KR20190046705A - Tm4sf5 단백질의 발현 변화를 이용한 간질환의 진단방법 및 간질환 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

Tm4sf5 단백질의 발현 변화를 이용한 간질환의 진단방법 및 간질환 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용한 비만, 간질환의 진단방법 및 간질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스에서 대사장애가 일어나고, Srebp1, Srebp2, Fasn, CD36, Fabp1, Vldlr, Ldlr, ApoB100, Pparα, Pparγ, Leptin, Accα, Accß 또는 SREBP1c의 mRNA 또는 단백질의 발현이 증가하고, 모노아실- (monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 및 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 수준이 증가하고, STAT3, c-Src, 또는 FAK 단백질의 인산화가 감소되어 지방간 및 간염의 특징을 나타내고, 상기 형질전환 마우스를 계속 사육하면 SREBP1, SREBP2, Fasn, CD36, Fabp1, Vldlr, Ldlr, ApoB100, Pparα, Pparγ, Leptin, Accα, Accß 또는 SREBP1c의 단백질의 발현이 감소하고, STAT3, c-Src, 또는 FAK 단백질의 인산화가 증가하고 laminin γ2, 라미닌, 콜라젠을 포함하는 세포외기질의 합성이 증가하여 간섬유화, 또는 간경화의 특징을 나타내고, 병약한 마우스종류에 TM4SF5를 과발현시키면 CD34, AFP, FUCA(AFU), Cyclin D1, Ki67, 또는 HIF1-α를 포함하는 간암 마커들의 단백질들의 발현이 증가함을 확인함으로써, TM4SF5 단백질의 발현 변화를 측정하여 비만 및 간질환을 진단하거나, 비만 및 간질환 예방 혹은 치료제 후보물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용한 간질환의 진단방법 및 간질환 치료제 스크리닝 방법{DIAGNOSIS METHOD OF LIVER DISEASES AND SCREENING METHOD OF TREATMENT AGENT FOR LIVER DISEASES USING TM4SF5 PROTEIN EXPRESSION LEVEL CHANGE}
본 발명은 TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질의 발현 변화를 이용한 세포 및 마우스로부터 확보한 세포 및 조직에서 TM4SF5의 발현 유무에 의존하는 지방간, 간염, 섬유화, 암 발병 및 대사장애에 따른 비만에 관련한 Srebp1 (Sterol regulatory element-binding protein 1), Srebp2 (Sterol regulatory element-binding protein 2), Fasn (Fatty acid synthase), CD36 (cluster of differentiation 36), Fabp1 (Fatty Acid-Binding Protein 1), Vldlr (very-low-density-lipoprotein receptor), Ldlr (low density lipoprotein receptor), ApoB100 (Apolipoprotein B 100), Pparα (Peroxisome proliferator-activated receptor alpha), Pparγ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma), Leptin, Accα (acetyl-CoA carboxylase alpha), Accß (acetyl-CoA carboxylase beta), collagen I, collagen type I alpha 1 chain, laminins, laminin α5, laminin γ2, laminin γ3, Socs1 (Suppressor of cytokine signalling 1), Socs3 (Suppressor of cytokine signalling 3), Sirt1 (Sirtuin 1), Sirt5 (Sirtuin 5), Sirt6 (Sirtuin 6), α-SMA (α-smooth muscle actin), MCP1 (monocyte chemoattractant protein 1), TGFß1 (transforming growth factor beta 1), 또는 F4/80 antigen (macrophage biomarker)의 mRNA 및 단백질의 발현 및 STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3), c-Src, FAK(focal adhesion kinase), mTOR, S6K, ULK(UNC-51-like kinase), 4EBP1(Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1) 및 Akt 단백질의 인산화 변화를 확인하고,
세포의 손상, 세포 배열 패턴 무질서화, collagen I 또는 laminin 합성 축적 여부, 및 AFP(Alpha-fetoprotein), FUCA(AFU, Alpha-L-fucosidase), CD34(human hematopoietic stem cell and endothelial cell marker), HIF1α(Hypoxia-inducible factor 1-alpha), Ki-67(Antigen KI-67), 또는 Cyclin D1의 발현 축적을 비교하여 간조직의 질환적 특성을 확인하고,
동물의 혈장(plasma) 샘플로부터 트리글리세라이드(triglyceride, TG), 자유 지방산(free fatty acid, FFA), 콜레스테롤(cholesterol), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT), 아스파르산 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase, AST), LDL(Low-density lipoprotein), 글루코스(glucose), 또는 인슐린(insulin)의 수준을 확인하고, 체중의 증가를 측정하고, 체중/간무게의 증가를 측정하는 간질환의 진단방법 및 간질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
간은 우리 몸에서 지질 등의 대사 작용, 해독, 담즙의 배설, 각종 영양소의 저장, 조혈이나 혈액응고 및 순환 혈액량의 조절 등 많은 기능을 한다. 따라서, 간에 장애가 발생하면 여러 가지 기능이 저하되고, 최악의 경우에는 생명의 유지가 곤란해진다.
간의 기능을 보다 구체적으로 살펴보면, 첫째, 에너지 대사를 관리하는 기능이 있어 음식물로부터 흡수된 탄수화물, 지방, 및 아미노산을 포함하는 단백질 등의 모든 영양소들이 간에서 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사되어 전신에 공급되거나 저장된다. 둘째, 간에 존재하는 약 2,000여 종의 효소, 알부민, 응고인자들이 혈청 단백질, 담즙산, 인지질, 콜레스테롤 등의 지방을 합성하고 저장 및 분배한다. 셋째, 해독 및 분해 기능으로서, 간에서 약물, 술, 독성물질 등을 해독시키므로 이 과정에서 간세포가 손상되기 쉽다. 따라서, 약물, 독 또는 알코올에 의한 간질환이 흔히 발생할 수 있다. 또한, 간은 각종 대사산물을 십이지장으로 배설하는 기능, 면역기능 등이 있어 생명 유지에 중요하다.
간질환은 원인에 따라 바이러스성 간질환, 알코올성 간질환, 약물 독성 간질환, 지방간, 자가면역성 간질환, 대사성 간질환 및 기타로 구분할 수 있다. 간질환은 초기 자각증상이 없어 상당히 진행된 뒤에서야 발견되기 때문에 우리나라뿐만 아니라 세계적으로 사망원인의 수위를 차지하고 있다. 이에, 간질환을 효과적으로 진단하고 이의 치료방법에 관한 연구가 필요하다.
간이 알코올, 바이러스, 유해 환경인자 등에 의해 자극을 받으면 간성상세포가 활성화되어 TGFß(transforming growth factor ß)를 포함하는 다양한 사이토카인을 분비한다. TGFß는 발생, 발암 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 사이토카인으로서, 활성화된 TGFß에 의해 TGFß 수용체가 세포 내 Smad2/3 단백질 등을 인산화 및 활성화시켜 Smad4와 결합한 후 핵 내로 이동함으로써 여러 관련 유전자의 전사를 촉진한다.
이러한 TGFß1에 의해서 발현이 조절되는 단백질들 중 많은 것들이 지방간 및 지방간염의 유발과 연관되어 있다. TGFß1에 의해서 발현이 조절되는 단백질들의 발현 변화를 통해서 대사기능이 비정상적으로 조절되면, 탄수화물, 지방, 또는 단백질(아미노산 포함) 등의 영양분을 과다하게 섭취함에 따라, 지방 생합성 관련 효소, 신호전달 단백질 또는 지방의 흡수 및 축적에 관련된 효소와 단백질들의 발현이 향상되도록 조절되어 간상피세포에 지방이 축적되고 지방간(steatosis)이 발병하며, 염증이 추가적으로 발달하면 지방간염(steatohepatitis)이 유발될 수 있는 것으로 알려져 있다.
지방 생합성 관련 효소 또는 신호전달 단백질 혹은 인자들은 Srebp1, Srebp2, Fasn, Pparα, Pparγ, Leptin, Accα, Accß, Sirt1, Sirt5, Sirt6, insulin, 또는 glucose 등을 포함하고, 지방의 흡수 및 축적에 관련된 효소와 단백질 또는 인자들은 CD36, Fabp1, Vldlr, Ldlr, ApoB100 등을 포함한다. 상기와 같은 이유로 지방간이 심화되면 염증이 동반되어 지방간염이 발병될 수 있고, 비만 및 혈장 내부 트리글리세라이드(triglyceride 혹은 트리아실글라이세롤 triacylglycerol), 자유 지방산(free fatty acid), 콜레스테롤(VLDL 및 LDL)의 양이 증가하게 되며, 비만내지는 복부비만의 증상이 유발되고 체중이 증가하게 될 수 있다.
한편, TGFß는 콜라겐 합성을 촉진하여 간섬유화를 유발하고, 간성상세포 자신뿐만 아니라 주변의 간세포에도 영향을 주어 EMT(epithelial to mesenchymal transition)을 일으킨다. 간섬유화가 지속되면 결국 간경변증이 유발되므로, 간섬유화의 과정을 이해하는 것은 간경변증을 치료하는데 필요하다.
