JP2019534318A - 組換えリンパ球活性化遺伝子−3の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年9月12日に出願された米国特許出願第15/262,618号明細書からの優先権を主張する。
本発明は、疾患検出および疾患、例えば、心血管および免疫疾患のための治療に関し、より具体的には、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)タンパク質欠損についてのリスク評価に基づき、心血管疾患、他の慢性炎症疾患、ならびに心血管および非心血管死亡率についてのリスクがある患者を分類し、コンパニオン治療薬としての組換えリンパ球活性化遺伝子−3を使用してリスクを仲介する方法に関する。
SR−BI遺伝子、SCARB1(第12染色体:q24.31上に位置)内のrs10846744単一ヌクレオチド多型(SNP)が、無症候性アテローム性動脈硬化症およびCVDと有意に関連することが示されている。発行された米国特許第9,334,538号明細書において、本発明者は、女性をゲノタイピングしてSCARB1遺伝子(第12染色体:q24.31上に位置)のrs10846744突然変異の存在を同定する方法を開示した。これは、アテローム性動脈硬化症の多民族的研究(MESA)の参加者における無症候性アテローム性動脈硬化症(SCA)およびインシデント心血管疾患(incident cardiovascular disease)(CVD)と有意に関連した。特に、リスクCアレルのキャリアは、インシデントCVDについての有意に増加したオッズを有し、多変量回帰モデルにおいて、この関係は慣習的なCVDリスク因子、例えば、年齢、ボディーマスインデックス、高血圧、喫煙、腎疾患、スタチン使用または脂質レベル(総コレステロールか、LDL−コレステロール[LDL−C]か、HDL−Cか、トリグリセリドかを問わない)の包含により減衰されなかった。これらの知見は、他の因子または経路がこの遺伝子バリアントとインシデントCVDとの関連における原因であり得ることを強力に示唆した。
興味深いことに、rs10846744はSCARB1の第1イントロン内に存在し、バイオインフォマティック分析は、このSNPが調節領域内に存在することを明らかにした。データは、このSNPが同一染色体(染色体内)上で、または染色体間で遺伝子を転写的に調節し得ることを示唆した。本発明者はこの可能性を調査し、多数の転写調節される遺伝子候補が出現した。特にその1つ、リンパ球活性化遺伝子−3(LAG−3)も第12染色体上に位置し、それをさらに調査した。LAG3は、Tリンパ球活性化における重要な調節因子である[Lymphocyte−activation gene 3/major histocompatibility complex class II interaction modulates the antigenic response of CD4+T lymphocytes.Huard B,Tournier M,Hercend T,Triebel F,Faure F.s.l.:Eur J Immunol,1994,Vol.24,pp.3216−3221]。LAG3はIgスーパーファミリーに属し、抗原提示細胞のMHCクラスII分子に対するリガンドである[LAG−3:a regulator of T−cell and DC responses and its use in therapeutic vaccination.F.,Triebel.s.l.:TRENDS Immunol,2003,Vol.24,pp.619−622]。これは、B細胞、T細胞、およびNKリンパ球、単球、および樹状細胞(DC)中で発現され、その主要機能は、エフェクターT細胞拡大およびホメオスタシスを制御することによる活性化T細胞の負の調節因子であると考えられる[LAG−3 regulates plasmacytoid dendritic cell homeostasis.Workman CJ,Wang Y,El Kasmi KC,Pardoll DM,Murray PJ,Drake CG,Vignali DA.s.l.:J Immunol,2009,Vol.182,pp.1885−1891;The CD4−related molecule,LAG−3(CD223),regulates the expansion of activated T cells.Workman CJ,Vignali DA.s.l.:Eur J Immunol,2003,Vol.33,pp.970−979]。細胞表面LAG3は、ADAM10およびADAM17メタロプロテアーゼによる開裂に供され、それが可溶性LAG3(sLAG3)をもたらす[Metalloproteases regulate T−cell proliferation and effector function via LAG−3.Li N,Wang Y,Forbes K,Vignali KM,Heale BS,Saftiq P,Hartmann D,Black RA,Rossi JJ,Blobel CP,Dempsey PJ,Workman CJ,Vignali DA.s.l.:EMBO,2007,Vol.26,pp.494−504]。
インビトロおよびエクスビボアプローチは、高アルファリポタンパク質血症(HALP)対象から単離された生物検体中のrs10846744とLAG3との関連を試験するために採用される。rs10846744は、LAG3、および細胞内インフラマソームのマーカー、例えば、NLRP3の発現および機能の変更と有意に関連することが見出された。
LAG3は第12染色体(chr12:p13)上のCD4遺伝子座の近傍に位置する一方、rs10846744はchr12:q24.32上に位置する。LAG3は、CD4に対して競合するものでない場合、抗原提示細胞上のMHCクラスIIに結合することにより類似の機能を有する[Sierro S,Romero P,Speiser DE.The CD4−like molecule LAG−3,biology and therapeutic applications,Expert Opin Ther Targets 2011;15:91−101.]。
Golden et al.,Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,34:A359(2014)は、SCARB1rs10846744リスク(CC)アレルのヒトホモ接合性キャリアが、有意に低い血漿LAG3タンパク質レベルを有したことを示している。インビトロ試験は、リスク(CC)リンパ球が基準(GG)リンパ球と比較して多くの炎症促進サイトカイン(TNFα)を分泌し、少ない抗炎症サイトカイン(IL−10)を分泌することを明らかにした。結果的に、リスク(CC)アレルのこれらの同一キャリアは、CVDイベントリスクについての公知の代用物の増加した頸動脈内膜中膜厚度(cIMT)を有することが示された。
インビトロおよびインビボネズミ試験は、sLAG3が、MHCクラスIIシグナリング経路を調節してT細胞活性化およびホメオスタシスを制限することを示唆している一方、いくつかの臨床試験は、sLAG3と結核耐性[Lienhardt et al,Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo,G.s.l.:Eur J Immunol,2002,Vol.32,pp.1605−1613]および乳癌予後[Triebel et al.,A soluble lymphocyte activation gene−2(sLag−3)protein as a prognostic factor in human breast cancer expressing estrogen or progesterone receptors.M−F.s.l.:Cancer Letters,2006,Vol.235,pp.147−153]との関連を示している。ネズミ細胞において、Kisielowらは、活性化T細胞がB細胞上のLAG3発現を誘導することを報告した[Kisielow M,Kisielow J,Capoferri−Sollami g,Karjalainen K.Expression of lymphocyte activation gene 3(LAG−3)on B cells is induced by T cells.Eur J Immunol 2005;35:2081−2088.]。Kisielowらは、B細胞上のLAG3誘導がT細胞依存的であり、他の刺激、例えば、非メチル化CpGモチーフ1826、細菌LPS、または抗Ig抗体の、抗CD40およびIL−4との組合せに依存的でないことを決定した。対照的に、LAG3RNAおよびタンパク質はEBV形質転換B細胞中で検出され、リスクCアレルを発現する細胞と比較して、基準SCARB1rs10846744Gアレルを発現するEBV形質転換細胞中では発現が有意に高かった。Bリンパ球のEBV形質転換は細胞を活性化させ得るが、rs10846744ゲノタイプ層別化に基づくLAG3発現のレベルの有意差が存在した。重要なことに、他者らはB細胞、例えば、Ramos細胞中のLAG3発現の欠落を観察した[Baixeras E,Huard B,Miossec C,Jitsukawa S,Martin M,Hercend T,Auffray C,Triebel F,Piatier−Tonneau D.,Characterization of the lymphocyte activation gene 3−encoded protein.A new ligand for human leukocyte antigen class II antigens.J Exp Med 1992;176:327−337.]。しかしながら、本発明者はそれらの細胞をゲノタイピングし、それらがrs10846744バリアントについてヘテロ接合性であることを見出した。より最近では、Moralesらは、ホジキンリンパ腫におけるEBV陽性がLAG3の増加した遺伝子発現と有意に関連することを示した[Morales O,Mrizak D,Francois V,Mustapha R,Miroux C,Depil S,Decouvelaere AV,Lionne−Huyghe P,Auriault C,de Launoit Y,Pancre V,Delhem N.Epstein−Barr virus infection induces an increase of T regulatory type 1 cells in Hodgkin lymphoma patients.Br J Haematol 2014 July 9.Epub ahead of print]。
ネズミモデルを用いた試験は、アテローム性動脈硬化症病変サイズおよび炎症がT細胞活性化の阻害剤、例として、PD−1/PD−L1およびPD−L2経路ならびに制御性T細胞が欠損する場合に増加することを示している[Adaptive immunity in atherogenesis:new insights and therapeutic approaches.Lichtman AH,Binder CJ,Tsimikas S,Witztum JL.s.l.:J Clin Invest,2013,Vol.123,pp.27−36]。
