KR20190028786A - 스택 및 관련 시퀀서 내 액적들을 식별하기 위한 방법 - Google Patents

스택 및 관련 시퀀서 내 액적들을 식별하기 위한 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20190028786A
KR20190028786A KR1020197004498A KR20197004498A KR20190028786A KR 20190028786 A KR20190028786 A KR 20190028786A KR 1020197004498 A KR1020197004498 A KR 1020197004498A KR 20197004498 A KR20197004498 A KR 20197004498A KR 20190028786 A KR20190028786 A KR 20190028786A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
droplet
droplets
tube
stack
stream
Prior art date
Application number
KR1020197004498A
Other languages
English (en)
Inventor
카메론 알렉산더 프레이링
토마스 헨리 아이작
Original Assignee
베이스4 이노베이션 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베이스4 이노베이션 엘티디 filed Critical 베이스4 이노베이션 엘티디
Publication of KR20190028786A publication Critical patent/KR20190028786A/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0241—Drop counters; Drop formers
    • B01L3/0268—Drop counters; Drop formers using pulse dispensing or spraying, eg. inkjet type, piezo actuated ejection of droplets from capillaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00364—Pipettes
    • B01J2219/00367—Pipettes capillary
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00576—Chemical means fluorophore
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0642—Filling fluids into wells by specific techniques
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/525—Phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/159—Microreactors, e.g. emulsion PCR or sequencing, droplet PCR, microcapsules, i.e. non-liquid containers with a range of different permeability's for different reaction components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/12—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for screening libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

각각의 액적이 초기에 비형광 상태인 형광단들(fluorophores)을 갖는 액적 스트림 내의 개별 액적의 내용물을 식별하는 방법이 기술되고, 이 방법은 액적을 하나씩 하나 이상의 개방단부형(open-ended) 튜브 내로 도입하여 그 내부에 액적 스택을 생성하는 단계; 상기 액적들 내의 형광단들을 활성화시켜 형광시키는 단계; 상기 액적 스택 내의 각각의 액적을 상기 튜브로부터 차례로 배출하고 상기 튜브의 주축을 따라 배출되는 각각의 액적에 연관된 형광을 검출하는 단계를 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 생체고분자를 시퀀싱하기에 적합한 방법을 개시하고, 이 방법은 (1) 생체고분자를 그의 구성 단량체의 정렬된 스트림으로 점진적으로 소화시키는 단계; (2) 단량체들의 스트림을 단량체 함유 수성 액적들의 상응하는 스트림으로 전환시키는 단계로서, 각각의 액적들의 추가로 (a) 단량체를 포획 할 수 있고 (b) 그 후에 포획된 단량체의 퀀칭되지 않은 형광단을 방출하도록 소화 될 수 있는 프로브를 포함하는 단계; (3) 단계(2)에서 생성된 액적의 스트림을 적어도 하나의 개방단부형 튜브의 유입 단부내로 도입하여 그 내부에 액적들의 스택을 생성하는 단계 및 (4) 상기 튜브의 출구 단부로부터 차례로 각 액적을 방출하고 각각의 액적이 방출 될 때 각각의 방울에서 형광단을 검출하는 단계를 특징으로 한다. 본 방법은 핵산 또는 단백질과 같은 생체고분자를 시퀀싱하기 위한 상응하는 장치에서 사용될 수 있다.

Description

스택 및 관련 시퀀서 내 액적들을 식별하기 위한 방법
본 발명은 액적 스택(droplet stack; "액적 적층체")에서 액적들을 식별하기 위한 개선된 방법 및 장치에 관한 것이다. 이는 핵산(nucleic acid)과 같은 생체고분자(biopolymer)를 분석하기 전에 그것의 단위 구성 단량체(constituent monomer unit)를 미세액적들(microdroplets)로 포획함으로써 핵산과 같은 생체고분자를 시퀀싱(sequencing) 하는 데 유용하다.
본 발명자의 기출원된 특허 출원 WO2014053854 및 WO2014167323에서, 본 발명자는 대응하는 전구체 분석물(precursor analyte)로부터 단일 뉴클레오타이드의 정렬된 스트림을 우선 생성하는 것을 포함하는 방법을 이용해 합성 및 자연발생 DNA 및 RNA와 같은 핵산을 시퀀싱하는 방법을 개시한 적이 있다; 예를 들어 점진적 피로포스포로졸 분해(pyrophosphorolysis, "가파이로인산 분해") 또는 외부핵 분해(exonucleolysis)를 이용하는 것이다. 이후, 단일 뉴클레오타이드는 수성 미세액적들에 포획되어 여기서, 퀀칭된 형광표지된 올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide) 프로브 시스템으로 처리되는데, 이 시스템은, 포획된 이후, 검출 가능한 상태에 있는 퀀칭되지 않은 형광표지물질을 갖는 단일 뉴클레오타이드를 유리시키도록 점진적 외부핵 분해를 거치며, 그의 특유의 형광 방출은 본래 포획된 뉴클레오타이드가 신뢰성 있게 식별되도록 한다. 이러한 목적에 적합한 프로브들(probes) 및 방법의 예시들이 WO201405385 및 WO2016012789를 비롯한 이들 및 다른 특허 출원에 기재되어 있다.
앞서 기술된 방법은, 예를 들어, 실리콘 오일과 같은 비혼화성 캐리어 매질(immiscible carrier medium) 중에 분산된 액적의 스트림(stream)을 생성하여 조작함으로써 수행될 수 있지만, 본 발명자는 최근에 액적이 형성될 평면 기판의 표면 상에 액적을 직접 인쇄함으로써 보다 효율적이며 유리하게 수행될 수 있는 방법을 발견하였다. 본 발명자는 US 2016122802 및 유럽 특허 출원 EP 15002007.1에서 이러한 액적 인쇄 및 저장 방법의 다양한 예시들을 설명하였다.
