섭법에 의하여 각각 확인했다.

93201 항체, TS2/16 항체, SG/19 항체 및 t8E4 항체에 대한 Fv-clasp(v2)에 대해서는, 각각의 항원 분자[93201 항체에 대한 Fv-clasp(v2)에 대해서는 배열 번호 77로 나타나는 SORLA Vps10p 도메인, TS2/16 항체에 대한 Fv-clasp(v2)와 SG/19 항체에 대한 Fv-clasp(v2)에 대해서는 배열 번호 78로 나타나는 α6쇄와 배열 번호 79로 나타나는 β1쇄로 이루어지는 인테그린 α6β1, t8E4 항체에 대한 Fv-clasp(v2)에 대해서는 배열 번호 80으로 나타나는 HGF]와 안정적인 복합체를 형성하는 것을, 겔 여과 크로마토그래피의 피크 시프트에 의하여 확인했다.

결과를 도 9에 나타낸다. 어느 항체에 대한 Fv-clasp(v2)도, 항원 단백질과 결합함으로써 피크가 시프트한 점에서, 각종 항체에 대한 Fv-clasp(v2)는, 항원 결합 활성을 갖는 것을 알 수 있었다.

또, 9E10 항체에 대한 Fv-clasp(v2)와 12CA5 항체에 대한 Fv-clasp(v2)에 대해서는, 각각의 항원 분자인 배열 번호 81로 나타나는 Myc 태그를 부가한 T4L 단백질, 또는 배열 번호 82로 나타나는 HA 태그를 부가한 T4L 단백질에 대한 결합을, Octet Red96(프라임테크사)을 이용한 바이오 레이어 간섭법에 의하여 리얼 타임 해석하고, 오리지널의 항체(9E10 항체 및 12CA5 항체)의 항원 분자에 대한 결합능과 비교했다.

결과를 도 10에 나타낸다. 어느 항체에 대한 Fv-clasp(v2)도, 오리지널의 항체와 동일한 정도의 항원 결합 활성(항원 친화성)을 갖는 것을 알 수 있었다.

또한, NZ-1 항체에 대한 Fv-clasp(v2) 및 t1E4 항체에 대한 Fv-clasp(v2)에 대해서는, 후술하는 실시예 14 및 실시예 17에 있어서, 각각의 항원과의 복합체 상태로 결정 구조 해석하고, 결정 중에서 항원과 1:1의 복합체를 형성하고 있는 것을 직접 확인했다. 이러한 결과로부터, 각종 항체에 대한 Fv-clasp(v2)는, 항원 결합 활성을 갖는 것을 알 수 있었다.

<실시예 11 TS2/16 항체에 대한 Fv-clasp(v2)의 결정 구조 해석>

실시예 4에서 조제한 TS2/16 항체에 대한 Fv-clasp(v2)(이하, TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)라고 약기하는 경우가 있음)를 이용하여, 비교예 4와 동일한 방법에 의하여, TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)의 결정화를 행했다.

단, 4.9mg/mL의 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2) 용액을 결정화 시료로 하고, 스크리닝 키트는, Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건)를 이용했다.

그 결과, 스크리닝 단계에 있어서, 192조건 중, 1조건(0.5%)에서 결정이 얻어졌다. 얻어진 결정에 대하여, 비교예 5와 동일한 방법에 의하여, X선 회절 데이터를 측정하고, 2.04Å 분해능으로 데이터가 얻어져, 구조를 결정할 수 있었다.

결과를 도 11에 나타낸다. Fv-clasp(v2)는, 결정화능을 갖는 것을 알 수 있었다. 일반적으로, 전장의 항체에서는 통상 결정은 얻을 수 없고, 또 종래의 프래그먼트 항체(Fab 프래그먼트나 단쇄 항체(scFv) 프래그먼트)에서는 결정이 얻어지지 않는 경우도 많기 때문에, 항원 결정 부위의 입체 구조 해석이 불명확한 항체가 존재하고 있다. Fv-clasp(v2)는, 결정화능을 갖고 있고, 또 결정화가 용이한 점에서, 항체의 항원 결정 부위의 입체 구조 해석에 있어서, 특히 유용하다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 12-14 각종 Fv-clasp(v2)와 항원과의 복합체의 결정 구조 해석>

실시예 2에서 조제한 P20.1 항체-Fv-clasp(v2)와 배열 번호 21로 나타나는 P20.1 항체의 항원 분자인 C8 펩타이드와의 복합체(실시예 12), 실시예 8에서 조제한 12CA5 항체-Fv-clasp(v2)와 배열 번호 30으로 나타나는 12CA5 항체의 항원 분자인 HA 펩타이드와의 복합체(실시예 13), 실시예 10에서 조제한 NZ-1 항체-Fv-clasp(v2)와 배열 번호 83으로 나타나는 NZ-1 항체의 항원 분자인 PA펩타이드와의 복합체(실시예 14)에 대하여, 비교예 4와 동일한 방법에 의하여 결정화를 행했다.