염증에 의해 TGFß1과 같은 사이토카인이 많이 분비되는데, 분비된 사이토카이에 의해서 간성상세포(hepatic stellate cells) 및 다른 간세포들이 활성화 되고 Collagen I, fibronectin, 및 laminin 등과 같은 세포외기질을 많이 합성하여 세포 외부에 축적한다. 이러한 경우에, 염증과 관련된 인자들인 MCP1 또는 F4/80 antigen의 mRNA 및 단백질의 양이 증가할 수 있고, 조직 내 세포의 손상, 세포 배열 패턴의 무질서화, 또는 collagen I 혹은 laminin 합성 축적이 나타날 수 있다.
알코올성 간손상을 알코올 자체 또는 알코올의 대사과정에서 생성되는 화합물에 의해 유발되고, 이는 지질축적, 간세포 손상 및 섬유화증을 발생시킨다. 또한, 만성 B형 간염, 만성 C형 간염, 만성 자가면역 질환, 만성 담관성 질환, 만성 심장질환, 기생충, 약물중동 등과 같은 다양한 원인에 의해 간세포가 손상되면 간세포, 쿠퍼세포(kupffer cell), 동모양 혈관 내피세포(sinusoidal endothelial cell) 및 간성상세포 등 다양한 세포의 상호작용에 의해 각종 사이토카인 및 활성산소 등이 생성된다. 이로 인해 세포외 기질(ECM)이 손상되고, 콜라겐 I 및 III와 같은 ECM의 이상 증식이 유발됨으로써 간섬유화증이 진행된다.
일반적으로, 간섬유화증은 간경변과는 달리 가역적이고, 얇은 미세섬유(fibril)로 구성되며 결절(nodule)이 형성되지 않는다. 또한, 간섬유화증은 간이 손상된 원인이 사라지면 정상회복이 가능하나, 간섬유화증의 재발이 반복적으로 지속되면 ECM 사이의 가교(crosslinking)가 증가하여 얇은 미세섬유를 형성하고 결절이 있는 비가역적인 간경변으로 진행된다. 이와 같이 발생한 간경변은 병리학적으로 괴사, 염증 및 섬유화를 수반하는 만성질환이며, 간경변을 방치하는 경우 궁극적으로 간암으로 진행된다.
보통 임상적으로 간암 환자의 간조직에는 AFP (Alpha-fetoprotein), FUCA (AFU, Alpha-L-fucosidase), CD34 (human hematopoietic stem cell and endothelial cell marker), HIF1α (Hypoxia-inducible factor 1-alpha), Ki-67 (Antigen KI-67), 또는 Cyclin D1의 mRNA 혹은 단백질 발현이 증가되어 있는 것으로 알려져 있다.
한편, TM4SF5(transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질은 테트라스패닌(tetraspanin)의 한 종류로 알려져 있다. TM4SF5 단백질은 비수용성의 단백질로서 세포막을 통과하는 4개의 영역, 세포 외부에 존재하는 2개의 고리구조, 세포질 내에 존재하는 하나의 고리구조, 및 2개의 말단구조를 포함한다. 이들 단백질은 인테그린과 같은 세포 부착 분자와 세포막에서 복합체인 거대한 테트라스패닌-웹(tetraspanin-web) 또는 테트라스패닌-풍부한 마이크로도메인(tetraspnin-enriched microdomain, TERM)을 형성한다. 상기 복합체는 세포의 부착, 증식 및 이동 등과 같은 다양한 생물학적 기능에 기여한다. TM4SF5 단백질을 사람의 간암세포에서 과발현되는 것으로 알려져 있다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0934706호에는 TM4SF5 단백질을 발현하는 암세포를 이용하여 항암물질을 스크리닝하는 방법과 TM4SF5 단백질의 활성을 억제하는 화합물을 포함하는 항암용 조성물을 개시하고 있다.
이에, 본 발명자들은 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용하여 간질환을 진단하는 방법을 개발하고자 노력하던 중, TM4SF5 단백질이 과발현(transgenic mouse; TG mouse)되었거나, Tm4sf5 유전자를 녹아웃(knockout; KO mouse)한 형질전환 마우스에서 확보한 간조직 혹은 간세포에서 (1) Srebp1 (Sterol regulatory element-binding protein 1), Srebp2 (Sterol regulatory element-binding protein 2), Fasn (Fatty acid synthase), CD36 (cluster of differentiation 36), Fabp1 (Fatty Acid-Binding Protein 1), Vldlr (very-low-density-lipoprotein receptor), Ldlr (low density lipoprotein receptor), ApoB100 (Apolipoprotein B 100), Pparα (Peroxisome proliferator-activated receptor alpha), Pparγ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma), Leptin, Accα (acetyl-CoA carboxylase alpha), Accß (acetyl-CoA carboxylase beta), collagen I, collagen type I alpha 1 chain, laminins, laminin α5, laminin γ2, laminin γ3, Socs1 (Suppressor of cytokine signalling 1), Socs3 (Suppressor of cytokine signalling 3), Sirt1 (Sirtuin 1), Sirt5 (Sirtuin 5), Sirt6 (Sirtuin 6), α-SMA (α-smooth muscle actin), MCP1 (monocyte chemoattractant protein 1), TGFß1 (transforming growth factor beta 1), 또는 F4/80 antigen (macrophage biomarker)의 mRNA 및 단백질의 발현의 변화를 확인하고, (2) STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) 단백질, Src(cellular　sarcoma) 단백질, FAK(focal adhesion kinase) 단백질, FAK(focal adhesion kinase), mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질의 인산화 변화를 확인하고, (3) 세포의 손상, 세포 배열 패턴 무질서화, collagen I 또는 laminin 합성 축적 여부, 및 AFP(Alpha-fetoprotein), FUCA(AFU, Alpha-L-fucosidase), CD34(human hematopoietic stem cell and endothelial cell marker), HIF1α(Hypoxia-inducible factor 1-alpha), Ki-67(Antigen KI-67), 또는 Cyclin D1의 발현 축적을 비교하여 조직의 질환적 특성을 확인하고, (4) 동물의 혈장(plasma) 샘플로부터 트리글리세라이드(triglyceride, TG), 자유 지방산(free fatty acid, FFA), 콜레스테롤(cholesterol), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT), 아스파르산 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase, AST), LDL(Low-density lipoprotein), 글루코스(glucose), 또는 인슐린(insulin)의 수준을 확인하고, (5) 체중의 증가를 측정하고, 체중/간무게의 증가를 측정하여 TM4SF5가 지방간 및 지방간염, 간섬유화에 긍정적인 역할 함을 밝히고, 상기 형질전환 TG 마우스를 계속 사육하면 상기 mRNA 및 단백질의 발현이 변화하고 상기 단백질의 인산화가 변화하여 간섬유화, 간염, 간경화, 또는 간암의 특징을 나타냄을 확인하고, Tm4sf5 유전자가 결여된 KO 마우스의 경우에는 상기 TG마우스에서 확인된 인자들의 mRNA 및 단백질들의 발현 및 인산화의 변화가 의미 없었거나, 비만 및 대사질환을 유발할 수 있는 고지방 식이, 고탄수화물 식이, 고아미노산(아르기닌), 또는 고수크로즈(sucrose) 식이에 따른 글루코스(포도당) 저항성, 인슐린 저항성, 체중 증가가 유발되는 정도가 미약해지고, 혈장 내 중성지방, 콜레스테롤, AST/ALT 수치 등의 증가가 미약해지는 것을 확인함으로써, TM4SF5의 발현에 의한 지방간, 간염, 간섬유화, 간경화 및 간암을 포함하는 간질환이 유발될 수 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-0934706호
본 발명의 목적은 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용하여 간질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 이용하여 간질환을 치료하기 위한 후보물질 또는 항비만 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TM4SF5 유전자가 녹아웃(knock-out)된 마우스를 이용하여 문맥암항진증 동물모델을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 동물모델을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 간질환 의심 환자로부터 분리된 시료에서 TM4SF5(transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 시료를 선별하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 선별된 시료에서 SREBP1(sterol regulatory element-binding transcription factor 1)의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 단백질, c-Src(cellular　sarcoma) 단백질, FAK(focal adhesion kinase) 단백질, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 정상 대조군 시료의 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) TM4SF5 및 SREBP1 단백질을 발현하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 SREBP1 단백질의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBP1 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 억제하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 증가시키거나, 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBP1 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 억제하고, 모노아실-(monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 또는 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 합성을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 지방간 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) TM4SF5 단백질을 발현하는 세포 또는 동물모델에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 TM4SF5 단백질과 mTOR 단백질, SLC7A1 단백질 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과의 결합을 측정하는 단계;
3) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 mTOR 단백질, S6K 단백질, UNC-51-like kinase 1(ULK1) 단백질, 또는 4EBP1 단백질의 인산화를 측정하는 단계;
4) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 모노아실-(monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 또는 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 수준을 측정하는 단계;
5) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 체중 증가, 포도당 저항성, 인슐린 저항성 및 해당과정의 반응성으로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상을 측정하는 단계; 및
6) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 해당과정 관련된 유전자들의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
7) 상기 단계 2)에서 TM4SF5 단백질과 mTOR 단백질, SLC7A1 단백질 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과의 결합을 억제하고, 단계 3) mTOR 단백질, S6K 단백질, UNC-51-like kinase 1(ULK1) 단백질, 또는 4EBP1 단백질의 인산화를 억제하며, 단계 4)에서 모노아실- (monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 및 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 수준을 감소시키고, 단계 5)에서 체중 증가, 포도당 저항성, 인슐린 저항성 또는 해당과정의 반응성을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항비만, 지방간, 또는 간암 치료 후보물질의 스크리닝 방법 을 제공한다.
