KR20190049844A - 재조합형 림프구 활성화 유전자-3의 사용 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3) 단백질 결핍에 기초하여 심혈관 질환, 다른 만성 염증성 질환, 심혈관 및 비심혈관 질환으로 인한 사망률 및 사망 위험을 평가할 수 있는 새로운 전략과, 동반 치료제로서의 재조합 인간 림프구 활성화 유전자-3의 사용을 포함하는 맞춤형 치료 요법으로 상기 위험을 중재하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
한 실시예에서, 상기 방법은 심혈관 질환을 발병시키기 위한 하나 이상의 위험 인자에 대해 개체를 질적으로 예비 스크리닝하는 제 1 단계, 상기 개체로부터의 샘플에서 LAG3 단백질 결핍을 정량적으로 검출하는 제 2 단계와 항염증제, HDL-C 기능, 크기를 개선시키는 제제 및/또는 부적절한 HDL-C를 감소시키는 약제, PCSK9 억제제 (LDL 콜레스테롤 수치를 현저하게 낮추는 새로운 종류의 약물) 또는 다른 콜레스테롤 저하 생물학, 콜레스테롤 변화 저분자, 약물 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 LAG3 기능을 모방하는 약물, LAG3 인산화 신호 효과를 모방하는 약물, CD4 +, CD8 + T, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, B regs 및 Tregs에서 LAG3의 역할을 모방하는 약제 MHC 클래스 II 분자 및 세포막의 지질 래프트에서 LAG3의 역할을 모방하는 물질을 포함하는 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제에 대한 동반 치료제로서의 재조합 인간 림프구 활성화 유전자-3으로 대상체를 치료하는 제 3 단계가 있다. LAG3 모체에는 칼륨, 나트륨, 리튬 및 칼슘과 같은 세포 내 양이온을 조절하는 약제를 포함하여 LAG3 전사 조절에 영향을주는 DNA 또는 RNA 구조 또는 유연성에 영향을 미치는 소분자 제제, 마이크로 RNA, 올리고 뉴클레오타이드, 생물학적 제제, 활성화 항체가 포함될 수 있다.

Description

재조합형 림프구 활성화 유전자-3의 사용
본 발명은 심혈관 질환 및 면역 질환과 같은 질병의 질병 검출 및 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3) 단백질 결핍에 대한 위험 평가에 기초하여 심혈관 질환, 다른 만성 염증성 질환 및 심혈관 및 비심혈관 질환의 위험성이 있는 환자를 분류하고, 재조합 림프구 활성화 유전자-3를 동반 치료제로 사용을 포함하는 맞춤형 치료요법에 관한 것이다.
죽상동맥경화증(atherosclerosis)은 만성 염증성 질환이며, 선천성 및 적응성 면역 세포 및 콜레스테롤 플라그가 관상 동맥 혈관에 침투하여 궁극적으로 혈관 폐색 및 임상 질환을 일으킨다(Atherosclerosis-a matter of unresolved inflammation. Viola J. Soehnlein O. s.l.: Semin Immunol. 2015. Vol. 27, pp. 1 184-931). 고혈압, 당뇨병, 지질, 나이, 성별을 포함한 환자의 죽상동맥경화증 위험을 평가하기 위해 심혈관 질환(CVD) 위험 인자가 임상적으로 많이 사용된다(Executive Summary. Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection. Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults. s.l. : NIH Publication No. 01 -3670, 2001). 정밀 의학의 시대에는 CVD 위험에 유전적 원인이 큰 영향을 미친다고 이해된다. 현재 CVD와 연관되어있는 유전자좌, 특히 죽상동맥경화증 및 심근경색과 같은 질병을 확인한 많은 게놈 관련 연구(GWAS)가 있다(Genetics of human cardiovascular disease. Kathircsan S. Srivasiava D. s.l. : Cell, 2012, Vol. 148, pp. 1242-1257).
SR-BI 유전자 내에서 rs10846744 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)이 밝혀졌다. SCARB 1(염색체 12:q24.31 위치)은 무증상 죽상동맥경화증 및 CVD와 관련이 있다. 미국특허 제 9.334.538호에서, 본 발명자는 SCARB1 유전자(염색체 12:q24.31 위치)의 rs10846744 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 여성의 유전자형 분석 방법을 개시했다. 이는 다민족 죽상동맥경화증 연구(Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis, MESA) 참가자에서 무증상 죽상동맥경화증(subclinical atherosclerosis, SCA) 및 사고 심혈관 질환(CVD)과 유의한 관련이 있었다.
특히, 리스크 C allele의 캐리어는 인시던트 CVD에 대한 확률이 유의하게 증가했으며, 이는 다변량 회귀 모델에서 연령, 체질량 지수, 고혈압, 흡연, 신장 질환, 스타틴(statin) 이용 또는 지질 수치(총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤[LDL-C], HDL-C, 또는 triglycerides)과 같은 전통적인 CVD 위험 요소로 인하여 관계가 약화되지 않았다. 이러한 결과는 이 유전 변이와 CVD와의 연관성에서 다른 요인이나 경로가 원인이 될 수 있음을 강력히 시사했다.
흥미롭게도 rs10846744는 SCA RBI의 첫 번째 인트론 내에 존재하며 생물정보분석 결과, 이 SNP는 조절 부위 내에 존재함이 밝혀졌다. 데이터는 이 SNP가 동일한 염색체(염색체 내) 또는 유전자 내 염색체상의 유전자를 전사 조절할 수 있다고 제시했다. 본 발명자는 이러한 가능성을 조사하고, 전사적으로 조절된 다수의 유전자 후보에서 특히 하나를 출현 하였다. 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 또한 12번 염색체에 위치하며, LAG 3는 T 림프구 활성화에 중요한 조절 인자이다. (Lymphocyte-activation gene 3 'major histocompatibility complex class II interaction modulates the antigenic response of CD4+ T lymphocytes. Huard B, Tournier M, Hercend T. Tricbel F, Faurc F. s.l. : Eur J Immunol. 1994, Vol. 24. pp. 3216-3221.) LAG3는 Ig superfamily에 속하고 항원제시세포(APC)의 MHC Class II 분자에 대한 리간드이다(LAG-3: a regulator of T-cell and DC responses and its use in therapeutic vaccination. F.. Triebel. s.l.: TRENDS Immunol. 2003, Vol. 24. pp. 619-622). 이는 B 세포, T 세포 및 NK 림프구, 단핵 세포 및 수지상 세포(DC)에서 발현되며, 주요 기능은 작동 T 세포(effector T cell)의 팽창 및 항상성 조절에 의해 활성화된 T 세포의 음성 조절 인자로 생각된다(LAG-3 regulates plasmacytoid dendritic cell homeostasis. Workman CJ, Wang Y, El Kasmi KC, Pardoll DM, Murray PJ. Drake CG. Vignali DA. s.l. : J Immunol, 2009, Vol. 1X2, pp. 1885-1891 ; The CD4-related molecule, LAG-3 (CD223), regulates the expansion of activated T cells. Workman CJ. Vignali DA. s.l. : Eur J Immunol. 2003, Vol. 33. pp. 970-979). 세포 표면 LAG3은 ADAM 10과 ADAM 17 meialloproases에 의해 분해되어 용해성 LAG3 (sLAG3)가 된다(Metalloproteases regulate T-cell proliferation and effector function via LAG-3. Li N, Wang Y. Forbes K, Vignali KM. Heale BS, Saftiq P, Hartmann D. Black RA, Rossi JJ. Blobel CP, Dempsey PJ, Workman CJ, Vignali DA. s.l. : EMBO, 2007, Vol. 26, pp. 494-504).
과알파 지방 단백질 혈증(hyperalphalipoproteinemic, HALP) 피험자로부터 분리된 샘플에서 rs10846744와 LAG3의 연관성을 시험하기 위해 시험관내(in vitro) 및 생체 외(ex vivo) 접근법을 취하였다. rs10846744는 LAG3의 발현 및 기능의 변경과 NLKP3와 같은 세포내 염증복합체(inflammasomes)의 표지와 유의한 관련이 있음을 발견했다.
LAG3은 12번 염색체(chr 12:p13)의 CD4 유전자좌 근처에 위치하고 있으며 rs10846744는 12번 염색체의 q24.32에 있다. LAG3는 항원제시세포에 MHC class II를 결합시킴으로써 CD4에 대해 경쟁적이지는 않지만 유사한 기능을 갖는다(Sierro S. Romero P. Speiser DF. The CD4-like molecule LAG-3, biology and therapeutic applications. Expert Opin Ther Targets 2011:15:91 - 101).
