KR20190060716A - Serum-free medium composition - Google Patents
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Abstract
Description
세포 배양용 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용하여 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.A serum-free medium composition for cell culture, and a method for culturing cells using the same.
줄기세포를 이용한 임상시험은 전 세계적으로 600개 이상이 clinicaltrial.gov의 임상시험 (clinical trial)에 등록되어 있고, 주입 부위에 따라 차이는 있지만 임상적으로 적용되는 치료적 효능을 보이는 세포의 수는 약 1 내지 5 억 개로, 반복적인 계대를 통해 생산되고 있다. 이러한 대량의 세포를 확보하기 위해, 배양 시 사용되고 있는 동물 유래 혈청, 예를 들면, 우태아혈청 (Fetal bovine serum: FBS)은 박테리아, 바이러스, 마이코플라즈마와 같은 미생물학적 감염성의 위험에 노출되고, 이러한 물질이 세포 내 잔류하는 경우, 확인되지 않은 감염 물질로서 작용하여 임상으로 적용할 경우에 문제를 일으킬 가능성이 높다. 동물 유래 혈청은 세포의 부착 및 생장에 중요한 역할을 하나, 세포 분리 단계에서 이종개체군 (heterogenous population)을 함께 증식시켜 줄기세포의 순도 (purity)를 낮추며, 랏 간의 편차 (lot-to-lot variation)를 증가시키고, 증식능을 저하시키며, 분화능을 감소시킨다. 또한, 항원 반응 (antigenic response)을 높임으로써 세포의 생존능 (viability), 안전성 (safety) 및 치료적 효능 (therapeutic efficacy)에 영향을 준다. More than 600 clinical trials using stem cells have been registered in clinical trials of clinicaltrial.gov worldwide, and the number of clinically applicable therapeutic efficacy cells varies, depending on the site of injection It is produced in repetitive passages of about 1 to 500 million pieces. In order to obtain such a large amount of cells, an animal-derived serum used in culture, for example, fetal bovine serum (FBS) is exposed to the risk of microbiological infectious diseases such as bacteria, viruses and mycoplasma, If the material remains in the cell, it acts as an unidentified infectious agent and is likely to cause problems when applied clinically. Animal-derived serum plays an important role in adherence and growth of cells, but in the cell separation step, a heterogenous population is proliferated together to lower the purity of stem cells, and a lot-to-lot variation , Decrease the ability to proliferate, and decrease the ability to differentiate. It also affects the viability, safety and therapeutic efficacy of cells by increasing the antigenic response.
따라서 동물 유래 혈청을 배제한 무혈청 배지를 개발함으로써 배양 안전성을 확보하는 것이 중요하다고 할 수 있다.Therefore, it is important to secure culture safety by developing a serum-free medium that excludes animal-derived serum.
일 양상은 세포 배양용 무혈청 배지 조성물을 제공한다.One aspect provides a serum-free medium composition for cell culture.
다른 양상은 상기 배지 조성물에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.Another aspect provides a method of culturing cells in the medium composition.
일 양상은 세포 배양용 무혈청 배지 조성물을 제공한다. One aspect provides a serum-free medium composition for cell culture.
용어 "세포 배양 (cell culture)"이란 조절된 조건 하에서 인공적으로 체외에서 살아있는 세포를 키우는 과정을 의미한다. 또한, 개체 조직의 일부분을 무균적으로 떼어내 효소로 세포간 연결 물질을 분해하여 유리시킨 현탁액을 병이나 페트리 접시와 같은 배양 접시의 편평한 밑부분에 도말하여 세포를 성장 및 증식시키는 것일 수 있다.The term " cell culture " refers to the process of cultivating living cells artificially in vitro under controlled conditions. In addition, a part of the individual tissue can be aseptically removed, and the suspension in which the intercellular connective material is degraded by an enzyme can be streaked on a flat bottom of a culture dish such as a bottle or a Petri dish to grow and proliferate the cells.
용어 "배지 (culture media)"는 인 비트로 (in vitro)에서 줄기세포를 비롯한 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 물질을 의미한다.The term " culture media " refers to materials that enable growth and survival of cells, including stem cells, in vitro.
상기 조성물은 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin), 셀레늄 (Selenium), 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HAS), 지질, 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast Growth Factor: FGF), 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF), 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1), 헤파린 (heparin), 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid), 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12) 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. The composition may be selected from the group consisting of insulin, transferrin, selenium, platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB), human serum albumin (HAS) (FGF), Epidermal Growth Factor (EGF), Transforming growth factor beta-1 (TGFbeta-1), heparin, Lysophosphatidic acid, human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF), chemokine (CXC motif)
상기 인슐린 (Insulin)은 당과 아미노산의 세포 내로의 섭취를 촉진하여 세포를 증식시키는 역할을 하는 호르몬이며, 소마토메딘C (somatomedin C)와 연계하여 세포 증식을 촉진시킬 수 있다. 상기 트랜스페린 (Transferrin)은 세포로 철을 이동시키는 역할을 하는 단백질이며, 배지에 있는 유리산소 (Oxygen radical)와 과산화물 (peroxides)을 해독시킬 수 있다. 상기 셀레늄 (Selenium)은 셀레늄 의존적인 효소들이 지방의 과산화를 감소시키도록 하는 물질로서 세포막을 보호해주는 역할을 가진다. 상기 셀레늄은 셀레늄 자체 또는 셀레늄 염의 형태, 예를 들면 유기 및 무기 형태인 것일 수 있다. 상기 셀레늄 염의 유기 형태는 아미노산 L(+)-셀레노메티오닌, L(+)-메틸셀레노시스테인 또는 L(+)-셀레노시스테인 것일 수 있다. 상기 셀레늄 염의 무기 형태는 소듐 셀레나이트, 칼슘 셀레나이트, 또는 칼륨 셀레나이트인 것일 수 있다. 상기 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄은 배지 중에 약 0.05% 내지 약 20%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%로 포함되는 것일 수 있다. 여기서, %는 v/v%를 의미한다. Insulin is a hormone that promotes the uptake of sugar and amino acids into cells and promotes cell proliferation. It can promote cell proliferation in association with somatomedin C (C). Transferrin is a protein that transports iron to cells and can detoxify oxygen radicals and peroxides in the medium. Selenium is a substance that causes selenium-dependent enzymes to reduce fat peroxidation, and plays a role in protecting the cell membrane. The selenium may be in the form of selenium itself or a selenium salt, such as organic and inorganic forms. The organic form of the selenium salt may be an amino acid L (+) - selenomethionine, L (+) - methyl selenocysteine or L (+) - selenocysteine. The inorganic form of the selenium salt may be sodium selenite, calcium selenite, or potassium selenite. The insulin, the transferrin and the selenium may be contained in the medium in an amount of about 0.05% to about 20%, or about 0.1% to about 10%. Here,% means v / v%.