또한, TM4SF5 유전자가 녹아웃(knock-out, KO)된 마우스를 APCmim/+(adenomatous polyposis colimin/+)의 유전형을 갖는 마우스와 교배하는 단계를 포함하는 문맥압항진증(portal hypertension) 동물 모델 제조 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 문맥압항진증 동물 모델을 제공한다.
본 발명은 TM4SF5 단백질이 과발현된 세포 및 형질전환 마우스에서 대사 기능이 저해되고 체중이 증가하며, 탄수화물, 지방, 및 아미노산 고함유 식이에 의하여 SREBP1 단백질과 같은 TM4SF5 발현-의존적인 단백질들을 포함하는 지방의 생합성에 관련된 인자들의 mRNA 및 단백질들의 발현과 축적이 증가하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK 단백질, mTOR 단백질, S6K 단백질, ULK 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화가 감소되어 비만, 지방간 및 간염의 특징을 나타내고, 상기 형질전환 마우스를 계속 사육하면 SREBP1 단백질의 발현이 감소하고, STAT3 단백질의 인산화가 증가하고 콜라젠, 라미닌 등 세포외기질의 발현 축적이 증가하여 간섬유화 또는 간경화의 특징을 나타냄을 확인함으로써, TM4SF5 단백질의 발현 변화를 측정하여 비만 및 간질환을 진단하거나, 비만 혹은 간질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 TM4SF5 단백질을 발현하는 컨스트럭트의 모식도(A) 및 상기 컨스트럭트가 도입된 형질전환 마우스의 간조직으로부터 TM4SF5 유전자의 발현을 확인한 결과(B)를 나타낸 도면이다.
도 2는 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스(52주령)의 간조직을 관찰한 사진(A); 상기 마우스의 간조직을 H&E, 오일 레드 O 또는 메이슨의 트리크롬으로 염색한 결과 사진(B); 조직을 해당 항체를 이용하여 immunohistochemsitry를 수행하였을 경우, 1년된 TM4SF5 과발현 동물의 간조직에서 STAT3의 인산화 정도가 낮고, 대신에 SREBP1의 발현이 높거나(Fatty liverhigh) 낮은 fatty liverlow) 정도를 정상 대조군(normal)과 대비하여 발병정도를 확인한 결과 그래프(C); 및 상기 마우스의 혈장에서 트리글리세라이드, 알부민 및 ALT의 수치를 확인한 결과 그래프(D)이다.
도 3은 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스(52주령)의 간조직에서 지방간과 관련된 유전자(A) 및 단백질(B)의 발현을 확인하고, 상기 마우스의 간조직을 면역염색으로 확인한 결과 도면(C)이다.
도 4는 TM4SF5 단백질이 과발현된 동물로부터 분리한 간세포에서 지방이 축적되고(A), 지방과 관련된 유전자의 발현 변화를 확인한 결과 그래프(B 및 C) 및 정상 혹은 Tm4sf5-/+ 녹아웃 동물을 굶겼다가 다시 음식을 제공(refed)하였을 경우, 정상동물에서는 증가하지만 녹아웃동물 간조직에서는 증가하는 정도가 미미한 ApoB100, Ldlr, Srebp2, Pparγ, 및 leptin 유전자들에 대한 분석정보(D)이다.
도 5는 TM4SF5 단백질이 과발현된 간세포에서 SREBP1 단백질의 발현 및 STAT3 단백질의 인산화 변화 및 PPARη 단백질의 발현을 확인한 결과(A); STAT3 단백질의 안산화의 SREBP1 단백질 발현의 상호작용을 간상피세포에 자유지방산 (free fatty acid)을 처리하여 확인한 결과(B); 및 SREBP1 단백질의 발현 증가에 의해 STAT3 단백질의 인산화 변화(C)를 확인한 결과 도면이다.
도 6은 TM4SF5 단백질의 발현이 억제된 지방세포에서 지방의 생성 억제(A)를 확인, 지방과 관련된 유전자의 발현 억제(B)를 확인, 지방세포(3T3-L1)가 분화해 나감에 따라 발현 양이 증가하는 SREBP1(전구체인 pSREBP1과 성숙한 형태의 mSREBP1), Pparγ와 지방세포가 분화해 나감에 따라 그 양이 감소하는 STAT3 단백질의 인산화를 확인(C)한 도면이다.
도 7은 TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스(52주령)의 간조직에서 SIRT 유전자들의 발현 변화(A); SOCS 단백질들의 발현 변화(B); SOCS 유전자들의 발현 변화(C); 및 지방전구세포를 배양한 배양 배지를 얻어 TM4SF5 단백질을 발현하는 간상피세포에게 처리하여 배양한 후 SOCS3 단백질 발현 변화(D)를 확인한 결과 도면이다.
도 8은 TM4SF5 단백질이 과발현된 간상피세포에서 혹은 TM4SF5를 과발현하지 않더라도 자유지방산을 처리한 간상피세포에서 SOCS1 및 SOCS3 유전자(A) 및 단백질(B 및 C)의 발현 변화를 확인하고, SREBP1 단백질이 과발현된 간세포에서 SOCS1 및 SOCS3 단백질의 발현 변화(D)를 확인하고, 52주된 TM4SF5 과다발현 유전자변형동물(transgenic mice)로부터 분리한 primary 간상피세포에서 SOCS3 단백질의 발현을 억제시켰을 경우, SREBP1 단백질의 양이 감소하고, STAT3 단백질의 인산산화가 증가(E)하는 것을 확인한 결과 도면이다.
도 9는 정상동물 (WT), Tm4sf5 유전자 KO 마우스(실시예 7의 방법으로 제조한 KO 마우스인 Exon 1-KO 또는 마크로젠에서 제작한 마우스인 Exon 3-KO) 또는 heterozygote Exon 1-KO 마우스를 3개월 혹은 6개월 동안 정상식이를 통하여 간무게 및 체중을 측정하고 각 수놈(male, A)과 암놈(female, B)의 경우에 있어 녹아웃마우스의 경우가 정상동물의 경우에 대비하여 간무게/체중의 비율이 감소함을 확인하는 도면이다.
도 10은 정상동물 (WT), Tm4sf5 유전자 녹아웃 (Tm4sf5-/- KO) 마우스에게 정상식이(Chow) 또는 열량 60 kCal/kg을 발생시키는 고지방식이(high fat diet, HFD)를 10주 동안 자유 급식하였을 경우, WT 및 Tm4sf5-/- KO 마우스의 체중 변화를 매주 확인(A)하고, 10주 후 총 체중변화 정도를 확인(B)하고, 각 동물의 간조직에서의 콜레스테롤 (C)와 free fatty acid (FFA, D)를 확인한 도면이다.
도 11은 정상동물 (WT), heterozygote Tm4sf5 유전자 녹아웃 (Tm4sf5-/+ KO) 마우스에게 정상식이(Chow) 또는 열량 60 kCal/kg을 발생시키는 고지방식이(high fat diet, HFD)를 10주 동안 자유 급식하였을 경우, 유전자 Tm4sf5(A), Srebp1, Srebp2, LdlR, 및 ApoB100(B)의 mRNA의 발현 수준을 확인하였고, 혈장 내에 존재하는 콜레스테롤, 자유 지방산(free fatty acid)의 양을 확인(C)한 도면이다.
도 12는 TM4SF5 유전자 녹아웃(KO) 마우스에서 SOCS1 및 SOCS3 유전자(A) 및 단백질(B)의 발현 변화와, 상기 마우스에 고지방 식이(high fat diet, HFD)를 섭취시키고 지방 축적 여부를 확인(C)하고, 지방과 관련된 유전자의 mRNA 및 단백질의 발현 변화(D)를 확인한 결과 도면이다.
도 13은 TM4SF5 유전자 KO 마우스와 APCmim/+ 마우스를 교배하여 수득된 자손에서 TM4SF5 및 APC 유전자의 발현 변화(A); 상기 자손의 해부 결과(B); 상기 자손의 간조직에서
Figure pat00001
-카테닌 및 HIF1α 단백질의 발현 변화(C); 상기 자손의 간조직에서 콜라겐의 발현 변화(D); 및 상기 자손의 간조직에서 지방관련 신호전달 기전 확인(E) 결과를 나타내는 도면이다.
도 14은 TM4SF5 단백질이 과발현된 세포주에서 TM4SF5 단백질과 mTOR(A), SLC7A1(B), 또는 SLC38A9(C)과의 결합을 확인하였고, TM4SF5 단백질을 발현하는 세포외부에 아미노산을 없앴다가 다시 제공하였을 경우에 TM4SF5 단백질의 발현이 억제된 세포보다 S6K, UNC-51-like kinase 1(ULK1) 또는 4EBP1의 인산화가 증가됨(D와 E)을 확인한 도면이다.