이 접근 방식의 한 가지 잠재적 결점은, 큰 핵산 조각들이 분석될 때 이에 연관된 액적들의 수가 너무 많기 때문에, 기판이 매우 커야 할 필요가 있고 실제로 다수의 기판들이 필요할 수 있다는 것이다. 이는 본래의 분석물이 유기체의 유전자 또는 염색체의 특성인 뉴클레오타이드가 수천 또는 수백만 개일 때 특히 그러하다. 이러한 결점을 극복하기 위해, 인쇄된 액적이, 기판의 표면에 저장되는 것이 아니라, 액적들이 분석이 이루어질 준비가 될 때까지 기판 안에 배치된 모세관 내에 적층되는 방법을 발명하였다. 이후, 액적들은 적절한 시점에 튜브로부터 방출되며 이 방출 지점에서 액적들은, 앞서 고찰된 바와 같이, 분광 방식으로(spectroscopically) 분석될 수 있다. 이를 통해, 본 발명자는 현재 개발중인 해당 시퀀서의 중요 부분의 크기를 크게 줄일 수 있었다. 더욱이, 본 발명자는 이 방법이 개별적인 형광 특성에 기초하여 큰 액적 스트림 내에서 액적들을 분류하는 것에 더 큰 범용성을 가질 것으로 본다.
이에, 본 발명의 제1 측면에서, 각각의 액적이 형광단들(fluorophores)을 갖는 액적 스트림 내의 개별 액적의 내용물을 식별하는 방법이 제공되며, 이 방법은 액적을 하나씩 하나 이상의 개방단부형(open-ended) 튜브 내로 도입하여 그 내부에 액적 스택을 생성하는 단계; 상기 튜브로부터 액적 스택 내의 각 액적을 차례로 방출하고 방출되는 각 액적과 관련된 형광(fluorescence)을 튜브의 주축(major axis)을 따라 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 본 방법은 예를 들어 전자기계식 게이트 따위의 하나 또는 그 이상의 분류 게이트(sorting gate)를 사용해, 검출된 형광에 기초하여 액적들을 특성화 또는 분류하는 추가 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 액적들은 튜브의 입구 단부로 도입되고 대응하는 출구 단부로부터 제거된다. 다른 실시예에서, 튜브는 수직으로 정렬되고 액적들은 상부의 입구로 도입되고 액적 스택으로부터 바닥의 출구 단부에서 제거된다.
바람직한 일 실시예에서, 형광단을 함유하는 액적들은 초기의 퀀칭된(비형광) 상태에서 튜브 내로 도입되며, 본 방법은, 액적이 상기 액적 스택 내에 위치하는 동안, 상기 형광단을 활성화시키는 추가 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 형광단들은 프로브 분자(probe molecule), 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프로브와 관련되며, 이는 사용자가 간접적으로 식별하고자 하는 분석물 분자의 특성을 가지는 것으로 선택된다. 튜브(들)의 성질-이들이 어떻게 배치될 수 있는지(예를 들어, 고체 기판), 및 액적들의 성질 및 내용물에 대한 더 상세항 내용은 본 발명의 적절한 일 응용; 및 그 구성 단량체 단위들로 특징지어 지는 생체 고분자들의 시퀀싱을 상세히 참조하여 이하에서 더 자세히 설명한다.
따라서, 본 발명의 제2 측면에서, (1) 생체고분자를 그의 구성 단량체의 정렬된 스트림으로 점진적으로 소화시키는 단계; (2) 단량체들의 스트림을 단량체 함유 수성 액적들의 상응하는 스트림으로 전환시키는 단계로서, 각각의 액적들의 추가로 (a) 단량체를 포획 할 수 있고 (b) 그 후에 포획된 단량체의 퀀칭되지 않은 형광단을 방출하도록 소화 될 수 있는 프로브를 포함하는 단계; (3) 단계(2)에서 생성된 액적의 스트림을 적어도 하나의 개방단부형 튜브의 유입 단부내로 도입하여 그 내부에 액적들의 스택을 생성하는 단계 및 (4) 상기 튜브의 출구 단부로부터 차례로 각 액적을 방출하고 각각의 액적이 방출 될 때 각각의 방울에서 형광단을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
또한, 이러한 특정 방법은 핵산 또는 단백질과 같은 생체고분자를 시퀀싱하는데 적합한 해당 시퀀서의 작동 기반을 형성 할 수 있다는 점도 유의할 것이다. 따라서, 본 발명의 제3 측면에 따르면, 하기를 특징으로 하는 생체고분자를 시퀀싱하는 장치가 제공된다.
생체고분자가 그 구성 단량체의 대응하는 스트림으로 점진적으로 소화되는 분석물 수용 위치를 포함하는 소화 유닛;
대응하는 액적들의 스트림으로서 단량체의 스트림을 방출하기 위한 적어도 하나의 액적 방출 노즐을 포함하는 배출 유닛;
개방단부형 튜브들의 어레이가 관통하도록 제공된 기판으로서, 각각의 튜브는 대향하는 면들 상에 입구와 출구를 가지며 그 주축들은 액적들이 방출될 방향에 평행하게 배치되는, 기판;
액적들이 튜브 내로 분배될 수 있도록 튜브의 주축에 수직인 적어도 하나의 방향으로 기판의 유입면에 대해 액적 분배 노즐을 스테핑하는(stepping) 수단;
요구에 따라 배출구를 통해 스택으로부터 액적들을 방출하기 위해 튜브들 내에 액적 스택을 생성하는 제어기;
기판의 배출면 내의 배출구들을 조명하도록 구성된 적어도 하나의 전자기 방사선 소스;
배출구들에 대한 조명을 배출구들로부터 액적이 토출되는 것에 동기화 시키는 수단 및
배출구들로부터 발생하는 동기화된 형광 방사선 신호를 감지하도록 구성된 적어도 하나의 광검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
일 실시예에서, 생체고분자는 핵산이고 단위 단량체는 뉴클레오타이드이다; 예를 들어 3인산뉴클레오시드(nucleoside triphosphates), 2인산뉴클레오사이드(nucleoside diphosphates) 또는 1인산뉴클레오사이드(nucleoside monophosphates)이다. 다른 실시예에서, 생체고분자는 단백질이고 단량체는 아미노산 분자이다.