단, P20.1 항체-Fv-clasp(v2)와 C8 펩타이드의 복합체에 대해서는, 각각의 종농도가 11mg/mL, 2mM이 되도록 양자를 혼합한 것을 결정화 시료로 하고, 스크리닝 키트는, Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), Classics II Suite(QIAGEN사제)(96조건), Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건), JCSG+(Molecular Dimensions사제)(96조건)를 이용했다. 12CA5 항체-Fv-clasp(v2)와 HA 펩타이드의 복합체에 대해서는, 각각의 종농도가 7mg/mL, 1mM이 되도록 양자를 혼합한 것을 결정화 시료로 하고, 스크리닝 키트는, Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), Classics II Suite(QIAGEN사제)(96조건), Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건)를 이용했다. NZ-1 항체-Fv-clasp(v2)와 PA펩타이드의 복합체에 대해서는, 각각의 종농도가 3.8mg/mL, 1mM이 되도록 양자를 혼합한 것을 결정화 시료로 하고, 스크리닝 키트는, Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건)를 이용했다.

그 결과, 스크리닝 단계에서, P20.1 항체-Fv-clasp(v2)와 C8 펩타이드와의 복합체에 대해서는, 384조건 중 35조건(9.1%), 12CA5 항체-Fv-clasp(v2)와 HA 펩타이드와의 복합체에 대해서는, 288조건 중 74조건(25.7%), NZ-1 항체-Fv-clasp(v2)와 PA펩타이드와의 복합체에 대해서는, 192조건 중 6조건(3.1%)에서 각각 결정이 얻어졌다.

12CA5 항체-Fv-clasp(v2)와 HA 펩타이드와의 복합체 및 NZ-1 항체-Fv-clasp(v2)와 PA펩타이드와의 복합체에 대해서는, 스크리닝에서 얻어진 결정을 이용하여, 비교예 5와 동일한 방법에 의하여, X선 회절 데이터를 측정하고, 각각 2.45Å 분해능, 2.15Å 분해능으로 데이터가 얻어졌다. 또, P20.1 항체-Fv-clasp(v2)와 C8 펩타이드와의 복합체에 대해서는, 스크리닝에서 얻어진 결정의 조건을 바탕으로 결정화 조건의 최적화를 행하고, 그 결과 얻어진 결정을 이용하여 X선 회절 데이터의 측정을 행하여, 1.17Å 분해능의 데이터가 얻어졌다. 얻어진 X선 회절 데이터를 이용하여, 비교예 5와 동일한 수법에 의하여 구조를 결정했다. 단, Fv 영역에 대한 분자 치환의 서치 모델은, P20.1 항체-Fv-clasp(v2)에 대해서는 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)과 C8 펩타이드와의 복합체의 구조, 12CA5 항체-Fv-clasp(v2)에 대해서는 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)과 HA 펩타이드와의 복합체의 구조, NZ-1 항체-Fv-clasp(v2)에 대해서는 NZ-1Fab의 구조(PDB ID: 4YO0)를 사용했다.

결과를 도 12~도 14에 나타낸다.

Fv-clasp(v1)과 Fv-clasp(v2)에 대하여, 이하와 비교하여 고찰한다.

비교예 4의 결과, 대장균 발현계에서 얻어진 P20.1 항체-Fv-clasp(v1)과 C8 펩타이드와의 복합체는, 480조건을 검토했지만, 전혀 결정을 얻을 수 없고, 동물 세포 발현계에서 조제하여 처음으로 3.6%의 확률로 결정이 얻어진 것에 대하여, 실시예 12의 결과, P20.1 항체-Fv-clasp(v2)와 C8 펩타이드와의 복합체는, 대장균 발현계에서 얻어진 것이어도 384조건 중 35조건(9.1%)에서 결정이 얻어지고, 결정화 조건을 최적화한 결정으로부터는 1.17Å 분해능의 매우 고분해능인 데이터가 얻어졌다.

또, 비교예 6의 결과, 스크리닝 단계에 있어서의 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)과 HA 펩타이드와의 복합체는, 288조건 중 51조건(17.7%)에서 결정이 얻어지고, 당해 결정으로부터는 대략 4Å 분해능~9Å 분해능의 저분해능의 데이터밖에 얻어지지 않았던 것에 대하여, 12CA5 항체-Fv-clasp(v1)과 HA 펩타이드와의 복합체와 완전히 동일한 조건(단백질 농도, 항원 농도, 사용한 스크리닝 키트의 종류)에서 스크리닝을 실시했음에도 불구하고, 실시예 13의 결과, 스크리닝 단계에 있어서의 12CA5 항체-Fv-clasp(v2)와 HA 펩타이드와의 복합체는, 288조건 중 74조건(25.7%)에서 결정이 얻어지고, 당해 결정으로부터는 2.45Å 분해능의 고분해능의 데이터가 얻어졌다.

