KR20190046787A - Pna 프로브 - Google Patents

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Abstract

본원에는 핵산을 분석하는 여러 다양한 방법에 사용하기 위한 개선된 PNA 기반 단량체, 핵염기, 올리고머 및 프로브가 개시된다. 또한, 본 발명은 개질되고 개선된 PNA 분자를 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

PNA 프로브
본 발명은 펩티드 핵산 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 전적으로는 아니지만, 원하는 위치, 예를 들어 골격 내의 원하는 위치에 하전된 모이어티와 같은 모이어티를 혼입하도록 개질된 펩티드 핵산 단량체, 이량체, 및/또는 올리고머에 관한 것이다.
DNA 시퀀싱(sequencing)은 많은 연구의 주제가 되어 온 공지된 절차이다. Maxim과 Gilbert의 화학적 접근법 (AM Maxam and W. Gilbert, PNAS, 1977, 74, 560-564) 및 Sanger의 효소 기반 방법 (F. Sanger et al., PNAS, 1976, 5463-5467)을 비롯한 다양한 DNA 시퀀싱 방법이 보고되었다.
수 많은 더 새로운 접근법이 보고되었고, 이들은 다음 3 가지 범주에 속한다: (i) 반복적인 단일 염기 부가에 의한 시퀀싱, (ii) 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 및 (iii) 디콘볼루션(deconvolution)/디코딩(decoding)을 이용한 제한 효소 매개 절단 또는 키나아제 연결.
그러한 방법의 예는 PCT 출원 공개 WO 2009/037473호 (Bradley 등)에 개시되어 있다.
펩티드 핵산(PNA)은 유전자 프로브로서의 응용을 비롯한 수 많은 응용에 사용되어 온 합성 화합물이다 (P. Paulosova and F. Pellestor, Ann. Genetique, 2004, 47, 349-358 참조).
펩티드 핵산(PNA)은 천연 핵산인 데옥시리보핵산(DNA)과 리보핵산(RNA)과 유사하다. 그러나, DNA와 RNA가 각각 데옥시리보스 또는 리보스 당 골격을 각각 보유하는 반면, PNA의 골격은 펩티드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 반복적으로 포함한다. PNA의 다양한 피리미딘 및/또는 퓨린 염기 (또는 핵염기)는 아미드 결합 형성에 의해 펩티드 골격에 연결된다. 아미드 결합을 통해 단일 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위에 연결된 단일 핵염기가 PNA 단량체로 기술될 수 있지만, 다른 PNA로는, 예를 들어 피롤리딘 기반 DNA 모방체(mimic) (문헌[RJ Worthington et al. Org. Biomol. Chem., 2007, 5, 249-259]) 및 인돌 기반 DNA 모방체 (화학식 9)와 같은 개질된 아미노에틸-글리신 골격을 함유하는 PNA가 포함될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 당업자는 다른 적합한 올리고머를 인식할 것이다.
Figure pct00001
항바이러스제 내성 B형 간염 바이러스에서 점 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 어레이의 사용 예는 Hyunjung Jang 등의 문헌[Journal of Clinical Microbiology, 2010, Vol.48, No. 9, 3127-3131]에 논의되어 있다.
펩티드 핵산(PNA) 마이크로어레이의 제작, 검출 및 응용에 대한 검토는 Huanhuan Shi 등의 문헌[Biosensors and Bioelectronics, 2015, 66, 481-489]에 논의되어 있다.
PCT 출원 공개 WO 2009/037473호 (Bradley 등)에는 개질 핵염기, 및 개질 PNA 단량체와 이의 이량체 및 올리고머뿐만 아니라 핵산의 시퀀싱 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 특성규명과 같은 유전자 분석 방법에서의 이들의 용도가 개시되어 있다. SNP는 게놈의 변이 형태를 나타내며, 그 게놈의 특정 뉴클레오티드는 개체군의 구성원들 사이에 달라진다. 예로서, SNP는 2개의 대립 유전자 (즉, 특정 유전자좌에 있는 2개의 가능한 뉴클레오티드 중 하나)를 포함할 수 있고, 그러한 경우, 개체군 내의 개체들 중 일부는 특정 유전자좌에 하나의 SNP 대립 유전자를 지닐 수 있는 한편, 다른 개체들은 동일한 유전자좌에 다른 하나의 대립 유전자를 지닐 수 있다.
WO 2009/037473호 (Bradley 등)에는 펩티드 골격의 2차 아민 중 하나 이상이 핵염기를 포함하도록 유도체화되지 않고 커플링되지 않은 상태로 존재하는 PNA 올리고머가 개시되어 있다. 그러한 "공백(blank)" 또는 "무염기(abasic)" PNA 단위의 제공은 핵산 서열에서 핵염기의 개선된 특성규명을 제공한다. 예를 들어, 그러한 방법은 핵산을 그 핵산의 일부에 하이브리드화할 수 있고 그 핵산의 핵염기와 상보적인 핵염기를 결여하는 개질된 펩티드 핵산(PNA) 올리고머와 접촉시켜 핵산/PNA 이중체(duplex)를 형성하는 단계; 및 상기 핵산/PNA 이중체를, 검출 가능한 태그를 포함하는 개질 염기와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 핵산의 핵염기와 상보적인 개질 핵염기는 상기 핵산/PNA 이중체와 통합되고, 이어서 검출 가능한 태그에 의해 특성규명될 수 있다.
그러나, PNA 올리고머 프로브에서 하나 이상의 "공백" 또는 "무염기" 단위의 제공은 예기치 않은 어려움을 초래할 수 있는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 프로브가 고체 지지체, 예를 들어 수지 지지체 물질의 표면에 부착되는 경우, "공백" 위치에서 핵염기의 부재에 의해 생성된 공간은 프로브가 구부러지게 하거나, 휘어지게 하거나, 다른 방식으로 이의 "정상적인" 선형 배열으로부터 변형되게 할 수 있는 것으로 관찰되었다. 이는 많은 문제를 일으킬 수 있다:
첫째, 그러한 프로브는 특성규명하려는 핵산의 핵염기와 상보적인 핵염기뿐만 아니라 특성규명하려는 핵염기와 상보적이지 않은 핵염기와도 결합하는 경향을 가질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이 현상은 감소된 특이성으로 기술될 수 있다.
둘째, 예를 들어, PNA 프로브의 "공백" 위치에 혼입된 개질 핵염기와 회합된 검출 가능한 태그의 검출에 의한, 특성규명하려는 핵산의 핵염기와 상보적인 핵염기와 결합된 프로브의 검출 효능 또는 수율이 달라지고/달라지거나 영향을 받고/받거나 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이 현상은 감소된 감도로 기술될 수 있다.
본 발명의 목적은 종래 기술과 관련된 전술한 문제점 중 적어도 하나를 제거하거나 완화하는 데에 있다.
본 발명은 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 포함하도록 개질된 PNA가 이러한 방식으로 개질되지 않은 PNA 단량체를 사용하여 제조된 PNA 분자와 비교하여 상보적인 핵산 가닥에 더 잘 하이브리드화하는 PNA 분자를 제공하는데 사용될 수 있다는 발견에 기초한다.
본원에 기술된 개질은, 예를 들어 PNA 단량체, 이량체, 올리고머 및 PNA 기반 프로브 (편의상, 이들 PNA 기반 분자는 이하 포괄적으로 "PNA 분자"로 지칭될 것임)를 비롯한 임의의 유형의 PNA 기반 분자에 적용될 수 있다.
당업자는 PNA 분자가 많은 용도를 가지며, (특정 프로토콜에서) 고체 기질에 고정될 수 있음을 인지할 것이고, 그러한 조건 하에서, 종래 기술의 PNA 기반 분자는 사용시 어느 정도의 바람직하지 않은 변형, 구부러짐 및/또는 휘어짐을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 상기 바람직하지 않은 변형, 구부러짐 및/또는 휘어짐은 적절한 표적 결합을 막는 등 검정에서 PNA 분자의 성능 (예를 들어, 특이성 및/또는 감도)에 영향을 줄 수 있다.
본 발명자들은 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 포함하도록 PNA 단량체를 개질시킴으로써 PNA 분자의 안정성을 개선하여, 예를 들어 사용시, 특히 표면 또는 기판에 고정된 경우, PNA 분자가 이의 형태를 더 용이하게 유지하며, 변형, 구부러짐 및/또는 휘어짐을 덜 (또는 유의하지 않거나 실질적이지 않게) 나타낼 수 있고; 본원에 기재된 임의의 개질된 PNA로부터 제조된 PNA 분자는 유전자 분석 및 핵염기 특성규명 검정을 비롯한 검정에서 개선된 성능을 또한 나타낼 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 제 1 양태에 따르면, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 감마 위치에 포함하는 PNA 단량체가 제공된다.
PNA 단량체는 글리신 단위로부터 유래될 수 있다.
전형적으로, PNA 단량체는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로부터 유래될 수 있다. 언급된 바와 같이, PNA 단량체는 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 감마 위치에 포함할 수 있다.
PNA 단량체는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00002
상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고,
P3은 수소이거나, 보호기 P이거나, 또는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이며:
Figure pct00003
상기 식에서, NB는 핵염기이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "포함하는"이라는 용어는 본 개시의 양태 및 실시형태가 특정 특징(들)을 "포함"함을 나타내기 위해 사용된다. "포함하는"이라는 용어는 관련된 특징(들)로 "본질적으로 구성되거나" 이로 "구성되는"는 양태 및/또는 실시형태를 또한 포함할 수 있다.
유리하게는, PNA 단량체의 감마 위치에서의 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티의 제공은, 특히 프로브가 고체 지지체의 표면에 부착되는 경우, 더 안정한 배열을 갖는 PNA 분자, 예를 들어 PNA 올리고머를 제조할 수 있게 한다. 그러한 PNA 올리고머, 예를 들어, PNA 프로브는 구부러지거나 휘어지거나 다른 방식으로 이의 "정상적인" 선형 배열로부터 변형될 가능성이 적다. 예를 들어, 핵산을 시퀀싱하고 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 특성규명하는 방법과 같은 유전자 분석 방법에서 프로브가 사용되는 경우, 본원에 기술된 개질은 특성규명하려는 핵산의 핵염기와 상보적인 염기에 대해 개선된 특이성 및/또는 개선된 감도를 갖는 프로브를 생성시킬 수 있다.
이론에 의해 구속시키고자 하는 것은 아니지만, PNA 단량체의 감마 위치에서의 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티의 제공은 PNA 단량체에 키랄 중심을 도입하는 것임이 제안된다.
일 실시형태에서, P3은 화학식 (II)로 표시되는 기가 아니다. 그러한 경우, P3은 보호기 P이거나 수소일 수 있다.
보호기 ("P")는 P가 부착되는 기를 추가로 유도체화할 수 있는 기를 지칭하는 것으로 이해될 것이다.
일부 실시형태에서, 보호기 P는 아세틸, N-[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸] (Dde), 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), 트리틸 기, 디설파이드 (Ardec (아릴디티오에틸옥시카르보닐)) 광 절단 보호기 (니트로베라틸 기반),부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐 (Cbz), 트리플루오로아세틸 (Tfa), 프탈이미드, 벤질, 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 톨루엔설포닐 (Ts), 메톡시메틸 에테르 (MOM), 테트라히드로피라닐 에테르 (THP), 알릴 에테르, 부틸 에테르, 및 벤질리덴 아세탈로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있다 (Green, Wiley-Interscience, New York, 1999).
당업자는 용어 "핵염기"(화학식 II에서 NB: 다르게는, "뉴클레오티드" 또는 "염기"라고 공지되거나 본원에서 지칭됨)가 퓨린 및 피리미딘을 포함할 수 있음을 인지할 것이다. "핵염기"라는 용어는, 예를 들어 특정 염기인 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실뿐만 아니라, 예를 들어 크산틴, 하이포크산틴, 이소구아닌, 요산, 및 "합성 염기"로 포괄적으로 공지된 핵염기의 군과 같은 변이체를 포함할 수 있다.
