KR20190067117A - 세포독성 t 세포 생성방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시험관내에서 세포독성 T 세포를 생성하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 및 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체를 이용한 T 세포 자극을 통하여 항원특이적 기억 세포독성 T 세포를 효율적으로 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지의 사용으로 면역체크포인트 분자들의 발현을 억제한 종양특이적인 기억 세포독성 T 세포의 생성 효율을 극대화할 수 있으므로, 이렇게 생성된 세포독성 T 세포를 면역치료, 항종양치료 등 다양한 분야에 응용할 수 있다.
Description
본 발명은 시험관내에서 세포독성 T 세포를 생성하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 및 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체를 이용한 T 세포 자극을 통하여 항원특이적 기억 세포독성 T 세포를 효율적으로 생성하는 방법에 관한 것이다.
현재 미세수술요법 및 방사선 치료법의 발달과 함께 화학요법과 같은 새로운 치료제의 개발에도 불구하고, 많은 악성 종양의 경우 치료 효과가 제한적이므로 우리 몸 자체의 면역 기능을 이용한 차세대 면역세포치법의 개발이 필요하다. 면역항암 치료법은 다른 기존의 치료법인 화학약품, 방사선 치료에 비해 비교적 부작용이 작고 다른 치료법과 같이 동반치료를 수행했을 시 우수한 효과를 나타내므로 최근에 중요성이 더욱 부각되고 있는 치료법이다.
인체의 면역기능에는 체액성 면역과 세포성 면역이 있다. 체액성 면역은 세균, 바이러스 등 외부항원이 체내에 들어왔을 때 그 항원을 제거하기 위해 B 세포가 항체를 만들어 내는 일련의 과정이다. 한편 세포성 면역은 세포 내로 들어온 바이러스나 종양의 항원이 주 조직 적합성 분자에 의해 세포표면에 제시되어 이에 반응하는 T 세포(림프구)를 만들어 내는 것으로 감염되거나 비정상적인 세포를 제거하는 것이다. 암에 관한 면역에서는 체액성 면역보다 CD8+ T 세포를 중심으로 한 세포성 면역이 더 중요한 역할을 한다.
기존의 면역세포치료법이 가지는 문제점으로는 종양항원특이성 부족, 짧은 체내 유지기간, 대량 이식에 따른 사이토카인 충격 등의 부작용, 종양의 면역회피기전에 취약 및 수지상 세포의 체외증식의 어려움 등이 있다. 특히, 면역세포를 이용한 항암치료에서 과도한 면역반응을 제어하기 위해서 항원을 인식한 T 세포가 면역체크포인트 수용체들 (CTLA-4, PD-1 등)을 발현하여 면역체크포인트 리간드 (B7, PD-L1)를 발현하는 다른 세포들과 접촉할 때 T 세포의 활성이 억제된다는 문제가 있다 (Chen L et al., Nat. Rev. Immunol . 13(4):227242, 2013). 다수의 암세포들은 면역체크포인트 수용체들을 자극하는 리간드 발현을 통해 항암면역세포의 활성을 저해하는 면역회피 기작을 사용한다. 따라서 항암면역세포치료에 대한 내성암 발생가능성을 높이고 있다. 이러한 문제를 극복하고자, 현재 전 세계적으로 면역조절기전 저해제 (예: 항-CTLA항체, 항-PD-1항체, 항-PD-L1항체) 등을 사용하여 종양의 면역회피 기작을 저해하려는 시도들이 활발히 시도되고 있다 (Connie Lee Batlevi et al., Nat Rev Clin Oncol . 13(1):2540, 2016).
세포독성 T 세포를 이용한 종양치료에 관한 연구에서, 종양 항원에 특이적인 세포독성 T 세포를 생성하는 생체 내 (in vivo) 방법이 연구되었으나, 암환자의 경우 다수의 불활성화 된 수지상 세포가 기능이 저하되어 있기 때문에 환자의 수지상 세포를 통해서 종양항원 특이 CD8+ 세포독성 T 세포를 자극하는 것은 적절하게 환자의 면역시스템을 작동시킬 수 없다. 즉, 암환자들의 경우 다수의 불활성화 된 수지상 세포를 가지고 있으며, T 세포 활성을 저해하는 면역조절시스템이 공존하기 때문에 정상적으로 기능이 수행되기 어렵다. 이러한 이유로 암환자의 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생체 내에서 생성하기는 어렵다.
따라서, 시험관 내에서 종양항원 특이적 세포독성 T 세포를 생성하는 방법이 연구되고 있다. 그러나, 종양항원 특이적 세포독성 T 세포 생성을 위해 주로 환자의 CD8+T 세포 또는 말초혈액림프구 (peripheral blood lymphocytes)를 반응세포로 이용하는 이전 연구들에서는 이들 세포들을 시험관 내에서 증식시키게 되면 체외 증식된 세포독성 T 세포가 대부분 효과 (effector) T 세포이기 때문에 면역세포치료 목적으로 환자에 이식하는 경우 대부분 수일 내 사멸하였다 (Rosenberg et al., Nature Reviews, 3:666-675, 2003). 이런 효과를 상쇄하기 위해 대량의 세포독성 T 세포를 이식하게 되면, 이미 활성화된 세포독성 T 세포들은 IFN-γ 등 항염증 사이토카인을 대량 방출하므로 환자에게 아나필락시스 등의 충격 (cytokine release syndrome, CRS)을 유발하게 된다. 이를 방지하기 위해서는 이식되는 T 세포의 숫자를 가능한 한 적게 하여야 한다.
상기와 같은 이유로 인해, 종양특이적 세포독성 T 세포를 기억 T 세포 형태로 소량 이식하는 경우 안전하며 항암 활성이 지속되고, 결과적으로 항종양효과가 가장 높다는 것이 잘 알려져 있다 (Klebanoff CA et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102(27):9571-6, 2005). 하지만, 동물모델과 달리 환자의 경우 기억 T 세포를 선택적으로 분리할 여유가 없으므로, 세포독성 T 세포 증식단계에서 기억 T 세포의 비율(점유율)을 높여줄 필요가 있다. 즉, 세포독성 T 세포의 증식 및 생존률이 증가하더라도 증식된 T 세포 중에 기억 T 세포의 점유율이 당연히 증가하는 것이 아니므로 효과적인 T 세포 살상 효과를 얻기 위해서는 기억 T 세포의 점유율을 높이는 것이 중요하다.
