KR20190068853A - 갑상선암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 갑상선암 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 갑상선암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 갑상선암 진단 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 갑상선암 진단용 조성물은, 갑상선암 세포주를 이용한 세크리톰 분석에서 유의적으로 발현이 변화하는 단백질로서 선별 및 동정되고, 갑상선암 환자의 조직에서도 유의적으로 증가함이 확인된 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질의 발현량을 측정하는 시약을 포함함으로써, 갑상선암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

갑상선암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 갑상선암 진단 방법{DIAGNOSIS COMPOSITION OF THYROID CANCER AND DIAGNOSIS METHOD OF THYROID CANCER USING THE SAME}
본 발명은 갑상선암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 갑상선암 진단 방법에 관한 것이다.
갑상선암은 그 환자의 수가 빠른 속도로 증가하는 추세에 있는 암으로서, 예후가 좋은 것으로 알려져 있다. 또한, 암진단의 발전과 함께 과거에는 진단이 어려웠던 미세한 크기의 종양도 현재는 조기발견됨으로써 갑상선암에 걸린 환자의 생존율도 증가하고 있다. 그러나, 전체 갑상선암 환자의 66%는 10년 이내에 재발되는 경우가 많고, 일부 갑상선암은 매우 공격적인 성향을 보일 수 있어 지속적인 치료가 필요하다.
갑상선암의 종류에는 갑상선 유두암(papillary carcinoma), 여포암(follicular carcinoma), 수질암(medullary carcinoma), 미분화암(anaplastic thyroid cancer) 등이 있다. 이중 유두암이 갑상선암 환자의 90%를 차지하고 있고, 이는 생존율이 높으나 림프절 전이와 갑상선 피막침윤을 동반한 국소진행특성을 보여 일부 환자에서는 반복적으로 재발한다. 한편, 미분화암은 유두암과 여포암의 탈분화(dedifferentiation)에 의해, 즉 유두암과 여포암을 조기에 치료하지 않은 경우에 발생한다. 이분화암은 진단 후 수술이 불가능한 경우가 많으며 생존 기간도 3 내지 6개월로 짧다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1786309호는 사이클린 D1의 변형체인 사이클린 D1b의 mRNA 또는 단백질의 발현을 확인함으로써 갑상선 유두암종을 진단하는 방법을 개시하고 있다.
한편, 세크리톰 연구법은 프로테오믹스 분석법의 하나로서 세포에서 혈액으로 분비되는 단백질을 대상으로 수행된다. 이와 같은 세크리톰 연구법은 유전학, 전사체학뿐만 아니라 더 나아가 암의 실제 활동성을 알 수 있는 암의 바이오마커를 연구하는데 중요하다. 또한, 이는 종래의 유전체학 연구 결과 밝혀내지 못한 부분을 해결하는데 매우 유용한 것으로 알려졌다.
이에, 본 발명자들은 갑상선암을 진단할 수 있는 바이오마커를 개발하기 위해 노력하던 중, 갑상선암 세포주를 이용하여 세크리톰 분석을 수행함으로써 유의적으로 발현이 변화하는 단백질을 선별하고, 상기 선별된 단백질 중 9종류의 단백질을 동정하였다. 또한, 상기 9종류의 단백질 중, S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질이 갑상선 암 환자의 조직에서도 유의적으로 증가함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1786309호
본 발명의 목적은, 특정 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 이용하는 갑상선암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 갑상선암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 특정 단백질의 발현량을 측정함으로써 갑상선암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 시약을 포함하는 갑상선암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 갑상선암 진단용 조성물을 포함하는 갑상선암 진단용 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 시료로부터 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질 발현량을 정상 대조군의 단백질 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 갑상선암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 갑상선암 진단용 조성물은, 갑상선암 세포주를 이용한 세크리톰 분석에서 유의적으로 발현이 변화하는 단백질로서 선별 및 동정되고, 갑상선암 환자의 조직에서도 유의적으로 증가함이 확인된 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질의 발현량을 측정하는 시약을 포함함으로써, 갑상선암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 갑상선 모낭 상피세포인 Nthy-ori 3-1(N), 인간 갑상선 유두암 세포주인 SNU790(P) 또는 미분화 갑상선 암 세포주인 BHT101(A)를 이용하여 세크리톰을 2D PAGE 방법으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 갑상선암 환자로부터 수득된 갑상선암 조직에서 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯의 방법으로 확인한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 시약을 포함하는 갑상선암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 갖는 아미노산의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 상기 폴리펩티드는 경우에 따라서 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylaton), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.