화학식 I의 화합물에서, P3이 보호기 P이거나 수소인 경우, 펩티드 단량체의 2차 아민은 핵염기 NB를 포함하도록 유도체화되지 않는다. 즉, PNA 골격의 2차 아민은 핵염기를 포함하도록 유도체화되지 않고 "커플링되지 않은" 상태로 존재한다. 그러한 경우, PNA 단량체는 "공백" 또는 "무염기" PNA 단량체 ("공백"이라는 용어는 유도체화되지 않은 2차 아민을 지칭함)로 기술될 수 있다. 그러한 "공백" 또는 "무염기" PNA 단량체의 제공은 핵산 서열에서 핵염기의 특성규명을 용이하게 하는 방법에서 특히 유용할 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들어 WO 2009/037473호 (Bradley 등: 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. 전형적으로, 그러한 경우, P3은 보호기 P일 수 있다. 그렇게 제공함으로써, 유사-펩티드 단량체의 2급 아민의 화학 반응이 회피 및/또는 방지될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 공백 또는 무염기 PNA 단량체는 PNA 프로브를 생성하는데 사용될 수 있다. PNA 프로브는 공백 또는 무염기 단량체인 적어도 하나의 PNA 단량체를 비롯한 많은 PNA 단량체를 포함하는 PNA 올리고머의 형태를 취할 수 있다. PNA 올리고머 (프로브)는 특정 핵산 서열에 하이브리드화될 수 있고, 공백/무염기 PNA 단량체를 포함하더라도 특성규명하려는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 염기는 결여하고 있다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 유형의 PNA 프로브 (올리고머)를 이용할 수 있는 상세한 방법은 WO2009/037473호 (본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있으며, 본 발명은 이들 방법에 사용하기 위한 개질된 PNA 분자를 제공한다. 이러한 개질된 분자는, 예를 들어 WO2009/037473호에 기술된 핵염기/SNP 특성규명 방법을 비롯한 유전자 분석 방법에서 더 높거나 개선된 안정성을 나타낸다.
본원에 기재된 PNA 분자는 하나 이상의 "개질 염기"와 함께 사용될 수 있다. "개질 염기"라는 용어는 가역적 공유 결합 반응이 가능한 작용기를 추가로 포함하는 알킬 사슬을 포함하는 염기/핵염기를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 바람직하게는, 염기의 헤테로사이클은 알킬 사슬과 작용기를 포함하도록 개질될 수 있다. 더욱 상세하게는, 헤테로사이클의 헤테로 원자 또는 탄소 원자는 알킬 사슬과 작용기를 포함하도록 개질될 수 있다. 예시적인 개질 염기는 WO2009/037473호 (그 관련 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
"개질 염기"와 관련하여, "가역적 공유 결합 반응"이 가능한 작용기는, 예를 들어 알데히드 및/또는 케톤을 포함하는 기일 수 있으며, 일 실시형태에서, 상기 가역적 공유 결합 반응은 개질 염기의 알데히드/케톤 기와, 아민, 히드라지드(들) (A. Dirksen, et al., J. Am. Chem . Soc ., 2006, 128, 15602-15603), 알콕시아민 (VA Polyakov et al., J. Phys. Org . Chem . 1999, 12, 357-363) 또는 알코올, 디올 및/또는 보론산 (O. Abed et al., Chem . Mater., 2006, 18, 1247-1260) 사이의 반응을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일 실시형태에서, 가역적 공유 결합 반응이 가능한 기는 알코올이 아니다.
"검출 가능한 태그"라는 용어는, 예를 들어 광학적으로 또는 다른 방식으로 서로 구별 가능한 태그 또는 표지를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 그러한 많은 태그 또는 표지는 당업자에게 공지되어 있지만, 예로서, 적합한 태그는, 예를 들어 형광-태그 또는 질량-태그 화합물을 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는 그리고 일 실시형태에서, 본 발명의 개질 염기/핵염기는, 예를 들어 청색 내지 원적색 스펙트럼 범위의 광학적으로 검출 가능한 염료를 갖는 태그 군으로부터 선택된 하나 이상의 (예를 들어, 형광 발색단과 같은) 검출 가능한 태그(들)를 포함할 수 있다. 적합할 수 있는 태그의 예로는, 예를 들어 단실(dansyl), 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 텍사스 레드(texas red), 이애단스(IAEDANS), 시아닌 염료 (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), 보디파이(Bodipy) 염료 (Invitrogen), SETA 425와 같은 SETA 염료 (Seta Biomedicals) 및/또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료 (Invitrogen)를 들 수 있다.
적합한 "질량-태그" 화합물은, 예를 들어, 브로마이드 모이어티 또는 예를 들어 MALDI-TOF와 같은 질량 분석 기술에서 뚜렷한 동위 원소 패턴을 제공할 수 있는 다른 화합물, 분자 또는 모이어티를 포함하는 태그를 포함할 수 있다. 개질 염기가 개질된 우라실 염기인 경우, 질량 태그는 브롬이 아닐 수 있다.
따라서, 당업자는 본원에 기재된 임의의 개질 핵염기가, 예를 들어 형광 현미경검사 또는 MALDI-TOF와 같은 질량 분석 기술 등에 의해 검출될 수 있음을 인지할 것이다.
유리하게는, 본원에 기재된 개질 염기/핵염기의 각각의 헤테로사이클은, 예를 들어 헤테로 원자 또는 탄소 원자를 통해 임의의 수의 위치에 연결된 검출 가능한 태그를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 헤테로 원자는, 예를 들어 상기 언급된 하나 이상의 검출 가능한 태그로 독립적으로 치환될 수 있는 알킨, 알케닐렌 또는 알키닐렌 모이어티와 같은 적합한 스페이서/탄소 스페이서 모이어티를 추가로 포함하도록 개질될 수 있다. 예로서, 헤테로사이클의 헤테로 원자 및/또는 개질된 헤테로 원자는 하나 이상의 형광발색단(들) (T.S. Seo et al., PNAS, 2004, 101, 5488-5493; Z. Li et al., PNAS, 2003, 100, 414-419; L. Thoresen et al., Chem . Eur. J. 2003, 9, 4603-4610) 및/또는 질량 태그, 즉, 브로마이드, 클로라이드 (C. Portal et al., J. Comb. Chem ., 2005, 7, 554-560)를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 퓨린 및/또는 피리미딘 헤테로사이클은, 예를 들어 팔라듐 촉매를 사용하는 교차 커플링 반응에 의해 개질될 수 있다 (L. Thoresen et al., Chem . Eur . J. 2003, 9, 4603-4610]; 문헌[N.K. Garg et al. Chem. Commun., 2005, 4551-4553).
유리하게는, 각각의 개질 염기/핵염기는 상이한 검출 가능한 태그를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 검출 가능한 태그는, 예를 들어 개질된 아데닌 핵염기가 임의의 다른 개질 핵염기와 구별되게 할 수 있다.
PNA 단량체는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00004
상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고;
NB는 핵염기이다.
PNA 단량체는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00005
상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이다.
따라서, 화학식 (Ib)의 PNA 단량체는 핵염기 대신에 Boc 보호기를 포함하는 "공백" 또는 "무염기" 단량체로 기술될 수 있다.
전형적으로, N-말단 및/또는 C-말단 위치는 (전술한 바와 같이) 보호기를 포함하도록 유도체화될 수 있다. 따라서, PNA 단량체는 보호될 수 있고/거나 N-말단 또는 C-말단 위치에 보호기 P를 포함할 수 있다.
P1이 보호기 P인 경우, P2는 수소이며, 그 반대도 마찬가지이다.
P1은 보호기 P일 수 있고, P2는 수소일 수 있다. 그러한 경우, PNA 단량체는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00006
G가 하전된 모이어티인 경우, G는 하나 이상의 음전하를 포함할 수 있고/있거나 G는 하나 이상의 양전하를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, G는 하나의 음전하 또는 하나의 양전하를 포함할 수 있다.
G는 카르복실레이트, 설포네이트, 설페이트, 포스포네이트, 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음하전된 기를 포함할 수 있다.
G는 구아니디늄, 4급 암모늄, 포스포늄, 또는 설포늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 양하전된 기를 포함할 수 있다.
G는 하나 이상의 기, 예를 들어 제 1 pH에서는 전하를 띠지 않을 수 있지만 제 2 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 중성 기를 포함할 수 있다. 그러한 경우, G는 아민, 히드라지드, 히드라진, 구아니딘, 알콕시아민, 술폰산 및/또는 이의 유도체, 및/또는 포스폰산 및/또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
G는 제 1 pH 또는 pH 범위에서 제 1 전하, 예를 들어, 음전하를 띨 수 있고/있거나 제 2 pH 또는 pH 범위에서 제 2 전하, 예를 들어 양전하를 띨 수 있는 하나 이상의 기를 포함할 수 있다.
PNA 단량체가 유래되는 PNA 올리고머의 사용 동안 의도되는 조건에 기초하여 적합한 기 "G"를 당업자가 선택할 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 생성된 PNA 올리고머를 검정에서 사용하고자 하는 경우, 적합한 기 "G"는 기 "G"가 검정의 pH 환경에서 하전된 모이어티를 지니도록 당업자에 의해 선택될 수 있다.
G가 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 기인 경우, 기 G가 전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
G가 음전하를 띨 수 있는 경우, 기 G가 음전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
G가 양전하를 띨 수 있는 경우, 기 G 가 양전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 미리 결정된 pH에서 음전하를 띨 수 있는 기 G는 산 및/또는 이의 유도체, 예를 들어 에스테르를 포함할 수 있다. 기 G는 카복실산 또는 이의 유도체, 술폰산 또는 이의 유도체, 황산 또는 이의 유도체, 포스폰산 또는 이의 유도체, 인산 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 미리 결정된 pH에서 양전하를 띨 수 있는 기 G는 염기 및/또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 기 G는 아민, 히드라지드, 히드라진, 구아니디늄, 알콕시아민, 및/또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, G는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00007
그러한 경우, PNA 단량체는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00008
상기 식에서, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐이다.
본 발명의 제 2 양태에 따르면, 하기 일반식을 갖는 PNA 단량체가 제공된다:
Figure pct00009
상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고,
P3은 수소이거나, 보호기 P이거나, 또는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이며:
Figure pct00010
상기 식에서, NB는 핵염기이다.
일 실시형태에서, P3은 화학식 (II)로 표시되는 기가 아니다. 그러한 경우, P3은 보호기 P이거나 수소일 수 있다.
본 발명의 임의의 다른 양태와 관련하여 기술된 특징들은 본 발명의 제 2 양태에 따른 PNA 단량체와 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간략함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