도 15는 TM4SF5 유전자 KO (Tm4sf5-/+-KO) 마우스의 간조직에서 아르기나아제1, Tm4sf5, 및 Tm4sf4 유전자의 발현 변화(A); TM4SF5 단백질과 Castor1 단백질이 대조군 단백질 MetaP2에 대비하여 L-아르기닌에 더 강하게 결합 (B); TM4SF5 단백질이 유사한 다른 단백질 TM4SF1이나 TM4SF4보다 아르기닌과의 더 강하게 결합(C); 세포 추출액(cell extract)에 존재하는 TM4SF5 단백질 또는 TM4SF5-LEL도메인(long extracellular loop) 세포막추출액 속의 TM4SF5 혹은 TM4SF5 재조합 단백질과 L-아르기닌과의 농도 의존적 결합을 확인하고 결합정도를 나타내는 IC50 농도를 확인(D와 E), TM4SF5 단백질들 중 전체부위(full length, FL), SEL(short extracellular loop, SEL), 또는 LEL도메인들과 L-아르기닌 사이의 결합을 확인한 결과(F), 및 TM4SF5의 LEL 도메인 중 다수의 아미노산에서 돌연변이가 존재하는 TM4SF5 돌연변이 단백질과 L-아르기닌이 결합하지 못함을 확인(G)한 결과 도면이다.
도 16은 정상마우스(WT), Tm4sf5 유전자 녹아웃 (Tm4sf5-/- KO) 마우스에게 정상 식이(Chow) 또는 열량의 70%를 탄수화물에서 얻게되는 70% kCal 고탄수화물 식이(high carbohydrate diet, HCD)를 10주 동안 자유 급식하였을 경우, WT 및 Tm4sf5-/- KO 마우스의 체중 변화를 매주 확인(A)하고, 10주 후 총 체중변화 정도를 확인(B)하고, 각 동물의 포도당저항성(C), 인슐린저항성(D)을 확인하고, 혈장에서의 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase), 및 콜레스테롤 수준(E)을 확인한 도면이다.
도 17는 고아르기닌 식이(high arginine, HR)를 섭취한 TM4SF5 유전자 KO 마우스의 체중변화(A), 고아르기닌 식이 시작점 대비 체중 증가(B), 및 상기 마우스의 간조직에서 지방 축적 여부(C)를 확인한 결과 도면이다.
도 18는 TM4SF5 단백질의 발현된 세포주에서 S6K 단백질의 인산화 여부(A), TM4SF5 단백질의 억제에 의한 글루코스 반응성 변화(B), 및 TM4SF5 단백질의 억제에 의한 해당작용 관여 유전자의 발현 변화(C)를 확인한 결과 도면이다.
도 19은 TM4SF5 유전자 KO 마우스에서 고수크로즈(high sucrose) 식이 (고농도의 수크로즈 AIN-93G diet; sucrose의 함량이 3.15%인 chow diet에 대비하여 10%로 수크로즈 농도가 3배 이상 높게 함유됨) 섭취에 의한 체중의 변화를 매주 측정하여 3주 혹은 10주 동안 측정한 결과(A)이고, 포도당저항성 및 인슐린 저항성을 확인한 결과(B), 혈장에서의 AST, ALT, 콜레스테롤(total cholesterol, TCHO), 및 triacyl-glycerol(TG)의 수준(C), 간조직의 H&E 을 통한 조직의 lipid droplet의 축적 여부(D), 모노아실- (monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 및 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 수준(E)을 확인한 도면이다.
도 20은 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스(78주령)의 간조직에서 간조직의 표현형을 확인한 결과(A); 골수외조혈(extramedullary hematopoiesis), 지방간(steatohepatitis) 간섬유화 (fibrosis) 의 표현형을 통계적으로 확인한 결과(B); 및 상기 간조직에서 지방과 관련된 단백질들의 발현 변화(C)를 확인한 결과 그래프이다.
도 21은 TM4SF5 단백질이 과발현된 형질전환 마우스(78주령)의 간조직에서 SOCS 단백질, ECM 및 STAT3 인산화의 변화를 확인한 결과(A) 및 지방대사와 관련된 유전자의 발현 변화(B 및 C)를 확인한 결과 그래프이다.
도 22는 사염화탄소(CCl4) 약물의 4주 혹은 16주 처리로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에서 콜라젠의 축적을 염색을 통해 관찰한 결과(A) 및 TM4SF5 유전자 (Tm4sf5-/--KO) KO 마우스에 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직을 관찰(B)하고 콜라젠의 축적을 염색을 통해 관찰(C)한 결과를 나타내는 도면이다.
도 23은 사염화탄소(CCl4) 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에서 섬유화와 관련된 단백질(A) 및 유전자(B)의 발현 변화를 확인한 도면이다.
도 24은 사염화탄소(CCl4) 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에서 섬유화와 관련된 단백질의 발현 변화를 면역염색법으로 확인한 도면이다.
도 25는 사염화탄소(CCl4) 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에서 분리한 primary 간상피세포을 이용하여 TM4SF5(A) 및 STAT3(B) 단백질의 발현 억제에 의한 콜라겐, 라미닌 발현 및 STAT3, STAT5, 및 FAK 단백질의 인산화의 변화를 확인한 도면이다.
도 26은 사염화탄소(CCl4) 약물로 간질환을 유도한 동물모델의 간조직에서 확보한 간상피세포 혹은 HepG2 간상피세포를 이용하여 IL-6에 의한 콜라젠, 라미닌, 라미닌 γ2 단백질의 발현 및 STAT3, FAK, 및 c-Src 단백질의 인산화 변화(A); 라미닌에 의한 단백질 발현 변화(B); c-Src 단백질의 활성 억제제(PP2) 처리에 의한 라미닌 단백질 발현 및 STAT3와 c-Src의 인산화 변화 (C); 및 TM4SF5 단백질의 발현 억제에 의한 STAT3 단백질의 인산화 및 콜라젠, 및 라미닌 단백질의 발현 변화(D)를 확인한 도면이다.
도 27는 STAT3 단백질의 인산화가 라미닌의 프로모터를 통해 이의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 제조된 컨스트럭트의 모식도(A) 및 간상피세포(AML12) 또는 간성상세포 (LX2 세포)에서 라미닌 γ2 (Lamc2, B) 또는 콜라젠 1 α1 (Col1a1, C)의 프로모터가 STAT3 단백질에 의해서 조절되는지 확인한 결과(B와 C)를 나타내는 도면이다.
도 28는 사염화탄소(CCl4) 약물의 4주 혹은 16주 처리로 간질환을 유도한 동물모델에서 TM4SF5 단백질에 의한 TM4SF5 단백질과 라미닌 단백질의 공동발현 변화를 확인한 결과(A), 상기 동물모델의 간조직에서 알부민, α-SMA 및 콜라겐의 발현변화를 확인한 결과(B 및 C), 및 TM4SF5 단백질의 발현을 억제시킨 HepG2 세포에서 콜라겐, 라미닌, 및 라미닌 γ2의 발현 변화와 STAT3의 인산화를 확인한 결과(D 및 E)를 나타내는 도면이다.
도 29은 라미닌 또는 콜라겐의 발현을 억제 시킨 뒤, 사염화탄소(CCl4) 약물로 간질환을 유도한 동물모델에서 간 조직을 관찰한 결과(A), TM4SF5, 콜라겐, 라미닌, α-SMA 및 TGFß 단백질의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과(B)이고, TM4SF5, 콜라겐, 라미닌, 라미닌 γ2, 단백질 발현과 STAT3의 인산화 변화를 확인한 결과(C)를 나타내는 도면이다.
도 30은 TM4SF5 단백질이 과발현된 마우스의 간조직을 관찰한 결과 암조직으로 여겨지는 nodule을 확인(A), 간암 마커들의 발현 변화를 확인한 결과(B 및 E), 염증 관련 유전자들의 발현 변화(C), 및 CD34, Ki67, Cyclin D1, 및 HIF1-α의 발현 변화(D), 라미닌의 발현과 STAT3의 인산화 확인(E), 혈장 내 AST, ALT, 알부민, LDL(low-density lipoprotein), 트리글리세라이드 (triglyceride의 수준(F)를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 31은 diethylnitrosamine(DEN) 약물로 간암을 유발시킨 동물모델에서 간조직을 관찰한 결과(A), TM4SF5 및 라미닌 단백질의 발현 변화와 STAT3의 인산화를 확인한 결과(B), TM4SF5, 인산화된 STAT3, 라미닌(laminins), 라미닌 γ2(laminin γ2) 및 콜라겐 I(collagen I)의 발현 변화를 조식염색을 통하여 확인한 결과(C)를 나타내는 도면이다.
도 32는 간암 환자로부터 수득한 간암조직 (HCC-tumor) 및 암조직-주변 (tumor-near)에서 인산화된 STAT3, 라미닌(laminins) 및 콜라겐 I(collagen I)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
16-2. TM4SF5 유전자 KO 마우스에서 고탄수화물 식이 또는 또는 고수크로즈 식이 섭취에 의한 포도당 저항성 변화 확인
실시예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 KO 마우스의 포도당 저항성을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
구체적으로, 3주 및 10주간의 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 각각 섭취한 마우스를 16시간 동안 굶기고, 꼬리에서 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액 내 혈당을 혈당기(One touch ultra, Johnsons and Johnsons, 미국)를 이용하여 측정하였다. 혈당 측정 후, 상기 마우스에 2 g/㎏의 포도당을 복강으로 주사하고, 주사 30분, 60분, 90분 및 120분 후에 각각 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다.