상기 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB)는 세포 성장 및 분열을 조절하는 성장 인자이며, 배지 중에 약 0.5ng/ml 내지 약 200ng/㎖ 또는 약 1ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin: HAS)은 인간 혈장에 다량으로 존재하고, 호르몬, 지방산 등의 화합물을 운반하고, pH 및 삼투압을 조절하는 단백질이며, 배지 중에 약 0.0125% 내지 약 5.0% 또는 약 0.025% 내지 약 2.5%로 포함되는 것일 수 있다. 여기서, %는 v/v%를 의미한다. 상기 지질 (lipid)은 세포의 성장과 유지에 있어 조절하는 역할을 하며, 포화지방산, 불포화지방산 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 지질은 배지 중에 약 0.005% 내지 약 2% 또는 약 0.01% 내지 약 1%로 포함되는 것일 수 있다. 여기서, %는 v/v%를 의미한다. 상기 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast Growth Factor: FGF)는 세포가 성장하고 증식하기 위한 신호를 제공하여, 증식을 위한 신호전달 (signal transduction) 과정을 유도한다. 상기 섬유아세포 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자-4 (Fibroblast Growth Factor-4: FGF-4), 섬유아세포 성장 인자-2 (Fibroblast Growth Factor-2: FGF-2), 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. The platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB) is a growth factor that regulates cell growth and cleavage. The platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB) is added to the medium in an amount of about 0.5 ng / ml to about 200 ng / To about 100 ng / ml. The human serum albumin (HAS) is a protein which is present in a large amount in human plasma and transports a compound such as a hormone or a fatty acid, and regulates pH and osmotic pressure. The protein is contained in the medium in an amount of about 0.0125% to about 5.0% 0.025% to about 2.5%. Here,% means v / v%. The lipid may regulate the growth and maintenance of cells and may include saturated fatty acids, unsaturated fatty acids, or combinations thereof. The lipid may be included in the medium at about 0.005% to about 2% or about 0.01% to about 1%. Here,% means v / v%. The Fibroblast Growth Factor (FGF) induces signal transduction for proliferation by providing a signal for growth and proliferation of cells. The fibroblast growth factor is one comprising Fibroblast Growth Factor-4 (FGF-4), Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) .
상기 섬유아세포 성장 인자-4 (Fibroblast Growth Factor-4: FGF-4)는 배지 중에 약 0.25 ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖ 또는 약 0.5 ng/ml 내지 약 50ng/ml로 포함되는 것일 수 있다. 상기 섬유아세포 성장 인자-2 (Fibroblast Growth Factor-2: FGF-2)는 배지 중에 약 0.25 ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖ 또는 약 0.5 ng/㎖ 내지 약 50ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF)는 수용체인 EGFR에 결합하여 증식 및 분화를 자극하며, 배지 중에 약 0.5ng/㎖ 내지 약 200ng/㎖ 또는 약 1ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1)는 세포 성장, 세포 증식, 세포 분화 및 세포 사멸을 조절하며, 배지 중에 약 0.25 ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖ 또는 약 0.5 ng/㎖ 내지 약 50ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. The Fibroblast Growth Factor-4 (FGF-4) may be contained in the medium at about 0.25 ng / ml to about 100 ng / ml, or about 0.5 ng / ml to about 50 ng / ml. The Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) may be contained in the medium at about 0.25 ng / ml to about 100 ng / ml, or about 0.5 ng / ml to about 50 ng / ml. The Epidermal Growth Factor (EGF) binds to the receptor EGFR to stimulate proliferation and differentiation and is contained in the medium at about 0.5 ng / ml to about 200 ng / ml or about 1 ng / ml to about 100 ng / ml . The transforming growth factor beta-1 regulates cell growth, cell proliferation, cell differentiation and apoptosis, and is administered to the medium in an amount of about 0.25 ng / ml to about 100 ng / ml or about 0.5 ng / ml to about 50 ng / ml.
상기 헤파린 (heparin)은 섬유아세포 성장 인자가 결합하여 세포증식을 돕는 역할을 하며, 배지 중에 약 0.05㎍/㎖ 내지 20㎍/㎖ 또는 약 0.1㎍/㎖ 내지 10㎍/㎖로 포함되는 것일 수 있다. The heparin binds to the fibroblast growth factor and promotes cell proliferation. The heparin may be contained in the medium at about 0.05 μg / ml to 20 μg / ml or about 0.1 μg / ml to 10 μg / ml .
상기 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid)은 신호 분자로 작용하는 포스포리피드 유도체의 일종이며, 미토겐 (mitogen)으로 작용할 수 있고, 배지 중에 약 0.1ng/㎖ 내지 40ng/㎖ 또는 약 0.2ng/㎖ 내지 20ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF)는 대식세포, T 세포, 비만 세포, 자연 살해 세포 등에서 분비되는 사이토카인으로 전구세포의 분화성숙을 촉진하는 역할을 하며 배지 중에 약 0.05 ng/㎖ 내지 약 20ng/㎖ 또는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 10ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. 상기 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12)은, 스트로마 세포 유래 인자 (stromal cell-derived factor 1: SDF1)와 혼용되며, B 전구세포의 증식을 촉진하는 케모카인이고, 배지 중에 약 1ng/㎖ 내지 약 400ng/㎖ 또는 약 2ng/㎖ 내지 약 200ng/㎖로 포함되는 것일 수 있다. The lysophosphatidic acid is a kind of phospholipid derivative acting as a signal molecule and can act as a mitogen and can be used in a concentration of about 0.1 ng / ml to 40 ng / ml or about 0.2 ng / ml To 20 ng / ml. The human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF) is a cytokine secreted from macrophages, T cells, mast cells, natural killer cells and the like and promotes differentiation maturation of progenitor cells And from about 0.05 ng / ml to about 20 ng / ml or from about 0.1 ng / ml to about 10 ng / ml in the medium. The chemokine (CXC motif) ligand 12: CXCL12 is a chemokine that is mixed with stromal cell-derived factor 1 (SDF1) and promotes the proliferation of B precursor cells, From about 1 ng / ml to about 400 ng / ml or from about 2 ng / ml to about 200 ng / ml in the medium.
상기 성분을 포함하는 경우, 세포 배양시에 안전성을 확보하면서도, 증식능 및 순도가 높으므로, 동물 유래 혈청을 대체할 수 있다. 상기 동물 유래 혈청은 인간은 제외한 개체 유래의 혈청을 의미한다.When the above-mentioned components are contained, the animal-derived serum can be substituted because the productivity and purity are high while securing safety in cell culture. The animal-derived serum refers to a serum derived from an individual other than a human.