Baixerasら、前掲は、多数の細胞系におけるLAG3の細胞分布を特徴付けし、LAG3が脂質ラフト内に存在することを実証した。続いて、WooらはLAG3の細胞内分布を報告し、LAG3が細胞内コンパートメントおよび細胞膜間で等しく分布することを見出した[Woo S−R,Li N,Bruno TC,Forbes K,Brown S,Workman C,Drake CG,Vignali DAA.Differential subcellular localization of the regulatory T−cell protein LAG−3 and the coreceptor CD4.Eur J Immunol 2010;40:1768−1777]。
フローサイトメトリーを使用することにより、本発明者は、刺激条件にかかわらず低レベルのLAG3がrs10846744リスクC発現細胞の表面上で検出されることを確認した。しかしながら、LAG3は非刺激rs10846744基準G細胞において細胞表面上で発現され、そのレベルは刺激後に有意に増加した。EBV形質転換B細胞におけるこれらの結果は、Wooら、前掲により報告されたものとは、WooらがLAG3が活性化T細胞の表面上でのみ発現されることを報告したという点で対照的である。
脂質ラフトシグナリングは、B細胞活性化に必須であることも公知である[Simons K,Toomre D.Lipid rafts and signal transduction.[Nat Rev Mol Cell Biol 2000;1:31−39]。具体的には、B細胞受容体(BCR)の刺激は、CD79AおよびCD79B(Ig−アルファ/Ig−ベータヘテロ二量体と会合する膜貫通免疫グロブリン(Ig)受容体)の細胞質テール中で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)のリン酸化を開始させる[Schamel WW,Reth M.Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.Immunity.2000;13:5−14]。ITAMのリン酸化はSykについてのドッキング部位として機能し、それは様々なSrcファミリーキナーゼ(SFK)、例として、Fyn、Blk、およびLynにより媒介される[Takata M,Sabe H,Hata A,Inazu T,Homma Y,Nukada T,Yamamura H,Kurosaki T.Tyrosine kinases Lyn and Syk regulate B cell receptor−coupled Ca2+mobilization through distinct pathways.EMBO J.1994;13:1341−9.]。Lynは、B細胞活性化時に脂質ラフトシグナリングに関与する主要なタンパク質である[Simons、前掲]。この活性化は、種々の細胞内シグナリング分子から構成される「シグナロソーム」の協調的集合を開始させ、それとしては、Btk、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K)およびPLCγ2が挙げられる[Blix ES,Irish JM,Husebekk A,Delabie J,Forfang L,Tierens AM,Myklebust JH,Kolstad A.Phospho−specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B−cell lymphoma.BMC Cancer 2012;12:478.]。PLCγ2は、ヒトBリンパ球中で発現される主なアイソフォームである[Coggeshall KM,McHugh JC,Altman A.Predominant expression and activation−induced tyrosine phosphorylation of phospholipase C−gamma 2 in B lymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA.1992;89:5660−4.]。これは、BCR媒介ホスホイノシトール加水分解および後続の生化学的イベント、例として、PKC活性化にも必要不可欠である[Sugawara H,Kurosaki M,Takata M,Kurosaki T.Genetic evidence for involvement of type 1,type 2 and type 3 inositol 1,4,5−trisphosphate receptors in signal transduction through the B−cell antigen receptor.EMBO J.1997;16:3078−88]。
MHCクラスIIはLAG3に対する主なリガンドであり、LAG3はMHCクラスIIに、それがT細胞の細胞増殖、活性化、およびホメオスタシスを負に調節する場合に高い親和性で結合し、Treg抑制機能における役割を担うことが報告されている。対照的に、樹状細胞のサブセット上の脂質ラフトミクロドメイン中のMHCクラスIIを介するシグナリングは、それが可溶性LAG3(sLAG3)により結合された後、樹状細胞活性化をもたらす。本発明者は、目下、リンパ球中の細胞LAG3がホスホシグナリングカスケードの調節の原因であることを発見した。このことは、その従来の公知のMHCクラスII受容体への結合機能とは無関係のLAG3の区別される新規な機能である。
しかしながら、HDL粒子と会合する主要なアポリポタンパク質、apoA−Iは、Tリンパ球による単球の活性化を阻害することにより炎症サイトカイン産生を阻害することが示されている[Hyka N,Dayer J−M,Modoux C,Kohno T,Edwards III CK,Roux−Lombard P,Burger D.Apolipoprotein A−I inhibits the production of interleukin−1β and tumor necrosis factor−α by blocking contact−mediated activation of monocytes by T lymphocytes.Blood 2001;97:2381−2389]。具体的には、Hykaらは、apoA−Iが最初に表面因子に結合することにより、刺激単球からのサイトカイン産生を阻害することを観察し、それは、apoA−Iが表面LAG3と相互作用し得る可能性を示唆する。
SCARB1バリアント、rs10846744と冠動脈性心疾患(CHD)との有意な関連は、Manichaikulら(Arterioscler Thromb Vasc Biol 2012;32:1991−1999)に示された。しかしながら、従来の分析は、rs10846744がSCAおよびインシデントCVDと直接関連することを示していない。これは、本発明者が見出したとおり、LAG3が、rs10846744とアテローム性動脈硬化疾患およびCVDとの関連を媒介する重要な免疫調節因子であるためである。エフェクターおよび制御性T細胞上でのLAG3タンパク質発現はT細胞受容体(TCR)媒介活性化を、MHCクラスIIとのTCR相互作用を遮断することにより阻害し得、形質細胞様DC上のLAG3タンパク質は、他の機序によりエフェクターT細胞を間接的に抑制し得る。LAG3タンパク質欠損は、DCおよびマクロファージによる向上したインフラマソーム媒介IL−1βおよびIL−18産生(特殊化サイトカイン潜在性を有する炎症表現型にT細胞分化を歪曲する2つのサイトカイン)をもたらし得る[The interleukin−1 family:back to the future.Garlanda C,Dinarello CA,Mantovani A.s.l.:Immunity,2013,Vol.39,pp.1003−1018]。
したがって、マウス(Lag3)およびヒト(LAG3)におけるLAG3タンパク質欠損は、高コレステロール血症に対するアテローム生成促進T細胞応答を向上させ、増加したプラーク炎症および/または増加したプラーク発生をもたらすことが予測される。
遺伝子変異に起因するLAG−3タンパク質の欠損がヒトにおいて存在することならびにそれがアテローム性動脈硬化症、他の慢性炎症疾患、心血管および/または非心血管死亡率と有意に関連することは明らかではない。LAG3がCVDおよび他の慢性炎症疾患において担う媒介因子の役割に基づき、本発明は、あるSCARB1およびLAG−3遺伝子変異ならびに臨床的に有意なアテローム性動脈硬化症、他の慢性炎症疾患、慢性炎症疾患、機能不全HDL、心血管および/または非心血管罹患率および死亡率についてのリスクを増加させる他の遺伝子および非遺伝子的因子に基づきCVDリスクがある患者を評価するためのバイオマーカーとしてのLAG3発現プロファイリングを使用し、新規組換えLAG3コンパニオン治療薬により前記リスクを改善する方法を開示する。
IMP321(LAG3のヒト二量体可溶性形態)の治療活性は、前臨床および臨床試験において周知である。アジュバントとしてのhLAG3−−Igと化学療法剤の組合せはそれ自体でのいずれかの治療よりも優れていることが示されている。
さらに、LAG3遮断は、他の阻害受容体、例えば、PD−1の遮断と組み合わせ、向上したT細胞活性および疾患からの保護をもたらすことができる。さらに、可溶性組換え二量体LAG3タンパク質の治療活性は、いくつかの点で公知である。[Sierro et al.,“The CD4−like molecule LAG−3,biology and therapeutic applications”,Section 3]。ヒトにおいて、組換えLAG3はDC活性化を誘導し、免疫アジュバント活性を提供する(LAG−3の膜結合形態の阻害活性とは対照的である)。Andreae et al.,“Maturation and activation of dendritic cells induced by lymphocyte activation gene−3(CD223)”,J Immunol,168:3874−80(2002)。
