CN109716139A - 重组淋巴细胞活化基因-3的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白缺陷的风险评估的基础上对具有心血管疾病、其他慢性炎性疾病、心血管和/或非心血管性发病和死亡的风险的患者进行分类，以及单独地或与他汀类药物和/或抗高脂血症药物相组合使用重组淋巴细胞活化基因‑3或LAG3模拟物作为伴侣治疗剂来调停所述风险的方法。所述风险评估是双管齐下的，首先定性确定对象是否具有或易于发生炎性体的异常表达、炎症的高风险和/或功能失调的HDL，然后对所述LAG3基因的编码序列中出现的多态性进行定量测定或遗传筛查。倘若出现阳性指示，单独地或与胆固醇调节药物的治疗性使用相组合，使用重组LAG3和/或LAG3模拟物进行治疗。

Description

重组淋巴细胞活化基因-3的用途
与相关申请的交叉引用
本申请的优先权源自于2016年9月12日提交的美国专利申请系列号15/262,618。
发明背景
技术领域
本发明涉及对于疾病例如心血管和免疫疾病的疾病检测和治疗，更具体来说涉及一种用于在淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白缺陷的风险评估的基础上对具有心血管疾病、其他慢性炎性疾病以及心血管和非心血管性死亡的风险的患者进行分类的方法，以及使用重组淋巴细胞活化基因-3作为伴侣治疗剂来调停所述风险的方法。
背景技术
现在已公认动脉粥样硬化是一种慢性炎性疾病，具有被先天性和适应性免疫细胞浸润的冠状动脉血管和胆固醇斑块，最终引起血管堵塞和临床疾病[“动脉粥样硬化——未消解的炎症的问题”(Atherosclerosis-a matter of unresolved inflammation)，ViolaJ，Soehnlein O.s.l.：Semin Immunol.2015.Vol.27,pp.184-193]。许多心血管疾病(CVD)风险因子在临床上被用于评估患者中的动脉粥样硬化风险，包括高血压、糖尿病、脂质、年龄和性别[“国家胆固醇教育计划(NCEP)专家委员会关于成年人中高血液胆固醇的检测、评估和治疗的第三次报告，执行摘要”(Executive Summary.Third Report of the NationalCholesterol Education Program(NCEP)Expert Panel on Detection,Evaluation,andTreatment of High Blood Cholesterol in Adults)，s.l.：NIH Publication No.01-3670,2001]。在当前这个精准医疗的年代里，应该理解遗传病因也对CVD风险发挥重要影响。目前有大量基因组广度的关联性研究(GWAS)已鉴定到与CVD、特别是诸如动脉粥样硬化和心肌梗塞的疾病显著相关的已知和新的基因座[“人类心血管疾病的遗传学”(Geneticsof human cardiovascular disease)，Kathiresan S.Srivastava D.s.l.：Cell.2012.Vol.148,pp.1242-1257]。
已显示，SR-B1基因SCARB1(位于染色体12:q24.31上)内的rs10846744单核苷酸多态性(SNP)与亚临床动脉粥样硬化和CVD显著相关。在已授权的美国专利9,334,538中，发明人公开了一种对女性进行基因分型，以便鉴定SCARB1基因(位于染色体12:q24.31上)的rs10846744突变的存在的方法。在多种族动脉粥样硬化研究(Multi-Ethnic Study ofAtherosclerosis)(MESA)的参与者中，这与亚临床动脉粥样硬化(SCA)和偶发性心血管疾病(CVD)显著相关。具体来说，风险性C等位基因的携带者具有明显更高的偶发性CVD的几率，并且在多变量回归模型中，这种关系不被传统CVD风险因子例如年龄、体重指数、高血压、吸烟、肾病、他汀类药物的使用或脂质水平(不论是总胆固醇、LDL-胆固醇[LDL-C]、HDL-C还是甘油三酯)的包含所减弱。这些发现强烈地表明，其他因素或途径可能是这种遗传变体与偶发性CVD的关联性的原因。
有趣的是，rs10846744位于SCARB1的第一个内含子中，并且生物信息学分析揭示出这个SNP位于调控区内。数据表明，这个SNP可能在转录上调控同一染色体上的基因(染色体内)或进行染色体间调控。发明人探究了这种可能性，并且出现了大量受到转录调控的基因候选者。具体来说，其中之一即淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)，也位于12号染色体上，并被进一步研究。LAG3是T淋巴细胞活化的显著调控物[“淋巴细胞活化基因3/II类主要组织相容性复合物的相互作用调节CD4+T淋巴细胞的抗原性应答”(Lymphocyte-activation gene3/major histocompatibility complex class II interaction modulates theantigenic response of CD4+T lymphocytes)，Huard B,Tournier M,Hercend T.TriebelF,Faure F.s.l.：Eur J Immunol.1994,Vol.24.pp.3216-3221]。LAG3属于Ig超家族，并且是抗原呈递细胞的II类MHC分子的配体[“LAG-3：T-细胞和DC应答的调控物及其在治疗性疫苗接种中的用途”(LAG-3:a regulator of T-cell and DC responses and its use intherapeutic vaccination)，F.,Triebel.s.l.：TRENDS Immunol.2003.Vol.24.pp.619-622]。它在B细胞、T细胞和NK淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞(DC)中表达，并且它的主要功能被认为是通过控制效应T细胞扩增和体内平衡而作为活化的T细胞的负调控物[“LAG-3调控浆细胞样树突状细胞体内平衡”(LAG-3 regulates plasmacytoid dendritic cellhomeostasis)，Workman CJ,Wang Y,El Kasmi KC,Pardoll DM,Murray PJ,Drake CG,Vignali DA.s.l.：J Immunol,2009,Vol.182,pp.1885-1891；“CD4相关分子LAG-3(CD223)调控活化的T细胞的扩增”(The CD4-related molecule,LAG-3(CD223),regulates theexpansion of activated T cells)，Workman CJ,Vignali DA.s.l.：Eur JImmunol.2003,Vol.33.pp.970-979]。细胞表面的LAG3受到ADAM10和ADAM17金属蛋白酶切割，其产生可溶性LAG3(sLAG3)[“金属蛋白酶通过LAG-3调控T-细胞增殖和效应物功能”(Metalloproteases regulate T-cell proliferation and effector function viaLAG-3)，Li N,Wang Y,Forbes K,Vignali KM,Heale BS,Saftiq P,Hartmann D,Black RA,Rossi JJ,Blobel CP,Dempsey PJ,Workman CJ,Vignali DA.s.l.：EMBO,2007,Vol.26,pp.494-504]。
采取体外和离体方法，在来自于高α脂蛋白血症(HALP)对象的生物样本中检查了rs10846744与LAG3的关联性。已发现，rs10846744与LAG3和细胞内炎性体的标志物例如NLKP3的表达和功能的改变显著相关。
LAG3位于12号染色体上CD4基因座附近(chr 12:p13)，而rs10846744位于chr12:q24.32上。LAG3通过结合抗原呈递细胞上的II类MHC，具有与CD4相似的功能，如果不是与CD4竞争的功能的话[Sierro S,Romero P,Speiser DE.“CD4样分子LAG-3的生物学和治疗应用”(The CD4-like molecule LAG-3,biology and therapeutic applications)，Expert Opin Ther Targets 2011；15:91-101]。
Golden等人的“动脉粥样硬化、血栓形成和血管生物学”(Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology)，34:A359(2014)显示，SCARB1rs10846744风险(CC)等位基因的人类纯合携带者具有明显更低的血浆LAG3蛋白水平。体外研究揭示，风险(CC)淋巴细胞与参比(GG)淋巴细胞相比分泌更多的促炎性细胞因子(TNFα)和更少的抗炎性细胞因子(IL-10)。结果，这些相同的风险(CC)等位基因携带者显示出具有增加的颈动脉内膜中层厚度(cIMT)，这是CVD事件风险的一种已知代用物。