상기 배지 조성물은 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax Ⅱ complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's Medium, MesenCult-XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose)배지, 및 MCDB+DMEM/LG (MCDB +Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. The medium composition is not particularly limited as long as it can be used for cell culture. For example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle) 10, F-12, DMEM / F12, a-Minimal essential medium, G-MEM, Iscove's modified Dulbecco's medium, MacCoy's 5A medium, AmnioMax complete medium, AminoMax II complete (MECB + Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medium low glucose) medium, EBM (Endothelial Basal Medium) medium, Chang's Medium, MesenCult-XF medium, Dulbecco's modified Eagle medium high glucose medium, And the like.
상기 세포는 미분화 세포, 분화 중인 세포, 또는 분화가 완료된 세포인 것일 수 있다. 상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다. The cells may be undifferentiated cells, differentiated cells, or differentiated cells. The cell may be a stem cell.
용어 "줄기세포"는 분화능 (potency) 및 자기재생 (self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능 (pluripotency), 다분화능 (multipotency) 또는 단일분화능 (unipotency)로 나누어진다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cell: ESC) (착상 전 배아의 내세포), 성체줄기세포 (adult stem cell) (각 조직 및 장기에 존재하는 미분화된 세포) 및 역분화 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC) (체세포에 유전자 및/또는 단백질을 삽입하여 역분화가 유도된 세포, 또는 유도만능 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.The term " stem cell " means a cell having potency and self-renewal ability. Stem cells are divided into pluripotency, multipotency, or unipotency depending on the differentiation ability. The stem cells include embryonic stem cells (ESCs), adult stem cells (undifferentiated cells present in each tissue and organs), and stem cells (induced a pluripotent stem cell (iPSC) (a cell in which a gene and / or a protein is inserted into somatic cells to induce differentiation, or an induced pluripotent stem cell).
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다. 용어 "중간엽 줄기세포 (Mesenchymal sterm cell: MSC)"는 성체 줄기세포로서, 다분화능과 자기재생능을 갖고, 증식능이 우수하고 유전적으로 안정화되어 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 연골, 뼈, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포이며, 다양한 세포 예를 들면, 지방세포, 연골세포, 피부세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있다.The stem cells may be mesenchymal stem cells. The term " mesenchymal stem cell (MSC) " is an adult stem cell, having multipotential and self-renewing ability, and excellent in proliferative capacity and genetically stabilized. The mesenchymal stem cells are cells that aid in the production of fat, cartilage, bone, bone marrow stroma, muscle, nerve, etc. and can differentiate into various cells such as adipocytes, cartilage cells, skin cells and bone cells .
상기 줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 또는 조직의 환경과는 다른 환경에 존재하는 것을 의미한다. 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수를 분리하는 것 및 이로부터 줄기세포를 수득하는 것은 통상의 해부학적 방법 및 공지된 방법으로 수행되는 것 일수 있다.The types and origins of the stem cells are not limited as long as they have the ability to differentiate and self-regenerate. The stem cells may be derived from, for example, mammals, humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice or rabbits. The stem cells may be derived from isolated umbilical cord, placenta, fat, bone marrow, umbilical cord blood or amniotic fluid. The term " isolated " means that it is present in an environment different from that of a naturally occurring cell or tissue. Separation of umbilical cord, placenta, fat, bone marrow, umbilical cord blood or amniotic fluid and obtaining stem cells therefrom may be performed by conventional anatomical methods and known methods.
상기 배양은 성장 및 증식인 것일 수 있다. The culture may be growth and proliferation.
용어 "성장 (growth) 및 증식 (proliferation)"이란, 세포 수의 증가를 의미한다. 상기 배양은 미분화 증식인 것일 수 있다. 상기 미분화 증식 (undifferentiated proliferation)은 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 즉, 분화능 (potency) 및 자기재생 (self-renewal)능을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 용어 "분화 (differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 특정 세포 유형으로의 분화 정도를 측정 또는 판단하는 것은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 분화는, 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지 (예를 들면, 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 세포 형태의 변화 (예를 들면, 핵 비율/세포질 비율)를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태를 조사함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다. The term " growth and proliferation " means an increase in the number of cells. The culture may be undifferentiated growth. The undifferentiated proliferation refers to the proliferation of stem cells into cells having the same properties as the original cells without being differentiated into specific cells, that is, cells having potency and self-renewal ability . The term " differentiation " means that the structure or function of one another is specialized while the cells are growing by proliferation and proliferation, that is, the cells and tissues of the organism are changed in shape or function . Measuring or determining the degree of differentiation into a particular cell type may be performed by methods well known in the art. In addition, the differentiation can be effected by cell surface markers (e.g., staining cells with a tissue-specific or cell-specific antibody) using techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry and changes in cell morphology By examining the cell type using an optical microscope or a confocal microscope while measuring the nucleus ratio / cytoplasmic ratio), or by studying in the art such as polymerase chain reaction (PCR) and gene-expression profile Can be identified by measuring changes in gene expression using known techniques.
다른 양상은 상기 배지 조성물에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다. Another aspect provides a method of culturing cells in the medium composition.
상기 배양은 성장 및 증식인 것일 수 있다. The culture may be growth and proliferation.
상기 배양하는 방법은 계대 배양을 포함하는 것일 수 있다. The method of culturing may include subculturing.
용어, "계대 배양"이란, 세포 증식 방법의 하나로, 세포를 보존하고 세포의 대를 이어가기 위해 수일마다 주기적으로 새로운 배지에 이식시키는 것을 의미한다. "계대 (passage)"는 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기 (confluence)까지의 줄기세포의 성장 및 증식인 것일 수 있다. 세포를 배양하는 방법 및 계대 배양 방법은 통상의 배양 방법 및 공지된 방법으로 수행되는 것 일수 있다.The term " subculture " refers to a method of cell proliferation, in which cells are periodically transplanted into new medium every few days to preserve the cells and continue the cell cycle. A " passage " may be a growth and proliferation of stem cells from the initial seed culture in the culture vessel to the confluence of the cells in the same culture vessel. The method of culturing the cells and the method of subculturing may be carried out by a conventional culture method and a known method.
상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 또는 역분화 줄기세포인 것일 수 있다. 배양할 수 있는 세포에 대하여는 전술한 바와 동일한다.The cell may be a stem cell. The stem cells may be embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, or degenerated stem cells. The cells that can be cultured are the same as described above.
상기 배지 조성물을 이용하여 세포를 배양하는 방법에 따르면, 동물 유래 혈청을 포함하는 배지를 사용하지 않는 경우에도, 줄기세포 고유의 특성을 유지하는 줄기세포를 대량으로 증식 및 성장시켜 수득할 수 있다.According to the method of culturing cells using the above-mentioned culture medium composition, even when a medium containing serum derived from animals is not used, it is possible to obtain a large amount of stem cells that maintain the inherent characteristics of the stem cells and proliferate and grow.
