KR20190009944A - 형광 자성입자를 이용한 비스페놀 a 바이오센싱 키트 - Google Patents

형광 자성입자를 이용한 비스페놀 a 바이오센싱 키트 Download PDF

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Abstract

전처리 단계를 거치지 않고, 단시간에 농도 측정이 가능하며, 1회의 분석으로 시료 내에 존재하는 여러 가지 환경호르몬들을 동시에 다중 분석할 수 있는 형광 자성입자 배열을 이용한 비스페놀 A(Bisphenol A; BPA) 바이오센싱 키트를 제시한다. 그 키트는 비스페놀 A 친화성 리간드(ligand)를 부착한 형광 자성입자 형태의 다중분석 플랫폼 비스페놀 A 바이오센싱 키트에 있어서, 비스페놀 A 친화성 펩타이드(peptide) 리간드의 특이적 반응을 이용하여 여러 성분이 혼합되어 있는 임상 시료, 추출물 등의 복합 시료에서 간단하게 비스페놀 A 농도를 측정할 수 있다.

Description

형광 자성입자를 이용한 비스페놀 A 바이오센싱 키트{Bisphenol A biosensing kit using fluorescent magnetic particles}
본 발명은 비스페놀 A 바이오센싱 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비스페놀 A(Bisphenol A; BPA) 친화성 리간드(ligand)를 부착한 형광 자성입자 형태의 다중분석 플랫폼 비스페놀 A 바이오센싱 키트로서, 비스페놀 A 친화성 펩타이드(peptide) 리간드의 특이적 반응을 이용하여 여러 성분이 혼합되어 있는 임상 시료, 추출물 등의 복합 시료에서 간단하게 비스페놀 A 농도를 측정할 수 있는 바이오센싱 키트에 관한 것이다.
환경호르몬은 환경에 노출된 화학물질이 생체 내로 유입되어 마치 호르몬처럼 작용하는 것으로, 학술적으로는 내분비계의 정상적인 기능을 방해하여 호르몬 분비에 변화를 일으키는 내분비계 장애물질(endocrine disruptors)을 총칭한다. 호르몬은 보통 내분비계에서 호르몬 수용체와 결합하는 방식에 의해 인체의 대사 반응을 조절한다. 그런데, 환경호르몬은 정상적인 호르몬과 경쟁적으로 호르몬 수용체와 결합하기 때문에, 내분비계에서 정상적인 호르몬에 의해 조절되는 대사 반응을 교란한다. 특히 저농도에서 내분비계의 기능을 조절하는 호르몬과 흡사하게, 환경호르몬 역시 매우 낮은 농도에서 내분비계의 정상적인 기능을 저해하므로 기타 환경독성물질에 비해서 그 위해성이 더욱 크다.
환경호르몬은 그 종류가 광범위하며, 매년 수십만 종의 비생체성분(xenobiotics)이 합성됨에 따라 그 수가 계속 증가하고 있다. 환경호르몬은 토양, 수질 및 대기 등에 지속적으로 방출되어 먹이사슬을 통해 생체 내에 직간접적으로 농축된다. 농축된 환경호르몬은 면역성 저하, 정자수 감소, 호르몬 관련 암 유발, 선천적 기형, 불임, 자궁내막증 등을 유발한다. 특히 사람의 생식기능에 영향을 미치고 성인에 비해 태아에게 심각한 영향을 미치므로, 그 폐해가 세대를 통해 지속적으로 파급되어 다른 환경오염물질과는 구별되는 심각성을 지니고 있다.
한편, 비스페놀 A는 우리 생활과 밀접한 관련이 있다. 즉, 비스페놀 A는 실생활에 밀접한 제품들로부터 직접적인 노출이 되고 있어, 대표적인 환경호르몬의 하나이다. 비스페놀 A(2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane, BPA)는 두 개의 히드록시페닐(hydroxypheny)기를 가진 비스페놀에 속하는 화합물로써 (CH3)2C(C6H4OH)2의 화학식을 가진다. 비스페놀 A는 유기용매에는 잘 녹지만, 물에는 낮은 용해도(120~130 ppm, 21.5℃)를 보이는 특징을 띄고 있다. 비스페놀 A는 1957년부터 상업화되어 사용되고 있으며, 비스페놀 A-기반 플라스틱은 물병과 같은 식품들의 플라스틱 포장재, 금속 식품 캔의 코팅재, 스포츠 용품, 치과용 실란트, CD 그리고 DVD 같이 다양한 생활물품에 사용되고 있다.
비스페놀 A가 인체에 미치는 영향은 에스트로젠 호르몬 교란에 의한 비만 관련 영향, 뇌 속의 해마에 영향을 주어 기억력 이상, 도파민 시스템에 영향, 갑상선 호르몬 수용체와 결합하여 기능 이상, 암(특히 유방암) 발생 관련성, 정자 수 감소 및 생식기 변이 등의 현상이 있다. 이외에도 어린이 천식 관련, 심장 질환 관련, 심혈관 질환 관련 등이 알려져 있다. 폐기되는 플라스틱에서 유출된 비스페놀 A가 토양이나 수질 오염을 초래하고, 먹이 사슬을 통해 식물, 동물, 심지어 미생물 생태에도 영향을 미친다. 토양 내의 비스페놀 A가 식물 및 미생물의 질소 고정에 영향을 미치고, 다양한 동물에 노출되어 성장, 분화, 생식에 영향을 미친다. 이로 인하여. 다양한 변이 동물체에 대한 보고가 있어 왔다.
이와 같이, 비스페놀 A가 내분비계 교란물질로써, 신체에 흡수되었을 때 호르몬 같이 작용한다는 사실이 밝혀짐에 따라, 2008년 이후에는 비스페놀 A 사용에 대하여 규제하고 있다. 최근 유럽연합(EU)은 2014년 6월, 완구의 난연물질 3종 및 비스페놀 A 사용 제한을 규정한 Directive 2014/79/EU, Directive 2014/81/EU 법령을 발표하였다. US FDA(Food and Drug Administration)은 비스페놀 A를 젖병과 유아용품에 사용하는 것을 금지하고 있다. 비스페놀 A 규제 내용은 36개월 미만의 아동 대상의 입으로 사용하도록 의도된 완구에 대하여 0.1 ppm 이하로 되어 있다. 아주 미량의 낮은 농도에서 미치는 영향이 불분명하다고 해도, 세계 각국은 비스페놀 A를 규제하고 있으며 이들의 분석 모니터링이 필요한 상황이다.
현재, 비스페놀 A의 분석은 주로 가스/액체 크로마토그래피(HPLC, LC/MS, GC/MS)를 이용하고 있다. 그런데, 일반적인 크로마토그래피 방법은 시료의 전처리가 필요하며, 측정 시간이 비교적 길고, 검출 농도의 한계도 제법 높다. 이러한 단점은 다른 화학물질들의 미량 농도 측정 과정에서도 흔히 발생하는 문제점들과 동일하다. 크로마토그래피 방법 이외에, 비스페놀 A는 PA 친화성 펩타이드를 금 전극에 신호감지부로 이용한 전기화학 센싱 개발(Biosensors & Bioelectronics, 2014) 및 비스페놀 A 친화성 펩타이드가 융합된 재조합단백질을 그래핀 표면에 흡착시켜 센싱 프로브로 활용하는 임피던스 센싱 개발(Biosensors & Bioelectronics, 2015) 등이 있다.
생물학적인 시료들의 분석에 유리한 효소면역 분석법(ELISA) 키트가 판매되고 있다. ELISA는 국내등록특허 제10-1551984호 등에서 혈류 분석 등에 많이 적용되고 있다. 분석대상인 비스페놀 A는 작은 분자량 물질(hapten)이므로 경합(competitive) ELISA 방법을 사용하고 있다. 항체는 다세포군(polyclonal) 항체(PAb)를 적용하고 있다. 비스페놀 A에 대한 특이성이 높은(specific) 단세포군(monoclonal) 항체(MAb) 개발이 쉽지 않다. 하지만, 특이성이 높은 단세포군(monoclonal) 항체(MAb)가 개발되어야 안정적인 ELISA 제품을 만들 수 있고, 전처리 과정을 줄여주거나 좀 더 정밀한 분석이 가능하다. 현재까지는 아직 이런 항체(MAb)가 개발되지 않고 있고, 제조하는 데 어려움이 있다.