体外和体内鼠类研究表明，sLAG3调控II类MHC信号传导途径以限制T细胞活化和体内平衡，而几项临床研究显示出sLAG3与结核抗性[Lienhardt等，“非洲活动性结核病与体内Th1活性降低和Th2活性提高相关”(Active tuberculosis in Africa is associatedwith reduced Th1and increased Th2activity in vivo)，G.s.l.：Eur JImmunol.2002.Vol.32.pp.1605-1613]和乳腺癌预后[Triebel等，“在表达雌激素或孕酮受体的人类乳腺癌中，可溶性淋巴细胞活化基因-2(sLAG-3)蛋白作为预后因子”(A solublelymphocyte activation gene-2(sLAG-3)protein as a prognostic factor in humanbreast cancer expressing estrogen or progesterone receptors)，M-F.s.l.：CancerLetters,2006,Vol.235,pp.147-153]之间的相关性。在鼠类细胞中，Kisielow等人报道了活化的T细胞在B细胞上诱导LAG3表达[Kisielow M,Kisielow J,Capoferri-Sollami g,Karjalainen K,“B细胞上淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的表达由T细胞诱导”(Expressionof lymphocyte activation gene 3(LAG-3)on B cells is induced by T cells)，Eur JImmunol 2005；35:2081-2088]。他们确定了B细胞上LAG3的诱导是T细胞依赖性的，并且不依赖于其他刺激物例如未甲基化的CpG基序1826、细菌LPS或抗Ig抗体与抗CD40抗体和IL-4的组合。相反，在EBV转化的B细胞中检测到LAG3RNA和蛋白，其中在表达参比SCARB1rs10846744G等位基因的EBV转化的细胞中，与表达风险C等位基因的细胞相比具有明显更高的表达。尽管B淋巴细胞的EBV转化可以激活所述细胞，但在rs10846744基因型分层的基础上LAG3的表达水平存在显著差异。重要的是，其他人观察到在B细胞例如拉莫斯细胞中缺少LAG3表达(Baixeras E,Huard B,Miossec C,Jitsukawa S,Martin M,Hercend T,Auffray C,Triebel F,Piatier-Tonneau D,“淋巴细胞活化基因-3编码的蛋白的表征：人类白细胞抗原II类抗原的新配体”(Characterization of the lymphocyte activationgene 3-encoded protein.A new ligand for human leukocyte antigen class IIantigens)，J Exp Med 1992；176:327-337]。然而，发明人对这些细胞进行基因分型，并发现它们对于rs10846744变体来说是杂合的。更近些时候，Morales等人显示了在霍奇金淋巴瘤中阳性的EBV与LAG3基因表达的提高显著相关[Morales O,Mrizak D,Francois V,Mustapha R,Miroux C,Depil S,Decouvelaere AV,Lionne-Huyghe P,Auriault C,deLaunoit Y,Pancre V,Delhem N,“在霍奇金淋巴瘤患者中Epstein-Barr病毒感染引起1型调节性T细胞增加”(Epstein-Barr virus infection induces an increase of Tregulatory type 1 cells in Hodgkin lymphoma patients)，Br J Haematol 2014 July9，印刷前的电子出版物]。
使用鼠类模型的研究显示，当存在T细胞活化的抑制剂包括PD-1/PD-L1和PD-L2途径和调节性T细胞的缺陷时，动脉粥样硬化病变的尺寸和炎症增加[“动脉粥样硬化形成中的适应性免疫：新的见解和治疗方法”(Adaptive immunity in atherogenesis:newinsights and therapeutic approaches)，Lichtman AH,Binder CJ,Tsimikas S,WitztumJL,s.l.：J Clin Invest,2013,Vol.123,pp.27-36]。
Baixeras等人同上表征了LAG3在大量细胞系中的细胞分布，并证实了LAG3驻留在脂筏内。随后，Woo等人报道LAG3的细胞内分布，并发现LAG3在细胞内区室和细胞质膜之间同等地分布[Woo S-R,Li N,Bruno TC,Forbes K,Brown S,Workman C,Drake CG,VignaliDAA,“调节性T细胞蛋白LAG-3和辅助受体CD4的不同亚细胞定位”(Differentialsubcellular localization of the regulatory T-cell protein LAG-3 and thecoreceplor CD4)，Eur J Immunol 2010；40:1768-1777]。
通过使用流式细胞术，发明人确认了不论刺激条件如何，在表达rs10846744风险C的细胞的细胞表面上检测到低水平的LAG3。然而，在未刺激的rs10846744参比G细胞中，LAG3在细胞表面上表达，并且它的水平在刺激后显著提高。在EBV转化的B细胞中的这些结果与Woo等人同上所报道的结果相反，因为他们报道了LAG3仅在活化的T细胞中在表面上表达。
还已知，脂筏信号传导对于B细胞活化来说是必需的[Simons K,Toomre D,“脂筏和信号转导”(Lipid rafts and signal transduction)，Nat Rev Mol Cell Biol 2000；1:31-39]。具体来说，B细胞受体(BCR)的刺激引发CD79A和CD79B(与Ig-α/Ig-β异二聚体结合的跨膜免疫球蛋白(Ig)受体)的细胞质尾部中免疫受体的基于酪氨酸的活化基序(ITAM)的磷酸化[Schamel WW,Reth M,“B细胞抗原受体的单体和寡聚体复合物”(Monomeric andoligomeric complexes of the B cell antigen receptor)，Immunity.2000；13:5-14]。ITAM的磷酸化充当Syk的停靠位点，其由不同的Src家族激酶(SFK)包括Fyn、Blk和Lyn介导[Takata M,Sabe H,Hata A,Inazu T,Homma Y,Nukada T,Yamamura H,Kurosaki T,“酪氨酸激酶Lyn和Syk通过不同途径调控B细胞受体偶联的Ca2+动员”(Tyrosine kinases Lynand Syk regulate B cell receptor-coupled Ca2+mobilization through distinctpathways)，EMBO J.1994；13:1341-9]。Lyn是在B细胞活化后参与脂筏信号传导的重要蛋白质[Simons，同上]。这种活化引发由各种不同的细胞内信号传导分子包括Btk、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和PLCγ2构成的“信号体”的协调组装[Blix ES,Irish JM,Husebekk A,Delabie J,Forfang L,Tierens AM,Myklebust JH,Kolstad A,“磷酸特异性流式细胞术在难治性B-细胞淋巴瘤中鉴定到异常的信号传导”(Phospho-specific flow cytometryidentities aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma)，BMC Cancer 2012；12:478]。PLCγ2是在人类B淋巴细胞中表达的优势同种型[Coggeshall KM,McHugh JC,Altman A,“在B淋巴细胞中磷脂酶C-γ2的优势表达和活化诱导的酪氨酸磷酸化”(Predominant expression and activation-induced tyrosine phosphorylation ofphospholipase C-gamma 2in B lymphocytes)，Proc Natl Acad Sci U S A.1992；89:5660-4]。它对于BCR介导的磷酸肌醇水解和后续的生物化学事件包括PKC活化来说也是必不可少的[Sugawara H,Kurosaki M,Takata M,Kurosaki T,“1型、2型和3型肌醇1,4,5-三磷酸受体通过B-细胞抗原受体参与信号转导的遗传证据”(Genetic evidence forinvolvement of type 1,type 2and type 3inositol 1,4,5-trisphosphate receptorsin signal transduction through the B-cell antigen receptor)，EMBO J.1997；16:3078-88]。
II类MHC是LAG3的主要配体，并且后者以高亲和力结合到前者，它负调控T细胞的细胞增殖、活化和体内平衡，并且已报道在Treg的抑制功能中发挥作用。相反，通过一部分树突状细胞上的脂筏微区中的II类MHC在被可溶性LAG3(sLAG3)结合后的信号传导，引起树突状细胞活化。发明人现在已发现，淋巴细胞中的细胞内LAG3是调控磷酸化信号传导级联反应的起因。这是LAG3的独特且新颖的功能，不依赖于它的以前已知的结合到II类MHC受体的功能。
然而，与HDL粒子相关的主要载脂蛋白apoA-I，已显示通过经T淋巴细胞抑制单核细胞活化来抑制炎性细胞因子产生[Hyka N,Dayer J-M,Modoux C,Kohno T,Edwards IIICK,Roux-Lombard P,Burger D,“载脂蛋白A-I通过经T淋巴细胞阻断单核细胞的接触介导的活化来抑制白介素-1β和肿瘤坏死因子-α的产生”(Apolipoprotein A-I inhibits theproduction of interleukin-1βand tumor necrosis factor-αby blocking contact-mediated activation of monocytes by T lymphocytes)，Blood 2001；97:2381-2389]。具体来说，Hyka等人观察到apoA-I通过首先结合到表面因子来抑制从受刺激的单核细胞产生细胞因子，这暗示了apoA-I可能与表面LAG3相互作用的可能性。
SCARB1变体rs10846744与冠心病(CHD)的显著相关性被显示在Manichaikul等人的文献中(Arterioscler Thromb Vasc Biol 2012；32:1991-1999)。然而，以前的分析没有显示rs10846744与SCA和偶发性CVD直接相关。这是因为正如发明人已经发现的，LAG3是介导rs10846744与动脉粥样硬化疾病和CVD的关联性的重要免疫调控物。LAG3蛋白在效应和调控T细胞上的表达，可能通过阻断TCR与II类MHC的相互作用来抑制T细胞受体(TCR)介导的活化，并且浆细胞样DC上的LAG3蛋白可能通过其他机制间接地抑制效应T细胞。LAG3蛋白缺陷可能导致DC和巨噬细胞的炎性体介导的IL-1β和IL-18生产的提高，这是使T细胞分化偏向具有特化细胞因子潜力的炎性表型的两种细胞因子[“白介素-1家族：回到未来”(Theinterleukin-1 family:back to the future)，Garlanda C,Dinarello CA,Mantovani A,s.l.：Immunity,2013,Vol.39.pp.1003-1018]。
因此，预计小鼠(Lag3)和人类(LAG3)中的LAG3蛋白缺陷增强对高胆固醇血症的促动脉粥样硬化形成性T细胞应答，并导致斑块炎症提高和/或斑块生成增加。