본 발명의 세포 배양용 무혈청 배지 조성물을 이용하는 경우, 혈청을 포함하는 고가의 세포 배양용 배지를 대체하여 경제적이면서도, 기존의 혈청을 포함할 때 발생할 수 있는 감염 등의 부작용을 감소시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 기존의 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지와 유사한 세포 증식율 및 유전자 발현율을 나타낸다.When the serum-free medium composition for cell culture of the present invention is used, it is economical to replace the expensive cell culture medium containing serum, and it is possible to reduce side effects such as infection that may occur when existing serum is contained. In addition, it exhibits similar cell proliferation rate and gene expression ratio as the cell culture medium containing the existing serum.
도 1은 기본 배지에 따른 줄기세포의 증식율을 나타낸다. 즉, 6종의 기본 배지를 포함하는 세포 배양용 배지에서 줄기세포의 증식율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 형상 및 증식된 정도를 나타낸다.
도 3은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 크기를 나타낸다.
도 4는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지, 통상의 무혈청 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 증식율을 나타낸다.
도 5는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지, 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다.
도 6a는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 유전자의 발현 특성을 플롯 시그널로 나타낸 결과이다.
도 6b는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 유전자의 발현 특성을 막대 그래프로 나타낸 결과이다.
도 7은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 계대별 유전자 발현을 분석하여 Identity-by-state (IBS) 값으로 나타낸 결과이다.
도 8은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 분비된 분비 단백질을 비교한 결과이다.
도 9는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 분비된 칼슘염을 Alizarin Red S로 염색한 결과이다.
도 10은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포를 Oil Red O로 염색한 결과이다.
도 11은 Oil Red O로 염색된 줄기세포를 이소프로필 알코올로 탈색한 후, 지방분화율을 정량적으로 평가한 그래프이다.
도 12는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포를 Alcian blue로 염색한 결과이다.
도 13a는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 TNFAIP6 유전자의 발현 양상을 확인한 그래프이다.
도 13b는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 PTGS2 유전자의 발현 양상을 확인한 그래프이다.
도 13c는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포에서 IDO1 유전자의 발현 양상을 확인한 그래프이다.
도 13d는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 마우스에 주입하여 TNF-a의 발현 양상을 확인한 그래프이다. Figure 1 shows the proliferation rate of stem cells according to the basal medium. That is, the result of measuring the proliferation rate of stem cells in a cell culture medium containing 6 kinds of basic medium is shown.
Fig. 2 shows the morphology and degree of proliferation of stem cells after culturing the stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
Fig. 3 shows the size of stem cells after culturing stem cells in medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
Fig. 4 shows the proliferation rate of stem cells after culturing stem cells in a medium containing normal animal-derived serum, normal serum-free medium and medium of the present invention.
Fig. 5 shows results of the surface antigen characteristics of stem cells after culturing stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
FIG. 6A is a graph showing the expression characteristics of stem cell gene expression after culturing stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention. FIG.
FIG. 6B is a bar graph showing the expression characteristics of stem cell genes after culture of stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
FIG. 7 shows results of identity-by-state (IBS) analysis of gene expression of stem cells in stem cells after culturing stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
FIG. 8 is a result of comparing secreted proteins secreted from stem cells after culture of stem cells in medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
FIG. 9 shows results of staining of calcium salts secreted from stem cells with Alizarin Red S after culture of stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
FIG. 10 shows the result of staining stem cells with Oil Red O after culturing stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
11 is a graph quantitatively evaluating the degree of lipolysis after discoloration of stem cells stained with Oil Red O with isopropyl alcohol.
Fig. 12 is a result of staining of stem cells with Alcian blue after culturing stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention.
FIG. 13A is a graph showing the expression pattern of the TNFAIP6 gene in stem cells after culturing a medium containing normal animal-derived serum and a stem cell cultured in the medium of the present invention. FIG.
FIG. 13B is a graph showing the expression patterns of PTGS2 gene in stem cells after culturing a medium containing normal animal-derived serum and a stem cell cultured in the medium of the present invention.
13C is a graph showing the expression patterns of the IDO1 gene in stem cells after culturing a medium containing normal animal-derived serum and a stem cell cultured in the medium of the present invention.
FIG. 13D is a graph showing the expression pattern of TNF-.alpha. After culturing a medium containing normal animal-derived serum and cultured stem cells in the medium of the present invention and injecting it into a mouse.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: One: 무혈청Serum-free 세포 배양 배지 조성물 제조 및 상기 배지 조성물에서 배양된 줄기세포의 형상, 크기, 증식, 표현 항원 특성 확인 Identification of the shape, size, proliferation and expression antigen characteristics of the stem cell cultured in the preparation of the cell culture medium composition and the culture medium composition
1. 탯줄 유래 줄기세포 분리 및 배양1. Isolation and culture of umbilical cord stem cells
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만시에 수집된 태반으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리된 탯줄 각각을 Ca/Mg를 함유하지 않는 (free) 둘베코스 인산염 완충 식염수 (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 탯줄에서 동맥과 정맥을 제거한 뒤 1 내지 5 mm 정도 크기로 탯줄을 잘라내었다. 이후, 상기 탯줄을 배양 용기에 부착하여 10 내지 15일 배양을 하였고, 상기 배양된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인한 후, 5 내지 6시간 동안 200 U/㎖의 콜라게나아제 I을 가하여 탯줄 유래 줄기세포를 각각 분리하였다. 분리된 탯줄 유래 줄기세포는 37℃, 95%의 공기 및 5%의 CO2의 조건의 배양기에서 배양하였다. We received informed consent from normal healthy pregnant women in advance and separated umbilical cord from placenta collected during normal placental delivery. Each separated umbilical cord was washed 2 to 5 times with free Ca / Mg-free Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) to remove blood. Thereafter, the umbilical cord was removed from the umbilical cord and the umbilical cord was cut to a size of 1 to 5 mm. Thereafter, the umbilical cord was attached to a culture container and cultured for 10 to 15 days. After confirming that the cells spread out from the cultured tissue, 200 U / ml of collagenase I was added for 5 to 6 hours, Cells were separated from each other. The isolated umbilical cord stem cells were cultured in an incubator at 37 ° C, 95% air and 5% CO 2 .