이러한 결과로부터, Fv-clasp(v1)은 대장균 발현계에서 얻어진 것은 결정화능을 갖지 않는 경우가 있지만, Fv-clasp(v2)는 발현 시의 숙주에 상관없이 결정화능을 갖는 것이 얻어지는 것을 알 수 있었다. 대장균은 동물 세포에 비하여 취급이 용이한 점에서, 특히 대장균 발현계에서 결정화능을 갖는 것이 얻어지는 점에 있어서, Fv-clasp(v2)는 Fv-clasp(v1)보다 유용하다.

또, 비유 대장균 발현계에서 얻어진 Fv-clasp(v1)이 결정화능을 갖는 경우여도, Fv-clasp(v2)는, Fv-clasp(v1)에 비하여, 결정화능이 높아(결정화되기 쉬워), 고분해능의 결정이 얻어지는 것을 알 수 있었다.

<실시예 15-17 각종 Fv-clasp(v2)와 난결정성 항원과의 복합체의 결정 구조 해석>

난결정성 단백질인 SORLA(neuroral sorting receptor)의 Vps10p 도메인, 인테그린 α6β1, 및 HGF(간세포 증식 인자)에 대하여, 배열 번호 77로 나타나는 Vps10p와 실시예 3에서 조제한 93201 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체(실시예 15), 배열 번호 78 및 배열 번호 79로 나타나는 인테그린 α6β1과 실시예 4에서 조제한 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체(실시예 16), 배열 번호 80으로 나타나는 HGF와 실시예 9에서 조제한 t1E4 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체(실시예 17)에 대하여, 비교예 4와 동일한 방법에 의하여 결정화를 행했다.

단, Vps10p와 93201 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는, 농도를 3mg/mL 및 1.5mg/mL로 한 것을 결정화 시료로 하고, 스크리닝 키트는, 전자에 대해서는 Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), 후자에 대해서는 Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건) 및 Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건)를 이용했다. 인테그린 α6β1과 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는, 농도를 9.2mg/mL로 한 것을 결정화 시료로 하고, 스크리닝 키트는, Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건), ProPlex(Molecular Dimensions사제)(96조건)를 이용했다. HGF와 t1E4 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는, 농도를 9.7mg/mL로 한 것을 결정화 시료로 하고, 스크리닝 키트는, Classics Neo Suite(QIAGEN사제)(96조건), Classics II Suite(QIAGEN사제)(96조건), Wizard Classic 1 & 2(Rigaku사제)(96조건), ProPlex(Molecular Dimensions사제)(96조건), JCSG+(Molecular Dimensions사제)(96조건)를 이용했다.

그 결과, 스크리닝 단계에서, Vps10p와 93201 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는, 288조건 중 11조건(3.8%), 인테그린 α6β1과 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는, 288조건 중 2조건(0.7%), HGF와 t1E4 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는, 480조건 중 1조건(0.2%)에서 각각 결정이 얻어졌다.

얻어진 각 복합체의 결정에 대하여, 비교예 5와 동일한 방법에 의하여, X선 회절 데이터를 측정하고, 당해 복합체의 X선 결정 구조 해석을 행했다.

결과를 도 15-도 17에 나타낸다. 스크리닝 단계에 있어서, Vps10p와 93201 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는 3.2Å 분해능, 인테그린 α6β1과 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는 3.37Å 분해능, HGF와 t1E4 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는 4.1Å 분해능으로 데이터가 얻어져, 결정 구조를 결정할 수 있었다.

또한, 결정화 조건의 최적화를 행한바, Vps10p와 93201 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는 2.59Å 분해능, 인테그린 α6β1과 TS2/16 항체-Fv-clasp(v2)와의 복합체에 대해서는, 최종적으로 3.05Å 분해능으로 데이터가 얻어져, 결정 구조를 결정할 수 있었다.

이하에, Fv-clasp(v2)의 결정화를 촉진하는 기능에 대하여 고찰한다.

인테그린은 멀티 도메인의 당단백질이며, 세포 외 도메인은 시그널 전달에 연동하여 매우 큰 구조 변화를 일으키는 것이 알려져 있어, 단독으로 결정화는 곤란하다고 생각되고 있었다. 그래서 본 발명자들은, 지금까지 TS2/16을 포함하는 복수의 항체의 Fab를 사용하여 결정화를 시도했지만, 전혀 결정은 얻을 수 없었다. 그러나, 상기와 같이, TS2/16 항체의 Fv-clasp(v2)와의 복합체를 이용함으로써, 스크리닝 단계에 있어서도 3.37Å 분해능으로 데이터가 얻어져, 결정 구조를 결정할 수 있었다.

또, 본원 발명자들은, 과거에 HGF와 t1E4 항체의 Fab의 결정 구조 해석을 시도했지만, 최고로 9Å 정도의 회절능을 가진 결정밖에 얻어지지 않았다. 그러나, 상기와 같이, Fv-clasp(v2)를 이용함으로써, 스크리닝 단계에 있어서도 4.1Å 분해능으로 결정 구조를 결정할 수 있었다.