그 결과, 도 16C와 19B에 나타난 바와 같이, 정상 마우스와 비교하여 TM4SF5 유전자 KO 마우스는 10주 동안의 고탄수화물 식이 혹은 고수크로즈(자당, sucrose) 식이의 섭취로 인한 포도당 저항성이 감소되었다(도 16C 및 도 19B).
16-3. TM4SF5 유전자 KO 마우스에서 고탄수화물 혹은 고수크로즈(자당, sucrose) 식이 섭취에 의한 인슐린 저항성에 대한 영향 확인
실시예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 KO 마우스의 인슐린 저항성을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
구체적으로, 10주간의 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 각각 섭취한 마우스를 6시간 동안 굶기고, 꼬리에서 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액 내 혈당을 혈당기(One touch ultra, Johnsons and Johnsons, 미국)를 이용하여 측정하였다. 혈당 측정 후, 상기 마우스에 0.5 U/㎏의 인슐린을 복강으로 주사하고, 주사 30분, 60분, 90분 및 120분 후에 각각 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다.
그 결과, 도 16D와 19B에 나타난 바와 같이, 포도당 저항성과 달리, 인슐린 저항성은 TM4SF5 단백질의 존재 여부와 관련이 없었다(도 16D). 하지만, 10주 동안의 고수크로즈 식이의 경우, Tm4sf5 유전자 KO 마우스는 인슐린 저항성이 낮아져 호전되었다 (도 19B).
16-4. TM4SF5 유전자 KO 마우스에서 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이 섭취에 의한 혈액 내 AST, ALT, Triglyceride 및 콜레스테롤 수준에 대한 영향 확인
실시예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 KO 마우스의 혈액 내 AST, ALT, 및 콜레스테롤 수준을 Fuji Dri-Chem 3500i를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 16E와 19C에 나타난 바와 같이, 고탄수화물 식이를 섭취한 정상마우스는 혈액중 ALT, AST, Total cholesterol, 및 Triglyceride의 수준이 증가하였으나, TM4SF5 유전자 KO 마우스에서는 그 증가가 미약하였다(도 16E).
하지만, 고수크로즈(자당, sucrose) 식이의 경우, 정상마우스는 혈액중 ALT, AST 수준이 증가하였으나, TM4SF5 유전자 KO 마우스에서는 그 증가가 미약하였으나, Total cholesterol, 및 Triglyceride의 수준은 통계적 유의성 없이 변화가 없었다 (도 19C).
16-5. TM4SF5 유전자 KO 마우스에서 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이 섭취에 의한 지방 축적 확인
실시예 16-1에서 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 KO 마우스로부터 간조직을 적출하여 상기 서술한 방법을 이용하여 H&E 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 19D에 나타난 바와 같이, 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 섭취한 정상 마우스는 지방간이 유도된 반면, TM4SF5 유전자 KO 마우스의 간조직에서는 상대적으로 지방 축적이 억제되었다(도 19D).
16-6. TM4SF5 유전자 KO 마우스에서 고탄수화물 또는 고수크로즈 식이 섭취에 의한 모노아실- (monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 및 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol) 합성 축적 확인
실시예 16-1에서 고탄수화물 또는 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 섭취한 TM4SF5 유전자 KO 마우스로부터 간조직을 적출하여, lysophilization하고 막자사발을 이용하여 분쇄한 후, 간조직 10 mg 당 0.3 ml의 메탄올과 0.1% butylated hydroxytoluene 용액으로 지질을 추출하였다. 0.1% butylated hydroxytoluene 를 포함하는 methyl-tert-butyl ether를 추출액에 첨가한 후, 상온에서 1시간동안 shaking 하였다. 0.25 ml의 H2O로 희석한 후, 상온에서 10분간 vortex한 후, 14,000 g로 4°C에서 15분간 원심분리하였다. 상층액과 하층액을 별개로 분주 확보한 후 dyringl 과정을 거친 후, 0.16 ml에 40 μl CHCl3:MeOH (1:9)를 처리하여 Lipids analysis using LC-MS/MS (8040, Shimadzu, 일본)로 측정하였다.
그 결과, 도 19E에 나타난 바와 같이, 고수크로즈(자당, sucrose) 식이를 섭취한 정상 마우스에 대비하여, TM4SF5 유전자 KO 마우스의 간조직에서는 상대적으로 모노아실- (monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 및 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 합성이 낮았다(도 19E).
실시예 17. TM4SF5 단백질의 과발현에 의한 간경화 증상 확인
실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 TM4SF5 단백질이 과발현된 마우스를 제작하고, 이를 78주 동안 사육하였다. 사육된 마우스를 상술한 바와 같이 희생시켜 간조직을 수득하고, 이를 H&E 및 메이슨의 트리크롬 염색을 통해 간조직의 표현형을 확인하였다. 그 결과, 도 20A에 나타난 바와 같이, 간조직의 섬유화가 생성된 간경화의 표현형을 나타내었다(도 20A). 마우스의 주령이 78주 (1년 6개월)되어 노령이기 때문에, 정상쥐의 경우에도 지방간의 증세가 미약하게 보였으나, TM4SF5가 과발현된 동물의 겨웅에는 좀 더 심각한 지방간 증세와 더불어 골수외조혈 (extramedullary hematopoiesis) 증상이 확인되었다(도 20B).
또한, 상기 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 지방과 관련된 단백질들의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 도 20C에 나타내었다.
도 20C에 나타난 바와 같이, 지방간의 표현형을 나타낸 52주령의 마우스와 달리, 78주령의 경우 TM4SF5 단백질의 과발현에 의해 STAT3의 인산화가 증가하고, 간경화의 주요 인자인 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)이 증가하였다. 한편, SREBP1 단백질의 발현은 억제되고, SIRT1 단백질의 발현은 증가됨으로써 간조직 내에서의 지방 합성 및 축적이 감소되었다(도 20C).
나아가, 상기 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 면역 염색을 수행한 결과를 도 21A에 나타내었다. 도 21A에 나타난 바와 같이, TM4SF5의 과발현에 의해 SOCS1 및 SOCS3 단백질의 발현이 억제되고, STAT3의 인산화가 증가되었으며, α-SMA, 콜라겐1 및 라미닌과 같은 ECM의 발현이 증가되었다. 이때, 콜라겐1과 α-SMA는 유사한 발현 패턴을 나타낸 반면, 라미닌 및 라미닌 γ2는 발현 세포 및 발현 패턴이 상이하였다(도 21A).
한편, 상기 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 지방대사, 간경화 및 간염과 관련된 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 21B 및 21C에 나타난 바와 같이, 지방대사와 관련된 유전자의 발현은 TM4SF5 단백질의 과발현에 영향을 받지 않았으나, 간경화 및 간염과 관련된 유전자의 발현은 증가하였다(도 21B 및 21C).
따라서, 상기로부터 TM4SF5 단백질을 과발현하는 형질전환 마우스에서 지방간이 발생하다가 일정 시간이 경과하면 지방간이 간경화나 간염으로 발전하고, 그에 따라 STAT3 단백질의 인산화나 ECM 수준을 증가시키는 것을 확인하였다.
실시예 18. 간질환 모델 마우스에서의 TM4SF5 단백질 발현 변화 확인
TM4SF5 단백질이 과발현된 마우스에서 생성된 지방간이 시간이 경과함에 따라 간경화 및 간염 증상을 나타내는 것을 확인하였다. 일반적으로 사염화탄소를 4주 동안 투여한 마우스는 간섬유증을 16주 동안 투여한 마우스는 간경변증의 증상을 나타내는 것이 보고되어 있다. 이에, 약물로 간경화를 유도시킨 모델 마우스에서 TM4SF5 단백질의 발현 변화를 확인하였다.
먼저, 4주령의 BALB/C 마우스(오리엔트 바이오, 대한민국)에 1 ㎎/㎏의 양으로 사염화탄소(CCl4)를 1, 4 또는 16주 동안 일주일에 1회 복강 내 주사하여, 간질환이 유도된 모델 마우스를 제조하였다. 제조된 모델 마우스를 이용하여 상술한 바와 같이 H&E 및 메이슨의 트리크롬 염색을 수행한 결과를 도 22A에 나타내었다.
도 22A에 나타난 바와 같이, CCl4를 4주 또는 16주 동안 투여한 마우스의 간조직에서 혈관을 중심으로 세포들이 죽어있고, 그 주변으로 면역반응이 일어나면서 정상세포와 비교하여 형태가 변형된 세포가 관찰되었다. 또한, 세포 사이에 콜라겐이 축적되면서 혈관과 혈관 사이에 길이 생성되었다(도 22A).
또한, 상기 모델 마우스의 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 단백질 및 mRNA의 발현 수준을 확인한 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23A에 나타난 바와 같이, 모델 마우스의 간조직에서 TM4SF5 단백질의 발현, STAT3 단백질의 인산화 및 ECM이 증가하였다(도 23A). 뿐만 아니라, CCl4를 4주 또는 16주 처리한 동물의 간경화가 일어난 조직에서 처리하지 않은 대조군에 대비하여 elastin, 라미닌 α2, α3, α5, γ2, γ3 chain의 mRNA가 높아지는 것을 확인하였다 (도 23B).