2. 무혈청 세포 배양 배지 조성물 제조2. Preparation of serum-free cell culture medium composition
(2.1) 혈청 대체 물질 선정(2.1) Selection of serum substitute substance
줄기세포의 증식, 생존, 기능 등에 영향을 미칠 것으로 예상되는 인자를 발굴하고, 다양한 조성 및 조성비를 갖는 세포 배양 배지 조성물을 제작하였다. 이에 따라, 다양한 세포 배양 배지 조성물에 Lot 번호를 부여하고 (CHA-SFM-000), 그 중에서 기본 배지, 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin), 셀레늄 (Selenium), 혈소판 유래 증식 인자-AB (Platelet-derived growth factor-AB subunit : PDGF-AB), 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HAS), 지질, 섬유아세포 성장 인자 4 (Fibroblast Growth Factor 4: FGF4), 섬유아세포 성장 인자 2 (Fibroblast Growth Factor 2: FGF2), 표피세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF), 전환 성장 인자 베타-1 (Transforming growth factor beta-1: TGFbeta-1), 헤파린 (heparin), 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid), 인간 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: hGM-CSF), 및 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12: CXCL12)를 포함하는 CHA-SFM-035 Lot을 선정하였다. The factors expected to affect the proliferation, survival, and function of stem cells were identified, and cell culture medium compositions having various compositions and composition ratios were prepared. Accordingly, a variety of cell culture medium compositions were given lot numbers (CHA-SFM-000), and the basic medium, insulin, transferrin, selenium, platelet-derived growth factor-AB , fibroblast growth factor 4 (FGF4), fibroblast growth factor 2 (FGF2), fibroblast growth factor 2 (FGF2), fibroblast growth factor 2 (FGF2), Epidermal Growth Factor (EGF), Transforming growth factor beta-1 (TGFbeta-1), heparin, lysophosphatidic acid, A CHA-SFM-035 lot containing a human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF) and a chemokine (CXC motif) ligand 12: CXCL12 was selected Respectively.
(2.2) 기본 배지 선정(2.2) Selection of basic medium
기본 배지 (Basal media)를 선정하기 위해, 총 6종의 배지 (MCDB+DMEM/LG, EBM, DMEM/F12, IMDM, DMEM/HG, 및 MEM alpha)를 이용하여, 최적화된 배지를 선정하였다. In order to select basal media, optimized media were selected using a total of six media (MCDB + DMEM / LG, EBM, DMEM / F12, IMDM, DMEM / HG and MEM alpha).
상기 (2.1)의 CHA-SFM-035 Lot에서 기본 배지로, 6종의 기본 배지 각각 첨가하여, 6종의 세포 배양용 배지를 제작하였다. 상기 6종의 세포 배양용 배지에서 1에 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 약 72 시간 배양한 후, 세포 계수 키트(Cell Counting Kit-8: CCK-8) 분석으로 줄기세포의 세포 증식율을 측정하였다. Six types of cell culture medium were prepared by adding 6 kinds of basic medium as the basic medium in the CHA-SFM-035 lot of (2.1) above. The umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured at 1 in the above-mentioned six cell culture mediums were cultured for about 72 hours, and the cell proliferation rate of the stem cells was measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Respectively.
도 1은 기본 배지에 따른 줄기세포의 증식율을 나타낸다. 즉, 6종의 기본 배지를 포함하는 세포 배양용 배지에서 줄기세포의 증식율을 측정한 결과를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 줄기세포를, DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지에서 배양하는 경우, 다른 기본 배지를 포함하는 세포 배양용 배지에서 배양하는 경우에 비하여, 증식율이 약 25% 내지 약 400% 증가하였다. 따라서, (2.1)의 기본 배지로 DMEM/F12를 선정하였다.Figure 1 shows the proliferation rate of stem cells according to the basal medium. That is, the result of measuring the proliferation rate of stem cells in a cell culture medium containing 6 kinds of basic medium is shown. As shown in Fig. 1, when the stem cells are cultured in the cell culture medium containing DMEM / F12, the proliferation rate is about 25% to about 25% as compared with the case where the stem cells are cultured in the cell culture medium containing other basic medium 400% increase. Therefore, DMEM / F12 was selected as the basic medium of (2.1).
3. 1의 배지 조성물에서 배양된 줄기세포의 형상, 크기, 증식, 표현 항원 특성 확인3. Identification of shape, size, proliferation and expression antigen character of cultured stem cells in medium composition
(3.1) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 형상 (morphology) 및 증식된 정도 (cell density) 분석(3.1) 1, followed by morphology and cell density analysis of the stem cells
실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지 (CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 10%의 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum: FBS)과 25 ng/ml의 FGF4, 2 ug/ml의 헤파린(heparin)이 함유된 α-MEM배지 (이하, CCM)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 이 때, 배양은 줄기세포를 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에 분주하고, 성장 및 증식시킨 후, 트립신을 가하여 세포 부유액을 회수하여 수행하였다. 계대 배양 후, 실험군 및 양성 대조군에서, 줄기세포의 형상 및 증식된 정도를 확인하였다. In the experimental group, the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured in a 4 to 7 passages in a cell culture medium (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as the basic medium in (2.1). The positive control group was obtained from 1 in α-MEM medium (hereinafter referred to as CCM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 25 ng / ml of FGF4 and 2 ug / ml of heparin And one umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured to 4 to 7 passages. At this time, the culture was performed by dividing stem cells into fibronectin-coated plates, growing and proliferating them, and then adding trypsin to recover the cell suspension. After the subculture, the shape and proliferation of the stem cells were confirmed in the experimental group and the positive control group.
도 2는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 형상 및 증식된 정도를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 실험군에서 줄기세포의 형상은 방추사 (spindle) 형상을 유지하였고, 이는 동물 유래 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지(CCM)에서 배양된 줄기세포와 동일 또는 유사한 형상이었다. 또한, 증식된 정도는 실험군 및 양성 대조군이 유사하였다. 본 발명의 세포 배양용 배지는 동물 유래 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지와 유사한 정도의 세포 증식력을 갖는 것임을 알 수 있다. Fig. 2 shows the morphology and degree of proliferation of stem cells after culturing the stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention. As shown in FIG. 2, in the experimental group, the shape of the stem cells maintained a spindle shape, which was the same or similar to that of the stem cells cultured in the cell culture medium (CCM) containing the animal-derived serum. In addition, the degree of proliferation was similar in the experimental group and the positive control group. It can be understood that the cell culture medium of the present invention has cell proliferation power similar to that of the cell culture medium containing animal-derived serum.
(3.2) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 크기 (size) 분석(3.2) < / RTI > 1, and then analyzed for size of stem cells
실험군은 CHA-SFM-035에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 CCM에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 실험군 및 양성 대조군에서, 수득한 세포의 크기를 LUNA 분석으로 확인하였다. In the experimental group, in CHA-SFM-035, the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured to 4 to 7 passages. Positive control cells were obtained by culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 to 4 to 7 passages in CCM. In the experimental group and the positive control group, the size of the obtained cells was confirmed by LUNA analysis.
도 3은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 크기를 나타낸다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 배양된 줄기세포의 크기는 약 15 내지 17㎛로, 실험군 및 양성 대조군에서 줄기세포의 크기는 유사하였다. 본 발명의 세포 배양용 배지 조건에서 세포를 배양한 경우, 세포의 크기가 유의하게 줄어들거나 커지지 않고 유지되는 것을 알 수 있다. Fig. 3 shows the size of stem cells after culturing stem cells in medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention. As shown in Fig. 3, the sizes of the cultured stem cells were about 15 to 17 mu m, and the sizes of the stem cells in the experimental group and the positive control group were similar. When the cells were cultured under the culture medium for cell culture of the present invention, the size of the cells was not significantly reduced or maintained.