Golden el al., Arteriosclerosis. Thrombosis, and Vascular Biology. 34: A359 (2014)에서는 SCARB 1 rs10846744 위험 (CC) 대립 유전자의 인간 동형 접합체 캐리어가 혈장 LAG3 단백질 수준이 유의하게 낮았다는 것을 보여주었다. 시험 관내 연구에 따르면 기준 (GG) 림프구와 비교하여 위험 (CC) 림프구가 더 많은 염증 유발성 사이토카인(TNFot)과 항염증성 사이토카인(IL-10)을 분비한다는 것이 밝혀졌다. 결과적으로, 위험 (CC) 대립 유전자의 이러한 동일한 운반체는 CVD 사건 위험에 대해 알려진 대용 경동맥 내중막 두께(carotid intimal media thickness, cIMT)를 증가시키는 것으로 나타났다.
in vitro 및 in vivo 생쥐 연구는 sLAG3가 T 세포 활성화 및 항상성을 제한하기 위해 MHC class II 신호 전달 경로를 조절하는 반면, 몇몇 임상 연구에서는 sLAG3와 결핵 내성[Lienhardt et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Thl and increased Th2 activity in vivo. G. s.l. : Eur J Immunol. 2002. Vol. 32. pp. 1605- 1613]과 유방암 예후[Triebel et al., A soluble lymphocyte activation gene-2(sLAG-3)protein as a prognostic factor in human breast cancer expressing estrogen or progesterone receptors. M-F. s.l. : Cancer Letters. 2006, Vol. 235, pp. 147-153]사이의 연관성을 보여 주었다고 제시하였다. 쥐 세포에서 Kisielow el al은 활성화된 T 세포가 B 세포에서 LAG3 발현을 유도한다고 보고했다(Kisielow M. Kisielow J, Capoferri-Sollanii g, Karjalainen K. Expression of lymphocyte activation gene 3 (LAG-3) on B cells is induced by T cells. Eur J Immunol 2005: 35:2081 -2088). 그들은 B 세포에 대한 LAG3 유도가 1 세포 의존적이며 메틸화되지 않은 CpG 모티프 1826, 박테리아 LPS, 또는 anti-CD4 및 IL-4와 조합된 anti-Ig 항체와 같은 다른 자극에 의존하지 않는다고 생각했다. 대조적으로, LAG3 RNA 및 단백질은 EBV-형질전환된 B 세포에서 검출되었고, C 대립 유전자를 발현하는 세포와 비교하여 표현형 SCARBI rs10846744G 대립 유전자를 발현하는 FBV-형질 전환 세포에서 현저하게 높은 발현을 나타내었다. B 림프구의 EBV 형질 전환이 세포를 활성화시킬 수 있었지만, rs10846744 유전자형 층화에 근거한 LAG3 발현 수준에는 유의한 차이가 있었다. 중요한 것은 Ramos 세포와 같은 B 세포에서 LAG3 발현의 결핍이 관찰되었다(Baixeras E, Huard B. Miossec C, Jitsukawa S. Martin M. Hercend T. Auffray C. Triebel F. Piatier-Tonneau D.. Characterization of the lymphocyte activation gene 3-encoded protein. A new ligand for human leukocyte antigen class II antigens. J Exp Med 1 92; 176:327-337). 그러나, 본 발명자는 이들 세포를 유전자형화하여 이들이 rx10846744 변이체에 대해 이형 접합체인 것을 발견했다. 최근에는 Morales el al 은 호지킨 림프종(Hodgkin lymphomas)에서 EBV가 LAG3의 유전자 발현 증가와 유의한 상관 관계가 있음을 보여 주었다(Morales O. Mrizak D, Francois V, Mustapha R. Miroux C. Depil S, Decouvelaere AV, Lionne-Huyghe P. Auriaull C, de Launoit Y. Pancre V, Delhem N. Epstein-Barr virus infection induces an increase of T regulatory type 1 cells in Hodgkin lymphoma patients. Br J Haematol 2 14 July 9. Epub ahead of print).
쥐 모델을 이용한 연구에서 PD-1, PD-L1 및 PD-L2 경로와 조절 T 세포를 포함하여 T 세포 활성화 억제제가 부족할 때 죽상동맥경화증 병변 및 염증이 증가한다는 사실이 밝혀졌다. atherogene의 적응 면역은 새로운 통찰력과 치료 방법입니다(Adaptive immunity in atherogene is: new insights and therapeutic approaches. Lichtman AH. Binder CJ, Tsimikas S, Witzturn JL. s.l. : J Clin Invest, 201 , Vol. 123, pp. 27-36).
Baixeras et al. 상기 문헌은 다수의 세포주에서 LAG3의 세포 분포를 특성화하고 LAG3이 지질 래프트 내에 존재함을 입증하였다. 이어서, Woo et al.은 LAG3의 세포 내 분포를 보고하고 LAG3이 세포 내 구획과 원형질막 사이에 균등하게 분포되어있는 것을 발견했다(Woo S-R. Li N, Bruno TC. Forbes K. Brown S, Workman C. Drake CG, Vignali DAA. Differential subcellular localization of the regulatory T-cell protein LAG-3 and the coreceptor CD4. Eur J Immunol 2010;40: 1768-1777).
유동 세포 계측법(flow cytometry)을 사용함으로써, 본 발명자는 자극 조건에 관계없이 rs10846744 리스크 C 발현 세포의 세포 표면에서 낮은 수준의 LAG3가 검출되었음을 확인하였다. 그러나 LAG3는 자극받지 않은 rs10846744 기준 G 세포에서 세포 표면에 발현되었으며, 자극 후 그 수준은 유의하게 증가하였다. 상기 EBV 형질 전환된 B 세포에서의 이러한 결과는 LAG3가 활성화된 T 세포에서만 표면상에 발현된다는 보고에서 상기 문헌 Woo el al.에 의해 보고된 것과 대조적이다.
지질 래프트 신호가 B 세포 활성화에 필수적이라는 것도 알려져 있다(Simons K. Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol 2000; 1 :31-39). 구체적으로, B 세포 수용체(BCR)의 자극은 CD79A 및 CD79B (Ig-α, Ig-β heterodimer와 관련된 transmembrane immunoglobulin(Ig) 수용체)의 세포질 내 미부(cytoplasmic tail)에서 immunorecepior tyrosine-based activation motifs(ITAMs)의 인산화를 개시한다(Schamel WW. Reth M. Monomelic and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 2000; 13:5-14). ITAM의 인산화는 Syk의 도킹 사이트 역할을 한다. 이는 Fyn, BIk 및 Lyn을 포함하는 Src family kinases (SFKs)에 의해 매개된다(Takata M, Sabe H. Hala A. Ina/u T, Homma Y. Nukada T. Yamamura H. Kurosaki T. Tyrosine kinases Lyn and Syk regulate B cell receptor-coupled Ca2+ mobilization through distinct pathways. EMBO J. 1994: 13: 1341-9). 문헌 Simons에 의해보고 된 것과 같이 Lyn은 B 세포 활성화시 지질 래프트 신호 전달에 관여하는 주요 단백질이다. 이 활성화는 다양한 세포 내 신호 전달 분자로 구성된 "신호전달 복합체(signalosome)"의 좌표 어셈블리를 시작하며 Btk, phosphalidylinosilol 3-kinase (PI3K) 및 PLCy2를 포함한다(Blix ES, Irish JM, Husebekk A. Delabie J. Forfang L. Tierens AM, Myklebust JH. Kolstad A. Phospho-specific flow cytometry identities aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer 2012; 12:478). PLCy2는 인간 B lymphocytes에서 발현되는 지배적인 형태이다(Coggeshall KM. McHugh JC. Aliman A. Predominant expression and activation-induced tyrosine phosphorylation of phospholipase C-gamma 2 in B lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992; 89:5660-4). 그것은 또한 BCR-매개 phosphoinositol hydrolysis 및 PKC 활성화를 포함하는 계속되는 생화학적 사건에 필수적이다(Sugawara H. Kurosaki M. Takata M, Kurosaki T. Genetic evidence for involvement of type 1 , type 2 and type 3 inositol 1 , 4,5-trisphosphate receptors in signal transduction through the B-cell antigen receptor. EMBO J. 1997; 16:3078-88).