나아가, 상기 모델 마우스의 간조직을 이용하여 상술한 바와 같이 면역 염색을 수행한 결과를 도 24에 나타내었다. 도 24에 나타난 바와 같이, 모델 마우스의 간조직에서 TM4SF5 단백질의 발현이 증가함에 따라, STAT3의 인산화가 증가하였고, α-SMA, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 및 라미닌 γ2 단백질의 발현이 증가하였다(도 24).
한편, 실시예 7-1에서 제조한 TM4SF5 유전자 KO 마우스에 상술한 바와 같이 CCl4를 투여한 뒤, 간조직을 수득하여 메이슨의 트리크롬 염색을 수행한 결과를 도 22C에 나타내었다. 그 결과, 대조군에 비해 TM4SF5 유전자 KO 마우스에서 콜라겐의 축적이 감소하였다(도 22C).
실시예 19. 간질환 모델 마우스에서의 라미닌 단백질 발현 조절 기전확인
실시예 18에서 약물 투여로 제조된 간질환 모델 마우스의 간조직을 이용하여 라미닌 단백질의 발현 조절 기전을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 상기 분리된 간조직으로부터 상술한 바와 같이 간세포를 수득하였다. 수득된 간세포에서 TM4SF5 및 STAT3 단백질의 발현을 shTM4SF5 또는 silencing STAT3 [On-Target plus SMART pool siRNA(Thermo)]를 transfection 시키어 억제시키고, 그에 따라 라미닌의 발현 변화를 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이, TM4SF5 및 STAT3 단백질의 발현이 억제됨으로써, 라미닌 단백질의 발현도 억제되었다. 한편, STAT3 단백질의 발현을 억제하였을 때는 TM4SF5 단백질의 발현 변화에는 별다른 영향을 미치지 않았다(도 25).
또한, 상기 분리된 간조직에 IL-6를 처리하여 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행함으로써 증가된 STAT3 인산화 및 라미닌 단백질의 발현이 IL-6에 의존적인지 확인하였다. 그 결과, 도 26A에 나타난 바와 같이 IL-6에 의해 STAT3 단백질의 인산화 및 콜라겐1의 발현이 증가하였으나, 라미닌 단백질의 수준은 변화가 없었다(도 26A). 따라서, 상기로부터 라미닌 및 라미닌γ2는 TM4SF5 단백질에 의존적으로 발현이 증가함을 알 수 있었다.
또한, 상기와 같은 신호전달 기전에서 라미닌의 위치를 확인하기 위해, 상기 분리된 간조직에 라미닌을 처리하여 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, 도 26B에 나타난 바와 같이, 라미닌에 의해 STAT3 단백질의 발현 수준은 변화하지 않았다(도 26B). 따라서, 상기로부터 TM4SF5 단백질이 STAT3 단백질의 인산화를 통해 라미닌의 발현을 조절함을 알 수 있었다.
또한, 상기 분리된 간조직에 c-Src 단백질의 저해제인 PP2(LC Laboratories, 미국) 또는 대조약물(control compound)인 PP3(LC Laboratories, 미국)를 첨가하여, 그에 따른 단백질의 발현 변화를 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과, 도 26C에 나타난 바와 같이, PP2에 의해 STAT3 단백질의 인산화 및 라미닌 단백질의 발현이 억제되었다(도 26C).
나아가, HepG2 (한국세포주 은행, 서울) 간암 세포를 이용하여, TM4SF5 단백질의 발현을 억제하였을 때, STAT3 단백질의 인산화 및 라미닌 단백질의 발현 변화를 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과, 도 26D에 나타난 바와 같이, TM4SF5 단백질의 발현이 억제되면 STAT3 단백질의 인산화 및 라미닌의 발현이 억제되었다(도 26D).
실시예 20. STAT3 단백질의 인산화에 의한 라미닌 단백질의 조절 기전 확인
상기로부터 라미닌 단백질의 발현 변화를 조정하는 것으로 확인된 STAT3 단백질의 인산화가 라미닌의 프로모터를 통해 이의 발현을 조절하는지를 루시퍼라제 분석 방법으로 확인하였다.
먼저, LAMC2 프로모터의 -1871 내지 +388(1 kb) 및 -592 내지 +388(2.3 kb)에 해당하는 부위와 COL1A1 프로모터의 -2865 내지 +85(0.9 kb), -2047 내지 +89(2.1 kb) 및 -845 내지 +89(2.9 kb)에 해당하는 부위를 하기 표 11에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
LAMC2-0.9kb_F AATCCTAAGTCTATAGCAGG 서열번호 97
LAMC2-0.9kb_R CCTCGATCAGGTGTTTTATGC 서열번호 98
LAMC2-2.3kb_F AGTGACTAGTGGGTTTTTTC 서열번호 99
LAMC2-2.3kb_R CCTCGATCAGGTGTTTTATC 서열번호 100
COL1A1-0.9kb_F AGGAGGTCAGAGAAGAATTT 서열번호 101
COL1A1-0.9kb_R TAGACATGTAGACTCTTTGC 서열번호 102
COL1A1-2.1kb_F AACAAAGGGTGAGCAGATCA 서열번호 103
COL1A1-2.1kb_R TAGACATGTAGACTCTTTGC 서열번호 104
COL1A1-2.9kb_F ACATTTATACCTAGGCTGCC 서열번호 105
COL1A1-2.9kb_R TAGACATGTAGACTCTTTGC 서열번호 106
증폭된 PCR 산물을 pGL3 벡터(Promega, Cat#.E1751, 미국)에 삽입하여 컨스트럭트를 제조하였다(도 27A). 한편, AML12 세포를 48-웰 플레이트에 배양하고, 리포펙타민 3000을 사용하여 상기 제조된 컨스트럭트와 TM4SF5 또는 STAT3 단백질을 각각 발현하는 컨스트럭트를 각각 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시퍼라제 리포터 어세이 키트(Promega, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 활성을 측정하였다.생쥐 간상피세포 [murine hepatocytes, AML12, (도 27B 및 27C)] 또는 인간 간성상세포 [human hepatic stellate cells, LX2, (도 27B 및 27C)]에 발현하는 TM4SF5 또는 STAT3 단백질에 의해 라미닌 γ2 (Lamc2, 도 27B) 또는 콜라겐 I A1 (Col1a1, 도 27C)의 프로모터 활성을 나타내는 루시퍼라제 활성이 증가하였다.
실시예 21. TM4SF5 단백질의 발현 증가에 의해 발현되는 ECM의 종류 확인
일반적으로 간 성상세포에 의해 활성화되는 콜라겐의 축적으로 질병이 악화됨이 알려져 있다. 또한, 상기 실험에 의해 콜라겐 I 및 라미닌 γ2의 루시퍼라제 활성 정도가 다른 것으로 보아 세포 종류에 따라 다른 종류의 ECM이 발현될 것이라고 예상되어 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 간경화 조직을 이용하여 상기 서술한 바와 같이 형광염색을 수행하였고, 그 결과, TM4SF5 단백질의 발현이 증가함으로써, 라미닌 단백질도 손상된 간조직 주변에 발현된 것을 확인하였다(도 28A).
또한, 상기 세포들이 어떤 종류의 세포인지 더욱 명확하게 확인하기 위해서 간세포 마커인 알부민, 간성상세포 마커인 α-SMA를 콜라겐 I 및 라미닌과 같이 상술한 바와 동일한 방법으로 염색하였다. 그 결과, 도 28B 및 28C에 나타난 바와 같이, 콜라겐 I은 α-SMA와 같이 염색되었고, 라미닌은 처음엔 α-SMA 및 알부민과 같이 염색되다가, 간경화가 악화되어 간경변증이되면 알부민에만 염색되었다(도 28B 및 28C). 이로부터 라미닌은 콜라겐과는 상이한 패턴으로 간 성상세포보다는 간세포에서 더 많이 발현되고, 간경화에 영향을 주는 것을 확인하였다.
한편, HepG2 세포에서 실시예 4-1과 같은 방법으로 TM4SF5 단백질의 발현을 억제시킨 후 상기와 동일한 방법으로 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 28D 및 도 28E에 나타난 바와 같이, TM4SF5의 발현을 낮춘 세포에서는 간성상세포를 배양하였을 때 얻게되는 배양액(conditioned medium)를 처리하거나 HepG2 세포와 간성상세포와 공동배양을 transwell chamber(Corning, 미국, 위쪽의 chamber에는 간성상세포 배양하고 아래 chamber에는 간상피세포 배양)에서 하더라도 콜라겐의 발현 양은 올라가지만 라미닌의 발현 양은 올라가지 않는 것을 확인함으로써 간상피세포에서는 TM4SF5와 관련하여 STAT3의 인산화를 통해 라미닌이 조절된다는 것을 알 수 있다(도 28D 및 도 28E).