(3.3) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 증식능 분석(3.3) < RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
실험군은 CHA-SFM-035에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 약 72시간 동안 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 CCM에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 약 72시간 동안 배양한 것을 사용하였다. 음성 대조군은 시판용 무혈청 배지(통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 약 72시간 동안 배양한 것을 사용하였다. 배양, 약 24시간, 약 48시간, 및 약 72시간 후에, 세포 계수 키트(Cell Counting Kit-8: CCK-8) 분석으로 줄기세포의 세포 증식율을 측정하였다. In the experimental group, in CHA-SFM-035, the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured for about 72 hours. Positive control cells were obtained by culturing the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 in CCM for about 72 hours. The negative control group was obtained by culturing the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 in a commercially available serum-free medium (medium containing normal animal-derived serum) for about 72 hours. Cell proliferation rates of stem cells were measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) analysis after about 24 hours, 48 hours, and about 72 hours.
도 4는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지, 통상의 무혈청 배지 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 증식율을 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 시판용 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 경우, CCM에서 줄기세포를 배양한 경우에 비하여, 63%의 증식율을 나타내었다. 또한, 본 발명의 배지인 CHA-SFM-035에서 줄기세포를 배양한 경우, 시판용 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 경우에 비하여 약 27% 향상된 증식율을 나타내었으며, 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지에서 배양한 경우에 비하여 약 90%의 증식율을 나타내었다. 본 발명의 세포 배양용 배지는 혈청을 함유하는 배지와 유사한 수준의 증식력을 갖는 것을 알 수 있다. Fig. 4 shows the proliferation rate of stem cells after culturing stem cells in a medium containing normal animal-derived serum, normal serum-free medium and medium of the present invention. As shown in FIG. 4, when the stem cells were cultured in a commercial serum-free medium, the growth rate was 63% as compared with the case where stem cells were cultured in CCM. In addition, when the stem cells were cultured in CHA-SFM-035 medium of the present invention, the proliferation rate was improved by about 27% as compared with the case of culturing the stem cells in the commercial serum-free medium. The growth rate was about 90% as compared with that in the culture medium. It can be seen that the cell culture medium of the present invention has a level of proliferation similar to that of the medium containing serum.
(3.4) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 표면 항원 특성 분석(3.4) < RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 배양한 후 줄기세포의 특성이 변화하는지 확인하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 세포를 둘베코스 인산염 완충 식염수 (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)를 사용하여 세척하고, 2%의 FBS가 함유된 DPBS에 담아 CD44, CD73, CD105, CD45, CD34, CD31, CD29, CD49 및 CD90 항체와 약 20분간 반응시켰다. 이후, 유세포 분석기 (FACS Calibur, Becton Bickinson)를 통해 표면 항원 특성을 분석하였다. As the medium contained the composition of (2.1), flow cytometry was performed to determine whether the characteristics of stem cells changed after culturing in CHA-SFM-035. The cells were washed with Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) and incubated with DPBS containing 2% FBS to remove CD44, CD73, CD105, CD45, CD34, CD31, CD29, CD49 and CD90 antibodies For about 20 minutes. Subsequently, surface antigen characteristics were analyzed by flow cytometry (FACS Calibur, Becton Bickinson).
도 5는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지, 및 본 발명의 배지에서 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 배지인 CHA-SFM-035에서 줄기세포를 배양한 경우와 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양한 경우는 모두 세포에서 CD44, CD73, CD105, CD29, CD49 및 CD90의 발현 수준이 높고 (양성, positive), CD45, CD34, CD31 및 HLA-DR의 발현 수준이 낮았으며 (음성, negative), 발현 수준 또한 유사하였다. 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 표면 항원 특성을 변화시키지 않는 것을 알 수 있다.Fig. 5 shows results of the surface antigen characteristics of stem cells after culturing stem cells in a medium containing normal animal-derived serum and the medium of the present invention. As shown in Fig. 5, when the stem cells were cultured in the culture medium of CHA-SFM-035, which is the culture medium of the present invention, and in the medium containing normal animal-derived serum, all of the cells were cultured in CD44, CD73, CD105 , CD29, CD49 and CD90 were high (positive), the expression levels of CD45, CD34, CD31 and HLA-DR were low (negative, negative), and the expression levels were also similar. It can be seen that the medium for cell culture of the present invention does not change the surface antigen characteristics of the stem cells.
4. 1의 배지 조성물에서 배양된 줄기세포의 유전자, 사이토카인 발현 확인Identification of gene, cytokine expression of stem cells cultured in the medium composition of 4.1
(4.1) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 유전자 발현 특성 확인(4.1) < RTI ID = 0.0 > 1 < / RTI >
실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. 실험군 및 양성 대조군에서, 동등한 유전자를 발현하는지 평가하기 위해 Affymetrix Human Gene 2.0 ST Array 시험법을 통해 다수의 유전자의 발현양상을 동시에 확인하였다. 실험군 및 양성 대조군의 계대 7인 세포에서 총 RNA를 추출해 cDNA로 합성하여 발현 차이의 여부를 확인하였다. In the experimental group, the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured in a 4 to 7 passages in a cell culture medium (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as the basic medium in (2.1). Positive control cells were cultured in serum-containing medium (CCM). Expression patterns of multiple genes were simultaneously confirmed by Affymetrix Human Gene 2.0 ST Array test method to evaluate the expression of equivalent genes in the experimental group and the positive control group. Total RNA was extracted from the passaged cells of the experimental group and the positive control group and synthesized with cDNA to confirm the difference in expression.
도 6은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포에서 유전자의 발현 동등성을 비교한 결과이다. 도 6a에 나타난 바와 같이, 실험군과 양성 대조군의 유전자 발현 수준의 플롯 시그널(plot signal)이 1에 가까운 것을 확인하였다. 또한, 6b에 나타난 바와 같이, 실험군과 양성 대조군의 플롯 시그널이 유사하게 나온 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 혈청 배지와 동등한 세포 유전자 발현 수준을 나타냄을 알 수 있다. Fig. 6 shows the results of comparing the expression equivalency of genes in medium containing normal animal-derived serum and in stem cells cultured in the medium of the present invention. As shown in FIG. 6A, it was confirmed that the plot signal of the gene expression level of the test group and the positive control group was close to 1. Also, as shown in 6b, it was confirmed that the plot signals of the experimental group and the positive control group were similar. That is, the cell culture medium of the present invention shows the level of cell gene expression equivalent to the serum medium.