본 발명의 제 3 양태에 따르면, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 적어도 하나의 감마 위치에 포함하는 PNA 이량체가 제공된다.
PNA 이량체는 글리신 단위로부터 유래될 수 있다.
전형적으로, PNA 이량체는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로부터 유래될 수 있다. 언급된 바와 같이, PNA 이량체는 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 하나 또는 둘 모두의 반복 단위의 감마 위치에 포함할 수 있다.
PNA 이량체는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00011
상기 식에서, G1 및 G2는 독립적으로 수소 또는 G이며, G는 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고,
P3은 수소이거나, 보호기 P이거나, 또는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이며;
Figure pct00012
상기 식에서, NB는 핵염기이고;
단,
G1 및 G2 중 적어도 하나는 G이며,
P3이 수소 또는 보호기 P인 경우, G1 = G이고,
P4가 수소 또는 보호기 P인 경우, G2 = G이다.
G가 하전된 모이어티인 경우, G는 하나 이상의 음전하를 포함할 수 있고/거나 G는 하나 이상의 양전하를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, G는 하나의 음전하 또는 하나의 양전하를 포함할 수 있다.
G는 카르복실레이트, 설포네이트, 설페이트, 포스포네이트, 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음하전된 기를 포함할 수 있다. G는 구아니디늄, 4급 암모늄, 포스포늄, 또는 설포늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 양하전된 기를 포함할 수 있다.
G는 하나 이상의 기, 예를 들어 제 1 pH에서는 전하를 띠지 않을 수 있지만 제 2 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 중성 기를 포함할 수 있다. 그러한 경우, G는 아민, 히드라지드, 히드라진, 구아니딘, 알콕시아민, 술폰산 및/또는 이의 유도체, 및/또는 포스폰산 및/또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
G는 제 1 pH 또는 pH 범위에서 제 1 전하, 예를 들어 음전하를 띨 수 있고/거나 제 2 pH 또는 pH 범위에서 제 2 전하, 예를 들어 양전하를 띨 수 있는 하나 이상의 기를 포함할 수 있다.
PNA 단량체가 유래되는 PNA 올리고머의 사용 동안 의도되는 조건에 기초하여 적합한 기 "G"를 당업자가 선택할 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 생성된 PNA 올리고머를 검정에서 사용하고자 하는 경우, 적합한 기 "G"는 기 "G"가 검정의 pH 환경에서 하전된 모이어티를 지니도록 당업자에 의해 선택될 수 있다.
G가 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 기인 경우, 기 G가 전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
G가 음전하를 띨 수 있는 경우, 기 G가 음전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
G가 양전하를 띨 수 있는 경우, 기 G 가 양전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 미리 결정된 pH에서 음전하를 띨 수 있는 기 G는 산 및/또는 이의 유도체, 예를 들어 에스테르를 포함할 수 있다. 기 G는 카복실산 또는 이의 유도체, 술폰산 또는 이의 유도체, 황산 또는 이의 유도체, 포스폰산 또는 이의 유도체, 인산 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 pH에서 양전하를 띨 수 있는 기 G는 염기 및/또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 기 G는 아민, 히드라지드, 히드라진, 구아니디늄, 알콕시아민, 및/또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, G는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00013
전형적으로, N-말단 및/또는 C-말단 위치는 (전술한 바와 같이) 보호기를 포함하도록 유도체화될 수 있다. 따라서, PNA 단량체는 보호될 수 있고/있거나 N-말단 또는 C-말단 위치에 보호기 P를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, P1이 보호기 P인 경우, P2는 수소이며, 그 반대도 마찬가지이다.
바람직한 실시형태에서, P1은 보호기 P이고, P2는 수소이다.
본 발명의 임의의 다른 양태와 관련하여 기술된 특징들은 본 발명의 제 3 양태에 따른 PNA 이량체와 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간략함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
본 발명의 제 4 양태에 따르면,하기 일반식을 갖는 PNA 이량체가 제공된다:
Figure pct00014
상기 식에서, G1 및 G2는 독립적으로 수소 또는 G이며, G는 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고,
P3은 수소이거나, 보호기 P이거나, 또는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이며;
Figure pct00015
상기 식에서, NB는 핵염기이고;
단,
G1 및 G2 중 적어도 하나는 G이고,
P3이 수소 또는 보호기 P인 경우, G1 = G이고, 및
P4가 수소 또는 보호기 P인 경우, G2 = G이다.
본 발명의 임의의 다른 양태와 관련하여 기술된 특징들은 본 발명의 제 4 양태에 따른 PNA 이량체와 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간략함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
본 발명의 제 5 양태에 따르면, 적어도 하나의 반복 단위가, 이의 감마 위치에, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 포함하는, PNA 올리고머가 제공된다.
전형적으로, PNA 올리고머가 유래되는 PNA 단량체, 또는 PNA 올리고머의 하나 이상의 반복 단위는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로부터 유래된다. 언급된 바와 같이, PNA 단량체 또는 PNA 올리고머의 하나 이상의 반복 단위는, (이들의) 감마 위치(들)에, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 포함할 수 있다.
PNA 올리고머는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00016
상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
NB는 핵염기이고;
l ≥ 0이고; m ≥ 0이고; n ≥ 0이며, 단, l + m + n ≥ 2이고, n + m ≥ 1이다.
바람직하게는, l ≥ 1이다.
바람직하게는, m ≥ 1이다.
전형적으로, m = 1이다.
바람직하게는, n ≥ 1이다.
화학식 (V)의 PNA 올리고머의 반복 단위는 반드시 순차적으로 또는 블록 1, m, 및 n의 블록 중합체로서 제공될 필요는 없고, 반복 단위는 임의의 순서로 제공될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
전형적으로, 올리고머에서 PNA 단위 (1 + m + n)의 총 수는 5개 내지 50개, 예를 들어 7개 내지 40개, 예를 들어 10개 내지 30개, 전형적으로 12개 내지 24개 의 범위일 수 있다.
하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 각각의 감마 위치에 포함하는 반복 단위의 수, 및/또는 화학식 (V)에서 "G" 모이어티를 갖는 단위의 수는, PNA 분자, 예를 들어 PNA 올리고머에 대해 예상되는 특정 응용에 좌우될 수 있음이 인지될 것이다.
전형적으로, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 각각의 감마 위치에 포함하는 반복 단위의 수, 및/또는 화학식 (V)에서 "G" 모이어티를 갖는 단위의 수는 1개 내지 10개, 예를 들어, 2개 내지 8개, 예를 들어 3개 내지 5개의 범위일 수 있다. 다르게 언급하자면, (n + m)은 1 내지 10, 예를 들어 2 내지 8, 예를 들어 3 내지 5의 범위일 수 있다.
예를 들어, 대략 12개 내지 22개의 반복 단위를 갖는 PNA 분자/올리고머의 경우, 3개 내지 5개의 범위의, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 각각의 감마 위치에 포함하는 반복 단위의 수, 및/또는 화학식 (V)에서 "G" 모이어티를 갖는 단위의 수가 유의하게 개선된 성능을 제공하는 것으로 관찰되었다.
하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 각각의 감마 위치에 포함하는 반복 단위의 수 및/또는 화학식 (V)에서 "G" 모이어티를 갖는 단위의 수의, 반복 단위의 총 수에 대한 비는, 1:20 내지 1:1, 전형적으로 1:10 내지 1:2, 예를 들어 1:5 내지 1:2의 범위일 수 있다.
비 (n + m)/(l + m + n)는 1:20 내지 1:1, 전형적으로 1:10 내지 1:2, 예를 들어 1:5 내지 1:2의 범위일 수 있다.
전형적으로, PNA 분자가 "공백" 또는 "무염기" 단위를 포함하는 경우, 상기 "공백" 또는 "무염기" 단위는 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 감마 위치에 포함한다. "공백" 또는 "무염기" 단위의 감마 위치에서의 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티의 제공은 PNA 분자의 유의하게 개선된 성능을 제공하는 것으로 관찰되었다.
전형적으로, m = 1이다.
하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 감마 위치에 포함하는 반복 단위는 최적의 안정성 및/또는 성능을 제공하도록 PNA 분자 내에 분포될 수 있다.
PNA 올리고머가 포함할 수 있는 적어도 일부에는, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 감마 위치에 포함하는 각각의 반복 단위가 PNA 올리고머의 그 일부에 1개 내지 5개의 단위마다, 예를 들어 2개 내지 4개의 단위마다 분포되어 있다.
PNA 분자가 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 감마 위치에 포함하는 "공백" 또는 "무염기" 단위를 포함하는 경우, PNA 올리고머가 "공백" 또는 "무염기" 단위에 인접한 위치 또는 그 주위에 포함하는 적어도 일부에는 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 감마 위치에 포함하는 각각의 반복 단위가 그 일부에 1개 내지 5개의 단위마다, 예를 들어 2개 내지 4개의 단위마다 분포되어 있다.
이론에 의해 구속시키고자 하는 것은 아니지만, "공백" 또는 "무염기" 단위 근처 또는 그 주위의 "개질된" 단위의 존재 및/또는 분포는 PNA 분자, 예를 들어 PNA 올리고머의 치수 안정성 및/또는 성능을 개선시킬 수 있음이 제안된다.
"공백" 또는 "무염기" 단위는 PNA 올리고머의 하나 이상의 단부로부터 원위에 위치할 수 있다. 전형적으로, "공백" 또는 "무염기" 단위는 PNA 올리고머의 하나 이상의 단부, 바람직하게는 양 단부로부터 적어도 한 개, 예를 들어 적어도 두 개, 예를 들어 적어도 세 개의 반복 단위 만큼 떨어져 위치할 수 있다. 그렇게 제공함으로써, 프로브의 성능이 개선될 수 있다. PNA 올리고머 내의 "공백" 또는 "무염기" 단위의 정확한 위치, 및/또는 PNA 올리고머의 하나 이상의 단부에 대한 "공백" 또는 "무염기" 단위의 거리는 PNA 올리고머의 전체 길이 및 프로브에 대해 의도된 특정 응용에 좌우될 수 있음이 인지될 것이다.
G가 하전된 모이어티인 경우, G는 하나 이상의 음전하를 포함할 수 있고/거나 G는 하나 이상의 양전하를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, G는 하나의 음전하 또는 하나의 양전하를 포함할 수 있다.
G는 카르복실레이트, 설포네이트, 설페이트, 포스포네이트, 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음하전된 기를 포함할 수 있다.