일 실시예에서, 해당 시퀀서의 분해 단위에서 수행되는 본 발명의 제 2 측면의 단계(1)을 고려하면, 생체고분자가 핵산인 경우, 이는 점진적 피로포스포로졸 분해(pyrophosphorolysis, "가파이로인산 분해") 또는 외부핵 분해(exonucleolysis)에 의해 영향을 받는다. 해당 시퀀서에서는 이러한 현상이 소화 유닛의 분석물 수용위치에서 발생하는데, 예를 들어 분석물이 직접적으로 챔버 또는 미세 유체 튜브 외벽에 부착하거나, 가령 흡입(suction) 또는 자기적 인력에 의해 해당 위치에 고정되도록 조정된 기능성 비드와 같은 중간물을 통하여 이루어진다.
핵산 분석물은 원칙적으로 유전자나 염색체에서 발견되는 길이까지의 DNA 조각 혹은 RNA를 포함하여 모든 자연 또는 합성 원소의 핵산이 될 수 있다. DNA 또는 RNA가 자연적으로 기원하는 한 실시예에서, 핵산은 특징적인 핵염기 티민(T), 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 및 우라실(U) 중 하나를 갖는 뉴클레오타이드로 구성되어 있다. 본 발명의 방법 및 장치에 의해 분석 될 수 있는 다른 핵산, 뉴클레오타이드 및 핵염기의 범위 및 범위에 관한 추가 정보를 위해, 상기 언급 한 본 발명자의 특허 출원들이 참고될 수 있다.
일 실시예에서, 핵산 분석물은 순차적 피로포스포로졸 분해(pyrophosphorolysis, "가파이로인산 분해") 또는 외부핵 분해(exonucleolysis)에 의해 수성 매질에서 단일 3인산뉴클레오시드(nucleoside triphosphates) 또는 단일 1인산뉴클레오사이드(nucleoside monophosphates)의 해당 순서 스트림으로 소화되며, 여기서 염기서열은 분석물의 뉴클레오타이드 서열에 상응한다. 이 소화는 위에서 언급한 본원 특허 출원들에 개시된 필수 시약 및 효소를 포함하는 유동 매체에서 적절하게 효과가 발생한다. 바람직하게는 뉴클레오타이드는 파이로인산염(pyrophosphate) 및 관련 피로 인산 분해 작용을 나타내는 중합 효소의 존재 하에 분석물의 점진적인 피로포스포로졸 분해(pyrophosphorolysis, "가파이로인산 분해")에 의해 생성된 3인산뉴클레오시드(nucleoside triphosphates)이다. 일 실시예에서, 소화 유닛의 하류에는 무기 피로포스파타아제(pyrophosphatase)를 도입하여 임의의 잔류 파이로인산염(pyrophosphate) 이온을 가수 분해 할 수 있는 챔버 또는 유체 접합부를 포함하는 구역이 제공된다.
시퀀서의 배출 유닛에서 수행되도록 설계된 방법의 단계(2)에서, 뉴클레오타이드의 스트림은 뉴클레오타이드를 함유하는 수성 액적의 대응하는 정렬된 스트림으로 전환된다. 이론상, 스트림의 각 액적은 뉴클레오타이드 함유 스트림으로부터 유도된 뉴클레오타이드를 포함 할 수 있다. 그러나, 각각의 충전된 액적이 오직 하나의 뉴클레오타이드만 포함하도록 하기 위해서는, 일반적으로 뉴클레오타이드 함유 스트림의 유량에 비례하게 액적 생성 속도를 조절하여 액적 스트림에서 충전된 각 액적이 여러 개의 빈 액적으로 분리되게 하는 것이 바람직하다. 일 실시예에서, 스트림 내의 각각의 충전된 액적은 1 내지 20 개, 바람직하게는 2 내지 10 개의 빈 것으로 분리된다.
뉴클레오티타이드 이외에, 액적 스트림 내의 각각의 액적은 도입된 뉴클레오타이드를 포획 할 수 있는 프로브를 적절하게 함유한다. 실제로 DNA와 RNA의 경우, 이것은 다른 특징적인 핵염기에 대해 선택적이고 상응하는 다른 형광체 유형을 가지는 1, 2, 3 또는 4 개의 상이한 프로브 유형을 액적에 포함한다는 것을 의미한다. 바람직한 프로브 유형의 예는 본원 출원들인 WO2014053853, WO2014053854, WO2014167323 및 WO2016012789에 기술된 것을 포함하며, 이는 본질 및 합성에 관한 추가 정보에 관한 것이다. 이러한 모든 프로브 유형의 공통적인 특징은 (1) 리가아제 및 폴리머라아제와 같은 효소의 존재 하에서 단일 뉴클레오타이드를 선택적으로 포획하기에 적합하다는 것; (2) 미사용 상태에서 이들은 외부핵 분해(exonucleolysis)에 내성이 있지만, 해당 단일 뉴클레오타이드가 포획된 후에 쉽게 외부핵 소화 될 수 있고 (3) 이들은 사용된 프로브 또는 구성 요소가 소화될 때까지 퀸칭된 상태로 남아있는 특징적인 형광단으로 구성된다. 따라서, 프로브 및 뉴클레오타이드 이외에, 각각의 액적이 리가아제, 폴리머라아제 및 엑소뉴클레아제(exonuclease) 행동을 나타낼 수 있는 효소를 더 포함한다면, 관찰자는 일정 배양 기간 후 각 액적에서 포획된 특정 뉴클레오타이드의 형광 시그널 특성이 증가하는 것을 볼 수 있다. 특히 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 프로브가 바람직한데, 이 프로브는 (a) 퀸칭 상태의 특징적인 형광단으로 표지된 제 1 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 (b) 본질적으로 이중 가닥 사용 프로브를 생성하기 위하여 타겟 단일 3인산뉴클레오시드(nucleoside triphosphates), 리가아제 및 폴리머라아제의 존재 하에 제 1 올리고뉴클레오티드 상의 상보적 영역과 하이브리드화 될 수 있는 제2 및 제3 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 그 후, 사용된 프로브의 제1 단일 가닥 구성 요소는 퀀칭되지 않고 따라서 검출 가능한 상태로 형광 물질을 방출하기 위해 외부핵 소화(exonucleolytically digestion)될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 제 2 및 제 3 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 그 자체가 뉴클레오타이드로 구성 될 수 있는 링커 영역에 의해 함께 연결된 올리고뉴클레오타이드 영역이다. 이 실시예에서, 프로브에 의한 표적 뉴클레오타이드의 포획은 외부핵 분해(exonucleolysis)에 대해 고도의 내성을 갖는 제 2 및 제 3 영역을 포함하는 폐쇄형 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 성분을 생성한다. 이후, 두 경우 모두 및 제1 올리고뉴클레오타이드 성분이 분해되어 형광 물질을 방출하는 경우, 다른 올리고뉴클레오타이드 가닥은 형광 신호의 빠른 성장을 보장하는 순환 과정에서 추가로 사용된 프로브를 하이브리드화 및 추가 생성 할 수 있다. 이들 프로브, 적합한 형광단, 퀀처 및 포획 방법에 관한 추가 정보는 WO2016012789에서 찾을 수 있다.