MHC class II는 LAG3의 주요 리간드이고 후자는 T 세포의 세포 증식, 활성 및 항상성을 부정적으로 조절하는 높은 친화성으로 전자에 결합하고, Treg을 억제하는 역할을 하는 것으로 보고되었다. 대조적으로, 수지상 세포의 아군(subset)의 지질 레일 미세부분(microdomain)에서 MHC class II을 통한 신호는 용해성 LAG3 (sLAG3)이 바인딩 된 후 수지상 세포의 활성화 결과를 가져온다. 본 발명자는 림프구에서의 세포내 LAG3가 인산화 신호의 조절에 인과 관계가 있음을 발견했다. 이것은 MHC class II 수용체에 결합하는 이전의 공지된 기능과는 무관한 LAG3의 독특하고 새로운 기능이다.
그러나, HDL 입자 apoA-1과 연관된 주요 아포지단백은 T 림프구에 의한 단핵구의 활성화를 억제함으로써 염증성 사이토카인 생성을 억제하는 것으로 나타났다(Hyka N. Dayer J-M, Modoux C, Kohno T. Edwards III CK. Roux-Lombard P. Burger D. Apolipoprotein A-I inhibits the production of interleukin-
Figure pct00001
β and tumor necrosis factor-a by blocking contact-mediated activation of monocytes by T lymphocytes. Blood 2001 : 97:2381-2389). 특히 Hyka et al.는 apoA-1이 표면 인자에 먼저 결합함으로써 자극된 단핵구에서 사이토카인 생산을 저해한다는 것을 관찰하였다. 이는 apoA-1이 표면 LAG3과 상호 작용할 가능성을 시사한다.
관상동맥성 심장질환(coronary heart disease, CHD)과 관련된 SCARB 1 변이 형인 rs 10846744의 중요한 연관성이 Manichaikul et al.에 알려져있다(Anerioscler Thromb Vase Biol 2012: 32: 1991-1999). 그러나, 이전의 분석은 rs10846744가 SCA 및 CVD와 직접 관련이 있음을 보여주지는 않는다. 이것은, 본 발명자가 발견한 바에 따르면, LAG3은 rs10846744와 죽상 동맥 경화성 질환 및 CVD의 관련을 중재하는 중요한 면역 조절자이기 때문이다. 작동 및 조절 T세포에 대한 LAG3 단백질 발현은 MHC class II와 T 세포 수용체 (TCR)의 상호 작용을 차단하여 T 세포 수용체 매개 활성화를 억제 할 수 있으며, plasmacytoid DC에서 LAG3 단백질은 다른 메커니즘으로 간접적으로 effector T 세포를 억제 할 수 있다. LAG3 단백질 결핍은 특이적인 사이토카인 잠재력을 갖는 염증성 표현형에 T 세포 분화를 왜곡하는 2 가지 사이토카인인 IL-1β 및 IL-18를 DC 및 대식세포에 의한 염증조절결합체(inflammasome)에서의 생산 증진을 초래할 수 있다(The inierleukin- 1 family: back to the future. Garlanda C. Dinarello CA. Mantovani A. s.l. : Immunity. 2013, Vol. 39. pp. 1003- 1018).
따라서 LAG3 단백질 결핍인 마우스(Lag3)와 인간(LAG3)에서 고콜레스테롤 혈증에 대한 Pro-atherogenic T 세포 반응을 증가시키고 플라크 염증의 증가 및 / 또는 증가된 플라크 발생을 유도할 것으로 예측된다.
사람에서 유전적 변이로 인한 LAG-3 단백질의 결핍이 존재하지 않으며 죽상동맥경화증, 다른 만성 염증성 질환, 심혈관 및 비심장 혈관 사망률과 유의한 관련이 있음이 분명하지 않다. CVD 및 기타 만성 염증성 질환에서 LAG3가 담당하는 중재자 역할을 바탕으로, 본 발명은 특정 SCARB1 및 LAG-3 유전자 변이와 임상적으로 유의한 아테롬성 동맥 경화증, 다른 만성적인 만성 동맥 경화증에 대한 위험을 증가시키는 기타 유전적 및 비유전적 요인에 기초하여 CVD의 위험이있는 환자를 평가하기 위한 바이오 마커로서 LAG3 발현 프로파일링을 사용하는 방법과 염증성 질환, 만성 염증성 질환, HDL 기능 장애, 심혈관 및 / 또는 비심혈관 이환율 및 사망률을 감소시키고 신규 한 재조합 LAG3 동반 치료제로 상기 위험을 완화시키는 방법을 개시한다.
IMP321(the human dimeric soluble form of LAG3)의 치료 활성은 전임상 시험뿐만 아니라 임상 시험에서도 잘 알려져 있다. 화학요법제와 보조제로서의 hLAG3-Ig의 조합은 단독 치료법보다 우수한 것으로 나타났다.
또한, LAG3 차단제는 PD-1과 같은 다른 억제 수용체의 차단과 결합하여 T 세포 활성을 증가시키고 질병으로부터 보호 할 수 있다. 또한, 가용성 재조합 이량체 LAG3 단백질의 치료활성은 여러 측면에서 공지되어있다(Sierro et al., “The CD4-like molecule LAG-3. biology and therapeutic applications". Section 3). 인체에서 재조합 LAG3는 DC 활성화를 유도하고 면역 보조제 활성을 제공한다(LAG-3의 막 결합 형태의 억제 활성과 대조적으로)(Andreae et al., "Maturation and activation of dendritic cells induced by lymphocyte activation gene-3 (CD223)", J Immunol, 168:3874-80 (2002)).
2002년 6월 25일에 발행된 Triebel(Institul Gustave-Roussy)의 미국 특허 6.410,509는 생체 내 종양 성장을 직접적으로 유도하는 가용성 hLAG3의 전신 투여와 백신 접종 및 암 치료를 위한 보조제로서 hLAG3의 사용을 기재하였다(실시 예 IV). 이와 유사하게 2011년 1월 13일자로 공개된 Triebel (Immutep)의 미국 특허 출원 20110008331은 단핵구 매개 면역 반응을 증가시키기 위한, 특히 혈액 내의 단핵 세포의 수의 증가를 유도하기 위한 재조합 LAG3의 주기적인 사용을 개제했다. 이 응용 프로그램은 악성 종양이 있는 환자에게 접종했을 때 인간 LAG3 또는 그 유도체가 단핵구 의존성인 강력한 면역을 유도한다는 "완전히 예상치 못한"발견에 주목한다. 유도된 면역은 혈액 단핵구 수의 현저한 증가로 나타난다. 알려진 암 환자에서 T 세포 수를 증가시키는 백신 보조제로서 hLAG3의 사용에도 불구하고, 아무도 아직까지 LAG3 결핍 마커를 심도있게 스크리닝하지 않았으며, 발견된 경우라도 환자를 다른 시점에 주기적으로 재조합 인간 LAG3을 투여함으로 이어지는 위험을 완화시키지 못했다. 본 발명자는 심혈관 질환, 다른 만성 염증성 질환, 특정 2-point 발현 프로파일을 사용한 심장혈관 및 / 또는 비심혈관 이환율 및 사망률에 대한 위험이 있는 환자를 선별하여(SCARB1 rs10846744 돌연변이 및 / 또는 LAG-3 rs870849 또는 기타 유전 적 또는 비 유전 적 원인 및 돌연변이와 같은 돌연변이 및 / 또는 비 유전 원인의 조합), 재조합 인간 림프구 활성화를 사용한 맞춤 치료 요법 gene-3를 동반 치료제로 사용하였다.
미국특허출원 15/262,618 (2016년 9월 12일 출원)
본 발명의 목적은 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3) 단백질 결핍에 기초하여 심혈관 질환, 다른 만성 염증성 질환, 심혈관 및 비심혈관 질환으로 인한 사망률 및 사망 위험을 평가할 수 있는 새로운 전략과, 동반 치료제로서의 재조합 인간 림프구 활성화 유전자-3의 사용을 포함하는 맞춤형 치료 요법으로 상기 위험을 중재하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 인간 성인 대상에서 만성 염증성 및 심혈관 질환을 치료하는 방법으로서, LAG3 단백질의 잠재적 결핍을 나타내는 LAG3 결핍 마커를 검출하기 위해 상기 환자의 정성적 예비 스크린을 투여하는 단계, 상기 개체에 대한 정량적 검사를 투여하여 상기 LAG3 단백질 결핍증을 확인하는 단계 및 적어도 하나의 화학 요법제와의 보조제로서의 hLAG3-Ig의 조합을 포함하는 치료요법을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 환자의 정성적 예비 스크린을 투여하는 단계는 LAG3 결핍 마커에 대한 의학 기록을 예비 검사하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 환자의 정성적 예비 스크린을 투여하는 단계는 LAG 결핍 마커에 대한 가족력을 사전 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 정량적 검사을 투여하는 단계는 상기 LAG3 단백질 결핍을 확인하기 위해 상기 피험자로부터의 혈액 시료에 양적 반응을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 혈액 시료에 대한 상기 정량적 검사는 분석인 방법을 포함할 수 있다.