상기 시약은 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합항체일 수 있다. 상기 항체는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 재조될 수 있다. 상기 항체 단편은 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 구체적으로 Fab, F(ab'), F(ab)2 및 Fv 등일 수 있다. 상기 앱타머는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 분자로서 RNA, DNA, 수식화된 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 이는 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.
상기 단일클론항체는 통상의 기술분야에 잘 알려진 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같이 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 분리된 면역 세포와 암 세포주를 융합하여 만들 수 있다. 이와 같은 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 수행되고 항체를 생산하는 세포는 표준적인 배양방법으로 증식시킬 수 있다. 구체적으로, 한계 희석법을 이용하여 서브 클로닝을 실시하고, 균일한 세포 집단을 수득한 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양하여 제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다.
상기 다클론항체는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 레트, 양, 토끼와 같은 포유동물일 수 있다. 상기 면역원이 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되는 경우, 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수득하고 이로부터 항체를 분리 및 정제하여 제조될 수 있다.
상기 시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
상기 시약은 추가로 상기 시약에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 갑상선암 세포주에서 세크리톰 분석을 수행하여 유의적으로 발현이 변화하는 단백질을 선별 및 동정하고(도 1 및 표 1 참조), 상기 선별된 단백질 중, S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질이 갑상선암 환자로부터 수득된 갑상선암 조직에서도 유의적으로 발현이 증가함으로 확인하였다(도 2 참조).
따라서, S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질의 발현량을 측정하는 시약을 포함하는 조성물은 갑상선암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 갑상선암 진단용 조성물을 포함하는 갑상선암 진단용 키트를 제공한다.
상기 갑상선암 진단용 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 갑상선암 진단용 조성물은 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 시약을 포함할 수 있다.
한편, 시약은 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 시약은 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
상기 키트는 피검사자가 갑상선암 위험군인지 아닌지를 구별하여 의사 등 진료 행위자가 갑상선암을 진단할 수 있게 한다. 또한, 마우스 및 랫트 등의 갑상선암 모델의 생체 내 또는 생체 외에서 하나 이상의 마커의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다.
상기 갑상선암 진단용 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 갑상선암 세포주에서 세크리톰 분석을 수행하여 유의적으로 발현이 변화하는 단백질을 선별 및 동정하고(도 1 및 표 1 참조), 상기 선별된 단백질 중, S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질이 갑상선암 환자로부터 수득된 갑상선암 조직에서도 유의적으로 발현이 증가함으로 확인하였다(도 2 참조).
따라서, S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질의 발현량을 측정하는 시약을 포함하는 조성물은 갑상선암 진단용 키트로 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 시료로부터 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질 발현량을 정상 대조군의 단백질 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 갑상선암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
상기 시료는 소변, 혈액, 혈청 또는 혈장 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 단백질의 발현량을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 생물학적 액체 시료인 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 발현량은 웨스턴블랏, 효소-면역화학 검출법(ELISA), 면역조직화학 염색법, 면역침강 및 면역형광법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다. 이때, S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현량은 정상 대조군에 비해 증가할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 갑상선암 세포주에서 세크리톰 분석을 수행하여 유의적으로 발현이 변화하는 단백질을 선별 및 동정하고(도 1 및 표 1 참조), 상기 선별된 단백질 중, S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질이 갑상선암 환자로부터 수득된 갑상선암 조직에서도 유의적으로 발현이 증가함으로 확인하였다(도 2 참조).
따라서, S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질의 발현량을 측정하는 것을 포함하는 방법은 갑상선암의 진단을 위한 정보 제공방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 갑상선암 세포주를 이용한 세크리톰 분석
2종류의 갑상선암 세포주를 무혈청(serum-free) 배양 배지를 사용하여 배양한 뒤, 세크리톰(secretome) 분석을 수행하여 그 분비량이 증가한 단백질을 확인하였다.