적합하게는, 공정의 단계(2) 및 시퀀서의 배출 유닛에서 생성 된 방울은 100 마이크론 미만, 바람직하게는 50 마이크론 미만, 보다 바람직하게는 20 마이크론 미만, 보다 더 바람직하게는 15 마이크론 미만인 유한 직경을 갖는 미세액적들(microdroplets)이다. 가장 바람직한 모든 직경의 범위는 2 내지 20 마이크론이다. 일 실시예에서, 상기 방법 및 배출 유닛의 단계(2)에서 사용되는 미세액적 생성 속도는 50 내지 3000 미세액적/초, 바람직하게는 100 내지 2000 범위이다.
임의의 적합한 방법을 사용하여 배출 유닛의 설계에 반영되는 뉴클레오타이드 함유 스트림으로부터 액적 스트림을 생성 할 수 있다. 일 실시예에서, 배출 유닛은 단계(3)에서 튜브(들)의 입구 내로 액적을 분배하기 위해 하나 이상의 액적 분배 노즐(들)에 부착된 챔버로 구성된다. 이러한 실시예의 설계에서, 다수의 공급 라인이 노즐(들)에 인접하게 또는 직접 부착 될 수 있다; 그 중 하나는 단계(a)로부터의 수성 뉴클레오타이드 함유 스트림을 포함하며, 다른 것은 프로브를 위한 것이며, 다양한 효소 및 다른 화학 시약이 요구된다. 노즐 헤드 내부 또는 근처에서 혼합하면 분배된 각 액적이 뉴클레오타이드 및 프로브가 작동하는 데 필요한 모든 구성 요소가 포함된다. 다른 실시예에서, 노즐(들)은 뉴클레오타이드 함유 스트림으로부터 액적 스트림을 생성하고 그 후에 첨가되는 다른 성분을 생성하는데 사용될 수있다; 예를들어, 피코인젝션(picoinjection)에 의해 또는 제어기의 작용에 의해 개방 튜브 내로 도입되기 전에 기판의 표면상에 그 위에 인쇄된 다른 성분을 함유하는 유사한 2 차 액적과 각각의 액적을 유착시킴으로써 수행 될 수 있다.
상기 방법의 단계(3)에서, 뉴클레오타이드 및 다양한 프로브 성분을 함유하는 액적 스트림은 하나 이상의 튜브에 도입되어 다른 하나의 튜브 위에 하나의 액적 스택을 생성한다. 액적의 순서가 스택에 보존되도록 하려면 튜브의 내부 지름이 액적의 지름의 두 배 미만이어야 한다. 일 실시예에서 액적의 완전성을 보존하기 위해 튜브(들)에는 실리콘 오일과 같은 소수성 용매가 미리 채운다. 다른 실시예에서, 스태킹이 일어날 때 튜브를 통한 액적의 이동을 용이하게 하기 위해 튜브(들)의 내부 표면(들)에 소수성 코팅 또는 바람직하게는 소수성 및 친수성 영역으로 이루어진 코팅이 제공된다. 하기 단계(4)에서 액적의 형광 검출을 신뢰할 수 있게 하기 위해, 액적 및 용매를 포함하는 수성 매질의 굴절률은 각각 1.3 내지 1.4 및 1.3 내지 1.7의 범위 인 것이 바람직하다. 전형적으로 용매에 대한 굴절률의 선택은 액적(들)에 함유 된 프로브 및 다른 시약의 정확한 농도에 따라 달라지는 수성 매질의 굴절률에 의해 결정될 것이다. 일 실시예에서, 튜브(들)는 속이 빈 코어 광섬유의 하나 또는 다발을 포함 할 수 있다.
적합하게는, 액적은 배출구에 음압을 가함으로써 튜브(들) 내로 끌어 당겨지게 된다. 이는 튜브의 배출구 부분에 연결된 영역 또는 챔버를 흡입(suction)하여 가장 편리하게 이루어질 수 있다. 일 실시예에서, 주어진 튜브의 액적 스택이 생성되면, 단계(4)가 일어날 때까지 음압을 제거 할 수 있다. 이는 형광 기능이 프로브의 적용과 관련된 다양한 효소 과정의 작용을 통해 전개되는 단계(3)과 단계(4) 사이에 액적이 쌓일 수 있는 기간을 갖게 한다.