이러한 결과로부터, Fv-clasp(v2)는, 단백질, 특히, 난결정성 단백질과 복합체를 형성시켰을 때에, 그 결정화를 촉진하는 기능이 있는 것이 명확해져, 결정화 촉진용 프래그먼트 항체로서 유용하다는 것을 알 수 있었다.

또, 본원 발명자들은, 과거에 Vps10p와 프로펩타이드와의 복합체의 결정 구조를 행했지만(Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nature Struct. Mol. Biol. 22, 199-206. (2015)), 당해 복합체의 결정은 석출에 1~2개월 정도 걸리고, 해석에 견딜 품질의 결정이 얻어지는 빈도가 매우 낮았다. 그러나, 상기와 같이, Fv-clasp(v2)를 이용함으로써, 스크리닝 단계에 있어서도, 3.2Å 분해능, 결정화 조건의 최적화 후에는 2.59Å 분해능으로 결정 구조를 결정할 수 있고, 또한 이러한 결정은 불과 1일로 양호한 재현성으로 얻을 수 있었다.

즉, Fv-clasp(v2)는, 재현성이 양호하게, 또 단시간에, 단백질, 특히, 난결정성 단백질의 결정화를 촉진하는 기능이 있는 것이 명확해져, 결정화 촉진용 프래그먼트 항체로서 유용하다는 것을 알 수 있었다.

<실험예 3 Fv-clasp(v2)의 열안정성>

종래의 단쇄 항체인 scFv 및 Fv-clasp(v1)과 Fv-clasp(v2)의 열안정성을 이하의 방법에 의하여 비교했다.

종래의 프래그먼트 항체인 P20.1 항체의 scFv(single-chain Fv)는, 일본 특허 제5257997호에 기재된 방법에 의하여, 대장균 발현 및 재접힘법(refolding)으로 조제했다. NZ-1 항체의 scFv는, 배열 번호 84로 나타나는 배열을 이용한 것 이외에는, P20.1 항체의 단쇄 항체(scFv)와 동일한 방법에 의하여 조제했다.

또, NZ-1 항체에 대한 Fv-clasp(v1) 및 SG/19 항체에 대한 Fv-clasp(v1)은, 비교예 3과 동일한 방법에 의하여, 배열 번호 85로 나타나는, NZ-1 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C) 및 배열 번호 86으로 나타나는, NZ-1 항체에 대한 VL-SARAH(M24C), 및 배열 번호 87로 나타나는, SG/19 항체에 대한 VH-SARAH(Y35C) 및 배열 번호 88로 나타나는, SG/19 항체에 대한 VL-SARAH(M24C)를 각각 (1) 유전자 재조합·발현 공정 및 가용화 공정, (2) 리폴딩 공정, (3) 농축 공정 및 (4) 정제 공정을 이용하여, 조제했다.

조제한 P20.1 항체의 scFv, NZ-1 항체의 scFv, NZ-1 항체에 대한 Fv-clasp(v1), SG/19 항체에 대한 Fv-clasp(v1), 비교예 1에서 얻어진 P20.1 항체-Fv-clasp(v1), 비교예 3에서 얻어진 12CA5 항체-Fv-clasp(v1), 실시예 2에서 조제한 P20.1 항체-Fv-clasp(v2), 실시예 5에서 조제한 SG/19 항체-Fv-clasp(v2), 실시예 8에서 조제한 12CA5 항체-Fv-clasp(v2), 및 실시예 10에서 조제한 NZ-1 항체-Fv-clasp(v2)를 이용하여 서멀 시프트 에세이를 실시하여, 각각의 Tm값을 구했다.

서멀 시프트 에세이에서는, 각 시료에 SYPRO Orange(써모 피셔 사이언티픽사제)를 첨가하고, 25℃에서 85℃까지 온도를 상승시켰을 때의 형광값의 변화를 리얼 타임으로 측정함으로써 단백질의 변성 상태를 모니터하고, 얻어진 변성 곡선으로부터 Tm값[℃]을 산출했다. 결과를 하기 표 4에 나타낸다. 표 중의 단위는 모두 [℃]이다.

[표 4]

이러한 실험 결과로부터, Fv-clasp(v2)는, 종래의 프래그먼트 항체인 scFv나 Fv-clasp(v1)에 비하여 Tm값이 높고, 그 차는 6-11℃에도 도달하는 것을 알 수 있었다. 즉, Fv-clasp(v2)는, 종래의 프래그먼트 항체보다 매우 열안정이 높기 때문에, 냉장 혹은 실온에서의 보존 안정성도 높다. 이 성질에 의하여, Fv-clasp(v2)는, 프래그먼트 항체, 및 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체로서는 물론, 그 이외의 용도로도 매우 유리한 성질을 갖는 것이 기대된다.