먼저, 인간 갑상선 유두암 세포주인 SNU790(한국세포주은행, 대한민국), 미분화 갑상선 암 세포주인 BHT101(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH German Collection of Microorganisms and Cell Culture(DSMZ), 독일)을 5% 페니실린/스트렙토마이신(WelGene, 대한민국) 및 10% 소태아혈청(Capricorn, 독일)이 포함된 RPMI1640(Capricorn, 독일) 배양 배지를 사용하여 배양하여 준비하였다. 준비된 세포는 우태아 혈청이 포함되지 않은 배양 배지를 사용하여 약 500 ㎖의 배양액이 확보될 때까지 계대배양하였다. 배양은 37℃, 5% CO2의 조건하에서 수행되었다. 이때, 대조군으로서 인간 갑상선 모낭 상피세포인 Nthy-ori 3-1(Sigma-Aldrich, 미국)을 사용하였다. 확보된 배양액을 원심분리하여 세포만을 수득하고, 수득된 세포에 7 M의 우레아(urea), 2 M의 티오우레아(thiourea), 4%(w/v)의 CHAPS(3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate), 1%(w/v) DTT(dithiothreitol), 2%(v/v) 파말레이트(pharmalyte) 및 1 mM 벤즈아미딘(benzamidine)을 포함하는 2DE 용해 완충액을 첨가하였다. 2DE 용해 완충액이 첨가된 세포를 1시간 동안 볼텍싱하여 단백질을 추출한 뒤, 이를 15℃ 및 15,000 rpm의 조건하에서 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상층액에 포함된 단백질의 양은 통상의 기술분야에 알려진 브래드포드 방법으로 측정하였다.
이후, 추출된 단백질을 이용하여 2D PAGE를 수행하였다. 구체적으로, 일차 IEF(isoelectric focusing)를 위해 IPG 스트립(strip)에 7 M의 우레아, 2 M의 티오우레아, 2%(w/v)의 CHAPS, 1%(w/v) DTT 및 1%(v/v) 파말레이트를 포함하는 재팽윤(reswell) 완충액을 첨가하였다. 이를 상온에서 12 내지 16시간 동안 반응시켰다. 이때, 스트립 당 상기에서 추출된 단백질 200 ㎍을 사용하였고, Multiphore II 시스템(Amersham Biosciences, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 20℃의 IEF를 수행하였다. IEF의 조건은 150 V에서 3,500 V까지의 도달시간을 3시간으로 설정하고, 3,500 V에서 26시간 동안 지속시킨 뒤, 최종적으로 96 ㎸h가 되도록 설정하였다. IEF를 완료한 뒤, IPG 스트립을 1% DTT가 포함된 평형 완충액(50 mM Tris-Cl, pH 6.8, 6 M 우레아, 2% SDS 및 30% 글리세롤)에 넣어 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나고, 2.5%의 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 포함하는 평형 완충액에 넣어 10분 동안 더 반응시켰다. 평형화된 IPG 스트립을 SDS-PAGE 겔(20x24 ㎝, 10~16%) 위에 배열시키고, Hoefer DALT 2D 시스템(Amersham Biosciences)을 이용하여 20℃에서 1.7 ㎸h가 되도록 전개하였다. 전기영동이 완료된 겔의 단백질은 은염색을 하여 시각화하였고, 은염색된 겔로부터 Duoscan T1200 스캐너로 스캐닝하여 수득된 사진을 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 갑상선암 세포주에서 발현이 변화된 단백질의 동정
실시예 1에서 2D PAGE를 수행하여 수득한 결과에서 대조군에 비해 두배 이상 유의한 발현 변화를 나타내는 단백질 스팟을 MS 분석을 이용하여 동정하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 수득된 사진으로부터 스팟(spot)의 발현 변화를 PDQuest 소프트웨어(BioRad, 미국)를 사용하여 정량적으로 분석하였고, 각 스팟의 수는 전체 스팟의 밀도로 평준화(normalization)하였다. 대조군에 비해 유의한 발현 변화를 나타내는 단백질 스팟을 선별하고, 액체질량분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 선별된 스팟이 나타내는 단백질을 동정하였다. LC-MS/MS는 애질런트 1100 시리즈 캐필러리 액체 크로마토그래피 및 이온트랩 질량분석 시스템을 사용하였고, 질량분석은 양이온 모드(positive ion mode)에서 ESI(electrospray ionization) 시스템을 사용하여 분석하였다. 질량분석 결과 수득된 데이터를 이용하여 MASCOT(http://www.matrixscience.com) 데이터베이스를 이용하여 단백질을 동정하였다. 그 결과, 동정된 단백질을 하기 표 1에 나타내었다.