G는 구아니디늄, 4급 암모늄, 포스포늄, 또는 설포늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 양하전된 기를 포함할 수 있다.
G는 하나 이상의 기, 예를 들어 제 1 pH에서는 전하를 띠지 않을 수 있지만 제 2 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 중성 기를 포함할 수 있다. 그러한 경우, G는 아민, 히드라지드, 히드라진, 구아니딘, 알콕시아민, 술폰산 및/또는 이의 유도체, 및/또는 포스폰산 및/또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
G는 제 1 pH 또는 pH 범위에서 제 1 전하, 예를 들어, 음전하를 띨 수 있고, 제 2 pH 또는 pH 범위에서 제 2 전하, 예를 들어 양전하를 띨 수 있는 하나 이상의 기를 포함할 수 있다.
PNA 단량체가 유래되는 PNA 올리고머의 사용 동안 의도되는 조건에 기초하여 적합한 기 "G"를 당업자가 선택할 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 생성된 PNA 올리고머를 검정에서 사용하고자 하는 경우, 적합한 기 "G"는 기 "G"가 검정의 pH 환경에서 하전된 모이어티를 지니도록 당업자에 의해 선택될 수 있다.
G가 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 기인 경우, 기 G가 전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
G가 음전하를 띨 수 있는 경우, 기 G가 음전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
G가 양전하를 띨 수 있는 경우, 기 G 가 양전하를 띨 수 있는 pH는 6 내지 8의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 미리 결정된 pH에서 음전하를 띨 수 있는 기 G는 산 및/또는 이의 유도체, 예를 들어 에스테르를 포함할 수 있다. 기 G는 카복실산 또는 이의 유도체, 술폰산 또는 이의 유도체, 황산 또는 이의 유도체, 포스폰산 또는 이의 유도체, 인산 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 미리 결정된 pH에서 양전하를 띨 수 있는 기 G는 염기 및/또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 기 G는 아민, 히드라지드, 히드라진, 구아니디늄, 알콕시아민, 및/또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, G는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00017
본원에 기재된 PNA 분자, 예를 들어 PNA 올리고머는 지지체에 부착되고/되거나, 결합되고/되거나, 그리고/또는 지지체와 회합될 수 있다.
일 실시형태에서, PNA 분자는 지지체에 공유 결합될 수 있다.
지지체는 고체 지지체를 포함할 수 있다.
지지체는 막, 필름, 시이트 등과 같은 2차원 및/또는 실질적으로 평탄한 표면의 형태로 제공될 수 있다.
지지체는 막을 포함할 수 있다. 막은 나일론 또는 나일론-작용기화 막과 같은 폴리머 기반 막을 포함할 수 있다.
지지체는 실리케이트 표면을 포함할 수 있다. 실리케이트 표면은 작용기화 유리 표면 또는 실리콘 표면을 포함할 수 있다. 지지체는 입자, 비드 등의 형태로 제공될 수 있다. 그러한 경우, 지지체는 가교 폴리스티렌 마이크로비드, 가교 폴리스티렌 상자성 마이크로비드, 가교 폴리스티렌 착색 태그부착 마이크로비드 (예를 들어, Luminex Inc.로부터의 제품), 폴리스티렌 라텍스 비드 등과 같은 수지 지지체를 포함할 수 있다. 지지체, 예를 들어 2차원 지지체 및/또는 미립자 지지체는 표면 개질된 물질, 예를 들어 표면 개질된 수지를 포함할 수 있고/있거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 물질은 N-말단 또는 C-말단 위치에서 PNA 분자 또는 이의 성분 (예를 들어, PNA 올리고머가 유래되는 PNA 단량체)에 결합, 예를 들어 공유 결합할 수 있는 화학 기를 혼입하도록 개질된 표면을 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 다른 양태와 관련하여 기술된 특징은 본 발명의 제 5 양태에 따른 PNA 올리고머와 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간략함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
본 발명의 제 6 양태에 따르면, 하기 일반식을 갖는 PNA 올리고머가 제공된다:
Figure pct00018
상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
NB는 핵염기이고;
l ≥ 0이고; m ≥ 0이고; n ≥ 0이며, 단, l + m + n ≥ 2이고, n + m ≥ 1이다.
바람직하게는, l ≥ 1이다.
바람직하게는, m ≥ 1이다.
전형적으로, m = 1이다.
바람직하게는, n ≥ 1이다.
화학식 (V)의 PNA 올리고머의 반복 단위는 반드시 순차적으로 또는 블록 1, m, 및 n의 블록 중합체로서 제공될 필요는 없고, 반복 단위는 임의의 순서로 제공될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
전형적으로, 올리고머에서 PNA 단위 (1 + m + n)의 총 수는 5개 내지 50개, 예를 들어 7개 내지 40개, 예를 들어 10개 내지 30개, 전형적으로 12개 내지 24개 의 범위일 수 있다.
본 발명의 임의의 다른 양태와 관련하여 기술된 특징들은 본 발명의 제 6 양태에 따른 PNA 올리고머와 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간략함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
본 발명의 제 7 양태에 따르면, 유전자 또는 핵산 분석 방법에서, 본원에 기재된 바와 같은 개질된 PNA 분자 (예를 들어, PNA 올리고머)에 대한 용도가 제공된다.
용어 "유전자" 또는 "핵" 분석 방법은, 예를 들어 핵산의 핵염기의 특성규명, 동정 및/또는 시퀀싱을 목적으로 하는 방법을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일 실시형태에서, 그러한 방법은 개별 뉴클레오티드, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 특성규명하고/하거나 핵산을 시퀀싱하는데 사용될 수 있다.
따라서, "핵염기의 특성규명"이라는 문구는 특정 핵산 서열의 특정 핵염기를 동정하거나 결정하는 행위, 즉, 특정 뉴클레오티드가 어떠한 핵염기를 포함하는지를 확인하는 행위를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 이 방법을 사용하여 SNP를 특성규명하는 경우, "특성규명"이라는 용어는 특정 핵산 서열에 어떠한 특정 SNP 대립 유전자 (또는 핵염기)가 존재하는지를 결정하는 행위를 포함하는 것으로 간주될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 유전자 분석 방법 (예를 들어, 핵산 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드(들)을 특성규명하는 방법)에서 사용하기 위한 개질된 PNA 분자 (예를 들어, PNA 올리고머)는 특성규명하려는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 염기를 결여할 수 있다. 그러한 경우, PNA 올리고머는 "공백" 또는 "무염기" PNA 단위를 포함하는 것으로 기술될 수 있다.
본 발명의 임의의 다른 양태와 관련하여 기술된 특징들은 본 발명의 제 7 양태에 따른 용도과 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간략함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
본 발명의 제 8 양태에 따르면, PNA 분자, 예를 들어 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 PNA 단량체를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은,
화학식 (A3)에 따른 화합물을 제공하는 단계;
상기 화학식 (A3)의 화합물을 핵염기 함유 산 유도체 또는 보호기 P와 반응시키는 단계; 및
가수분해하는 단계를 포함한다.
Figure pct00019
상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고,
P1은 보호기이다.
상기 핵염기 함유 산 유도체는 화학식 NB-1에 따른 화합물일 수 있다.
Figure pct00020
상기 식에서, NB는 핵염기이다.
따라서, 상기 방법은 반응식 1에 따른 반응을 포함할 수 있다:
Figure pct00021
일 실시형태에서, 상기 화학식 (A3)의 화합물에 도입된 보호기 P는 Boc 보호기일 수 있다.
일 실시형태에서, 보호기 P1은 Fmoc일 수 있다.
상기 방법은 반응식 2에 따른 반응을 포함할 수 있다:
Figure pct00022
따라서, 상기 화학식 (A5)의 화합물은 무염기 또는 "공백" PNA 단량체로 명명될 수 있다.
상기 방법은 상기 화학식 (A3)의 화합물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 화학식 (A1)에 따른 화합물과 같은 N-보호 알파-개질 글리신 화합물의 아민화를 포함할 수 있다.
Figure pct00023
상기 아민화는 N-보호 알파-개질 글리신 화합물, 예를 들어 화학식 (A1)에 따른 화합물을 글리신 메틸 에스테르와 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 아민화는 반응식 3에 따른 반응을 포함할 수 있다:
Figure pct00024
상기 방법은 상기 화학식 (A1)의 화합물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 화학식 (A0)에 따른 화합물의 산화를 포함할 수 있다.
Figure pct00025
상기 산화는 반응식 4에 따른 반응을 포함할 수 있다.
Figure pct00026
전형적으로, N-말단 및/또는 C-말단 위치는 (전술한 바와 같이) 보호기를 포함하도록 유도체화될 수 있다. 따라서, PNA 단량체는 보호될 수 있고/거나 N-말단 또는 C-말단 위치에 보호기 P를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, P1이 보호기 P인 경우, P2는 수소이며, 그 반대도 마찬가지이다.
바람직한 실시형태에서, P1은 보호기 P이고, P2는 수소이다. 그러한 경우, 상기 PNA 단량체는하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00027
본 발명의 임의의 다른 양태와 관련하여 기술된 특징은 본 발명의 제 8 양태에 따른 방법과 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간결함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
본 발명의 제 9 양태에 따르면, 본 발명의 제 5 또는 제 6양태에 따른 PNA 올리고머를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 하나 이상의 PNA 단량체를 반응시켜 PNA 올리고머를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 하나 이상의 PNA 단량체 (즉, 기 "G"를 감마 위치에 갖는 PNA 단량체)를, 기 "G"를 감마 위치에 포함하지 않는 하나 이상의 PNA 단량체와 같은 상이한 PNA 단량체와 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 N-말단에 보호기 P를 포함하는 하나 이상의 PNA 단량체를 사용하여 PNA 올리고머를 합성하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 고체상에서 (문헌[J.J. Diaz-Mochon et al., Org. Lett. 2004, 6, 1127-1129]) 문헌[Bradley et al., Tetrahedron, 2005, 61, 8295-8305]에 개시된 방법에 교시된 바와 같은 Dde-보호 PNA 단량체를 사용하여 PNA 올리고머를 합성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 PNA 단량체를, 예를 들어 이의 C-말단을 통해, 지지체, 예를 들어 고체 지지체 상에 고정시키는 예비 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 개질된 지지체와 PNA 단량체의 C-단부 사이의 공유 결합을 통해 PNA 단량체를 고정시키는 단계를 포함할 수 있다.
지지체 상에 고정되거나 이에 결합된 PNA 단량체는, 하전된 모이어티를 위치시키려는 PNA 올리고머 내의 위치(들)에 따라, 본 발명의 제 1 양태에 따른 PNA 단량체, 또는 기 "G"를 감마 위치에 포함하지 않는 상이한 PNA 단량체일 수 있음이 인지될 것이다.