2002年6月25日に発行されたTriebel(Institut Gustave−Roussy)の米国特許第6,410,509号明細書は、ワクチン接種のための、および癌治療におけるアジュバントとしてのhLAG3の使用を示しており、可溶性hLAG3の全身投与はインビボ腫瘍成長の阻害を直接誘導する(実施例IV参照)。同様に、2011年1月13日に公開されたTriebel(Immutep)の米国特許出願第20110008331号明細書は、単球媒介免疫応答をブーストするため、特に、血中の単球数の増加を誘発させるための、組換えLAG3の定期的使用を示している。この出願は、ヒトLAG3またはその誘導体が、極めて悪性の腫瘍を有する患者中に接種された場合、単球依存的である強力な免疫を誘導したという「完全に予想外の」発見を記載している。誘導される免疫は、血液単球数の有意な増加によりそれ自体顕在化する。既知癌患者におけるT細胞数をブーストするためのワクチンアジュバントとしてのhLAG3の使用にもかかわらず、LAG3欠損マーカーを確定的にスクリーニングすること、およびそれが見出された場合、組換えヒトLAG3により異なる時点の定期投与により予測患者を治療することにより結果として生じるリスクを改善することが依然として動機付けられていない。本発明者は、特異的2点発現プロファイル(突然変異および/または非遺伝子的原因、例えば、SCARB1rs10846744突然変異および/もしくはLAG−3rs870849または他の遺伝的もしくは非遺伝子的原因および突然変異の組合せ)を使用して心血管疾患、他の慢性炎症疾患、心血管および/または非心血管罹患率および死亡率についてのリスクがある患者をプレスクリーニングし、次いでコンパニオン治療薬としての組換えヒトリンパ球活性化遺伝子−3を使用するテーラード治療レジメンを施与することにより、これを行う。
本発明の他の課題、特徴、および利点は、好ましい実施形態およびそのある改変の以下の詳細な説明からより明らかになる。
本発明の他の課題、特徴、および利点は、添付の図面と一緒に解釈される場合、好ましい実施形態およびそのある改変の以下の詳細な説明からより明らかになる。
本明細書において使用される単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈がそうでないことを明記しない限り、複数の言及対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、1つ以上のタンパク質への言及であり、当業者に公知のその均等物を含む。「rs」表記によるSNPへの任意のおよび全ての言及、例えば、rs10846744は、本明細書において、公知の方法により容易に検索可能な関連ヌクレオチド配列を取り込む。具体的には、rs10846744についてのヌクレオチド配列は、例えば、NCBIのdbSNP Entrezデータベースから検索可能である。SCARB1はHDL受容体遺伝子、スカベンジャー受容体クラスB1型(SCARB1)を指し、LAG3は免疫チェックポイント阻害剤、リンパ球活性化遺伝子−3(LAG−3)を意味する。用語「アジュバント」は、本明細書において、抗原に対する身体の免疫応答を向上させる物質と定義される。
発見データ
LAG3は、SCARB1rs10846744バリアントにより、ならびにLAG3SNPおよび細胞代謝変化により転写的に制御される。具体的には、SCARB1および/またはLAG3遺伝子のコード配列中で生じる多型を、病変、例えば、感染、炎症、慢性炎症疾患、冠動脈疾患、心血管および/または非心血管罹患率および死亡率の診断予測因子として使用することができる。本発明者は、RNAシーケンシングを使用して免疫モジュレーターLAG3が、SCARB1イントロン性バリアントrs10846744と、無症候性アテローム性動脈硬化症およびインシデントCVDとの関連を結び付ける因果経路における主要な役割を担うことを同定した。検証実験は、SCARB1rs10846744とLAG3との有意な関連を裏付けた。実験は、rs10846744基準G細胞と比較してrs10846744リスクC発現細胞からの培養培地中で有意に低いレベルのsLAG3を観察した。したがって、この異なる方法はLAG3タンパク質がrs10846744リスクC細胞中であまり発現されないことを裏付けた。次いで、本発明者は、LAG3の欠落がある場合、EBV形質転換B細胞における下流シグナリング経路に対してどのような効果を有し得るのかを試験した。結果は、rs10846744リスクCおよびrs10846744基準G発現細胞間で脂質ラフトシグナリングの有意差を明確に示した。rs10846744Cリスクアレル中のCD79Aのリン酸化の不存在は、膜に対するLAG3の損傷が、近位および下流シグナリングを開始させる受容体間の相互作用を因果的に阻害することを示し、B細胞活性化におけるLAG3の重要な役割をさらに示す。重要なことに、LAG3の過剰発現またはサイレンシングは下流シグナリングにおけるLAG−3の因果的役割を裏付け、これは本発明者により同定された新たな観察である。EBV形質転換B細胞からのLAG3のRNAシーケンシングおよびインビトロ試験に由来するデータと、表面LAG3が開裂されてsLAG3を生成するという知識とを組み合わせることにより、本発明者は、血漿sLAG3レベルがrs10846744バリアントのキャリア間で有意に異なるか否かを探索した。
図1は、SCARB1rs10846744と有意に関連する血漿sLAG3レベルのグラフであり、rs10846744基準GGとrs10846744リスクCCアレルのHALPキャリア間の血漿sLAG3レベルの有意差を示す。アテローム性動脈硬化症の分野において、HDLリポタンパク質および/またはサブフラクションとLAG3またはsLAG3との関連はこれまで存在しなかった。
血漿apoA−Iとrs10846744またはsLAG−3との関連は観察されなかったが、それらの変数と小型HDL粒子との有意な関連が見出された。
図2は、NMR分光法によりsLAG3が小型HDL粒子と有意に関連したことを示す。sLAG3レベルは、HALP対象からの空腹時血漿試料において小型HDL粒子と反比例して関連した。このデータは、rs10846744についてのキャリア状態により層別化されなかった(P=0.01、r=0.27、n=81)。さらに、小型高密度HDL粒子はapoA−Iが濃縮しており、コレステロール不足であり、多数の大型臨床試験においてCHDについての増加したリスクと正に関連した。細胞LAG3発現および機能は、rs10846744リスクCアレルのキャリアから単離された細胞において有意に低減した。より重要なことに、循環sLAG3レベルは、HALPにおいて計測されたキャリアと同一のキャリアにおいて有意に低かった。まとめると、LAG3は重要な免疫調節因子であり、rs10846744バリアントにより、ならびにLAG3rs870849および非遺伝子的原因により転写的に制御されることが同定された。
診断方法
一般に、本方法は、対象がアテローム性動脈硬化症、慢性炎症疾患、インシデント心血管疾患(ICD)、心血管および/または非心血管罹患率および死亡率、ならびに炎症応答により特徴付けされる他の病変を有するか否かまたは罹患しやすいか否かに関する、それらの症候的発現による、または非遺伝子的原因に基づく定性的プレスクリーニングから開始する二又式診断を必要とする。定性的指標を考慮して、診断は、血液試料に基づく定量的調査を続ける。試料は、アッセイにより、または遺伝子試験により分析することができる。より具体的には、LAG3タンパク質欠損は、ELISAアッセイまたは当業者により決定される他のタンパク質アッセイを使用する血漿、血清、または他の生物体液計測値により決定することができる。あるいは、LAG3タンパク質欠損は、SCARB1突然変異、例えば、rs10846744またはLAG3rs870849、LAG3タンパク質の発現および機能に悪影響を与える他のSNP/挿入/欠失、または非遺伝子的原因の計測により決定することができる。SR−B1遺伝子の1つ以上の多型領域の特異的アレルバリアントの存在を決定するために対象からの生物試料の遺伝子スクリーニングが必要とされ、それを実施して潜在SCARB1突然変異rs10846744の存在を決定する。SR−B1(SCARB1)はHDLコレステロールについての主な受容体であり、リバースコレステロール輸送(肝臓を介する最終的な廃棄を伴う細胞からの除去)における重要な役割を担う。SR−B1は、肝臓およびステロイド生成組織、例えば、卵巣中で高度に発現される。SR−B1は、ステロイド産生のためのコレステロール蓄積の維持において重要であると考えられる。1)非遺伝子的原因と2)アッセイ/突然変異のマーカーの組合せを含む発現プロファイルを考慮して、陽性のプレスクリーニング指標の後に、コンパニオン治療薬としての組換えリンパ球活性化遺伝子−3を使用するテーラード治療レジメン(下記)が続く。
図3は本診断方法の例示的な実施形態のブロック図であり、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症疾患、インシデント心血管疾患(ICD)、心血管および/もしくは非心血管罹患率および死亡率、スタチンまたは他のコレステロール降下薬の服用を伴う心発作の経験、または炎症応答により特徴付けされる任意の他の病変、インフラマソームの異常な発現および/または機能不全HDLの症状および/または非遺伝子的原因の素因についての対象の初回プレスクリーニング/定性的診断を有するステップ10を起点とする。
初回の陽性のプレスクリーニングを考慮して、ステップ20において、リンパ球活性化遺伝子−3(LAG−3)の低レベル発現の存在について対象からの血漿または血清試料のベースラインタンパク質アッセイおよび/または遺伝子スクリーニングを実施する。LAG3発現を計測し、低LAG3についてのベースライン閾値と比較し、それは≦3400pg/mlの血漿レベルであるべきである。このLAG3発現プロファイリングは、インフラマソーム、慢性炎症疾患および機能不全HDLのさらなる評価についての陽性バイオマーカーを提供する。LAG3欠損に起因する炎症促進状態は、慢性炎症と関連する疾患、例として、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、加齢黄斑変性、およびアルツハイマー病についての新規なタンパク質バイオマーカーを提供する。ネズミおよびヒトリンパ球活性化遺伝子−3アッセイは、市販のネズミLag3およびヒトLAG3ELISAキットにより実施することができる。
