KR20190022381A - 3종의 리포펩타이드계 화합물을 생산하고, 항진균 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 jck-12 균주 및 항진균성 합성농약을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 - Google Patents
3종의 리포펩타이드계 화합물을 생산하고, 항진균 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 jck-12 균주 및 항진균성 합성농약을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 3종의 리포펩타이드계 화합물을 생산하고, 항진균 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 및 항진균성 합성농약을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 분리한 활성물질인 이투린, 펜기신 및 서펙틴은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않기에 식물병 방제에 대한 생물농약으로 활용하여 화학농약의 사용량을 저감할 수 있고, 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 리포펩타이드계 화합물을 생산하고, 식물병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지며, 기탁번호가 KCTC12952BP인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물 또는 상기 균주로부터 분리된 리포펩타이드계 화합물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상; 및 식물병 방제용 합성농약;의 합제를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.
자낭균류인 붉은곰팡이(유성생식세대: Gibberella zeae, 무성생식세대: Fusarium graminearum)는 전세계적으로 곡류에 붉은곰팡이병(Fusarium head blight; FHB)을 일으키는 주된 원인균이다. FHB는 밀, 보리, 옥수수, 벼 등에 일정 주기를 두고 대발생하여 전 세계적으로 많은 피해를 초래하여 왔으며, 특히 지난 몇년간 미국 및 캐나다를 중심으로 대발생하여 세계 곡물 가격을 급등시키는 결과를 초래하였다. 붉은곰팡이병은 곡물의 생산량 감소를 초래할 뿐만 아니라 감염된 부위에서 인축에 유해한 트리코테신(trichothecene)과 에스트로겐성 독소 제랄레논(zearalenone; ZEA) 등과 같은 곰팡이독소를 잔류시킴으로써 농산품의 품질을 저하시키며, 이들 모두는 인간 및 가축에 유해하다. 특히 트리코테신(trichothecene)의 일종인 디옥시니발레놀(deoxynivalenol, DON)은 면역력 저하, 소화관 장애를 유발하는 등 심각한 중독증을 야기한다. 특히, 국내의 밀 재배단지에서의 붉은곰팡이(fusarium) 오염률과 트리코테신(trichothecenes) 검출치 간에 상당한 정도의 상관관계가 있는 것으로 보아 붉은곰팡이병에 의한 곰팡이 독소의 오염은 국민 건강에 상당한 위협이 되고 있다. FHB의 제1차 및 2차 접종원으로서, 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)은 자낭포자(유성 포자) 및 분생자(무성 포자)를 각각 생산한다.
화학적 방제에 의한 붉은곰팡이 독소 오염 예방은 살균제 처리 시기가 매우 중요한데, 밀의 경우 이삭으로부터 꽃밥이 처음으로 나오는 시기에 살포해야 하며, 보리의 경우 이삭이 나오는 시기에 살포해야 한다. 메트코나졸(metconazole), 프로피코나졸(propiconazole), 테부코나졸+프로티오나졸(tebuconazole+prothionazole), 테부코나졸(tebuconazole) 등의 DMI(Demethylation Inhibitor) 계열의 살균제가 가장 효과가 우수하나, 국소적 침투 이행능과 일부 약제의 경우 잔류문제 때문에 수확 전 30일 이전까지만 사용이 가능하다는 문제점으로 인하여 포장에서의 방제가는 50% 이하로 약효가 우수하지 못한 단점이 있다. 또한, 농약 중 다수를 차지하는 합성농약의 오남용으로 인해 토양, 수질 및 농산물 오염, 독성, 생태계 교란, 저항성 균주들의 출현 등 여러 가지 문제점이 제기되고 있다. 이에 최근에는 OECD 국가를 중심으로 합성농약의 사용량을 40% 이상 절감하고자 하고 있으며, 또한 웰빙에 대한 관심 증가와 함께 선진국을 중심으로 유기농산물에 대한 수요가 급증하고 있는 상황이다.
한편, 한국등록특허 제0825652호에는 '신규 바실러스 서브틸리스 DBB 1501 균주 및 이를 이용한 식물병의 방제방법'에 대해 개시하고 있고, 한국등록특허 제0380625호에는 '식물병원균 방제에 유용한 무독성 살균제 조성물'에 대해 개시하고 있고, 한국등록특허 제1291915호에서는 '식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ＧＹＬ４ 및 이를 이용한 항생물질의 제조방법'에 대해 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '3종의 리포펩타이드계 화합물을 생산하고, 항진균 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 및 항진균성 합성농약을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 푸사리움 속(Fusarium sp.)을 포함한 다양한 식물 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 점을 확인하였고(표 1 및 도 1), 상기 균주 배양 상층액의 부탄올 추출물에서 리포펩타이드계 활성물질인 이투린 외 펜기신과 서펙틴을 동정하였으며(도 4 및 도 5), 이들 3종의 리포펩타이트계 화합물간의 시너지 효과에 의하여 붉은곰팡이 포자발아 억제 정도가 증가되었고(도 9), 각종 화학 농약과의 합제 처리시 시너지 효과가 있음을 확인하였다(도 11). 뿐만 아니라, 상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양 상층액의 부탄올 추출물과 각종 화학 농약을 합제 처리하여 다양한 식물병 원인균에 처리하였을 때, 상용농도의 합성농약 단제 처리보다 상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양 상층액의 부탄올 추출물과 상용농도보다 낮은 농도의 합성농약 합체 처리시 다양한 식물병 원인균의 균사생장을 억제하는 효과가 더 우수한 것을 확인하였다(표 11 내지 22 및 도 16 내지 24).
또한, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양체로 제제화한 수화제를 합성 농약과 합제하여 붉은곰팡이병 및 잔디 동전마름병을 방제하고자 하였을 때 합성농약의 상용농도가 반 이상으로 줄어들더라도 높은 병 방제율을 보임을 확인하였으며(표 5 및 도 14; 도 25 및 26), 온실실험뿐만 아니라 포장 조건에서도 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 제제와 화학농약과의 합제처리에 의한 곡류 붉은곰팡이병의 뛰어난 방제효과를 확인하였다(표 6).
따라서, 상기와 같은 항진균 활성이 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 생산하는 3종의 리포펩타이드계 화합물간의 시너지 효과에 의한 항균물질의 병원성 곰팡이 내로의 투과율을 높이는 리포펩타이드계 화합물의 작용기작에 의함을 밝혀냈고, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 생산하는 리포펩타이드계 화합물 처리에 의해 붉은곰팡이가 생산하는 곰팡이 독소를 저감할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 리포펩타이드계 화합물 및 합성농약의 합제를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 이투린 A(iturin A);와 펜기신(fengycin) 및 서펙틴(surfactin) 중 하나 이상의 화합물;의 합제를 유효성분으로 함유하는 붉은곰팡이병 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 리포펩타이드계 화합물을 생산하고, 식물병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지며, 기탁번호가 KCTC12952BP인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상; 및 항진균성 합성농약;의 합제를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 합성농약의 저항성 발생을 저해하거나 또는 감도를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 생산하는 리포펩타이드계 활성물질의 구조를 동정하고 이들 리포펩타이드계 화합물간의 시너지 효과 및 이의 작용기작을 곡류에 붉은곰팡이병을 일으키는 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum )을 이용하여 밝히고 그로 인한 진균 독소 오염량 저감 효과를 제시하고 있다. 더욱이 3종의 리포펩타드 화합물을 동시에 생산하는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주 배양액 및 이를 이용한 제제는 화학 농약의 합제 처리시 상용농도보다 낮은 농도의 화학 농약 처리시에도 상기 붉은곰팡이병 이외에도 다양한 식물병에 대해 높은 방제 활성을 보였다.
따라서, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주로부터 분리한 활성물질인 이투린, 펜기신 및 서펙틴은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않기에 식물병 방제에 대한 생물농약으로 활용하여 화학농약의 사용량을 저감할 수 있고, 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 제공될 수 있다.
도 1은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주 처리에 따른 식물 병원균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)(A), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케(Raffaelea quercus-mongolicae)(B), 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici)(C), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)(D), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)(E), 그리고 푸사리움 속 식물병원균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)(F), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)(G), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)(H) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)(I), 이외의 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)(J)의 균사 생장 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 분리된 사이클로리포펩타이드(cyclolipopetide, CLP) CLP-1 물질과 시그마-알드리치로부터 구입한 펜기신(fengycin) 표준물질과의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 분리된 사이클로리포펩타이드(cyclolipopetide, CLP) CLP-2 물질과 시그마-알드리치로부터 구입한 서펙틴(surfactin) 표준물질과의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 생산되는 사이클로리포펩타이드(cyclolipopetide, CLP) CLP-1에 대한 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 생산되는 사이클로리포펩타이드(cyclolipopetide, CLP) CLP-2에 대한 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액(JCK-12)의 곡류 붉은곰팡이 균사 생육억제 활성을 dual-culture 분석법(A)으로, 부탄올 추출물(CLPs)의 곡류 붉은곰팡이 균사 생육억제 활성을 dual-culture 분석법(B)과 pour plating 방법(C)으로 측정한 것이다.
도 7은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물(CLPs)의 처리시 처리 농도에 따른 붉은곰팡이 곰팡이독소 트라이코테신의 생성량 분석결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물(CLPs)의 붉은곰팡이에 처리시 처리 농도에 따른 붉은곰팡이 내의 독소 생성 유전자(TRI5 및 TRI6)의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 생산하는 이투린, 펜기신, 서펙틴을 포함한 3종의 CLPs의 총 함량(A)과 이투린의 함량(B)에 따른 다양한 처리조건에서의 붉은곰팡이(Fusarium graminearum) 포자발아 억제활성을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물의 붉은곰팡이 처리시 처리 농도에 따른 붉은곰팡이의 균사 형태와 핵상에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물과 합성농약성분의 혼합 처리에 의한 붉은곰팡이 균사 생장 저해 시너지 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물의 붉은곰팡이 세포내 물질 투과력에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12의 배양액 처리시 처리농도에 따른 온실 조건에서의 다양한 식물병원성 곰팡이병의 방제효과를 나타낸 것이다. TGM는 잿빛곰팡이병, RCB는 벼도열병, BPM는 보리흰가루병, RSB는 벼잎집무늬마름병, WLR는 밀붉은녹병에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12의 배양액의 방제효과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제의 붉은곰팡이를 이용한 밀 감염시 병 전파에 대한 JCK-12 분말수화제 단제와 화학 농약 합제(알무리, Almuri)의 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 포장 조건에서 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)을 접종한 밀에서의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제 처리에 따른 수확량을 확인한 것이다.
도 16은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) RBS 0119에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 발리다마이신(validamycin)의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 블라스티시딘-S(blasticidin-S)의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸(tebuconazole)의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 19는 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 40153에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 20은 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 40154에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 21은 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대한 본 발명의 플루디옥소닐(fludioxonil)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 22는 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 디티아논(dithianon)의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG1-1B 40111에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata)에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12의 분말수화제 및 화학농약 합제 처리에 따른 잔디 동전마름병에 대한 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12의 분말수화제 및 화학농약 합제 처리에 따른 잔디 동전마름병에 대한 방제 효과를 나타낸 포트 사진이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 분리된 사이클로리포펩타이드(cyclolipopetide, CLP) CLP-1 물질과 시그마-알드리치로부터 구입한 펜기신(fengycin) 표준물질과의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 분리된 사이클로리포펩타이드(cyclolipopetide, CLP) CLP-2 물질과 시그마-알드리치로부터 구입한 서펙틴(surfactin) 표준물질과의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 생산되는 사이클로리포펩타이드(cyclolipopetide, CLP) CLP-1에 대한 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주로부터 생산되는 사이클로리포펩타이드(cyclolipopetide, CLP) CLP-2에 대한 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액(JCK-12)의 곡류 붉은곰팡이 균사 생육억제 활성을 dual-culture 분석법(A)으로, 부탄올 추출물(CLPs)의 곡류 붉은곰팡이 균사 생육억제 활성을 dual-culture 분석법(B)과 pour plating 방법(C)으로 측정한 것이다.
