KR20190010204A

KR20190010204A - 지렁이 분변토로부터 제조된 생균제 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20190010204A
Application number: KR1020170092670A
Authority: KR
Inventors: 박병성; 서종록
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 주식회사 후인바이오
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2019-01-30

Abstract

본 발명은 지렁이 분변토로부터 분리된 복합 생균제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 복합생균제는 동물의 대장에서 유해한 세균수의 증식을 억제함으로써 동물의 건강을 증진시킴과 동시에 악취의 발생을 억제하여 동물복지 향상 및 농가소득 증대에 기여할 수 있다.

Description

지렁이 분변토로부터 제조된 생균제 및 이의 제조방법{Probiotics manufactured from earthworm vermicomposts and preparing the same}

본 발명은 지렁이 분변토로부터 제조된 복합 생균제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

축산업자는 관행적인 축사 환경관리의 문제점을 최소화하기 위해 일정한 압력을 받고 있다. 악취는 주로 대기 환경의 질에 영향을 미치며 동물 생산에 있어서 심각한 민원 발생의 원인이 된다. 특히, 산란계의 분뇨로부터 발생하는 악취의 원인인 암모니아 저감 및 제거와 관련한 문제는 양계산업에서 커다란 관심사가 되고 있는 중요한 현안이다.

암모니아(ammonia, NH₃)는 동물생산을 위해 가축에게 급여하는 사료 중 단백질의 비효율적인 전환으로 인하여 동물의 배설물로 배출되어 생성된다. 산란계는 동물의 영양소 요구량을 충족시키기 위하여 과잉의 질소를 포함하는 고단백질 사료를 공급해준다. 사료를 통하여 섭취된 단백질이 산란계의 소장에서 가수분해되지 않고 닭의 분뇨로 배설되었을 때 공기 중에 노출됨으로써 분뇨에 존재하는 유해세균이 활성화되고 배설된 단백질이 분해되는 과정에서 암모니아가 증가한다. 암모니아는 고온 환경에서 환기가 불량하고 동물 시설관리가 나쁠 경우 양계장 내부에 축적되어 악취 발생의 원인이 된다.

또한, 양계장 내 암모니아 농도의 상승은 동물의 건강과 생산에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 양계장 내부의 암모니아 수치가 25 ppm 이상이면 가금류의 체중이 감소하는 것으로 보고되었다. 또한, 암모니아는 사람의 건강에도 해로운 영향을 미치며 저농도의 암모니아에서도 폐와 눈을 자극한다. 동물시설 내부에 암모니아 농도를 낮추는 하나의 전략은 환기를 통한 공기속도를 높여주는 것이다. 환기는 시설 내부의 암모니아 제거를 증가시킴으로써 암모니아 농도를 희석하며 환기로 인하여 새롭게 유입된 공기는 배설물과 깔짚의 건조 속도를 증가시킨다. 따라서 실내 암모니아 수준을 감소시킨다.

사료 단백질의 구성분인 질소는 가축의 분뇨를 통하여 배설되는데 포유동물과 조류에서 각각 요소(urea), 요산(uric acid), 암모니아 및 유기태 질소의 형태로 배설된다. 동물의 분뇨로 배설되는 사료 단백질의 대사 산물인 요소, 요산은 공기 중에 노출된 이후 수일 이내에 유해세균으로부터 분비되는 효소작용에 의해 빠르게 암모니아로 전환된다. 분뇨 단백질 중의 질소는 알칼리성 pH에서 쉽고 빠르게 암모니아로 전환된다.

한편, 생균제(probiotic bacteria)는 상피세포 수용체 및 소화관 점막 층에서 유해균과 경쟁하고 유해세균에 직접 결합하여 유해세균이 장 내 정착할 수 있는 능력을 감소시킨다. 장 내 생균제와 세균총의 개선은 장 내 발효의 활성과 관련이 있다. 생균제로 사용되는 Lactobacillus는 박테리오신(bacteriocin), 항생제, 락트산 과산화물을 비롯한 다양한 항균성 물질을 생성하며 이러한 물질은 병원체의 소화관 벽 부착 방지에 중요한 역활을 하는 소화관 점막의 유익한 균총을 형성한다. 생장 내 세균 숲의 안정화를 통하여 체액성 면역반응을 갖으며 소화관 벽을 튼튼하게 해주는 장 내 방어 메카니즘으로써 면역학적 질환을 예방한다. 생균제를 공급해주면 가축 분에서 더 많은 숫자의 유산균이 검출됨과 동시에 포도알균과 같은 유해균의 감소가 나타난다.