실시예 22. 라미닌 및 콜라겐 유전자의 억제에 의한 간경화 완화 효과 확인
상기 실험을 통해 STAT3 단백질에 의해 라미닌 단백질의 발현이 조절되는 것을 확인하였다. 먼저, 마우스의 꼬리 정맥으로 라미닌 γ2(LAMC2) 또는 콜라겐 I(COL1A1) 유전자에 대한 siRNA를 주사한 뒤, CCl4를 투여하였다. 상기 마우스로부터 간조직을 수득하고, 이를 H&E 염색으로 염색한 결과, CCl4에 의한 간손상이 억제되었다(도 29A). 또한, TM4SF5, 라미닌 γ2 (LAMC2) 또는 콜라겐 I α1 (COL1A1) 단백질의 발현과 STAT3의 인산화가 감소하였고 (도 29B), TM4SF5, laminin γ2 (LAMC2) 또는 collagen I α1 (COL1A1), a-SMA, 및 TGFß1의 mRNA (도 29C) 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 23. 간암 동물모델에서 TM4SF5 단백질에 의한 라미닌의 조절 확인
지방간, 간경화, 지방간염 및 간경변증을 거쳐 유발된 간암 모델에서도 상기와 같은 신호전달이 적용되는지를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, TM4SF5 단백질이 과발현된 52주령 FVB/N 동물모델을 1년 동안 사육한 뒤, 이를 희생시켜 간조직을 적출하였다. 적출된 간조직에서 TM4SF5 단백질이 과발현되고, 간조직에 nodule이 생긴 것을 확인하였다(도 30A). 상기 간조직에서 간암 마커인 CD34, AFP, AFU, 인산화된 STAT3, 라미닌, 라미닌 γ2 및 콜라겐 I등의 발현이 증가하였다(도 30B 및 30E). 한편, 상기 간조직을 이용하여 mRNA의 발현 수준을 확인한 결과, 지방간과 관련된 유전자의 발현은 증가하지 않았다(도 30C). 한편, 상기 간조직으로부터 간암 마커인 CD34, HIF1α, Ki67 및 cyclinD 유전자의 발현이 HIF1-α의 발현과 함께 증가한 것을 확인하였다(도 30D). 또한, 혈액 샘플을 분석하였을 경우, AST, ALT, LDL, 및 triglyceride의 수준이 증가함을 확인하였다 (도 30E).
실시예 24. 간섬유화 및 간암의 동물모델에서 TM4SF5 단백질 및 관련 단백질의 발현 변화 확인
유전자 변형 마우스를 이용하여 간질환의 심화과정을 다음과 같이 확인하였다. 구체적으로, 상기 유전자 변형 마우스에 diethylnitrosamine(DEN) 약물을 주입함으로써 간암을 유도하였다. 상기 마우스로부터 간조직을 적출하여 H&E 염색을 수행한 결과 간암이 유발된 것을 확인하였고(도 31A), TM4SF5 단백질의 발현이 증가하면서 STAT3 단백질의 인산화 및 라미닌의 발현이 증가하였다(도 31B).
또한, 상기 수득된 간조직을 이용하여 면역염색을 수행함으로써, TM4SF5, 인산화된 STAT3, 라미닌(laminins), 라미닌 γ2(laminin γ2) 및 콜라겐 I(collagen I) 단백질의 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 31C).
실시예 25. 간암 환자의 암 조직에서 TM4SF5 단백질의 발현 변화 확인
간암환자로부터 암 조직 및 암 주변조직을 수득하여 상술한 바와 같은 방법으로 인산화된 STAT3, 라미닌 및 콜라겐 I의 발현변화를 확인하였다. 이때, 암 주변조직은 암으로 발병되기 전 단계로서 간염, 섬유화 및 간경화의 병리학적 증상이 나타날 것으로 예상되었다. 그 결과, 도 32에 나타난 바와 같이, 암 조직 및 암 주변조직에서 TM4SF5, 인산화된 STAT3, 라미닌 및 콜라겐 I의 발현이 증가하였다(도 32).
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> DIAGNOSIS METHOD OF LIVER DISEASES AND SCREENING METHOD OF TREATMENT AGENT FOR LIVER DISEASES USING TM4SF5 PROTEIN EXPRESSION LEVEL CHANGE <130> 2018P-09-024 <160> 112 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Cys Thr Gly Lys Cys Ala Arg Cys Val Gly Leu Ser Leu Ile Thr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Val Cys Ile Val Ala Asn Ala Leu Leu Leu Val Pro Asn 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Trp Thr Asn Thr Asn His Leu Ser Leu Gln Val Trp 35 40 45 Leu Met Gly Gly Phe Ile Gly Gly Gly Leu Met Val Leu Cys Pro Gly 50 55 60 Ile Ala Ala Val Arg Ala Gly Gly Lys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Cys 65 70 75 80 Cys Gly Asn Arg Cys Arg Met Leu Arg Ser Val Phe Ser Ser Ala Phe 85 90 95 Gly Val Leu Gly Ala Ile Tyr Cys Leu Ser Val Ser Gly Ala Gly Leu 100 105 110 Arg Asn Gly Pro Arg Cys Leu Met Asn Gly Glu Trp Gly Tyr His Phe 115 120 125 Glu Asp Thr Ala Gly Ala Tyr Leu Leu Asn Arg Thr Leu Trp Asp Arg 130 135 140 Cys Glu Ala Pro Pro Arg Val Val 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15 Arg Pro Gly Leu Trp Leu Tyr Thr His Pro Leu Ile Lys Leu Leu Phe 20 25 30 Leu Pro Arg Arg Ser Arg Cys Lys Phe Phe Ser Leu Thr Glu Thr Pro 35 40 45 Glu Asp Tyr Thr Leu Met Val Asp Glu Glu Gly Phe Lys Glu Leu Pro 50 55 60 Pro Ser Glu Phe Leu Gln Val Ala Glu Ala Thr Trp Leu Val Leu Asn 65 70 75 80 Val Ser Ser His Ser Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Gly Val Thr Lys 85 90 95 Ile Ala Arg Ser Val Ile Ala Pro Leu Ala Glu His His Val Ser Val 100 105 110 Leu Met Leu Ser Thr Tyr Gln Thr Asp Phe Ile Leu Val Arg Glu Gln 115 120 125 Asp Leu Ser Val Val Ile His Thr Leu Ala Gln Glu Phe Asp Ile Tyr 130 135 140 Arg Glu Val Gly Gly Glu Pro Val Pro Val Thr Arg Asp Asp Ser Ser 145 150 155 160 Asn Gly Phe Pro Arg Thr Gln His Gly Pro Ser Pro Thr Val His Pro 165 170 175 Ile Gln Ser Pro Gln Asn Arg Phe Cys Val Leu Thr Leu Asp Pro Glu 180 185 190 Thr Leu Pro Ala Ile Ala Thr Thr Leu Ile Asp Val Leu Phe Tyr Ser 195 200 205 His Ser Thr Pro Lys Glu Ala Ala Ser Ser Ser Pro Glu Pro Ser Ser 210 215 220 Ile Thr Phe Phe Ala Phe Ser Leu Ile Glu Gly Tyr Ile Ser Ile Val 225 230 235 240 Met Asp Ala Glu Thr Gln Lys Lys Phe Pro Ser Asp Leu Leu Leu Thr 245 250 255 Ser Ser Ser Gly Glu Leu Trp Arg Met Val Arg Ile Gly Gly Gln Pro 260 265 270 Leu Gly Phe Asp Glu Cys Gly Ile Val Ala Gln Ile Ala Gly Pro Leu 275 280 285 Ala Ala Ala Asp Ile Ser Ala Tyr Tyr Ile Ser Thr Phe Asn Phe Asp 290 295 300 His Ala Leu Val Pro Glu Asp Gly Ile Gly Ser Val Ile Glu Val Leu 305 310 315 320 Gln Arg Arg Gln Glu Gly Leu Ala Ser 325 <210> 95 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shTM4SF5 #2 <400> 95 accaugugua cgggaaaaug ugc 23 <210> 96 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shTM4SF5 #4 <400> 96 ccaucucagc uugcaaguc 19 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMC2-0.9kb_F <400> 97 aatcctaagt ctatagcagg 20 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMC2-0.9kb_R <400> 98 cctcgatcag gtgttttatg c 21 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMC2-2.3kb_F <400> 99 agtgactagt gggttttttc 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMC2-2.3kb_R <400> 100 cctcgatcag gtgttttatc 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1-0.9kb_F <400> 101 aggaggtcag agaagaattt 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1-0.9kb_R <400> 102 tagacatgta gactctttgc 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1-2.1kb_F <400> 103 aacaaagggt gagcagatca 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1-2.1kb_R <400> 104 tagacatgta gactctttgc 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1-2.9kb_F <400> 105 acatttatac ctaggctgcc 20 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1-2.9kb_R <400> 106 cgctattacc atggtgatgc g 21 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RG1 <400> 107 gaggttgccg tccgtccagg tgg 23 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RG2 <400> 108 gctgaggttg ccgtccgtcc agg 23 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF5_forward <400> 109 acttcctcag ggcctctctc 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF5_reverse <400> 110 cctttcccac attcctcaga 20 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOCS3 (NM_174466) sense <400> 111 caacaucucu gucggaagau u 21 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOCS3 (NM_174466) antisense <400> 112 ucuuccgaca gagauguugu u 21

Claims (19)

1) 간질환 의심 환자로부터 분리된 시료에서 TM4SF5(transmembrane 4 L6 family member 5) 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 시료를 선별하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 선별된 시료에서 SREBP1(sterol regulatory element-binding transcription factor 1)의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 단백질, c-Src(cellular　sarcoma) 단백질, FAK(focal adhesion kinase) 단백질, mTOR, S6K, ULK(UNC-51-like kinase 1), 4EBP1(Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein) 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 정상 대조군 시료의 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 간질환이 비만, 대사장애, 포도당저항성, 인슐린저항성, 체중증가, 지방간, 간섬유화증, 간염, 간경화증, 또는 간암인, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK 단백질, mTOR 단백질, S6K 단백질, ULK 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준이 정상 대조군에 비해 감소하거나,