상기 혈액 시료에 대한 상기 정량적 검사는 유전자 테스트인 방법을 포함할 수 있다.
상기 정량적 시험은 LAG3의 저수준 발현의 존재에 대한 상기 대상으로부터의 혈장 샘플의 유전자 검사 및 분석을 포함할 수 있다.
상기 정량적 유전자 검사는 SCARB1 또는 LAG3 유전자의 코딩 서열에서의 다형성을 검출하도록 구성되는 것인 방법을 포함할 수 있다.
상기 다형성이 SCARB1 rs10846744 또는 LAG3 rs870849 돌연변이인 방법을 포함할 수 있다.
상기 혈액 시료에 대한 상기 정량적 검사는 대립 변이체를 동정하기 전에 SCARB1 또는 LAG3 유전자의 적어도 일부를 증폭시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 분석은 3400 pg/ml 이하의 낮은 LAG3을 측정하도록 구성되는 것인 방법을 포함할 수 있다.
상기 분석은 ELISA 분석인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 치료요법을 상기 대상에게 투여하는 단계는 주기적인 투여에 의해 재조합 인간 LAG3를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 치료요법을 상기 대상에게 투여하는 상기 단계는 주기적으로 투여하여 재조합 LAG3 모방체를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 치료요법을 상기 대상에게 투여하는 상기 단계는 상기 화학요법치료제인 프로부콜(probucol)을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 프로부콜을 투여하는 단계는 3 내지 4 개월의 범위 내에서 주기적으로 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 프로부콜을 투여하는 단계는 상기 환자의 수명의 나머지 동안 주기적으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 주기적인 투여에 의해 재조합 인간 LAG3을 투여하는 단계는 인간 LAG3 단백질을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 조합 치료제는 항염증제, HDL-C 기능, 크기를 개선시키는 제제 및/또는 대상에서 기능 장애 HDL-C를 감소시키는 제제, PCSK9 억제제 및 LAG3 모방체 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다.
LDL 산화 및 혈장 HDL 콜레스테롤 및 plasma/serum 사이토카인(cytokine)에 대한 효과를 결정하기 위해 상기 주기적 투여동안 상기 대상을 모니터링하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 모니터링 단계는 포괄적인 프로파일 및 EKG를 갖는 매월 안전 실험을 포함할 수 있다.
심혈관 질환, 다른 만성 염증성 질환, 심혈관 및 비심혈관 질환으로 인한 사망률 및 사망 위험을 평가할 수 있는 새로운 전략과, 동반 치료제로서의 재조합 인간 림프구 활성화 유전자-3의 사용을 포함하는 맞춤형 치료 요법으로 상기 질병의 위험을 줄일 수 있다.
도면 1은 SCARB1 rs10846744와 관련이 있는 혈장 sLAG3 수준의 그래프이다.
도면 2는 NMR 분광법에 의한 소형 HDL 판과의 sLAG3 결합 그래프이다.
도면 3는 본 진단 방법의 예시적인 실시예의 블록도이다.
도면 4는 단량체 또는 이량체 형태일 수 있는 적합한 재조합 인간 LAG3에 대한 등록번호 및 서열 목록
도면 5는 표 2는 혈장 LAG-3 (A) 및 HDL-C (B)에 대한 독립적인 예측 인자의 다변량 회귀 분석을 나타낸 것이다 : MESA
도면 6은 유동 세포 계측법에 의해 측정된 rs10846744 기준 G 및 rs10846744 리스크 C 발현 세포에서의 LAG3의 세포 표면 발현의 cytogram 그래프이다.
도면 7은 유동 세포 계측법에 의해 측정된 LAG3 + rs10846744 기준 G 및 리스크 C 발현 세포의 세포 표면 발현의 그래픽 분석이다.
도면 8은 rs10846744 기준 G 및 rs10846744 리스크 C 발현 세포로부터의 활성화 후 시간 경과에 따른 배지에서의 LAG3 단백질 수준의 변화 그래프이다.
도면 9은 rs10846744 레퍼런스 G-003 및 rs10846744 리스크 C-008 발현 세포에서 활성화 후 시간 경과에 따른 배지 중 분비된 사이토 카인(TNFα 및 IL-10) 수준의 변화를 나타낸 그래프이다.
도면 10은 LAG3 단백질이 BCR 신호 전달에서 어떻게 중요하며 인산화 신호에 영향을 미치는지를 설명한다.
도면 11은 LAG3 단백질이 지질 래프트의 특징적인 지표임을 보여준다.
도면 12은 다변수 회귀 분석의 표 (표 3-6)의 컴포지트이다.
도면 13은 고지방 사료 공급 후 마우스에서의 CD4 + Lag3 T 세포 활성화의 그래프이다.
도면 14는 Ldlr 마우스에 Lag3 null 세포의 골수 이식 후 고지방식을 먹인 결과, 대동맥 근위부에서 CD4 + T 세포의 현저한 침윤을 유도한다는 것을 보여준다.
도면 15 Ldlr 마우스에 Lag3 null 세포의 골수 전달이 죽상동맥경화 림프절의 증가 및 증가 된 대퇴 동맥 림프절에서의 exTregs의 증가와 유의한 관련이 있음을 보여준다.
도면 16은 용량 의존적으로 MHC class II 분자를 발현하는 마우스 B 비장 세포에 결합 된 재조합 인간 용해성 단량체 LAG3의 복합 그래프이다.
도면 17은 용량 의존적으로 마우스 T 세포(MHC class II 분자를 발현하지 않음)와 비교하여 마우스 B 세포(MHC class II 분자를 발현함)에 우선적으로 결합한 재조합 인간 가용성 단량체 LAG3를 나타낸 그래프이다.
도면 18은 포볼 에스테르(phorbol esters), 이노마이신(Ionomycin) 및 IL-4(interleukin-4)와 같은 것을 나타낸다.
2339 pg/ml. n=22. p=0.03)가 유의하게 낮았다.
Rs10846744 및 sLAG3와 지질 분획의 연관성
발명자는 다음으로 rs10846744 및 sLAG3와 지질 수준 및 HDL 하부 구조의 관련성을 조사했다. 이 HALP 집단에서 rs10846744 또는 sLAG-3와 총 콜레스테롤, LDL-C, 트리글리 세라이드 또는 HDL-C (데이터는 표시되지 않음)와의 연관성을 관찰하지 않았다. 마찬가지로 본 발명자는 rs10846744 또는 sLAG3와 혈장 아포지단백(apoA-1, apoA-II, apoB, apoCI, apoCII, apoC-III 및 apoE)과의 연관성도 관찰하지 않았다. NMR 분광학으로 측정했을 때, rs10846744와 HDL subfraction의 유의한 연관성이 관찰되었다.
다시 도면 2를 참조하면, 그래프는 NMR 분광학에 의해 측정된 바와 같이 중형 및 소형 HDL 입자와 유의하게 관련된 rs10846744를 나타낸다. 중간 및 작은 HDL 입자는 참조 G 대립 유전자에 대해 동형 접합체 및 rs10846744에 대한 위험 C 대립 형질에 대해 동형 접합체로 분리된 공복 혈장 시료에서 NMR 분광법(Liposcience, Raleigh NC)으로 측정하였다. 표시된 값은 중간 및 작은 HDL 입자의 평균 ± 표준 편차 및 HDL 크기(nm)이다.
인종 / 민족, SCARB1 rs10846744 및 기타 변수는 MESA에서 혈장 LAG3 수준의 독립적인 예측 인자이다. 다변수 회귀모델에서 인종(p=0.0005), 나이(p=0.003), 지질 약물(p=0.03), rs10846744 유전자형(p = 0.002)과 흡연(p<0.0001)은 혈장 LAG3 수준의 독립적인 예측 인자로 유지되었다(도 5, 표 2A). 혈장 LAG-3 (p<0.007)는 나이(p=0.006), 성별(p<0.0001), BMI (p<0.0001), TG (p<0.0001), 음주(p<0.0001), HgbAlc(p=0.01) 및 수축기 혈압(p=0.03)에 따른 조절에도 불구하고 HDL-C 수치의 독립적인 예측 인자로 남아있었다 (도. 5, 표 2B).