由遗传变异造成的LAG-3蛋白的缺陷存在于人类中，并且它与动脉粥样硬化、其他慢性炎性疾病、心血管和/或非心血管性死亡显著相关，这一点并不明显。在LAG3在CVD和其他慢性炎性疾病中发挥的介导物作用的基础上，本发明公开了在某些SCARB1和LAG-3基因变异以及提高临床显著的动脉粥样硬化、其他慢性炎性疾病、慢性炎性疾病、功能失调的HDL、心血管和/或非心血管性发病和死亡的风险的其他遗传和非遗传因子的基础上，使用LAG3表达情况剖析作为生物标志物来评估具有CVD风险的患者的方法，以及使用新的重组LAG3伴侣治疗剂改善所述风险的方法。
在临床前以及临床研究中，IMP321(人类LAG3的二聚体可溶形式)的治疗活性是公知的。已显示，作为佐剂的hLAG3-Ig与化学治疗剂的组合优于任一种治疗本身。
此外，可以将LAG3的阻断与其他抑制性受体例如PD-1的阻断相组合，导致T细胞活性和针对疾病的保护作用增强。此外，可溶性重组二聚体LAG3蛋白的治疗活性在几个方面也是已知的[Sierro等，“CD4样分子LAG-3的生物学和治疗应用”(The CD4-like moleculeLAG-3,biology and therapeutic applications)，第3节]。在人类中，重组LAG3诱导DC活化并提供免疫佐剂活性(与膜结合形式的LAG-3的抑制活性相反)。Andreae等，“由淋巴细胞活化基因-3(CD223)诱导的树突状细胞的成熟和活化”(Maturation and activation ofdendritic cells induced by lymphocyte activation gene-3(CD223))，J Immunol,168:3874-80(2002)。
2002年6月25日授权的Triebel(Institut Gustave-Roussy)的美国专利6,410,509显示了hLAG3作为疫苗接种用佐剂和在癌症治疗中的用途，并且可溶性hLAG3的系统性给药直接诱导体内肿瘤生长的抑制(参见实施例IV)。同样地，2011年1月13日公布的Triebel(Immutep)的美国专利申请20110008331显示了定期使用重组LAG3来增强单核细胞介导的免疫应答，特别是在血液中引发单核细胞数目的增加。所述申请提到了“完全出人意料的”发现，即人类LAG3或其衍生物当接种到具有高度恶性肿瘤的患者中时，诱导强力的单核细胞依赖性免疫力。所述诱导的免疫力本身表现为血液单核细胞计数的显著增加。尽管使用hLAG3作为疫苗佐剂在已知的癌症患者中提高T-细胞计数，但尚未有人被激发去进行LAG3缺陷标志物的断然筛查，并且如果发现的话，通过使用重组人类LAG3在不同时间点定期给药以治疗潜在患者来改善随之而来的风险。发明人通过使用特定的2点表达情况剖析(突变和/或非遗传病因例如SCARB1rs10846744突变和/或LAG-3rs870849或其他遗传或非遗传病因和突变的组合)对具有心血管疾病、其他慢性炎性疾病、心血管和/或非心血管性发病和死亡风险的患者进行预筛查，然后使用重组人类淋巴细胞活化基因-3作为伴侣治疗剂实施定制治疗方案，做到了这一点。
发明内容
因此，本创新的目的是提供一种用于在淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白缺陷的基础上评估具有心血管疾病、其他慢性炎性疾病、心血管和/或非心血管性发病和死亡的风险的患者，以及利用包括使用重组人类淋巴细胞活化基因-3作为伴侣治疗剂的定制治疗方案来调停所述风险的新策略。
在一个实施方式中，所述方法包括对于对象发生心血管疾病的一种或多种风险因子进行定性预筛查的第一步骤，在来自于所述对象的样品中定量检测LAG3蛋白缺陷的第二步骤，以及使用重组人类淋巴细胞活化基因-3作为一种或多种药剂的伴侣治疗剂来治疗所述对象的第三步骤，所述一种或多种药剂选自：抗炎剂，在所述对象中改善HDL-C功能、尺寸和/或组成的药剂，在所述对象中减少功能失调的HDL-C的药剂，PCSK9抑制剂(已显示出急剧降低LDL胆固醇水平的一类新的药物)或任何其他降低胆固醇的生物制剂、改变胆固醇的小分子，通过结合到II类MGC分子来模拟LAG3的功能的药剂，模拟LAG3磷酸化信号传导效应的药剂，模拟LAG3在CD4+、CD8+T细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞、B regs和Tregs中的作用的结合或不结合II类MHC分子的药剂，以及模拟LAG3在细胞膜的脂筏中的作用的药剂。LAG3模拟物可以包括小分子药剂、微小RNA、寡核苷酸、生物制剂、活化抗体、影响DNA或RNA结构或柔性的影响LAG3转录调控的药剂，包括调控细胞内阳离子例如钾、钠、锂和钙的药剂。
从下面的优选实施方式及其某些改良的详细描述，本发明的其他目的、特点和优点将变得更加显而易见。
附图说明
当与附图一起来看时，从下面的优选实施方式及其某些改良的详细描述，本发明的其他目的、特点和优点将变得更加显而易见，在所述附图中：
图1是血浆sLAG3水平与SCARB1rs10846744显著相关的图。
图2是通过NMR波谱术获得的sLAG3与小HDL粒子相关的图。
图3是本发明的诊断方法的示例性实施方式的框图。
图4列出了适合的重组人类LAG3的登记号和序列表，所述LAG3可以是单体或二聚体形式。
图5的表2示出了血浆LAG-3(A)和HDL-C(B)的独立预测物MESA的多变量回归分析。
图6是在表达rs10846744参比G和rs10846744风险C的细胞中通过流式细胞术测量到的LAG3的细胞表面表达的细胞图。
图7是通过流式细胞术测量到的表达LAG3+rs10846744参比G和风险C的细胞的细胞表面表达的图解分析。
图8是在来自于表达rs10846744参比G和rs10846744风险C的细胞的培养基中LAG3蛋白水平随活化后时间的变化的图。
图9是在来自于表达rs10846744参比G-003和rs10846744风险C-008的细胞的培养基中分泌的细胞因子(TNFα和IL-10)水平随活化后时间的变化的图。
图10说明了LAG3蛋白在BCR信号传导中是多么关键，并且是影响磷酸化信号传导的原因。
图11说明了LAG3蛋白如何是脂筏中的特征性标志物。
图12是多变量回归分析的一组表格(表3-6)。
图13是在高脂肪喂食后小鼠中CD4+Lag3T细胞活化的图。
图14示出了Lag3裸细胞在Ldlr受体小鼠中的骨髓转移和随后喂食高脂肪饮食引起CD4+T细胞在主动脉根中明显更高的浸润。
图15示出了Lag3裸细胞在Ldlr受体小鼠中的骨髓转移与动脉粥样硬化病变尺寸增加和主动脉旁引流淋巴结中exTreg的百分率提高显著相关。
图16是重组人类可溶性单体LAG3以剂量响应性方式结合到表达II类MHC分子的小鼠B脾细胞的一组图。
图17是示出了重组人类可溶性单体LAG3与小鼠T细胞(其不表达II类MHC分子)相比以剂量响应性方式偏好性结合到小鼠B细胞(其表达II类MHC分子)的图。
图18示出了例如佛波酯、离子霉素和白介素-4。
优选实施方式的详细描述
本发明提供了用于确定对象是否患有或容易患上动脉粥样硬化、慢性炎性疾病、偶发性心血管疾病(ICD)、以炎性反应、心血管和/或非心血管性发病和死亡为特征的其他疾病的新颖方法和药剂盒，以及使用重组人类淋巴细胞活化基因-3作为一种或多种药剂的伴侣治疗剂通过定制的治疗方案来改善所述风险的新颖方法和药剂盒，所述一种或多种药剂选自抗炎剂、在所述对象中改善HDL-C功能、尺寸和/或组成的药剂、在所述对象中减少功能失调的HDL-C的药剂和/或模拟LAG3的所有功能的药剂。
当在本文中使用时，没有具体数目的指称包括复数指称物，除非上下文明确陈述不是如此。因此，例如，对“蛋白”的指称是指一种或多种蛋白，并且包括本领域技术人员已知的其等同物。通过“rs”名称对SNP的任何和所有指称例如rs10846744，在本文中合并了可以通过已知方法容易地检索的相关核苷酸序列。具体来说，rs10846744的核苷酸序列可以例如从NCBI的dbSNP Entrez数据库检索。SCARB1是指HDL受体基因清道夫受体B类1型-(SCARB1)，LAG3意味着免疫检查点抑制剂淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)。术语“佐剂”在本文中被定义为增强身体对抗原的免疫应答的物质。
发现数据
LAG3受到SCARB1rs10846744变体以及LAG3SNP和细胞代谢变化的转录控制。具体来说，出现在SCARB1和/或LAG3基因的编码序列中的多态性，可以用作疾病诸如感染、炎症、慢性炎性疾病、冠状动脉疾病、心血管和/或非心血管性发病和死亡的诊断预测物。发明人已使用RNA测序鉴定了免疫调节物LAG3在联系SCARB1内含子变体rs10846744与亚临床动脉粥样硬化和偶发性CVD的相关性的因果途径中发挥主要作用。验证实验确认了SCARB1rs10846744与LAG3的显著相关性。所述实验观察到与rs10846744参比G细胞相比，在来自于表达rs10846744风险C的细胞的培养基中sLAG3的水平明显更低。因此，不同的方法确认了在rs10846744风险C细胞中表达更少的LAG3蛋白。然后，发明人在EBV转化的B细胞中检查了LAG3的缺乏对下游信号传导途径如果具有任何影响的话可能具有什么影响。结果清楚地显示出在表达rs10846744风险C和rs10846744参比G的细胞之间脂筏信号传导的显著差异。在rs10846744C风险等位基因中不存在CD79A的磷酸化，指示了细胞膜的LAG3损伤作为原因抑制了引发近端和下游信号传导的受体之间的相互作用，进一步指示了LAG3在B细胞活化中的关键作用。重要的是过表达或沉默LAG3确认了LAG-3在下游信号传导中的因果作用，这是由发明人认识到的新的观察。将源自于RNA测序的数据和EBV转化的B细胞的LAG3的体外研究与表面LAG3被切割以产生sLAG3的知识相结合，发明人探索了在rs10846744变体的携带者之间血浆sLAG3水平是否有显著差异。
图1是血浆sLAG3水平与SCARB1rs10846744显著相关的图，并且示出了rs10846744参比GG与rs10846744风险CC等位基因的HALP携带者之间血浆sLAG3水平的显著差异。在动脉粥样硬化领域中，以前没有将HDL脂蛋白和/或亚级分与LAG3或sLAG3相关联。
没有观察到血浆apoA-I与rs10846744或sLAG-3的关联性，但发现了这些变量与小HDL粒子的显著关联性。
图2示出了通过NMR波谱术获得的sLAG3与小HDL粒子相关联的图。在来自于HALP对象的禁食血浆样品中，sLAG3水平与小HDL粒子反相关。这一数据不被rs10846744的携带者状态分层(P＝0.01，r＝0.27，n＝81)。此外，在许多大型临床研究中已将富含apoA-I且贫胆固醇的小的致密HDL粒子与CHD的高风险正相关。在从rs10846744风险C等位基因的携带者分离的细胞中，细胞内LAG3的表达和功能显著降低。更重要的是，在这些相同的携带者中循环sLAG3水平明显更低，正如在HALP中测量到的。总而言之，LAG3这种重要的免疫调控物已被鉴定为受到rs10846744变体以及LAG3rs870849和非遗传学原因的转录控制。