돼지 대장에서 생균제로 인하여 Lactobacillus 속에 속하는 토착 젖산균이 증가가 되었으며 젖산균의 증가는 젖산 생산을 촉진하였다. 젖산을 이용하는 미생물은 초산(Acetic acid, C2)과 프로피온산(Propionic acid, C3)으로 젖산을 대사한다(Ohashi et al., 2001; Tsukahara et al., 2006). 대장 발효의 활성이 증가하면 분 중의 pH가 감소하며 대장발효의 주요 산물인 SCFA는 대장의 운동성에 중요한 역할을 한다. 따라서, 대장 근육의 연동성을 유지시켜주기 위하여 SCFA 생성을 높이는 것이 필요하며 이러한 과정은 생균제가 설사를 치료하는 기작 중 하나이다.

장 내 세균 숲에서 특히, 비피도박테리아와 락토바실러스는 소화관 상부에서 분해되지 않은 영양소의 대장 미생물 발효를 진행하여 대장의 pH를 감소시킨다. 대장에서 낮아진 pH는 공생 미생물의 증식과 생존을 자극하고 산성 조건을 선호하고 상피세포, 대장 및 위장에서 성장하는 일부 유해균의 생장을 억제한다. 장 내 세균 숲은 항균물질인 박테리오신을 생성하며 이는 경쟁적인 유해세균의 생존을 억압하는 효과가 있다. 체외배양 실험(in vitro)에서 생균제로부터 생성된 박테리오신이 장 세포에 도달하여 소화관 벽에 부착 기생하는 E. coli O157:H7 병원체의 능력을 감소시키는 효과가 관찰되었다.

한편, 축사에서 악취 제거와 관련한 생균제는 다양한 종류가 알려져 있지만, 농민들이 피부로 느낄 수 있는 실질적인 효능이 확실하게 알려진 제품은 아직 없는 것으로 보고되었다. 이에 본 발명자들은, 축사에서 악취 제거 방법에 대하여 연구를 진행하던 중, 지렁이 분변토로부터 분리한 바실러스 서브틸리스(acillus subtillis)외 2가지 복합생균제재(BSCP)를 이용하는 경우, 축사 내 악취 저감을 할 수 있다는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제10-2012-0068204호

본 발명의 목적은 지렁이 분변토로부터 생균제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 지렁이 분변토에서 분리된 미생물을 포함하는 가축 사료용 생균제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 지렁이 분변토에서 분리된 미생물을 포함하는 가축분뇨 악취저감용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생균제 조성물을 포함하는 가축용 사료를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 일 측면은,

1)지렁이 분변토를 열처리하는 단계;

2)상기 열처리된 지렁이 분변토로부터 바실러스과의 균주를 분리하는 단계;

3)상기 2)단계의 열처리된 지렁이 분변토에 상기 2)단계의 분리된 바실러스과의 균주를 재접종하는 단계; 및

4)상기 3)단계의 지렁이 분변토에서 바실러스과(Bacillaceae), 스핑고박테리움과(Sphingobacteriaceae) 및 산토모노(Xanthomonadaceae) 균주를 분리하는 단계;를 포함하는 가축 사료용 생균제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일측면에서는 상기 열처리에서 1000℃ 내지 3000℃에서 30분 내지 3시간 수행될 수 있고, 바람직하게는 1500℃에서 1시간 수행할 수 있다.

또한, 상기 2)단계 및 3)단계의 바실러스과의 균주는 서브틸리스 균주(Bacillus subtillis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일측면에서는 지렁이 분변토로부터 분리된 바실러스과(Bacillaceae), 스핑고박테리움과(Sphingobacteriaceae) 및 산토모노(Xanthomonadaceae) 균주를 포함하는 가축 사료용 생균제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 생균제는 가축의 소화기능을 개선하여, 가축분뇨 내의 암모니아를 감소하여 가축분뇨의 악취를 저감할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면은 지렁이 분변토로부터 분리된 바실러스과(Bacillaceae), 스핑고박테리움과 (Sphingobacteriaceae) 및 산토모노(Xanthomonadaceae) 균주를 포함하는 가축분뇨의 악취저감용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 일측면은 본 발명의 상기 생균제 조성물을 포함하는 가축용 사료에 관한 것이다.