ステップ50において、SCARB1rs10846744またはLAG3rs870849突然変異の疑われる存在の二重陽性指標を考慮して、患者の潜在SCARB1rs10846744またはLAG3rs870849突然変異を遺伝子診断により確定する。SCARB1rs10846744またはLAG3rs870849突然変異の存在は、種々の公知の方法、例として、ゲノタイピングにより確認することができる。ゲノタイピングは、標準的な血液試験のDNAシーケンシングによる直接的な突然変異分析により実施することができる。ゲノムDNAは、精製された全血試料から調製して血液試料からDNAを単離する。DNAの純度および品質は、分光法により確認することができる。DNAをプレートに添加し、オリゴ−ライゲーションアッセイ(例えば、SNPlex(登録商標)は、Applied Biosystems of Foster City,CA,USAにより販売されているSNPゲノタイピング用の好適なプラットフォームである)により製造業者の指針に従ってゲノタイピングする。オリゴ−ライゲーションアッセイは、SCARB1rs10846744突然変異またはLAG3rs870849突然変異の存在を示すための蛍光色素標識プローブを使用する。SR−BI遺伝子の1つ以上の多型領域の特異的アレルバリアントの存在のスクリーニングにおける有用な他の方法としては、例えば、DNAシーケンシング、ハイブリダイゼーション技術、PCRベースアッセイ、蛍光色素および消光剤ベースPCRアッセイ(Taqman PCR検出システム)、RFLPベース技術、一本鎖立体構造多型(SSCP)、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)、化学的ミスマッチ開裂(CMC)、ヘテロ二本鎖分析ベース系、質量分析をベースとする技術、侵入開裂アッセイ、多型比シーケンシング(PRS)、マイクロアレイ、ローリングサークル伸長アッセイ、HPLCベース技術、DHPLCベース技術、オリゴヌクレオチド伸長アッセイ(OLA)、伸長ベースアッセイARMS(増幅不応性突然変異システム(Amplification Refractory Mutation System))、ALEX(増幅不応性突然変異線形伸長(Amplification Refractory Mutation Linear Extension))、SBCE(一塩基鎖伸長)、モレキュラービーコンアッセイ、インベーダー(Third wave technologies)、リガーゼ連鎖反応アッセイ、ヌクレアーゼアッセイベース技術、ハイブリダイゼーションキャピラリーアレイ電気泳動(CAE)、パイロシーケンシング、タンパク質トランケーションアッセイ(PTT)、免疫アッセイ、ハプロタイプ分析、および固相ハイブリダイゼーション(ドットプロット、リバースドットプロット、チップ)などが挙げられる。スクリーニング方法の1つのタイプは、多型部位と重複し、多型領域周囲に約5、10、20、25、または30ヌクレオチドを有するプローブを使用するアレル特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の一実施形態において、アレルバリアントに特異的にハイブリダイズし得るいくつかのプローブを、固相担体、例えば、「チップ」に付着させる。オリゴヌクレオチドは、種々のプロセス、例として、リソグラフィーにより固体担体に結合させることができる。実際、チップは、最大250,000個のオリゴヌクレオチドを保持し得る(GeneChip(登録商標)、Affymetrix(登録商標))。
一実施形態において、チップは、SCARB1および/またはLAG3遺伝子の少なくとも1つの多型領域の全てのアレルバリアントを含む。次いで、固相担体を試験核酸と接触させ、特異的プローブへのハイブリダイゼーションを検出する。したがって、1つ以上の遺伝子の多数のアレルバリアントのアイデンティティーを簡易なハイブリダイゼーション実験において同定することができる。
一部のスクリーニング方法において、SCARB1またはLAG3遺伝子の少なくとも一部を最初に増幅させてからアレルバリアントを同定することが必要である。増幅は、例えば、PCRにより、当業者に公知の方法に従って実施することができる。一実施形態において、細胞のゲノムDNAを2つのPCRプライマーおよび要求量の増幅DNAを産生するために十分な多数のサイクルのための増幅に曝露する。SNPは不変配列の領域によりフランキングされている変異の部位を構成するため、それらの分析は変異の部位に存在する単一ヌクレオチドのアイデンティティーの決定のみを要求し、それぞれの患者についての完全な遺伝子配列を決定することが不要である。このような単一ヌクレオチド多型の分析を容易にするいくつかの方法が開発されている。本明細書に記載の方法は、例えば、対象が特異的SCARB1および/またはLAG3アレルバリアントと関連する疾患を有するか否かまたはそれを発症する増加したリスクがあるか否かを決定するために簡便に使用することができる本明細書に記載の少なくとも1つのプローブまたはプライマー核酸を含むプレパッケージング診断キット、例えば、上記のものを利用することにより実施することができる。本発明の方法は、対象のSR−BI遺伝子中のアレルバリアントまたはSNPの存在を同定する方法を含め、当分野において周知の方法を使用して他の情報またはパラメータと組み合わせてLAG3タンパク質欠損の対象の同定を支援することができる。
確認を考慮して、ステップ90において、本方法は、コレステロール医薬プロブコールの治療有効レジメンを、ステップ95における組換えLAG3のレジメンとの組合せで同時に開始する。組換えLAG3は、下記の全長もしくは可溶性トランケート形態のいずれかである組換えヒトLAG3またはLAG模倣体である。コンパニオン治療薬として、LAG3またはLAG3模倣体は、コレステロール医薬との相乗的に機能してLAG3タンパク質の欠損が見出された患者を治療する。LAG3模倣体は、LAG3機能を模倣する任意の好適な薬剤、例として、小分子薬剤、マイクロRNA、オリゴヌクレオチド、生物剤、活性化抗体、DNAもしくはRNA構造もしくはフレキシビリティーに影響を与える薬剤、またはLAG3転写調節に影響を与える薬剤、例として、細胞内カチオン、例えば、カリウム、ナトリウム、リチウム、およびカルシウムを調節する薬剤であり得る。特異的天然存在ヒトLAG3配列からのLAG3配列を含む発現ベクターを構築することにより特異的天然存在ヒトLAG3タンパク質の特性を模倣する組換えタンパク質を発現させることにより、リンパ球活性化遺伝子−3(LAG3)の機能を複製することが可能である。本詳細な説明の目的のため、用語「LAG3模倣体」は、それらの合成LAG3タンパク質ならびにLAG3ホスホシグナリング効果を模倣する任意の他の公知の分子または薬剤、MHCクラスII分子に結合し、または結合しないCD4+T細胞、CD8+T細胞、単球、B細胞およびNK細胞におけるLAG3の役割を模倣する薬剤、ならびに細胞膜の脂質ラフトにおけるLAG3の役割を模倣する薬剤を含む。プロブコール治療の例示的レジメンは、3〜4ヵ月間の低用量治療(250mg/日)を含み得、いっそうさらに好ましくは、1〜2ヵ月間の前記治療を含む。LAG3診断試験との組合せで使用される治療方針としては、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、心血管疾患、2型糖尿病、加齢黄斑変性およびアルツハイマー病に関する技術水準の治療法が挙げられる。例えば、本方法は、ステップ30においてコレステロール医薬プロブコールの治療有効レジメンを開始する。プロブコール治療の例示的なレジメンは、3〜4ヵ月間の低用量治療(250mg/日)を含み得、いっそうさらに好ましくは、1〜2ヵ月間の前記治療を含む。
組換えLAG3は、ネズミLag3もしくはヒトLAG3タンパク質であり得、または全長インタクト521アミノ酸タンパク質として、もしくは血漿、血清、もしくは他の生物体液中で計測されるトランケート可溶性形態として化学合成されたLAG3模倣体であり得る。化学合成は、正常タンパク質の発現および機能に実質的に影響を与える挿入も、欠失も、未成熟終止コドンも、ミスセンス突然変異も導入されないように実施しなければならない。受託番号および配列表を図4に示す。LAG3コンパニオン治療薬またはLAG3模倣体は、外部ポンプ、植込み型ポンプ(すなわち、腹腔インスリンポンプ)を介する静脈内注入、SQ注射、SQ注入、筋肉内、吸入、鼻腔内、脳室内、坐剤(膣および/または直腸)、局所クリーム剤、局所ゲル剤、局所パッチ剤、脊髄、舌下、経口、胃洗浄、肺洗浄により投与することができる。送達は、純粋形態であり得、または添加剤、例として、Ig、アルブミン、グリコシル化、ペグ化などを伴う。
最後に、ステップ100において、モニタリングは、LDL酸化に対する、ならびに血漿HDLコレステロールおよび血漿/血清サイトカインに対する効果を決定するための包括的プロファイルを用いる月1回の安全性検査およびEKGを含む。当業者は、他の好適な治療方針、例として、限定されるものではないが、他の任意のコレステロールおよびトリグリセリド修正薬、黄体およびエストロゲンおよびエストロゲン様医薬、ならびにHDLコレステロールレベルを降下させるためのプロブコールと類似し、酸化防止剤としての医薬を用いてそれらの遺伝子または非遺伝子スクリーニングされた個体を治療することができることを容易に理解する。他の治療剤を用いる、または用いない組換えヒトLAG3による治療は、生涯治療であることが予測される。
さらなる説明を用いずとも、当業者は、上記詳細な説明を使用して本発明を最大程度に利用することができることが考えられる。これを確保するため、以下に実施例を挙げる。
材料および方法:
≧60mg/dlの空腹時血漿HDL−Cレベル(HALP)を有する年齢18〜80歳の地域在住成人を臨床試験に登録した。集団は中高年であり、主に白人女性であった。登録時点において、試験対象は処方されるか処方されないかにかかわらずコレステロール降下薬により治療されていなかった。対象は、脂質プロファイルの分析、SCARB1ゲノタイピングのためのDNA分析、および軟膜からのリンパ球単離のための一晩空腹時血液試料を提供することに同意した。カテゴリ型共変量の多重比較に一元配置分散分析を使用し、2つの試料分析にスチューデントのt検定を使用した。連続型変数としての時間の効果を評価するため、依存因子としての時間を用いて二次多項式回帰を実施した。≦0.05の確率値を統計的に有意とみなした。ホモ接合性rs10846744バリアントの頻度は、アテローム性動脈硬化症の多民族試験に既に記載されている割合と類似した。トランスクリプトーム分析は、LAG3の示差的発現を明らかにした。rs10846744は、ENCODEデータベース[http://genome.ucsc.edu/]のバイオインフォマティックスクリーンにより示されるとおり、SCARB1の調節領域内に存在するため、本発明者は、基底(非刺激)条件下で培養されたrs10846744基準GGおよびリスクCCアレル発現B細胞間に転写差が存在するか否かを最初に試験した。rs10846744は第12染色体の長腕上に存在するため、本発明者らは、同様に第12染色体上(シス)に存在する標的の転写差について試験した。rs10846744基準GG細胞と比較してrs10846744リスクCC細胞において、5つの遺伝子転写物が有意に下方調節され、3つの遺伝子転写物が上方調節された。第12染色体上のトランスクリプトームの差に加え、本発明者らは、細胞内インフラマソームマーカー、例えば、NLRP3の有意な上方調節を含む染色体間転写差()も観察した(トランス)。LAG3発現は、rs10846744リスクC発現細胞において有意に低い。活性化後の細胞表面LAG3発現の変化を計測するため、細胞を最初に、ホルボールミリステートアセテート(PMA)/イオノマイシン+インターロイキン−4(IL−4)を用いておよび用いずにインキュベートし、次いでLAG3をフローサイトメトリーにより計測した。
図6は、フローサイトメトリーを使用したrs10846744基準Gおよびrs10846744リスクC発現細胞におけるLAG3の示差的発現をプロットする。rs10846744基準Gまたはrs10846744リスクCアレルについてホモ接合性である形質転換Bリンパ球を基底または刺激カクテル(ホルボールエステル 500ng/ml、イオノマイシン 250ng/ml、およびIL−4 100U/ml)条件下で0〜4時間インキュベートし、細胞表面LAG3タンパク質の計測のためにアイソタイプ対照または抗LAG3抗体により染色し、次いでフローサイトメトリーのために固定した。
パネルI:アイソタイプ対照またはLAG3抗体により染色された基底および刺激条件下のrs10846744基準G−003細胞;データは、3つの独立実験の代表物である;