도 7은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물(CLPs)의 처리시 처리 농도에 따른 붉은곰팡이 곰팡이독소 트라이코테신의 생성량 분석결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물(CLPs)의 붉은곰팡이에 처리시 처리 농도에 따른 붉은곰팡이 내의 독소 생성 유전자(TRI5 및 TRI6)의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 생산하는 이투린, 펜기신, 서펙틴을 포함한 3종의 CLPs의 총 함량(A)과 이투린의 함량(B)에 따른 다양한 처리조건에서의 붉은곰팡이(Fusarium graminearum) 포자발아 억제활성을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물의 붉은곰팡이 처리시 처리 농도에 따른 붉은곰팡이의 균사 형태와 핵상에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물과 합성농약성분의 혼합 처리에 의한 붉은곰팡이 균사 생장 저해 시너지 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물의 붉은곰팡이 세포내 물질 투과력에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12의 배양액 처리시 처리농도에 따른 온실 조건에서의 다양한 식물병원성 곰팡이병의 방제효과를 나타낸 것이다. TGM는 잿빛곰팡이병, RCB는 벼도열병, BPM는 보리흰가루병, RSB는 벼잎집무늬마름병, WLR는 밀붉은녹병에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12의 배양액의 방제효과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제의 붉은곰팡이를 이용한 밀 감염시 병 전파에 대한 JCK-12 분말수화제 단제와 화학 농약 합제(알무리, Almuri)의 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 포장 조건에서 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)을 접종한 밀에서의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제 처리에 따른 수확량을 확인한 것이다.
도 16은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) RBS 0119에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 발리다마이신(validamycin)의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 블라스티시딘-S(blasticidin-S)의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸(tebuconazole)의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 19는 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 40153에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 20은 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 40154에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 21은 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대한 본 발명의 플루디옥소닐(fludioxonil)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 22는 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)에 대한 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 디티아논(dithianon)의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG1-1B 40111에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata)에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물과 테부코나졸의 감작 효과를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12의 분말수화제 및 화학농약 합제 처리에 따른 잔디 동전마름병에 대한 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12의 분말수화제 및 화학농약 합제 처리에 따른 잔디 동전마름병에 대한 방제 효과를 나타낸 포트 사진이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포펩타이드계 화합물 및 합성농약의 합제를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물병 방제용 조성물에서, 상기 리포펩타이드계 화합물은 기탁번호가 KCTC12952BP인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주 추출물 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물병 방제용 조성물에서, 상기 리포펩타이드계 화합물은 이투린 A(iturin A), 하기 화학식 1로 표시된 펜기신(fengycin) 및 하기 화학식 2로 표시된 서펙틴(surfactin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 한국생명공학연구원에 2015년 11월 25일자로 기탁된(기탁번호: KCTC12952BP) 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주를 배양하여 이투린 이외의 리포펩타이드계 활성성분인 펜기신 및 서펙틴을 동정하고, 이투린을 포함한 펜기신 및 서펙틴의 리포펩타이계 활성 성분(CLPs)의 항진균 활성에 작용하는 기능을 규명하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12의 제제의 확장된 식물병 방제 적용 범위를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물병 방제용 조성물에서, 상기 합성농약은 이프로디온(iprodione), 플루디옥소닐(fludioxonil), 베노밀(benomyl), 디페노코나졸(difenoconazole), 테부코나졸(tebuconazole), 발리다마이신(validamycin), 블라스티시딘-S(blasticidin-S) 및 디티아논(dithianon)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주의 뛰어난 항진균 활성과 더불어 이프로디온, 플루디옥소닐, 베노밀, 디페노코나졸, 테부코나졸, 발리다마이신(validamycin), 블라스티시딘-S(blasticidin-S) 및 디티아논(dithianon) 계통의 합성농약과 합제 처리에 의한 뛰어난 시너지 효과에 의한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주의 항진균 활성을 제공한다.
따라서, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주는 식물병 방제에 사용하는 생물농약으로 화학농약과의 합제처리를 통한 식물병 방제활성의 상승작용으로 화학농약의 사용량을 획기적으로 저감할 수 있고 식물병을 일으키는 곰팡이에 오염된 곡물의 곰팡이독소의 오염을 줄일 수 있으며, 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 이용할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 식물병은 상기 진균들로부터 유발된 식물병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 식물병은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp. niveum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케(Raffaelea quercus-mongolicae), 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae), 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita), 블루메리아 그라미니스 에프. 에스피. 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 콜레토트리쿰 호라이(Colletotrichum horii), 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 및 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata) 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병원성 진균에 의해 발병하는 식물병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 식물병은 곡류 붉은곰팡이병 원인균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 수박 덩굴쪼김병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp. niveum), 토마토 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 옥수수 이삭썩음병 원인균인 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides) 이외에 벼 잎집무늬마름병 또는 잔디 갈색잎마름병의 원인균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 참나무 시들음병의 원인균인 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케(Raffaelea quercus-mongolicae), 고추 역병의 원인균인 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici), 고추 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 토마토 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 벼 도열병의 원인균인 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae), 밀 붉은녹병의 원인균인 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita), 보리 흰가루병의 원인균인 블루메리아 그라미니스 에프. 에스피. 호르데이(Blumeria grammis f. sp. hordei), 토마토 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 잔디 동전마름병의 원인균인 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 감나무 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 호라이(Colletotrichum horii), 잔디 춘고병의 원인균인 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis), 잔디 엽고병의 원인균인 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata)가 일으키는 식물병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물병 방제용 조성물은 상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주뿐만 아니라 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물과 식물병 방제용 합성농약을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 방제용 조성물은 액상 살균제 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 즉 화학 살균제 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물 살균제로 제형화가 가능하다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 추출물은 부탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물병 방제용 조성물에서, 상기 식물병 방제용 조성물은 분말수화제, 액상수화제, 액제 또는 입제의 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 관수용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 작물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.
상기 식물병을 방제하는 방법으로는 상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주를 배양한 배양액 또는 상기 균주와 항진균성 합성농약을 이용한 방제용 조성물을 종자나 식물에 침지하거나 관주, 또는 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 또는 방제용 조성물을 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 또는 방제용 조성물에 담가둘 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물을 이용하여 식물병을 방제하는 방법에서, 붉은곰팡이 생장을 저해하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주의 항균 활성물질과 식물병 방제용 합성농약 합제 처리에 따른 시너지 효과를 이용하여 합성농약의 사용량 저감하는 방법을 제공한다. 본 발명의 식물병 방제용 조성물과 합제 처리로 인한 시너지 효과를 이용하여 사용량을 저감하는 상기 항진균성 물질은 합성농약성분으로 이프로디온, 플루디옥소닐, 베노밀, 디페노코나졸, 테부코나졸, 발리다마이신(validamycin), 블라스티시딘-S(blasticidin-S) 및 디티아논(dithianon) 계통인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물에서 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주 JCK-12 균주의 항균 활성물질인 이투린, 펜기신과 서펙틴의 리포펩타이드계 화합물의 시너지 효과를 이용하여 곡류 붉은곰팡이병을 포함한 상기 식물병 방제에 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물을 이용하여 식물병원성 곰팡이가 곡류에 오염시키는 곰팡이독소의 생산을 저감하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주의 배양 방법 및 식물병 방제용 조성물의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 이투린 A(iturin A);와 펜기신(fengycin) 및 서펙틴(surfactin) 중 하나 이상의 화합물;의 합제를 유효성분으로 함유하는 붉은곰팡이병 방제용 조성물을 제공한다. 상기 이투린 A(iturin A), 펜기신(fengycin) 및 서펙틴(surfactin)은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이투린 A(iturin A);와 펜기신(fengycin) 및 서펙틴(surfactin) 중 하나 이상의 화합물;의 합제의 처리는 붉은곰팡이병 방제에 있어서 시너지 효과를 보였다 (실시예 5 참고).
또한, 본 발명은 리포펩타이드계 화합물을 생산하고, 식물병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지며, 기탁번호가 KCTC12952BP인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상; 및 항진균성 합성농약;의 합제를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 식물병은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp. niveum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케(Raffaelea quercus-mongolicae), 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 보트리티스 시네리아( Botrytis cinerea), 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae), 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita), 블루메리아 그라미니스 에프. 에스피. 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 콜레토트리쿰 호라이(Colletotrichum horii), 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 및 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata) 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병원성 진균에 의해 발병하는 식물병일 수 있으며, 바람직하게는 붉은곰팡이병 또는 잔디 동전마름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 붉은곰팡이병 원인균은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)일 수 있으며, 상기 잔디 동전마름병 원인균은 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 합성농약의 저항성 발생을 저해하거나 또는 감도를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주는 식물병 방제 합성농약과의 합제처리를 통한 식물병 방제활성의 상승작용으로 식물병 방제 화학농약의 사용량을 획기적으로 저감하여 식물병 방제 합성농약의 저항성 발생을 저해하거나 또는 감도를 증가시킬 수 있으므로, 식물병 방제 합성농약만의 사용에 따른 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 이용할 수 있는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 균주 처리에 따른 식물 병원균의 균사 생장 저해 활성 측정
본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 식물 병원균의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해, 4종의 푸사리움 속(Fusarium sp.) 식물 병원균과 6종의 식물병원균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케(Raffaelea quercus-mongolicae), 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)를 대상으로 생장 저해 활성을 측정하였다.
구체적으로, 왕성하게 자라고 있는 배양체로부터 얻은 하기 표 1에 기재된 10종의 식물 병원균 중 파이토프토라 캡시시를 제외한 9종의 식물병원균 균사 조각을 PDA 배지 한쪽에 접종하였다. 파이토프토라 캡시시는 생장 저해 활성을 측정하기 위해 V8 아가 배지를 사용하여 균사 조각을 배지 한쪽에 접종하였다. 이후, 상기 접종 부위로부터 약 3.5 cm 정도 떨어진 부위에 배양한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주를 접종한 다음 25℃에서 식물병원균의 생장속도에 따라 3일에서 13일간 배양하였다. 배양 후 JCK-12 균주를 처리하지 않은 음성대조구의 곰팡이가 3.5 cm 정도까지 자랐을 때 JCK-12 균주를 처리한 식물 병원균의 균사 생장저해 정도를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 1 및 도 1에 개시한 바와 같이, 본 발명의 JCK-12 균주는 푸사리움(Fusarium) 속 식물 병원균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp. niveum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)와 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케(Raffaelea quercus-mongolicae), 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)인 10종의 식물 병원균의 생장을 강하게 저해하는 것으로 나타났다.