로지스틱 다변수 회귀분석 결과, 혈장 LAG3은 무증상 죽상경화증(cIMT) 또는 관상동맥 칼슘 수치(CAC)와 유의한 관련이 없음이 확인되었다. 도면 12에서, 표 3은 MESA 참가자들에서 혈장 LAG3와 CHD의 연관성을 보여주는 다변수 회귀분석이다. 공변량은 인종, 혈통, 나이, 연구 장소, 성별, HgbAlc, BMI, 지질 약물, 지질(TC 및 LDL-C), 흡연량, 수축기 혈압 및 이완기 혈압이 포함된다. LAG3 (SE)의 추정 계수는 -0.078 (0.034)이다. LAG3의 경우 교차비는 1st quartile과 3rd quartile을 비교하여 추정했다. 다른 연속 변수의 경우, 확률 비율은 변수의 1st quartile과 3rd quartile 를 비교하여 추정했다. *N=4707, *p<0.0001: **p=0.02; +p=0.0002; ++p=0.04; &p=0.002; &&p=0.03; ※p=0.05
로지스틱 다변수 회귀분석 결과, 나이 (p<0.0001), 성별 (p<0.0001), 수축기 혈압(p=0.002), LDL-C (p=0.02), TC(p=0.04), 지질 약물(p=0.002), HgbAlc (p=0.03), 흡연(p=0.05), 혈장 LAG3 (beta -0.078, OR 1.15, p=0.02)는 CHD의 독립적인 예측 인자였다.
HDL-C가 60mg 이상인 MESA 코호트 환자의 유병률은 26 %였고, 이 그룹 내에서 CHD 유병률은 4%였고 인종/민족 간에 유의하지 않았다. CHD가 있는 환자(n = 55, 72.4 ± 1.6 mg/dl)의 HDL-C 수치는 CHD가없는 환자(n = 1387, 71.8 ± 0.3 mg/dl, p=0.71)와 비교하여 유의한 차이가 없었다. 그러나 혈장 LAG3 수치는 CHD가 없는 피험자(1828 ± 107.6 pg/ml, n = 1386, p=0.04)와 비교하여 CHD를 가진 피험자(843.3 ± 540.1 pg/ml, n = 55)에서 2배 더 낮았다. 로지스틱 회귀 분석에서 혈장 LAG3 (베타 -0.212 ± 1.45, p=0.004), 연령 (p=0.006), 성 (p=0.001) 및 이완기 혈압 p=0.03)은 CHD의 독립적인 예측 인자로 유지되었다. 도면 12에서, 표 4는 HDL-C ≥ 60 mg/dl인 MESA 참여자에서 혈장 LAG3와 CHD의 관련을 나타내는 회귀 분석이다. 공변량에는 인종, 혈통, 연령, 연구 장소, 성별, HgbA1c, BMI, 지질 약물, 지질 (TC 및 LDL-C), 흡연량, 수축기 혈압, 수축기 혈압 및 이완기 혈압이 포함된다. LAG3 (SE)의 추정 계수는 -0.212 (0.073)이었다. LAG3 (SE)의 추정 계수는 -0.212 (0.073)이었다. LAG3의 경우 확률비는 변수의 1st quartile과 3rd quartile 를 비교하여 추정했다. 다른 연속 변수의 경우, 교차비는 1st quartile과 3rd quartile 을 비교하여 추정되었다. * N= 1134, p=0.004;: ** p=0.006; +p=0.001 ; ++p=0.03 (표 4).
발명인은 또한 MESA 코호트의 혈장 LAG3이 Framingham 위험 점수와 비교하여 CHD 위험 예측에 유의 한 영향을 미치는지 여부를 조사 하였다. 도면 12, 표 5는 모델 2 (로그 변환 된 혈장 LAG3)와 모델 1 (개인의 10 년 심혈관 위험을 예측하기 위한 Framingham 위험 점수)을 비교하는 우도비(likelihood ratio) 테스트이다. 표 5는 혈장 LAG3의 함유가 CHD 위험 예측에 중요한 추가 정보를 제공함을 나타낸다(p=0.039). 모델 3과 4는 모델 3과 모델 3을 비교하는 가능성 비율 테스트에서 LAG3를 포함하면 CHD 위험 예측에 중요한 추가 정보를 제공한다는 결론을 얻었다(p = 0.044). 이는 도면 12, 표 5에서 볼 수 있다. Framingham 위험 점수(p=0.039)와 비교하여 혈장 LAG3가 CHD 위험 예측을 증가시켰다. 이 모델이 연구 장소, 인종 및 혈통에 대한 조정을 포함 할 때, 혈장 LAG3은 CHD 위험 예측 자로서 유의성이 있었다(p=0.04).
발명자는 LAG3와 배양된 B 세포로부터의 염증 마커 사이에 유의한 상관 관계가 있음을 감안하여, 혈장 LAG3가 MESA 데이터 세트에서 이용 가능한 염증 표지자와 관련되어 있는지를 조사하였다. 도면 12, 표 6은 MESA 참여자에서 혈장 LAG3과 염증 표지자의 연관성을 보여준다. 회귀 모델은 연령, 성별, 연구 장소, 인종 및 조상의 PC에 맞게 조정되었다. 모든 결과 변수와 혈장 LAG3는 로그 변환되었으며, sTNFαR=soluble TNFα receptor; hs-CPR=high sensitive C reactive protein. 표 6에서 볼 수 있듯이, 다 변수 회귀 분석 결과, 혈장 LAG3은 IL-10 (p<0.0001)과 양의 상관 관계가 있었다.
결론적으로, 이 연구는 심혈관 질환을 유발하는 하나 이상의 위험 인자에 대해 환자를 질적으로 사전 스크리닝하기 위해 SCARB1 rs10846744 및 / 또는 LAG3 rs870849 돌연변이 또는 혈청 / 혈청 LAG3 측정을 사용하여 3400 pg/ml 미만의 환자를 확인한 후 상기 질환을 매개하기 위한 맞춤형 치료법을 개발을 위해 유전자형 분석을 통해 LAG3 단백질 결핍을 정량적으로 검출하는 두 번째 단계인 대상을 질적으로 사전 스크리닝하기 위한 새로운 전략의 유용성을 입증한다.
실험예 2_재료 및 방법
모든 실험에 사용된 배양 배지는 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin, 100) ㎍/ml streptomycin(Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 보충된 RPMI 1640이다. Interleukin-4 (IL-4)는 PeproTech (Oak Park, CA)에서 구입 한 반면, phorbol 12-myristate acetate (PMA)와 ionomycin calcium salt는 Sigma-Aldrich(St. Louis. MO)에서 구입하였다. LAG3 및 isotype control 형광표지 단클론 항체는 Biolegend Inc. (San Diego, CA)로부터 구입하였다. anti-CD79A (#3351), anti-phospho CD79A (Y182) (#5173), anti-CD19 (#3574), anti-phospho CD19 (Y531) (#3571 ), anli-Syk(#2712), anti-phospho-Syk (Y525/526) (#2710), anti-Lyn (#2796), anti-phospho Lyn (Y507) (#2731). anti-PLCy2 (#3872), anti-phospho-PLCy2 (Y759) (#3874), anti-phospho-PKCα/β II (T638/641) (#9375) 항체는 Cell Signaling Technologies (Beverly, MA)로부터 구입하였다. Anti-PKCβ(Santa Cruz Biotechnology. Santa Cruz, CA sc-210)는 Santa Cruz에서 anti-p-Actin(Sigma-Aldrich, St. Louis. MO)은 Sigma-Aldrich에서 각각 구입하였다.
HALF 피험자로부터 분리된 림프구는 Epstein Barr Virus를 사용하여 B 림프구를 생성하기 위해 불멸화(immortalize)되었다(University of North Carolina Lineberger Comprehensive Cancer Center Tissue Culture Facility, Chapel Hill, NC). EBV 형질전환된 B 림프구를 10 % FBS 및 1% Penicillin-Streptomycin으로 보충되고 L- 글루타민이 함유된 RPMI 1640 배지 1ml 당 1-2 x 106의 밀도로 배양했다. 배지는 실험을 위해 세포를 사용하기 전에 필요에 따라 일주일에 두 번 또는 더 자주 교체되었다.