ELISA로는 하나의 시료에서 한 가지 물질만을 분석할 수 있을 뿐, 한 시료 내의 여러 가지 환경 호르몬들을 측정대상으로 동시에 분석할 수 없다. 이에 따라, 수백 종에 이르는 환경호르몬 분석의 효율을 높이기 위하여, 한 시료에서 동시에 각 종 환경호르몬을 한 번에 분석할 수 있는 동시 다중 분석(multiplex) 플랫폼 개발이 필요하다. 예를 들어, 표적에 선택적으로 친화성을 보이는 다양한 생물학적 리간드 기반의 바이오센싱 키트가 연구되고 있고, 현재까지 항체, DNA, 펩타이드 등의 alkylphenol, polychlorinated biphenyl, isoproturon 등이 연구대상이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 전처리 단계를 거치지 않고, 단시간에 농도 측정이 가능하며, 1회의 분석으로 시료 내에 존재하는 여러 가지 환경호르몬들을 동시에 다중 분석할 수 있는 형광 자성입자를 이용한 비스페놀 A 바이오센싱 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 과제를 해결하기 위한 형광 자성입자 배열을 이용한 비스페놀 A 바이오센싱 키트는 비스페놀 A(Bisphenol A; BPA) 친화성 리간드(ligand)를 부착한 형광 자성입자 형태의 다중분석 플랫폼 비스페놀 A 바이오센싱 키트에 있어서, 비스페놀 A 친화성 펩타이드(peptide) 리간드의 특이적 반응을 이용하여 여러 성분이 혼합되어 있는 임상 시료, 추출물 등의 복합 시료에서 간단하게 비스페놀 A 농도를 측정할 수 있다.
본 발명의 형광 자성입자(MP)를 이용한 비스페놀 A 바이오센싱 키트에 의하면, 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA)에 친화성 리간드(ligand)를 부착한 형광 자성입자 배열의 다중분석(multiplexing) 플랫폼을 마련함으로써, 전처리 단계를 거치지 않고, 단시간에 농도 측정이 가능하며, 1회의 분석으로 시료 내에 존재하는 여러 가지 환경호르몬들을 동시에 다중 분석할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 바이오센싱 키트의 특성을 설명하기 위한 모식도이다.
도 2는 본 발명에 적용되는 비스페놀 A(BPA) 및 4,4-Bis(4-hydroxyphenyl)valeric acid(BHPVA)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 BSA conjugation with BHPVA(BSA-BHPVA,2B)의 합성원리를 나타내는 반응식이다.
도 4는 본 발명에 의한 BPA, BHPVA 및 BHPVA-BSA(2B)의 UV-Vis 흡수분광 분석 결과를 나타내는 그래프 및 native PAGE의 결과이다.
도 5는 본 발명에 의한 중합체에 비오틴(biotin)이 추가 도입된 Biotin-BSA-BHPVA(3B) 중합체 합성 반응식이다.
도 6은 본 발명에 의한 형광 자성입자(MP)에 대한 비스페놀 A 항체의 흡착등온선 및 3B 중합체와 다양한 농도의 비스페놀 A 항체가 고정화된 형광 자성입자(MP)의 반응으로부터 얻어진 형광신호를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 의한 형광 자성입자(MP)의 표면 형태를 설명하기 위한 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) 사진이다.
도 8은 본 발명에 의한 다양한 농도에서 준비한 3B 중합체와 BPA-Ab@MP의 반응에 따른 형광신호(MFI) 검출량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 의한 비스페놀 A와 3B 중합체의 BPA-Ab@MP에 대하여 경쟁적 흡착 반응을 이용하여 비스페놀 A 농도에 따른 NET MFI 값을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 의한 3가지 샘플 도입 방식의 최적화(A) 및 경쟁 반응 시간의 최적화(B) 및 SA-PE과 배양(incubation) 시간의 최적화(C)의 데이터를 나타내는 그래프들이다.
도 11은 본 발명에 적용되는 간섭후보 물질들이다.(A) 비스페놀 A (Bisphenol A, BPA), (B) 비스페놀 B (Bisphenol B, BPB), (C) 비스페놀 F (Bisphenol F, BPF), (D) 2, 4-디니트로페놀 (2,4-Dinitrophenol, DNP), (E) 페놀(phenol), (F) 4-클로로페놀(4-Chlorophenol, CP), (G) p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid, HBA) 및 (H) 프로토카테큐산(protocatechuic acid, PCA).
도 12는 본 발명에 의한 비스페놀 A 및 그 유도체의 농도에 따른 MFI값 및 BPA-Ab@MP 기반 바이오센싱 키트의 상대적인 반응성을 나타내는 그래프들이다.
도 13은 본 발명에 의한 형광 자성입자(MP)의 동적측정범위(DDR) 및 최소검출한계(LDL)를 설명하기 위한 그래프이다.
도 14는 본 발명에 의한 형광 자성입자의 표면 상태에 따른 3B 중합체의 비특이적 흡착정도를 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명에 의한 펩타이드 서열 1, 2 및 3의 형광신호(MFI) 값을 나타내는 그래프이다.
도 16은 본 발명에 의한 형광 자성입자에 대한 BPA-peptide의 흡착등온선을 보여주는 그래프이다.
도 17은 본 발명에 의한 형광 자성입자의 표면 형태를 나타내는 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 18은 본 발명에 의한 형광신호 최적화를 위하여 3B 중합체 몇 SA-PE (Streptavidin-Phycoerythrin) 농도 최적화 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 19는 본 발명에 의한 비스페놀 A 및 그 유도체의 농도에 따른 MFI값 및 BPA-peptide@MP 기반 바이오키트의 상대적인 반응성을 나타내는 그래프들이다.
도 20은 본 발명에 의한 형광 자성입자(MP)의 동적측정범위(DDR) 및 최소검출한계(LDL)를 나타내는 그래프들이다.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 다음에서 설명되는 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술되는 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이다.
본 발명의 실시예는 비스페놀 A(Bisphenol A, BPA)에 친화성 리간드(ligand)를 부착한 형광 자성입자 배열의 다중분석(multiplexing) 플랫폼을 마련함으로써, 전처리 단계를 거치지 않고, 단시간에 농도 측정이 가능하며, 1회의 분석으로 시료 내에 존재하는 여러 가지 환경호르몬들을 동시에 다중 분석할 수 있는 바이오센싱 키트를 제시한다. 이를 위해, 형광 자성입자 배열의 다중분석 플랫폼을 가진 바이오센싱 키트의 구조 및 제조방법에 대하여 상세하게 살펴보고, 상기 키트를 활용하여 비스페놀 A를 분석하는 과정을 각각의 단계로 구분하여 구체적으로 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 의한 바이오센싱 키트의 특성을 설명하기 위한 모식도이다.
도 1에 의하면, 본 발명의 실시예에 의한 바이오센싱 키트에 적용되는 시료는 다음과 같은 사례가 있다. 첫째, 비스페놀 A에 노출된 사람의 임상 시료(serum/plasma, Urine 등) 및 독성 시험 등의 바이오 시료이고, 둘째는 플라스틱 포장재 추출물 및 원료 내용 물질, 포장 내용물의 가공 식품 및 음료수, 일회용품 용기 및 그 추출물 등의 분석 시료이다. 셋째 시료는 토양 오염이나 수질 오염을 확인하기 위한 환경 시료 등이다. 상기 사례와 같이 여러 분야의 시료들은 비스페놀 A 측정에 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예는 비스페놀 A 친화성 펩타이드의 특이적 반응을 이용하여 상기 시료들 내에 다른 성분들이 많이 들어 있어도, 전처리를 거의 하지 않고 반응시키고 분석해낼 수 있다. 나아가, 형광 자성입자 배열 방식의 다중분석 플랫폼을 구현한다.
<비스페놀 A 유사 중합체 BSA-BHPVA(2B) 합성>
비스페놀 A의 작은 분자 크기(분자량=228.3 Da)는 캡쳐 프로브(capture probe)와 탐지 프로브(detection probe)에 의한 샌드위치(sandwich) 형태의 비스페놀 A의 인지를 어렵게 할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 경합측정(competitive assay) 형태의 센싱 프로토콜을 제시한다. 경합측정 플랫폼은 크게 경합적 저해(competitive inhibition) 및 경합적 해리(competitive dissociation)가 있다. 그런데, 경합적 해리 측정을 진행할 경우, 표면결합 피분석물(surface-bound analyte)와 용액상 피분석물(solution-phase analyte) 각자가 지니는 프로브(probe) 분자와의 반응성 혹은 친화도가 유사해야 한다. 왜냐하면, 검출 분자와 표면결합 피분석물이 먼저 복합물(complex)을 형성한 후, 용액상 피분석물의 양이 증가함에 따라 상기 복합물로부터의 검출 분자의 유출속도(off-rate)가 해석가능한 범위 내에 있어야 한다. 따라서 경합적 해리보다는 경합적 저해 측정의 프로토콜이 바람직하다.
구체적으로, 카르복실(-COOH) 그룹을 가진 형광 자성입자(Magnetic particle, MP)의 입자 표면에 비스페놀 A의 코어(core) 구조를 유지한 형태로 비스페놀 A를 붙여준다. 형광 자성입자(MP)는 비드(bead) 형태가 바람직하다. 비스페놀 A를 직접적으로 결합시키는 것은 기술적으로도 결합구조를 유지하기 어렵다. 이는 형광 자성입자(MP) 표면의 카르복실 그룹과 결합할 수 있는 비스페놀 A의 화학 작용기(chemical functional group)가 상기 코어 구조에 존재하는 하이드록실(-OH) 그룹 외에는 없기 때문이다.