본 발명의 임의의 다른 양태과 관련하여 기술된 특징들은 본 발명의 제 9 양태에 따른 방법과 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간결함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
본 발명의 제 10 양태에 따르면, 핵산 서열에서 뉴클레오티드를 특성규명하는 방법이 제공되며, 상기 방법은,
(a) 핵산을, 그 핵산의 일부와 하이브리드화할 수 있는 본원에 기재된 펩티드 핵산(PNA) 올리고머와 접촉시켜, 핵산/PNA 이중체를 형성하는 단계; 및
(b) 상기 핵산/PNA 이중체를 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 개질 염기와 접촉시키는 단계를 포함한다:
(i)
Figure pct00028
(ii)
Figure pct00029
(iii)
Figure pct00030
; 및
(iv)
Figure pct00031
상기 식에서, Y는 가역적 공유 결합 반응이 가능한 작용기이고;
X1 내지 X4는 검출 가능한 태그, 스페이서-태그 조합 또는 수소이고;
Z는 탄소 또는 질소이며;
상기 PNA 올리고머는 작용기 Y와 가역적으로 반응할 수 있는 모이어티를 포함하고, 상기 핵산/PNA 이중체와 통합되는 개질 염기는 특성규명하려는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이며, 상기 뉴클레오티드는 질량 분석에 의해 또는 상기 개질 염기의 검출 가능한 태그에 의해 특성규명된다:
바람직한 실시형태에서, 상기 PNA 올리고머는 특성규명하려는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 염기를 결여할 수 있다. 그러한 경우, 상기 PNA 올리고머는 "공백" 또는 "무염기" PNA 단위를 포함하는 것으로 기술될 수 있다.
상기 PNA 올리고머는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Figure pct00032
상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
NB는 핵염기이고;
l ≥ 1이고; m ≥ 0이고; n ≥ 0이고, 단, l + m + n ≥ 2이며, n + m ≥ 1이다.
바람직하게는, m ≥ 1이다.
전형적으로, m = 1이다.
바람직하게는, n ≥ 1이다.
일 실시형태에서, 상기 PNA 분자는 지지체에 부착될 수 있다. 전형적으로, 상기 PNA 분자는 지지체에 공유 결합될 수 있다.
상기 지지체는 고체 지지체, 예를 들어, 본 발명의 제 5 양태에 따른 PNA 올리고머와 관련하여 기재된 바와 같은 지지체를 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 다른 양태과 관련하여 기술된 특징들은 본 발명의 제 10 양태에 따른 방법과 관련하여 동일하게 적용될 수 있으며, 그러한 특징들은 간결함을 위해 여기서는 반복하지 않는다.
이하, 본 발명은 다음의 도면을 참조하여 상세히 설명될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 PNA 단량체를 제조하는데 사용된 반응식을 도시하고;
도 2는 PNA 프로브를 시험하기 위한 비색법을 나타내는 도식을 도시하고;
도 3은 시험한 PNA 분자의 예를 도시하고;
도 4는 도 3의 PNA 분자에 대해 측정된 강도의 결과를 도시하고;
도 5는 시험한 PNA 분자의 대안적인 예를 도시하고;
도 6은 도 5의 PNA 분자에 대해 측정된 강도의 결과를 도시하고;
도 7은 시험한 PNA 분자의 대안적인 예를 도시하고;
도 8은 도 8의 PNA 분자에 대해 측정된 강도의 결과를 도시하고;
도 9는 PNA 분자의 대안적인 실시형태에 대해 측정된 강도의 결과를 도시하고;
도 10은 상이한 지지체를 사용하여 시험한 PNA 분자의 예를 도시하고;
도 11은 도 10의 PNA 분자에 대해 측정된 강도의 결과를 도시한다.
도 12는 PNA 프로브를 시험하는 두 가지 대안적인 방법을 나타내는 도식으로서, A)는 화학발광법 (마이크로플레이트 판독기를 사용함)이고; B) 형광분석법 (유세포 계측을 이용함)을 도시한다.
도 13은 표 1 (하기 참조)에 기재된 PNA 올리고머의 성능을 도시한다. (+) 양성 신호 - oligo 122 (15nM). (-) 음성 신호 - 대조군으로서 물.
도 14는 표 2 (하기 참조)에 기재된 PNA 올리고머의 유세포 계측 분석을 도시한다. 도 14a) PNA 올리고머 DGL 21_6.0, SMART-A-핵염기-바이오틴 및 Oligo DNA 21 (15nM)을 함유하는 미세구체를 사용하여 미세구체 표지화를 수행하였고; 도 14b) 음성 대조군으로서 물을 사용하였다 (표지화 없음).
도 15는 표 2 (하기 참조)에 보고된 PNA 올리고머의 유세포 계측 분석을 도시한다. PNA 올리고머 DGL 21_2.0 (도 15a)와 DGL 21_3.0 (도 15b), SMART-A-핵염기-바이오틴 및 oligo DNA 21 (15nM)을 함유하는 미세구체를 사용하여 미세구체 표지화를 수행하였다.
실시예
제조
단량체 제조
본 발명의 감마-개질 핵염기 함유 PNA 단량체 및 "공백" PNA 단량체를 제조하였다.
본 실시형태에서, PNA 단량체는 (L) 글루탐산 아미노 유도체를 기반으로 하였다.
본 실시형태에서, 핵염기 함유 감마-개질 PNA 단량체 (A8) 및 "공백" 감마-개질 PNA 단량체 (A9)를 다음과 같이 제조하였다.
제 1 단계에서, 화학식 (A6)의 (L) Fmoc-글루타몰(Glutamol)의 1) 산화 및 2) 환원성 아민화에 의해 화학식 (A7)의 감마-개질 화합물을 제조하였다. 알코올을 알데히드 (IBX 또는 DMP)로 산화시키고, 이어서 이를 환원성 아민화 조건 하에서 글리신 메틸 에스테르 (A2)와 반응시켜 감마-개질 화합물 (A7)을 수득하였다.
제 2 단계에서, 감마-개질 화합물 (A7)을 반응시켜 핵염기 함유 PNA 단량체 (A8) 또는 "공백" PNA 단량체 (A9)를 수득하였다.
핵염기 함유 PNA 단량체 (A8)를 제조하기 위해, 감마 글루탐산 화합물 (A7)을 핵염기 (A, C, G, T)와 커플링시키고, 이어서 가수분해 조건 하에서 처리하여 감마-개질 핵염기 함유 PNA 단량체 (A8)을 수득하였다.
키랄성 "공백" PNA 단량체 (A9)를 제조하기 위해, 화합물 (A7)의 2급 아민을, 본 실시형태에서는 Boc인 보호기로 보호하고, 생성된 생성물을 가수분해 조건 하에서 처리하여 "공백PNA" 단량체 (A9)를 얻었다.
이는 도 1의 반응식에 예시되어 있다.
PNA 분자
상기 단량체 A8 및 A9를 함유하고/하거나 이로부터 유래된 PNA 올리고머를 비롯한 다양한 PNA 분자를 제조하고 평가하였다.
PNA 분자의 특이성 및 감도를 평가하기 위해, 바이오틴으로 개질된 SMART C 핵염기를 사용하였다. N-말단 단부에 있는 아미노-페길화 기를 통해 나일론 막 상에 지지된 PNA 프로브를 사용하여 (도 2의 도식에 도시된 바와 같은) 비색법을 수행하였다.
본 방법에서는, N-말단에서 아미노-페길화 기로 개질된 DestiNA 프로브 (10 내지 100 μM 용액)를 Immunodyne ABC (Pall로부터의 활성화 나일론 6.6 막) 상에 고정시켰다. 30 μL의 SMART-C-PEG-바이오틴 (SMART "리더 베이스(Reader Base)") (100 μM), 45 μL의 100 nM 핵산 가닥 (KWT DNA와 K12S DNA) 또는 45 uL의 PCR KWT와 K12S 및 20 μL의 환원제, 시아노수소화붕소나트륨 (15 mM) 및 0.1 % SDS (pH 6)를 함유한 205 μL의 0.1 M 시트레이트 완충액을 사용하여 DestiNA 마스터 믹스(master mix)를 제조하였다. 이어서 DestiNA 마스터 믹스를 반점이 형성된 막에 첨가하고, 41℃에서 20분 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 진공 매니폴드를 사용하여 0.5x 시트르산나트륨 식염수(SSC) 및 0.5 % 소디움 도데실 설페이트(SDS)로 막을 2회 세척하였다. 막을 BSA와 카제인이 함유된 블로킹 용액으로 5분 동안 블로킹하고, 이어서 스트렙타비딘-알칼라인 포스파타아제 용액을 막에 첨가하고 29℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 진공 매니폴드를 사용하여 트리스-HCl 0.1M/트윈 20 0.5%로 4회 세척하였다. 마지막으로, NBT/BCIP 발색 용액을 첨가하고, 36℃에서 8분 동안 인큐베이션하였다. 세척 단계 후에, 막의 사진을 촬영하고 반응의 강도를 측정하였다. LED 조명을 이용하는 LifeCam으로 영상을 촬영하였다. 농도계측 영상 소프트웨어에 의해 신호 강도를 측정하였다. 신호 값은 동일한 막 내의 바이오틴 마커 강도와 관련된 임의의 단위이다.
a) 6개의 감마-개질 단위 및 "비개질" 무염기 위치를 함유하는 PNA 분자
"비개질" 무염기 위치와 함께 6개의 감마-개질 단위 (흑색으로 표시됨)를 함유하는 4개의 상이한 PNA 프로브 (도 3에 도시됨)를 나일론 막에 고정시키고 시험하였다.
특히, 백색으로 나타낸 반복 단위는 감마 위치에 임의의 치환체가 없고, 흑색으로 나타낸 반복 단위는 이들의 감마 위치에 카르복실산 기를 함유하는 모이어티를 가졌다.
프로브의 특이성 및 감도를 다음과 같이 평가하였다:
(i) 특이성: 하기 (a) 또는 (b)와 반응한 경우 두 PNA 프로브 사이의 가장 높은 신호 차이:
(a) KWT DNA (양성 대조군 - 특성규명하려는 뉴클레오티드로서 "G"를 함유하는 핵산 가닥의 일부; 이 뉴클레오티드는 이에 따라 개질 핵염기가 지니는 검출 가능한 태그에 의해 특성규명되며, 이 경우 왓슨과 크릭 쌍형성 규칙을 따라 개질 염기는 "C"임) 또는
(b) K12S DNA (음성 대조군 - 특성규명하려는 뉴클레오티드가 "A"를 함유하는 핵산 가닥의 일부; 이 뉴클레오티드는 이에 따라 개질 핵염기가 지니는 검출 가능한 태그에 의해 특성규명되지 않아야 하는데, 그 이유는 이의 상보적 개질 염기 "T"가 검출 가능한 태그를 지니지 않기 때문임).
(ii) 감도: 시험한 4개의 프로브인 12SRC - 12DAV - 13SRC - 13DAV에 의해 주어진 신호는 DNA KWT를 사용한 경우 유사해야 한다.
양성 대조군인 KWT DNA와 음성 대조군인 K12S DNA의 구체적인 구조; 및 각 프로브에 대해 측정된 신호의 결과는 도 4에 도시되어 있다.
도 4에는, PCR 증폭으로부터의 DNA 및 PNA (DGL) 서열이 정렬되어 있다. 미스매치 뉴클레오티드에는 밑줄이 그어져 있다. 프로브를 100 μM로 반점을 형성하였다.
K13SRC를 제외한 4개의 모든 프로브의 경우 특이성 (KWT 막과 K12S 막 사이의 상이한 신호)이 매우 양호한 것으로 관찰되었다. 또한, 감도 (동일한 막 내의 K12DAV 및 K13DAV와 비교한 경우 프로브 K12SRC 및 K13SRC에 의해 제공된 신호 강도의 차이)는 만족스럽지 못하고 (76 - 90 대 44 - 44), 도 3에 도시된 서열을 기초로 하여 예측하고 이해하기 어려운 것으로 관찰되었다.
b) 무염기 또는 "공백" 위치에 대안적인 변이체를 함유하는 PNA 분자
나일론 막에 고정하고 도 2에 따라 시험한 프로브의 구체적인 구조는 하기 도 5에 도시되어 있다. 이 경우, 프로브를 50 μM로 반점을 형성하였다 (도 4에서 시험한 6-neg 프로브 농도의 절반).
도 5에서, Glu 프로브는 C 및 N 말단 단부 모두에 표준 글루탐산 단위를 가진다. U 및 Glu는 감마 위치에 임의의 치환체가 없는 무염기 단위에 해당한다. CBU는 감마 위치에 중성 (메틸) 기를 포함하는 무염기 단위에 해당한다. CBC는 카복실산 기를 함유하는 모이어티를 감마 위치에 갖는 무염기 단위에 해당한다.
각 프로브에 대해 측정된 신호의 결과는 도 6에 도시되어 있다.
CBC 프로브 (무염기 위치에 있는 단위가 카르복실 기를 함유함)는 4개의 상이한 프로브 (K12SRC, K12DAV, K13SRC 및 K13DAV) 사이에 매우 유사한 강도를 나타내면서 허용되는 수준의 특이성을 유지하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 신호 강도는 비교적 낮았다.
또한, 나머지 프로브들은 4 가지 유형의 프로브 사이에 강도 면에서 높은 수준의 변화를 겪는 것으로 관찰되었다.
c) 무염기 또는 "공백" 위치에 대안적인 변이체를 함유하는 PNA 분자뿐만 아니라 핵염기를 함유하는 다른 단위에 변이체를 함유하는 PNA 분자
나일론 막에 고정하고 도 2에 따라 시험한 프로브의 구체적인 구조는 하기 도 7에 도시되어 있다. 프로브를 10, 20 및 50 μM로 반점을 형성하였다.
각 프로브에 대해 측정된 신호의 결과는 도 8에 도시되어 있다.
3RCC 배열이 PNA K12SRC 및 K12DAV의 경우 특이성 (각각 55 대 3 및 55 대 5) 면에서 가장 우수한 것으로 관찰되었다. 이러한 배열에서, 공백 위치는 양측에서 감마 위치에 임의의 치환체가 없는 핵염기 단위에 의해 카르복실산 기를 함유하는 모이어티를 감마 위치에 갖는 핵염기 단위로부터 분리되어 있다. 이 배열은 또한 6Neg PNA 구조로 얻은 결과와는 달리 신호들이 유사한 강도를 가질 수 있게 해준다. 또한, 카르복실산 기를 함유하는 모이어티를 감마 위치에 갖는 핵염기 단위가 무염기 키랄 단위에 바로 인접하지 않은 경우 (3CC 프로브) 프로브가 더 잘 성능을 발휘하는 것으로 관찰되었다.