총 RNA는 대조군 G 대립 유전자에 대해 상동성인 3 명의 HALP 피험자와 위험 C 대립 유전자에 대해 상동성인 3 명의 HALP 피험자로부터 분리한 다음 Perkin Elmer next gen sequencing platform (RNA-Seq) (Perkin Elmer. Bran ford CT)을 사용하여 완전한 전사체 서열분석을 수행 하였다. Perkin Elmer Gene Sifter 소프트웨어 프로그램을 사용하여 bioinformatics를 수행 하였다. 데이터는 전체 맵 읽기, 품질 판독> 20, 로그 변환을 선택하고 Benjamini Hochberg를 사용하여 다중 테스트를 수정하여 조정되었다. 대상 RNA 표적은 표준 방법론을 사용하여 실시간 PCR 및 웨스턴 블랏팅(western blotting)으로 검증하였다. RNA-Seq은 세포가 혈청(일반적인 배양 조건)에서 배양되고 phorbol esters(ΡMA 500 ng/ml), ionomycin(250 ng/ml) 및 IL-4(100 U/ml)로 자극 한 조건에서 분리 된 6개의 세포주에서 6시간동안 수행되었다.
6개의 EBV 형질 전환된 B 세포주에서 LAG3 발현 및 기능을 평가하기 위해 다수의 분석법이 사용되었다.
유동 세포 계측법(Flow cytometry): 유동 세포 계측법은 10-laser flow cytometry (Becton Dickson. Franklin Lakes, NJ)에서 수행하였다. 죽은 세포는 Blue Dead Cell Stain Kit (Molecular Probes, Eugene, OR)로 염색 하였다. 자극 된 B 세포에서 LAG3의 반응을 측정하기 위해 먼저 Smeland et al (I)에 의해 발표된 프로토콜을 수정하고 최적화했다. 세포를 다양한 기간(0-4 시간) 동안 PMA(500 ng/ml), ionomycin(250 ng/ml) 및 IL-4 (100 U/ml) 유무와 함께 배양하였다. 세포 표면 LAG3 발현의 퍼센트 세포 표면 변화는 단지 살아있는 세포 분획을 사용하고 이어서 단클론 LAG3 항체로 처리된 세포에 대한 퍼센트 염색 값으로부터 백분율 이소타입 염색 값을 subtraction함으로써 계산하였다.
사이토카인 분비: 인터루킨 10(II.-10) 및 종양 괴사 인자(TNFα)의 수준을 기초 및 자극 조건하에 배양된 세포로부터 분리된 배지에서 측정하고, XMAP 기술을 사용하여 Luminex 200의 multiplex(Milliplex; millipore, Temecula, CA)에서 0~4시간 동안 측정하였다.
Western Blotting: 자극된 B 세포인 p-CD79A, p-CD19, p-Syk, p-Lyn, p-PLCy2 및 p-PKCβ 에서 하류 신호 전달에 관여하는 것으로 알려진 다음 단백질의 총 발현과 인산화된 발현을 측정하기 위해 western blotting을 사용했다. 일부 실험에서는 2시간 동안 CD40 리간드(CD40L) (200 ng/mL)로 세포를 자극한 다음 western blotting을 위해 전체 세포 lysate을 분리했습니다(그림 S4 및 S5). 세포를 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 % NP-40, 0.25 % Na decoycholate, 150 mM NaCl, 1mM PMSF, 5mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM β- Glycerophosphate, 10mM Na4P2O7, 2mM EDTA 및 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche Diagnostics Corp., San Francisco, CA)로 용해시켰다. 얼음에서 30분간 반응시킨 후, 4 ℃에서 15분 동안 원심 분리(10,000g)하여 용해물을 맑게하고 상층액을 수집하였다. 단백질 농도는 BCA 분석을 사용하여 측정하였고, 등량을 Laemmli 샘플 버퍼에서 가용화시킨 후 SDS/linear gradient PAGE를 수행하였다. PVDF 멤브래인으로 단백질을 옮기고 항체 반응전에 5 % 무지방 우유로 blocking하였다. 다음으로 멤브레인을 인산화된 단백질과 총 단백질에 대한 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 항체-항원 복합체는 chemiluminesence(ECL + System : Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)에 의해 동정되었다. Anti-p-Actin을 loading control으로 사용하였다. 인산화된 단백질은 Image Studio Lite 4.0 (Licor, Lincoln, NE)을 사용하여 해당하는 단백질과 정상화되었다.
지질 래프트 분리. 원형질막 지질 래프트 구획에서 LAG3의 발현을 평가하기 위해 지질 래프트 막을 500 mM sodium carbonate (pH 11.0) 및 sucrose 밀도 원심분리를 사용하여 분리하였다. sucrose gradient method는 근본적으로 상기 (2)에서 기술한 바와 같이 수정하여 실시 하였다. 세포(1 x 108)를 차가운 PBS로 세척하고 pH 11.0(2)의 phosphatase and protease inhibitors( 1 mM PMSF. 5 mM NaF. 1 mM Na3VO4, 1 mM β-Glycerophosphate, 10 mM Na4P2O7, 2 mM EDTA and Complete protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics Corp., San Francisco. CA)가 포함되어있는 500 mM sodium carbon으로 재현탁(resuspend)시켰다. 용액을 Wheaton dounce 균질기에서 10회 스트로크로(strokes)하여 균질화하였다. 불연속의 sucrose 농도에 대해, 300μL의 맑은 상층액을 300μL의 5 % sucrose와 혼합하고 2.2㎖의 Beckman 원심 분리 튜브의 바닥으로 옮겼다. 희석된 용해물을 1 ml 35 % sucrose 넣어서 최종적으로 600 μL 5 % sucrose로 overlaid하였다. 샘플을 4 ℃에서 20시간동안 70,000g에서 Beckman tabletop 원심 분리기에서 초원심분리(ultracentrifuge)하였다. 원심분리 후, 농도 구배를 10,220 μL로 나누었다. 분획 1 내지 3을 모았다 (블롯상의 분획 1을 합친 것). 불연속적인 sucrose 농도에서 지질 래프트과 독특한 단백질의 위치를 결정하기 위해, rail fractions(sucrose 농도의 4와 5, blot의 2와 3)와 non raft fractions의 40μLl는 SDS-polyacrylamide 겔 전기 영동과 면역 블로킹을 수행하였다.
LAG3 분석법의 과발현 및 침묵. LAG3의 존재 또는 부재가 하위 신호 전달 경로의 변경에 인과 관계가 있는지를 결정하기 위해 두 가지 실험적 접근법을 사용했다. 먼저 rs10846744의 위험 C 발현 세포에서 LAG3를 과발현 시켰으며, GFP 태그된 전장(GFP tagged full-length) 인간 LAG3 cDNA를 발현하는 렌티 바이러스 벡터로 이들을 선별 하였다. 두 번째 접근법은 특정 shRNA 벡터를 사용하여 rs10846744 기준 G 발현 세포에서 LAG3 발현을 침묵시키는 것이다.
Lentiviral 형질주입 및 형질도입: pReceiver-Lv122 과발현 벡터에 삽입된 LAG3-GFP, psi-LVRHIMP RNAi silencing 벡터에 삽입된 shRNA-LAG3, 스크램블된 shRNA 및 lentiviral Mock GFP 대조군 벡터를 GeneCopoeia (Rockville, MD)로부터 수득하였다. LAG3에 대한 4개의 shRNA를 가장 효율적인 플라스미드의 선별을 위해 스크리닝하였다. 렌티바이러스는 Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD)를 사용하여 만들었다. 간단히, 각각의 렌티 바이러스 플라스미드 2.5 μL와 EndoFectin Lenti 시약 5.0 μL를 Opti-MEM I에 첨가하여 DNA-EndoFectine 복합체를 형성시켰다. 실온에서 복합체를 배양한 후 20 분 동안, DNA-EndoFectine 복합체를 10% FBS가 함유 된 DMEM에서 HEK 293으로 배양기에 첨가하고 5% CO2에서 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 배지를 5% FBS가 함유된 새로운 DMEM으로 교체하고 배양을 계속 하였다. 바이러스 함유 배양 배지를 형질전환 후 48 시간에 수집하고 여과 후 농축시켰다. 렌티 바이러스로 형질 도입. 1.5 ml의 완전 배지에서 1 x 106 EBV- 형질 전환 된 B 림프구를 12-well plate에 접종하고 바이러스 현탁액 500 ㎕를 첨가 하였다. 세포를 37 ℃에서 72 시간 동안 배양 하였다. 위험 C allele을 갖는 림프구에서 과발현 LAG3 또는 림프구에서 LAG3를 억제하는 효과를 평가하기 위해, 형질전환된 세포를 phorbol esters(500 ng/ml), ionomycin(250 ng/ml), IL-4(100 U/ml) 칵테일로 2시간동안 처리하고, Western blot하여 하위 신호 단백질의 인산화를 평가하였다.