배열표

국제 접수 특허 협력 조약에 근거하는 국제 출원 원2056PCT 프래그먼트 항체 및 당해 플래그 JP1704013820171107----00240113551702337543 정상 20171107162021201711021818387220_P1AP101_20_7.app

SEQUENCE LISTING <110> Wako Pure Chemical lndustries ltd. <120> Fragment antibody and method for protein crystallization using fragment antibody <130> 2056PCT <160> 89 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln Lys Arg 1 5 10 15 Leu Leu Ala Leu Asp Pro Met Met Trp Gln Glu Ile Glu Glu Ile Arg 20 25 30 Gln Lys Tyr Gln Ser Lys Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala 35 40 45 Lys <210> 2 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Phe Asp Phe Leu Lys Asn Leu Ser Leu Glu Glu Leu Gln Met Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Arg Glu Ile Glu Glu Leu Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr Thr Ala Gln Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Met Asp Ala 35 40 45 Lys <210> 3 <211> 48 <212> PRT <213> Drosophila <400> 3 Phe Glu Phe Leu Lys Phe Leu Thr Phe Asp Asp Leu Asn Gln Arg Leu 1 5 10 15 Cys Asn Ile Asp His Glu Met Glu Leu Glu Ile Glu Gln Leu Asn Lys 20 25 30 Lys Tyr Asn Ala Lys Arg Gln Pro Ile Val Asp Ala Met Asn Ala Lys 35 40 45 <210> 4 <211> 47 <212> PRT <213> Drosophila <400> 4 Val Ala Gln Phe Leu Asn Leu Ser Leu Pro Glu Cys Arg Ala Ile Leu 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Asp Glu Leu Ala Arg Glu Val Ala Lys Ile Lys Glu Arg 20 25 30 Tyr Ala Glu Leu Arg Arg Arg Ile Val Ser Arg Met Glu Ser Leu 35 40 45 <210> 5 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Glu Trp Asp Ala Phe Ser Ile Pro Glu Leu Gln Asn Phe Leu 1 5 10 15 Thr Ile Leu Glu Lys Glu Glu Gln Asp Lys Ile Gln Gln Val Gln Lys 20 25 30 Lys Tyr Asp Lys Phe Arg Gln Lys Leu Glu Glu Ala Leu Arg Glu Ser 35 40 45 <210> 6 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Val Asn Trp Asp Ala Phe Ser Met Pro Glu Leu His Asn Phe Leu 1 5 10 15 Arg Ile Leu Gln Arg Glu Glu Glu Glu His Leu Arg Gln Ile Leu Gln 20 25 30 Lys Tyr Ser Tyr Cys Arg Gln Lys Ile Gln Glu Ala Leu His Ala Cys 35 40 45 <210> 7 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Leu Lys Trp Glu Leu Phe Gln Leu Ala Asp Leu Asp Thr Tyr Gln 1 5 10 15 Gly Met Leu Lys Leu Leu Phe Met Lys Glu Leu Glu Gln Ile Val Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Ala Tyr Arg Gln Ala Leu Leu Thr Glu Leu Glu Asn Arg 35 40 45 <210> 8 <211> 48 <212> PRT <213> Drosophila <400> 8 Leu Leu Gln Phe Asn Met Phe Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gly Phe Asp 1 5 10 15 Ser Met Leu Val Arg Leu Phe Lys Gln Glu Leu Gly Thr Ile Val Gly 20 25 30 Phe Tyr Glu Arg Tyr Arg Arg Ala Leu Ile Leu Glu Lys Asn Arg Arg 35 40 45 <210> 9 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated Mst1 SARAH Domain <400> 9 Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln Lys Arg 1 5 10 15 Leu Leu Ala Leu Asp Pro Met Met Trp Gln Glu Ile Glu Glu Ile Arg 20 25 30 Gln Lys Tyr Gln Cys Lys Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala 35 40 45 Lys <210> 10 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated Mst2 SARAH Domain <400> 10 Asp Phe Asp Phe Leu Lys Asn Leu Ser Leu Glu Glu Leu Gln Met Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Arg Glu Ile Glu Glu Leu Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr Thr Cys Gln Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Met Asp Ala 35 40 45 Lys <210> 11 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated Hippo SARAH Domain <400> 11 Phe Glu Phe Leu Lys Phe Leu Thr Phe Asp Asp Leu Asn Gln Arg Leu 1 5 10 15 Cys Asn Ile Asp His Glu Met Glu Leu Glu Ile Glu Gln Leu Asn Lys 20 25 30 Lys Tyr Asn Cys Lys Arg Gln Pro Ile Val Asp Ala Met Asn Ala Lys 35 40 45 <210> 12 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated RASSF SARAH Domain <400> 12 Val Ala Gln Phe Leu Asn Leu Ser Leu Pro Glu Cys Arg Ala Ile Leu 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Asp Glu Leu Ala Arg Glu Val Ala Lys Ile Lys Glu Arg 20 25 30 Tyr Ala Cys Leu Arg Arg Arg Ile Val Ser Arg Met Glu Ser Leu 35 40 45 <210> 13 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated RASSF5 SARAH Domain <400> 13 Glu Val Glu Trp Asp Ala Phe Ser Ile Pro Glu Leu Gln Asn Phe Leu 1 5 10 15 Thr Ile Leu Glu Lys Glu Glu Gln Asp Lys Ile Gln Gln Val Gln Lys 20 25 30 Lys Tyr Asp Cys Phe Arg Gln Lys Leu Glu Glu Ala Leu Arg Glu Ser 35 40 45 <210> 14 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated RASSF1 SARAH Domain <400> 14 Glu Val Asn Trp Asp Ala Phe Ser Met Pro Glu Leu His Asn Phe Leu 1 5 10 15 Arg Ile Leu Gln Arg Glu Glu Glu Glu His Leu Arg Gln Ile Leu Gln 20 25 30 Lys Tyr Ser Cys Cys Arg Gln Lys Ile Gln Glu Ala Leu His Ala Cys 35 40 45 <210> 15 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated WW45 SARAH Domain <400> 15 Ile Leu Lys Trp Glu Leu Phe Gln Leu Ala Asp Leu Asp Thr Tyr Gln 1 5 10 15 Gly Met Leu Lys Leu Leu Phe Met Lys Glu Leu Glu Gln Ile Val Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Cys Tyr Arg Gln Ala Leu Leu Thr Glu Leu Glu Asn Arg 35 40 45 <210> 16 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated Sav SARAH Domain <400> 16 Leu Leu Gln Phe Asn Met Phe Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gly Phe Asp 1 5 10 15 Ser Met Leu Val Arg Leu Phe Lys Gln Glu Leu Gly Thr Ile Val Gly 20 25 30 Phe Tyr Glu Cys Tyr Arg Arg Ala Leu Ile Leu Glu Lys Asn Arg Arg 35 40 45 <210> 17 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-SARAH(Y35C) of P20.1 Antibody <400> 17 Met Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Gln Lys Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr 20 25 30 Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Ser Leu Lys Trp 35 40 45 Ile Gly Trp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ile Ala 65 70 75 80 Tyr Leu His Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Gly Pro Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr 115 120 125 Val Glu Asp Leu Gln Lys Arg Leu Leu Ala Leu Asp Pro Met Met Glu 130 135 140 Gln Glu Ile Glu Glu Ile Arg Gln Lys Cys Gln Ser Lys Arg Gln Pro 145 150 155 160 Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala Lys 165 <210> 18 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-SARAH(M24C) of P20.1 Antibody <400> 18 Met Gly Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr 20 25 30 Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe 35 40 45 Thr Gly Leu Ile Val Gly Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Glu Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr 65 70 75 80 Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr 85 90 95 Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gly Ser Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln 115 120 125 Lys Arg Leu Leu Ala Leu Asp Pro Met Cys Glu Gln Glu Ile Glu Glu 130 135 140 Ile Arg Gln Lys Tyr Gln Ser Lys Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile 145 150 155 160 Glu Ala Lys <210> 19 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-SARAH(Y35C) of P20.1 Antibody <400> 19 atgcagatcc agttggtgca gtctggacct gaggtgcaga agcctggaga gacagtcagg 60 atctcctgca aggcttctgg gtataccttc acaactgctg gaatgcagtg ggtgcaaaag 120 atgccaggaa agagtttgaa gtggattggc tggataaaca cccgctctgg agtgccaaaa 180 tatgcagaag acttcaaggg acgttttgcc ttctctttgg aaacctctgc cagtattgca 240 tatttacata taaacaacct caaaaatgag gacacggcta cctatttctg tgcgagagag 300 gggcctggat ttgtttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcgag cggatccgac 360 tacgagtttc ttaagagttg gacagtggag gaccttcaga agaggctctt ggccctggac 420 cccatgatgg agcaggagat tgaagagatc cggcagaagt gccagtccaa gcggcagccc 480 atcctggatg ccatagaggc taagtag 507 <210> 20 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-SARAH(M24C) of P20.1 Antibody <400> 20 atgggccaga tccagttggt gcagtctgga cctgaggtgc agaagcctgg agagacagtc 60 aggatctcct gcaaggcttc tgggtatacc ttcacaactg ctggaatgca gtgggtgcaa 120 aagatgccag gaaagagttt gaagtggatt ggctggataa acacccgctc tggagtgcca 180 aaatatgcag aagacttcaa gggacgtttt gccttctctt tggaaacctc tgccagtatt 240 gcatatttac atataaacaa cctcaaaaat gaggacacgg ctacctattt ctgtgcgaga 300 gaggggcctg gatttgttta ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc gagcggatcc 360 gactacgagt ttcttaagag ttggacagtg gaggaccttc agaagaggct cttggccctg 420 gaccccatga tggagcagga gattgaagag atccggcaga agtgccagtc caagcggcag 480 cccatcctgg atgccataga ggctaagtag 510 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C8 Peptide <400> 21 Pro Arg Gly Tyr Pro Gly Gln Val 1 5 <210> 22 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-SARAH(Y35C) of P20.1 Antibody <400> 22 Met Leu Asp Ala Ser Gly Cys Ser Trp Met Trp Thr Trp Ala Leu Leu 1 5 10 15 Gln Leu Leu Leu Leu Val Gly Pro Gly Gly Cys Gly Arg Gln Ile Gln 20 25 30 Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Gln Lys Pro Gly Glu Thr Val Arg 35 40 45 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Gly Met Gln 50 55 60 Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Ser Leu Lys Trp Ile Gly Trp Ile 65 70 75 80 Asn Thr Arg Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly Arg 85 90 95 Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ile Ala Tyr Leu His Ile 100 105 110 Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu 115 120 125 Gly Pro Gly Phe Val Tyr Trp Gly 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atgatggagc aggagattga agagatccgg 540 cagaagtgcc agtccaagcg gcagcccatc ctggatgcca tagaggctaa gtaa 594 <210> 24 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-SARAH(M24C) of P20.1 Antibody <400> 24 Met Leu Asp Ala Ser Gly Cys Ser Trp Met Trp Thr Trp Ala Leu Leu 1 5 10 15 Gln Leu Leu Leu Leu Val Gly Pro Gly Gly Cys Gly Arg Thr Gln Thr 20 25 30 Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val 35 40 45 Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr 50 55 60 Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile 65 70 75 80 Val Gly Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 85 90 95 Ser Leu Ile Glu Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr 100 105 110 Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp 115 120 125 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Asp Tyr 130 135 140 Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln Lys Arg Leu Leu 145 150 155 160 Ala Leu Asp Pro Met Cys Glu Gln Glu Ile 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gaggacacgg ctacctattt ctgtgcgaga 300 gaggggcctg gatttgttta ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc gagcggatcc 360 gactacgagt ttcttaagag ttggacagtg gaggaccttc agaagaggct cttggccctg 420 gaccccatga tggagcagga gattgaagag atccggcaga agtaccagtg caagcggcag 480 cccatcctgg atgccataga ggctaagtag 510 <210> 43 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH(112C)-SARAH of P20.1 Antibody <400> 43 Met Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Gln Lys Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr 20 25 30 Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Ser Leu Lys Trp 35 40 45 Ile Gly Trp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ile Ala 65 70 75 80 Tyr Leu His Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Gly Pro Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Cys Ser Gly Ser Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr 115 120 125 Val Glu Asp 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Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu 130 135 140 Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala 145 150 155 160 Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys 165 170 175 Gln Val Leu Gln Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp 180 185 190 Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val 195 200 205 Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr 210 215 220 Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp 225 230 235 240 Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys 245 250 255 Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Gln Glu Ser Glu Ile Cys 260 265 270 Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly 275 280 285 Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val 290 295 300 Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe 305 310 315 320 Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr 325 330 335 Tyr Lys Val Pro Gln Ser Arg Leu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 340 345 350 <210> 81 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T4L Protein <400> 81 Met Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Arg Glu Asn Leu 1 5 10 15 Tyr Phe Gln Gly Lys Asp Gly Ser Gly His Lys Asn Ile Phe Glu Met 20 25 30 Leu Arg Ile Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys Ile Tyr Lys Asp Thr Glu 35 40 45 Gly Tyr Tyr Thr Ile Gly Ile Gly His Leu Leu Thr Lys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala Ile Gly Arg Asn Thr 65 70 75 80 Asn Gly Val Ile Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys Leu Phe Asn Gln Asp 85 90 95 Val Asp Ala Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Ala Lys Leu Lys Pro 100 105 110 Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Leu Ile Asn Met 115 120 125 Val Phe Gln Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Phe Thr Asn Ser Leu 130 135 140 Arg Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu Ala Ala Val Asn Leu Ala 145 150 155 160 Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile 165 170 175 Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr Leu Glu His His His 180 185 190 His His His His His 195 <210> 82 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T4L Protein <400> 82 Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Arg Glu Asn Leu Tyr 1 5 10 15 Phe Gln Gly Lys Asp Gly Ser Gly His Lys Asn Ile Phe Glu Met Leu 20 25 30 Arg Ile Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Gly 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ile Gly Ile Gly His Leu Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu 50 55 60 Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala Ile Gly Arg Asn Thr Asn 65 70 75 80 Gly Val Ile Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys Leu Phe Asn Gln Asp Val 85 90 95 Asp Ala Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Ala Lys Leu Lys Pro Val 100 105 110 Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Leu Ile Asn Met Val 115 120 125 Phe Gln Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg 130 135 140 Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu Ala Ala Val Asn Leu Ala Lys 145 150 155 160 Ser Arg Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Thr 165 170 175 Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr Leu Glu His His His His 180 185 190 His His His His 195 <210> 83 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PA Peptide <400> 83 Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val 1 5 10 <210> 84 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence for producing scFv of NZ-1 Antibody <400> 84 Met Lys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Ala Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asp Lys Thr Tyr Tyr Gly Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 His Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Thr Ser Arg Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Val Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Asn Ser 130 135 140 Val Ser Thr Asn Leu Gly Ser Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser 145 150 155 160 Thr Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu 165 170 175 Gly Arg Ser Pro Thr Thr Met Ile Tyr Arg Asp Asp Lys Arg Pro Asp 180 185 190 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser 195 200 205 Ala Leu Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 210 215 220 Phe Cys His Ser Tyr Ser Ser Gly Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala 245 250 255 Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 265 270 <210> 85 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-SARAH(Y35C) of NZ-1 Antibody <400> 85 Met Lys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Ala Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asp Lys Thr Tyr Tyr Gly Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 His Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Thr Ser Arg Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Val Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser 115 120 125 Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln Lys Arg Leu Leu Ala Leu Asp Pro Met 130 135 140 Met Glu Gln Glu Ile Glu Glu Ile Arg Gln Lys Cys Gln Ser Lys Arg 145 150 155 160 Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala Lys 165 170 <210> 86 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-SARAH(M24C) of NZ-1 Antibody <400> 86 Met Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Asn Ser Val Ser Thr Asn Leu Gly 1 5 10 15 Ser Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Arg Ser Thr Gly Asn Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Arg Ser Pro Thr Thr 35 40 45 Met Ile Tyr Arg Asp Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Leu Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Asn Val Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Ser Tyr Ser 85 90 95 Ser Gly Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Ser Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln Lys 115 120 125 Arg Leu Leu Ala Leu Asp Pro Met Cys Glu Gln Glu Ile Glu Glu Ile 130 135 140 Arg Gln Lys Tyr Gln Ser Lys Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu 145 150 155 160 Ala Lys <210> 87 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-SARAH(Y35C) of SG/19 Antibody <400> 87 Met Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Leu Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Tyr Ile His Tyr Asn Glu Lys 50 55 60 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ser Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser 115 120 125 Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln Lys Arg Leu Leu Ala Leu Asp Pro Met 130 135 140 Met Glu Gln Glu Ile Glu Glu Ile Arg Gln Lys Cys Gln Ser Lys Arg 145 150 155 160 Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala Lys 165 170 <210> 88 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-SARAH(M24C) of SG/19 Antibody <400> 88 Met Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn 20 25 30 Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly 50 55 60 Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 85 90 95 Asn Asp Asn Ser His Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Leu Lys Ala Gly Ser Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr Val Glu 115 120 125 Asp Leu Gln Lys Arg Leu Leu Ala Leu Asp Pro Met Cys Glu Gln Glu 130 135 140 Ile Glu Glu Ile Arg Gln Lys Tyr Gln Ser Lys Arg Gln Pro Ile Leu 145 150 155 160 Asp Ala Ile Glu Ala Lys 165 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eTEV Peptide <400> 89 Arg Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys Asp Gly 1 5 10