이에, 본 발명자들은 효율적으로 종양 항원 특이적인 기억 세포독성 T 세포를 획득할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 다양한 세포의 배양액들 중 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 (conditioned media)를 시험관 내에서 세포독성 T 세포를 증식시킬 때 첨가하게 되면 기억 T 세포의 점유율이 높아지고 면역체크 포인트 분자들의 발현이 억제되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 면역체크포인트 분자들의 발현이 억제된 항원 특이적 기억 세포독성 T 세포를 시험관내에서 생성하는 방법 및 상기 기억 세포독성 T 세포를 효율적으로 생성하기 위해 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 포함하는 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법 및 조성물을 이용하여 생성된 기억 세포독성 T 세포를 포함하는 면역질환 또는 암의 치료제 및 항종양 백신을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 포함하는 배지에서 CD8+ T 세포를 배양하여 세포독성 T세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 세포독성 T 세포의 생성방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 환원제를 포함하는 기본배지에서 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 유효성분으로 포함하는 CD8+ T 세포로부터 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 항종양 백신을 제공한다.
본 발명에 따르면, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지의 사용으로 면역체크포인트 분자들의 발현을 억제한 종양특이적인 기억 세포독성 T 세포의 생성 효율을 극대화할 수 있으므로, 이렇게 생성된 세포독성 T 세포를 면역치료, 항종양치료 등 다양한 분야에 응용할 수 있다.
도 1은 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체를 이용한 시험관 내에서의 T 세포 증식 결과를 나타낸 것으로, OVA 펩타이드(257-264)를 선택적으로 인식하는 T 세포를 이용하여 항원특이적 T세포 증식 및 활성화 유도를 확인한 것이다.
도 2의 (A)는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 이용한 세포독성 T 세포 (cytotoxic T lymphocytes, CTLs) 유도를 나타낸 것으로, 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체에 의해 자극된 CD8+ T 세포가 분비하는 IFN-γ와 그랜자임 B 양을 측정한 결과이며, (B)는 3 종류의 섬유아세포 및 CHO 세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포 중 IFN-γ와 그랜자임 B를 분비하는 세포 빈도를 flow cytometry로 분석한 것이다.
도 3은 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 이용하여 유도된 세포독성 T 세포의 면역체크포인트 분자들의 발현을 확인한 것으로, 조건배지와 재조합 IL7 (interleukin 7, 인터루킨 7)를 함께 처리한 후 자극된 CD8+ T 세포가 발현하는 면역체크포인트 분자들의 발현을 flow cytometry로 분석한 것이다.
도 4는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 처리 후, 자극된 CD8+ T 세포에서 (A) 중심기억 세포 (central memory cytotoxic T cell)로의 분화 및 (B) 발현하는 다양한 표면분자를 flow cytometry로 확인한 것이다. (CM: conditioned media, MEF: mouse embryonic fibroblast, 3T3: NIH3T3 세포)
도 5는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 이용하여 세포독성 T 세포의 중심기억 세포의 주요 전사인자인 Eomes 발현이 증가하는 것을 나타낸 것이다.
도 6의 A 및 B는 종양세포를 접종한 마우스에 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포를 이식하여, (A) 종양의 부피를 측정하여 종양세포 성장을 확인 및 (B) 말초혈액, 림프절, 비장 및 종양 내 림프구 중 종양 특이적 CD8 T+ 세포 빈도의 비율을 FACS로 분석하였다. 또한, 도 6의 C 및 D는 상기 종양세포를 접종한 마우스에 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포를 이식한 종양 모델로부터 CD8+ T세포를 분리한 후, 종양침투 한 CD8 T+ 세포에서 (C) 면역체크포인트 분자 (PD-1, Tim-3)를 발현하는 세포 빈도의 비율 및 (D) IFN-γ, TNF-α 및 그랜자임 B를 발현하는 세포 빈도의 비율을 나타낸 것이다.
도 7은 항원특이 T 세포를 마우스 C57BL/6의 MHC-I 분자인 Kb에 제시된 OVA 펩타이드(257-264)를 선택적으로 인식하는 OT-1 T 세포와 야생형 T 세포를 1:99 비율로 섞은 후 재조합 Kb/OVA 복합체로 자극하는 환경에서 섬유아세포 배양액을 처리하여 항원특이 T 세포가 특이적으로 빠르게 증식함을 보여주는 그래프이다. (A) 실험 계획 및 방법을 나타낸 것으로, 항원특이 T 세포를 야생형 T 세포와 식별하고자 림프구 마커인 CD45.1(Ly5.1)를 발현하는 마우스로부터 항원특이 T 세포를 (OT-1) 분리하였다. 야생형 마우스는 CD45.2(Ly5.2)만을 발현한다. (B) 배양기간에 따른 항원특이 (Ly5.1 양성) T 세포의 증식을 전체 세포 중 비율 (왼쪽 그래프) 및 처음 세포 수 대비 증식되는 배율 (오른쪽 그래프)로 나타낸 것이다.
도 8은 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지로 자극된 인간 CD8+ T 세포에서 (A) 항원 특이적으로 증식되는 T 세포의 숫자를 그래프로 보여주는 것이고, (B) 중심기억 세포 (central memory cytotoxic T cell)와 줄기세포 유사 기억 세포 (stem cell like memory cytotoxic T cell)로의 분화 및 (C) PD-1 발현 증가가 억제되는 것을 flow cytometry로 확인한 것이다. (D)는 CMV 펩티드 항원을 첨가한 T2 세포주에 대한 CMV-특이 인간 T 세포의 표적 세포 살상효과를 Calcein AM 분석법으로 확인한 것이다.
도 2의 (A)는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 이용한 세포독성 T 세포 (cytotoxic T lymphocytes, CTLs) 유도를 나타낸 것으로, 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체에 의해 자극된 CD8+ T 세포가 분비하는 IFN-γ와 그랜자임 B 양을 측정한 결과이며, (B)는 3 종류의 섬유아세포 및 CHO 세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포 중 IFN-γ와 그랜자임 B를 분비하는 세포 빈도를 flow cytometry로 분석한 것이다.
도 3은 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 이용하여 유도된 세포독성 T 세포의 면역체크포인트 분자들의 발현을 확인한 것으로, 조건배지와 재조합 IL7 (interleukin 7, 인터루킨 7)를 함께 처리한 후 자극된 CD8+ T 세포가 발현하는 면역체크포인트 분자들의 발현을 flow cytometry로 분석한 것이다.
도 4는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 처리 후, 자극된 CD8+ T 세포에서 (A) 중심기억 세포 (central memory cytotoxic T cell)로의 분화 및 (B) 발현하는 다양한 표면분자를 flow cytometry로 확인한 것이다. (CM: conditioned media, MEF: mouse embryonic fibroblast, 3T3: NIH3T3 세포)
도 5는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 이용하여 세포독성 T 세포의 중심기억 세포의 주요 전사인자인 Eomes 발현이 증가하는 것을 나타낸 것이다.