상기 생균제 조성물은 가축용 사료 총 중량 대비 0.1% 내지 1%이 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.2 내지 0.5%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 복합생균제는 동물의 대장에서 유해한 세균수의 증식을 억제함으로써 동물의 건강을 증진시킴과 동시에 악취의 발생을 억제하여 동물복지 향상 및 농가소득 증대에 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 지렁이분변토에서 603개의 세균 숲에 관한 유전자 발현을 분석한 결과이다.
도 2은 본 발명의 복합 생균제 섭취 후 배설된 신선한 계분의 NH₃ 감소율을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 복합 생균제 섭취 후 배설된 계분의 실온에서 5일 동안 방치 후 NH₃ 감소율을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 따라서, 본 발명은 지렁이 분변토로부터 가축 사료용 생균제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 지렁이 분변토를 열처리한 후, 상기 지렁이 분변토로부터 바실러스과의 균주를 분리하고, 열처리된 지렁이 분변토에 분리된 바실러스과의 균주를 재접종하고, 지렁이 분변토에서 바실러스과(Bacillaceae), 스핑고박테리아움과(Sphingobacteriaceae) 및 산토모노(Xanthomonadaceae) 균주를 분리하여 제조할 수 있다.

보다 구체적으로, 열처리는 1500℃에서 1시간을 수행할 수 있고, 상기 바실러스과의 균주는 바실러스 서브틸리스 균주일 수 있다.

본 발명의 용어 복합 생균제(BSCP)는 지렁이 분변토에서 분리한 바실러스과, 스핑고박테리아움과 및 산토모노(Xanthomonadaceae) 균주를 포함하는 생균제를 의미하는데, 본 발명에서는 상기 복합 생균제를 포함하는 가축사료용 생균제 조성물을 제공할 수 있다.

보다 구체적으로, 바실러스과 균주는 k__Bacteria, p__Firmicutes, c__Bacilli, o__Bacillales, f__Bacillaceae, g__Bacillus일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니고, 스핑고박테리움과 균주는 k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Sphingobacteriia; o__Sphingobacteriales; f__Sphingobacteriaceae; g__일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 산토모노 균주는 k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteobacteria; o__Xanthomonadales; f__Xanthomonadaceae; g__Lysobacter일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 복합 생균제(BSCP)를 섭취한 동물의 분에서 유해한 세균수가 낮아 지는데, 본 발명의 복합 생균제(BSCP)가 맹장에서 짧은 사슬지방산의 생성으로 장 내 세균 숲을 유지해줌과 동시에 유해세균의 장 점막에 대한 부착 방지를 유도하여 유해세균을 사멸시킬 수 있다. 생균제의 장 세균 숲 유지 기능은 영양소와 장 점막의 부착 부위에 대하여 유해세균과 경쟁하고 있기 때문에 유해세균의 집단을 낮춤과 동시에 유해세균에 대한 활성물질인 박테리오신(bacteriocin)을 분비하고 각종 유기산과 기타 미생물에 대한 기질을 생성하고, 기질은 병원균에 의한 장 군락화를 억압할 수 있다. 즉, 본 발명의 복합 생균제(BSCP)를 섭취한 동물의 분에서 유해한 세균수가 낮아진 점은 맹장 세균 숲에서 유익한 미생물 수가 높아져서 강력한 항균활성 작용을 수행하였기 때문이다.

따라서, 본 발명의 생균제에 의하여 장내 소화 기능을 개선시켜, NH₃가스의 감소를 유도하여 가축분뇨의 악취를 저감시킬 수 있다. 따라서, 본원 발명의 생균제 조성물을 악취저감용 조성물로 이용가능하다.

본 발명에서 동물 또는 가축은 소, 돼지, 말 및 닭 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예에 의해 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예 및 실험예는 본 발명의 이해를 위해 예시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하지는 아니하며, 하기 실시예는 전부 또는 일부가 선택적으로 조합되어 다양한 변형이 이루어질 수 있도록 구성될 수도 있다

< 실시예 1>복합 생균제( BSCP )의 제조

복합생균제(BSCP)의 제조를 위하여, 지렁이 분변토를 1500℃의 고온 하에서 1시간 열처리를 실시하여 유해균을 사멸하였다. 그 후 분변토로부터 Bacillus subtillis를 분리한 후, 상기 균주를 열처리된 분변토에 다시 접종하여 분변토에 존재하는 추가적인 2종류의 균주를 재 활성화하여 Bacillus subtillis 외 2가지 균주를 포함하는 복합 생균제(BSCP)를 제조하였다. 존재하는 균주의 명칭은 세균 숲에 관한 유전자 발현(microbiota)을 분석한 결과 603개의 세균 숲에 관한 유전자 발현(microbiota)을 분석한 결과 상위 6번째 까지의 균주로써 바실러스과 균주(k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; o__Bacillales; f__Bacillaceae; g__Bacillus); 스핑고박테리움과 균주(k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Sphingobacteriia; o__Sphingobacteriales; f__Sphingobacteriaceae; g__) 및 산토모노균주(k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteobacteria; o__Xanthomonadales; f__Xanthomonadaceae; g__Lysobacter )로 나타났으며 이는 장내세균 및 토양환경 세균으로 구성되었음을 확인하였다 (하기 도 1 참조).