パネルII:アイソタイプ対照またはLAG3抗体により染色された基底および刺激条件下のrs10846744リスクC−008細胞;データは、3つの独立実験の代表物である。
図7は、フローサイトメトリーにより計測されたLAG3+細胞の細胞表面発現のグラフ分析である。
パネルIは、rs10846744基準G−003細胞系からの3つの独立実験のプールデータ(平均±SE)を表し、それぞれの実験は3つ組で実施した(n=9、ベースラインと比較してp<0.0001)。
パネルIIは、全てのrs10846744基準G細胞系からのプールデータ(平均±SE)を表す(n=18、ベースラインと比較してp<0.0001)。
パネルIIIは、rs10846744リスクC−008細胞系からの3つの独立実験のプールデータ(平均±SE)を表し、それぞれの実験は3つ組で実施した(n=9、p=0.06)。パネルIVは、全てのリスクC細胞系からのプールデータ(平均±SE)を表す(n=15、p=0.04)。
図8は、rs10846744基準Gおよびrs10846744リスクC発現細胞からの活性化後の経時的な培地中のLAG3タンパク質レベルの変化のグラフである。
パネルIは、rs10846744基準G−003細胞系からの3つの独立実験のプールデータ(平均±SE)を表し、それぞれの実験は3つ組で実施し(n=9、ベースラインと比較してp<0.0001)、rs10846744リスクC−008細胞系からの3つの独立実験のプールデータ(平均±SE)からのものを表し、それぞれの実験は3つ組で実施した(n=9、p=0.06)。
パネルIIは、全てのrs10846744基準G細胞系からのプールデータ(平均±SE)(n=18、ベースラインと比較してp<0.0001)および全てのrs10846744リスクC細胞系からのプールデータ(平均±SE)(n=15、p=0.04)を表す。
図9は、rs10846744基準G−003およびrs10846744リスクC−008発現細胞における活性化後の経時的な培地中の分泌サイトカイン(TNFαおよびIL−10)レベルの変化のグラフである。
パネルIは、rs10846744基準G−003細胞系からの3つの独立実験のTNFαプールデータ(平均±SE)を表し、それぞれの実験は2つ組で実施した(n=6、ベースラインと比較してp<0.0001)。
パネルIIは、rs10846744リスクC−008細胞系からの3つの独立実験のTNFαプールデータ(平均±SE)を表し、それぞれの実験は2つ組で実施した(n=6、ベースラインと比較してp<0.0001)。パネルIIIは、rs10846744基準G−003細胞系からのIl−10プールデータ(平均±SE)を表し、それぞれの実験は2つ組で実施した(n=6、ベースラインと比較してp=0.02)一方、パネルIVは、rs10846744リスクC−008細胞系からの3つの独立実験のIL−10プールデータ(平均±SE)を表し、それぞれの実験は2つ組で実施した(n=6、p<0.0001)。
図6〜9をまとめて参照すると、ベースラインにおいて、LAG3の細胞表面発現は、rs10846744基準G細胞(26.3±2.6、p<0.0001)と比較してrs10846744リスクC発現細胞(2.02±2.8)において92%低かった。PMA/イオノマイシン+IL−4による刺激後、ベースラインレベルと比較して、経時的に、細胞表面LAG3発現は、rs10846744基準G(p<0.0001、003細胞系および全ての組合せ)およびrs10846744リスクC発現細胞(008細胞についてp=0.06および全ての組合せについてp=0.04)において有意に減少した(図7)。並行して、経時的に、LAG3レベルは、rs10846744リスクC−008発現細胞において観察された変化なしと比較してrs10846744基準G−003細胞(p=0.03、パネルI)からの培地中で増加した(図8)。しかしながら、組合せrs10846744基準Gとrs10846744リスクC組合せ発現細胞とを比較した場合、LAG3培地レベルにおける統計的に有意な差は存在しなかった(図8、パネルII)。経時的に、培地中のTNFαおよびIL−10レベルは、rs10846744基準G発現003細胞と比較してrs10846744リスクC発現008細胞において有意に高かった(図9)。
図10は、いかにLAG3がBCRシグナリングにおいて重要であるかを説明する。2時間の基底または刺激カクテル(ホルボールエステル 500ng/ml、イオノマイシン 250ng/ml、およびIL−4 100U/ml)条件下でrs10846744基準Gまたはrs10846744リスクCアレルを発現する形質転換B細胞から全細胞溶解物を単離した。等量の溶解緩衝液の添加により反応を終結させ、示される総抗体およびホスホ抗体によりブロットした。示される結果は、3つのレプリケートプール試料の1つの代表実験からのものである。
図10(A):Ramos細胞系、GG(003)またはCC(008)細胞:刺激Gアレル細胞、対応する総タンパク質に正規化されたホスホシグナリング、基準Gアレル細胞における非刺激条件と比較したp−CD79A(p=0.04)、p−CD19(p=0.04)、p−Syk(p=0.005)、p−Lyn(p=0.001)、p−PLCγ2(p=0.004)およびp−PKCβ(p=0.003)。
図10(B):非刺激細胞におけるレンチウイルスLAG3−GFPまたはshRNA−LAG3のBCRシグナリングおよび過剰発現:それぞれのアレルにおけるモックベクターを発現する細胞と比較したCC細胞のp−Lyn(p=0.04);p−PKCβ(p=0.03)およびGG細胞のp−Lyn(p=0.04);p−PKCβ(p=0.01)。
図10(C):刺激細胞におけるレンチウイルスLAG3−GFPまたはshRNA−LAG3のBCRシグナリングおよび過剰発現:リスクCアレルにおけるモックベクターを発現する刺激細胞と比較した刺激細胞におけるCC細胞のp−Lyn(p=0.01);p−PKCβ(p=0.01)。ショートヘアピンRNAによりGG細胞におけるLAG3をノックダウン、基準Gアレルにおけるモックベクターを発現する刺激細胞と比較した刺激細胞におけるp−Lyn(p=0.002);p−PKCβ(p=0.009)。示される結果は、3つのレプリケートプール試料の1つの代表実験からのものである。
刺激後、rs10846744リスクC発現細胞においてリン酸化標的は検出されなかった一方、全ての標的は、非刺激条件と比較してrs10846744基準G細胞において有意に発現されたp−CD79A(p=0.04)、p−CD19(p=0.04)、p−Syk(p=0.005)、p−Lyn(p=0.001)、p−PLCγ2(p=0.004)およびp−PKCβ(p=0.003)。
下流シグナリング経路に対するLAG3の効果を直接評価するため、本発明者らは、rs10846744リスクC発現細胞(減少したLAG3レベルを有する)中でLAG3を過剰発現させ、または内因性LAG−3タンパク質を発現するrs10846744基準G発現細胞中でLAG3をサイレンシングする実験を実施した。
図10(B)に示されるとおり、基底または刺激rs10846744リスクC細胞中のLAG3の過剰発現は、対照細胞(これらは、空ベクターにより形質移入させた細胞である)と比較してリン酸化標的の有意に増加したレベルと関連した(非刺激細胞においてp−Lynについてp=0.04;p−PKCβについてp=0.03および刺激細胞においてp−Lynについてp=0.01;p−PKCβについてp=0.01)。LAG3のサイレンシングは、対照細胞と比較してrs10846744基準G細胞中のリン酸化標的の有意に低いレベルと関連した(刺激細胞においてp−Lynについてp=0.002;p−PKCβについてp=0.009)(図8(C)。
rs10846744リスクCアレルのキャリアは、有意に低い血漿可溶性LAG3(sLAG3)を有した。LAG3発現および機能がrs10846744リスクC発現細胞中で低減したことを考慮して、本発明者らは、次に、LAG3タンパク質レベルが、基準GおよびリスクCアレルのHALPキャリアから単離された血漿中で有意に異なるか否かを決定し;この試験群は発見コホートを構成した。
図11は、LAG3の発現が脂質ラフトにおいて低減し、rs10846744リスクC発現細胞において下流シグナリングが損傷されることを示す。LAG3は活性化細胞中の脂質ラフト中に位置し、下流ホスホシグナリングに影響を与えることが示されているため、本発明者は、このLAG3下方調節が下流シグナリング経路に影響を与えるか否かを試験した。rs10846744リスク(CC)細胞において、LAG3は、細胞が基底状態であるか、PMA/イオノマイシン/IL−4により刺激されるかにかかわらず、脂質ラフト中で同定されなかった。脂質ラフトは、炭酸ナトリウム抽出均質化溶解物について改変3ステップスクロース密度勾配を使用して基底または刺激条件(ホルボールエステル、PMA 500ng/ml、イオノマイシン 250ng/ml、およびIL−4 100U/ml)下のエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換B細胞から単離した。免疫ブロッティングにより特異的抗体を使用して以下の標的の発現を決定した:LAG3;LYNおよびFLOT2(フロチリン)(全ての脂質ラフトマーカー)。基底条件(A、レーン2〜3)と比較した刺激基準(GG)細胞(B、レーン2〜3)の脂質ラフト画分に位置するLAG3タンパク質の発現(FLOT2に正規化)、N=3、p=0.03。LAG3タンパク質は、リスク(CC)細胞中で、基底(C、レーン2〜3)か、刺激条件(D、レーン2〜3)かにかかわらず検出されなかった。両側スチューデントt検定を使用して結果を分析し、ブロットは、3つの独立実験の1つの代表物である。0.05未満のP値を有意とみなした。
上記のとおり、図1は、血漿sLAG3レベルがSCARB1rs10846744と有意に関連したことを示す。図1(A)において確認されるとおり、血漿sLAG−3レベルは、基準Gアレルについてホモ接合性である対象(GG:10,169±1120pg/ml、n=96)またはヘテロ接合性対象(GC:11,139±2288pg/ml、n=23)と比較してリスクCアレルについてホモ接合性である対象(CC:3430±2339pg/ml、n=22、p=0.03)において有意に低かった。
次に、本発明者はrs10846744およびsLAG3と、脂質レベルおよびHDLサブフラクションとの関連を探索した。このHALP集団において、本発明者はrs10846744またはsLAG−3と、総コレステロール、LDL−C、トリグリセリド、またはHDL−Cとの関連を観察しなかった(データ示さず)。同様に、本発明者らは、rs10846744またはsLAG3と、血漿アポリポタンパク質(apoA−I、apoA−II、apoB、apoCI、apoCII、apoC−III、およびapoE)との関連を観察しなかった。rs10846744とHDLサブフラクションとの有意な関連は、NMR分光法により計測された場合に観察された。