도 6의 A 및 B는 종양세포를 접종한 마우스에 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포를 이식하여, (A) 종양의 부피를 측정하여 종양세포 성장을 확인 및 (B) 말초혈액, 림프절, 비장 및 종양 내 림프구 중 종양 특이적 CD8 T+ 세포 빈도의 비율을 FACS로 분석하였다. 또한, 도 6의 C 및 D는 상기 종양세포를 접종한 마우스에 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포를 이식한 종양 모델로부터 CD8+ T세포를 분리한 후, 종양침투 한 CD8 T+ 세포에서 (C) 면역체크포인트 분자 (PD-1, Tim-3)를 발현하는 세포 빈도의 비율 및 (D) IFN-γ, TNF-α 및 그랜자임 B를 발현하는 세포 빈도의 비율을 나타낸 것이다.
도 7은 항원특이 T 세포를 마우스 C57BL/6의 MHC-I 분자인 Kb에 제시된 OVA 펩타이드(257-264)를 선택적으로 인식하는 OT-1 T 세포와 야생형 T 세포를 1:99 비율로 섞은 후 재조합 Kb/OVA 복합체로 자극하는 환경에서 섬유아세포 배양액을 처리하여 항원특이 T 세포가 특이적으로 빠르게 증식함을 보여주는 그래프이다. (A) 실험 계획 및 방법을 나타낸 것으로, 항원특이 T 세포를 야생형 T 세포와 식별하고자 림프구 마커인 CD45.1(Ly5.1)를 발현하는 마우스로부터 항원특이 T 세포를 (OT-1) 분리하였다. 야생형 마우스는 CD45.2(Ly5.2)만을 발현한다. (B) 배양기간에 따른 항원특이 (Ly5.1 양성) T 세포의 증식을 전체 세포 중 비율 (왼쪽 그래프) 및 처음 세포 수 대비 증식되는 배율 (오른쪽 그래프)로 나타낸 것이다.
도 8은 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지로 자극된 인간 CD8+ T 세포에서 (A) 항원 특이적으로 증식되는 T 세포의 숫자를 그래프로 보여주는 것이고, (B) 중심기억 세포 (central memory cytotoxic T cell)와 줄기세포 유사 기억 세포 (stem cell like memory cytotoxic T cell)로의 분화 및 (C) PD-1 발현 증가가 억제되는 것을 flow cytometry로 확인한 것이다. (D)는 CMV 펩티드 항원을 첨가한 T2 세포주에 대한 CMV-특이 인간 T 세포의 표적 세포 살상효과를 Calcein AM 분석법으로 확인한 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
현재 사용되고 있는 면역요법으로는 면역조절 세포치료제의 원조라고 할 수 있는 림포카인 활성 세포 (LAK) 치료제가 있다. 이는 환자의 혈액에서 얻은 림프구에 인터루킨-2 (interleukin-2)를 넣어 배양하여 항암 능력을 증가시킨 세포 치료제이다. 또한, 인체 면역계의 자연 어쥬번트 (natural adjuvant)라고 표현되는 수지상 세포 (dendritic cells)를 이용한 면역치료법이 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포인 수지상 세포의 표면에 종양 항원의 펩타이드와 MHC (major histocompatibility complex)가 제시된 형태로 증식하여 투여하는 세포 치료제로서 2010년 미국 FDA에서 승인된 ProvengeTM (sipuleucel-T)가 있다. 그러나 수지상 면역조절 세포치료제의 경우, 수지상 세포에 탑재할 종양 항원의 생산과정이 별도로 필요하며, 종양 항원을 수지상 세포에 탑재하는 제조 과정이 복잡하고 제조비용이 높은 단점이 해결해야 할 과제이다.
T 세포 기반 면역치료제로서는 CTL에 종양 특이성을 부여한 CAR (chimeric antigen receptor) 기술이 B 세포 림프종, 혈액암 등에서 효능을 입증한 이후로 각광을 받고 있는 추세이다 (Nat Rev Cancer. 13(8):525-41, 2013). 그러나, CAR T 세포 치료제는 세포표면 항원을 인식하는 특성을 가지고 있어 강력한 효력을 나타내는 반면 부작용을 최소화하기 위해서는 일반 조직에 발현되지 않는 세포표면 암항원을 표적해야 하므로 개발에 어려움이 있다. 또한 유전자 조작을 위해서 고가의 레트로바이러스 (retrovirus) 또는 렌티바이러스 (lentivirus)를 이용해야 하므로 생산 단가를 낮추는 것이 해결해야 활 과제이다.
이에, 본 발명에서는 T 세포 자극을 통하여 세포독성 T 세포의 면역 체크포인트 분자의 발현을 억제하는 동시에 항원특이적 기억 세포독성 T 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 개발하고, 상기 세포독성 T 세포를 활용한 면역치료 등을 포함한 다양한 응용을 제시하였다.
본 발명에서는 섬유아세포를 배양하여 조건배지를 수득하고, 상기 조건배지와 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체를 이용하여 시험관내에서 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)를 증식시켰다. 이때 생성된 세포독성 T 세포는 면역체크포인트 분자들의 발현이 억제된 종양특이적인 기억 세포독성 T 세포의 점유율이 향상되었다. 또한, 이러한 종양 항원 특이적인 기억 세포독성 T 세포는 면역치료, 항종양치료 등 다양한 분야에 응용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 (conditioned media)(이하, “조건배지")를 시험관 내에서 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cell)를 증식시킬 때 첨가함으로써 기억 세포독성 T 세포 (memory cytotoxic T cell)의 점유율 (portion)을 효율적으로 늘리고 면역체크포인트 분자들의 발현을 억제시켰다.