혈장 또는 용해성 림프구 활성화 유전자3 (sLAG3) 분석. sLAG3 ELISA 키트는 RayBiotech, Inc. (Norcross GA)에서 구입했으며 sLAG3는 첫번째 최적레벨 키트에 의해서 측정했다. 143 명의 HALP 피험자로부터 -80 ℃로 저장한 공복 혈장 샘플을 sLAG3 측정을 위해 샘플 당 복제물에 대해 해동하고, 3 배 희석 한 후, 100 μl을 사용 하였다. 표준 곡선을 2 배 희석하고, 혈장 샘플을 정량화하기 위해 표준 곡선에 대해 선형 회귀 분석을 수행하였고, 평균 ± 표준 오차로 나타내었다.
실험예 1_마우스
모든 죽상동맥경화증 연구에서 병변 면적 측정의 예상된 25% 계수 및 병변 면적의 25 % 차이를 감지할 확률이 80 %인 것으로 계산된 파워 계산으로 계산한 그룹당 15마리의 마우스(연구 당 30 마리)를 사용했다. 모든 실험에서, 마우스에게 10주 동안 정의된 고콜레스테롤/고포화 지방식이를 했다. 혈장 지질 프로파일을 표준 색좌 검정 및 HPLC 분획물에서의 콜레스테롤 측정을 통해 측정하였다(LDL-C, HDL-C, 트리글리 세라이드). 대동맥 근부 및 하행 대동맥에서 죽상동맥경화증 병변의 양은 직렬 대동맥 근위부 단면의 병변 면적에 의해 평가된 병변 부피 및 대동맥의 Oil Red O로 염색된 표본의 병변 면적을 포함하는 확립된 방법으로 분석되었다. Necrotic core 크기는 H&E가 염색하지 않은 병변 내 영역으로 측정되었다. 각각의 실험 그룹에 대하여 비장 및 대동맥 림프절의 CD4-, CD8 + 및 CD4 + FoxP3 + T 세포 수를 정량하고 유동 세포 계측법(CD62L, CD44, CD69, Lag-3, PD- 1)에 의한 T 세포의 활성화 표현형을 정량화 하였다.
10주간의 chow vs. 고지방 사료 섭취 후 ldlr 마우스에서 비장 세포를 채취하고 24시간 동안 anti-CD3/anti-CD28로 ex vivo로 자극 한 경우, CD4 + 세포의 48.2 ± 2.8%는 chow 사육 된 마우스의 36.7 ± 3.9 % Lag3 + 세포와 비교하여 Lag3 +이었다 (31 % 증가, n = 8-10, p=0.02). 도면 13은 고지방 사료 공급 후 마우스에서의 CD4 + Lag3 + T 세포 활성화의 그래프이다. 그래프는 고지방 식단이 활성화 된 CD4 + T 세포를 유발한다는 것을 나타낸다.
죽상동맥경화증에 대한 골수 유래 세포(bone marrow derived cells, BMDC)의 영향을 조사하기 위해, 먼저 조사한 10주령의 Ldlr-/-수령 생쥐에 Lag3-/- 또는 Lag3+/+ BMDC를 이식했다. 이러한 이식된 마우스는 4주 동안 평형을 유지 한 다음 고지방/콜레스테롤 식이를 10주 동안 공급하고 희생시킨 후 대동맥 병변 및 면역 매개 변수를 분석 하였다. Lag3-/-골수 수령자의 대동맥 근부 병변 T 세포는 대조군에 비해 유의하게 증가했다 (45.5 ± 8.5 vs. 21.1 ± 3.4 CD4+ cells/mm2, n = 14 및 12, p=0.01, 2배 증가) (도면 14). 또한 대조군에 비해 Lag3-/-골수의 대동맥 림프절에서 활성화 된 (CD62L-CD44 +) CD4 + 및 CD8 + T 세포의 백분율이 유의하게 증가한 것을 발견했다 (41.4 ± 1.0 vs. 28.1 ± 1.5 activated CD4+ cells. n= 14, p<0.0001 ; 12.9 ± 0.7 vs. 8.2 ± 0.5 activated CD8+ cells; n= 14, p<0.001). 이 결과는 고콜레스테롤 혈증의 설정에서 Lag-3 단백질에 대한 항염증, 세포 보호적인 역할을 강력히 보여준다.
Tregs는 pro-atherogenic T 세포 반응을 억제한다(Foks AC. Lichiman AH. Kuiper J. s.l., "Treating Atherosclerosis With Regulatory T Cells". Arterioscler Thromb Vasc Biol, vol. 35, pp. 280-287, 2015). 그러나 이 보호 기능에서 Lag-3의 역할은 알려져 있지 않았다. 예기치 않게 대동맥 림프절의 Tregs 수는 Lag3 환자군의 병변 면적과 양의 상관 관계를 보였으나 (그림 15), 이는 Lag-3 단백질 결핍이 Treg 기능을 저해하지만 팽창은 감소시킨다는 것을 의미한다. 최근 연구에 따르면 FoxP3 + 발현 세포에서 CTLA-4의 선택적 결실이 FoxP3 + Tregs의 확장을 가져 왔지만 이 세포는 억제 활성(exTregs)을 손상시켰다. Tregs의 CTLA-4와 Lag3은 모두 분자를 결합 및 차단하는 역할을 할 수 있기 때문에 effector T 세포 (각각 B7 및 Class II MHC)가 존재할 때, Lag3 결핍 Tregs 또한 결핍 억제 활성을 가질 수 있다.
Lag3가 CD4 + T 세포 반응을 저해하는 메커니즘이 주어지면, Lag3 결핍 마우스가 병변의 염증을 현저히 나타냈다는 것이 관찰되었다. 그것은 Lag3 단백질 결핍의 설정에서 림프절 Tregs의 기능이 부족하지만 기능적으로 결핍된 것이 관찰되었고, 야생형 Tregs에 비해 아테롬성 동맥 경화증을 조절하기 위해 Lag3-deficient Tregs를 이식한 것이 실패했다.
다시 말하면, 이는 염증복합체, 만성 염증성 질환 및 기능 이상 HDL을 평가하기 위한 바이오마커로서 LAG3 발현 프로파일링을 사용하기위해 새로운 전략을 확립 한 후, 상기 질병을 매개하는 맞춤형 치료 요법을 확립했다. 재조합 림프구 활성화 유전자-3의 SCARB1 및/또는 LAG3 변이체 또는 다른 유전적 또는 비유전적 원인에 의해 낮은 혈장/혈청 LAG3 단백질 수준으로 확인된 변이체의 인간 캐리어에서 죽상동맥경화 위험에 대한 항고지질혈증 및/또는 스타틴을 갖는 동반 치료제로서의 용도로 맞춤형 치료 요법으로서 더 많은 유용성을 얻을 수 있습니다.
실험예 2_마우스
마우스에서 LAG3 결핍이 변화된 Treg 기능 및 죽상동맥경화성 쥐 모델에서 증가된 염증 세포와 유의하게 연관되어 있음을 확인한 후 재조합 인간 가용성 단량체 LAG3이 그의 결합 표적 MHC class II 분자를 고도로 발현하는 마우스 B 세포에 결합하는지를 결정하였다. 야생형 마우스의 마우스 비장 세포(약 1 백만 세포)를 96 well plate에 넣었다. 세포를 스핀 다운시키고 Ca2+ / Mg2+를 함유하는 PBS 용액에서 재조합 인간 가용성 단량체 LAG3 용액(0-162㎍단백질/ml)에 재현탁했다.
실험 조건 :
Condition 1, 162 μg/ml (slock solution, 희석 배수 1) ;
Condition 2, 32.4 μg/ml 희석 배수 5;
Condition 3, 3.24 ㎍/ml 희석 배수 50;
Condition 4. 0.32 ㎍/ml 희석 배수 500;
Condition 5, 0 μg / ml
30 분 배양 후, 세포를 스핀 다운시키고, FACS 완충액(0.5 % bovine serum albumin, 0.05 % sodium azide를 함유하는 PBS)으로 1회 세척하고, Fc-block, anti-CD3 PerCP, anti-B220 FITC, LAG3/isotype control를 함유하는 50㎕ 항체 칵테일을 첨가 하였다((anti-human LAG-3 and mouse IgG1 K isotypc control APC). 세포를 실온에서 20 분간 반응시키고 150μL FACS 완충액을 가한 다음 세포를 FACS 완충액으로 다시 한 번 세척 한 다음 최종적으로 FACS 완충액에 재현탁하여 유동 세포 계측법으로 분석했다.