図2を再度参照すると、グラフは、NMR分光法により計測してrs10846744が中型および小型HDL粒子と有意に関連したことを示す。中型および小型HDL粒子は、基準Gアレルについてホモ接合性であり、rs10846744についてのリスクCアレルについてホモ接合性であるキャリアから単離された空腹時血漿試料においてNMR分光法(Liposcience,Raleigh NC)により計測した。示される値は、中型および小型HDL粒子(μmol/L)ならびにHDLサイズ(nm)の平均±標準偏差である。
人種/民族性、SCARB1rs10846744および他の共変量は、MESAにおける血漿LAG3レベルの独立予測因子である。多変量回帰モデルにおいて、人種(p=0.0005)、年齢(p=0.003)、脂質薬(p=0.03)、rs10846744ゲノタイプ(p=0.002)、および喫煙状態(p<0.0001)は、血漿LAG3レベルの独立予測因子として保持された(図5、表2A)。血漿LAG−3(p<0.007)は、年齢(p=0.006)、性別(p<0.0001)、BMI(p<0.0001)、TG(p<0.0001)、アルコール飲用(p<0.0001)、HgbA1c(p=0.01)、および最高血圧(p=0.03)により調整してもHDL−Cレベルの独立予測因子のままであった(図5、表2B)。
ロジスティック多変量回帰分析は、血漿LAG3が無症候性アテローム性動脈硬化症(cIMT)(p=0.25)とも、冠動脈カルシウムスコア(CAC)(p=0.062)とも有意に関連しないことを明らかにした。図12、表3は、MESA参加者における血漿LAG3とCHDとの関連を示す多変量回帰分析である。共変量は、人種、系統のPC、年齢、試験場所、性別、HgbA1c、BMI、脂質薬、脂質(TCおよびLDL−C)、喫煙パックイヤー、最高血圧、および最低血圧を含んだ。LAG3の推定係数(SE)は、−0.078(0.034)であった。LAG3について、オッズ比は変数の第1四分位数と第3四分位数とを比較することにより推定した。他の連続変数について、オッズ比は変数の第3四分位数と第1四分位数とを比較することにより推定した。*N=4707、*p<0.0001;**p=0.02;+p=0.0002;++p=0.04;&p=0.002;&&p=0.03;#p=0.05
ロジスティック多変量回帰分析は、慣習的なリスク因子、例えば、年齢(p<0.0001)、性別(p<0.0001)、最高血圧(p=0.0002)、LDL−C(p=0.02)、TC(p=0.04)、脂質薬(p=0.002)、HgbA1c(p=0.03)、および喫煙(p=0.05)に加え、血漿LAG3(ベータ−0.078、OR1.15、p=0.02)がCHDの独立予測因子であることを明らかにした。
≧60mg/dlのHDL−Cを有するMESAコホート内の参加者の有病率は26%であり、この群内でCHDの有病率は4%であり、人種/民族群間で有意でなかった。CHDを有する対象におけるHDL−Cレベル(n=55、72.4±1.6mg/dl)は、CHDを有さない対象(n=1387、71.8±0.3mg/dl、p=0.71)と比較して有意に異なることはなかった。しかしながら、血漿LAG3レベルは、CHDを有さない対象(1828±107.6pg/ml、n=1386、p=0.04)と比較してCHDを有する対象(843.3±540.1pg/ml、n=55)において2倍低かった。ロジスティック回帰分析において、血漿LAG3(ベータ−0.212、OR1.45、p=0.004)、年齢(p=0.006)、性別(p=0.001)、および最低血圧(p=0.03)は、CHDの独立予測因子として保持された。図12、表4は、≧60mg/dlのHDL−Cを有するMESA参加者における血漿LAG3とCHDとの関連を示す回帰分析である。共変量は、人種、系統のPC、年齢、試験場所、性別、HgbA1c、BMI、脂質薬、脂質(TCおよびLDL−C)、喫煙パックイヤー、最高血圧、および最低血圧を含んだ。LAG3の推定係数(SE)は、−0.212(0.073)であった。LAG3について、オッズ比は変数の第1四分位数と第3四分位数とを比較することにより推定した。他の連続変数について、オッズ比は変数の第3四分位数と第1四分位数とを比較することにより推定した。*N=1134、p=0.004;**p=0.006;+p=0.001;++p=0.03(表4)。
本発明者は、MESAコホートにおける血漿LAG3が、フラミンガムリスクスコアと比較してCHDリスク予測に有意に影響を与えるか否かも試験した。図12、表5は、モデル2(対数変換血漿LAG3)をモデル1(個人の10年間の心血管リスクを推定するためのフラミンガムリスクスコア)と比較する尤度比検定である。表5は、血漿LAG3の包含がCHDリスクの予測における有意な追加情報を提供したことを示す(p=0.039)。モデル3および4を試験場所、人種、および系統のPCについて調整し;モデル4をモデル3を比較する尤度比検定は、LAG3の包含がCHDリスクの予測における有意な追加情報を提供することを裏付けた(p=0.044)。図12、表5において、血漿LAG3がフラミンガムリスクスコアと比較してCHDリスク予測を増加させたことを確認することができる(p=0.039)。モデルが試験場所、人種、および系統のPCについての調整を含んだ場合、血漿LAG3は、CHDリスク予測因子として有意のままであった(p=0.04)。
培養B細胞からのLAG3と炎症マーカーとの間の有意な相関の観察を考慮して、本発明者は血漿LAG3がMESAデータセットにおいて利用可能な炎症マーカーと関連するか否かを調査した。図12、表6は、MESA参加者における血漿LAG3と炎症マーカーとの関連を示す。回帰モデルを年齢、性別、試験場所、人種、および系統のPCについて調整した。全てのアウトカム変数および血漿LAG3を対数変換した。sTNFαR=可溶性TNFα受容体;hs−CPR=高感度C反応性タンパク質。表6において確認されるとおり、多変量回帰分析後、血漿LAG3はIL−10と正に関連した(p<0.0001)。
まとめると、これは、心血管疾患の発症についての1つ以上のリスク因子について対象を定性的にプレスクリーニングし、第2のステップにおいてゲノタイピングしてSCARB1rs10846744および/もしくはLAG3rs870849突然変異を存在についてプレスクリーニングし、または血漿/血清LAG3を計測して3400pg/ml未満のレベルを有する患者を同定することによりLAG3タンパク質欠損を定量的に検出し、次いで前記疾患を仲介するためのテーラード治療レジメンを施与するこの新規方針の利用性を確立する。
材料および方法:
全ての実験において使用される培養培地は、10%のウシ胎児血清(FBS)、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンが補給されたRPMI1640(全てLife Technologies,Carlsbad,CAから購入した)であった。リンパ球刺激のため、ホルボール12−ミリステートアセテート(PMA)およびイオノマイシンカルシウム塩をSigma−Aldrich (St.Louis,MO)から購入した一方、インターロイキン−4(IL−4)をPeproTech(Oak Park,CA)から購入した。LAG3およびアイソタイプ対照フルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体をBiolegend Inc.(San Diego,CA)から購入した。シグナリングに使用される抗体は、Cell Signaling Technologies(Beverly,MA)から購入した:抗CD79A(#3351)、抗ホスホCD79A(Y182)(#5173)、抗CD19(#3574)、抗ホスホCD19(Y531)(#3571)、抗Syk(#2712)、抗ホスホ−Syk(Y525/526)(#2710)、抗−Lyn(#2796)、抗ホスホLyn(Y507)(#2731)、抗PLCγ2(#3872)、抗ホスホ−PLCγ2(Y759)(#3874)、抗ホスホ−PKCα/βII(T638/641)(#9375)。抗PKCβ(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA sc−210)および抗β−アクチン(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を別個に購入した。
HALP対象から単離されたリンパ球を、エプスタイン・バーウイルスを使用して不死化してBリンパ球を生成した(University of North Carolina Lineberger Comprehensive Cancer Center Tissue Culture Facility,Chapel Hill,NC)。EBV形質転換Bリンパ球を、10%のFBSおよび1%のペニシリン−ストレプトマイシンが補給されたL−グルタミンを有する完全RPMI1640培地の1ml当たり約1〜2×106個の細胞の密度において懸濁液中で成長させた。培地を必要に応じて週2回以上交換してから細胞を実験に使用した。
基準Gアレルについてホモ接合性である3人のHALP対象およびリスクCアレルについてホモ接合性である3人のHALP対象から全RNAを単離し、次いでPerkin Elmer次世代シーケンシングプラットフォーム(RNA−Seq)(Perkin Elmer,Branford CT)を使用する全長トランスクリプトームシーケンシングに供した。Perkin Elmer Gene Sifterソフトウェアプログラムを使用してバイオインフォマティクスを実施した。データは、完全マップリード、品質リード>20、対数変換を選択し、複合試験補正のためにBenjamini Hochbergを使用することにより調整した。目的のRNA標的は、標準的な方法を使用するリアルタイムPCRおよびウエスタンブロッティングによりバリデートした。RNA−Seqは、別個の6つの細胞系に対して、細胞を血清(通常の培養条件)中で培養し、次いでホルボールエステル(PMA 500ng/ml)、イオノマイシン(250ng/ml)、およびIL−4(100U/ml)により6時間刺激する条件下で実施した。
多数のアッセイを使用して6つのEBV形質転換B細胞系におけるLAG3発現および機能を評価した。
フローサイトメトリー:フローサイトメトリーを10レーザーフローサイトメトリー(Becton Dickson,Franklin Lakes,NJ)により実施した。死細胞をBlue死細胞染色キット(Molecular Probes,Eugene,OR)により染色した。刺激B細胞におけるLAG3の応答を計測するため、本発明者らは、Smelandら(1)により既に公開されているプロトコルを最初に改変し、最適化した。PMA(500ng/ml)、イオノマイシン(250ng/ml)およびIL−4(100U/ml)を用いておよび用いずに細胞を種々の時間(0〜4時間)でインキュベートした。生存細胞画分のみを使用し、次いでモノクローナルLAG3抗体により処理された細胞についての染色パーセント値からアイソタイプ染色パーセント値を減算することにより細胞表面LAG3発現の細胞表面変化パーセントを計算した。