물론, 카르복실 그룹을 가진 형광 자성입자(MP) 표면에 비스페놀 A를 직접적으로 고정화할 수 있다. 하지만, 비스페놀 A와 같이 크기가 작은 물질(hapten)은 형광 자성입자(MP) 표면과의 근접성(proximity)으로 인해, 비스페놀 A를 인지할 수 있는 항체 등의 프로브(probe) 분자와 비스페놀 A 반응 중에 입체장애(steric hindrance)가 발생할 가능성이 크다. 따라서 비스페놀 A를 형광 자성입자(MP) 표면에 직접 고정화하는 것은 바람직하지 않다. 즉, 비스페놀 A에 긴 고리(long-chain) 링커 혹은 캐리어(carrier) 단백질을 결합시키고 이를 형광 자성입자(MP) 표면에 고정하는 것이 좋다. 비스페놀 A와 캐리어 단백질과의 결합은 비스페놀 A 처럼 분자량이 작은 분자량 물질(hapten)을 항원으로 하여 항체를 만들 때, 면역반응 유도능이 약한 단백질(carrier protein)을 작은 분자량 물질(hapten)과 결합하여 면역원을 만들 때와 유사하다.
도 2는 비스페놀 A(BPA) 및 4,4-Bis(4-hydroxyphenyl)valeric acid(BHPVA)의 화학구조를 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 비스페놀 A의 코어(core) 구조를 그대로 가지고 있으면서, 비스페놀 A에 존재하는 2개의 메틸(methyl) 그룹 중 하나의 말단에 카르복실 그룹이 추가된 형태의 비스페놀 A 유사체(analog) 4,4'-bis(4-hydroxyphenly) valeric acid(BHPVA)를 캐리어 단백질인 BSA(Bovine Serum Albumin)와 결합(conjugation)에 이용한다.
한편, 비스페놀 A 항체는 BPA-BSA(hapten-carrier protein) 중합체를 항원으로 사용하기보다 비스페놀 A 유사체인 BHPVA를 BPA와 결합시킨 BHPVA-BSA(2B)를 항원으로 사용하는 것이 더 효율적이라고 알려져 있다. 왜냐하면, BPA-BSA 형태의 작은 분자량 물질(hapten) 항원을 제작하기 위해서는 비스페놀 A의 하이드록시기(??OH) 그룹이 BSA의 아민(??NH2) 그룹과 반응해야 한다. 이에 따라, BPA-BSA 형태의 작은 분자량 물질(hapten) 제작 과정에서, 비스페놀 A의 코어 구조(core structure)에 구조적 변형이 일어날 가능성이 크기 때문이다. BHPVA-BSA(2B)형태의 중합체를 항원으로 사용하여 얻은 항체는 BHPVA와 비스페놀 A의 모두를 잘 인지한다.
본 발명의 실시예는 BHPVA라는 비스페놀 A와 동일한 코어 순환구조(core cyclic structure)를 가진 물질을 캐리어 단백질에 결합시킨 중합체(conjugate)를 먼저 제작하고 이를 형광 자성입자(MP) 표면에 고정시켰다. 이를 위한 캐리어 단백질로는 전술한 바와 같이 작은 분자량 물질(hapten) 제작에 가장 일반적으로 사용되는 BSA(Bovine Serum Albumin)를 선정하였다.
도 3은 본 발명의 실시예에 의한 BSA-BHPVA(2B)의 합성원리를 나타내는 반응식이다. 도 3에 의하면, 캐리어 단백질 BSA의 lysine 잔기(residue)에 존재하는 아민(-NH2) 그룹과 BHPVA의 카르복실 그룹과의 커플링 반응은 NHS/EDC 물질(chemistry)을 이용하여 진행하였다. 미반응된 BHPVA를 투석 공정을 통해 제거하였다. 반응 종료 후, 회수한 BHPVA-BSA(2B) 중합체의 농도(단백질 농도)를 측정하였고, 0.01M Phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4) 버퍼로 커플링 산물을 1 mg/ml로 희석하고, UV-Vis 흡수 분광 분석을 실시하였다. 동시에 같은 농도의 BSA 용액과 BHPVA 용액도 UV-Vis 흡수분광 분석을 이용하여 비교분석하여 2B 중합체의 합성 여부를 확인하였고, native PAGE를 통해 2B 중합체 생성 여부를 확인하였다.
도 4는 본 발명의 실시예에 의한 BPA, BHPVA 및 BHPVA-BSA의 UV-Vis 흡수분광 분석 결과를 나타내는 그래프 및 native PAGE의 결과이다. 도 4에 의하면, 같은 질량 농도의 BHPVA과 BSA의 최대 흡수 피크(peak)는 모두 280nm 근처에 위치하며, 2B 중합체의 흡수 피크는 red-shift 현상을 보인다. 이를 통해, BHPVA와 BSA 사이에서 이루어진 아미드(amide) 결합에 의해 2B의 흡수 피크 위치가 변하였다고 알 수 있다. 커플링의 성공 여부를 재검증하기 위한 native-PAGE를 이용한 2B 중합체에 의하면, 캐리어 단백질로 사용한 BSA 밴드 위치와 비교하여 비해 2B 중합체의 밴드 위치 변화하였다. 이는 커플링 반응에 의해 캐리어 단백질이 가지는 전하량이 변화했기 때문이다. 즉, 2B 중합체가 함유한 전하량이 많아지고 전기장에서의 드리프트 이동도가 높아짐에 따라 밴드 위치의 변화가 발생하였다. 이에 근거하여 BHPVA가 캐리어 단백질 BSA에 성공적으로 커플링 되었음을 알 수 있었다.
<2B 중합체에 비오틴(biotin)이 추가 도입된 Biotin-BSA-BHPVA(3B) 중합체 합성>
본 발명의 실시예는 시료 내에 존재하는 비스페놀 A의 함량을 직접적으로 측정하는 것이 아니다. 즉, 형광 자성입자(MP)에 고정화된 비스페놀 A 인지 프로브(probe) 물질인 anti-BPA 항체와 결합하는 비스페놀 A의 양이 시료 상에 비스페놀 A와 함께 존재하는 BSA-BHPVA(2B) 중합체와의 경쟁 반응에 의해 결정되는 원리를 이용하여 시료 중의 비스페놀 A 농도를 측정하였다. 이를 위해서, 시료와 비스페놀 A를 인지하는 검출물질인 BPA-Ab@MP 중합체와의 반응 중에 일정량의 2B 중합체를 같이 넣어 주었다. 시료에 존재하는 비스페놀 A 농도에 반비례적으로 BPA-Ab@MP에 결합하는 2B 중합체의 양을 형광신호 측정으로 구할 수 있어야 한다. 본 발명의 실시예는 형광신호물질로 streptavidin-phycoerythrine(SA-PE) 결합(conjugate)을 이용하였고, 이 형광신호물질이 결합할 수 있는 분자(Biotin)가 2B 중합체에 추가적으로 도입하였다.
도 5는 본 발명의 실시예에 의한 중합체에 비오틴(biotin)이 추가 도입된 Biotin-BSA-BHPVA(3B) 중합체 합성 반응식이다. 비오틴(biotin, MW=244.31 Da)은 avidin, streptavidin 등과 특이적으로 결합하는 물질이다. 비오틴(biotin)은 앞에서 설명한 2B 중합체에 형광신호물질인 SA-PE와 특이적 결합을 매개한다. 비오틴(biotin)이 추가 도입된 Biotin-BSA-BHPVA(3B)중합체를 도시된 바와 같다. 이때, 상기 합성은 abcam-ab102867-Biotin(type B) 결합키트(conjugation kit)를 사용하였다.
구체적으로, 3B 중합체는 먼저 Phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)를 이용해서 0.5 mg/mL 농도로 2B 중합체를 준비한다. 그후, 100 μL의 2B 중합체에 포함된 10 μL의 modifier 시약을 이용하여 녹인 후, 이를 100 μg의 비오틴(biotin)을 상기 키트(kit)와 섞어 실온에서 빛을 차단시킨 상태에서 3시간 동안 반응시킨다. 이에 따라, 비오틴(biotin)의 카르복실 및 2B 중합체에 존재하는 아민 그룹간의 커플링 반응이 일어난다. 10 μL의 급냉(quenching) 시약을 가한 후, 실온에서 빛을 차단시킨 상태에서 30분 동안 배양(incubation)한다.