도면 16에 나타낸 바와 같이, 재조합 인간 용해성 단량체 LAG3은 MHC class II 분자를 발현하는 마우스 B 비장 세포에 용량 의존적 방식으로 결합하였다. 도면 17에서, 재조합 인간 용해성 단량체 LAG-3은 용량 의존적 방식으로 마우스 T 세포 (MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않음)와 비교하여 마우스 B 세포 (MHC 클래스 II 분자를 발현 함)에 우선적으로 결합하였다.
도면 18은 무자극 및 자극 후 조건 하에서 임파구에서 LAG3 exon 3 전사체의 상이한 발현을 나타낸다. 본 발명자는 LAG3 유전자의 exon 3이 phorbol ester, ionomycin, 및 IL-4로 자극 된 세포와 비교하여 무자극 상태 또는 정지 상태하에 배양된 인간 B 림프구 사이에서 상이하게 발현된다는 것을 확인했다. Exon 3 전사는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 LAG3 단백질의 도메인 1의 여분의 고리로 번역하는데 필수적이다.
LAG-3 전사 조절
LAG-3 단백질 구조는 연결 펩타이드, 막횡단 및 세포질 도메인과 같은 4 개의 Ig-like eciodomains으로 구성된다. LAG3 단백질 구조는 아미노산 서열상 상동성이 20%에 불과하지만 CD4와 유사합니다. Creg J. Workman. Dario A. A. Vignali, "The CD4-Related Molecule. LAG-3 (CD223), Regulates the Expansion of Activated T Cells. Eur. Jl. of Immunology. 24 March (2003). CD4와 비교하여, LAG3 단백질은 domain I의 일부로 30개의 아미노산으로 구성된 추가 루프(extra loop)를 고유하게 포함한다. 이 추가 루프는 exon 3에 코딩되어 있으며 MHC class II 수용체에 결합하는 것이 이 루프이다(Huard el al., Characterization Of The Major Histocompatiability Complex Class II Binding Site On LAG-3 Protein. Proc Natl Acad Sci U S A., 94(11): 5744-5749 (May 1997)).
도면 18은 휴지상태 세포(basal quiescent cells)에서 exon 3 전사가 감소하고, 세포가 phorbol ester(PMA)/ ionomycia/IL-4를 함유하는 칵테일로 자극되었을 때 증가한다는 것이 증명되었다. 이 새로운 관찰에서, 세포가 활성화되었을 때만 여분의 루프를 전사한다는 것은 의미가 있다. 재조합 인간 LAG3의 실시예는 MHC class II 분자에 결합하는 추가 루프의 RNA 및 단백질 발현을 증가시키기 위해 LAG3 exon 3(LAG3 모방체)의 활성화를 모방하는 제제일 수 있다. LAG3 exon 3 활성화의 모방체는 칼륨, 나트륨, 리튬, 또는 칼슘과 같은 대체 DNA 또는 RNA 구조에 영향을 미치는 세포 내 또는 세포 외 양이온에 영향을 미치는 분자를 포함하여 RNA 전사에 영향을 미치는 대체 DNA 또는 RNA 구조의 형성에 영향을 미치는 분자 및 / 또는 제제를 포함 할 수 있다. LAG3 exon 3 활성화의 모방체는 LAG3 exon 3의 전사를 포함하거나 배제시키는 선택적 스플라이싱(splicing)에 영향을 미치는 분자 및/또는 작용제를 포함 할 수 있다.
상기 설명된 실시예들의 다양한 다른 실시예, 변형예 및 수정예가 상기 기본 개념에 익숙해지면 당업자에게 명백하게 발생할 것이다. 그러므로, 본 발명은 첨부된 청구 범위에서 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시 될 수 있음을 이해해야한다.
산업 상용화 허가
알려진 암 환자에서 백신 보조제로서의 T 세포 카운트를 증가시키는 hLAG3의 사용에도 불구하고, LAG3 결핍 마커를 선별 검사하는 산업적 응용 가능성이 크며, 발견되면, 재조합 인간 LAG3를 다른 시간 지점에서 주기적으로 투여하는 방법으로 환자를 치료함으로써 결과 위험을 개선시킨다. 본 발명자는 심혈관 질환, 다른 만성 염증성 질환, 심혈관 및/또는 비심혈관 질환으로 인한 사망률 및 특정 2점 발현 프로파일(SCARB1 rs10846744 돌연변이 및/또는 LAG-3 rs870849 또는 다른 유전적 또는 비유전적 원인 및 돌연변이와 같은 돌연변이 및/또는 비유전적 원인의 조합)을 이용한 사망률에 대한 재검사와 재조합 인간 림프구를 사용한 맞춤형 치료 요법 활성화 유전자-3을 동반 치료제로 사용한다.

Claims (21)

  1. 인간 성인 대상에서 만성 염증성 및 심혈관 질환을 치료하는 방법으로서,
    LAG3 단백질의 잠재적 결핍을 나타내는 LAG3 결핍 마커를 검출하기 위해 상기 환자의 정성적 예비 스크린을 투여하는 단계;
    상기 개체에 대한 정량적 검사를 투여하여 상기 LAG3 단백질 결핍증을 확인하는 단계;
    적어도 하나의 화학요법제와 보조제로서의 hLAG3-Ig의 조합을 포함하는 치료요법을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 환자의 정성적 예비 스크린을 투여하는 단계는 LAG3 결핍 마커에 대한 의학 기록을 예비 검사하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 환자의 정성적 예비 스크린을 투여하는 단계는 LAG 결핍 마커에 대한 가족력을 사전 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 정량적 검사를 투여하는 단계는 상기 LAG3 단백질 결핍을 확인하기 위해 상기 피험자로부터의 혈액 시료에 양적 반응을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 혈액 시료에 대한 상기 정량적 검사는 분석인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 혈액 시료에 대한 상기 정량적 검사는 유전자 테스트인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 정량적 검사는 LAG3의 저수준 발현의 존재에 대한 상기 대상으로부터의 혈장 샘플의 유전자 검사 및 분석을 포함하는 것인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 정량적 유전자 검사는 SCARB1 또는 LAG3 유전자의 코딩 서열에서의 다형성을 검출하도록 구성되는 것인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 다형성이 SCARB1 rs10846744 또는 LAG3 rs870849 돌연변이인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 혈액 시료에 대한 상기 정량적 검사는 대립 변이체를 동정하기 전에 SCARB1 또는 LAG3 유전자의 적어도 일부를 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  11. 제 5 항에 있어서,
    상기 분석은 3400 pg/ml 이하의 낮은 LAG3을 측정하도록 구성되는 것인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 분석은 ELISA 분석인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 치료요법을 상기 대상에게 투여하는 단계는 주기적인 투여에 의해 재조합 인간 LAG3를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 치료요법을 상기 대상에게 투여하는 상기 단계는 주기적으로 투여하여 재조합 LAG3 모방체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 치료요법을 상기 대상에게 투여하는 상기 단계는 상기 화학요법치료제인 프로부콜(probucol)을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 프로부콜을 투여하는 단계는 3 내지 4 개월의 범위 내에서 주기적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 프로부콜을 투여하는 단계는 상기 환자의 수명의 나머지 동안 주기적으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제 13 항에 있어서,
    상기 주기적인 투여에 의해 재조합 인간 LAG3을 투여하는 단계는 인간 LAG3 단백질을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    상기 조합치료제가 항염증제, HDL-C 기능, 크기를 개선시키는 제제 및/또는 대상에서 기능 장애 HDL-C를 감소시키는 제제, PCSK9 억제제 및 LAG3 모방체 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 제제를 포함하는 것인 방법
  20. 제 1 항에 있어서,
    LDL 산화 및 혈장 HDL 콜레스테롤 및 plasma/serum 사이토카인(cytokine)에 대한 효과를 결정하기 위해 상기 주기적 투여 동안 상기 대상을 모니터링하는 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 모니터링 단계는 포괄적인 프로파일 및 EKG를 갖는 매월 안전 실험을 포함하는 것 인 방법.
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GB201322626D0 (en) * 2013-12-19 2014-02-05 Immutep S A Combined preparations for the treatment of cancer
US10265379B2 (en) * 2015-09-16 2019-04-23 Annabelle Rodriguez Oquendo Use of recombinant lymphocyte activation gene-3 as a companion therapeutic for patients at risk for cardiovascular disease and other chronic inflammatory diseases

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