< 실시예 2>본 발명의 복합생균제의 악취저감 효과 확인

1. 실험설계 및 사양관리

50주령의 갈색산란계(Hyline brown) 197마리를 이용하여 강원대학교 동물사육장 철제 3단 산란 케이지에서 1주일의 적응기를 거친 후 6주(51주-56주령)동안 실험에 사용하였다. 4개의 처리구로 구분하여 각 처리구 당 60마리씩 임의 배치 후, 케이지 당 한 마리씩 사용하였다. 실험 처리구는 대조군(생균제를 포함하지 않는 처리군), T1(상업용 생균제 0.1%), T2(BSCP 0.3%), T3(BSCP 0.5%)으로 구분하였다. 한국가축사양표준 가금(2012)에 의해서 권장된 영양소 요구량을 충족할 수 있도록 배합된 사료를 무제한 급여하였다. 물과 실험사료는 무제한 급여하였으며 18시간(08:30-24:30) 점등을 실시하였다.

2. 분 암모니아, pH, 미생물

일반사료를 섭취 후 배설된 신선한 계분 2,500 g을 polycarbonate 개방 상자(폭 27 × 직경 22.5 × 높이 13.5 cm)에 담아서 25℃에서 0(개시), 3, 5일 동안 보관하였다. 발생하는 암모니아 농도를 계분이 담긴 상자로부터 3 내지 5 cm 높이에서 Gas sampling pump GV-100S (Gastec, Japan)를 이용하여 측정하였다. pH는 암모니아를 측정한 바로 직후, 계 분에서 개시 일 및 5일째에 각각 pH 미터(Eco testr pH1, Singapore)를 사용하여 측정하였다. 계분에서 유해세균수의 변화를 조사하기 위하여 암모니아를 측정하기 전과 측정 후 계분 1g을 멸균된 혐기성 생리식염수(phosphorus buffered saline; PBS 0.1 M, pH 7.0)와 혼합해서 10배 희석(1:9, wt/vol)하였다. 계수를 위하여 동일한 생리식염수에서 일련의 희석을 계속하였다.

모든 절차는 anaerobic chamber (5% hydrogen, 5% CO₂, balanced nitrogen)에서 혐기상태로 이루어졌다. 배양은 희석된 10^-2 ~ 10^-7에서 각각 100 uL씩을 분주하여 멸균된 평판 선택배지 즉 Salmonella (SS agar, Difco); E. coli (McConkey purple agar, Difco); Coliform bcteria (Violet red bile agar, Difco); Total aerobic bacteria 배지(Nutrient agar, Difco)에서 실행하였다. 37℃에서 24시간 호기성 조건으로 배양한 후 각각의 평판배지에서 미생물 카운터로써 클로니의 수를 조사하였다. 미생물 군락의 수는 분 g당 균수(cfu, colony forming unit/계분 g)로써 상용로그를 이용하여 제시하였다.

3. 결과 확인

( 1)분 암모니아, PH 결과

본 발명의 복합 생균제(BSCP)를 급여 후 배설된 신선한 계분을 25℃에서 5일간 방치하면서 조사한 암모니아(NH₃) 농도의 변화는 표 1에 나타내었다.

표 1, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 방치 일자별로 암모니아 발생은 대조군, T1과 비교할 때 본 발명의 복합 생균제 첨가군에서 농도 의존적으로 뚜렷하게 줄어들었으며 각 처리구 사이의 유의차이가 있음을 확인하였다(p<0.05). 신선한 분의 경우 본 발명의 복합생균제를 섭취한 T2, T3에서 63.39% 낮아졌음을 확인하였으며 본 발명의 복합생균제 0.5%를 섭취한 T2, T3에서 5일간 방치하였을 때 각각 75.67, 68.56% 낮아짐을 확인하였다.

신선한 분의 pH는 T1, T2, T3에서 각각 8.6, 8.6, 8.5, 8.5로써 처리구 사이의 차이가 없었으나 5일 간 방치한 계분에서 측정한 pH는 각각 9.7, 9.4, 9.3, 9.1로써 생균 복합제를 섭취한 처리군이 대조군, T1에 비해서 유의하게 낮아짐을 확인하였다(p<0.05).