<카르복실 작용기를 지닌 형광 자성입자에 캡쳐 프로브(capture probe) 고정화 조건 확립>
비스페놀 A 인지 항체(BPA-Ab)를 캡쳐 프로브(capture probe)로 도입한 비스페놀 A 항체 기반 바이오센싱 키트의 개발을 위해, 비스페놀 A 항체(BPA-Ab)를 바람직하게는 나노크기의 형광 자성입자에 고정화시키는 조건을 확립할 필요가 있다. 이를 위해 EDC/NHS mediated amine coupling 반응을 통해 -COOH 반응기를 가진 형광 자성입자(MP)와 다양한 농도의 비스페놀 A 항체(BPA-Ab) 용액을 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 세척(washing) 과정을 통해 미반응하거나 약하게 결합한 항체 분자를 제거한다. 이를 통하여, 비스페놀 A 인지항체가 고정화된 형광 자성입자(MP)를 제작하였다.
비스페놀 A 항체가 고정화 형광 자성입자(BPA-Ab@MP)가 계획한 바와 같이 합성되었는지 여부를 검증하기 위해 BPA-Ab@MP를 비오틴(biotin)이 수식된 BSA-BHPVA(3B 중합체) 및 SA-PE와 단계적으로 반응시켰다. 즉 형광 자성입자(MP)에 고정화된 비스페놀 A 항체의 양에 따라 3B 중합체의 흡착량이 결정된다. 다시 흡착된 3B 중합체의 양에 따라 BPA-Ab@MP에 결합되는 SA-PE의 양이 달라지므로, 위와 같은 검증 실험을 통해 3B 중합체의 농도에 비례하는 형광신호를 확인할 수 있다. 이때, 대조군으로는 항체가 고정화되지 않은 순수한 형광 자성입자(bare MP)를 사용하였다.
또한 같은 방법으로 형광 자성입자(MP)에 고정화하는 항체의 양을 최적화하는 실험을 진행하였다. 즉, 형광 자성입자(MP) 표면에 존재하는 카르복실 그룹이 모두 항체 고정화에 사용된다면, 그 조건에서 제작된 BPA-Ab@MP가 3B 중합체 및 SA-PE와의 단계적 흡착 반응 후에 때 발생시키는 형광신호가 최대치에 도달한다.
도 6은 본 발명이 실시예에 의한 형광 자성입자(MP)에 대한 비스페놀 A항체의 흡착등온선 및 3B 중합체와 다양한 농도의 비스페놀 A 항체가 고정화된 형광 자성입자(MP)의 반응으로부터 얻어진 S자 형태의 곡선(sigmoidal curve) 형태의 형광신호를 나타내는 그래프이다. 도 6에 의하면, 다양한 농도의 비스페놀 A 항체가 고정화된 형광 자성입자(MP)에 3B 중합체를 인지하는 정도를 SA-PE 형광신호를 통해 측정함으로써 최대의 타겟(target) 인지능을 가질 수 있는 최적의 캡쳐 프로브(capture probe) 고정화 조건을 확립하였다.
확보한 흡착등온선을 통해 항체가 EDC/NHS mediated amine coupling 반응을 통해 형광 자성입자(MP)에 고정화될 경우, 형광 자성입자(MP) 당 최대로 고정화되는 항체 분자의 수(Qm)는 96×106개이며, 항체와 형광 자성입자(MP) 간의 결합 친화력을 나타내는 해리상수(dissociation constant, Kd)는 10.3 μg/mL임을 확인하였다. 이는 항체가 형광 자성입자(MP)와 반응할 때 항체의 평형농도가 Kd의 4배(c/Kd = 4)인 41.2 μg/mL 이상일 경우, 형광 자성입자(MP)의 표면을 80% 이상 덮을 수 있음(q/Qm = 0.8)을 의미한다. 또한, 형광 자성입자(MP)에 고정화된 항체의 밀도에 따른 인지능을 살펴본 결과, 90% 이상의 형광 자성입자(MP) 표면 커버리지(coverage)를 보이는 항체 고정화 형광 자성입자(MP)에서 가장 우수한 동적측정범위를 가질 수 있음을 확인하였다(80 μg/mL 의 항체 농도). 다시 말해, 항체를 캡쳐 프로브(capture probe)로 활용하는 경우에 대한 최적의 캡쳐 프로브(capture probe) 고정화 조건이 확립된 것이다.
<비스페놀 A 항체가 최적 농도에서 고정화된 형광 자성입자(BPA-Ab@MP) 제작>
본 발명의 실시예는 앞에서 기술한 바와 같은 방법으로 형광 자성입자(MP)에 고정화할 비스페놀 A 항체의 양을 결정하고 다음과 같은 방법으로 항체가 고정화된 형광 자성입자(BPA-Ab@MP)를 제작하였다. 먼저, 100 μL의 카르복실 작용기를 지닌 형광 자성입자(MP)를 1.5 mL 튜브에 넣고 자석으로 형광 자성입자를 분리하여 수집한다. 그후, 80 μL의 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2, 10 μL의 50 mg/mL NHS, 10 μL의 50 mg/mL EDC를 순서대로 넣고 충분히 섞은 후에 실온에서 빛을 차단시킨 상태에서 20분 반응시켜 형광 자성입자(MP) 표면에 존재하는 카르복실 작용기를 활성화한다.
이어서, 자석으로 형광 자성입자를 수집 후, 활성화된 카르복실 작용기를 지닌 형광 자성입자(MP)와 250 μL의 BPA-Ab(80 μg/mL) 용액을 혼합하여 2시간 실온에서 반응시킨다. 0.01 M PBS, pH 7.4로 세척(150 μL * 2회) 과정을 통해 미반응한 혹은 약하게 반응한 항체를 제거한다. 250 μL의 블록킹 용액(blocking solution)을 (0.02% Tween-20, 1% BSA가 포함된 0.01 M PBS 용액, pH 7.4) 형광 자성입자(MP)에 넣고 실온에서 빛을 차단시킨 상태에서 30분간 반응시켜 형광 자성입자 표면 반응에 참가하지 않은 카르복실 작용기를 블록킹(blocking)한다. 0.01 M PBS, pH 7.4 용액으로 2회 세척(washing) 후 (각각 150 μL), 150 μL 의 0.01 M PBS, pH 7.4 넣고 4℃에서 보관한다.
도 7은 본 발명의 실시예에 의한 형광 자성입자(MP)의 표면 형태를 설명하기 위한 주사전자현미경(SEM) 사진이다. 왼쪽은 순수한 형광 자성입자(MP)이고 오른 쪽은 antibody-modified 형광 자성입자(MP)이다. 도시된 바와 같이, 순수한 구형 형광 자성입자(MP)는 크기가 균일하며 균일한 표면을 지니고 있으며, 단백질의 표면 커플링을 용이하게 할 수 있는 미세 기공(pore)이 표면에 존재하였다. 항체 고정화 반응을 거친 형광 자성입자(MP)의 표면은 항체 단백질 층의 형성으로 표면의 거칠기(roughness) 및 전체적인 입자 크기가 증가하였다.
<비스페놀 A 항체가 고정화된 형광 자성입자의 3B 중합체 인지능 확인>
비스페놀 A 항체가 고정화된 형광 자성입자(BPA-Ab@MP)의 3B 중합체 인지 여부를 확인하기 위한 실험은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, 4℃에서 보관 중인 BPA-Ab@MP 서스펜션(suspension)을 0.01 M PBS, pH 7.4로 25배 희석한 자석입자(MP) 서스펜션(suspension) 용액 50 μL를 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 넣고, 0~100 μg/mL 범위에서 준비한 3B 중합체 용액 50 μL를 가한 후, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 그후, BPA-Ab@MP에 캡쳐(capture)되지 않은 3B 중합체를 자성분리(magnetic separation)로 분리하여 제거하였다. 상기 웰(well)에 잔존하는 미흡착 3B 중합체를 제거하기 위해 0.01 M PBS, pH 7.4 용액으로 2회 세척(washing, washing volume = 100 μL)하였다. SA-PE 형광물질을 2 μg/mL로 준비하여 웰(well) 당 50 μL씩 넣고 2분간 흔든(shaking) 후, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 0.01 M PBS, pH 7.4 용액으로 2회 세척하여 형광 자성입자(MP)에 흡착되지 않은 SA-PE 제거하였다(washing volume = 100 μL). 100 μL의 0.01 M PBS, pH 7.4 용액을 넣고 MAGPIX를 이용하여 형광신호 측정하였다.
도 8은 본 발명의 실시예에 의한 다양한 농도에서 준비한 3B 중합체와 BPA-Ab@MP의 반응에 따른 형광신호 검출량을 나타낸 그래프이다. 도 8에 의하면, Biotin-BSA-BHPVA 3B 중합체의 농도가 50 μg/mL 이상이면, BPA-Ab@MP 표면에 고정화된 항체와 3B 중합체의 결합이 포화상태에 이르게 되고, 형광신호가 최대치에서 안정기(plateau)를 보였다. 한편 3B 중합체의 농도가 50 μg/mL 보다 높은 경우, 순수 형광 자성입자(MP)와의 배경결합(background binding)이 다소 증가하는 현상이 일어났다. 따라서 경합적 저해 측정(competitive inhibition assay)에 사용할 3B 중합체의 최적 농도를 50 μg/mL로 결정하였다.