Claims

(a) 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, VH 영역이 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VH(112C)-SARAH)와,
(b) 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, SARAH 도메인이 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VL-SARAH(37C))와의 복합체로 이루어지는 프래그먼트 항체로서,
(c) VH(112C)-SARAH와 VL-SARAH(37C)가, 상기 2개의 시스테인 간의 다이설파이드 결합에 의하여 결합하고 있는 프래그먼트 항체.
청구항 1에 있어서,
상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 1~8로 나타나는 것이며, 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 9~16으로 나타나는 것인, 프래그먼트 항체.
청구항 1에 있어서,
상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 1~2로 나타나는 것이며, 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 9~10으로 나타나는 것인, 프래그먼트 항체.
(a) 항체의 중쇄 도메인(VH 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, VH 영역이 Chothia법에 의한 항체 잔기 번호 112의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VH(112C)-SARAH)와,
(b) 항체의 경쇄 도메인(VL 영역)의 C 말단에 SARAH 도메인의 N 말단이 결합한 펩타이드로서, SARAH 도메인이 C 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로 변이시킨 펩타이드(VL-SARAH(37C))와의 복합체로 이루어지는 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체로서,
(c) VH(112C)-SARAH와 VL-SARAH(37C)가, 상기 2개의 시스테인 간의 다이설파이드 결합에 의하여 결합하고 있는 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체.
청구항 4에 있어서,
상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 1~8로 나타나는 것이며, 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 9~16으로 나타나는 것인, 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체.
청구항 4에 있어서,
상기 VH(112C)-SARAH에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 1~2로 나타나는 것이며, 상기 VL-SARAH(37C)에 있어서의 SARAH 도메인이, 배열 번호 9~10으로 나타나는 것인, 단백질 결정화 촉진용 프래그먼트 항체.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 기재된 프래그먼트 항체를 이용하는, 단백질의 결정화 방법.