| 식물병 이름 | 병원균 학명 | 저지대의 길이(mm) |
| 곡류 붉은곰팡이병 | 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum) |
12.3 |
| 토마토 시들음병 | 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시 (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) |
13.7 |
| 수박 덩굴쪼김병 | 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp. niveum) | 14.1 |
| 옥수수 이삭썩음병 | 푸사리움 베르티실리오이데스 (Fusarium verticillioides) |
14.3 |
| 벼 잎집무늬마름병 | 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) |
13.7 |
| 참나무 시들음병 | 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae) |
14.7 |
| 고추 역병 | 파이토프토라 캡시시 (Phytophthora capsici) |
9.0 |
| 고추 탄저병 | 콜레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes) |
18.7 |
| 토마토 잿빛곰팡이병 | 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea) |
24.0 |
| 벼 도열병 | 마그나포르테 오리재 ( Magnaporthe oryzae ) |
25.3 |
실시예
2. 항균활성 물질의 분리 및 동정
본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 생산하는 항균활성 물질을 분리하기 위해, 상기 균주를 TSB 액체배지에 접종한 다음, 30℃에서 3일간 150 rpm으로 진탕배양하였다. 상기 배양액을 8,000×g에서 20분간 원심분리하여 배양 상층액(3 L)을 획득한 다음, 이를 동량의 부탄올로 2회씩 분획하였다. 얻어진 부탄올층을 감압농축하여 10 g의 부탄올 추출물을 얻었다. 상기 부탄올 추출물을 실리카겔 컬럼에 가한 다음 클로로포름:메탄올:물:아세트산(14:6:1:0.021) 용매로 용출하였다. 이 중 상기 실시예 2에서 기술한 방법으로 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대한 포자 발아 억제 활성을 분석하고 억제 활성을 나타내는 분획(F2)을 모아 감압농축하여 2.72 g의 용출물을 수득하였다. 활성 리포펩타이드(CLP)를 정제하기 위하여 활성분획 F2를 6 mol/㎖의 염산으로 산도 2로 적정하여 침전시켰다. 침전물은 20분간 7,000 rev/min의 속도로 원심분리하여 수확되었으며 메탄올로 두 번 용출하였다. 용출된 F2 분획은 CPL 물질로 더욱 순화하기 위하여 ODS 컬럼에 가하였으며 메탄올 함량을 증가시키면서 최종적으로 100% 메탄올로 용출하였다. 획득한 각 분획을 10 mg/㎖ 수준으로 메탄올로 용해하여 96-웰 플레이트에서 푸사리움 그라미네아룸 포자현탁액(104 포자/㎖)에 1%씩 분주한 후 25℃에서 24시간 배양하면서 포자 발아 억제 활성을 확인하였으며, 무처리구의 경우 메탄올을 처리하였다. 상기 활성이 확인된 활성분획을 세파덱스(Sephadex) LH-20 컬럼에 가한 다음 100% 메탄올로 용출하였다. 활성분획만을 모아서 감압농축하여 최종적으로 분취 TLC를 사용하여 활성분획을 분리하였다. 시료를 메탄올로 용해한 다음 분취 TLC(Kiesel gel 60GF 254, 0.5 mm film thickness, E. Merck)에 가하여 클로로포름:메탄올:물:아세트산(14:6:1:0.021, v/v)을 이용하여 전개한 후 활성이 있는 부위의 TLC의 실리카겔을 긁은 다음 메탄올로 용출하였다. 이와 같은 과정을 통하여 TLC에서 단일 스폿(spot)을 보이는 물질 이투린 A (25.2mg)을 분리하였다.
또한, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 생산하는 다른 CPLs를 확인하기 위하여 배양액의 부탄올 추출물을 분취 TLC (Kiesel gel 60GF 254, 0.5 mm film thickness, E. Merck)에 가하여 클로로포름:메탄올:물:아세트산(14:6:1:0.021, v/v)을 이용하여 전개한 후 물을 살포하여 TLC 상에서 CLPs로 추정되는 두 개의 흰색 스폿 부위의 실리카겔을 긁은 다음 메탄올로 용출하였고 이를 CLP-1과 CLP-2라 명명하였다.
CPLs의 구조동정을 위하여 시그마-알드리치로부터 표준물질로 이투린(iturin), 펜기신(Fengycin), 서펙틴(surfactin)을 구입하여 사용하였다. 표준물질과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주의 배양액으로부터 분리한 CLP-1과 CLP-2의 HPLC의 retention time과 UV 스펙트럼을 비교해 본 결과 도 2와 도 3에 개시한 바와 같이 표준물질로 구입한 펜기신(Fengycin), 서펙틴(surfactin)과 동일하였다. 또한 CLP-1의 [M+H]+ 이온 피크가 약 1,477.8 및 CLP-2의 [M+Na]+이온 피크가 1,058.7에서 나타났으며, ESI-MS 분석 결과 도 4와 도 5에서 개시한 바와 같이 CLP-1은 펜기신(Fengycin), CLP-2는 서펙틴(surfactin)으로 동정되었다.
실시예
3.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 균주 배양액과 부탄올 추출물의
붉은곰팡이
균사 억제 활성
본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주의 실시예 2에서 획득한 배양액과 부탄올 추출물(CLPs)의 붉은곰팡이 균사의 억제활성을 듀얼-컬쳐(dual-culture) 분석과 포어 플레이팅(pour plating) 방법으로 측정하였다. 듀얼-컬쳐 분석을 위하여 CM(complete medium)이 담긴 50 mm 직경의 페트리디쉬 한쪽 편에 활발히 자라는 5 mm 직경의 붉은곰팡이 균사조각을 배양하였다. 배양 24시간 후 살균한 페이퍼 디스크에 LB(Luria-Bertani) 배지에서 키운 JCK-12 배양액(1×107 cfu/㎖) 혹은 JCK-12 배양액의 부탄올 추출물(CLPs, 60 ㎍/㎖)을 각각 처리하여 붉은곰팡이 균사조각이 위치한 반대편에 치상한 후 25℃에서 4일간 배양하였다. 포어 플레이팅 방법으로 붉은곰팡이 균사의 억제활성을 보기 위하여 JCK-12 배양액의 부탄올 추출물을 CM 아가 배지에 60 ㎍/㎖의 농도로 첨가해 배지를 굳힌 후 그 중앙에 활발히 자라는 5 mm 직경의 붉은곰팡이 균사조각을 배양하였다. 실험결과, 도 6에서 개시한 바와 같이 JCK-12 균주의 배양액과 부탄올 추출물(CLPs)이 붉은곰팡이 균사의 억제활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 균주 부탄올 추출물 처리에 따른
푸사리움
그라미네아룸의
독소 생산
저감
효과 및 독소 생합성 유전자 발현 정도 분석
바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물 처리에 따른 붉은곰팡이 독소생성 저해 효과를 확인하기 위하여 일반적으로 붉은곰팡이에서 곰팡이 독소인 트라이코테신 (DON, 15-acetyl-DON) 독소 생성능을 확인하는데 사용되는 MMA (5 mM 아그마틴이 포함된 최소배지) 배지를 사용하였다. JCK-12 추출물을 0, 15, 30 ㎍/㎖의 농도로 처리한 MMA 배지에서 붉은곰팡이를 7일 배양한 후 배양 여액을 에틸아세테이드-메탄올 용액으로 추출하였다. 탈수된 추출물을 트리메틸실릴화 시약 (BSA + TMCS + TMSI, 3:2:3, Supelco, Bellefonte, PA, U.S.A.)으로 유도체화한 후 가스크로마토그래피 질량분석기(GC-MS)로 분석하였다. 총 트라이코테신 생성량은 각 균주의 바이오매스에 기초하여 정량화되었다. 도 7에서 개시한 바와 같이 JCK-12 추출물을 처리할 경우 트라이코테신의 생성량은 JCK-12 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비하여 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 리포펩타이드계 화합물이 포함된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 붉은곰팡이 생성 곰팡이독소 생산 저감 효과를 확인할 수 있었다.
바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물 처리에 따른 붉은곰팡이 트라이코테신 생합성 유전자인 TRI5 및 TRI6의 발현량 변화를 관찰하기 위하여 JCK-12 추출물을 0, 15, 30 ㎍/㎖의 농도로 처리한 MMA 배지에서 붉은곰팡이를 4일 간 배양한 후 균사에서 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로부터 cDNA를 제작한 뒤 TRI5와 TRI6 유전자의 발현량을 qRT-PCR를 수행하여 확인하였다. 실험 결과, 도 8에서 개시한 바와 같이 JCK-12 처리에 의해 붉은곰팡이 트라이코테신 생합성 유전자의 발현량이 무처리군인 대조군에 비하여 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
5.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 균주가 생산하는
이투린
,
펜기신
,
서펙틴의
혼합비율에 의한
붉은곰팡이
포자 억제 활성 비교
바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주가 생산하는 이투린, 펜기신, 서펙틴의 혼합비율에 따른 붉은곰팡이 포자의 억제 활성을 비교하기 위하여 시그마-알드리치로부터 표준물질로 이투린(iturin), 펜기신(Fengycin), 서펙틴(surfactin)을 구입하여 사용하였다. 푸사리움 그라미네아룸 포자는 PDA 배지에서 배양된 푸사리움 그라미네아룸을 잘라 멸균된 CMC(Carboxymethylcellulose) 액체배지에 넣고 25℃에서 200 rpm 수준으로 5일간 진탕배양하여 얻었으며, PDB 배지로 희석하여 104 포자/㎖으로 포자의 농도를 맞추고, 96-웰 플레이트의 각 웰에 180㎕의 포자 현탁액(104 포자/㎖)을 가한 다음 여기에 20㎕의 시료를 분주하였다. 이투린(iturin)과 펜기신(Fengycin)은 에탄올과 메탄올에 각각 1 mg/㎖의 농도로 용해하였고, 서펙틴(surfactin)은 10 mg/㎖의 농도로 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해하여 사용하였다. 3종의 CLPs인 이투린 에이, 펜기신, 서펙틴의 혼합물(iturin A:fengycin:surfactin = I:F:S, w/w/w)의 혼합은 I+F+S (1:1:1), I+F (1:1), I+S (1:1), F+S (1:1)의 비율로 준비하였다. 각 혼합물의 처리 농도는 5-60 ㎍/㎖였으며, 양성 대조군으로는 캡탄(captan)을 0.63, 0.31, 0.16 및 0.08 ㎍/㎖(용매: 메탄올) 수준으로 처리하였고, 음성 대조군으로는 1%(v/v) DMSO를 처리하였다. 25℃에서 24시간 후에 포자 발아 정도를 측정하였다.