<형광 자성입자를 이용하여 비스페놀 A를 측정하는 조건의 최적화>
비스페놀 A 항체가 고정화된 형광 자성입자(BPA-Ab@MP)를 이용하여 경쟁적의 반응에 의하여 비스페놀 A를 측정하는 조건을 최적화하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, 비스페놀 A와 같이 BPA-Ab@MP에 대해 경쟁적 흡착 반응하기 위하여 3B 중합체 농도 최적화하였다. 경쟁 반응 구축하기 위하여 샘플 도입 방식과 배양(incubation) 시간을 확립하였다. 형광신호를 측정하기 위하여 SA-PE 도입한 후, SA-PE와 비오틴(biotin)의 배양(incubation) 시간 최적 조건을 확립하였다. 시료 내에 존재하는 비스페놀 A의 함량을 직접적으로 측정하는 것이 아니라, 형광 자성입자(MP)에 고정화된 비스페놀 A 인지 프로브(probe) 물질인 비스페놀 A 항체와 결합하는 비스페놀 A의 양이 시료 상에 비스페놀 A와 함께 존재하는 Biotin-BSA-BHPVA(3B 중합체)와의 경쟁 반응에 의해 결정되는 원리를 이용하여 시료 중의 비스페놀 A 농도를 측정하였다. 따라서 3B 중합체가 측정 결과에 대한 영향을 주는지 확인하기 위하여, 다른 여건이 변하지 않고 3B 중합체 농도만을 바뀌어 실험을 진행하였다.
도 9는 본 발명의 실시예에 의한 비스페놀 A와 3B 중합체의 BPA-Ab@MP에 대하여 경쟁적 흡착 반응을 이용하여 비스페놀 A 농도에 따른 형광신호(MFI) 값을 나타내는 그래프이다. 도 9에 의하면, 3B 중합체 농도가 12.5 μg/mL에서 25 μg/mL으로 올려줄 때, 형광신호는 농도 변화에 따라 증가하였다. 그러나, 3B 중합체 농도가 50 μg/mL까지 증가할 경우, 오히려 농도 변화에 따른 형광신호(MFI)가 줄어들었다. 3B 중합체 농도가 너무 높아지면 입체적 방해효과(stereo-hindrance effect)에 의하여 비오틴(biotin)과 SA-PE의 결합을 저해해서 형광신호가 오히려 줄어든 것이다. 최종적으로 경쟁 반응에 넣어줄 최적의 3B 중합체 농도는 25 μg/mL로 선택하였다.
한편, 본 발명의 실시예는 경쟁 반응을 유도하는 과정에 대해 3가지 샘플 도입 방법을 고려하였다. 첫째, 96-well plate에 비스페놀 A 시료와 본 발명의 바이오센서(BPA-Ab@MP suspension)를 먼저 섞어서 반응한 후에 3B 중합체를 추가로 도입하여 반응시키는 방법이다. 둘째, BPA-Ab@MP suspension과 3B 중합체를 먼저 섞어주고 반응한 후 비스페놀 A 시료를 추가로 도입하여 반응시키는 방법이다. 셋째, BPA-Ab@MP suspension, 비스페놀 A 시료, 3B 중합체를 한 번에 섞어주고 반응시키는 방법이다. 이 세 가지 방법을 각각 측정해 보고 결과의 영향을 비교하여 최적 방법을 선택하였다. 또한, 각각의 반응 배양(incubation) 시간도 비교하여 최적화하였다.
도 10은 본 발명의 실시예에 의한 3가지 샘플 도입 방식의 최적화(A) 및 경쟁 반응 시간의 최적화(B) 및 SA-PE과 배양(incubation) 시간의 최적화(C)의 데이터를 나타내는 그래프들이다. 여기서는 본 발명의 형광 자성입자(MP) 표면 항체에 대한 경쟁의 최적 조건 확립하기 위한 것이다.
도 10에 의하면, (A)의 경우, 3가지 샘플 첨가의 순서는 측정 결과에 별 영향을 미치지 않았음을 알 수 있다. 반응시간을 줄여주기 위해 모두(BPA-Ab@MP suspension, 비스페놀 A 시료, 3B 중합체) 한꺼번에 섞어주는 방법으로 선택하였다. (B)의 경우, 각각의 반응시간에 따른 비스페놀 A 측정 형광강도를 비교해 나타냈으며, 15분부터 30분까지는 형광강도(MFI값)가 크게 증가하고 있고 30분부터 60분 사이에는 형광강도가 약간 증가하였다. (B)를 기준으로 측정 시간의 최소화를 위해 경쟁 반응의 최적 반응시간을 30분으로 선택하였다. (C)의 경우, SA-PE(Streptavidin-Phycoerythrin) 도입 후 5분, 15분, 45분 3가지 반응 시간에 따라 형광 강도(MFI) 값의 변화를 관찰하였다. 5분부터 15분까지 반응 시간이 길어지면 MFI 값도 증가하나 15분 이후에는 거의 증가하지 않았다. 측정 시간의 최소화를 위해 SA-PE 반응의 최적 반응시간을 15분으로 선택하였다.
<항체 기반 형광 자성입자의 비스페놀 A에 대한 선택적 친화도 확인>
앞에서 설명한 항체 기반 비스페놀 A 측정용 형광 자성입자가 비스페놀 A 이외에 기타 유사물질 간섭현상이 없이 얼마나 선택적으로 비스페놀 A를 인지할 수 있는지를 알기 위하여, 비스페놀 A 간섭 후보 물질을 선정하여 비교 실험을 하였다. 도 11은 본 발명의 실시예에 적용되는 간섭후보 물질들이다. 상기 간섭물질 후보는 (A) 비스페놀 A (Bisphenol A, BPA), (B) 비스페놀 B (Bisphenol B, BPB), (C) 비스페놀 F (Bisphenol F, BPF), (D) 2, 4-디니트로페놀 (2,4-Dinitrophenol, DNP), (E) 페놀(phenol), (F) 4-클로로페놀(4-Chlorophenol, CP), (G) p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid, HBA) 및 (H) 프로토카테큐산(protocatechuic acid, PCA)를 선정하였다.
도 12는 본 발명의 실시예에 의한 비스페놀 A 및 그 유도체의 농도에 따른 MFI값 및 MP@MP 기반 바이오센싱 키트의 상대적인 반응성을 나타내는 그래프들이다. 도 12에 의하면, 본 발명의 형광 자성입자(MP)는 반응시킨 비스페놀 A 농도와 동일한 질량 농도로 준비된 유사 물질들에 대해 약한 반응성을 보였다. 본 발명의 형광 자성입자(MP)는 비스페놀 A에 대한 경쟁 반응으로 비스페놀 A 농도가 늘어날수록 MFI값이 떨어지는 전형적인 경쟁(competition) 결과를 보이고 있다. 비스페놀 A 없이 본 발명의 형광 자성입자(MP)와 3B 중합체만으로 반응하는 경우, 데이터와 비교하면 유사 물질들의 MFI값(형광 강도)이 거의 변하지 않았다. 즉 유사 물질들은 본 발명의 형광 자성입자(MP) 표면에 거의 반응하지 않는다.
비스페놀 A와 간섭 유사물질들의 상대적 반응성(relative response)은 비스페놀 A 농도에 따라 변화하는 경향이 각각 평균 28%, 28%, 5%, 6%, 5%, 4%, 3%로 나타났다. 단일 순환구조(single cyclic structure) 지닌 유사물질인 DNP, phenol, CP, HBA, PAC와 비교하면 BPA, BPB 및 BPF 구조물은 탄소원자(carbon atom)를 링크로 통해 phenolic rings bridged를 형성하기 때문에 상대적 반응성(relative response)이 상대적인 높았다. 즉, 본 발명의 항체 기반 형광 자성입자(MP)는 비스페놀 A에 특이적으로 반응하였다.
본 발명의 실시예에 의한 형광 자성입자(MP)를 이용하여 표준 비스페놀 A 용액을 대상으로 비스페놀 A 효율을 다음과 같이 항목별로 평가하였다. 도 13은 본 발명의 실시예에 의한 형광 자성입자(MP)의 동적측정범위(DDR) 및 최소검출한계(LDL)를 설명하기 위한 그래프이다. 도 13에 의하면, 일정한 양의 3B 중합체 및 다양한 농도의 비스페놀 A 시료를 일정한 양의 형광 자성입자(MP)와 반응시켜 비스페놀 A 농도에 따른 형광신호 변화를 관측하고, 표준검량 곡선을 통계적으로 처리하여 R2>0.99를 만족하는 선형 추세선을 얻을 수 있는 비스페놀 A 농도 측정 구간으로 정의하였으며, 5회 반복 측정 후 평균화한 것이다. 비스페놀 A와 3B 중합체의 BPA-Ab@MP와의 경쟁적 흡착 반응을 이용하여 비스페놀 A 농도에 따라 선형적으로 변화, 특히 감소하는 NET MFI 값을 확인한 것이다.