또한, 표준 프로브 (천연 아미노산 글루탐산 기를 통해 C 및 N 단부 둘 모두에 단지 음전하를 갖는 U 및 Glu 프로브)는 더 낮은 특이성을 부여하는 것으로 관찰되었는데, 이는 이들이 음성 대조군인 K12S DNA를 사용하는 경우 더 높은 신호를 유발하기 때문이었다.
이어서, 프로브 K13SRC 및 K13DAV를 3RCC 배열로 시험하였다. 프로브를 20 μM로 반점을 형성하였다. 결과는 도 9에 도시되어 있다.
도 9로부터, 3RCC 개질이 감도와 특이성 둘 모두와 관련하여 탁월한 성능을 제공함을 알 수 있다.
d) 막의 대안으로서 비드 지지체의 사용
프로브 DGL-13SRC-CBC 및 DGL-13SRC-3RCC (하기 도 10 참조)를 나일론 막 대신 자기(magnetic) 미세구체에 공유 결합시키고, 비색법이 아닌 전기 화학적 검출을 통해 SMART 핵염기 혼입을 검출하였다.
표준 카르보디이미드 커플링 화학을 두 단계로 사용하여 프로브를 다이나비즈 카르복실산(Dynabeads Carboxylic Acid) 미세구체(microsphere)(미국의 Thermo Fisher Scientific)에 커플링시켰다. 미세구체를 세척하고 (x2, 0.02% 트윈-20, 200 μL 및 x2, 0.1% SDS, 200 μL), 물에 재현탁시키고 (100 μL 당 약 100만개의 미세구체), pH 6.0으로 조정된 2x 시트르산나트륨 식염수(SSC)와 0.1% 소디움 도데실 설페이트(SDS) (완충액 A)로 희석하였다 (μL 당 100개의 미세구체). 23.5 μL의 완충액 A, 12.5 μL의 작용기화 미세구체 (완충액 A에 분산되어 있고, μL당 100개의 미세구체를 함유함), 4 μL의 SMART-C-PEG-바이오틴 (500 μM), 7.5 μL의 (1 μM, 100 nM, 10 nM 또는 1 nM의) s-miRNA122 또는 대조군인 s-miRNA21 및 s-miRNA122-A 및 2.5 μL의 환원제, 시아노수소화붕소나트륨 (20 mM)을 200 μL 에펜도르프에 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)하고, 인큐베이션하였다 (41℃로 30분간, 써멀 사이클러(thermal cycler)). 이어서, 미세구체를 완충액 A로 2회 세척하고, (50 μL의 완충액 A 중에) 재현탁시킨 후, 10 μL의 스트렙타비딘-HRP를 10분 동안 첨가하였다. 세척 단계 (3 분의 자기 분리) 후, 전자 전달 매개체로서 하이드로퀴논(HQ)을 사용하고, HRP 기질로서 과산화수소 (H2O2)를 사용하였다. 이 단계에서, 스크린 프린트 탄소 전극(Screen-printed carbon electrode, SPCE) (스페인의 Dropsens)를 사용한 전류 측정을 수행하였다.
결과는 도 11에 도시되어 있다.
DGL-13SRC-3RCC 프로브 (공백 위치에 있는 감마-개질 단위가 양측에서 감마 위치에 임의의 치환체가 없는 핵염기 단위에 의해 카르복실산 기를 함유하는 모이어티를 갖는 감마-개질 핵염기 단위로부터 분리되어 있음)는 DGL-13SRC-3CBC 프로브 (공백 위치에 있는 감마-개질 단위가 감마-개질 핵염기 단위를 지니지 않음)와 비교하여 특정 신호 생성을 3배 개선시키는 것으로 관찰되었다.
상기 실험은 PNA 프로브 내의 무염기 단위 및 다양한 위치들 둘 모두에서 키랄 개질을 조합하는 능력의 이점을 입증한다.
상기 시험은 감마 위치에 임의의 치환체가 없는 핵염기 단위에 의해 카르복실산 기를 함유하는 모이어티를 갖는 감마-개질 핵염기 단위로부터 양측에서 분리된 공백 위치에 감마-개질 단위를 갖는 프로브의 경우 탁월한 성능을 나타내지만, 프로브 내의 감마-개질 핵염기 단위의 특정 위치가 프로브의 개선된 성능을 손상시키지 않고 변경될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 예를 들어, 감마-개질 핵염기 단위는 공백 위치로부터 2개, 3개 또는 4개 단위 만큼 떨어져 위치할 수 있다. 하나 이상의 감마-개질 핵염기 단위의 최적 위치는 프로브의 길이 및 프로브에 대한 특정 응용과 같은 다수의 인자에 좌우될 수 있다.
e) 화학발광 플랫폼 (마이크로플레이트 판독기)을 사용한 순환 마이크로RNA(miRNA) 검출을 위한 키랄 개질-PNA 프로브의 용도.
성숙 miRNA122 가닥과의 역평행 하이브리드화가 가능하도록 상기 단량체 A8 및 A9를 함유하고/하거나 이로부터 유래된 PNA 올리고머를 설계/제조하였다 (표 1). 표 1 (하기 참조)에 나타낸 바와 같이, 프로브 DGL122_3.0-5.0와 같은 비개질 PNA 단량체를 함유하는 PNA 올리고머 및 3개 이상의 감마-개질 단위를 지닌 일부 다른 프로브 (DGL122_1.2, 4.1, 4.2)를 합성하였다.
PNA 분자를 시험하기 위해, 바이오틴으로 태깅된 개질 핵염기 (SMART-C-핵염기-바이오틴)를 (도 12의 도식 A에 도시된 바와 같이) 화학 발광 방법과 함께 사용하였다.
PNA 분자를 시험하여, i) 감마-개질 단위의 존재; ii) 무염기 단위 내의 감마-개질의 존재; iii) PNA 올리고머의 무염기 단위 위치 및 길이 (하기 표 1 참조)에 관하여 상기 PNA 분자의 특이성 및 감도를 평가하였다.
이 방법에서, N-말단에서 아미노 페길화 기로 개질된 프로브를, 제조자 프로토콜 (Thermo Fisher Scientific)에 따라 두 단계 프로토콜 (NHS 비함유) 카르보디이미드 커플링 화학을 이용하여 카르복실화 다이나비즈(Dynabeads®) (M-270 Carboxylic Acid)에 공유 결합시켰다.
50 μL의 미세구체 (4 x 104 비드/uL), SMART-C-핵염기-바이오틴 (리더 베이스) (2 μM), 15 nM의 핵산 가닥 (Oligo DNA 122) 또는 그 대신 대조군으로서의 물 및 환원제, 시아노수소화붕소나트륨 (1 mM) 및 SCD 완충액 (2x SSC 및 0.1% SDS - pH 6.0)을 사용하여 50 μL의 최종 부피가 되도록 마스터 믹스를 제조하였다. 이어서, DestiNA 마스터 믹스를 볼텍싱하고, 써멀 사이클러에서 41℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 완료시, 미세구체를 200 uL의 세척 완충액 A (PBS-트윈 0.1%)로 3회 세척하였다. 이어서, 미세구체를 펠렛화하고, 상층액을 분리하고, 100uL의 피어스 하이 센서티비티 스트렙타비딘-HRP(Pierce High Sensitivity Streptavidin-HRP) (1:8000) 용액 (Thermo Fisher Scientific)과 함께 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 세척 단계 (완충액 A에서 4 x) 후, 미세구체를 펠렛화하고 100 uL의 기질인 수퍼시그널 ELISA 피코 케미루미네슨트 서브스트레이트(SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate) (Thermo Fisher Scientific)에서 다시 상층액을 분리하였다. 미세구체를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 완료시, 화학발광 검출 능력을 갖는 플레이트 판독기 (FLUOstar Omega)를 사용한 최종 판독을 위해 미세구체/기질을 기판 (백색 96-웰 플레이트)에 옮겼다 (100 uL) (도 12의 A). 결과는 도 13에 도시되어 있다.
최상의 성능 결과는 캡처 프로브 122_1.2, 122_4.1 및 122_4.2를 사용하여 얻었다. 구체적으로, 감마-개질 단위가 공백 위치 (감마-개질 무염기 위치)에 있거나 PNA 골격에 걸쳐 분포되어 있는 122_1.2, 122_4.1 및 122_4.2 프로브는 DGL122_3.0-5.0 프로브 (공백 위치에 감마-개질 단위가 없거나 PNA 골격에 걸쳐 감마-개질 핵염기 단위가 없음)와 비교하여 특정 신호 생성을 개선하는 것으로 관찰되었다.
PNA 올리고머 122_4.1 (공백 위치에 감마-개질 단위를 갖지 않고, 좌측에 2개의 감마-개질 핵염기를 그리고 우측에 하나의 감마-개질 핵염기를 지님 (표 1 참조))은 양호한 성능을 나타냈다. 이는 PNA 올리고머의 성능 (즉, 신호 대 배경 비의 개선; 상기 배경은 반응이 대조군으로서 물을 사용하여 수행된 경우 (도 13에서 DestiNA 프로브 뒤에 "-"가 붙음) 얻은 배경과 비교한 것임)이 프로브 내의 감마-개질 핵염기 단위의 위치에 부분적으로 좌우됨을 나타낸다. 이러한 결과는 감마-개질 핵염기 단위의 최적 위치 및 수는 다수의 인자 및 프로브의 특정 응용에 좌우될 수 있음을 확인해준다.
f) 유세포 계측을 이용한 순환 마이크로RNA(miRNA) 검출을 위한 키랄 개질-PNA 프로브의 용도
유세포 계측을 이용하여 "공백 위치"에 있는 감마-개질 단위뿐만 아니라 PNA 올리고머의 골격에 걸쳐 분포된 감마-개질 단위의 효과를 추가로 연구하였다 (도 12의 B).
성숙 miRNA21 가닥과의 역평행 하이브리드화가 가능하도록 상기 단량체 A8 및 A9를 함유하고/하거나 이로부터 유래된 3개의 PNA 올리고머를 설계/제조하였다 (표 2). PNA 올리고머 DGL21_2.0과 DGL21_6.0은 성숙 miRNA21의 동일한 영역에 하이브리드화하도록 설계되었다. 두 올리고머는 공백 위치 옆의 (또는 이에 인접한) 2개의 티민 핵염기 상에 각각 존재하는 2개의 감마-개질 단위를 지닌다. 또한, DGL21_6.0는 공백 위치에 감마-개질 단위를 함유하고 있고, 서열이 약간 더 길다 (17량체 대신 19량체). 다른 17량체 PNA 올리고머 (DGL21_3.0)는 성숙 miRNA21 가닥의 상이한 영역에 역평행 하이브리드화가 가능하도록 설계되었고, 공백 위치의 양측의 티민 핵염기 상에 2개의 감마-개질 단위를 지닌다 (표 2). 상기 3개의 PNA 올리고머의 경우, 공백 위치는, 하이브리드화 후에 성숙 miRNA21 가닥이 공백 위치 앞에 우라실 (표 2, 녹색으로 나타낸 핵염기)을 제시함으로써 바이오틴으로 태깅된 아데닌 개질 핵염기 (SMART-A-핵염기-바이오틴)의 혼입을 가능하게 하도록 위치하였다.
표준 카르보디이미드 커플링 화학을 두 단계로 사용하여 (커플링은 상기 보고된 바와 같이 수행하였음) PNA 올리고머 DGL21_2.0, DGL21_6.0 및 DGL21_3.0을 다이나비즈 카르복실산(Dynabeads Carboxylic Acid) 미세구체 (미국의 ThermoFisher Scientific)에 공유 결합시켰다. PNA 분자의 특이성과 감도를 평가하기 위해, SMART-A-핵염기-바이오틴 (리더 베이스)의 선택적 혼입에 의해 미세구체의 성능을 평가하였다.
유세포 계측 방법을 이용하여 미세구체를 처리하였다. 50 μL의 미세구체 (8 x 107 비드/uL), SMART-A-핵염기-바이오틴 (30 μM), 15 nM의 핵산 가닥 (Oligo DNA 21) 또는 그 대신 대조군으로서의 물 및 환원제, 시아노수소화붕소나트륨 (150 μM) 및 인산염 완충액 pH 6 (150 mM)을 사용하여 50 μL의 최종 부피가 되도록 마스터 믹스를 제조하였다. 이어서, 마스터 믹스를 볼텍싱하고, 써멀 사이클러에서 41℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 완료시, 미세구체를 200 uL의 세척 완충액 A (PBS-트윈 0.1%)로 3회 세척하였다. 이어서, 미세구체를 펠렛화하고, 상층액을 분리하고, Thermo Fisher Scientific으로부터 구입한 100 uL의 스트렙타비딘-R-피코에리트린 컨쥬게이트(Streptavidin-R-Phycoerythrin Conjugate) - SAPE (20 μg/mL)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. SAPE 인큐베이션 후에, 미세구체를 BD FACSCanto (PE-채널, 필터 585/42) 및 Flowjo를 통해 얻은 도트 플롯에 의해 분석하였다.
결과는 도 14에 도시되어 있다.
PE 채널 상에서의 집단 이동은 PNA 올리고머 DGL 21_6.0을 함유한 미세구체의 경우 뚜렷하게 나타났다. DGL 21_6.0 프로브 (공백 위치에 감마-개질 단위를 함유하고 다른 감마-개질 단위는 PNA 골격에 걸쳐 분포되어 있음)는, DGL21_2.0 및 DGL21_3.0 프로브 (공백 위치에 감마-개질 단위가 없음) (도 15)와 비교하여 특정 신호 생성 (PE 채널 상에서의 집단 이동)과 함께 리더 베이스의 효율적인 동적 혼입을 가능하게 하는 것으로 (도 14) 관찰되었다. 이러한 결과는 공백 위치에서의 감마-개질의 첨가 (DGL 21_6.0)가 DGL21_2.0와 같은 매우 유사하지만 공백 위치에 감마-개질이 없는 서열 (표 2 참조)과 비교한 경우 탁월한 SMART-A-핵염기-바이오틴 혼입을 가져옴을 보여준다.
표
Figure pct00033
표 1: 순환 마이크로RNA 122를 위한 PNA 분자. 성숙 miRNA122 가닥와 상보적인 핵염기의 서열을 갖는 6개의 PNA 올리고머. 올리고머는 비개질 PNA 단량체 (백색 원) 및 카복실산 기를 함유하는 모이어티를 감마 위치에 함유하는 키랄 개질 함유 단량체 (흑색 원)를 함유하였다. 흑색 타원과 빈 타원은 감마 위치에 각각 개질이 있거나 없는 무염기 단위를 나타낸다.
Figure pct00034
표 2: 순환 마이크로RNA 21을 위한 3개의 PNA 분자. 범례에 대해서는 표 1을 참조한다.