실험결과, 도 9 (A)에서 개시한 바와 같이 이투린 에이, 펜기신, 서펙틴의 단일 CLP와 I+F+S (1:1:1), I+F (1:1), I+S (1:1), F+S (1:1) 혼합물의 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대하여 30 ㎍/㎖ 농도에서 각각 88.7%, 0.0%, 0.0%, 58.3%, 78.3%, 64.7%, 0.0%의 포자 발아 억제 활성을 보였다. 이투린 에이가 제외된 펜기신과 서펙틴 단제와 합제의 처리구는 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대한 포자 발아 억제 활성을 전혀 가지지 못하였다. 하지만 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대한 포자 발아 억제 활성을 전혀 가지지 못하는 펜기신과 서펙틴이 활성을 가지는 이투린 에이와 혼합물로 처리시 동일량의 이투린 에이를 처리시에 비하여 높은 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대한 포자 발아 억제 활성을 보였다. 또한 도 9의 (B)에서 개시한 바와 같이 이투린 에이의 농도가 15 ㎍/㎖인 경우, 단독 처리시에 51.7%의 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대한 포자 발아 억제 활성을 보였으나 I+F와 I+S 혼합물 처리시에는 각각 78.3%, 64.7%의 높은 포자 발아 억제 활성을 보였다. 이투린 에이의 농도가 10 ㎍/㎖인 경우도 단독 처리시에 32.0%의 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대한 포자 발아 억제 활성을 보였으나 F+I+S 혼합물 처리시에는 58.3%의 높은 포자 발아 억제 활성을 보였다. 이와 같이 붉은곰팡이 포자의 억제 활성에 대한 3종의 CLPs 간의 혼합에 의한 시너지 효과를 비교 결과를 통해, 이투린 에이의 항진균 활성이 펜기신, 서펙틴의 시너지 효과로 인하여 낮은 농도의 이투린 에이 처리시에도 높은 방제효과를 보임에 따라 3종의 CLPs를 생산하는 본 발명의 JCK-12 제제가 밀 붉은곰팡이병 방제에서 다른 화학농약과의 합제에 따른 시너지 효과를 이용하여 친환경적인 방제제로서 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예
6.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 균주 부탄올 추출물 처리에 대한
푸사리움
그라미네아룸의
균사 형태에 미치는 영향
붉은곰팡이 균사의 생육을 저해하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 추출물이 붉은곰팡이 균사 생육시 균사의 형태와 균사 세포의 핵상에 미치는 영향을 알아보기 위하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 0, 30, 60 ㎍/㎖의 농도로 처리한 액체 CM 배지에 붉은곰팡이의 히스톤 단백질을 녹색형광단백질(GFP)로 표지한 GFP 표지 붉은곰팡이를 접종한 뒤 25℃ 진탕배양기에서 200 rpm으로 24시간 배양하였다. 배양 후 붉은곰팡이 균사의 형태 및 세포안의 핵에서 발현되는 GFP 표지 히스톤 단백질의 분포를 DIC(differential interference contrast) 현미경인 DE/Axio Imager A1 현미경(Carl Zeiss)과 38H (excitation 470/40; emission 525/50) 필터를 사용하여 관찰하였다. 실험결과 도 10에서 개시된 바와 같이 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 30 ㎍/㎖의 농도로 처리시 붉은곰팡이 균사가 풍선모양으로 부푸는 현상을 관찰할 수 있었으며, 60 ㎍/㎖의 농도로 처리시 붉은곰팡이 균사의 생육이 크게 지연되었을 뿐만 아니라 더 많은 수의 균사 부품현상을 관찰할 수 있었다. 또한 이처럼 부품현상을 보이는 균사에서는 GFP로 표지된 히스톤 단백질이 한 세포안에 여러개 모여 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 곰팡이 세포벽이나 세포막의 손상에 의한 영향으로 볼 수 있으며, 이러한 손상은 3종의 리포펩타이드계 화합물이 포함된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물 처리에 기인한 것으로 볼 수 있다.
실시예
7.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 균주 추출물과
화학농약
활성성분 혼합처리에 따른
푸사리움
그라미네아룸의
생육 저해 시너지 효과
바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 추출물과 다른 항진균성 물질과의 혼합처리에 따른 붉은곰팡이 생육 저해 시너지 효과를 확인하기 위하여 항진균성 물질인 이프로디온(iprodione, 8.6 ㎍/㎖), 플루디옥소닐(fludioxonil, 0.023 ㎍/㎖), 베노밀(benomyl, 0.65 ㎍/㎖), 디페노코나졸(difenoconazole, 0.025 ㎍/㎖), 그리고 테부코나졸(tebuconazole, 0.0125 ㎍/㎖)를 사용하였으며 곰팡이 생장에 스트레스를 주는 화학적 스트레스 요인으로 세포벽 구성에 영향을 주는 콩고 레드(congo red, 60 ㎍/㎖), 칼코플로어 화이트(calcoflour white, 0.3 mg/㎖)를 사용하였다. 이 항진균성 물질들과 세포벽 구성저해 요인을 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 부탄올 추출물을 함께 처리한 배지에 붉은곰팡이를 배양하여 생육 저해 효과를 음성 대조군과 비교하여 관찰하였다. 실험 결과, 도 11에서 개시한 바와 같이 JCK-12 추출물과 다른 항진균성 물질을 혼합처리하였을 경우 단독 처리한 것에 비하여 붉은곰팡이의 생육을 더 크게 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 리포펩타이드계 화합물이 포함된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물이 각 조건에서 처리된 항진균물질과 화학적 세포벽 구성 저해요인들과 상승작용을 일으켜 붉은곰팡이의 처리 물질에 대한 감수성을 극대화하였음을 확인할 수 있었다.
실시예
8.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 균주 추출물의
푸사리움
그라미네아룸
곰팡이
세포내
물질
투과력에
미치는 영향 검정
붉은곰팡이 세포막 투과성에 대한 JCK-12 추출물의 효과를 검정하기 위하여 PI(propidium iodide) 염색을 수행하였다. PI는 건강한 세포의 세포막은 투과할 수 없으나 세포막이 손상된 세포 내로 들어갈 수 있는 형광 물질로 PI 염색을 통하여 세포막 투과성의 변화를 관찰할 수 있다. 붉은곰팡이 균사에 30 ㎍/㎖의 농도로 JCK-12 추출물을 처리한 후 균사를 수확하여 2 μM 의 농도로 20분간 PI를 처리한 후 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 실험 결과 도 12에서 개시된 바와 같이 JCK-12 추출물을 처리한 균사의 적색형광이 무처리 대조군에 비하여 강하게 관찰되는 것을 알 수 있었고, 이러한 결과는 리포펩타이드계 화합물을 함유한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물 처리가 붉은곰팡이의 세포막에 영향을 주어 세포내로의 물질 투과성을 증가시켰음을 제시한다.
실시예
9. 온실 조건에서
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus amyloliquefaciens
)
JCK
-12 배양액 처리에 따른 다양한 식물병원성 곰팡이병의 방제 효과
온실 조건에서 다양한 식물병원성 곰팡이병에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 배양액의 병 방제 효과를 관찰하기 위하여, 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)가 원인균인 벼 도열병, 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani AG1)가 원인균인 벼 잎집무늬마름병, 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)가 원인균인 토마토 잿빛곰팡이병, 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita)가 원인균인 밀 붉은녹병, 블루메리아 그라미니스 에프. 에스피. 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei)가 원인균인 보리 흰가루병, 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)가 원인균인 고추 탄저병의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 배양액 처리에 따른 병 방제 활성을 조사하였다.
벼 도열병 방제활성 평가의 경우, 벼는 "낙동벼"를 사용하였다. 병원균의 경우, 병원균인 마그나포르테 오리재 KJ201 균주를 쌀겨 한천배지(rice polish 20 g, 덱스트로스 10 g, 아가 15 g, 증류수1 L)에 접종하여 25℃ 배양기에서 2주간 배양하였다. 병원균이 자란 배지를 멸균한 붓으로 배지표면을 긁어 공기중 균사를 제거하고, 형광등이 켜진 선반(25±1℃)에서 48시간 동안 포자를 형성시켰다. 병원균의 접종은 형성시킨 분생포자를 멸균수로 일정농도의 포자현탁액 (1×106 포자/㎖)을 만든 뒤 식물에 흘러내릴 정도로 충분히 분무하였다. 접종한 벼는 습실상에서 암 상태로 24시간 습실처리를 하고 상대습도 80% 이상이며 온도 25±1℃인 항온항습실에서 5일간 둔 뒤 잎에 발생한 병반 면적율을 조사하여 병 방제 활성을 평가하였다.
벼 잎집무늬마름병의 경우 벼는 "낙동벼"를 사용하였다. 적당한 양의 밀기울을 1 ℓ를 배양병에 넣고 멸균한 후 리족토니아 솔라니 AG1 균을 접종하고 25℃ 배양기에서 7일간 배양하였다. 병원균 접종은 배양된 균사 덩어리를 적당히 잘게 마쇄하여 벼가 자란 포트에 고르게 접종하였고, 습실상(25℃)에서 3일간 배양한 후 상대습도 80% 이상인 항온항습실에서 4일간 둔 뒤에 병 발생을 조사하였다. 발병조사는 벼의 잎집에 발생된 병반 면적율을 조사하여 수행하였다.
토마토 잿빛곰팡이병의 경우 토마토는 "서광토마토"를 사용하고, 잿빛곰팡이병 병원균인 보트리티스 시네리아 NY76을 감자 한천배지에 접종하여 20℃ 항온기(암상태)에서 5일간 배양한 후, 하루에 12시간씩 광처리와 암처리를 교차하면서 다시 7일 동안 배양하여 접종원으로 사용하였다. 배지에 형성된 포자를 감자 액체배지로 수확하여 혈구계를 사용하여 포자농도를 5×105 포자/㎖로 조정하고, 본엽 1엽 오이 유묘에 분무접종하였다. 접종한 토마토 유묘는 20℃ 습실상(상대습도 95% 이상)에서 3일간 발병을 유도시킨 후 토마토 잎에 발생한 병반 면적율을 조사하여, 병 방제활성을 평가하였다.
밀 붉은녹병의 경우 밀은 "은파밀"을 사용하고, 병원균인 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita)는 활물기생균이므로, 실험실에서 식물체에 직접 계대배양하면서 밀 유묘에 형성된 하포자를 접종원으로 사용하였다. 수확한 하포자로 포자현탁액(포자 0.67 g/L)을 제조한 후 밀 유묘에 분무접종하였다. 접종한 유묘는 20℃의 습실상에서 1일간 습실처리한 후에 상대습도가 70%인 20℃의 항온항습실로 옮겨서 발병을 유도하고, 접종한지 7일 후에 병반 면적율을 조사하여 병 방제활성을 평가하였다.
보리 흰가루병의 경우 보리는 "동보리"를 사용하고, 병원균인 블루메리아 그라미니스 에프. 에스피. 호르데이(Blumeria grammis f. sp. hordei)는 활물기생균이므로, 실험실에서 보리 유묘에 인공 접종하여 발병시킨 보리 잎에 형성된 흰가루병균 포자를 접종원으로 사용하였다. 이들을 보리 유묘에 고르게 털어서 접종하였으며, 접종한 보리 유묘는 20℃, 상대습도 70% 정도의 항온항습실에 두어 7일간 발병시킨 후 병반 면적율을 조사하여 병 방제활성을 평가하였다.
고추 탄저병의 경우, 고추는 "부광고추"를 사용하고, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0 cm의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 후 발아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3 내지 4 엽기까지 키운 다음, 상기에서 준비한 시료를 처리하여 시험하였다. 먼저, 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)의 포자 현탁액(4×105 포자/㎖)을 분무 접종하였다. 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반 면적율을 조사하여 수행하였다. 실험결과 표 2와 도 13에서 개시된 바와 같이 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 배양액 처리시 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병과 같은 다양한 병원성 곰팡이가 일으키는 식물병 방제에 활성효과를 보임을 관찰할 수 있었다.
| 처리액 | 처리농도 | 방제가(%) | |||||
| RCB | RSB | TGM | WLR | BPM | PAN | ||
| JCK-12 배양액 |
9배 희석 | 25.0 | 0.0 | 0.0 | 60.0 | 41.7 | 16.7 |
| 3배 희석 | 90.0 | 100.0 | 64.3 | 83.3 | 86.7 | 25.0 | |
RCB (rice blast): 벼도열병, RSB (rice sheath blight): 벼잎집무늬마름병, TGM (tomato gray mold): 잿빛곰팡이병, WLR (wheat leaf rust): 밀붉은녹병, BPM (barley powder mildew): 보리흰가루병, PAN (pepper anthracnose): 고추탄저병
실시예
10.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 균주와 배양액을 이용한
분말수화제
조제
본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주와 배양액을 이용한 분말수화제를 조제하기 위하여, 상기 균주를 TSB 액체배지에 접종한 다음, 30℃에서 3일간 150 rpm으로 진탕배양하였다. 상기 배양액을 분무 건조하여 하기 표 3에서 열거한 성분들과 함께 블랜더에 넣어 분쇄하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제로 사용하였다.
| Ingredients | Weight (g) |
| 추출물 | 10 g |
| White carbon | 1 g |
| CR-SDS | 2.5 g |
| CR-WP100 | 2.5 g |
| 카올린 | 4 g |
| 총합 | 20 g |
실시예
11. 온실 조건에서
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus amyloliquefaciens
)
JCK
-12 제제 처리에 따른 다양한 식물병원성 곰팡이병의 방제 효과
온실 조건에서 다양한 식물병원성 곰팡이병에 대한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 제제 처리에 따른 다양한 곰팡이에 의해 발생하는 식물병 방제 효과를 관찰하기 위하여, 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)가 원인균인 벼 도열병, 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)가 원인균인 토마토 역병, 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita)가 원인균인 밀 붉은녹병, 블루메리아 그라미니스 에프. 에스피. 호르데이(Blumeria graminis f .sp. hordei)가 원인균인 보리 흰가루병, 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)가 원인균인 고추 탄저병의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 제제 처리에 따른 병 방제 활성을 조사하였다.