培地中へのサイトカイン分泌:インターロイキン−10(IL−10)および腫瘍壊死因子α(TNFα)のレベルを、基底および刺激条件下で培養された細胞から単離された培地アリコート中で、XMAP技術を使用するLuminex200によりマルチプレックス(Milliplex;Millipore,Temecula,CA)により種々の時間(0〜4時間)で計測した。
ウエスタンブロッティング:本発明者らは、ウエスタンブロッティングを使用して刺激B細胞における下流シグナリングに関与することが公知の以下のタンパク質の総発現およびリン酸化発現を計測した:p−CD79A、p−CD19、p−Syk、p−Lyn、p−PLCγ2、およびp−PKCβ。一部の実験において、本発明者らはまた、細胞をCD40リガンド(CD40L)(200ng/mL)により2時間刺激し、次いでウエスタンブロッティングのために全細胞溶解物を単離した(図S4およびS5)。細胞を、50mMのトリス−HCl(pH7.4)、1%のNP−40、0.25%のデオキシコール酸Na、150mMのNaCl、1mMのPMSF、5mMのNaF、1mMのNa3VO4、1mMのβ−グリセロホスフェート、10mMのNa4P2O7、2mMのEDTAおよび完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics Corp.,San Francisco,CA)により可溶化した。30分間の氷上インキュベーション後、溶解物を遠心分離(10,000g)により4℃において15分間澄明化し、上清を回収した。BCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定し、等量をSDS/線形勾配PAGEに供し、次いでLaemmli試料緩衝液中で可溶化させた。続いて、ゲル分解されたタンパク質をPVDF膜にウェットタンク転写を介して電気的に転写し、それを抗体インキュベーション前に5%の無脂肪乳によりブロッキングした。次いで、膜を最初にホスホ−タンパク質に対する抗体、次いで総タンパク質に対する抗体と4℃において一晩インキュベートした。抗体−抗原複合体を化学発光(ECL+System;Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)により同定した。抗β−アクチンをローディング対照として使用した。定量用Image Studio Lite 4.0(Licor,Lincoln,NE)を使用してホスホ−タンパク質を対応する総タンパク質に正規化した。
脂質ラフト単離。細胞膜脂質ラフトコンパートメントにおけるLAG3の発現を評価するため、500mMの炭酸ナトリウム(pH11.0)およびスクロース密度遠心分離を使用して脂質ラフト膜を単離した。スクロース勾配法を本質的には上記のとおり実施し(2)、改変した。細胞(1×108個)を氷冷PBSにより洗浄し、500mMの炭酸ナトリウム、pH11.0(2)を含有するホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤(1mMのPMSF、5mMのNaF、1mMのNa3VO4、1mMのβ−グリセロホスフェート、10mMのNa4P2O7、2mMのEDTAおよび完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics Corp.,San Francisco,CA)と再懸濁させた。溶液を、Wheatonダウンス型ホモジナイザー中での10回のストロークによりさらに均質化した。不連続スクロース勾配のため、300μLの澄明化上清を300μLの85%のスクロースと混合し、2.2mLのBeckman遠心分離管の底部に移した。希釈溶解物に1mlの35%のスクロースを重層し、最後に600μLの5%のスクロースを重層した。試料をBeckman卓上遠心分離機中で70,000gにおいて4℃において20時間超遠心した。遠心分離後、勾配を10個の220μL画分に分けた。画分1〜3をプールした(ブロット上の組合せ画分1)。脂質ラフトの位置を決定し、不連続スクロース勾配中でタンパク質を区別するため、40μLのラフト画分(スクロース勾配の4および5、ブロット上の2および3)および非ラフト画分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、免疫ブロットした。
LAG3の過剰発現およびサイレンシングアッセイ。本発明者らは、2つの実験アプローチを使用してLAG3の存在または不存在が下流シグナリング経路の変更の原因であるか否かを決定した。本発明者らは、最初にrs10846744リスクC発現細胞中で、それらにGFPタグ付き全長ヒトLAG3cDNAを発現するレンチウイルスベクターを形質移入することにより、LAG3を過剰発現させた。本発明者らの第2のアプローチは、特異的shRNAベクターを使用してrs10846744基準G発現細胞におけるLAG3発現をサイレンシングすることであった。
レンチウイルス形質移入および形質導入:pReceiver−Lv122過剰発現ベクター中に挿入されたLAG3−GFP、psi−LVRH1MP RNAiサイレンシングベクター中に挿入されたshRNA−LAG3、スクランブルshRNA、およびレンチウイルスモックGFP対照ベクターを、GeneCopoeia(Rockville,MD)から入手した。最も効率的なノックダウンを有するプラスミドの選択のためにLAG3に対する4つのshRNAをスクリーニングした。Lenti−Pac HIV発現パッケージングキット(GeneCopoeia,Rockville,MD)を使用することによりレンチウイルスを生成した。簡潔に述べると、2.5μlのそれぞれの個々のレンチウイルスプラスミドおよび5.0μlのEndoFectin Lenti試薬をOpti−MEMI中に添加してDNA−EndoFectine複合体を形成した。複合体を室温においてインキュベートして20分後、DNA−EndoFectine複合体をディッシュに10%のFBSを有するDMEM中のHEK293と添加し、5%のCO2中で37℃において一晩インキュベートした。培養培地を、5%のFBSを有する新鮮DMEMにより置き換え、インキュベートを継続した。ウイルス含有培養培地を形質移入の48時間後に回収し、濾過後に濃縮した。レンチウイルスによる形質導入のため、1.5mlの完全培地中の1×106個のEBV形質転換Bリンパ球を12ウェルプレート中で播種し、500μlのウイルス懸濁液を添加した。細胞を37℃において72時間インキュベートした。下流シグナリング経路に対する、リスクCアレルを有するリンパ球におけるLAG3の過剰発現または基準Gアレルを有するリンパ球におけるLAG3のサイレンシングのいずれかの効果を評価するため、形質移入細胞を、ホルボールエステル(500ng/ml)、イオノマイシン(250ng/ml)およびIL−4(100U/ml)カクテルを用いておよび用いずに2時間刺激し、次いでウエスタンブロッティングのために処理して下流シグナリングタンパク質のリン酸化を評価した。
血漿または可溶性リンパ球活性化遺伝子3(sLAG3)アッセイ。sLAG3ELISAキットをRayBiotech,Inc.(Norcross GA)から購入し、最初にキットを最適化することによりsLAG3を計測した。143人のHALP対象からの−80℃において貯蔵された空腹時血漿試料のアリコートを解凍し、3倍希釈し、次いで100μlをsLAG3計測のために1試料当たり2つ組に使用した。標準曲線を2倍希釈し、線形関連データを生じさせた。線形回帰を標準曲線に対して実施して血漿試料を定量した。値を平均±標準誤差として表す。
マウス
全てのアテローム性動脈硬化症試験のため、本発明者らは、病変区域計測値の予測される25%の変動係数、および病変区域における25%の差を検出する80%の機会に基づく出力計算から計算された1群当たり15匹のマウス(1試験当たり30匹)を使用した。全ての実験において、マウスに規定の高コレステロール/高飽和脂肪食を10週間給餌した。標準的比色アッセイおよびHPLC画分におけるコレステロール測定の両方により、血漿脂質プロファイルを計測した(LDL−C、HDL−C、トリグリセリド)。大動脈基部中および下行大動脈中のアテローム性動脈硬化病変の量を確立された方法により分析し、例として、病変容積を連続大動脈基部の断面の病変区域、および大動脈のエンフェースオイルレッドO染色調製物中の病変区域により評価した。壊死性コアサイズを、HE染色されなかった病変内の区域として計測した。マウスのそれぞれの実験群について、脾臓および傍大動脈リンパ節中のCD4+、CD8+、およびCD4+FoxP3+T細胞の数を定量し、フローサイトメトリー(CD62L、CD44、CD69、Lag−3およびPD−1について染色)によるT細胞の活性化表現型を決定した。
脾細胞をldlr-/-マウスから通常食と高脂肪食の10週間後に回収し、抗CD3/抗CD28によりエクスビボで24時間刺激した場合、通常食給餌マウスからの36.7±3.9%のLag3+細胞と比較して48.2±2.8%のCD4+細胞がLag3+であった(31%の増加、n=8〜10、p<0.02)。図13は、高脂肪食給餌後のマウスにおけるCD4+Lag3+T細胞活性化のグラフである。このグラフは、高脂肪食が活性化CD4+T細胞をもたらしたことを示す。
アテローム性動脈硬化症に対する骨髄由来細胞(BMDC)の効果を試験するため、本発明者らは最初にLag3-/-またはLag3+/+BMDCを放射線照射された10週齢Ldlr-/-レシピエントマウス中に移植した。これらの移植マウスを4週間平衡化してから高脂肪/コレステロール食を10週間給餌し、次いで屠殺し、大動脈病変および免疫パラメータについて分析した。Lag3-/-骨髄レシピエントにおける大動脈基部病変T細胞の有意な増加が対照と比較して存在した(それぞれ45.5±8.5と21.1±3.4のCD4+細胞/mm2、n=14および12、p=0.01、2倍増加)(図14)。本発明者らは、Lag3-/-骨髄レシピエントの傍大動脈リンパ節中で有意に増加した割合の活性化(CD62L−CD44+)CD4+およびCD8+T細胞も対照と比較して見出した(41.4±1.0と28.1±1.5の活性化CD4+細胞、n=14、p<0.0001;12.9±0.7と8.2±0.5の活性化CD8+細胞;n=14、p<0.001)。これらの結果は、高コレステロール血症の状況におけるLag−3タンパク質についての抗炎症、アテローム保護的役割を強力に支持する。
Tregは、アテローム生成促進T細胞応答を抑制する。Foks AC,Lichtman AH,Kuiper J.s.l.,“Treating Atherosclerosis With Regulatory T Cells”,Arterioscler Thromb Vasc Biol,vol.35,pp.280−287(2015)参照。しかしながら、この保護機能におけるLag−3の役割は不明である。予想外に、傍大動脈リンパ節中のTregの数は、Lag3-/-における病変区域と正に相関したが、野生型骨髄レシピエントとは相関しなかった(図15)。このことは、Lag−3タンパク質欠損がTreg機能を損傷させるが、拡大を損傷させないことを示唆する。特筆すべきことに、近年の研究は、FoxP3+発現細胞上のCTLA−4の選択的欠失がFoxP3+Tregの拡大をもたらすが、それらの細胞は損傷した抑制活性を有する(exTregと称される)ことを示した。Treg上のCTLA−4およびLag3は両方ともエフェクターT細胞上の分子(それぞれB7およびクラスIIMHC)に結合し、それを遮断するように機能し得るため、Lag3欠損Tregも欠陥抑制活性を有し得るという可能性が高い。