(4.2) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 (4.2) < RTI ID = 0.0 > 1 < / RTI > 계대별Categorical 유전자 발현 특성 확인 Identification of gene expression characteristics
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 배양한 줄기세포의 계대별 변이가 발생하지 않고 DNA가 동일하게 유지되는지 여부를 약 70만개의 SNP를 포함하고 있는 Infinium® Global Screening Array-24 v1.0 시험법을 통해 확인하였다. 실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. As the medium contained the composition of (2.1), it was determined whether the stem cells cultured in CHA-SFM-035 did not show any genetic variation and the DNA remained the same. Infinium® Global Screening Array-24 v1.0 test method. In the experimental group, the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured in a 4 to 7 passages in a cell culture medium (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as the basic medium in (2.1). Positive control cells were cultured in serum-containing medium (CCM).
도 7은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포의 계대별 유전자 발현을 분석하여 Identity-by-state (IBS) 값으로 나타낸 결과이다. 실험군 및 양성 대조군의 DNA를 추출하여 비교 분석한 결과, 총 70만 여개의 SNP 중 50여 개에서만 유전자의 차이를 보였다. 즉, 양성 대조군 대비 실험군의 DNA가 약 0.007%의 비율로 변이가 발생하며, 계대 시 양성 대조군 대비 실험군의 DNA는 변이가 거의 발생되지 않는 것을 확인하였다. 또한, 실험군 및 양성 대조군의 Identity-by-state (IBS) 값을 계산하여 나타낸 플롯(plot)으로 유사성을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 시 혈청 배지와 동등한 세포 안정성을 나타냄을 알 수 있다. FIG. 7 shows results of identity-by-state (IBS) analysis by analyzing the expression of gene by gene in a medium containing serum from normal animals and stem cells cultured in the medium of the present invention. As a result of comparing the DNA extracted from the experimental group and the positive control group, only 50 out of 700,000 SNPs showed a difference in the genes. In other words, it was confirmed that the DNA of the experimental group had a mutation rate of about 0.007% compared to that of the positive control group, and that the DNA of the experimental group hardly produced any mutation in the transfected group. Similarity was confirmed by plotting the identity-by-state (IBS) values of the experimental group and the positive control group. That is, the cell culture medium of the present invention exhibits cell stability equivalent to the serum medium during the passage of the stem cells.
(4.3) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 사이토카인 발현 확인(4.3) < RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI > the expression of cytokines in stem cells
실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. 실험군 및 양성 대조군에서, 동등한 사이토카인을 분비하는지 평가하기 위해, Human L-507 array 시험법을 통해 조건배지(conditioned media) 내 다수의 사이토카인의 양상을 동시에 확인하였다. 실험군 및 양성 대조군의 계대 7인 세포의 조건 배지에서 507개의 사이토카인의 차이 여부를 확인하였다. In the experimental group, the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured in a 4 to 7 passages in a cell culture medium (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as the basic medium in (2.1). Positive control cells were cultured in serum-containing medium (CCM). In order to assess whether secretion of equivalent cytokines was evident in the experimental and positive control groups, the appearance of multiple cytokines in the conditioned media was simultaneously confirmed by the Human L-507 array assay. Differences in 507 cytokines were determined on conditioned media of
도 8은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포에서 분비된 분비단백질을 비교한 결과이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 실험군 및 양성 대조군에서 사이토카인의 scatter plot이 1에 가까운 것을 확인하였다. 또한, 이미지 분석에서도 실험군 및 양성 대조군의 사이토카인 발현 양상이 유사한 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 혈청 배지와 동등한 사이토카인 발현 수준을 나타냄을 알 수 있다. Fig. 8 shows the results obtained by comparing the secretory proteins secreted from stem cells cultured in the culture medium of the present invention and the culture medium containing normal animal-derived serum. As shown in Fig. 8, it was confirmed that the scatter plot of the cytokine was close to 1 in the experimental group and the positive control group. In the image analysis, the expression patterns of cytokines in the experimental group and the positive control group were similar. That is, the cell culture medium of the present invention shows the level of cytokine expression equivalent to the serum medium.
5. 1의 배지 조성물에서 배양된 줄기세포의 다분화능 특성 확인Identification of the pluripotency of stem cells cultured in medium composition of 5. 1
(5.1) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 골분화능 확인(5.1) < RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 골분화 잠재력의 변화 여부를 확인하였다. (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 계대 4 내지 6까지 배양하였다. 이후, 계대 6의 세포를 시판용 골분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 세포를 실험군으로 사용하였다. 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 계대 6 세포를 시판용 골분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 것을 사용하였다.다. As the medium contained the composition of (2.1), it was confirmed whether the bone marrow differentiation potential of the subcultured stem cells in CHA-SFM-035 was changed. (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as a basic medium in step (2.1), the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured to
도 9는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포에서 분비된 칼슘염을 Alizarin Red S로 염색한 결과이다. 도 9에 나타난 바와 같이, 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포는 염색이 되지 않았으나, 실험군 및 대조군에서는 세포의 골분화시 생성되는 칼슘염과 반응하여 적색으로 염색이 됨을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 배양 시 혈청 배지와 동일한 골분화능을 가짐을 알 수 있다. Fig. 9 shows results obtained by staining with calcium-containing Alizarin Red S in a medium containing normal animal-derived serum and in calcium-containing cells secreted from stem cells cultured in the medium of the present invention. As shown in FIG. 9, cells cultured in the cell culture medium (CHA-SFM-035) and serum-containing medium (CCM) were not stained, but in the experimental group and the control group, And it was confirmed to be stained with red color. That is, the cell culture medium of the present invention has the same bone differentiation ability as the serum medium when the stem cells are subcultured.
(5.2) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 지방분화능 확인(5.2) < RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 지방분화 잠재력의 변화 여부를 확인하였다. (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 계대 4 내지 6까지 배양하였다. 이후, 계대 6의 세포를 시판용 지방분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 세포를 실험군으로 사용하였다. 대조군은 CCM에서 배양한 계대 6 세포를 시판용 지방분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 것을 사용하였다.As the medium contained the composition of (2.1), it was confirmed whether the fat differentiation potential of the subcultured stem cells in CHA-SFM-035 was changed. (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as the primary medium in the culture medium (2.1), the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured to
도 10은 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 Oil Red O로 염색한 결과이다. 도 10에 나타난 바와 같이, 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포는 염색이 되지 않았으나, 실험군 및 대조군에서는 세포의 지방분화시 생성되는 중성지방, 지방산 및 콜레스테롤에스테르가 적색으로 염색되는 것을 확인하였다. 또한, 인지질 및 세레브로시드(cerebroside)는 연한분홍색으로 염색되는 것을 확인하였다. 도 11은 Oil Red O로 염색된 줄기세포를 이소프로필 알코올로 탈색한 후, 지방분화율을 정량적으로 평가한 그래프이다. 도 11에 나타난 바와 같이, 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포와 비교하여 실험군 및 대조군에서 Fold change 각 1.71과 1.78로 유사한 수치를 나타냄을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 배양 시 혈청 배지와 동일한 지방분화능을 가짐을 알 수 있다. Fig. 10 shows results obtained by staining a medium containing normal animal-derived serum and stem cells cultured in the medium of the present invention with Oil Red O. Fig. As shown in FIG. 10, the cells cultured in the cell culture medium (CHA-SFM-035) and the serum-containing medium (CCM) were not stained. However, in the experimental group and the control group, And cholesterol ester were stained red. In addition, it was confirmed that the phospholipids and cerebrosides were stained with light pink. 11 is a graph quantitatively evaluating the degree of lipolysis after discoloration of stem cells stained with Oil Red O with isopropyl alcohol. As shown in Fig. 11, Fold change of 1.71 and 1.78 in the experimental group and the control group were similar to those of the cells cultured in the cell culture medium (CHA-SFM-035) and serum containing medium (CCM) have. That is, the cell culture medium of the present invention has the same fat-multiplying ability as the serum medium when the stem cells are subcultured.