항체가 중합된 형광 자성입자(MP)의 비스페놀 A 측정 성능 평가는 다음과 같은 순서로 경쟁적 저해 측정(competitive inhibition assay)를 통해 진행하였다. 먼저, 전술한 과정을 거쳐 준비한 BPA-Ab@MP를 25배 희석한 비드 서스펜션(bead suspension) 50 μL을 마이크로플레이트(microplate)의 각 웰(well)에 도입하였다. 그후, 다양한 농도에서 (0.01 - 10240 ng/mL) 준비한 비스페놀 A 시료 용액 50 μL을 각 웰(well)에 추가적으로 도입하고 50 μL의 25 μg/mL 3B 중합체 용액을 각 웰(well)에 넣고 37℃에서 30분 간 시켜 BPA 및 3B 중합체는 BPA-Ab@MP 표면에 고정화된 항체와 경쟁적으로 반응하였다.
이어서, BPA-Ab@MP에 미반응한 3B 중합체를 자성분리(magnetic separation)로 분리하여 제거하였다. 각 웰(well)에 잔존하는 미흡착 3B 중합체를 완전히 제거하기 위해 0.01 M PBS, pH 7.4 용액으로 100 μL 씩 2회 세척하였다. 3B 중합체에 존재하는 비오틴(biotin)을 인지하는 형광신호 물질인 SA-PE(Streptavidin-Phycoerythrin)를 2 μg/mL 농도로 준비하여 각 웰 당 50 μL씩 넣고 37℃에서 15분간 반응시켰다. 각 웰에 잔존하는 미흡착 SA-PE을 완전히 제거하기 위해 0.01 M PBS, pH 7.4 용액으로 100 μL씩 2회 세척하였다. 100 μL 0.01 M PBS, pH 7.4 용액을 넣어 혼합한 후, MAGPIX를 이용하여 형광신호 검측하였다.
항체 기반의 형광 자성입자(BPA-Ab@MP)를 이용한 비스페놀 A 측정 성능을 평가하기 위해 형광 자성입자(MP) 표면에 고정화되어 있는 항체와 결합하기 위해 경쟁하는 비스페놀 A와 3B 중합체는 각각 0.01~10240 ng/mL, 25 μg/mL로 준비하였다. 경쟁 반응 후, 형광 자성입자(MP)에 존재하는 항체와 결합한 최종 3B 중합체의 양은 3B 중합체와만 반응하는 SA-PE(Streptavidin-Phycoerythrin)에서 검출되는 형광신호를 측정하여 결정하였다.
시료에 존재하는 비스페놀 A 농도에 따라 BPA-Ab@MP에 존재하는 항체의 흡착분율(fraction of adsorption)이 달라진다. 50 μL의 3B 중합체를 추가로 웰에 도입함에 따라, BPA-Ab@MP에 존재하는 항체와 미리 결합하고 있는 비스페놀 A와 용액상(solution-phase)에 존재하는 3B 중합체 사이에 BPA-Ab@MP에 존재하는 항체의 결합 사이트(binding site)를 차지하려는 경쟁이 진행된다. 결과적으로 BPA-Ab@MP에 최종적으로 흡착되는 3B 중합체의 양은 시료 상에 원래 존재했던 비스페놀 A의 농도에 반비례하게 된다. 흡착된 3B 중합체가 SA-PE와 반응함에 따라 측정된 MFI 값과 시료에 존재하는 비스페놀 A 농도와의 선형 관계는 도 13과 같다. 도 13에 정리된 바와 같이, NET MFI는 비스페놀 A의 농도가 0.01 ng/mL 이상인 지점부터 관측되기 시작하여 5~1280 ng/mL의 농도 범위에서 R2 =0.99의 선형 관계를 보이는 것으로 나타났다.
형광 자성입자(MP) 기반 비스페놀 A 바이오센싱 기술은 다음과 같은 순서에 의해 약 52분의 측정시간을 가지는 것으로 평가되었다. 즉, 비스페놀 A 항체 고정화 형광 자성입자(MP)와 비스페놀 A와 3B 중합체 경쟁 반응(30 분)및 반응 후 3분간 세척하였다. SA-PE 도입 후 15분 반응시키고, 3분간 세척하였다. 버퍼(buffer)로 1분간 서스펜션(suspension) 후 MAGPIX 장비로 형광신호를 측정하였다. 정밀도(precision) 측면에서,BPA를 함유하는 시료에 대해 5회 반복 측정하여 분석되는 농도값의 %CV(coefficient of variation)를 구했다. 비스페놀 A 항체 고정화 형광 자성입자(MP)에 도 13에서 얻어진 표준검량 곡선의 중간에 해당하는 100 ng/mL 농도의 비스페놀 A 시료를 반응시킨 후 측정되는 형광신호를 5회 반복하여 측정 후 얻어지는 평균값과 표준편차의 비율(변동계수, coefficient of variation)을 확인한 결과 5.86%로 나타났다. 이때, CV%=(SD/Mean)ㅧ100%)를 만족한다.
정확도(recovery) 측면에서, 항체 기반 바이오 키트를 이용하여 시료에 다른 성분들이 들어 있어도 비스페놀 A를 측정할 수 있는 것을 확인하기 위해서, 스파이크 정확도 테스트(spike recovery test)를 실시하였다. 따라서 3가지 플라스틱류 제품을 이용하여 비스페놀 A 및 다른 성분들 농출된 시료(mock sample)를 준비하고 시료에 존재했던 비스페놀 A량을 측정하였다. 동시에 100 ng/mL의 비스페놀 A 용액을 추가로 스파이킹(spiking)한 시료에 존재한 비스페놀 A량도 측정하였다. 이를 통해 스파이크 정확도(spike recovery)를 확인한 결과는 114%, 109%, 97%로 나타났다. 이를 표 1에 표현하였다.
Figure pat00001
<형광 자성입자의 표면 상태에 따른 3B 중합체의 비특이적 흡착 최소화>
형광 자성입자(MP)를 이용하여 펩타이드 기반 형광 바이오센싱 키트를 구축함에 앞서, 시료 내 비스페놀 A와 경쟁시키는 3B 중합체의 반응에 비례하는 형광신호 결과, 즉 비스페놀 A 친화성 펩타이드와 3B 중합체 간의 특이적인 결합 반응에 의한 형광신호 결과임을 증명하여야 한다. 이를 위해, 먼저 비스페놀 A 친화성 펩타이드 분자가 고정되어 있지 않은 순수한(bare) 상태의 형광 자성입자(EDC/NHS 이용하여 카복실기 활성화된 상태)와 3B 중합체간의 비특이적인 결합을 확인하였다.
형광 자성입자(MP)의 표면 상태에 따른 3B 중합체의 비특이적 흡착 최소화하기 위해 실험은 다음과 같은 순서로 진행하였다. 먼저, 100 μL의 카르복실 작용기를 지닌 형광 자성입자(MP)를 1.5 mL 튜브에 넣고 자석으로 자성입자(MP)를 분리한다. 상층액을 버리고, 0.01 M PBS, pH 7.4 용액 100μL로 세척한 후 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 80 μL 추가하고, 50 mg/mL NHS 10 μL 추가하고, 50 mg/mL EDC 10 μL를 순서대로 넣고 충분히 섞은 후 실온에서 빛을 차단시킨 상태로 20분간 반응시켜 형광 자성입자(MP) 표면에 존재하는 카르복실 작용기를 활성화한다.
그후, 자석으로 자성입자(MP)를 분리하고 상층액을 털어버린 후 블록킹 용액(blocking solution: 0.02% Tween-20, 1% BSA가 포함된 0.01 M PBS 용액, pH 7.4) 250 μL를 형광 자성입자(MP)에 넣어주고 실온에서 빛을 차단시킨 상태로 30분간 반응시켜 자성입자(MP) 표면에 활성화된 카르복실 작용기를 블록킹한다. 블록킹 용액(blocking solution)을 넣지 않은 순수한 상태의 형광 자성입자(EDC/NHS 이용하여 카복실기 활성화된 상태)를 대조군으로 실험 진행한다. 0.01 M PBS, pH 7.4 용액으로 2회 세척 후 (150 μL 씩), 150 μL 의 0.01 M PBS, pH 7.4 넣고 4℃에서 보관한다.