Claims (37)

  1. 적어도 하나의 반복 단위가, 이의 감마 위치에, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 포함하는, PNA 올리고머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PNA 올리고머가 유래되는 PNA 단량체, 또는 상기 PNA 올리고머의 하나 이상의 반복 단위가 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로부터 유래되는, PNA 올리고머.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PNA 올리고머가 하기 일반식을 갖는, PNA 올리고머:
    　
    Figure pct00035

    상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
    NB는 핵염기이고; 및
    l ≥ 0이고; m ≥ 0이고; n ≥ 0이고, 단, l + m + n ≥ 2이며, n + m ≥ 1이다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머 내의 PNA 단위 (l + m + n)의 총 수가 12 내지 24의 범위인, PNA 올리고머.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 각각의 감마 위치에 포함하는 반복 단위의 수, 및/또는 화학식 (V)에서 "G" 모이어티를 갖는 단위의 수가 3개 내지 5개의 범위인, PNA 올리고머.
  6. 제1항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 각각의 감마 위치에 포함하는 반복 단위의 수 및/또는 화학식 (V)에서 "G" 모이어티를 갖는 단위의 수의, 반복 단위의 총 수에 대한 비가, 1:10 내지 1:2 범위인, PNA 올리고머.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, m = 1인, PNA 올리고머.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PNA 분자가 고체 지지체에 공유 결합되어 있는, PNA 올리고머.
  9. 하기 일반식을 갖는 PNA 올리고머:
    Figure pct00036