벼 도열병 방제활성 평가의 경우, 벼는 "낙동벼"를 사용하였다. 병원균의 경우, 병원균인 마그나포르테 오리재 KJ201 균주를 쌀겨 한천배지(rice polish 20 g, 덱스트로스 10 g, 아가 15 g, 증류수1 L)에 접종하여 25℃ 배양기에서 2주간 배양하였다. 병원균이 자란 배지를 멸균한 붓으로 배지 표면을 긁어 공기 중 균사를 제거하고, 형광등이 켜진 선반(25±1℃)에서 48시간 동안 포자를 형성시켰다. 병원균의 접종은 형성시킨 분생포자를 멸균수로 일정농도의 포자현탁액 (1×106 포자/㎖)을 만든 뒤 식물에 흘러내릴 정도로 충분히 분무하였다. 접종한 벼는 습실상에서 암 상태로 24시간 습실처리를 하고 상대습도 80% 이상이며 온도 25±1℃인 항온항습실에서 5일간 둔 뒤 잎에 발생한 병반 면적율을 조사하여 병 방제활성을 평가하였다.
토마토 역병의 경우 토마토는 "서광토마토"를 사용하고, 병원균인 파이토프토라 인페스탄스 PIT 균주를 오트밀 아가 배지에 접종한 뒤 20℃ 항온기에서 배양하였다. 배지에 형성된 유주자낭을 멸균수를 첨가하여 수확하고, 광학현미경 하에서 혈구계로 포자농도를 조사하여 3×104 유주자낭/㎖의 포자현탁액을 만들어 저온처리하여 유주자를 유출시킨 후, 토마토 유묘에 분무접종하였다. 병원균을 접종한 토마토 유묘는 20℃ 습실상에서 1일간 습실처리한 후에 20℃의 항온항습실(상대습도70%)에 2일간 두어 발병시킨 후 토마토 잎에 발생한 병반 면적율을 조사하여 병 방제활성을 평가하였다.
밀 붉은녹병의 경우 밀은 "은파밀"을 사용하고, 병원균인 푸치니아 레콘디타는 활물기생균이므로, 실험실에서 식물체에 직접 계대배양하면서 밀 유묘에 형성된 하포자를 접종원으로 사용하였다. 수확한 하포자로 포자현탁액(포자0.67 g/l)을 제조한 후 밀 유묘에 분무접종하였다. 접종한 유묘는 20℃의 습실상에서 1일간 습실처리한 후에 상대습도가 70%인 20℃의 항온항습실로 옮겨서 발병을 유도하고, 접종한지 7일 후에 병반 면적율을 조사하여 병 방제활성을 평가하였다.
보리 흰가루병의 경우 보리는 "동보리"를 사용하고, 병원균인 블루메리아 그라미니스 에프. 에스피. 호르데이(Blumeria grammis f. sp. hordei)는 활물기생균이므로, 실험실에서 보리 유묘에 인공 접종하여 발병시킨 보리 잎에 형성된 흰가루병균 포자를 접종원으로 사용하였다. 이들을 보리 유묘에 고르게 털어서 접종하였으며, 접종한 보리 유묘는 20℃, 상대습도 70% 정도의 항온항습실에 두어 7일간 발병시킨 후 병반 면적율을 조사하여 병 방제활성을 평가하였다.
고추 탄저병의 경우, 고추는 "부광고추"를 사용하고, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0 cm의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 후 발아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3 내지 4 엽기까지 키운 다음, 상기에서 준비한 시료를 처리하여 시험하였다. 먼저, 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)의 포자 현탁액(4×105 포자/㎖)을 분무 접종하였다. 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반 면적율을 조사하여 수행하였다.
실험결과 표 4에 개시된 바와 같이 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 제제 처리시 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병과 같은 다양한 병원성 곰팡이가 일으키는 식물병 방제에 활성효과를 보임을 관찰할 수 있었다.
| 처리액 | 처리농도 | 방제가(%) | ||||
| RCB | TLB | WLR | BPM | PAN | ||
| JCK-12 제제 |
500배 희석 | 78.8 | 0.0 | 60.0 | 16.7 | 0.0 |
| 250배 희석 | 95.0 | 7.1 | 73.3 | 33.3 | 20.0 | |
| 125배 희석 | 96.3 | 50.0 | 100.0 | 33.3 | 45.0 | |
RCB (rice blast): 벼 도열병, TLB (tomato leaf blight): 토마토 역병, WLR (wheat leaf rust): 밀 붉은녹병, BPM (barley powder mildew): 보리 흰가루병, PAN (pepper anthracnose): 고추 탄저병
실시예
12. 온실 조건에서
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus amyloliquefaciens
)
JCK
-12
분말수화제를
이용한 제제의 처리에 따른 밀
붉은곰팡이병의
방제 효과
온실 조건에서 본 발명의 실시예 10에서 제조한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제 처리에 대한 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과를 확인하기 위해, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 대상 식물인 밀의 이삭에 분무처리하고, 하루 뒤 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)을 접종하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 제제의 방제 효과를 조사하였다. 또한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제의 화학농약과의 시너지 효과를 온실 조건에서 확인하기 위하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 단제와 화학농약 합제를 대상 식물인 밀의 이삭에 분무처리하고, 하루 뒤 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)을 접종하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 제제의 방제 효과를 조사하였다. 구체적으로, 단제 처리의 경우 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 증류수로 500배로 희석한 희석액을 대상 식물인 밀(품종: 은파밀)의 이삭에 분무 처리하고 실온에서 하루 방치한 뒤, 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸의 포자 현탁액(2×105포자/㎖)을 분무 접종한 후 비닐을 포트 전체에 씌워 3일간 습도를 유지하였으며, 이삭에서 꽃이 필 때 시료를 처리하였다. 합제 처리의 경우 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 증류수로 250배로 희석한 희석액과 합성 농약인 알무리 2,000배 희석액을 1:1 (v/v)로 희석하여 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제 500배+알무리 4,000배 희석 합제로 명명하였고 대상 식물인 밀(품종: 은파밀)의 이삭에 분무 처리하여 실온에서 하루 동안 방치한 뒤, 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸의 포자 현탁액(2×105포자/㎖)을 분무 접종하였다. 포자 접종 후 비닐을 포트 전체에 씌워 3일간 습도를 유지하였으며, 이삭에서 꽃이 필 때 시료를 처리하였다. 양성 대조군으로서 합성 농약인 알무리(신젠타) 2,000배와 4,000배 희석액을 처리하였고, 음성 대조군으로는 Tween 20(250 ㎍/㎖)을 처리하였으며, 접종 2주 후 발병률을 조사하였다. 10개의 밀 이삭을 기본으로 3 반복으로 처리하였다.
그 결과, 하기 표 5에 개시된 바와 같이 JCK-12 균주의 분말수화제 단제 500배 희석액의 경우, 밀 붉은곰팡이병에 대하여 44.0%의 방제활성을 보였고, 화학농약과의 합제의 경우 화학농약 상용농도인 2,000배 희석액 처리 결과보다도 뛰어난 방제 효과인 96.4%의 높은 방제 활성을 보였다. 이러한 결과를 통해, 합성 항진균 약제인 알무리의 사용량을 줄이더라도 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제의 합제 처리로 높은 방제효과를 보임에 따라 본 발명의 JCK-12 제제가 밀 붉은곰팡이병 방제에 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었다.
| 처리구 | 희석배수 | 발병도(%) | 방제가(%) |
| 알무리 | 2,000배 | 10.7 | 94.3 |
| 4,000배 | 20.5 | 79.8 | |
| JCK-12 분말수화제 단제 | 500배 | 54.5 | 44.0 |
| JCK-12+알무리 합제 | 500배+4,000배 | 7.7 | 96.4 |
| 무처리구 | - | 82.0 | - |
실시예
13.
푸사리움
그라미네아룸의
밀 감염에 대한
JCK
-12
분말수화제
단제와
화학 농약
합제
효과
JCK-12 분말수화제 단제와 화학농약 합제 처리에 따른 감염 초기 밀 내에서의 붉은곰팡이 균사생장을 관찰하기 위하여 JCK-12 분말수화제 단제와 화학 농약 합제를 전처리한 밀에 형광 물질이 표지된 붉은곰팡이 균주를 접종하였다. 접종 6일 후 감염된 밀의 스파이크(spike)를 절단하여 형광현미경을 이용하여 밀 내에서의 붉은곰팡이 균사 생장을 관찰하였다. 실험 결과, 도 14에 개시된 바와 같이 무처리 대조군에서는 붉은곰팡이의 균사가 접종부위에서 인근 낱알로까지 생장하는 것을 관찰할 수 있었으나, JCK-12 분말수화제 단제와 화학농약 합제를 처리한 밀에서는 접종부위에서는 균사가 관찰되었으나 인근 낱알로는 더이상 균사가 생장하지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 화학농약 합제 처리군의 경우 JCK-12 분말수화제 단제나 화학농약 단제 처리군에 비하여 밀 내에서의 붉은곰팡이 균사 생장이 더 크게 저해되는 것으로 보아 JCK-12 분말수화제 단제와 화학농약을 함께 사용할 경우 균사 생장 저해 시너지 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
실시예
14. 포장 조건에서
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus amyloliquefaciens
)
JCK
-12
분말수화제
처리에 따른 맥류
붉은곰팡이병의
방제 효과
포장 조건에서 본 발명의 실시예 10에서 제조한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제 처리에 대한 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과를 확인하기 위해, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 대상 식물인 밀의 이삭에 분무처리하고, 하루 뒤 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)을 접종하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 제제의 방제 효과를 조사하였다. 또한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제의 화학농약과의 시너지 효과를 포장 조건에서 확인하기 위하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 단제와 화학농약 합제를 대상 식물인 밀의 이삭에 분무처리하고, 하루 뒤 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)을 접종하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 제제의 방제 효과를 조사하였다. 구체적으로, 단제 처리의 경우 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 증류수로 250배와 500배로 희석한 희석액을 대상 식물인 밀(품종: 은파밀)의 이삭에 분무 처리하고 하루 방치한 뒤, 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸의 포자 현탁액(2×105포자/㎖)을 분무 접종한 후 비닐을 씌워 3일간 습도를 유지하였으며, 이삭에서 꽃이 필 때 시료를 처리하였다. 합제 처리의 경우 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 증류수로 250배로 희석한 희석액과 합성 농약인 알무리 2,000배 희석액을 1:1 (v/v)로 희석하여 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제 500배+알무리 4,000배 희석 합제로 명명하였고 대상 식물인 밀(품종: 은파밀)의 이삭에 분무 처리하여 하루동안 방치한 뒤, 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸의 포자 현탁액(2×105포자/㎖)을 분무 접종하였다. 포자 접종 후 비닐을 씌워 3일간 습도를 유지하였으며, 이삭에서 꽃이 필 때 시료를 처리하였다. 양성 대조군으로서 합성 농약인 알무리(신젠타) 2,000배와 4,000배 희석액을 처리하였고, 음성 대조군으로는 트윈 20(250 ㎍/㎖)을 처리하였으며, 접종 2주 후 발병률을 조사하였다. 10개의 밀 이삭을 기본으로 3 반복으로 처리하였다.