诊断方法
总的来说，本发明的方法需要双管齐下的诊断，首先通过症状表现或根据非遗传学原因定性预筛查对象是否患有或易于患上动脉粥样硬化、慢性炎性疾病、偶发性心血管疾病(ICD)、心血管和/或非心血管性发病和死亡以及以炎性反应为特征的其他疾病。如果产生定性指示，所述诊断继续在血液样品的基础上进行定量查询。所述样品可以通过测定法或通过遗传测试进行分析。更具体来说，可以使用ELISA测定法或由本领域技术人员确定的其他蛋白测定法通过血浆、血清或其他生物流体测量来确定LAG3蛋白缺陷。或者，可以通过SCARB1突变例如rs10846744或LAG3 rs870849或不利地影响LAG3蛋白的表达和功能的其他SNP/插入/缺失或非遗传学原因的测量，来确定LAG3蛋白缺陷。为了确定SR-B1基因的一个或多个多态性区域的特定等位基因变体的存在，需要对来自于对象的生物学样品进行遗传筛查，以确定隐含的SCARB1突变rs10846744的存在。SR-B1(SCARB1)是HDL胆固醇的主要受体，并在胆固醇反向运输(从细胞移除并最终通过肝脏处置)中发挥重要作用。SR-B1在肝脏和生成类固醇的组织例如卵巢中高度表达。SR-B1据认为在维持胆固醇储存以备甾类生产中是关键的。如果表达情况剖析包含1)非遗传学原因加上2)测定法/突变的标志物组合，则在阳性预筛查指示后进行使用重组淋巴细胞活化基因-3作为伴侣治疗剂的定制治疗方案(下文)。
图3是本发明的诊断方法的示例性实施方式的框图，其始于步骤10，对对象的动脉粥样硬化、慢性炎性疾病、偶发性心血管疾病(ICD)、心血管和/或非心血管性发病和死亡、在服用他汀类药物或其他降胆固醇药物时心脏病发作的经历或以炎性反应、炎性体的异常表达和/或功能失调的HDL为特征的其他疾病的症状或非遗传学原因的易感性进行初始预筛查/定性诊断。
倘若初始预筛查为阳性，则在步骤20处进行来自于对象的血浆或血清样品的基线蛋白测定和/或遗传筛查，以确定淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的低水平表达的存在。测量LAG3表达并与应该为血浆水平≤3400pg/ml的低LAG3的基线阈值进行比较。这种LAG3表达情况剖析为炎性体、慢性炎性疾病和功能失调的HDL的进一步评估提供了正标志物。由LAG3缺陷造成的促炎性状态为与慢性炎症相关的疾病包括自体免疫疾病、动脉粥样硬化、2型糖尿病、与衰老相关的黄斑变性和阿兹海默氏病提供了新颖的蛋白质标志物。鼠类和人类淋巴细胞活化基因-3测定法可以通过可商购的鼠类Lag3和人类LAG3ELISA试剂盒来实施。
在步骤50处，并且倘若出现SCARB1 rs10846744或LAG3 rs870849突变的疑似存在的双阳性指示，则对患者潜在的SCARB1 rs10846744或LAG3 rs870849突变进行遗传确认。所述SCARB1 rs10846744或LAG3 rs870849突变的存在可以通过各种不同的已知方法包括基因分型来确认。基因分型可以通过标准血液测试的DNA测序，通过直接突变分析来进行。基因组DNA从纯化的全血样品制备，以从所述血液样品分离DNA。DNA的纯度和数量可以通过分光光度法来检查。将DNA添加到板，并使用寡核苷酸-连接测定法(例如，是用于SNP基因分型的一种适合的平台，由Applied Biosystems销售，Foster City,CA,USA)按照制造商的指南进行基因分型。所述寡核苷酸-连接测定法使用荧光染料标记的探针来指示SCARB1 rs10846744突变或LAG3rs870849突变的存在。在筛查SR-BI基因的一个或多个多态性区域的特定等位基因变体的存在中有用的其他方法包括例如DNA测序、杂交技术、基于PCR的测定法、基于荧光染料和淬灭剂的PCR测定法(Taqman PCR检测系统)、基于RFLP的技术、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、化学错配切割(CMC)、基于异源双链体分析的系统、基于质谱术的技术、侵入性切割测定法、多态性比率测序(PRS)、微阵列、滚环延伸测定法、基于HPLC的技术、基于DHPLC的技术、寡核苷酸延伸测定法(OLA)、基于延伸的测定法ARMS(扩增阻滞突变系统)、ALEX(扩增阻滞突变线性延伸)、SBCE(单碱基链延伸)、分子信标测定法、侵入者(Third wave technologies)、连接酶链反应测定法、基于核酸酶测定法的技术、杂交毛细管阵列电泳(CAE)、焦磷酸测序、蛋白质截短测定法(PTT)、免疫测定法、单倍型分析和固相杂交(斑点印迹、反向斑点印迹、芯片)等。一种类型的筛查方法是使用与多态性位点交叠并具有多态性区域周围的约5、10、20、25或30个核苷酸的探针进行的等位基因特异性杂交。在本发明的一个实施方式中，将能够特异性杂交到等位基因变体的几种探针附连到固相支持物例如“芯片”。寡核苷酸可以通过各种不同的方法包括光刻法结合到固相支持物。事实上，芯片可以容纳多达250,000个寡核苷酸
在一个实施方式中，芯片包含SCARB1和/或LAG3基因的至少一个多态性区域的所有等位基因变体。然后将固相支持物与试验核酸相接触，并检测与特异性探针的杂交。因此，可以在简单的杂交实验中鉴定一个或多个基因的大量等位基因变体的身份。
在某些筛查方法中，在鉴定等位基因变体之前必须首先扩增SCARB1或LAG3基因的至少一部分。扩增可以按照本领域中已知的方法例如通过PCR来进行。在一个实施方式中，将细胞的基因组DNA暴露于两种PCR引物并扩增足以产生所需量的扩增DNA的循环数。由于SNP构成变异位点，侧翼是不变序列的区域，因此它们的分析只需要确定所述变异位点处存在的单核苷酸的身份，并且不必确定每位患者的完整基因序列。已开发了几种方法以便于这种单核苷酸多态性的分析。本文中描述的方法可以例如通过使用预包装的诊断试剂盒例如上面描述的试剂盒来进行，所述试剂盒包含本文中描述的至少一种探针或引物核酸，其可以被方便地用于例如确定对象是否患有与特定SCARB1和/或LAG3等位基因变体相关的疾病或具有发生所述疾病的高风险。本发明的方法，包括用于鉴定对象的SR-BI基因中等位基因变体或SNP的存在的方法，可以使用本领域中公知的方法与其他信息或参数相组合，以协助鉴定具有LAG3蛋白缺陷的对象。
倘若得以确认，则在步骤90处，本发明的方法启动胆固醇药物普罗布考的治疗有效的方案，其与步骤95处的重组LAG3的方案相组合并在同时进行。所述重组LAG3是全长或如下所述的可溶性截短形式的重组人类LAG3或LAG-模拟物。作为伴侣治疗剂，所述LAG3或LAG3模拟物与胆固醇药物协同工作，以治疗被发现具有LAG3蛋白缺陷的患者。所述LAG3模拟物可以是模拟LAG3功能的任何适合药剂，包括小分子药剂、微小RNA、寡核苷酸、生物制剂、活化抗体、影响DNA或RNA结构或柔性的药剂或影响LAG3转录调控的药剂，包括调控细胞内阳离子例如钾、钠、锂和钙的药剂。通过从特定的天然存在的人类LAG3序列构建包括LAG3序列的表达载体来表达模拟所述特定的天然存在的人类LAG3蛋白的性质的重组蛋白，有可能复制淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的功能。出于本说明书的目的，术语“LAG3模拟物”包括合成的LAG3蛋白以及模拟LAG3磷酸化信号传导效应的任何其他已知的分子或药剂，模拟LAG3在CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞、B细胞和NK细胞中的功能并且结合或不结合II类MHC分子的药剂，以及模拟LAG3在细胞膜的脂筏中的作用的药剂。普罗布考治疗的示例性方案包括3至4个月的低剂量治疗(250mg/天)，甚至更优选地包括1至2个月的所述治疗。与LAG3诊断测试相组合使用的治疗策略包括现有技术的与自体免疫疾病、动脉粥样硬化、血脂异常、心血管疾病、2型糖尿病、与衰老相关的黄斑变性和阿兹海默氏病相关的疗法。例如，本发明的方法在步骤30处启动胆固醇药物普罗布考的治疗有效的方案。普罗布考治疗的示例性方案可以包括3至4个月的低剂量治疗(250mg/天)，甚至更优选地包括1至2个月的所述治疗。
所述重组LAG3可以是鼠类Lag3或人类LAG3蛋白或作为全长的完整的521个氨基酸的蛋白或作为在血浆、血清或其他生物流体中测量到的截短的可溶形式的化学合成的LAG3模拟物。化学合成必须被进行成使得不引入实质性影响正常蛋白的表达和功能的插入、缺失、过早的终止密码子或错义突变。登记号和序列表示出在图4中。所述LAG3伴侣治疗剂或LAG3模拟物可以通过静脉内输注、SQ注射、通过外部泵的SQ输注、可植入泵(即腹膜胰岛素泵)、肌肉内、吸入、鼻内、心室内、栓剂(阴道和/或直肠)、表面霜剂、表面凝胶、表面贴片、脊柱、舌下、口、胃灌洗、肺灌洗来给药。递送可以采取纯的形式，或者采取与赋形剂一起包括Ig、白蛋白、糖基化、聚乙二醇化等进行。
最后，在步骤100处，监测包括每个月进行带有全面情况剖析的安全性实验室测试和EKG，以确定对LDL氧化和血浆-HDL胆固醇和血浆/血清细胞因子的影响。本领域技术人员将会容易地理解，其他适合的治疗策略可用于治疗这些遗传和非遗传筛查的个体，包括但不限于任何其他胆固醇和甘油三酯调节药物、促孕和雌激素和雌激素样药物以及与普罗布考相似的用于降低HDL胆固醇水平和作为抗氧化剂的药物。连同或不连同其他治疗剂的使用重组人类LAG3的治疗，预期将是终生疗法。
不需进一步详细阐述，相信本领域技术人员使用上面的描述可以在最充分的程度上利用本发明。为了确保这一点，下面给出了实施例。
实施例1-材料和方法：
在临床研究中招收年龄在18-80岁之间并且禁食血浆HDL-C水平≥60mg/dl(HALP)的成年社区居民。所述群体为中年，并且主要是白人女性。在招收时，研究对象都未用处方或非处方降胆固醇药物治疗。对象同意提供过夜禁食血液样品用于脂类分布情况的分析、用于SCARB1基因分型的DNA分析和从血沉棕黄层(buffy coat)分离淋巴细胞。将单向方差分析用于分类协变量的多重比较，并将学生t-检验用于两个样品的分析。为了评估作为连续变量的时间的影响，使用时间作为依赖性因素进行二次多项式回归。概率值≤0.05被认为是统计学显著的。纯合rs10846744变体的频率与以前在动脉粥样硬化的多种族研究中所描述的比率相近。转录组分析揭示出LAG3的差异表达。由于如通过ENCODE数据库[http://genome.ucsc.edu/]的生物信息学筛查所示rs10846744位于SCARB1的调控区内，因此发明人首先检查了在基本(未刺激)条件下培养的表达rs10846744参比GG与风险CC等位基因的B细胞之间是否存在转录差异。由于rs10846744在12号染色体的长臂上，因此我们检查了也位于12号染色体上的靶(顺式)的转录差异。与rs10846744参比GG细胞相比，在rs10846744风险CC细胞中5个基因转录本被显著下调，并且3个基因转录本被上调。除了12号染色体上的转录组差异之外，我们还观察到染色体间转录差异，其包括细胞内炎性体标志物例如NLRP3(反式)的显著上调。在表达rs10846744风险C的细胞中LAG3表达明显更低。为了测量活化后细胞表面LAG3表达的变化，将细胞首先在含有和不含有肉豆蔻酸乙酸佛波酯(PMA)/离子霉素+白介素-4(IL-4)的情况下温育，然后通过流式细胞术测量LAG3。