다른 실시예에서는 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 시험관 내에서 세포독성 T 세포를 증식시킬 때 첨가함으로써 시험관내에서 항원 특이적인 세포독성 T 세포의 세포독성물질 (예를 들어, IFN-γ, 그랜자임 B 등)이 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 포함하는 배지에서 CD8+ T 세포를 배양하여 세포독성 T세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 세포독성 T 세포의 생성방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “조건 배지”는 세포 배양을 위해 처음 사용되는 신선한 배지에 대립되는 것으로서, 세포가 일정 기간 동안 배양된 배지를 의미하며, 통상 단백질, 사이토카인 등 세포로부터 분비 또는 방출된 성분을 함유하고 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 “기억 세포독성 T 세포(memory cytotoxic T cell)”는 항원자극을 받은 세포독성 T 세포 중 정지기에 들어가서 효과기 세포가 사멸한 후에도 장기간에 걸쳐 생존하는 기억 T세포로서, 동일한 항원에 대해 단시간에서 증식을 개시하여 대량의 효과기 세포를 유도함으로써, 신속하고 강력한 2차 면역 응답을 야기하는 세포독성 T 세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 세포독성 T 세포의 생성방법은 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 (conditioned media)를 시험관 내에서 세포독성 T 세포를 증식 시킬 때 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 세포독성 T 세포의 생성방법은 MHC class I(Kb)-OVA 펩타이드 복합체를 첨가하여 CD8+ T 세포를 배양하거나, 또는 HLA-A0201/A2402-CMV 펩타이드 복합체를 첨가하여 인간 CD8+ T 세포를 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 Kb에 한정된 오브알부민 (ovalbumin)의 257번째 아미노산에서 264번째 아미노산 서열일 수 있으며, HLA-A0201에 한정된 거대세포바이러스 pp65 단백질의 아미노산 495번째 아미노산에서 503번 아미노산 서열일 수 있고, HLA-A2402에 한정된 거대세포바이러스 pp65 단백질의 341번째 아미노산에서 349번 아미노산 서열인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 섬유아세포는 인간 유래 섬유아세포, 설치류 유래 섬유아세포 (예를 들어, 마우스 유래 섬유아세포, 래트 유래 섬유아세포 등) 및 조류 유래 섬유아세포로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 배양이 가능한 것으로 알려진 섬유아세포를 사용할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 실시예에서는, MEF (mouse embryonic fibroblast) 세포, NIH3T3 세포, HEK 293 (Human embryonic kidney) 세포, WI-38 세포, Hs27 (CRL-1634) 세포, Hs68 (CRL-1635) 세포, CCD1112Sk (CRL-2429) 세포 또는 BJ (CRL-2522) 세포를 섬유아세포로 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포독성 T세포 생성방법은 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체를 이용한 항원 특이적인 T 세포 자극을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 세포독성 T세포 생성방법은 상기 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 처리함으로써 기억 세포독성 T세포의 점유율을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 세포독성 T 세포는 기억 세포독성 T 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포독성 T 세포는 CTLA-4, PD-1 및 Tim-3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 면역체크포인트 분자의 발현이 감소하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 섬유아세포의 배양 배지는 환원제를 포함하는 기본배지인 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본 발명에서는 섬유아세포를 T 세포 배양 배지에서 배양하여 조건배지를 수득하였다.
일반적으로 세포 배양시 세포에서 생성되는 유독성의 산성 물질들과 활성산소의 작용을 억제하기 위해, 배양 배지에 환원제를 첨가할 수 있다. 이러한 환원제는 마우스 림프구 세포내의 시스테인과 글루타치온의 수준을 올리는 역할을 하여 (Ishii T, Sugita Y & Bannai S., Journal of Cellular, Physiology 133, 330-336, 1987), 면역세포의 활성화를 촉진시킨다. 그러나, 이러한 환원 환경 (Reducing environment)은 면역세포 배양에만 해당되며 간세포(Hepatocyte) 등은 환원제에 민감하여 사용할 수 없다.
즉, T 세포 배양 배지는 환원제를 포함할 수 있지만, 섬유아세포의 배양 시에는 환원제를 사용하지 않는 것이 일반적이다. 그러나, 본 발명에서는 섬유아세포의 배양시 배지에 환원제를 첨가하여 수행하였다. 특히, 본 발명에서 사용한 NIH3T3세포의 경우 ATCC의 권장 세포배양법에는 환원제를 사용하지 않고 배양하라고 명시되어 있으나, 본 발명자들은 환원제를 첨가함으로써 NIH3T3세포 배양액 내에 기억 세포독성 T 세포를 분화시키는 물질이 포함된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 환원제를 포함하는 기본배지에서 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지로 CD8+ T 세포를 배양하여 세포독성 T세포로 분화를 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 환원제는 β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol) 및 TCEP (tris(2-carboxyl)phosphine)로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 β-머캅토에탄올인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM, IMDM, MEM, RPMI1640 및 EMEM로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 DMEM인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 섬유아세포의 배양 배지는 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), L-글루타민, β-머캅토에탄올 및 항생제 칵테일을 포함하는 DMEM 배지인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10% 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 44mM 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 4mM L-글루타민, 5μM β-머캅토에탄올인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 섬유아세포의 배양은 2~3일 동안 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CD8+ T 세포의 배양 배지는 기본배지에 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), L-글루타민, β-머캅토에탄올 및 항생제 칵테일을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM, IMDM, MEM, RPMI1640 및 EMEM로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 RPMI1640인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일반적으로 DMEM 배지는 부착세포 배양에 사용하고, RPMI 배지는 부유세포에 배양에 사용하는 경향이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 특정세포의 배양을 위해 배지에 첨가하는 물질의 조성에 따라 DMEM 배지를 부유세포 배양에 사용하고, RPMI 배지를 부착세포 배양에 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CD8+ T 세포의 배양 배지는 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), L-글루타민, β-머캅토에탄올 및 항생제 칵테일을 포함하는 RPMI1640 배지인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10% 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 2mM 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 2mM L-글루타민, 5μM β-머캅토에탄올인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 CD8+ T 세포의 배양은 3 내지 5일 동안 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 기억 세포독성 T 세포 생성 증진용 조성물은 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 (conditioned media)를 유효성분으로 포함한다.
본 발명은 다른 관점에서, 환원제를 포함하는 기본배지에서 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 유효성분으로 포함하는 CD8+ T 세포로부터 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 환원제는 β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol) 및 TCEP (tris(2-carboxyl)phosphine로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 β-머캅토에탄올인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM, IMDM, MEM, RPMI1640 및 EMEM로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 DMEM인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 섬유아세포의 배양 배지는 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), L-글루타민 또는 항생제 칵테일을 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10% 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 44mM 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 4mM L-글루타민 및 5μM β-머캅토에탄올인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), L-글루타민, β-머캅토에탄올, 항생제 칵테일 및 RPMI1640 배지를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10% 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 2mM 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 2mM L-글루타민, 5μM β-머캅토에탄올인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 섬유아세포는 인간 유래 섬유아세포, 설치류 유래 섬유아세포 (예를 들어, 마우스 유래 섬유아세포, 래트 유래 섬유아세포 등) 및 조류 유래 섬유아세포로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 배양이 가능한 것으로 알려진 섬유아세포를 사용할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 실시예에서는, MEF (mouse embryonic fibroblast) 세포, NIH3T3 세포, HEK 293 (Human embryonic kidney) 세포, WI-38 세포, Hs27 (CRL-1634) 세포, Hs68 (CRL-1635) 세포, CCD1112Sk (CRL-2429) 세포 또는 BJ (CRL-2522) 세포를 섬유아세포로 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 MHC-1 class I-OVA 펩타이드 복합체, HLA-A0201-CMV 펩타이드 복합체 또는 HLA-A2402-CMV 펩타이드 복합체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 CTLA-4, PD-1 및 Tim-3로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역체크포인트 분자의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 환원제를 포함하는 기본배지에서 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 유효성분으로 포함하는 조성물에서 CD8+ T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 CD8+ T 세포로부터 기억 세포독성 T 세포의 생성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 세포독성 T 세포 생성방법에 의해 얻어진 항원 특이적인 세포독성 T 세포를 포함하는 면역치료제, 항종양 백신, 및/또는 종양치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 포함하는 배지에서 CD8+ T 세포를 배양하여 세포독성 T세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 세포독성 T 세포의 생성방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 항종양 백신에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 항종양 백신을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 담체는 환자를 자극하지 않고 본 발명에 따른 세포독성 T 세포의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 세포독성 T 세포를 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1 종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 고통받는 환자의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 면역질환의 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 암의 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 항종양 백신을 암의 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 면역질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암의 예방 또는 치료용 항종양 백신의 제조를 위한 상기 방법으로 생성된 세포독성 T 세포의 용도를 제공한다.