그 결과, 하기 표 6에 개시된 바와 같이 JCK-12 균주의 분말수화제 단제 250배 희색액 처리의 경우 밀 붉은곰팡이병에 대하여 25.30%의 방제효과를 보였다. JCK-12 균주의 분말수화제 단제 500배 희석액의 경우, 밀 붉은곰팡이병에 대하여 방제활성을 보이지 않았으나, 화학농약과의 합제의 경우 화학농약 상용농도인 2,000배 희석액 처리 결과보다도 뛰어난 방제 효과인 91.02%의 높은 방제 활성을 보였으며 이는 화학농약인 알무리 400배 처리에서 보이는 62.58%에 비해 현저히 높은 방제활성임을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 합성 항진균 약제인 알무리의 사용량을 줄이더라도 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제의 합제 처리로 인한 상승효과로 밀 붉은곰팡이병에 높은 방제효과를 보임에 따라 본 발명의 JCK-12 제제가 밀 붉은곰팡이병 방제에 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었다.
| 처리구 | 희석배수 | 발병도(%) | 방제가(%) |
| 알무리 | 2,000배 | 6.22 | 81.99 |
| 4,000배 | 8.79 | 62.58 | |
| JCK-12 분말수화제 단제 | 250배 | 15.13 | 25.30 |
| 500배 | 28.96 | - | |
| JCK-12+알무리 합제 | 500배+4,000배 | 4.83 | 91.02 |
| 무처리구 | - | 17.51 | - |
실시예
15. 온실 조건에서
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus amyloliquefaciens
)
JCK
-12
분말수화제
처리에 따른 밀에서의
붉은곰팡이
독소 생성 저해효과
온실 조건에서 본 발명의 실시예 10에서 제조한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제 처리에 대한 밀에서의 붉은곰팡이 독소 생성을 확인하기 위해, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 대상 식물인 밀의 이삭에 분무처리하고, 1일 후 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)을 접종하고 접종 2주 후 수확하여 붉은곰팡이 독소 생성정도를 조사하였다. 구체적으로, 온실 실험 밀 이삭을 냉동 보관 후 35℃ 오븐에서 2일간 보관하여 수분을 제거하였다. 수분을 제거한 밀의 밀대를 제거한 다음 밀 이삭만을 블렌더에 넣고 분쇄하였다. 각각의 밀 시료 분말 1 g을 전자저울에 측정하여 15 ㎖ 원심분리 튜브에 덜었다. 그 다음 10 ㎖의 증류수를 넣고 잘 혼합하여 주고 진탕배양기에서 1시간 동안 물질 추출이 원활하게 이루어지도록 하였다. 진탕배양기에서 꺼내어 5분 동안 초음파처리 후 10,000 rpm으로 5분간 원심분리시켰다. 각각의 처리구의 상층액을 취해 여과지에 거른 뒤 여과액 3 ㎖씩 취하여 미리 비시프렙 배쿰 매니폴드(visiprep vacuum manifold)에 설치한 DON kit의 컬럼에 주입하였다. 시료가 주입된 컬럼을 5 ㎖ PBS(Phosphate bufferd saline)와 5 ㎖의 증류수로 세척 후 컬럼내 용매들을 모두 제거하였다. 세척액 제거 후 0.5 ㎖ MeOH 및 1.5 ㎖ ACN로 용출시키고 얻어진 시료 용출액은 질소 농축 후 DON(deoxynivalenol) 표준물질과 함께 HPLC 분석을 통해 시료 내 DON 오염량을 분석하였다.
그 결과, 하기 표 7에 개시된 바와 같이 JCK-12 균주의 분말수화제 단제(500배) 처리구의 경우, 밀 붉은곰팡이병에 대하여 2.36 ㎍/g의 DON 오염량을 보였다. 이는 무처리구의 DON 오염량 5.89 ㎍/g 보다는 훨씬 낮은 독소 함량이었다. 이러한 결과를 통해, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제의 처리로 인한 곰팡이의 독소 저감 효과를 온실조건에서도 관찰할 수 있었다. 따라서 본 발명의 JCK-12 제제가 밀 붉은곰팡이병 방제 및 독소 생성 저감에 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었다.
| 처리구 | 희석배수 | DON(㎍/g) |
| 알무리 | 4,000배 | 2.4 |
| JCK-12 분말수화제 단제 | 500배 | 2.36 |
| JCK-12+알무리 합제 | 500배+4,000배 | 2.6 |
| 무처리구 | - | 5.9 |
실시예 16. 포장 조건에서 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(
Bacillus amyloliquefaciens
)
JCK
-12
분말수화제와
화학농약의
합제
또는
교호살포가
붉은곰
팡이병 발생 밀의 수확량에 미치는 영향
본 발명의 실시예 10에서 제조한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 화학농약과 합제 또는 교호살포를 통하여 붉은곰팡이병이 감염된 밀의 수확량에 미치는 영향을 조사하였다.
밀 품종은 은파밀(전남대 1차 시험포장)과 금강밀(극립식량과학원 2차 시험포장)을 사용하였고, 1차 약제처리 1일 후에 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum )의 포자 현탁액(2×105포자/㎖; 250 ㎍/㎖의 트윈 20 포함)을 분무 접종하였다. 효과적인 발병을 위하여 매일 2회 1주일간 물을 분무살포하였으며, 약제는 하기 표 8에 개시한 바와 같이 1회 또는 2회 처리하였다. 1차 약제처리는 개화기에 접종 1일 전에 처리하였고, 2차 약제처리는 1차 약제처리 20일 후에 처리하였다. 모든 시험 처리구의 이삭은 2차 약제 처리 20일 후 이삭을 수확하였다. 처리당 30개 이삭에 약제를 살포하였고, 3 반복으로 실험을 실시하였다. 무처리구의 경우 물을 처리하였다. 밀 수확량의 증감은 낱알의 무게로 측정하였으며 낱알의 무게는 처리구마다 이삭 껍질 부분을 제거하고 측정한 낱알의 무게를 이삭의 개수로 나누어 주었다.
전남대학교 시험포장에서 실시한 실험의 경우, 은파밀을 사용하였으며, 그 결과는 하기 표 8과 같다. JCK-12 분말수화제 및 화학농약(알무리)을 합제 처리한 것과 JCK-12 분말수화제 및 화학농약을 교호 살포하였을 때, 수확량이 이삭당 7-10 g 정도 증가한 것을 확인할 수 있었고, 수치적으로 볼 때에는 JCK-12 분말수화제 및 알무리 교호살포 처리구의 낱알 무게가 가장 무거운 것으로 나타났다.
또한, 도 15에 개시된 바와 같이 무처리구와 비교하여 모든 처리구가 우수한 밀 낱알의 품질을 보였으며 무처리구는 밀 붉은곰팡이병으로 인해 마름 증상과 품질이 저하되어 무게 또한 감소하였다. 따라서 JCK-12 분말수화제를 화학농약(알무리)과 합제로 처리하는 것은 화학농약의 상용농도를 1/2로 줄이면서 밀의 수확량을 증가시키고 품질을 효과적으로 유지시키는데 도움이 된다는 것을 확인할 수 있었다.
| 처리구 | 희석배수 | 낱알무게/이삭(g) | |
| 1차처리 | 2차처리 | ||
| 알무리 | 2,000배 | - | 37.92±3.85a |
| 알무리/JCK-12 교호살포 | 2,000배 | 500배 | 38.93±4.02a |
| JCK-12+알무리 합제 | 500배+4,000배 | 500배+4,000배 | 36.72±4.32a |
| 무처리구 | - | - | 29.11±1.18b |
*서로 다른 영어 소문자는 통계적으로 유의적인 차이가 있음을 나타냄(Duncan test, P≤0.05).
또한, 상기 결과를 재검증하기 위하여 국립식량과학원 시험포장에서 금강밀을 대상으로 상기 동일한 실험을 실시하였다. 그 결과, 하기 표 9에 개시한 바와 같이 JCK-12 분말수화제 및 알무리 교호살포 처리구의 이삭 무게 및 낱알의 무게가 통계적으로 가장 무거웠다. 따라서 본 실시예 16의 결과에서도 JCK-12 분말수화제를 화학농약과 합제로 처리하는 것은 화학농약의 상용농도를 1/2로 줄이면서 밀의 수확량을 증가시키고 품질을 효과적으로 유지시키는데 도움이 된다는 것을 확인할 수 있었다.
| 처리구 | 희석배수 | 이삭무게(g) | 낱알무게/이삭(g) | |
| 1차처리 | 2차처리 | |||
| 알무리 | 2,000배 | - | 40.89±1.10ab | 23.99±1.62ab |
| 알무리/JCK-12 교호살포 | 2,000배 | 500배 | 44.63±2.72b | 26.71±1.74b |
| JCK-12+알무리 합제 | 500배+4,000배 | 500배+4,000배 | 42.38±2.89ab | 24.75±2.95ab |
| 무처리구 | - | - | 40.02±1.54a | 22.32±1.54a |
*서로 다른 영어 소문자는 통계적으로 유의적인 차이가 있음을 나타냄(Duncan test, P≤0.05).
실시예 17. 포장 조건에서 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(
Bacillus amyloliquefaciens
) JCK-12 분말수화제와 화학농약의 합제 또는 교호살포가 붉은곰팡이병 발생 보리의 수확량에 미치는 영향
본 발명의 실시예 10에서 제조한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제를 화학농약과 합제 또는 교호살포를 통하여 붉은곰팡이병이 발생한 보리의 수확량에 미치는 영향을 조사하였다.
보리 품종은 호밀을 사용하였고, 실험은 국립식량과학원 포장에서 실시하였다. 1차 약제처리 1일 후에 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸의 포자 현탁액(2×105포자/㎖; 250 ㎍/㎖의 트윈 20 포함)을 분무 접종하였다. 효과적인 발병을 위하여 매일 2회 1주일간 물을 분무살포하였으며, 약제는 하기 표 10과 같이 1회 또는 2회 처리하였다. 1차 약제처리는 이삭이 완전히 올라왔을 때 접종 1일 전에 처리하였고, 2차 약제처리는 1차 약제처리 20일 후에 처리하였다. 모든 시험 처리구의 이삭은 2차 약제 처리 20일 후 이삭을 수확하였다. 보리 수확량의 증감은 이삭과 낱알의 무게로 측정하였으며 낱알의 무게는 처리구마다 이삭 껍질 부분을 제거하고 측정한 낱알의 무게를 이삭의 개수로 나누어 주었다.