상기 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고, 모노아실-(monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 또는 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 수준이 정상 대조군에 비해 감소하는 경우 지방간으로 판단하는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 SREBP1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준이 정상 대조군에 비해 증가하면 간섬유화증, 간염, 간경화증, 또는 간암으로 판단하는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, SIRT1(NAD-dependent deacetylase sirtuin-1), SIRT5, SIRT6, SREBP2, SREBP1c, CD36, FABP1(fatty acid-binding protein 1), FASN(fatty Acid Synthase), LDLR(low density lipoprotein receptor), VLDLR(very Low Density Lipoprotein Receptor), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptors γ), TIMP1(The tissue inhibitor of metalloproteinase-1), TGFß1(Transforming growth factor beta 1), TNFα(tumor necrosis factor α), vimentin, MCP1 [monocyte chemotactic protein 1 (CCL2)], laminin α2, laminin α3, laminin α5, laminin γ2, laminin γ3, SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1), SOCS3, ApoB100(Apolipoprotein B), PPARα, Leptin, Acc(Acetyl-CoA carboxylase)α, Accβ, F4/80 antigen, 콜라겐 I, 콜라겐 I형 α1 체인(collagen type I alpha 1 chain), AFP(Alpha-fetoprotein), FUCA(AFU, alpha-L-fucosidase 1), CD34, HIF1α(Hypoxia-inducible factor), Ki-67, 및 Cyclin D1으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제5항에 있어서, 상기 SIRT1, SIRT5, SIRT6, laminin α5, laminin γ2 또는 laminin γ3의 mRNAs 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소하고, SREBP2, SREBP1c, CD36, FABP1, FASN, LDLR, VLDLR, PPARγ, TIMP1, TGFß1, TNFα, vimentin, MCP1, SOCS1, SOCS3, ApoB100, PPARα, Leptin, Accα, 또는 Accβ 의 mRNA 혹은 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK 단백질, mTOR 단백질, S6K 단백질, ULK 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준이 정상 대조군에 비해 감소하면 지방간으로 판단하는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제5항에 있어서, 상기 SREBP2, SREBP1c, CD36, FABP1, FASN, LDLR, VLDLR 또는 PPARγ의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소하고, SIRT1, SIRT5, SIRT6, TGFß1, TNFα, vimentin, laminin, laminin γ2, collagen I, SOCS1, SOCS3, F4/80 antigen, 콜라겐 I, 콜라겐 I형 α1 체인(collagen type I alpha 1 chain), AFP(Alpha-fetoprotein), FUCA(AFU, alpha-L-fucosidase 1), CD34, HIF1α(Hypoxia-inducible factor), Ki-67, 또는 Cyclin D1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 증가하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK 단백질, mTOR 단백질, S6K 단백질, ULK 단백질, 4EBP1 단백질 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준이 정상 대조군에 비해 증가하면 간섬유화증, 간염, 간경화증, 또는 간암으로 판단하는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서, 상기 간염, 간섬유화증, 간경화증, 또는 간암이 간상피세포 (hepatocytes)에서 laminin α2, laminin α3, laminin α5, laminin γ2, laminin γ3 chain을 포함하는 라미닌(laminins) 또는 elastin을 포함하는 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 양이 증가하는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제8항에 있어서, 상기 ECM이 α-SMA(α-smooth muscle actin), 콜라겐, 라미닌 및 laminin γ2로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 간상피세포(hepatocytes) 또는 간성상세포(hepatic stellate cells)에서 각각의 발현 수준의 측정을 포함하는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, SREBP1, SREBP2 또는 SREBP1c의 mRNA 혹은 단백질의 발현 수준이 SIRT1(NAD-dependent deacetylase sirtuin-1), SIRT2, SIRT4, SIRT5, SIRT6 및 SIRT7로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 의해 조절되는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, TM4SF5가 과발현되거나 발현 억제된 세포 혹은 동물모델에서 STAT3 단백질의 인산화 수준이 SOCS1(suppressor of cytokine signaling 1) 및 SOCS3로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 의해 조절되고 elastin, 콜라겐(collagen) I, 라미닌(laminin) α2, 라미닌(laminin) α3, 라미닌(laminin) α5, 라미닌(laminin) γ2 또는 라미닌(laminin) γ3의 전사 활성 및 발현을 조절하는, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 TM4SF5 단백질의 발현 증가에 따라 지방간 및 간염이 발병함에 따라서 혈장 내에서 트리글리세라이드(triglyceride, TG), 자유 지방산(free fatty acid, FFA), 콜레스테롤(cholesterol), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT), 아스파르산 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase, AST), LDL(Low-density lipoprotein), 글루코스(glucose), 및 인슐린(insulin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 양이 증가되는 것인, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 TM4SF5 단백질의 발현 증가에 따라 간섬유화가 발병함에 따라서 조직에서 간세포의 손상, 세포 배열 패턴 무질서화, 또는 콜라겐 I 또는 라미닌 합성 축적 증가가 나타나는 것인, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 TM4SF5 단백질의 발현 증가에 따라 환자에서 체중의 증가, 체중/간무게의 증가, 고탄수화물 식이, 고지방 식이, 저지방/고탄수화물 식이, 고아르기닌, 및 고수크로즈(sucrose) 식이에 따른 체중 증가, 인슐린 저항성 증가, 글루코즈 저항성 증가, 지방간 및 지방간염의 증가, 또는 콜라겐 및 라미닌 등의 세포외기질 합성 증가가 나타나는 것인, 간질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
1) TM4SF5 및 SREBP1 단백질을 발현하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 SREBP1 단백질의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 및 STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBP1 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 억제하고, STAT3 단백질, c-Src단백질, FAK, mTOR, S6K, ULK, 4EBP1 및 Akt 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상 단백질의 인산화 수준을 증가시키거나, 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SREBP1 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 억제하고, 모노아실-(monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 또는 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 합성을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 지방간 치료 후보물질의 스크리닝 방법.
제15항에 있어서, SIRT1(NAD-dependent deacetylase sirtuin-1), SIRT5, SIRT6, SREBP2, SREBP1c, CD36, FABP1(fatty acid-binding protein 1), FASN(fatty Acid Synthase), LDLR(low density lipoprotein receptor), VLDLR(very Low Density Lipoprotein Receptor), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptors γ), TIMP1(The tissue inhibitor of metalloproteinase-1), TGFß1(Transforming growth factor beta 1), TNFα(tumor necrosis factor α), vimentin, MCP1 [monocyte chemotactic protein 1 (CCL2)], laminin α5, laminin γ2, laminin γ3, SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1) SOCS3, ApoB100(Apolipoprotein B), PPARα, Leptin, Acc(Acetyl-CoA carboxylase)α, Accβ, F4/80 antigen, 콜라겐 I, 콜라겐 I형 α1 체인(collagen type I alpha 1 chain), AFP(Alpha-fetoprotein), FUCA(AFU, alpha-L-fucosidase 1), CD34, HIF1α(Hypoxia-inducible factor), Ki-67, 및 Cyclin D으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 지방간 치료 후보물질의 스크리닝 방법.
1) TM4SF5 단백질을 발현하는 세포 또는 동물모델에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 TM4SF5 단백질과 mTOR 단백질, SLC7A1 단백질 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과의 결합을 측정하는 단계;
3) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 mTOR 단백질, S6K 단백질, UNC-51-like kinase 1(ULK1) 단백질, 또는 4EBP1 단백질의 인산화를 측정하는 단계;
4) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 모노아실-(monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 또는 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 수준을 측정하는 단계;
5) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 체중 증가, 포도당 저항성, 인슐린 저항성 및 해당과정의 반응성으로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상을 측정하는 단계; 및
6) 상기 단계 1)의 세포 또는 동물모델에서 해당과정 관련된 유전자들의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
7) 상기 단계 2)에서 TM4SF5 단백질과 mTOR 단백질, SLC7A1 단백질 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과의 결합을 억제하고, 단계 3) mTOR 단백질, S6K 단백질, UNC-51-like kinase 1(ULK1) 단백질, 또는 4EBP1 단백질의 인산화를 억제하며, 단계 4)에서 모노아실- (monoacyl-), 다이아실-(diacyl-), 및 트라이아실-(triacyl-) 글라이세롤 (glycerol)의 수준을 감소시키고, 단계 5)에서 체중 증가, 포도당 저항성, 인슐린 저항성 또는 해당과정의 반응성을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항비만, 지방간, 또는 간암 치료 후보물질의 스크리닝 방법.
TM4SF5 유전자가 녹아웃(knock-out, KO)된 마우스를 APCmim/+(adenomatous polyposis colimin/+)의 유전형을 갖는 마우스와 교배하는 단계를 포함하는 문맥압항진증(portal hypertension) 동물 모델 제조 방법.
제18항의 방법으로 제조된 문맥압항진증 동물 모델.
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