[
실시예
]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
재료 및 방법
1. 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체 제작
비오틴 (biotin)이 결합된 0.01 ㎍ ~ 4 ㎍ 재조합 Kb/OVA 복합체, HLA-A0201/CMV 복합체, HLA-A2402/CMV 복합체와 0.5 ㎍ 스트렙타비딘 비드 (streptavidin bead, miltenyi, 독일)를 4℃에서 12~16시간 동안 결합시켰다.
2. CD8+ T 세포 분리
OT-I 형질전환 마우스 (Jackson laboratory, 미국)로부터 비장을 적출한 후 나일론 (nylon) 망을 사용하여 단독세포 (single cell)로 분리하였다. 인간 림프구의 경우 말초혈액으로부터 말초혈액단핵구를 Lymphoprep (Axis Shield, 노르웨이)으로 분리한 이후 상용의 CD8 세포 분리용 비드(anti-CD8α magnetic bead; Miltenyli biotech, 독일)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 MACS 컬럼(column) (Miltenyli biotech, 독일)을 통해 CD8+ T 세포를 분리하였다.
3. 섬유아세포를 배양하여 얻은
조건배지의
제조
Balb/c MEF 세포, C57BL/6 MEF 세포, NIH3T3 세포 및 CHO 세포 각각을 1.25 Х 106 개씩 DMEM (Gibco BRL, 미국)에 10% 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS, Hyclone, 미국), 44mM 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate, Sigma), 4mM L-글루타민 (Gibco BRL), 5μM β-머캅토에탄올 (mercaptoethanol, Sigma) 및 항생제 칵테일 (antibiotics cocktail, Gibco BRL)을 첨가한 배지에 풀어 준 후 100 mm 디쉬 (dish)에서 5% CO2, 37℃로 3일 동안 배양하였다. 배양 3일 후, 배양액을 15 mL 코니컬 튜브 (conical tube)에 옮겨서 실온에서 2000g로 30분 동안 원심 분리하여 얻은 조건배지를 0.22㎛ 주사기 필터를 이용하여 여과하고, 새로운 15 mL 코니컬 튜브에 옮겨 -85℃ 냉동고에 보관하였다.
4. 세포독성
T세포
(
CTL
)의 표현형 결정을 위해 사용한 항체
FITC-표지된 항-TCRβ, 항-CD25, 항-CD45RA, 항-CD45RO, 항-CD69 및 항-Ly5.1;
PE-표지된 항-TCRVα2, 항-CD44, 항-Ly5.1, 항-PD1 및 스트렙타비딘 (streptavidin);
PercP-Cy5.5 표지된 항-CD8α 및 항-B220;
APC 표지된 항-CD44, 항-IFNγ, 항-TNFα 및 항-CD62L; APC-Cy7 표지된 스트렙타비딘 (streptavidin); Alexa647 표지된 항-CCR7;
PE-Cy7 표지된 항-IFNγ (상기 항체들은 Becton-Dickinson에서 구입).
비오틴(Biotin)-표지된 항-CD122, 항-PD1 및 항-CD28;
PE-표지된 항-Eomes 및 항-그랜자임 B;
APC-표지된 항-Tbet;
APC-efluor780 표지된 항-CD62L (상기의 항체들은 ebioscience(미국)에서 구입).
PE-표지된 항-Tim3;
APC-표지된 항-TCRVβ5.1&5.2 (상기 항체는 biolegend(미국)에서 구입).
APC-Vio770-표지된 항-CD8β (상기 항체는 Mitenyi biotech(독일)에서 구입).
실시예 1: 시험관 내 항원 특이 CD8+ T 세포 자극
본 실시예에서는 시험관 내에서 항원 특이적 세포독성 T 세포 (cytotoxic T lymphocytes, CTLs)를 생성하기 위하여, 재조합 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 (class) I/펩타이드 (peptide) 복합체 (Kb/OVA 복합체)가 코팅된 비드 (bead)를 이용하여 OVA (ovalbumin)의 257번째 아미노산에서 264번 아미노산 서열 (서열번호 1: SIINFEKL)을 인식하는 CD8+ T 세포들을 자극하였다. 즉, C57BL/6 마우스의 MHC-I 분자인 Kb에 제시된 OVA 펩타이드 (257-264)를 선택적으로 인식하는 OT-1 T 세포를 이용하여 재조합 Kb/OVA 복합체의 활성을 조사하여 항원특이적 T세포 증식 및 활성화를 확인하였다. 인간의 경우 재조합 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 (class) I/펩타이드 (peptide) 복합체 (HLA-A0201/HLA-A2402 복합체)가 코팅된 비드 (bead)를 이용하여 CMV (cytomegalovirus)의 pp65 단백질의 495번째 아미노산에서 503번 아미노산 서열(-A0201 해당)(서열번호 2: NLVPMVATV) 또는 pp65 단백질의 341번째 아미노산에서 349번 아미노산 서열 (서열번호 3: QYDPVAALF)을 인식하는 CD8+ T 세포들을 자극하였다 (도 8).
구체적으로, 미리 분리해 놓은 CD8+ T 세포를 PBS (phosphate buffer saline)로 세척한 다음, RPMI1640 (Gibco BRL, 미국)에 10% 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS, Hyclone, 미국), 2mM 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate, Sigma), 2mM L-글루타민 (Gibco BRL), 5μM β-머캅토에탄올 (mercaptoethanol, Sigma) 및 항생제 칵테일 (antibiotics cocktail, Gibco BRL)을 첨가한 배지에 1.0Х105 세포/㎖의 농도로 풀어준 후, 96 웰 플레이트에 CD8+ T 세포를 분주하였다. 그 다음으로, 미리 제조해 놓은 0.01 ㎍ ~ 4 ㎍의 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체와 미리 제조하여 보관해 놓은 조건배지를 첨가하여 잘 혼합한 후, 5% CO2, 37℃에서 3일 내지 5일 동안 배양하여 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocytes, CTLs)로 분화를 유도하였다. 대조군으로는 상기 방법에서 조건배지를 처리하지 않은 것을 제외하고는 상기 세포독성 T 림프구 유도방법과 동일하게 한 것을 사용하였다.