그 결과, 하기 표 10에 개시된 바와 같이 JCK-12 분말수화제 및 화학농약(알무리)을 합제 처리한 것과 JCK-12 분말수화제 및 화학농약(알무리)을 교호 살포하였을 때, 무처리구 대비 이삭수확량이 소량 증가하였다. 또한, 낱알 무게의 경우 JCK-12 분말수화제를 알무리와 합제 처리한 것과 JCK-12 분말수화제 및 알무리를 교호살포한 처리구가 보리 무게가 무처리구 대비 유의성있게 증가하였다. 따라서 화학농약(알무리)과 함께 JCK-12 분말수화제를 처리하는 것은 보리의 수확량을 증가시키고 품질을 효과적으로 유지시키는데 도움이 된다는 것을 확인할 수 있었다.
| 처리구 | 희석배수 | 이삭무게(g) | 낱알무게/이삭(g) | |
| 1차처리 | 2차처리 | |||
| 알무리 | 2,000배 | - | 50.83±2.24a | 39.12±2.14ab |
| 알무리/JCK-12 | 2,000배 | 500배 | 52.74±2.94a | 40.57±2.80b |
| JCK-12+알무리 합제 | 500배+4,000배 | - | 50.89±0.34a | 38.28±0.72ab |
| 무처리구 | - | - | 49.24±2.75a | 35.24±2.82a |
*서로 다른 영어 소문자는 통계적으로 유의적인 차이가 있음을 나타냄(Duncan test, P≤0.05).
실시예
18.
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus
amyloliquefaciens
)
JCK
-12 부탄올 추출물과 살균제 유효성분의
합제
처리에 따른
식물병원성 곰팡이
방제 시너지 효과
바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 사용하여 살균제 유효성분과의 시너지 효과를 확인하였다. 식물병원성 곰팡이는 하기 표 11에 나타난 균주들을 사용하여 실험하였다. 본 실시예의 식물병원성 곰팡이는 PDA와 OMA 배지에 접종하여 25℃에서 7-10일 정도 배양하였다. 식물병원성 곰팡이에 대하여 균사 생장 억제 효과를 확인하기 위하여, CM 배지를 사용하였다. 50 ㎖의 팔콘튜브에 CM 배지를 15 ㎖씩 넣고 멸균한 후, 배지 온도가 50℃가 되도록 식혔다. 항진균 효과가 있는 JCK-12 부탄올 추출물은 20,000 ppm을 스탁으로 사용하였고 여기에 살균제 유효성분 농도는 하기 표 11과 같이 설정하여 배지 부피의 1%가 되도록 첨가하여 최종 농도가 되도록 제조하였다. 그리고 약제가 고르게 섞이도록 잘 흔들어 직경 5.5 cm의 플레이트에 붓고 굳혀주어 약제 배지를 제조하였다. 그리고 식물병원성 곰팡이는 5 mm의 코르크 보러를 사용하여 절단하고 아가 디스크(agar disk)를 떼어내어 약제 배지 정중앙에 균사 부분이 배지와 닿도록 접종한 후 25℃에서 정치배양하였다. 결과 조사는 무처리구가 플레이트에 전체적으로 성장한 것을 기준으로 하여 조사하였다. 장경과 단경을 측정하고, 이들이 평균값에서 처음에 접종한 아가 디스크의 길이를 뺀 값을 균사 생장으로 하였다. 실험은 3 반복으로 실시하였으며, 약제의 균사 생장 억제율은 하기와 같은 식에 따라 계산하였다.
균사 생장 억제율(%) = (1 - 처리구의 균총 길이 / 무처리구의 균총 길이) × 100
그 결과, 하기 표 12 및 도 16에 개시된 바와 같이 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) RBS 0119에 대하여 살균제 유효성분인 발리다마이신(validamycin)을 3.125 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 5%의 균사생장 억제율을 보였으나, JCK-12 부탄올 추출물 15 ㎍/㎖과 발리다마이신 3.125 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때 방제효과(45%)가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 발리다마이신의 리족토니아 솔라니 RBS 0119에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 보이며, 실험시 사용한 가장 높은 농도인 12.5 ㎍/㎖의 발리다마이신 단독처리시의 방제효과(14%)보다 JCK-12 부탄올 추출물 15 ㎍/㎖과 발리다마이신 12.5 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때 방제효과(31%)가 월등한 것으로 확인되었다. 결과적으로, 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때 방제효과가 더 높은 것을 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) RBS 0119로 인해 발생하는 병 방제 전략의 가능성을 제시하여 주었다.
| 병원균 학명 | 식물병 이름 | 살균제 유효성분 |
살균제 처리농도 (㎍/㎖) |
JCK-12 처리농도 (㎍/㎖) |
| 콜레토트리쿰 호라이 (Colletotrichum horii) DMI-S |
감나무 탄저병 | 테부코나졸 | 0.003, 0.0015 | 30 |
| 콜레토트리쿰 호라이 (Colletotrichum horii) DMI-R |
감나무 탄저병 | 테부코나졸 | 0.25 | 30 |
| 라이족토니아 세레알리스 (Rhizoctonia cerealis) 40153 |
잔디 춘고병 | 테부코나졸 | 0.006, 0.003, 0.0015 | 30 |
| 라이족토니아 세레알리스 (Rhizoctonia cerealis) 40154 |
잔디 춘고병 | 테부코나졸 | 0.006, 0.003, 0.0015 | 30 |
| 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea) |
토마토 잿빛곰팡이병 |
플루디옥소닐 | 0.006, 0.003, 0.0015 | 30 |
| 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) RBS 0119 |
벼 문고병 | 발리다마이신 | 12.5, 6.25, 3.125 | 15 |
| 콜레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes) |
고추 탄저병 | 디티아논 | 12.5, 6.25, 3.125 | 30 |
| 마그나포르테 오리재 ( Magnaporthe oryzae ) |
벼 도열병 | 블라스티시딘-S | 12.5, 6.25, 3.125 | 30 |
| 스크레로티니아 호모에오카르파 (Sclerotinia homoeocarpa) |
잔디 동전마름병 |
테부코나졸 | 0.006, 0.003, 0.0015 | 30 |
| 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) AG1-1B 40111 |
잔디 갈색잎마름병 |
테부코나졸 | 0.025, 0.0125, 0.00625 | 60 |
| 쿠르불라리아 루나타 (Curvularia lunata) |
잔디 엽고병 | 테부코나졸 | 0.006 | 0.625 |
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 발리다마이신 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 12.5 | 14 | - | - | |
| 6.25 | 12 | - | - | |
| 3.125 | 5 | - | - | |
| 15 | 0 | 21 | - | - |
| 12.5 | 31 | 36 | 상가효과 | |
| 6.25 | 50 | 33 | 상승효과 | |
| 3.125 | 45 | 26 | 상승효과 | |
또한, 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)에 대한 블라스티시딘-S(Blasticidin-S)와 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과는 하기 표 13과 도 17에 개시된 바와 같이 블라스티시딘-S 12.5 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 23%의 균사생장 억제율을 보였으나, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 블라스티시딘-S 12.5 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때 방제효과(69%)가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 블라스티시딘-S의 마그나포르테 오리재에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 또한, JCK-12 부탄올 추출물 및 블라스티시딘-S 6.25 ㎍/㎖의 합제 처리구(49%)도 블라스티시딘-S 6.25 ㎍/㎖ 단독처리시의 방제효과(14%)보다 월등할 뿐만 아니라, 블라스티시딘-S 12.5 ㎍/㎖ 단독 처리하였을 때의 방제효과(23%)보다 우수한 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로, 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때, 방제효과가 더 우수한 것을 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 마그나포르테 오리재로 인해 발생하는 병 방제 전략의 가능성을 제시하여 주었다.
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 블라스티시딘-S | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 12.5 | 23 | - | - | |
| 6.25 | 14 | - | - | |
| 3.125 | 9 | - | - | |
| 30 | 0 | 26 | - | - |
| 12.5 | 69 | 49 | 상승효과 | |
| 6.25 | 49 | 40 | 상가효과 | |
| 3.125 | 29 | 38 | 상가효과 | |
또한, 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)에 대한 테부코나졸(tebuconazole)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과는 하기 표 14 및 도 18에 개시된 바와 같이 테부코나졸 0.006 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 27%의 균사생장 억제율을 보였으나, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.006 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때 78%의 방제가를 나타내어, 방제효과가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 유효성분인 테부코나졸의 스클레로티니아 호모에오카르파에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 또한, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖ 및 테부코나졸 0.003 ㎍/㎖의 합제 처리구도 방제가 51%로, 테부코나졸 0.003 ㎍/㎖ 단독처리시의 방제효과(17%)보다 월등하였으며, 이는 더 높은 농도인 테부코나졸 0.006 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때의 27%의 억제율보다도 방제효과가 우수하였다. 결론적으로, 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때 방제효과가 더 우수한 것을 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 스클레로티니아 호모에오카르파로 인해 발생하는 병 방제 전략의 가능성을 제시하여 주었다.
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 테부코나졸 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 0.006 | 27 | - | - | |
| 0.003 | 17 | - | - | |
| 0.0015 | 12 | - | - | |
| 30 | 0 | 21 | - | - |
| 0.006 | 78 | 48 | 상승효과 | |
| 0.003 | 51 | 38 | 상승효과 | |
| 0.0015 | 56 | 33 | 상승효과 | |
또한, 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 40153 및 40154에 대한 테부코나졸(tebuconazole)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과는 하기 표 15 및 표 16과 도 19 및 도 20에 개시된 바와 같이 테부코나졸을 0.006 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 라이족토니아 세레알리스 40153 및 40154에 대하여 각각 15% 및 12%의 균사생장 억제율을 보였으나 JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.006 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때 46% 및 50%의 방제가를 보여 방제효과가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 유효성분인 테부코나졸의 라이족토니아 세레알리스 40153 및 40154에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 또한, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.003 ㎍/㎖의 합제 처리구도 테부코나졸 0.003 ㎍/㎖ 단독 처리하였을 때의 라이족토니아 세레알리스 40153 및 40154에 대한 방제가보다 월등하였으며, 이는 테부코나졸을 0.006 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때의 라이족토니아 세레알리스 40153(15%) 및 40154(12)%의 균사생장 억제율보다 더 우수한 방제효과를 보였다. 결과적으로, 적은 양의 화학농약과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 합제 처리하였을 때 방제효과가 더 높은 것으로 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 라이족토니아 세레알리스 40153 및 40154로 인해 발생하는 병 방제 전략의 가능성을 제시하여 주었다.
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 테부코나졸 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 0.006 | 15 | - | - | |
| 0.003 | 8 | - | - | |
| 0.0015 | 8 | - | - | |
| 30 | 0 | 15 | - | - |
| 0.006 | 46 | 30 | 상가효과 | |
| 0.003 | 31 | 23 | 상가효과 | |
| 0.0015 | 27 | 23 | 상가효과 | |
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK12 | 테부코나졸 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 0.006 | 12 | - | - | |
| 0.003 | 0 | - | - | |
| 0.0015 | 0 | - | - | |
| 30 | 0 | 12 | - | - |
| 0.006 | 50 | 24 | 상승효과 | |
| 0.003 | 44 | 12 | 상승효과 | |
| 0.0015 | 38 | 12 | 상승효과 | |
보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 대한 플루디옥소닐(fludioxonil)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과는 하기 표 17과 도 21에 개시된 바와 같이, 플루디옥소닐을 0.00015 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 보트리티스 시네레아에 대하여 8%의 균사생장 억제율을 보였으나, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 플루디옥소닐 0.00015 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때에는 56%의 방제가를 보여 방제효과가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 플루디옥소닐의 보트리티스 시네레아에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 또한, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 플루디옥소닐 0.006 ㎍/㎖의 합제 처리구도 플루디옥소닐 0.006 ㎍/㎖ 단독 처리하였을 때보다 보트리티스 시네레아에 대한 균사생장 억제율이 더 우수한 것을 확인하였다. 결과적으로, 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때 방제효과가 더 높은 것을 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 보트리티스 시네레아로 인해 발생하는 병 방제 전략의 가능성을 제시하여 주었다.