다음에, 전술한 과정을 거쳐 준비한 형광 자성입자(MP)를 25배 희석한 bead suspension 50 μL을 마이크로플레이트(microplate)의 각 웰(well)에 도입한다. 50 μg/mL 3B 중합체 용액 50 μL씩 각 well에 넣고 37℃에서 빛을 차단시킨 상태로 60분간 반응시킨다. 형광 자성입자(MP)에 미반응한 3B 중합체를 제거하기 위해 자성분리(magnetic separation)로 분리하고, 상층액을 털어버린 후 0.01 M PBS, pH 7.4 용액 100 μL 씩 추가하여 2회 세척한다. 3B 중합체에 존재하는 비오틴(biotin)을 인지하는 형광신호 물질인 SA-PE를 2 μg/mL 농도로 준비하여 각 well 당 50 μL씩 넣고 37℃에서 30분간 반응한다. 각 웰에 잔존하는 미반응 SA-PE을 완전히 제거하기 위해 자성분리(magnetic separation)로 분리하고, 상층액을 털어버린 후 0.01 M PBS, pH 7.4 용액으로 100 μL씩 추가하여 2회 세척한다. 0.01 M PBS, pH 7.4 용액 100 μL을 넣어 혼합한 후, MAGPIX를 이용하여 형광신호 측정한다.
도 14는 본 발명의 실시예에 의한 형광 자성입자의 표면 상태에 따른 3B 중합체의 비특이적 흡착정도를 나타내는 그래프이다.
도 14에 의하면, 카복실기를 가진 순수한 상태의 자성입자(MP)에 3B 중합체의 농도를 증가시키며 반응할수록 MFI(Median Fluorescence Intensity) 값이 증가한다. 이는 3B 중합체가 형광 자성입자(MP)의 표면에 비특이적 흡착되고 있다는 것을 의미한다. 따라서 이러한 비특이적 흡착을 최소화하기 위해 형광 자성입자(MP)의 표면을 블로킹하였다. 대표적인 블록킹(blocking) 소제 BSA solution(0.02% Tween-20, 1% BSA가 포함된 0.01 M PBS 용액, pH 7.4)을 대상으로 블로킹 할 경우, 이전에 비하여 비특이적 결합이 감소된다. 블록킹 용액(blocking solution)을 형광 자성입자(MP)에 코팅시킨 결과 3B 중합체 농도와 관계없이 비특이적 반응 현상을 거의 대부분 제거하였다. 따라서 추후에는 3B 중합체의 비특이적인 결합을 막기 위해 펩타이드를 고정시킨 후, 블록킹 용액(blocking solution)을 이용하여 형광 자성입자(MP)에 코팅시킨 후 사용하였다.
<비스페놀 A 친화성 펩타이드가 고정된 형광 자성입자의 3B 중합체 인지 성능>
표 2는 본 발명의 실시예에 의한 비스페놀 A 친화성 펩타이드 시퀀스이다. 즉, 펩타이드가 고정된 형광 자성입자(MP)의 3B 중합체 인지 성능 극대화를 위하여 3 종료 비스페놀 A 친화성 펩타이드이다. 표 2를 참조하여, 고정된 형광 자성입자(MP)를 이용하여 3B 중합체와 결합한 후, 형광신호를 통해 가장 잘 인지(형광신호 최적화)할 수 있는 프로브를 선별하였다.
Figure pat00002
비스페놀 A 친화성 펩타이드 고정된 형광 자성입자(MP)를 이용하여 3B 중합체를 측정 과정을 간략하게 정리하면 다음과 같다. 먼저, 100 μL의 카르복실 작용기를 지닌 형광 자성입자(MP)를 1.5 mL 튜브에 넣고 자석으로 형광 자성입자를 분리하고 상층액을 버린다. 100 μL의 0.01 M PBS, pH 7.4 용액으로 세척 후 80 μL의 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2, 10 μL의 50 mg/mL NHS, 10 μL의 50 mg/mL EDC를 순서대로 넣고 충분히 섞은 후에 실온에서 빛을 차단시킨 상태에서 20분 반응시켜 형광 자성입자(MP) 표면에 존재하는 카르복실 작용기를 활성화시킨다.
그후, 자석으로 형광 자성입자를 분리하고 상층액을 털어버린 후 활성화된 카르복실 작용기를 가진 형광 자성입자(MP)에 3 종류 BPA-peptide 3가지 농도(80 μg/mL, 160 μg/mL, 320 μg/mL) 250 μL씩을 혼합하여 실온에서 2시간 반응시킨다. 이때, BPA-peptide 1 서열: CKSLENSYC, BPA-peptide 2 서열: AAAAAAYSNELSK, BPA-peptide 3 서열: AAAAAAKSLENSY이다. 반응 종료 후 자석으로 형광 자성입자를 분리하고 상층액을 털어버려 미반응한 혹은 약하게 반응한 펩타이드(peptide)를 제거하였고, 0.01 M PBS, pH 7.4로 150 μL씩 추가하여 세척을 2회 수행하였다. 블록킹 용액(blocking solution:0.02% Tween-20, 1% BSA가 포함된 0.01 M PBS 용액, pH 7.4) 250 μL씩 넣어주고 실온에서 빛을 차단시킨 상태로 30분간 반응시켜 형광 자성입자표면의 활성화된 카르복실 작용기를 블록킹 하였다.
다음에, 자석으로 형광 자성입자 중합체(BPA-peptide@MP)를 분리하고 미반응 상층액을 털어버린 후 0.01 M PBS, pH 7.4 용액 150 μL씩 추가하여 2회 세척하였다. 최종 0.01 M PBS, pH 7.4 용액 150 μL씩 넣어주고 4℃에 보관하였다. 전술한 과정을 거쳐 준비한 BPA-peptide@MP를 25배 희석한 비드 서스펜션(bead suspension) 50 μL을 마이크로플레이트(microplate)의 각 웰에 도입한다. 50 μg/mL 3B 중합체 용액 50 μL씩을 각 웰에 넣고 37℃에서 빛을 차단시킨 상태로 60분간 반응시킨다. BPA-peptide@MP에 미반응한 3B 중합체를 제거하기 위해 자성분리(magnetic separation)로 분리하고 상층액을 털어버린 후 0.01 M PBS, pH 7.4 용액 100 μL씩 추가하여 2회 세척한다.
계속하여, SA-PE(Streptavidin-Phycoerythrin)를 2 μg/mL 농도로 준비하여 각 well 당 50 μL씩 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨다. 각 웰에 잔존하는 미반응 SA-PE을 완전히 제거하기 위해, 자성분리(magnetic separation)로 분리하고 상층액을 털어버린 후 0.01 M PBS 용액 100 μL씩 추가하여 2회 세척한다. 0.01 M PBS, pH 7.4 용액 100 μL씩을 넣어 mix한 후 MAGPIX에서 형광신호를 측정한다.
도 15는 본 발명의 실시예에 의한 펩타이드 서열 1, 2 및 3의 MFI값을 나타내는 그래프이다. 도 15에 의하면, 형광자성입자(MP)를 EDC/NHS 처리 후 비스페놀 A 친화성 펩타이드와 반응 시켜 amine coupling 반응에 의해 고정시킨 형광 자성입자(MP) 각각을 3B 중합체 및 SA-PE 반응시킨 뒤 MAGPIX를 통해 측정한 상대적인 3B 중합체 인지정도를 나타낸 것이다. BPA-peptide가 고정된 형광 자성입자(MP)에 동일 농도의 3B 중합체(50 μg/mL)를 1시간 반응시킨 후, SA-PE를 반응시켜 발생하는 형광신호를 통해 최적의 프로브를 선정하는 실험 결과이다. 즉, 비스페놀 A 친화성 BPA-peptide 1(서열: CKSLENSYC)이 3B 중합체를 가장 잘 인지하는 최적의 프로브임을 확인할 수 있었다. BPA-peptide 3(서열:AAAAAAKSLENSY)과 비교하여 BPA-peptide 1 시퀀스 양쪽 말단에는 cysteine(Cys, C)이 들어있어, 순환구조(cyclic structure)가 되는 형태일 것으로 예상하고 이것에 의해 비스페놀 A 인지 효율이 좋아지는 것으로 판단하였다. 따라서 추후에는 BPA-peptide 1을 프로브(probe)로 사용하여 형광 자성입자(MP) 표면에 고정시킨다.
본 발명의 실시예는 최종적으로 비스페놀 A에 강하게 친화성을 보이는 펩타이드(peptide) 1 시퀀스(CysLysSerLeuGluAsnSerTyrCys)를 캡쳐 프로브(capture probe)로, 3B 중합체(Biotin-BHPVA-BSA)를 비스페놀 A 경쟁(competition) 물질로 사용한 분석 플랫폼이다. 이는 비스페놀 A를 포함하고 있는 다양한 시료에서 비스페놀 A만을 선택적으로 탐지 가능한 비스페놀 A 바이오센싱 키트이다.