바람직한 일 실시예에서, 상기 정의 된 시퀀서에서 이용되는 단계(3)의 기판 내에 배치된 개방 단부 튜브 배열이 사용된다. 이러한 튜브의 입구 및 출구는 기판의 대향하는 입구 및 출구면 상에 배치되고, 유입면은 방출 노즐 바로 아래에 배치된다. 튜브의 주축은 액적 방출 방향과 평행한 방향으로 연장된다. 일 실시예에서, 배열은 중력 및/또는 흡입(suction) 작용에 의해 튜브가 채워지도록 하는 수직면에 있다. 일 실시예에서, 기판은 내부에 배치 된 모세관 튜브의 규칙적인 배열을 갖는 금속, 반도체, 플라스틱 또는 유리와 같은 시트 또는 블록의 재료이다. 바람직한 일 실시예에서, 기판 자체는 모세관이 형성된 실리콘, 유리 또는 플라스틱 블록이고, 다른 모세관의 내부 표면은 상술 한 바와 같이 코팅된다. 적합하게는, 유리 또는 플라스틱 기판은 광흡수 정도를 갖도록 처리된다. 바람직한 일 실시예에서, 유리 기판은 1.4 내지 1.7, 바람직하게는 1.45 내지 1.65 범위의 굴절률을 갖는다.
튜브가 액적 방출 노즐(들)로 채워지도록 하기 위해, 시퀀서에는 튜브의 주축에 수직인 최소 한 방향으로 기판의 유입면에 대해 액적 방출 노즐을 스테핑하는 수단을 포함한다; 적절하게는 그것에 수직인 양 축들은 모두를 따른다. 이를 수행하는 방법은 기존의 프린터 기술을 고려하면 쉽게 알 수 있다. 일 실시예에서, 노즐들은 고정된 기판에 대해 컴퓨터 제어 전기 모터에 의해 2 차원으로 이동 가능한 조립체 상에 장착 될 수 있다; 다른 실시예에서, 기판은 이러한 조립체 상에 장착되고 프린터 노즐(들)의 위치는 고정된다. 한편 또 다른 실시예에서, 노즐과 기판 모두는 별도의 이동 가능한 조립체 상에 장착된다.
기판과 관련하여 각 튜브에 액적 스택을 생성하고 필요에 따라 각 튜브에서 액적을 방출하는 제어기가 있다. 전술한 바와 같이, 적절하게 컴퓨터로 제어되는 제어기는 음압을 생성하기위한 흡입(suction) 장치 및 필요에 따라 음압을 온 및 오프로 스위칭 하기 위한 수단을 포함 할 수 있다. 또한 바람직하게는 스택으로부터 출구를 통해 각 방울의 방출을 제어하기 위해 개폐할 수 있는 각 튜브 출구와 관련된 일련의 미세 전자 기계적 게이트를 포함한다. 일 실시예에서, 이들 게이트는 마이크로 전자 기계 밸브 또는 출구면을 가로 질러 이동 가능한 천공판을 포함한다.
일 실시예에서, 출구면 금속 입자 또는 입사 전자기 방사선의 영향 하에서 플라즈몬 공명을 수행할 수 있는 금속층 연관 될 수 있다. 이러한 수단에 의해, 각 액적 내의 형광단들(fluorophores)로부터의 형광 신호는 장치의 정확성에 대한 결과적인 향상뿐만 아니라 아래 언급된 액적 크로스토크를 감소시킴으로써 더욱 향상 될 수 있다.
방법의 단계(4)에서, 액적은 튜브(들)의 출구 단부의 적층으로부터 차례로 방출되어 방출될 때 그 안에 함유된 형광체가 검출 될 수 있게 한다. 튜브가 수직으로 정렬된 경우 배출구는 스택의 맨 아래에 있게 된다. 이들 형광단들(fluorophores)의 검출은 통상적인 수단에 의해 적합하게 수행된다; 즉, 각 액적을 형관단들(fluorophores)이 형광 되도록 유도 가능한 파장의 전자파 복사(예: 가시광선 또는 자외선)로 조명한다. 그 후, 광검출기 또는 이와 유사한 장치가 생성된 임의의 형광을 검출하는데 사용된다.
액적을 조명하는 것은 튜브의 주축에 실질적으로 평행한 향하게 함으로써 적절하게 수행되는데, 이 경우 검출된 형광 신호가 조사 중인 액적 뒤 스택의 나머지 부분에 있는 액적이 방출하는 2 차 형광 신호에 의해 복잡해지는 위험이 있다. 이 현상이 생성하는 형광 신호 크로스토크는 위에서 언급한 범위 내에서 액적, 용매 및 유리 기판의 상대 굴절률을 신중하게 선택함으로써 실질적으로 관리, 감소 또는 제거 될 수 있다; 사용된 특정 형광단들(fluorophores)의 성질 및 기판의 조직, 분극 및 기하학적 특성에 어느 정도까지 영향을 미친다. 일 실시예에서, 어두운 유리로 만들어진 기판이나 검은 코팅을 한 주변부가 있는 유리로 제조된 기판이 사용된다. 또 다른 실시예에서, 기판의 형상은 튜브에서 장거리 도파관 모드를 지원하지 않도록 선택한다; 다시 말해, 설정한 모든 모드는 스택의 최대 5 개의 인접한 액적에 걸쳐 단거리로 급속히 소멸한다. 이를 달성하기 위해 도파관이 사용 될 수 있다. 일 실시예에서, 이들 파라미터는 10 % 미만, 바람직하게는 5 % 미만의 신호 크로스 토크가 관찰되도록 최적화되는 것이 바람직하다. 또 다른 실시예에서, 검출되는 액적으로부터 발생하는 전자기 방사의 산란은, 예를 들어 튜브(들) 내 파동 유도 모드를 조정함으로써 스택 내의 액적(들)에 의한 전자기파 픽업을 억제한다.