图6对使用流式细胞术测量的表达rs10846744参比G和rs10846744风险C的细胞中LAG3的差异表达进行了作图。将对于rs10846744参比G或rs10846744风险C等位基因纯合的转化的B淋巴细胞在基本或刺激混合物(佛波酯500ng/ml，离子霉素250ng/ml，IL-4100U/ml)条件下温育0-4h，并用同种型对照或抗LAG3抗体染色用于细胞表面LAG3蛋白的测量，然后固定用于流式细胞术。
小组(panel)I：用同种型对照或LAG3抗体染色的在基本和刺激条件下的rs10846744参比G-003细胞；数据代表了三个独立实验；
小组II：用同种型对照或LAG3抗体染色的在基本和刺激条件下的rs10846744风险C-008细胞；数据代表了三个独立实验。
图7是通过流式细胞术测量的LAG3+细胞的细胞表面表达的图形分析。
小组I代表了来自于rs10846744参比G-003细胞系的三个独立实验的合并数据(平均值±SE)，每个实验使用三份平行样进行(n＝9，与基线相比p<0.0001)。
小组II代表了来自于所有rs10846744参比G细胞系的合并数据(平均值±SE)(n＝18，与基线相比p<0.0001)。
小组III代表了来自于rs10846744风险C-008细胞系的三个独立实验的合并数据(平均值±SE)，每个实验使用三份平行样进行(n＝9，p＝0.06)。小组IV代表了来自于所有风险C细胞系的合并数据(平均值±SE)(n＝15，p＝0.04)。
图8是来自于表达rs10846744参比G和rs10846744风险C的细胞的培养基中LAG3蛋白的水平随活化后时间的变化的图。
小组I代表了来自于rs10846744参比G-003细胞系的三个独立实验的合并数据(平均值±SE)，每个实验使用三份平行样进行(n＝9，与基线相比p<0.0001)，以及代表了来自于rs10846744风险C-008细胞系的三个独立实验的合并数据(平均值±SE)，每个实验使用三份平行样进行(n＝9，p＝0.06)。
小组II代表了来自于所有rs10846744参比G细胞系的合并数据(平均值±SE)(n＝18，与基线相比p<0.0001)和来自于所有rs10846744风险C细胞系的合并数据(平均值±SE)(n＝15，p＝0.04)。
图9是在表达rs10846744参比G-003和rs10846744风险C-008的细胞的培养基中分泌的细胞因子(TNFα和IL-10)的水平随活化后时间的变化的图。
小组I代表了来自于rs10846744参比G-003细胞系的三个独立实验的TNFα合并数据(平均值±SE)，每个实验使用两份平行样进行(n＝6，与基线相比p<0.0001)。
小组II代表了来自于rs10846744风险C-008细胞系的三个独立实验的TNFα合并数据(平均值±SE)，每个实验使用两份平行样进行(n＝6，与基线相比p<0.0001)。小组III代表了来自于rs10846744参比G-003细胞系的IL-10合并数据(平均值±SE)，每个实验使用两份平行样进行(n＝6，与基线相比p＝0.02)，而小组IV代表了来自于rs10846744风险C-008细胞系的三个独立实验的IL-10合并数据(平均值±SE)，每个实验使用两份平行样进行(n＝6，p<0.0001)。
合在一起参考图6-9，在基线时，与rs10846744参比G细胞(26.3±2.6，p<0.0001)相比，表达rs10846744风险C的细胞(2.02±2.8)中LAG3的细胞表面表达低92％。在用PMA/离子霉素+IL-4刺激后，与基线水平相比，在表达rs10846744参比G(p<0.0001，003细胞系和合并的所有细胞)和rs10846744风险C的细胞(对于008细胞来说p＝0.06，对于合并的所有细胞来说p＝0.04)中细胞表面LAG3表达随时间显著降低(图7)。平行地，与在表达rs10846744风险C-008的细胞中观察到的没有变化(图8)相比，在来自于rs10846744参比G-003细胞的培养基中LAG3水平随时间增加(p＝0.03，小组I)。然而，当将合并的表达rs10846744参比G的细胞与合并的表达rs10846744风险C的细胞相比时，在LAG3培养基水平上没有统计学显著的差异(图8，小组II)。与表达rs10846744参比G-003的细胞相比，在表达rs10846744风险C-008的细胞中培养基中的TNFα和IL-10的水平随时间明显更高(图9)。
图10说明了LAG3在BCR信号传导中是多么关键。从在基础或混合物刺激(佛波酯500ng/ml，离子霉素250ng/ml，IL-4 100U/ml)条件下2h的表达rs10846744参比G或rs10846744风险C等位基因的转化的B细胞分离全细胞裂解物。通过添加等体积的裂解缓冲液终止反应，并用所指示的总抗体和磷酸化抗体进行印迹分析。示出的结果来自于3份平行合并样的一个代表性实验。
图10(A)：Ramos细胞系、GG(003)或CC(008)细胞：与参比G等位基因细胞中未受刺激的条件相比，受刺激的G等位基因细胞中归一化到相应的总蛋白后的磷酸化信号传导，p-CD79A(p＝0.04)、p-CD19(p＝0.04)、p-Syk(p＝0.005)、p-Lyn(p＝0.001)、p-ΡLCγ2(p＝0.004)和p-ΡKCβ(p＝0.003)。
图10(B)：与在相应的等位基因中表达模拟载体的细胞相比，未刺激的细胞中的BCR信号传导和慢病毒LAG3-GFP或shRNA-LAG3的过表达：CC细胞p-Lyn(p＝0.04)，p-ΡKCβ(p＝0.03)；GG细胞p-Lyn(p＝0.04)，p-ΡKCβ(p＝0.01)。
图10(C)：与在风险C等位基因中表达模拟载体的刺激过的细胞相比，在刺激过的细胞中的BCR信号传导和慢病毒LAG3-GFP或shRNA-LAG3的过表达：CC细胞，p-Lyn(p＝0.01)，p-ΡKCβ(p＝0.01)。与在参比G等位基因中表达模拟载体的刺激过的细胞相比，在刺激过的细胞中的GG细胞中的用于沉默LAG3的短发夹RNA，p-Lyn(p＝0.002)，p-ΡKCβ(p＝0.009)。示出的结果来自于3份平行合并样的一个代表性实验。
在刺激后，与未刺激的条件相比，在表达rs10846744风险C的细胞中没有检测到任何磷酸化的靶，而在rs10846744参比G细胞中所有靶均显著表达，p-CD79A(p＝0.04)、p-CD19(p＝0.04)、p-Syk(p＝0.005)、p-Lyn(p＝0.001)、p-ΡLCγ2(p＝0.004)和p-ΡKCβ(p＝0.003)。
LAG3的过表达或沉默影响下游信号传导途径
为了直接评估LAG3对下游信号传导途径的影响，我们进行了实验，其中在表达rs10846744风险C的细胞(其具有降低的LAG3水平)中LAG3被过表达，或者在表达内源LAG-3蛋白的表达rs10846744参比G的细胞中沉默LAG3。
如图10(B)中所示，在基础或受刺激的rs10846744风险C细胞中LAG3的过表达，与相比于对照细胞(它们是用空载体转染的细胞)磷酸化的靶的水平显著提高相关(在未受刺激的细胞中对于p-Lyn来说p＝0.04，对于p-ΡKCβ来说p＝0.03；在受刺激的细胞中对于p-Lyn来说p＝0.01，对于p-ΡKCβ来说p＝0.01)。LAG3的沉默与相比于对照细胞来说rs10846744参比G细胞中磷酸化的靶的水平显著降低相关(在受刺激的细胞中对于p-Lyn来说p＝0.002，对于p-ΡKCβ来说p＝0.009)(图8(C))。
rs10846744风险C等位基因的携带者具有明显更少的血浆可溶性LAG3(sLAG3)。考虑到在表达rs10846744风险C的细胞中LAG3的表达和功能降低，我们接下来确定了在从参比G和风险C等位基因的HALP携带者分离的血浆中LAG3蛋白水平是否显著不同；这个研究组构成所述发现组群。
图11显示在表达rs10846744风险C的细胞中，脂筏中的LAG3表达降低并且下游信号传导受损。由于已显示LAG3位于被活化的细胞中的脂筏中并影响下游磷酸化信号传导，因此发明人测试了这种LAG3下调是否影响下游信号传导途径。在rs10846744风险(CC)细胞中在脂筏中没有鉴定到LAG3，不论细胞是在基础状态下还是用PMA/离子霉素/IL-4刺激。使用改良的用于碳酸钠提取的匀浆裂解液的三步蔗糖密度梯度，从在基础或刺激条件(佛波酯PMA 500ng/ml，离子霉素250ng/ml，IL-4 100U/ml)下的Epstein Barr病毒(EBV)转化的B细胞分离脂筏。使用特异性抗体，通过免疫印迹确定了下述靶的表达：LAG3，LYN和FLOT2(脂阀结构蛋白)(均为脂筏标志物)。与基础条件(A，第2-3道)相比，LAG3蛋白的表达(归一化到FLOT2)集中到受刺激的参比(GG)细胞的脂筏级分(B，第2-3道)，N＝3，p＝0.03。在风险(CC)细胞中没有检测到LAG3蛋白，不论是在基础(C，第2-3道)还是受刺激条件下(D，第2-3道)。使用双侧学生t-检验来分析结果，并且所述印迹代表了三个独立实验之一。P值小于0.05被认为是显著的。
如上所指示的，图1显示了血浆sLAG3水平与SCARB1 rs10846744显著相关。正如在图1(A)中看到的，与参比G等位基因纯合对象(GG：10,169±1120pg/ml，n＝96)或杂合对象(GC：11,139±2288pg/ml，n＝23)相比，在风险C等位基因纯合的对象(CC：3430±2339pg/ml，n＝22，p＝0.03)中血浆sLAG-3水平明显更低。
Rs10846744和sLAG3与脂类亚级分的关联性
发明人接下来探索了rs10846744和sLAG3与脂类水平和HDL亚级分的关联性。在该HALP群体中，没有观察到rs10846744或sLAG-3与总胆固醇、LDL-C、甘油三酯或HDL-C的关联性(数据未示出)。同样地，我们没有观察到rs10846744或sLAG3与血浆载脂蛋白(apoA-I、apoA-II、apoB、apoCI、apoCII、apoC-III和apoE)的关联性。当通过NMR波谱术测量时，观察到rs10846744与HDL亚级分的显著关联性。
再次参考图2，所述图显示出当通过NMR波谱术测量时，rs10846744与中和小HDL粒子显著相关。所述中和小HDL粒子通过NMR波谱术，在从对于rs10846744的参比G等位基因纯合的和风险C等位基因纯合的携带者分离的禁食血浆样品中测量。示出的值是中和小HDL粒子(μmoL/L)和HDL尺寸(nm)的平均值±标准偏差。