그 결과, 재조합 MHC를 이용한 T 세포 활성화 즉, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포는 수지상 세포를 이용한 것과 거의 유사한 수준으로 T 세포를 자극하는 것을 확인할 수 있었다 (도 1).
실시예 2: ELISA 분석을 통한 세포독성 T 림프구로의 분화 확인
96 웰 ELISA 플레이트 (Thermo scientific)에 탄산염 버퍼 (carbonate buffer)로 희석한 코팅 항체 (coating antibody, 1㎍/㎖, (BD pharmingen))를 50㎕/well로 넣어준 후 랩으로 밀봉하여 4℃에서 12~16시간 동안 부착시켰다. ELISA 세척 버퍼(washing buffer, 0.03% Tween 20 (Sigma) in PBS buffer)로 1회 세척하고, 5% 우태아 혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA)을 함유한 PBS를 블록킹 (blocking) 버퍼로 만들어 100㎕/well로 넣어 준 후 37℃에서 2시간 동안 블록킹 하고, 다시 ELISA 세척 버퍼로 1회 세척하였다.
섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 및 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체를 이용하여 CD8+ T 세포를 자극하여 CD8+ T 세포를 분화시켰으며, 각각의 CD8+ T 세포 배양액을 3개 웰을 한 그룹으로 하여 50㎕/well로 넣어 주었다. 상기 배양액을 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, ELISA 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 블록킹 (blocking) 버퍼로 각각 희석한 검출 항체 (Detecting antibody, 1㎍/㎖, (BD pharmingen)) 및 스트렙타비딘-HRP 용액 (Streptavidin-Horse radish peroxidase solution, 0.5㎍/㎖, (BD pharmingen))을 50㎕/well로 첨가 후, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. ELISA 세척 버퍼로 4회 세척 후, TMB 용액 (BD pharmingen)을 15분간 반응시키고 2.5mM 황산 용액 (Sigma)으로 HRP 반응을 중지시켰다. 450nm에서 ELISA 리더 (Bio-Rad)로 측정하고, 표준 값과 비교하여 사이토카인 양을 결정하였다. 표준 값은 정량된 재조합 인터페론 감마 (interferon-γ)와 그랜자임 B (granzyme B, GZMB) (BD pharmingen)를 2ng/㎖부터 5% BSA에 1/2씩 순차적으로 희석하여 측정하였다.
구체적으로, 조건배지를 시험관 내에서 세포독성 T 세포를 증식시킬 때 첨가한 경우 세포독성물질인 IFN-γ와 그랜자임 B의 양이 증가하는지 여부를 분석하였다. 재조합 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 I/펩타이드 복합체가 코팅된 비드 (bead)로 CD8+ T 세포를 3일간 자극할 때, 전체 CD8+ T 세포 배양액 200μL 중 50~150μL의 조건 배지 (conditioned media)를 넣어 준 경우, 상기 조건 배지의 양이 증가함에 따라 CD8+ T 세포가 분비하는 세포독성물질 (IFN-γ, 그랜자임 B)의 양이 증가하였다 (도 2A 및 도 2B). 또한, 여러 종류의 조건 배지를 위와 같은 조건으로 CD8+ T 세포와 함께 배양했을 시 CD8+ T 세포가 분비하는 세포독성물질 (IFN-γ, 그랜자임 B)의 양이 증가하였다.
따라서, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 처리한 CD8+ T 세포는 인터페론 감마와 그랜자임 B를 잘 분비하는 세포살상 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)로의 분화가 잘 이루어졌음을 알 수 있었다.
반면 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지가 아닌 CHO (Chinese hamster ovarian) 세포 유래 배양액을 넣어준 그룹에서는 CD8+ T 세포가 분비하는 세포독성물질 (IFN-γ, 그랜자임 B)의 양이 정상 배양액을 넣어 준 그룹과 큰 차이를 보이지 않았다 (도 2B).
실시예 3: 세포독성 T 세포의 면역체크포인트 분자의 발현 억제 확인
섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지 및 재조합 MHC-I/펩타이드 복합체를 이용하여 CD8+ T 세포를 자극하여 CD8+ T 세포를 세포살상 T 림프구로 분화시켜 세포들을 수확하였다. 세포들은 세척하고, 1×FACS 버퍼 (1% Bovine Serum Albumine, 0.01% NaN3 in PBS)에 재현탁한 후, 다양한 형광물질이 접합된 항체 (fluorochrome-conjugated antibodies)와 함께 암실에서 30분간 얼음에서 배양하였다. 세포들을 다시 세척하고, FACS Verse 기구 (Becton-Dickinson, 미국) 및 Flowjo (FlowJo, LLC, 미국)를 사용하여 세포독성 T세포 (CTL)의 표현형을 분석하였다.
항원 감작된 또는 감작되지 않은 세포를 직접적으로 세포내부 염색 (staining)에 의하여, R-피코에리트린 (R-phycoerythrin) 표지된 항-PD1 mAb와 항-Tim3 mAb로 염색하여 유세포분석법 (flow cytometry)을 통해 확인하였다. 제작자의 추천에 따른 염색 후의 제작사 고유 용액 (proprietary solution)(Cytofix/CytopermTM, Becton Dickinson, FoxP3 stainingTM, ebioscience)을 사용하여 세포들의 염색 후 고정을 수행하였다.
시험관내 배양에서 활성화된 CD8+ T 세포의 PD-1과 Tim-3의 발현 조절 여부를 비교 (인간의 경우 PD-1만 비교) 실험한 결과, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 첨가한 경우 CD8+ T 세포의 PD-1 발현 양이 감소하는 것을 확인하였다 (도 3 및 도 8C). 이와 더불어 IL-7를 첨가한 경우 PD-1의 발현 양이 더욱 많이 감소하는 것을 확인하였다 (도 3). 따라서, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 세포독성 T 세포를 증식시킬 때 첨가하게 되면 면역체크 포인트 분자들의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 항암 내성과 관련된 PD-1 발현 양이 감소하는 것으로부터 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지의 처리에 의해 생성된 세포독성 T 세포가 효과적으로 항암 작용을 나타낼 수 있음도 알 수 있었다.