상기 정의된 시퀀서에서, 입사 전자기 방사선의 출처는 전형적으로 LED, 레이저 또는 다른 고강도 광원으로, 보조 광학 기기(렌즈, 거울 등)을 통해 출구가 포함된 영역에 초점을 맞출 수 있다. 적합하게는, 상기 출처는 배출구들에 대한 조명을 배출구로부터 액적이 토출되는 것에 동기화시키는 수단에 연결된다. 일 실시예에서, 이는 소스를 마이크로 전자 기계 게이트의 개폐와 동기화시키기 위한 마이크로 프로세서로 구성된다.
마지막으로, 시퀀서는 동기화된 형광 신호를 검출하기 위해 적어도 하나의 광검출기 또는 이와 유사한 것으로 구성된다. 일반적으로 이 구성 요소는 모든 배출구에서 동시에 측정을 동기화하도록 설계된 일련의 광검출기로 구성된다. 광검출기(들)에 의해 생성된 신호들은 데이터 스트림으로 조립 될 수 있으며, 데이터 스트림은 마이크로프로세서 또는 독립형 PC로 전송되어 추가분석이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 방법 및 시퀀서는 이제 본 발명의 방법을 사용하는 핵산 시퀀서의 단면 개략도를 도시한다.
본 발명에 따른 방법 및 시퀀서는 이제 본 발명의 방법을 사용하는 핵산 시퀀서의 단면 개략도를 도시하는 첨부 도면을 참조하여 설명된다.
비드(1)에 부착된 DNA의 샘플은 파이로인산염(pyrophosphate) 및 소화에 필요한 다른 시약들을 함유하는 수성 매질 스트림(aqueous medium stream)(3)이 첨가되어 있는 소화 챔버(digestion chamber)(2) 내의 중합효소(polymerase)에 의해 점진적인 가파이로인산 분해(pyrophosphorolysis) 된다. 단일 뉴클레오티드3 인산염(single nucleotide triphosphates)(4)의 정렬된 스트림을 함유하는, (2) 및 (3)의 다운스트림(downstream, "하류")은 미세 유체 튜브(5)을 통해 액적-배출 노즐(7)을 포함하는 액적 배출 유닛(6)으로 전달된다. 인젝터 라인(8)은 실리콘 오일을 (6)의 상부로 공급하고, 여기서 (3)으로 구성된 액적(10)이 생성되어 인젝터 라인(9)을 지나 흐르게 되고, 여기서 본 발명자의 특허 출원 WO2016012789에 따른 프로브인, 무기 피로포스파타아제(inorganic pyrophosphatase) 및 무기 파이로 포스파타제 및 엑소뉴클레아제(exonuclease)가 피코인젝션(picoinjection)에 의해 도입된다. 1.3의 굴절률을 갖는 수성 액적들(10)은 적어도 그 일부가 (4)를 함유하고, 이들은 이후 기판(11)의 블록(block) 또는 시트(sheet) 상에 차례로 분배되는 영역으로부터 방출된다. (11)은 광흡수형 흑유리(dark glass)로 이루어지며 이는 적어도 1.5의 굴절률을 가지며 화살표로 표시된 적어도 X 방향으로 움직일 수 있는 조립체(12) 상에 장착된다. (11)에는 개방단부형 모세관 튜브(13)의 직사각형 어레이가 더 제공되며, 이들 각각에는 유입 오리피스(14) 및 배출 오리피스(15)가 제공된다. 미사용 상태에서, (11)의 유입면과 튜브(13)는 각각 코팅퇴며 굴절률 1.5의 실리콘 오일(16)로 채워진다. (13)의 직경은 액적(10)의 직경의 1.75 배이다.
(11)의 배출면의 바로 바로 아래에는 전동 모터(미도시)를 사용하여 배출 오리피스(15)를 부분적으로 개폐하도록 Y-Y'축을 따라 전후로 이동 가능한 천공된 플레이트(perforated plate)(17)가 있다. (14) 및 (15) 사이에 음압을 형성하기 위해, 튜브(19) 및 컴퓨터 제어 펌프(미도시)를 통해 원격으로 흡입(suction)이 적용될 수 있는 챔버(18) 내에서 (11)의 배출면이 밀봉된다. 이로 인해, (15) 각각이 부분적으로 (17)에 의해 폐쇄되어, 각각의 액적들(10)이 각각의 유입 오리피스(14 내지 16) 내로 분배되고, 여기서 이는 그 튜브(13) 내로 인출(drawn)되어 각 튜브가 가득 찰 때까지 적층된다(stacked). 이후 (11)은 그 시작 위치로 돌아가고 (10)의 내용물이 일정기간 동안 잠복상태로 남겨진다.
액적(10)의 내용물이 분석될 준비가 되면, (15) 각각을 개폐하도록 (17)이 ((11)에 대해 측방 이동하는 방식으로) 작동되고 이에 적층된 (10) 각각은 (13)으로부터 (17) 바로 아래에 있는 (11)의 표면상으로 차례로 방출된다. (17)의 개폐에 동기화되어, 방출된 액적들은 예컨대 튜브의 축으로부터 약간 축이 벗어난 레이저(미도시)와 같은 고강도 코히어런트 광원(a source of high intensity coherent ligh)으로 조사되며 이는 각각의 방출된 (10) 내의 활성 형광단들(active fluorophores)이 형광하도록 한다. 또한 이에 동기화되어, (15) 각각에 연관된 광검출기(photodetector)(20)에 의해 검출되는 (15)에 평행한 방향으로 임의의 형광이 재산란되어(back-scattered), 다수의 뉴클레오티드-특성 신호(nucleotide-characteristic signals)가 생성되며 이는 마이크로 프로세서(미도시)에 의한 분석을 위해 데이터 스트림으로 조합(assembled)되어 (1)의 시퀀스를 재구성할 수 있다. 동기화는 마이크로 프로세서(21)에 의해 이루어진다.