스팟
번호		 단백질 이름 Accession No. MW PI 서열 커버리지(%) 점수 폴드 SNU790(P)/Nthy-ori 3-1(N) 폴드 HHT101(A)/Nthy-ori 3-1(N)
4001 S100a4 gil394986362 10.9 5.9 39 93 0.127 231.085
1706 알부민 gil367460260 23.9 5.8 30 197 10.357 2.403
5411 카텝신 B NP_001899.1 49.7 6.2 48 139 161.373 0.098
2403 β-액틴 gil15277503 49.4 5.2 56 172 0.520 1.792
8312 MMP-1 BAD96755.1 65.3 6.61 47 191 10.257 47.8168
6806 피브로넥틴 1 AAl17177.1 152.6 5.6 23 220 11620.8 686.15
1002 티오레독신 아이소폼 1 NP_003320.2 10.9 4.82 81 114 2.398 0.391
5006 페록시레독신-2 BAG57331.1 19.9 8.9 44 124 2.087 1.518
102 14-3-3 β/α NP_003395.1 24.3 4.76 46 135 2.612 0.769
실험예 1. 갑상선 암 환자의 조직에서 동정된 단백질의 발현 변화 확인
갑상선 암 세포주에서 발현이 변화된 것으로 동정된 단백질 중에서 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α 단백질을 선별하여, 상기 단백질이 갑상선암 환자의 조직에서도 발현이 변화하는지를 웨스턴 블롯의 방법으로 확인하였다.
먼저, 2013년 9월부터 2015년 11월에 모집된 87명의 갑상선암 환자들로부터 갑상선 조직 샘플을 수득하였다. 갑상선암 절제술을 통해 얻어진 갑상선암 조직은 길의료재단의 바이오뱅크에 의해 수거되어 사용전까지 -80℃에 보관되었다. 갑상선암 조직 샘플의 수집에 대한 동의는 가천대학교 및 길의료재단의 윤리위원회가 발행한 가이드라인에 따라 얻었으며, 이를 이용한 모든 실험방법 또한 가천대학교 및 길의료재단의 검토위원회에 의해 승인되었다.
상기 수득된 갑상선암 조직을 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 구체적으로, 수득된 갑상선암 조직에 용해 완충액(25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100 및 25 mM Tris-HCl, pH 7.4 및 2 mM EDTA)을 첨가하고, 4℃에서 15분 동안 방치한 뒤, 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 이용하여 브래드포드 방법으로 단백질의 양을 정량하였다. 정량된 단백질을 10% SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동하고, 이를 100 V의 조건하에서 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 니트로셀룰로오스 막을 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충액에 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 1차 항체로서 S100A4, 카텝신 B 또는 14-3-3 β/α 단백질에 대한 항체를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 니트로셀룰로오스 막을 TBS-T 완충액으로 3회 세척한 뒤, 페록시다제(peroxidase)가 결합된 2차 항체를 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 니트로셀룰로오스 막을 TBS-T 완충액으로 세척하고, ECL 용액(Advansta, 미국)을 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 S100A4, 카텝신 B 또는 14-3-3 β/α 단백질이 갑상선암 환자의 암조직에서 발현이 유의적으로 증가하였다(도 2 참조).

Claims (4)

  1. S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 시약을 포함하는 갑상선암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시약이 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 갑상선암 진단용 조성물.
  3. 제1항의 갑상선안 진단용 조성물을 포함하는 갑상선암 진단용 키트.
  4. 1) 시료로부터 S100A4, 카텝신 B 및 14-3-3 β/α로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 측정된 단백질 발현량을 정상 대조군의 단백질 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 갑상선암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
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