种族/民族、SCARB1rs10846744和其他协变量是MESA中血浆LAG3水平的独立预测物。在多变量回归模型中，保留了种族(p＝0.0005)、年龄(p＝0.003)、脂类药物(p＝0.03)、rs10846744基因型(p＝0.002)和吸烟状态(p<0.0001)作为血浆LAG3水平的独立预测物(图5，表2A)。即使在用年龄(p＝0.006)、性别p<0.0001)、BMI(p<0.0001)、TG(p<0.0001)、酒精使用(p<0.0001)、HgbAlc(p＝0.01)和收缩BP(p＝0.03)调整后，血浆LAG-3(p<0.007)仍然是HDL-C水平的独立预测物(图5，表2B)。
多变量逻辑回归分析揭示出血浆LAG3不与亚临床动脉粥样硬化(cIMT)(p＝0.25)或冠状动脉钙评分(CAC)(p＝0.062)显著相关。图12的表3是显示了在MESA参与者中血浆LAG3与CHD的关联性的多变量回归分析。协变量包括种族、祖先的PC、年龄、研究地点、性别、HgbAlc、BMI、脂类药物、脂类(TC和LDL-C)、每年吸烟包数、收缩BP和舒张BP。估算的LAG3系数(SE)为-0.078(0.034)。对于LAG3来说，通过将所述变量的第一四分位数与第三四分位数进行比较，估算了优势比。对于其他连续变量来说，通过将所述变量的第三四分位数与第一四分位数进行比较，估算了优势比。*N＝4707，*p<0.0001；**p＝0.02；+p＝0.0002；++p＝0.04；&p＝0.002；&&p＝0.03；#p＝0.05。
多变量逻辑回归分析揭示出除了传统的风险因子例如年龄(p<0.0001)、性别(p<0.0001)、收缩血压(p＝0.0002)、LDL-C(p＝0.02)、TC(p＝0.04)、脂类药物(p＝0.002)、HgbAlc(p＝0.03)和吸烟(p＝0.05)之外，血浆LAG3(β-0.078，OR 1.15，p＝0.02)也是CHD的独立预测物。
在MESA组群中HDL-C≥60mg/dl的参与者的发生率为26％，并且在这个组中，CHD的发生率为4％，并且在种族/民族组之间不显著。具有CHD的对象中的HDL-C水平(n＝55，72.4±1.6mg/dl)与不具有CHD的对象(n＝1387，71.8±0.3mg/dl，p＝0.71)相比没有显著差异。然而，具有CHD的对象中的血浆LAG3水平(843.3±540.1pg/ml，n＝55)与不具有CHD的对象(1828±107.6pg/ml，n＝1386，p＝0.04)相比低2倍。在逻辑回归分析中，保留了血浆LAG3(β-0.212，OR 1.45，p＝0.004)、年龄(p＝0.006)、性别(p＝0.001)和舒张血压(p＝0.03)作为CHD的独立预测物。图12的表4是显示了在HDL-C≥60mg/dl的MESA参与者中血浆LAG3与CHD的关联性的回归分析。协变量包括种族、祖先的PC、年龄、研究地点、性别、HgbAlc、BMI、脂类药物、脂类(TC和LDL-C)、每年吸烟包数、收缩BP和舒张BP。估算的LAG3系数(SE)为-0.212(0.073)。对于LAG3来说，通过将所述变量的第一四分位数与第三四分位数进行比较，估算了优势比。对于其他连续变量来说，通过将所述变量的第三四分位数与第一四分位数进行比较，估算了优势比。*N＝1134，p＝0.004，**p＝0.006；+p＝0.001；++p＝0.03(表4)。
发明人还研究了在MESA组群中血浆LAG3与弗雷明汉风险评分相比是否显著影响CHD风险预测。图12的表5是似然率检验，其将模型2(对数变换的血浆LAG3)与模型1(弗雷明汉风险评分，用于估算个体的10年心血管风险)进行了比较。表5表明在预测CHD风险中包含血浆LAG3提供了显著的附加信息(p＝0.039)。模型3和4对研究地点、种族和祖先的PC进行了调整：将模型4与模型3进行比较的似然率检验证实了在预测CHD风险中包含LAG3提供了显著的附加信息(p＝0.044)。在图12的表5中可以看到，与弗雷明汉风险评分相比血浆LAG3提高了CHD风险预测(p＝0.039)。当所述模型包括对研究地点、种族和祖先的PC的调整时，血浆LAG3仍然是明显的CHD风险预测物(p＝0.04)。
鉴于观察到来自于培养的B细胞的LAG3与炎性标志物之间的显著关联性，发明人探究了血浆LAG3与MESA数据集中可用的炎性标志物是否相关。图12的表6显示了MESA参与者中血浆LAG3与炎性标志物的关联性。回归模型对年龄、性别、研究地点、种族和祖先的PC进行了调整。将所有结果变量和血浆LAG3进行对数变换。sTNFαR＝可溶性TNFα受体；hs-CPR＝高敏感性C反应蛋白。正如在表6中看到的，在多变量回归分析后，血浆LAG3与IL-10正相关(p<0.0001).
总而言之，这确立了这种新策略的用途，其用于定性预筛查对象发生心血管疾病的一种或多种风险因子，第二步是定量检测LAG3蛋白缺陷，其通过对初筛查进行基因分型以检测SCARB1rs10846744和/或LAG3rs870849突变的存在，或通过测量血浆/血清LAG3以鉴定水平低于3400pg/ml的患者，然后实施定制治疗方案以调停所述疾病。
实施例2-材料和方法：
在所有实验中使用的培养基是增补有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640(都购自Life Technologies,Carlsbad,CA)。对于淋巴细胞刺激来说，12-肉豆蔻酸乙酸佛波酯(PMA)和离子霉素钙盐购自Sigma-Aldrich(St.Louis.MO)，而白介素-4(IL-4)购自PeproTech(Oak Park,CA)。LAG3和同种型对照荧光团偶联的单克隆抗体购自Biolegend Inc.(San Diego,CA)。用于信号传导的抗体购自Cell SignalingTechnologies(Beverly,MA)：抗CD79A抗体(#3351)，抗磷酸化CD79A抗体(Y182)(#5173)，抗CD19抗体(#3574)，抗磷酸化CD19抗体(Y531)(#3571)，抗Syk抗体(#2712)，抗磷酸化Syk抗体(Y525/526)(#2710)，抗Lyn抗体(#2796)，抗磷酸化Lyn抗体(Y507)(#2731)，抗PLCγ2抗体(#3872)，抗磷酸化PLCγ2抗体(Y759)(#3874)，抗磷酸化PKCα/βII抗体(T638/641)(#9375)。抗PKCβ抗体(Santa Cruz Biotechnology.Santa Cruz,CA sc-210)和抗β-肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis.MO)被单独地购买。
将从HALP对象分离的淋巴细胞使用Epstein Barr病毒进行永生化，以产生B淋巴细胞(University of North Carolina Lineberger Comprehensive Cancer CenterTissue Culture Facility,Chapel Hill,NC)。将EBV转化的B淋巴细胞以每ml含有L-谷氨酰胺的完全RPMI 1640培养基～1-2 x 106个细胞的密度悬浮生长，所述培养基增补有10％FBS和1％青霉素-链霉素。在将细胞用于实验之前，所述培养基根据需要每周更换两次或更加频繁。
从对参比G等位基因纯合的三位HALP对象和对风险C等位基因纯合的三位HALP对象分离总RNA，然后使用Perkin Elmer下一代测序平台(RNA-Seq)(Perkin Elmer,BranfordCT)进行全转录组测序。生物信息学分析使用Perkin Elmer Gene Sifter软件程序来进行。通过选择总图谱读出、品质读出>20、对数变换并使用Benjamini Hochberg来校正多重试验，对数据进行调整。感兴趣的RNA靶使用标准的方法通过实时PCR和蛋白质印迹来确认。对分开的6个细胞系进行RNA-Seq，所述细胞系的条件为细胞在血清中培养(正常培养条件)和在用佛波酯(ΡΜA 500ng/ml)、离子霉素(250ng/ml)和IL-4(100U/ml)刺激6h后。
使用多种测定法在6个EBV转化的B细胞系中评估LAG3表达和功能。
流式细胞术。流式细胞术在10激光流式细胞仪(Becton Dickson,FranklinLakes,NJ)上进行。死细胞用蓝色死细胞染色试剂盒(Molecular Probes,Eugene,OR)染色。为了测量受刺激的B细胞中的LAG3响应，我们首先修改并优化了以前由Smeland等人(1)发表的方案。将细胞在含有和不含PMA(500ng/ml)、离子霉素(250ng/ml)和IL-4(100U/ml)的情况下温育不同的时间段(0-4h)。细胞表面LAG3表达的细胞表面变化百分数，通过仅使用活细胞级分，然后从用单克隆LAG3抗体处理的细胞的染色百分数值中减去同种型染色百分数值来计算。
分泌到培养基中的细胞因子：使用XMAP技术，在Luminex 200上通过multiplex(Milliplex；Millipore,Temecula.CA)来测量从在基本和刺激条件下培养不同时间段(0-4h)的细胞分离的培养基等分试样中白介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平。
蛋白质印迹：我们使用蛋白质印迹来测量下述已知在受刺激的B细胞中参与下游信号传导的蛋白质的总的和磷酸化的表达：p-CD79A，p-CD19，p-Syk，p-Lyn，p-PLCγ2和p-PKCβ。在某些实验中，我们也将细胞用CD40配体(CD40L)(200ng/mL)刺激2h，然后分离全细胞裂解液用于蛋白质印迹(图S4和S5)。将细胞用50mM Tris-HCl(pH 7.4)，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mM PMSF，5mM NaF，1mM Na3VO4，1mMβ-甘油磷酸，10mMNa4P2O7，2mM EDTA和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics Corp.,SanFrancisco,CA)溶解。在冰上温育30分钟后，将裂解液通过在4℃下离心(10,000g)15分钟进行澄清，并收集上清液。蛋白质浓度使用BCA测定法来确定，并将等量样品在溶解于Laemmli样品缓冲液后进行SDS/线性梯度PAGE。随后将凝胶分离的蛋白通过湿箱转移电转移到PVDF膜，在抗体温育之前将其用5％脱脂奶阻断。然后将膜首先与针对磷酸化蛋白的抗体、然后与针对总蛋白的抗体在4℃温育过夜。抗体-抗原复合物通过化学发光来鉴定(ECL+系统；Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。使用抗β-肌动蛋白抗体作为载样对照。使用Image Studio Lite 4.0(Licor,Lincoln,NE)将磷酸化蛋白归一化到相应的总蛋白，用于定量。