Claims (29)

  1. 각각의 액적이 형광단을 포함하는 액적 스트림 내 개별 액적들의 내용물을 식별하는 방법에 있어서,
    액적들을 하나씩 적어도 하나의 개방단부형 튜브 내로 도입하여 튜브 내에 액적 스택을 생성하는 단계 및 상기 튜브로부터 액적 스택 내의 각 액적을 차례로 방출하고 방출되는 각 액적과 관련된 형광(fluorescence)을 튜브의 주축(major axis)을 따라 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 액적은 상기 튜브의 유입단 내로 도입되어 배출단으로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 튜브는 수직방향으로 정렬되고 각 액적은 배출단을 통해 상기 액적 스택의 하단부로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적 스택 내 형광단은 초기에는 비형광 상태이고, 상기 액적이 상기 액적 스택 내에 위치되어 있는 동안 상기 형광단을 활성화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광단들은 사용자가 식별하고자 하는 분석물 분자의 특성을 가지는 것으로 선택되는 프로브 분자와 관련되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 형광 신호에 기초하여 액적을 특성화 또는 분류하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 튜브가 제1 단부로부터 유입된 액적들로 채워져 있는 동안 상기 튜브에 걸쳐 음압이 작용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 튜브의 내경은 상기 액적의 직경의 두 배 보다 작은 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적 스택 내의 액적은 비혼화성 용매 내에 현탁되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 튜브의 내부 표면은 소수성 및 친수성 코팅 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9 항에 있어서, 상기 액적의 굴절율은 1.3 내지 1.4이고 상기 용매의 굴율은 1.3 내지 1.7인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 기판 내에 평행하게 배치된 튜브들의 어레이가 사용되고, 액적의 스택이 각 튜브 내에 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, 기판은 1.4 내지 1.7 범위의 굴절률을 갖는 유리로 제조되며, 상기 유리는 선택적인 광 흡수성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 튜브에 전자기 방사선을 조사하여 각각의 액적이 토출되면서 그로부터 발생하는 형광 방사선 신호를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제9 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 액적, 상기 용매 및 유리의 굴절률은 토출 액적 및 스택 내 그 뒤에 있는 다른 액적들에 의해 생성된 형광 방사선 신호 사이에서 10 % 미만의 크로스 토크를 야기하는 안내 모드가 설정되도록 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출되는 액적으로부터의 전자기 방사선의 산란은 예를 들어 상기 튜브 내 상기 웨이브 가이드 모드를 조정함으로써 상기 액적의 뒤에 있는 액적들에 의한 전자기 방사선이 채집되는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, (1) 생체고분자를 그 구성 단량체의 정렬된 스트림으로 점진적으로 소화시키는 단계; (2) 단량체들의 스트림을 단량체 함유 수성 액적들의 상응하는 스트림으로 전환시키는 단계로서, 각각의 액적들이 추가로 (a) 단량체를 포획 할 수 있고 (b) 그 후에 포획된 단량체의 퀀칭되지 않은 형광단을 방출하도록 소화 될 수 있는 프로브를 포함하는, 단계; (3) 단계 (2)에서 생성된 액적의 스트림을 적어도 하나의 개방단부형 튜브의 유입 단부 내로 도입하여 그 내부에 액적들의 스택을 생성하는 단계 및 (4) 상기 튜브의 출구 단부로부터 차례로 각각의 액적을 방출하고 각각의 액적이 방출될 때 각각의 방울에서 형광단을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17 항에 있어서, (5) 다음에 나오는 액적에 대해 상기 단계 (4)를 반복하기 전에 상기 출구로부터 상기 액적을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 생체고분자는 핵산이고 상기 단량체는 뉴클레오타이드 인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 천연 또는 합성 유래(synthetic origin) DNA 또는 RNA임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (3)과 단계 (4) 사이에 잠복기가 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 핵산 또는 단백질과 같은 생체고분자를 시퀀싱하는 장치에 있어서,
    생체고분자가 그 구성 단량체의 대응하는 스트림으로 점진적으로 소화되는 분석물 수용 위치를 포함하는 소화 유닛;
    대응하는 액적들의 스트림으로서 단량체의 스트림을 방출하기 위한 적어도 하나의 액적 방출 노즐을 포함하는 배출 유닛;
    개방단부형 튜브들의 어레이가 관통하도록 제공된 기판으로서, 각각의 튜브는 대향하는 면들 상에 입구와 출구를 가지며 그 주축들은 액적들이 방출될 방향에 평행하게 배치되는, 기판;
    액적들이 튜브 내로 분배될 수 있도록 튜브의 주축에 수직인 적어도 하나의 방향으로 기판의 유입면에 대해 액적 분배 노즐을 스테핑하는(stepping) 수단;
    요구에 따라 배출구를 통해 스택으로부터 액적들을 방출하기 위해 튜브들 내에 액적 스택을 생성하는 제어기;
    기판의 배출면 내의 배출구들을 조명하도록 구성된 적어도 하나의 전자기 방사선 소스;
    배출구들에 대한 조명을 배출구들로부터 액적이 토출되는 것에 동기화 시키는 수단 및
    배출구들로부터 발생하는 동기화된 형광 방사선 신호를 감지하도록 구성된 적어도 하나의 광검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 액적 스택 내의 후속 액적들로부터 형광 신호가 크로스토크되는 것을 감소 또는 제거하기 위해 각각의 튜브와 관련된 도파관을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 파이로 포스파타아제(pyrophosphatase)를 도입하기 위해 소화 유닛과 배출 유닛 사이에 위치한 챔버 또는 유체 접합부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  25. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기판은 1.45 내지 1.65 범위의 굴절률을 갖는 광흡수 유리로 제조되는 것을 특징으로 하는 장치.
  26. 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 튜브는 모세관이고, 그 벽에는 소수성 및 친수성 코팅 영역이 제공되는 것을 특징으로 하는 장치.