Lag3がCD4+T細胞応答を阻害する機序を考慮して、Lag3欠損マウスが有意に多い病変炎症を示すことが観察された。Lag3タンパク質欠損の状況においてリンパ性Tregの拡大が観察されたが、その機能は欠落し、適合移植Lag3欠損Tregは野生型Tregに対してアテローム性動脈硬化症を制御し得なかった。
ここでも、これは、インフラマソーム、慢性炎症疾患および機能不全HDLを評価するためのバイオマーカーとしてのLAG3発現プロファイリングと、それに続く前記疾患を仲介するためのテーラード治療レジメンを使用するための新規方針を確立した。さらなる有用性は、SCARB1および/もしくはLAG3バリアントのヒトキャリアまたは他の遺伝的もしくは非遺伝子的原因による低い血漿/血漿LAG3タンパク質レベルを有すると同定されたキャリアにおけるアテローム性動脈硬化症リスクのための抗高脂血症薬および/またはスタチンとのコンパニオン治療薬としての組換えリンパ球活性化遺伝子−3のテーラード治療レジメンにより得られる。
マウス
マウスにおけるLAG3欠損がアテローム性動脈硬化症マウスモデルにおいてTreg機能の変更および炎症細胞の増加と有意に関連したことを同定したら、次に、組換えヒト可溶性単量体LAG3が、その結合標的MHCクラスII分子を高度に発現するマウスB細胞に結合するか否かを決定した。野生型マウスからのマウス脾細胞(約100万個の細胞)を、96ウェルプレートのウェルに播種した。細胞をスピンダウンさせ、Ca2+/Mg2+を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液中の組換えヒト可溶性単量体LAG3溶液(0〜162μgのタンパク質/ml)中で再懸濁させた。実験条件は、以下のとおりであった:条件1、162μg/ml(原液、希釈係数1);条件2、32.4μg/ml 希釈係数5;条件3、3.24μg/ml 希釈係数50;条件4、0.32μg/ml 希釈係数500;条件5、0μg/ml。30分間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンさせ、FACS緩衝液(0.5%のウシ血清アルブミン、0.05%のアジ化ナトリウムを有するPBS)により1回洗浄した。Fc−ブロック、抗CD3PerCP、抗B220FITCおよびLAG3/アイソタイプ対照(それぞれ、抗ヒトLAG−3およびマウスIgG1Kアイソタイプ対照APC)を含有する50μlの抗体カクテルを添加した。細胞を室温において20分間インキュベートし、次いで、150μlのFACS緩衝液を添加した。次いで、細胞をFACS緩衝液によりさらに1回洗浄し、次いで最後にFACS緩衝液中で再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。
図16(第1頁)において示されるとおり、組換えヒト可溶性単量体LAG3は、MHCクラスII分子を発現するマウスB脾細胞に用量応答的に結合した。図17(第2頁)において、組換えヒト可溶性単量体LAG−3は、マウスT細胞(MHCクラスII分子を発現しない)と比較してマウスB細胞(MHCクラスII分子を発現する)に優先的に用量応答的に結合した。
図18は、基底および刺激後条件下のリンパ球におけるLAG3エキソン3転写物の示差的発現を説明する。本発明者は、LAG3遺伝子のエキソン3が、ホルボールエステル、イオノマイシン、およびIL−4により刺激された細胞と比較して基底または休止条件下で培養されたヒトBリンパ球の間で示差的に発現されることを独自に同定した。エキソン3転写は、MHCクラスII分子に結合するLAG3タンパク質のドメイン1のエキストラループへの翻訳に必須である。
LAG−3転写調節
LAG−3タンパク質構造は、4つのIg様エクトドメイン、連結ペプチド、膜貫通および細胞質ドメインからなる。LAG3タンパク質構造はCD4のものと類似するが、アミノ酸配列相同性は20%にすぎない。Creg?J.Workman,Dario A.A.Vignali,“The CD4−Related Molecule,LAG−3(CD223),Regulates the Expansion of Activated T Cells,Eur.Jl.of Immunology,24 March(2003)。CD4と比較して、LAG3タンパク質は、ドメイン1の一部としての30個のアミノ酸のエキストラループを独自に含有する。このエキストラループはエキソン3中でコードされ、MHCクラスII受容体に結合することが示されているのはこのループである。Huard et al.,Characterization Of The Major Histocompatibility Complex Class II Binding Site On LAG−3?Protein,Proc Natl Acad Sci USA.,94(11):5744−5749(May 1997)。
図18において、エキソン3転写が、不存在である場合、基底休止細胞中で縮小され、細胞がホルボールエステル(PMA)/イオノマイシン/IL−4を含有するカクテルにより刺激された場合に増加することが実証される。この新規観察の考察において、細胞が活性化される場合にのみエキストラループが転写される必要があることは道理にかなっている。組換えヒトLAG3の一実施形態は、LAG3エキソン3の活性化を模倣してMHCクラスII分子に結合するエキストラループのRNAおよびタンパク質発現を増加させる薬剤(LAG3模倣体)であってもよい。LAG3エキソン3活性化の模倣体としては、RNA転写に影響を与える代替DNAまたはRNA構造の形成に影響を与える分子および/または薬剤、例として、代替DNAまたはRNA構造に影響を与える細胞内または細胞外カチオン、例えば、カリウム、ナトリウム、リチウムまたはカルシウムに影響を与える分子を挙げることができる。LAG3エキソン3活性化の模倣体としては、LAG3エキソン3の転写を含み、または除外する選択的スプライシングに影響を与える分子および/または薬剤を挙げることができる。
目下、好ましい実施形態を十分に記載してきたが、種々の他の実施形態ならびに本明細書に示され、記載される実施形態のある変更および改変が当業者に前記基礎概念の理解時に想起されるのは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されるもの以外で実施することができることを理解すべきである。
Claims (21)
- ヒト成人対象における慢性炎症および心血管疾患を治療する方法であって、
LAG3タンパク質の潜在的欠損を示すLAG3欠損マーカーを検出するために前記対象の定性的プレスクリーンを施与するステップ;
前記LAG3タンパク質欠損を確認するために前記対象に対して定量的試験を施与するステップ;
前記対象に、アジュバントとしてのhLAG3−−Igと、少なくとも1つの化学療法剤との組合せを含む治療レジメンを施与するステップ
を含む方法。 - 前記対象の定性的プレスクリーンを施与する前記ステップが、LAG3欠損マーカーについての医療記録をプレスクリーニングすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の定性的プレスクリーンを施与する前記ステップが、LAG欠損マーカーについての家族歴をプレスクリーニングすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 定量的試験を施与する前記ステップが、前記LAG3タンパク質欠損を確認するために前記対象からの血液試料に対して定量的試験を施与することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記血液試料に対する前記定量的試験が、アッセイである、請求項4に記載の方法。
- 前記血液試料に対する前記定量的試験が、遺伝子試験である、請求項4に記載の方法。
- 前記定量的試験が、LAG3の低レベル発現の存在についての前記対象からの血漿試料の遺伝子試験およびアッセイの両方を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記定量的遺伝子試験が、SCARB1またはLAG3遺伝子のコード配列中の多型を検出するように構成される、請求項6に記載の方法。
- 前記多型が、SCARB1rs10846744またはLAG3rs870849突然変異である、請求項8に記載の方法。
- 前記血液試料に対する前記定量的試験が、SCARB1またはLAG3遺伝子の少なくとも一部を増幅させてからアレルバリアントを同定することを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記アッセイが、3400pg/ml未満の低LAG3を計測するように構成される、請求項5に記載の方法。
- 前記アッセイが、ELISAアッセイである、請求項11に記載の方法。
- 前記対象に治療レジメンを施与する前記ステップが、組換えヒトLAG3を定期投与により投与することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象に治療レジメンを施与する前記ステップが、組換えLAG3模倣体を定期投与により投与することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象に治療レジメンを施与する前記ステップが、化学療法剤プロブコールを投与することを含む、請求項13に記載の方法。
- プロブコールを投与する前記ステップが、3〜4ヵ月間の範囲内の定期投与を含む、請求項15に記載の方法。
- プロブコールを投与する前記ステップが、前記対象の余生にわたる定期投与を含む、請求項15に記載の方法。
- 組換えヒトLAG3を定期投与により投与する前記ステップが、ヒトLAG3タンパク質を投与することを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記コンパニオン治療薬が、抗炎症剤、前記対象におけるHDL−C機能、サイズ、および/または組成を改善する薬剤、前記対象における機能不全HDL−Cを減少させる薬剤、PCSK9阻害剤、ならびにLAG3模倣体からなる群から選択される任意の1つ以上の薬剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象を前記定期投与の間モニタリングしてLDL酸化ならびに血漿HDLコレステロールおよび血漿/血清サイトカインに対する効果を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記モニタリングが、包括的プロファイリングを用いる月1回の安全性検査およびEKGを含む、請求項18に記載の方法。
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