실시예 4: 세포독성 T 세포의 중심 기억 T 세포로 분화 확인
4-1: 기억 T 세포로의 분화 확인
실시예 3과 동일한 방법으로 CD8+ T 세포의 기억 T 세포 생성 증가와 다양한 세포 표면 분자의 변화에 관해서 실험하였다. 시험관내에서 3~5일 동안 배양된 CD8+ T 세포의 기억 T세포 생성 여부를 확인하기 위해서 기억 T 세포의 전형적인 마커 (marker)인 CD44와 CD62L의 발현을 확인하였다. 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 처리한 후, 자극된 CD8+ T세포가 중심 기억 T 세포로 분화하는 지를 R-피코에리트린 (R-phycoerythrin) 표지된 항-CD44 mAb와 APC 표지된 항-CD62L mAb로 염색하여 유세포분석법(flow cytometry)을 통해 확인하였으며, 인간 림프구는 FITC 표지된 항-CD45RO(RA) mAb와 Alexa647 표지된 항-CCR7 mAb로 염색하여 유세포분석법(flow cytometry)을 통해 확인하였다.
그 결과, 정상 배양액만을 사용한 CD8+ T 세포에 비해 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 첨가한 CD8+ T세포에서 더 많은 CD44hiCD62Lhi 세포 (인간: CD45ROhiCCR7hi)가 확인되었다. 이는 상기 조건배지의 첨가가 CD8+ T 세포에 있어서 기억 T 세포로의 분화를 촉진하는 것을 의미한다 (도 4A 및 도 8B).
4-2: 세포 표면 분자 분석
다음으로, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 처리한 후 자극된 CD8+ T세포의 다양한 표면 분자가 발현하는 것을 항-CD25 mAb, 항-CD44 mAb, 항-CD28 mAb, 항-CD62L mAb, 항-CD69 mAb 그리고 항-CD122 mAb로 염색하여 유세포분석법(flow cytometry)을 통해 확인 하였다.
그 결과, CD25의 발현양이 정상 배양액만을 사용한 CD8+ T 세포에 비해 상기 조건배지를 첨가한 CD8+ T 세포에서 증가된 것을 확인하였다 (도 4B). 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 첨가한 CD8+ T 세포에서 CD25의 발현양이 높다는 사실은 인터루킨-2 (IL-2)에 보다 민감하게 반응하여 세포증식이 더 잘될 수 있음을 의미한다.
실시예
5: 기억 T 세포의 주요 전사 인자 확인
기억 CD8+ T 세포를 유도하는 것을 검증하기 위하여, 세포표면 분자뿐만 아니라 기억 T 세포의 주요 전사 인자인 T-bet와 에오메소더민 (Eomesodermin; “Eomes”)의 발현을 실시예 3과 동일한 방법으로 확인하였다. 기억 T 세포의 경우 T-bet의 발현량에 대비하여 에오메소더민 (Eomes)의 발현량이 높은 것으로 알려져 있다.
섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 처리한 후 자극된 CD8+ T 세포가 발현하는 주요 전사인자 분자들의 발현수준을 R-피코에리트린 (R-phycoerythrin) 표지된 항-Eomes mAb와 APC 표지된 항-T-bet mAb로 염색하여 유세포분석법 (flow cytometry)을 통해 확인 하였다.
그 결과, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 첨가한 CD8+ T 세포에서는 에오메소더민 (Eomes)/T-bet의 비율이 높은 것을 확인하였다 (도 5). 따라서, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 처리한 경우 기억 T 세포의 점유율이 높아지는 것을 알 수 있었다.
도 2, 도 4 및 도 5에서 나타나듯이, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 첨가한 CD8+ T 세포들은 세포독성물질 (IFN-γ, 그랜자임 B)의 분비량이 증가하고 기억 T 세포로의 분화가 촉진된다. 이는 시험관 내에서 항원 특이적인 기억 세포독성 T 세포의 효율적인 유도를 돕는다.
실시예 6: 종양 접종 및 종양 특이적 세포독성 T 세포 이식
6-1: 종양 모델에서 기억 세포독성 T 세포의 효과
시험관내 (in vitro) 환경하에서 효율적으로 항원 특이적인 기억 세포독성 T 세포가 유도됨을 확인하였으므로, 생체 내 (in vivo) 환경에서도 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 첨가한 CD8+ T 세포들이 효율적으로 암세포를 제거하는 지를 확인하였다.
T 세포를 이식하기 11일 혹은 13일 전 0.4 ~ 1 × 105 EG.7 종양 세포를 접종하여 마우스에서 종양의 크기가 (15-30mm3:11일, 50-70mm3:13일) 일정하게 확립된 것을 확인하였다. 그 다음, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리하여 제조된 세포살상 T 림프구와 대조군 림프구를 종양이 접종된 마우스에 0.7 ~ 1 × 106 세포의 양으로 이식하였다. 상기 접종하는 종양 세포 및 림프구 세포의 범위는 반복 실험시 각각의 실험 회차별로 조절 가능한 범위이며, 동일한 회차의 실험군 마우스 각각에는 상기 범위 내에서 동일한 양으로 접종 및 이식하였다. 종양의 크기는 짧은 직경 (l)과 긴 직경 (L)의 길이를 결정해서 계산한다 (종양부피 = 짧은직경(l)2 × 긴직경(L)/2). 종양부피가 2500mm3를 초과하였을 때를 실험종료 시점으로 결정하였다.
0.4-0.5Х105 종양세포 (EG.7)를 접종한 마우스에 2주 후 시험관에서 배양한 종양 항원 특이적 세포독성 T 세포를 각 그룹 당 5마리에 이식한 다음 종양세포의 성장을 종양의 부피를 측정하여 분석하였다.
그 결과, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포들은 정상 배양액에서 자란 CD8+ T 세포들에 비해 월등히 뛰어난 종양세포 성장 억제력을 보여주었다 (도 6A).
6-2: 종양 모델에서 분리한 CD8+ T 세포의 분석
이식된 CD8+ T 세포들 중 생체 내 남아있는 CD8+ T 세포들의 빈도를 확인하기 위해, 실시예 6-1과 동일한 방법으로 새로운 실험군 마우스에 1.0×106 종양세포 (EG.7)를 접종하고, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지 처리 혹은 미처리 CD8+ T 세포를 각 그룹당 3마리에 이식하고 일주일 후 FACS 분석을 하였다.
그 결과, 말초혈, 비장, 림프절 그리고 종양에서 상기 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포들은 정상 배양액에서 자란 CD8+ T 세포들에 비해 현저히 높은 빈도로 존재함을 확인하였다 (도 6B).