  27. 제22 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기는 유입구와 배출구 사이에 음압을 제공하기 위한 수단 및 상기 배출구를 통해 액적 스택으로부터 각각의 액적이 방출되는 것을 제어하도록 개폐될 수 있는 미세 전자 기계적 게이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  28. 제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 튜브는 수직으로 정렬되고 상기 제어기는 상기 액적 스택의 바닥으로부터 각각의 액적을 방출하는 것을 특징으로 하는 장치.
  29. 천연 또는 합성 유래 DNA 또는 RNA를 시퀀싱하기 위한, 제 22 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도.
KR1020197004498A 2016-07-14 2017-07-14 스택 및 관련 시퀀서 내 액적들을 식별하기 위한 방법 KR20190028786A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16179518.2 2016-07-14
EP16179518.2A EP3269444A1 (en) 2016-07-14 2016-07-14 Method of identifying droplets in a stack and an associated sequencer
PCT/EP2017/067851 WO2018011398A1 (en) 2016-07-14 2017-07-14 Method of identifying droplets in a stack and an associated sequencer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190028786A true KR20190028786A (ko) 2019-03-19

Family

ID=56418398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197004498A KR20190028786A (ko) 2016-07-14 2017-07-14 스택 및 관련 시퀀서 내 액적들을 식별하기 위한 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10369569B2 (ko)
EP (3) EP3269444A1 (ko)
JP (1) JP2019524095A (ko)
KR (1) KR20190028786A (ko)
CN (1) CN109475835A (ko)
WO (1) WO2018011398A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102019219913A1 (de) * 2019-12-17 2021-06-17 Lpkf Laser & Electronics Ag Träger für Flüssigkeitstropfen

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6893877B2 (en) * 1998-01-12 2005-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Methods for screening substances in a microwell array
FR2776072B1 (fr) * 1998-03-11 2000-06-02 Centre Nat Rech Scient Perfectionnements aux dispositifs d'electrophorese multicapillaires du type a detection en sortie des capillaires
WO2002078834A2 (en) * 2001-02-16 2002-10-10 Genospectra, Inc. Bundled capillaries apparatus for high throughput screening
US20030087309A1 (en) * 2001-08-27 2003-05-08 Shiping Chen Desktop drug screening system
US9477233B2 (en) * 2004-07-02 2016-10-25 The University Of Chicago Microfluidic system with a plurality of sequential T-junctions for performing reactions in microdroplets
CA2638758A1 (en) * 2006-01-05 2007-07-12 Simons Haplomics Limited Methods for identifying a microarray probe set capable of identifying a member of a group of related nucleotide sequences
AU2008236612B2 (en) * 2007-04-04 2014-09-04 Ande Corporation Methods for rapid multiplexed amplification of target nucleic acids
WO2009022125A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-19 University Of Strathclyde Identification of nucleic acid sequences
CA3106547C (en) * 2009-09-02 2022-07-05 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions
EP2534267B1 (en) * 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
MX2014004415A (es) * 2011-10-14 2015-06-05 Stc Unm Bicapas lipidicas soportadas por nanoparticulas porosas (protecelulas) para suministro dirigido, incluido el suministro transdermico de carga, y los metodos relacionados.
CN103946690B (zh) * 2011-11-28 2017-03-15 索尼公司 化学传感器、化学传感器模块、化学物检测装置和化学物检测方法
WO2013126741A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
US9657290B2 (en) * 2012-07-03 2017-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Scalable bio-element analysis
CN102930648B (zh) 2012-07-03 2015-09-16 青岛海信智能商用系统有限公司 信息安全保护装置
GB201217772D0 (en) * 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
GB201217770D0 (en) 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Biological probes and the use thereof
KR102016068B1 (ko) * 2012-11-30 2019-08-29 엘지디스플레이 주식회사 유기 발광 표시 장치
CN105452873B (zh) * 2013-03-15 2019-01-18 加利福尼亚大学董事会 高速按需微流体珠滴生成和操控
WO2014145760A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generator with collection tube
GB201306444D0 (en) 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
GB201310584D0 (en) 2013-06-13 2013-07-31 Base4 Innovation Ltd Droplet storage method
CN106414772B (zh) * 2014-04-08 2021-02-19 华盛顿大学商业中心 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备
GB201412977D0 (en) 2014-07-22 2014-09-03 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method

Also Published As

Publication number Publication date
US10369569B2 (en) 2019-08-06
JP2019524095A (ja) 2019-09-05
CN109475835A (zh) 2019-03-15
EP3403719B1 (en) 2020-01-29
EP3269444A1 (en) 2018-01-17
EP3285919A1 (en) 2018-02-28
EP3403719A1 (en) 2018-11-21
EP3285919B1 (en) 2018-09-19
WO2018011398A1 (en) 2018-01-18
US20180264475A1 (en) 2018-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7283798B2 (ja) 単一粒子解析方法およびその解析のためのシステム
EP0846124B1 (en) Chemical, biochemical and biological processing in thin films
US8613890B2 (en) Microparticle sorting apparatus, flow cytometer using the same and microparticle sorting method
US7282370B2 (en) System and apparatus for sequential processing of analytes
CN113967488B (zh) 微流体分析设备
US10000794B2 (en) Droplet storage method
JP2021509024A (ja) 多数の液滴の捕捉
JP7066756B2 (ja) 核酸等の分子を調査するための方法
CN107076975A (zh) 用于原位遗传分析的光学扫描系统
JP6482672B2 (ja) 改良された液滴配列決定装置および方法
US20030224439A1 (en) Multiplexed systems for nucleic acid sequencing
KR20190028786A (ko) 스택 및 관련 시퀀서 내 액적들을 식별하기 위한 방법
Klinger et al. A sensor for the in-flight detection of single fluorescent microbodies in nanoliter droplets
EP3698871A1 (en) Laser based sorting of droplets in microfluidic streams
WO2019158722A1 (en) Sequencing method
Ge et al. An integrated microfluidic platform for on-demand single droplet dispenser with high accuracy by electrohydrodynamic (EHD) printing technique
WO2024015072A1 (en) Cell porating and optically detecting microfluidic devices

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application