脂筏分离。为了评估LAG3在细胞质膜脂筏区室中的表达，使用500mM碳酸钠(pH11.0)和蔗糖密度离心分离脂筏膜。所述蔗糖梯度方法基本上按照以前的描述(2)来进行，并进行了一些修改。将细胞(1x 108)用冰冷的PBS洗涤，并用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，5mM NaF，1mM Na3VO4，1mMβ-甘油磷酸，10mM Na4P2O7，2mM EDTA和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics Corp.,San Francisco,CA))的pH 11.0的500mM碳酸钠重悬浮(2)。将所述溶液在Wheaton dounce均质机中使用10个冲程进一步均化。对于不连续蔗糖梯度来说，将300μL澄清的上清液与300μL 85％蔗糖混合，并转移到2.2mL Beckman离心管的底部。将所述稀释的裂解液用1ml35％蔗糖覆盖，最后用600μL 5％蔗糖覆盖。将所述样品在Beckman台式离心机中，在4℃下以70,000g超速离心20h。在离心后，梯度被分成10个220μL级分。将级分1-3合并(印迹上的合并级分1)。为了确定脂筏和不同蛋白质在所述不连续蔗糖梯度中的位置，对40μL脂筏级分(蔗糖梯度4和5，印迹上的2和3)和非脂筏级分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫转印。
LAG3的过表达和沉默测定法。我们使用两种实验方法来确定LAG3的存在或不存在是否是改变下游信号传导途径的原因。我们首先在表达rs10846744风险C的细胞中，通过用表达带有GFP标签的全长人类LAG3cDNA的慢病毒载体转染它们来过表达LAG3。我们的第二种方法是使用特异性shRNA载体在表达rs10846744参比G的细胞中沉默LAG3的表达。
慢病毒转染和转导：插入到pReceiver-Lv122过表达载体中的LAG3-GFP、插入到psi-LVRH1MP RNAi沉默载体中的shRNA-LAG3、杂乱的shRNA和慢病毒模拟GFP对照载体从GeneCopoeia(Rockville,MD)获得。对针对LAG3的4种shRNA进行筛选，以选择基因沉默(knockdown)效率最高的质粒。慢病毒使用Lenti-Pac HIV表达包装试剂盒(GeneCopoeia,Rockville,MD)产生。简单来说，在Opti-MEM I中添加2.5μL每种个体慢病毒质粒和5.0μLEndoFectin Lenti试剂，以形成DNA-EndoFectine复合物。在将所述复合物在室温温育20分钟后，将DNA-EndoFectine复合物添加到在含有10％FBS的DMEM中具有HEK 293的培养皿，并在5％CO2、37℃下温育过夜。将所述培养基用新鲜的含有5％FBS的DMEM替换并继续温育。在转染后48hr收集含有病毒的培养基，并在过滤后浓缩。对于使用慢病毒的转导来说，将在1.5ml完全培养基中的1x106个EBV转化的B淋巴细胞接种在12孔板中，并添加500μL病毒悬液。将所述细胞在37℃温育72h。为了评估在具有风险C等位基因的淋巴细胞中过表达LAG3或在具有参比G等位基因的淋巴细胞中沉默LAG3对下游信号传导途径的影响，将转染的细胞使用和不使用佛波酯(500ng/ml)、离子霉素(250ng/ml)和IL-4(100U/ml)混合物刺激2hr，然后进行处理用于蛋白质印迹，以评估下游信号传导蛋白的磷酸化。
血浆或可溶性淋巴细胞活化基因3(sLAG3)测定法。sLAG3ELISA试剂盒购自RayBiotech,Inc.(Norcross GA)，并且sLAG3通过首先优化所述试剂盒来测量。将来自于143位HALP对象的储存在-80℃下的禁食血浆样品的等分试样融化，稀释3倍，然后将100μl用于sLAG3测量，每种样品两份平行样。标准曲线是2倍稀释的，并得到线性相关的数据。针对标准曲线进行线性回归，以便定量所述血浆样品。值被表示为平均值±标准误差。
实施例1：小鼠
对于所有动脉粥样硬化研究来说，我们使用了每组15只小鼠(每个研究30只)，其在病变面积测量值的预期变差系数为25％和检测到病变面积的25％差异的机会为80％的基础上，从校验效能(power)计算来计算。在所有实验中，将小鼠喂食确定的高胆固醇/高饱和脂肪饮食10周。通过标准的比色测定法和通过HPLC积分中的胆固醇测定两者，测量血浆脂类分布情况(LDL-C、HDL-C、甘油三酯)。主动脉根和降主动脉中动脉粥样硬化病变的量通过已建立的方法来分析，包括通过连续主动脉根横截面的病变面积和主动脉的正面油红O染色制备物中的病变面积来评估病变体积。坏死核心的尺寸被测量为病变内未被H&E染色的面积。对于每个小鼠实验组来说，对脾脏和主动脉旁淋巴结中CD4+、CD8+和CD4+FoxP3+T细胞的数目进行定量，并通过流式细胞术(对CD62L、CD44、CD69、Lag-3和PD-1进行染色)确定T细胞的活化表型。
当在10周的鼠粮和高脂肪饮食后从ldlr-/-小鼠收获脾细胞并将其用抗CD3/抗CD28抗体离体刺激24h后，48.2±2.8％的CD4+细胞是Lag3+，与此相比来自于鼠粮喂食的小鼠的Lag3+细胞为36.7±3.9％(增加31％，n＝8-10，p<0.02)。图13是在高脂肪喂食后小鼠中CD4+Lag3+T细胞活化的图。所述图表明高脂肪饮食引起CD4+T细胞活化。
为了检查骨髓来源的细胞(BMDC)对动脉粥样硬化的影响，我们首先将Lag3-/-或Lag3+/+BMDC移植到已被辐照过的10周龄ldlr-/-受体小鼠中。允许这些移植的小鼠平衡4周，然后喂食高脂肪/胆固醇饮食10周，然后处死并分析主动脉病变和免疫参数。在Lag3-/-骨髓受体中与对照相比存在主动脉根病变T细胞的显著增加(分别为45.5±8.5相比于21.1±3.4CD4+细胞/mm2，n＝14和12，p＝0.01，增加到2倍)(图14)。我们还发现，在Lag3-/-骨髓受体中与对照相比，主动脉旁淋巴结中活化的(CD62L-CD44+)CD4+和CD8+T细胞的百分率显著提高(41.4±1.0相比于28.1±1.5个活化的CD4+细胞，n＝14，p<0.0001；12.9±0.7相比于8.2±0.5个活化的CD8+细胞；n＝14，p<0.001)。这些结果强烈地支持在高胆固醇血症的背景中Lag-3蛋白的抗炎、动脉保护作用。
Treg抑制促动脉粥样硬化生成性T细胞应答。参见Foks AC,Lichtman AH,KuiperJ,s.l.：“使用调节性T细胞治疗动脉粥样硬化”(Treating Atherosclerosis WithRegulatory T Cells)，Arterioscler Thromb Vasc Biol.vol.35,pp.280-287(2015)。然而，Lag-3在这种保护性功能中的作用尚属未知。出人意料的是，在Lag3-/-但不在野生型骨髓受体中，主动脉旁淋巴结中Treg的数目与病变面积正相关(图15)。这表明Lag-3蛋白缺陷损害Treg的功能而不是扩增。值得注意的是，最近的研究显示在表达FoxP3+的细胞上选择性缺失CTLA-4引起FoxP3+Treg的扩增，但这些细胞具有受损的抑制活性(被称为exTreg)。由于Treg上的CTLA-4和Lag3两者都可以起到结合并阻断效应T细胞上的分子(分别为B7和II类MHC)的作用，因此可能Lag3缺陷的Treg也可能具有缺陷的抑制活性。
已知Lag3抑制CD4+T细胞响应的机制，观察到Lag3缺陷小鼠显示出明显更多的病变炎症。在Lag3蛋白缺陷的背景中观察到淋巴系Treg的扩增但缺少功能，并且过继转移的Lag3缺陷的Treg相对于野生型Treg来说不能控制动脉粥样硬化。
同样地，这确立了将LAG3表达情况作为生物标志物用于评估炎性体、慢性炎性疾病和功能失调的HDL，然后实施定制的治疗方案以调停所述疾病的新策略。在SCARB1和/或LAG3变体的人类携带者或由于其他遗传或非遗传原因而被鉴定为具有低血浆/血清LAG3蛋白水平的人类中，将重组淋巴细胞活化基因-3作为抗高脂血药物和/或他汀类药物的伴侣治疗剂的定制治疗方案获得了用于动脉粥样硬化风险的进一步用途。
实施例2：小鼠
已在动脉粥样硬化的小鼠模型中鉴定到小鼠中的LAG3缺陷与Treg功能的改变和炎性细胞的增加显著相关后，接下来确定重组人类可溶性单体LAG3是否结合到高度表达它的结合靶点II类MHC分子的小鼠B细胞。将来自于野生型小鼠的小鼠脾细胞(约1百万个细胞)接种到96孔板的孔。将细胞离心下来并重悬浮在重组人类可溶性单体LAG3在含有Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中的溶液(0-162μg蛋白/ml)。实验条件如下：条件1，162μg/ml(储用溶液，稀释倍数1)；条件2，32.4μg/ml，稀释倍数5；条件3，3.24μg/ml，稀释倍数50；条件4，0.32μg/ml，稀释倍数500；条件5，0μg/ml。在温育30min后，将细胞离心下来，用FACS缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白、0.05％叠氮化钠的PBS)清洗一次。添加50μl抗体混合物，其含有Fc-区段、抗CD3抗体PerCP、抗B220抗体FITC和LAG3/同种型对照(分别为抗人类LAG-3抗体和小鼠IgG1K同种型对照APC)。将细胞在室温温育20min，然后添加150μl FACS缓冲液。然后将细胞再次用FACS缓冲液清洗一次，最后重悬浮在FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。
如图16(第一页)中所示，重组人类可溶性单体LAG3以剂量响应性方式结合到表达II类MHC分子的小鼠B脾细胞。在图17(第二页)中，与小鼠T细胞(其不表达II类MHC分子)相比，重组人类可溶性单体LAG-3以剂量响应性方式偏好性地结合到小鼠B细胞(其表达II类MHC分子)。
图18说明了在基础和刺激后条件下，LAG3外显子3转录本在淋巴细胞中的差异表达。发明人独特地鉴定到与用佛波酯、离子霉素和IL-4刺激的细胞相比，在基础或静止条件下培养的人类B淋巴细胞中LAG3基因的外显子3的差异表达。外显子3的转录对于翻译成LAG3蛋白的结合到II类MHC分子的结构域1的额外环来说，是必不可少的。
LAG-3转录调控