다음으로, 상기 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포를 이식한 종양 모델로부터 CD8+ T 세포를 분리한 후, 종양침투 한 CD8+ T 세포에서 면역체크포인트 분자 (PD-1, Tim-3)를 발현하는 세포 빈도의 비율을 FACS로 분석하였다.
그 결과, 시험관내 (in vitro) 환경하에서 상기 조건 배지를 처리한 CD8+ T 세포들이 면역체크포인트 분자의 발현이 억제되는 것을 생체 내에서도 확인할 수 있었다. 즉, 상기 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포들에서 면역체크포인트 분자 (PD-1, Tim-3)의 발현이 억제되는 것이 생체 내 (in vivo)에서도 지속적으로 유지되는 것을 확인하였다 (도 6C). 이는 상기 조건배지의 시험관 내 처리가 CD8+ T 세포의 면역체크포인트 분자들의 발현을 일시적으로 억제하는 것이 아니라 생체 내에서 종양항원과 지속적으로 접촉하고 증식할 때 면역체크포인트 분자들의 발현이 지속적으로 억제하는 것을 의미한다.
또한, 상기 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포들은 정상 배양액에서 자란 CD8+ T 세포들에 비해 여전히 많은 양의 TNF-α-및 IFN-γ 를 분비하는 것을 종양침투 세포독성 T 세포에서 확인하였다 (도 6D).
이러한 결과들은 본 발명의 세포독성 T 세포를 생성하는 방법이 세포독성 T 세포수와 빈도를 증가시키고, 시험관내에서 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지의 첨가는 기억 세포독성 T 세포의 생성을 더욱 증대하고 면역체크포인트 분자들의 발현 양을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이와 더불어 이렇게 배양된 기억 세포독성 T 세포는 생체 내 (in vivo) 환경하에서 종양에 대해 특이적으로 강력한 살상능력과 침투능력을 나타내며 생체 내에서 면역체크포인트 분자의 발현이 지속적으로 억제되어 장기기억 세포로 남아 있을 수 있다. 따라서, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지의 처리에 의해 시험관 내에서 기억 세포독성 T 세포를 고효율로 생산하여 종양 면역치료 분야에 적용할 수 있다.
실시예
7: 종양 특이적 인간 세포독성 T 세포 살상 효과
시험관내 (in vitro) 환경 하에서 효율적으로 항원 특이적인 기억 세포독성 T 세포가 유도됨을 확인하였으므로, 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지를 첨가한 인간 CD8+ T 세포들이 효율적으로 암세포를 제거하는 지를 분석하였다.
T2 세포주에 CMV pp65 펩타이드를 첨가하여 배양한 후 1×104 표적세포 (T2/CMV pp65 peptide)를 Calcein AM(Invitrogen, 미국)으로 표지(30μM/1×106/1mL)한 후 1~30×104 CD8+ T 세포와 호일로 빛을 차단한 96well round plate에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 후 plate를 300g, 4분 조건으로 원심 분리하여 100㎕ 상층액을 96well black plate에 옮겨 주었다. Multiplate reader에서 흡광 485nm / 발광 530nm 조건에서 형광을 측정하였다.
그 결과, 상기 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건배지를 처리한 CD8+ T 세포들은 정상 배양액에서 자란 CD8+ T 세포들에 비해 표적 세포를 더 많이 살상함을 확인하였다 (도 8D).
이러한 결과는 본 발명의 세포독성 T 세포를 생성하는 방법이 세포독성 T 세포의 세포살상 능력를 증가시키고, 시험관내에서 섬유아세포를 배양하여 얻은 조건 배지의 첨가는 세포독성 T 세포의 활성을 더욱 증대시키는 것을 나타낸다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<120> Method for Generation of Cytotoxic T Lymphocytes and Use Thereof
<130> P18-B287
<150> KR 10-2017-0166609
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OVA
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Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
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<213> Artificial Sequence
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<223> HLA-A0201
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Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-A2402
<400> 3
Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe
1 5
Claims (22)
- 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 포함하는 배지에서 CD8+ T 세포를 배양하여 세포독성 T세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제1항에 있어서, 상기 섬유아세포의 배양 배지는 환원제를 포함하는 기본배지인 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제2항에 있어서, 상기 환원제는 β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol) 및 TCEP (tris(2-carboxyl)phosphine)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제2항에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM, IMDM, MEM, RPMI1640 및 EMEM로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제2항에 있어서, 상기 섬유아세포의 배양 배지는 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), L-글루타민 또는 항생제 칵테일을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제1항에 있어서, 상기 섬유아세포의 배양은 2~3일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제1항에 있어서, 상기 섬유아세포는 인간, 설치류 또는 조류 유래인 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제7항에 있어서, MEF (mouse embryonic fibroblast) 세포, NIH3T3 세포, HEK 293 (Human embryonic kidney) 세포, WI-38 세포, Hs27 (CRL-1634) 세포, Hs68 (CRL-1635) 세포, CCD1112Sk (CRL-2429) 세포 또는 BJ (CRL-2522) 세포인 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CD8+ T 세포의 배양 배지는 기본배지에 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), L-글루타민, β-머캅토에탄올 및 항생제 칵테일을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제9항에 있어서, 상기 기본배지는 RPMI1640, DMEM, IMDM, MEM 및 EMEM로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CD8+ T 세포의 배양은 3 내지 5일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포독성 T 세포는 기억 세포독성 T 세포인 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포독성 T 세포는 CTLA-4, PD-1 및 Tim-3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 면역체크포인트 분자의 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 세포독성 T 세포의 생성방법.
- 환원제를 포함하는 기본배지에서 섬유아세포를 배양하여 수득된 조건배지를 유효성분으로 포함하는 CD8+ T 세포로부터 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 환원제는 β-머캅토에탄올, DTT (dithiothreitol) 및 TCEP (tris(2-carboxyl)phosphine)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM, IMDM, MEM, RPMI1640 및 EMEM로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 섬유아세포의 배양 배지는 열불활성화 우태아혈청 (heat inactivated FBS), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), L-글루타민 또는 항생제 칵테일을 포함하는 것을 특징으로 하는 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 섬유아세포는 인간, 설치류 또는 조류 유래인 것을 특징으로 하는 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물.
- 제18항에 있어서, MEF (mouse embryonic fibroblast) 세포, NIH3T3 세포, HEK 293 (Human embryonic kidney) 세포, WI-38 세포, Hs27 (CRL-1634) 세포, Hs68 (CRL-1635) 세포, CCD1112Sk (CRL-2429) 세포 또는 BJ (CRL-2522) 세포인 것을 특징으로 하는 기억 세포독성 T 세포의 생성 증진용 조성물.
- 제1항의 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항의 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항의 방법으로 생성된 세포독성 T 세포를 포함하는 항종양 백신.
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