표 1. BSCP 섭취 후 신선한 계분의 25℃에서 5일간 방치 일 수에 따른 암모니아 농도의 변화 (ppm)
방치일 수	대조군	T1	T2	T3	PSEM
개시	1.83^a	1.33^a	0.67^b	0.67^b	0.147
1 일	13.67^a	11.00^b	10.00^b	9.67^b	0.592
3 일	260.3^a	123.3^b	126.0^b	63.33^c	2.962
5 일	275.7^a	203.3^b	163.3^c	86.67^d	7.166

^a,b,c,d(p<0.05).

( 2)분 미생물 결과 확인

본 발명의 복합 생균제(BSCP)를 섭취한 산란계로부터 수집한 계분을 25℃에서 5일간 방치 후 측정한 세균수의 변화는 표 2(BSCP 섭취 후 배설된 신선한 계분의 25℃에서 5일간 방치, 가스 측정 전, 후 미생물의 변화), 도 2 및 도 3에 나타내었다

표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 복합 생균제(BSCP)를 섭취 후 배설된 신선한 계분(암모니아 측정 전)에서 대장균, 총호기성균, 콜리폼균, 살모넬라 균수는 대조군, T1과 비교할 때 낮았으며 특히, 대조군과 비교할 때 각각 22.07, 19.08, 21.27, 15.06% 유의하게 낮아짐을 확인하였다(p<0.05). 본 발명의 복합 생균제를 섭취 후 배설된 분을 5일간 방치 후 계분(암모니아 측정 후)에서 대장균, 총호기성균, 콜리폼균, 살모넬라 균수는 대조군, T1과 비교할 때 낮았으며 특히, 대조구군과 비교할 때 각각 8.58, 17.78, 14.33, 14.83% 유의하게 낮아짐을 확인하였다(p<0.05).

	대장균		총호기성균		콜리폼균		살모넬라
	측정 전	측정 후	측정 전	측정 후	측정 전	측정 후	측정 전	측정 후
대조군	6.89^a	8.16^a	7.86^a	9.11^a	6.77^a	7.12^a	4.78^a	6.88^a
T1	6.38^b	7.89^b	7.44^b	8.22^b	6.04^b	6.82^b	4.59^b	6.51^b
T2	5.98^c	7.74^c	6.56^c	7.97^c	5.50^c	6.53^c	4.33^c	6.16^c
T3	5.37^d	7.46^d	6.36^d	7.49^d	5.33^c	6.10^d	4.06^d	5.86^d
PSEM	0.057	0.042	0.045	0.034	0.048	0.028	0.040	0.026

^a,b,c,d(p<0.05). (산란계 51-56주) (log10 cfu/g)

Claims

1)지렁이 분변토를 열처리하는 단계;
2)상기 열처리된 지렁이 분변토로부터 바실러스과의 균주를 분리하는 단계;
3)상기 2)단계의 열처리된 지렁이 분변토에 상기 2)단계의 분리된 바실러스과의 균주를 재접종하는 단계; 및
4)상기 3)단계의 지렁이 분변토에서 바실러스과 균주(Bacillaceae), 스핑고박테리움과 균주(Sphingobacteriaceae) 및 산토모노균주(Xanthomonadaceae) 균주를 분리하는 단계;를 포함하는 가축 사료용 생균제의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 분변토의 열처리는 1000℃ 내지 2000℃에서 30분 내지 3시간 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.

제1항에 있어서, 상기 바실러스과의 균주는 서브틸리스 균주(Bacillus subtillis)인 것을 특징으로 하는, 방법.

지렁이 분변토로부터 분리된 바실러스과(Bacillaceae), 스핑고박테리움과 균주(Sphingobacteriaceae) 및 산토모노(Xanthomonadaceae) 균주를 포함하는 가축 사료용 생균제 조성물.

제 4 항에 있어서, 상기 생균제는 가축분뇨의 악취를 저감하는 것을 특징으로 하는 가축 사료용 생균제 조성물.

지렁이 분변토로부터 분리된 바실러스과(Bacillaceae); 스핑고박테리움과 균주(Sphingobacteriaceae) 및 산토모노(Xanthomonadaceae) 균주를 포함하는 가축분뇨의 악취저감용 조성물.

제 4 항의 생균제 조성물을 포함하는 가축용 사료.

제 7 항에 있어서, 상기 생균제 조성물은 가축용 사료 총 중량대비 0.1% 내지 1%이 포함된, 가축용 사료.