(5.3) 1의 배지 조성물에서 배양한 후, 줄기세포의 연골분화능 확인 (5.3) < RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 연골분화 잠재력의 변화 여부를 확인하였다. (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 계대 4 내지 6까지 배양하였다. 이후, 계대 6의 세포를 시판용 연골분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 세포를 실험군으로 사용하였다. 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 계대 6 세포를 시판용 골분화유도배지로 옮겨 추가로 3주 동안 배양한 것을 사용하였다. 도 12는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 Alcian blue로 염색한 결과이다. 도 12에 나타난 바와 같이, 전체적으로 유사한 양상을 나타냈으나 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포와 비교하여 실험군 및 대조군의 세포크기가 큰 것을 확인하였다. 또한, 핵(Red 염색)의 모양이 길어지고 얇아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는, 배양용 배지(CHA-SFM-035) 및 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포와 비교하여 실험군 및 대조군에서 연골 분화가 더 이루어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 배양 시 혈청 배지와 동일한 연골분화능을 가짐을 알 수 있다. As the medium contained the composition of (2.1), it was confirmed whether the chondrogenic differentiation potential of the subcultured stem cells in CHA-SFM-035 was changed. (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as a basic medium in step (2.1), the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured to
실시예 6. 면역자극 조건에서의 염증 인자 발현율 확인Example 6 Confirmation of Inflammatory Factor Expression Rate in Immune Stimulation Condition
(6.1) in vitro 분석(6.1) In vitro analysis
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 염증 인자인 TNFAIP6, PTGS2, IDO1의 유전자 발현 여부를 확인하였다. 실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. 먼저, TNF-a를 이용해 세포의 계대 별로 면역조절(Immunomodulation)을 시킨 후 정량적 중합효소연쇄반응(quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)을 수행하였다.The expression of TNFAIP6, PTGS2, and IDO1, which are inflammatory factors of stem cells cultured subcultured in CHA-SFM-035, was confirmed as the medium contained the composition of (2.1). In the experimental group, the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured in a 4 to 7 passages in a cell culture medium (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as the basic medium in (2.1). Positive control cells were cultured in serum-containing medium (CCM). Immunomodulation of each cell line was carried out using TNF-a, and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was performed.
도 13a~13c는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포에서 염증 인자의 발현 양상을 확인한 그래프이다. 도 13a 내지 13c에 나타난 바와 같이, 양성 대조군과 비교하여 실험군에서 TNFAIP6, PTGS2, IDO1 유전자의 발현이 비슷하거나 유의하게 상승하는 것을 확인하였다. 특히, 계대 5에서 현저하게 상승하는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지는 줄기세포의 계대 배양 시 유전자가 동등함을 알 수 있다. 13A to 13C are graphs showing the expression patterns of inflammatory factors in medium containing normal animal-derived serum and in stem cells cultured in the medium of the present invention. As shown in Figs. 13A to 13C, it was confirmed that expression of TNFAIP6, PTGS2, and IDO1 genes in the experimental group was similar or significantly increased compared with the positive control group. Particularly, it can be confirmed that the temperature rises remarkably in the
(6.2) in vivo 분석(6.2) in vivo analysis
배지가 (2.1)의 조성을 포함함에 따라, CHA-SFM-035에서 계대 배양한 줄기세포의 In vivo 상에서의 면역조절을 확인하였다. 실험군은 (2.1)에서 기본 배지로 DMEM/F12를 포함하는 세포 배양용 배지(CHA-SFM-035)에서, 1에서 수득한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 4 내지 7 계대까지 배양한 것을 사용하였다. 음성 대조군은 PBS, 양성 대조군은 혈청포함배지(CCM)에서 배양한 세포를 사용하였다. 먼저, 복막염 마우스 모델(zymosan induced peritonitis mouse model)을 이용하여 자이모산(zymosan)으로 복강내 염증을 유발하였다. 이후, 실험군, 음성대조군 및 양성대조군 세포를 주입하였다. 4시간 후 복막 삼출액(peritoneal exudates)을 추출하여 ELISA 시험을 진행하였다. As the medium contained the composition of (2.1), immune regulation in vivo of stem cells transplanted in CHA-SFM-035 was confirmed. In the experimental group, the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells obtained in 1 were cultured in a 4 to 7 passages in a cell culture medium (CHA-SFM-035) containing DMEM / F12 as the basic medium in (2.1). Cells cultured in serum-containing medium (CCM) were used for the negative control group and PBS for the positive control group. First, intraperitoneal inflammation was induced with zymosan using a zymosan induced peritonitis mouse model. Then, experimental group, negative control group and positive control group were injected. After 4 hours, peritoneal exudates were extracted and subjected to ELISA.
도 13d는 통상의 동물 유래 혈청을 포함하는 배지 및 본 발명의 배지에서 배양한 줄기세포를 배양한 후, 마우스에 주입하여 TNF-a의 발현 양상을 확인한 그래프이다. 도 13d에 나타난 바와 같이, 실험군을 주입한 마우스의 경우 mTNF-a 의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 배양용 배지에서 계대 배양한 세포는 혈청포함배지와 비교하여 동등하거나 향상된 mTNF-a의 발현을 나타내는 바 세포 유전자의 항-염증 효과가 있음을 알 수 있다. FIG. 13D is a graph showing the expression pattern of TNF-.alpha. After culturing a medium containing normal animal-derived serum and cultured stem cells in the medium of the present invention and injecting it into a mouse. As shown in Fig. 13 (d), the expression of mTNF-a was decreased in the mice injected with the experimental group. That is, it can be seen that the subcultured cells in the cell culture medium of the present invention have an anti-inflammatory effect of the cell gene showing mTNF-a expression equivalent or improved as compared with the serum-containing medium.
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