    상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
    NB는 핵염기이고;
    l ≥ 0이고; m ≥ 0이고; n ≥ 0이고, 단, l + m + n ≥ 2이며, n + m ≥ 1이다.
  10. 제9항에 있어서, m = 1인, PNA 올리고머.
  11. 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 감마 위치에 포함하는 PNA 단량체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 PNA 단량체가 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로부터 유래되는, PNA 단량체.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 PNA 단량체가 하기 일반식을 갖는, PNA 단량체:
    Figure pct00037

    상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
    P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
    P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고,
    P3은 수소이거나, 보호기 P이거나, 또는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이며:
    Figure pct00038

    상기 식에서, NB는 핵염기이다.
  14. 제13항에 있어서, P3이 화학식 (II)로 표시되는 기가 아닌, PNA 단량체.
  15. 제13항에 있어서, P3이 보호기 P이거나 수소인, PNA 단량체.
  16. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PNA 단량체가 하기 일반식을 갖는, PNA 단량체:
    Figure pct00039

    상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
    P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
    P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고;
    NB는 핵염기이다.
  17. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PNA 단량체가 하기 일반식을 갖는, PNA 단량체:
    Figure pct00040

    상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
    P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
    P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이다.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, P1이 보호기 P인 경우 P2는 수소이고, 그 반대도 마찬가지인, PNA 단량체.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PNA 단량체가 하기 일반식을 갖는, PNA 단량체:
    Figure pct00041

    상기 식에서, P1은 보호기 P이다.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PNA 단량체가 하기 일반식을 갖는, PNA 단량체:
    Figure pct00042

    상기 식에서, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐이다.
  21. 하기 일반식을 갖는, PNA 단량체:
    Figure pct00043

    상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
    P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
    P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고,
    P3은 수소이거나, 보호기 P이거나, 또는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이며:
    Figure pct00044

    상기 식에서, NB는 핵염기이다.
  22. 하전된 모이어티 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티를 적어도 하나의 감마 위치에 포함하는, PNA 이량체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 PNA 이량체가 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로부터 유래되는, PNA 이량체.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 PNA 이량체가 하기 일반식을 갖는, PNA 이량체:
    Figure pct00045

    상기 식에서, G1 및 G2는 독립적으로 수소 또는 G이며, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
    P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
    P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고,
    P3은 수소이거나, 보호기 P이거나, 또는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이며;
    Figure pct00046

    상기 식에서, NB는 핵염기이고;
    단,
    G1 및 G2 중 적어도 하나는 G이고,
    P3이 수소 또는 보호기 P인 경우, G1 = G이고,
    P4가 수소 또는 보호기 P인 경우, G2 = G이다.
  25. 하기 일반식을 갖는, PNA 이량체:
    Figure pct00047

    상기 식에서, G1 및 G2는 독립적으로 수소 또는 G이며, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고;
    P1은 보호기 P이거나, 수소이고;
    P2는 보호기 P이거나, 수소이거나, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 할로겐으로 이루어진 목록으로부터 선택된 기이고,
    P3은 수소이거나, 보호기 P이거나, 또는 하기 화학식 (II)로 표시되는 기이며;
    Figure pct00048

    상기 식에서, NB는 핵염기이고;
    단,
    G1 및 G2 중 적어도 하나는 G이고,
    P3이 수소 또는 보호기 P인 경우, G1 = G이고,
    P4가 수소 또는 보호기 P인 경우, G2 = G이다.
  26. G가 하전된 모이어티인, 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항의 PNA 올리고머, 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항의 PNA 단량체, 또는 제24항 내지 제25항 중 어느 한 항의 PNA 이량체.
  27. 제26항에 있어서, G가 카르복실레이트, 설포네이트, 설페이트, 포스포네이트, 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음하전된 기를 포함하는, PNA 올리고머, 단량체, 또는 이량체.
  28. 제26항에 있어서, G가 구아니디늄, 4급 암모늄, 포스포늄, 설포늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 양하전된 기를 포함하는, PNA 올리고머, 단량체, 또는 이량체.
  29. 제26항에 있어서, G가 제 1 pH에서는 전하를 띠지 않지만 제 2 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 하나 이상의 중성 기를 포함하는, PNA 올리고머, 단량체, 또는 이량체.
  30. 제29항에 있어서, G가 아민, 히드라지드, 히드라진, 구아니딘, 알콕시아민, 술폰산 및/또는 이의 유도체, 및/또는 포스폰산 및/또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, PNA 올리고머, 단량체, 또는 이량체.
  31. 제26항에 있어서, G가 6 내지 8의 pH 범위에서 전하를 띨 수 있는 기인, PNA 올리고머, 단량체, 또는 이량체.
  32. 유전자 분석 방법에서의, 제1항 내지 제10항 또는 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 PNA 올리고머의 용도.
  33. 화학식 (A3)에 따른 화합물을 제공하는 단계;
    상기 화학식 (A3)의 화합물을 핵염기-함유 산 유도체 또는 보호기 P와 반응시키는 단계; 및
    가수분해하는 단계를 포함하는,
    제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 PNA 단량체를 제조하는 방법:
    Figure pct00049
    　
    상기 식에서, G는 하전된 모이어티, 또는 미리 결정된 pH에서 전하를 띨 수 있는 모이어티이고,
    P1은 보호기이다.
  34. 제33항에 있어서, 상기 핵염기-함유 산 유도체가 화학식 NB-1에 따른 화합물인, 방법.
    Figure pct00050

    상기 식에서, NB는 핵염기이다.
  35. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 PNA 단량체를 반응시켜 PNA 올리고머를 형성하는 단계를 포함하는,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 PNA 올리고머를 제조하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, PNA 단량체를 이의 C-말단을 통해 고체 지지체 상에 공유 결합시키는 예비 단계를 포함하는, 방법.
  37. (a) 핵산을, 상기 핵산의 일부에 하이브리드화할 수 있는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 핵산(PNA) 올리고머와 접촉시켜, 핵산/PNA 이중체(duplex)를 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 핵산/PNA 이중체를 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 개질 염기와 접촉시키는 단계를 포함하는,
    핵산 서열에서 뉴클레오티드를 특성규명하는 방법:
    (i)
    Figure pct00051

    (ii)
    Figure pct00052

    (iii)
    Figure pct00053
    ; 및
    (iv)
    Figure pct00054
    　
    상기 식에서, Y는 가역적 공유 결합 반응이 가능한 작용기이고;
    X1 내지 X4는 검출 가능한 태그, 스페이서-태그 조합 또는 수소이고;
    Z는 탄소 또는 질소이며;
    상기 PNA 올리고머는 작용기 Y와 가역적으로 반응할 수 있는 모이어티를 포함하고, 상기 핵산/PNA 이중체와 통합되는 개질 염기는 특성규명하려는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이며, 상기 뉴클레오티드는 질량 분석에 의해 또는 상기 개질 염기의 검출 가능한 태그에 의해 특성규명된다.
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