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 플루디옥소닐 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 0.006 | 41 | - | - | |
| 0.003 | 26 | - | - | |
| 0.0015 | 8 | - | - | |
| 30 | 0 | 23 | - | - |
| 0.006 | 69 | 64 | 상가효과 | |
| 0.003 | 54 | 49 | 상가효과 | |
| 0.0015 | 56 | 31 | 상승효과 | |
콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)에 대한 디티아논(dithianon)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과는 하기 표 18과 도 22에 개시된 바와 같이 디티아논 6.25 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 콜레토트리쿰 코코데스에 대하여 22%의 억제율을 보였으나, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 디티아논 6.25 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때에는 50%의 균사생장 저해율을 보여 방제효과가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 디티아논의 콜레토트리쿰 코코데스에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 또한, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 디티아논 12.5 ㎍/㎖의 합제 처리구도 디티아논 12.5 ㎍/㎖ 단독 처리하였을 때의 방제가인 42%보다 우수한 방제가(67%)를 보였다. 결과적으로, 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때 방제효과가 더 높은 것으로 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 콜레토트리쿰 코코데스로 인해 발생하는 병 방제 전략의 가능성을 제시하여 주었다.
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 디티아논 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 12.5 | 42 | - | - | |
| 6.25 | 22 | - | - | |
| 3.125 | 14 | - | - | |
| 30 | 0 | 8 | - | - |
| 12.5 | 67 | 50 | 상승효과 | |
| 6.25 | 50 | 28 | 상승효과 | |
| 3.125 | 31 | 22 | 상승효과 | |
리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG1-1B 40111에 대한 테부코나졸(tebuconazole)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과는 하기 표 19과 도 23에 개시된 바와 같이 테부코나졸 0.012 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 리족토니아 솔라니 AG1-1B 40111에 대하여 20%의 균사생장 억제율을 보였으나 JCK-12 부탄올 추출물 60 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.012 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때에는 68%의 방제가를 보여 방제효과가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 테부코나졸의 리족토니아 솔라니 AG1-1B 40111에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 또한, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.006 ㎍/㎖의 합제 처리구도 테부코나졸 0.006 ㎍/㎖의 단독처리시의 리족토니아 솔라니 AG1-1B 40111에 대한 방제가인 15%보다 더 우수한 방제효과를 보였다. 결과적으로, 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때 방제효과가 더 높은 것으로 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 리족토니아 솔라니 AG1-1B 40111에 의한 잔디동전마름병 방제 전략의 효율적인 방안을 제시하여 주었다.
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 테부코나졸 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 0.025 | 24 | - | - | |
| 0.012 | 20 | - | - | |
| 0.006 | 15 | - | - | |
| 60 | 0 | 34 | - | - |
| 0.025 | 71 | 58 | 상승효과 | |
| 0.012 | 68 | 54 | 상승효과 | |
| 0.006 | 59 | 49 | 상승효과 | |
콜레토트리쿰 호라이(Colletotrichum horii) DMI-S(살균제 감수성 감나무 탄저병균)과 콜레토트리쿰 호라이(Colletotrichum horii) DMI-R(살균제 저항성 감나무 탄저병균)에 대한 테부코나졸(tebuconazole)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과는 하기 표 20 및 표 21에 개시된 바와 같이, 테부코나졸을 0.0015 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 콜레토트리쿰 호라이 DMI-S 병원균에 대하여 5%의 균사생장 억제율을 보였으나, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.0015 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때에는 58%의 방제가를 보여 방제효과가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 테부코나졸의 콜레토트리쿰 호라이 DMI-S 병원균에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 또한, JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.003 ㎍/㎖의 합제 처리구도 테부코나졸 0.003 ㎍/㎖의 단독처리구의 콜레토트리쿰 호라이 DMI-S 병원균에 대한 방제가인 48%보다 우수한 방제효과를 보였다.
또한, 하기 표 21에 개시된 바와 같이 테부코나졸을 0.25 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 콜레토트리쿰 호라이 DMI-R 병원균에 대하여 27%의 억제율을 보였으나 JCK-12 부탄올 추출물 30 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.25 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때에는 67%의 방제가를 보여 방제효과가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 테부코나졸의 콜레토트리쿰 호라이 DMI-R 병원균에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 결과적으로, 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때 방제효과가 더 높은 것을 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 콜레토트리쿰 호라이 DMI-S과 콜레토트리쿰 호라이 DMI-R 병원균이 유발하는 감나무 탄저병 방제 전략의 가능성을 제시하여 주었다. 또한, 이 실험은 살균제 남용과 오랜 사용으로 인해 생겨난 화학살균제 저항성 균주에 대하여 화학살균제의 병원균에 대한 민감성을 높여 저하된 살균 효과를 상승시켜주는 장점도 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 테부코나졸 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 0.003 | 48 | - | - | |
| 0.0015 | 5 | - | - | |
| 30 | 0 | 30 | - | - |
| 0.003 | 78 | 78 | 상가효과 | |
| 0.0015 | 58 | 35 | 상승효과 | |
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 테부코나졸 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 0.25 | 27 | - | - | |
| 30 | 0 | 30 | - | - |
| 0.25 | 67 | 57 | 상승효과 | |
또한, 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata)에 대한 테부코나졸(tebuconazole)과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물의 감작 효과는 하기 표 22 및 도 24에 개시된 바와 같이, 테부코나졸을 0.006 ㎍/㎖을 단독 처리하였을 때에는 쿠르불라리아 루나타에 대하여 16%의 억제율을 보였고, JCK-12 부탄올 추출물 0.625 ㎍/㎖과 테부코나졸 0.006 ㎍/㎖를 합제 처리하였을 때에는 43%의 방제가를 보여 방제효과가 급격히 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 부탄올 추출물의 감작 작용으로 인하여 살균제 테부코나졸의 쿠르불라리아 루나타 병원균에 대한 민감성을 높여 병원성 곰팡이 성장을 효과적으로 저해한 것으로 확인되었다. 결과적으로, 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때 방제효과가 더 높은 것을 보여주었으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 쿠르불라리아 루나타로 인해 발생하는 잔디 엽고병 방제 전략의 가능성을 제시하여 주었다. 또한, 이 실험은 살균제 남용과 오랜 사용으로 인해 생겨난 화학살균제 저항성 균주에 대하여 화학살균제의 병원균에 대한 민감성을 높여 저하된 살균 효과를 상승시켜주는 장점도 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
| 농도(㎍/㎖) | 균사생장 저해율(%) | 비고 | ||
| JCK-12 | 테부코나졸 | 실제저해율 | 이론상가효과치 | |
| 0 | 0 | 0 | - | - |
| 0.006 | 16 | - | - | |
| 0.625 | 0 | 5 | - | - |
| 0.006 | 43 | 21 | 상승효과 | |
실시예
19. 온실 조건에서
바실러스
아밀로리퀘파시엔스
(
Bacillus amyloliquefaciens
)
JCK
-12
분말수화제
처리에 따른
크리핑
벤트그라스에서의
잔디동전마름병에 대한 방제 효과
온실 조건에서 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 분말수화제 처리에 따른 크리핑 벤트그라스(creeping bentgrass)에서의 잔디 동전마름병에 대한 방제 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 약제처리를 위해 상기 실시예 10에서 제조한 JCK-12 분말수화제 250배 및 500배와 시판되는 화학살균제 호리쿠어(활성성분 : tebuconazole, ai 25%) 2,000배(상용농도) 및 4,000배, 그리고 JCK-12 분말수화제 500배 및 호리쿠어 4000배 합제를 각각 100 ㎖씩 제조하였다.
상기 제조된 약제들은 병원균 접종 4일 전에 포트당 10 ㎖씩 6 반복으로 약제를 토양 관주로 처리하였다. 약제 처리를 수행할 잔디는 건조상태를 유지하기 위하여 물을 주지 않고 실험을 수행하였다. 4일 후 균주를 접종하기 위하여 잔디에 물을 충분히 준 다음 균주를 접종하였다. 접종은 스크레로티니아 호모에오카르파(S. homoeocarpa) 균주를 접종한 밀기울-왕겨 배지를 스푼을 이용하여 믹서기에 넣은 후 110 ㎖ 증류수와 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate) 20,000 ppm을 스탁으로 사용하여 최종 농도가 200 ppm이 되도록 증류수를 넣은 후 믹서기로 혼합하였다. 그 후에 접종할 잔디에 포트당 3.3 ㎖씩 접종하여 주었다. 병원균을 접종한 잔디는 아크릴 챔버로 덮은 후 습도 유지를 위해 물을 부어주었다. 그리고 10일 동안 트레이에 물을 부어주면서 95%로 습도를 유지하였으며, 25℃에서 균주를 접종한 잔디를 주기적으로 확인을 하였다.
그 결과, 도 25 및 도 26에 개시된 바와 같이 시판되는 화학살균제인 호리쿠어 4000배를 단제 처리하였을 때에는 22.14% 방제 효과를 보였으며 JCK-12 분말수화제를 250배와 500배로 단제 처리하였을 때 방제 효과가 확인되지 않았다. 반면, JCK-12 분말수화제 500배와 호리쿠어 4000배를 합제 처리하였을 때에는 66.92%로 호리쿠어 2000배 단제 처리한 70.90%의 방제 효과 결과와 유사하게 나타났다. 따라서 JCK-12 분말수화제가 화학살균제인 호리쿠어의 효과를 증진시켜 잔디에서의 곰팡이 균사 생장을 저해시킨 것으로 보이며, 이러한 결과는 JCK-12 분말수화제의 적용이 밀에서 뿐만 아니라 실험실 내에서 감작 효과를 보인 다른 병원균의 포장시험에서도 동일한 효과를 보인다는 증거를 보여주었다. 결과적으로, 실제 포장조건에서 적은 양의 화학농약과 함께 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 처리하였을 때 방제효과가 더 높은 것을 보여주며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 부탄올 추출물을 감작제로 사용함으로써 우수한 방제가를 보장하면서 화학농약의 사용량을 줄일 수 있다는 식물병 방제 전략의 효율적인 방안을 제시하여 주었다.
Claims (10)
- 리포펩타이드계 화합물 및 합성농약의 합제를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 리포펩타이드계 화합물은 기탁번호가 KCTC12952BP인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주 추출물 유래인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리포펩타이드계 화합물은 이투린 A(iturin A), 펜기신(fengycin) 또는 서펙틴(surfactin)인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 합성농약은 이프로디온(iprodione), 플루디옥소닐(fludioxonil), 베노밀(benomyl), 디페노코나졸(difenoconazole), 테부코나졸(tebuconazole), 발리다마이신(validamycin), 블라스티시딘-S(blasticidin-S) 및 디티아논(dithianon)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 식물병 방제용 조성물은 분말수화제, 액상수화제, 액제 또는 입제의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 식물병은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp. niveum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케(Raffaelea quercus-mongolicae), 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae), 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita), 블루메리아 그라미니스 에프. 에스피. 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 콜레토트리쿰 호라이 (Colletotrichum horii), 라이족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 및 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata) 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 식물병원성 진균에 의해 발병하는 식물병인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법.
- 이투린 A(iturin A);와 펜기신(fengycin) 및 서펙틴(surfactin) 중 하나 이상의 화합물;의 합제를 유효성분으로 함유하는 붉은곰팡이병 방제용 조성물.
- 리포펩타이드계 화합물을 생산하고, 식물병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지며, 기탁번호가 KCTC12952BP인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상; 및 항진균성 합성농약;의 합제를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 합성농약의 저항성 발생을 저해하거나 또는 감도를 증가시키는 방법.
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