LAG-3蛋白的结构由4个Ig样胞外结构域、连接肽、跨膜和胞质结构域构成。LAG3蛋白的结构类似于CD4，尽管氨基酸同源性仅为20％。Creg J.Workman,Dario A.A.Vignali,“CD4相关分子LAG-3(CD223)调控活化的T细胞的扩增”(The CD4-Related Molecule,LAG-3(CD223),Regulates the Expansion of Activated T Cells)，Eur.Jl.of Immunology,24March(2003)。与CD4相比，LAG3蛋白独特地含有30个氨基酸的额外环作为结构域1的一部分。这个额外环被编码在外显子3中，并且正是这个环已被显示结合到II类MHC受体。Huard等，“LAG-3蛋白上的II类主要组织相容性复合物结合位点的表征”(Characlerization OfThe Major Histocompatibility Complex Class II Binding Site On LAG-3 Protein)，Proc Natl Acad Sci U S A.，94(11):5744-5749(May 1997)。
在图18中，证实了外显子3的转录在基础静止细胞中降低或不存在，并且在用含有佛波酯(PMA)/离子霉素/IL-4的混合物刺激细胞时提高。思考这个新的观察，合理的是只有在细胞被活化时才需要转录所述额外环。重组人类LAG3的实施方式也可以是模拟LAG3外显子3的活化的药剂(LAG3模拟物)，以便提高结合II类MHC分子的额外环的RNA和蛋白表达。LAG3外显子3活化的模拟物可以包括影响可替选DNA或RNA结构的形成的分子和/或药剂，所述可替选DNA或RNA结构影响RNA转录，包括影响细胞内或细胞外阳离子例如钾、钠、锂或钙的分子，所述细胞内或细胞外阳离子影响可替选DNA或RNA结构。LAG3外显子3活化的模拟物可以包括影响可替选剪接的分子和/或药剂，所述可替选剪接包括或排除LAG外显子3的转录。
现在已充分阐述了优选的实施方式，对于本领域技术人员来说，在熟悉了所述基础概念后，各种不同的其他实施方式以及本文示出和描述的实施方式的某些变化和修改，将是显而易见的。因此应该理解，本发明可以以随附的权利要求书中具体阐述的之外的方式实践。
工业实用性声明
尽管使用hLAG3作为疫苗佐剂在已知的癌症患者中提高T-细胞计数，但断然进行LAG3缺陷标志物的筛查，并且如果发现所述标志物的话，通过使用重组人类LAG3在不同时间点定期给药来治疗有前景的患者以改善随之而来的风险，具有极大的工业实用性。发明人通过使用特定的2点表达情况剖析(突变和/或非遗传病因例如SCARB1rs10846744突变和/或LAG-3rs870849或其他遗传或非遗传病因和突变的组合)对具有心血管疾病、其他慢性炎性疾病、心血管和/或非心血管性发病和死亡风险的患者进行预筛查，然后使用重组人类淋巴细胞活化基因-3作为伴侣治疗剂实施定制治疗方案，做到了这一点。

Claims (21)

1.一种用于在成年人类对象中治疗慢性炎性和心血管疾病的方法，所述方法包括下述步骤：
对所述对象进行定性预筛查，以检测指示LAG3蛋白的潜在缺陷的LAG3缺陷标志物；
对所述对象进行定量测试以确认所述LAG3蛋白缺陷；
对所述对象实施治疗方案，所述治疗方案包含作为佐剂的hLAG3-Ig与至少一种化学治疗剂的组合。
2.权利要求1的方法，其中所述对所述对象进行定性预筛查的步骤包括预筛查LAG3缺陷标志物的医疗记录。
3.权利要求1的方法，其中所述对所述对象进行定性预筛查的步骤包括预筛查LAG缺陷标志物的家族史。
4.权利要求1的方法，其中所述进行定量测试的步骤包括对来自于所述对象的血液样品进行定量测试以确认所述LAG3蛋白缺陷。
5.权利要求4的方法，其中所述血液样品的所述定量测试是测定法。
6.权利要求4的方法，其中所述血液样品的所述定量测试是遗传测试。
7.权利要求1的方法，其中所述定量测试包括来自于所述对象的血浆样品的遗传测试和测定法两者，用于确定LAG3的低水平表达的存在。
8.权利要求6的方法，其中所述定量遗传测试被配置成用于检测SCARB1或LAG3基因的编码序列中的多态性。
9.权利要求8的方法，其中所述多态性是SCARB1rs10846744或LAG3rs870849突变。
10.权利要求8的方法，其中所述血液样品的所述定量测试包括在鉴定等位基因变体之前扩增SCARB1或LAG3基因的至少一部分。
11.权利要求5的方法，其中所述测定法被配置成用于测量低于3400pg/ml的低LAG3。
12.权利要求11的方法，其中所述测定法是ELISA测定法。
13.权利要求1的方法，其中所述对所述对象实施治疗方案的步骤包括通过定期给药来给药重组人类LAG3。
14.权利要求1的方法，其中所述对所述对象实施治疗方案的步骤包括通过定期给药来给药重组LAG3模拟物。
15.权利要求13的方法，其中所述对所述对象实施治疗方案的步骤包括给药化学治疗剂普罗布考。
16.权利要求15的方法，其中所述给药普罗布考的步骤包括在3至4个月的范围内定期给药。
17.权利要求15的方法，其中所述给药普罗布考的步骤包括在所述对象的剩余生命期内定期给药。
18.权利要求13的方法，其中所述通过定期给药来给药重组人类LAG3的步骤包括给药人类LAG3蛋白。
19.权利要求1的方法，其中所述伴侣治疗剂包括选自抗炎剂、改善所述对象中的HDL-C功能、尺寸和/或组成的药剂、减少所述对象中功能失调的HDL-C的药剂、PCSK9抑制剂和LAG3模拟物的任一种或多种药剂。
20.权利要求1的方法，其还包括在所述定期给药期间监测所述对象以确定对LDL氧化和血浆HDL胆固醇和血浆/血清细胞因子的影响的步骤。
21.权利要求18的方法，其中所述监测包括每个月进行具有全面情况剖析的安全性实验室测试和EKG。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10265379B2 (en) * 2015-09-16 2019-04-23 Annabelle Rodriguez Oquendo Use of recombinant lymphocyte activation gene-3 as a companion therapeutic for patients at risk for cardiovascular disease and other chronic inflammatory diseases
WO2018165574A1 (en) * 2017-03-10 2018-09-13 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing risk for inflammatory disease through glycan profiling

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015091970A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Immutep S.A. Combined preparations for the treatment of cancer
US20150355203A1 (en) * 2012-12-06 2015-12-10 Annabelle Rodriguez Oquendo Use of lymphocyte activation gene 3 (lag-3) expression profiling as a biomarker for assessing inflammasomes, chronic inflammatory diseases and dysfunctional hdl
CN105392888A (zh) * 2013-03-16 2016-03-09 诺华股份有限公司 使用人源化抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0893507A1 (en) 1997-07-25 1999-01-27 Institut Gustave Roussy Use of MHC class II ligands (CD4 and LAG-3) as adjuvant for vaccination and of LAG-3 in cancer treatment
EP2044949A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Immutep Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response
US10265379B2 (en) * 2015-09-16 2019-04-23 Annabelle Rodriguez Oquendo Use of recombinant lymphocyte activation gene-3 as a companion therapeutic for patients at risk for cardiovascular disease and other chronic inflammatory diseases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150355203A1 (en) * 2012-12-06 2015-12-10 Annabelle Rodriguez Oquendo Use of lymphocyte activation gene 3 (lag-3) expression profiling as a biomarker for assessing inflammasomes, chronic inflammatory diseases and dysfunctional hdl
CN105392888A (zh) * 2013-03-16 2016-03-09 诺华股份有限公司 使用人源化抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症
WO2015091970A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Immutep S.A. Combined preparations for the treatment of cancer

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIERRO SOPHIE 等: "The CD4-like molecule LAG-3, biology and therapeutic applications", 《EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC TARGETS》 *

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