<비스페놀 A 친화성 펩타이드 기반 형광 자성입자(BPA-peptide@MP) 제작을 위한 비스페놀 A 친화성 최적 농도 결정>
본 발명의 실시예는 비스페놀 A 측정용 형광 자성입자(MP) 제작을 위한 기본 플랫폼으로 -COOH 작용기를 표면에 지닌 형광 자성입자(MP)를 사용하였다. 이 입자에 EDC/NHS mediated amine coupling 방법을 이용하여 비스페놀 A 친화성 펩타이드 프로브를 고정화시킨 비스페놀 A 측정용 형광 자성입자(MP)를 제작하였다. 형광 자성입자(MP)에 고정화된 비스페놀 A 인지프로브(probe) 물질인 BPA-peptide와 결합하는 비스페놀 A의 양이 시료 상에 비스페놀 A와 함께 존재하는 3B 중합체와의 경쟁 반응시키고, 3B 중합체 존재하는 비오틴(biotin) 인지하는 SA-PE를 차례로 반응시켰다. 비스페놀 A의 양에 반비례하는 형광신호를 발생시키기 위해 비스페놀 A 측정용 형광 자성입자(MP)에 비스페놀 A 친화성 펩타이드(peptide)의 최적 농도 고정화 조건을 확립하였다.
이를 위해, EDC/NHS mediated amine coupling 반응을 통해 -COOH 반응기를 가진 형광 자성입자(MP)와 다양한 농도의 BPA-peptide 용액을 2시간 동안 실온에서 반응시킨다. 그후, 세척 과정을 통해 미반응하거나 약하게 결합한 BPA-peptide를 새 튜브로 옮겨 미반응하거나 약하게 결합한 BPA-peptide 농도를 측정하였다. 미반응하거나 약하게 결합한 BPA-peptide 농도를 통해 형광 자성입자(MP) 표면에 고정화된 BPA peptide 분자를 계산하였고, BPA-peptide가 최적 농도에서 고정화된 조건들을 확립하였다.
도 16은 본 발명의 실시예에 의한 형광 자성입자에 대한 BPA-peptide의 흡착등온선을 보여주는 그래프이다. 도시된 바와 같이, 확보한 흡착등온선을 통해 비스페놀 A 친화성 펩타이드가 EDC/NHS mediated amine coupling 반응을 통해 형광 자성입자(MP)에 고정화될 경우, 형광자성 나노입자(MP) 당 최대로 고정화되는 비스페놀 A 친화성 펩타이드(peptide) 분자의 수 (Qm)는 4.62×1011개이며, 비스페놀 A 친화성 펩타이드와 형광 자성입자(MP) 간의 결합 친화력을 나타내는 해리상수(dissociation constant, Kd)는 0.503 μg/mL임을 알 수 있었다. 이는 펩타이드(peptide)가 형광 자성입자(MP)와 반응할 때 비스페놀 A 친화성 펩타이드의 평형농도가 Kd의 9.3배인(c/Kd = 9.3) 4.68 μg/mL 이상일 경우, 형광 자성입자(MP)의 표면을 88% 이상 덮을 수 있음을 의미한다(q/Qm = 0.88).
도 17은 본 발명의 실시예에 의한 형광 자성입자의 표면 형태를 나타내는 주사전자현미경 사진이다. 왼쪽은 순수한 형광 자성입자(MP)이고 오른 쪽은 BPA peptide-modified 형광 자성입자(MP)이다. 도시된 바와 같이, 구형으로 나타나는 형광 자성입자(MP)는 크기가 균일하고 표면이 평탄하다. 그리고 단백질이 더 쉽게 표면에서 커플링하기 위한 미세한 틈이 존재한다. 커플링 반응이 끝난 후에 자성입자(MP) 표면 형태와 공백의 형광 자성입자 크기가 다르고 그 표면이 울퉁불퉁하게 튀어나오는 소괴로 덮고 커플링 후의 형광 자성입자가 공백 형광 자성입자보다 조금 큰 것으로 커플링이 성공하였음을 알 수 있다.
<형광신호 최적화를 위하여 3B 중합체 몇 SA-PE 농도 최적화>
확보한 최적의 캡쳐 프로브 고정화 조건을 적용시켜 본 발명의 실시예의 진행 효율을 높이고자 비스페놀 A 측정용 형광 자성입자(MP) 제작 방법을 다음과 같은 순서로 변경하여 진행하였다. 먼저, -COOH 작용기를 지닌 형광 자성입자(MP) 표면에 비스페놀 A 친화성 펩타이드(peptide)를 캡쳐 프로브(capture probe)로써 고정한다. 그후, BPA-peptide가 고정된 형광 자성입자(MP) 표면에 다양한 농도의 3B 중합체 결합한다. 형광 자성입자(MP)에 결합한 3B 중합체의 비오틴(biotin) 인지하는 다양한 농도 SA-PE 도입한다. MAGPIX를 이용하여 형광신호 검측하였다.
도 18은 본 발명의 실시예에 의한 형광신호 최적화를 위하여 3B 중합체 몇 SA-PE 농도 최적화 데이터를 보여주는 그래프이다. 도 18에 의하면, 3B(Biotin-BSA-BHPVA) 중합체의 농도가 150 μg/mL 이상이면, BPA-peptide@MP 표면에 고정화된 peptide와 3B 중합체의 결합이 포화상태에 이르게 된다. 3B 중합체 농도를 늘면서 오히려 반응 결과 형광신호가 떨어진다. SA-PE 농도 증가에 따라 형광신호도 증가했지만 4 μg/mL 이상에서는 형광신호 증가 정도가 줄어든다. 즉, 경쟁 측정(competitive assay)에 사용할 3B 중합체 및 SA-PE의 최적 농도를 150 μg/mL 및 4 μg/mL로 결정하였다.
<비스페놀 A 친화성 펩타이드 기반 형광자성입자가 비스페놀 A에 대한 선택적 친화도 확인>
비스페놀 A 친화성 펩타이드 기반 형광 자성입자(MP)가 비스페놀 A 이외에 비스페놀 A에 유사물질에도 친화성을 보이는지 확인하기 위하여 비스페놀 A 간섭 후보물질을 선정하여 비교실험을 하였다. 따라서 본 발명의 비스페놀 A 친화성 펩타이드 기반 비스페놀 A 측정용 형광 자성입자(MP)가 비스페놀 A 이외에 기타 유사물질의 간섭 현상 없이 얼마나 선택적으로 비스페놀 A를 인지할 수 있는지 살펴보기로 한다. 간섭 후보물질로는 도 11을 참조하여 BPB, BPF, DNP, phenol, CP, HBA, PCA를 선정하였다.
도 19는 본 발명의 실시예에 의한 비스페놀 A 및 그 유도체의 농도에 따른 MFI값 및 MP@MP 기반 바이오키트의 상대적인 반응성을 나타내는 그래프들이다.
도 19에 의하면, 본 발명의 실시예에 의한 형광 자성입자(MP)는 반응시킨 비스페놀 A 농도와 동일한 질량 농도로 준비된 유사 물질들에 대해 부분적으로 선택도(selectivity)를 보였다. 비스페놀 A와 3B 복합제간 본 발명의 형광 자성입자(MP)에 대한 경쟁 반응 의하여 MFI값이 대폭적으로 떨어졌다. 형광 자성입자(MP) 자체와 3B 중합체만 반응하는 순수한 비스페놀 A의 경우, 유사물질들의 MFI값이 거의 변하지 않았다. 즉 유사물질들은 본 발명의 형광 자성입자(MP) 표면에 반응하지 않았다. 이 결과를 바탕으로 본 발명의 비스페놀 A 친화성 펩타이드 기반 형광 자성입자(MP)가 비스페놀 A에 특이적으로 반응한다고 볼 수 있다.
한편, 비스페놀 A와 간섭 유사물질들의 상대적 반응성(relative response)은 비스페놀 A 농도에 따라 변화하는 것을 없이 각각 평균 19%, 17%, 4%, 5%, 5%, 4%, 5%로 나타났다. 단일 순환구조(single cyclic structure) 지닌 유사물질인 DNP, phenol, CP, HBA, PCA와 비교하면, BPA, BPB 및 BPF 구조물은 탄소원자(carbon atom)를 링크로 통해 phenolic rings bridged를 형성하기 때문에 상대적 반응성(relative response)인 높았다. 비스페놀 A 항체 기반 형광 자성입자(MP)의 상대적 반응성(relative response)와 비교하면 비스페놀 A 친화성 펩타이드 기반 형광 자성입자(MP) 비스페놀 A에 대한 선택적 친화성은 더 우수하다.
<비스페놀 A 친화성 펩타이드(peptide) 기반 형광 자성입자를 이용한 비스페놀 A 측정 성능 평가>
본 발명의 실시예에 의한 형광 자성입자(MP)를 이용하여 표준 비스페놀 A 용액을 대상으로 비스페놀 A 효율을 다음과 같이 항목별로 평가하였다.
도 20은 본 발명의 실시예에 의한 동적측정범위(DDR) 및 최소검출한계(LDL)를 나타내는 그래프들이다. 도 20에 의하면, 비스페놀 A와 3B 중합체의 BPA-peptide@MP에 대한 경쟁적 흡착 반응을 이용하여 비스페놀 A 농도에 따라 선형적으로 변화, 특히 감소하는 NET MFI 값을 확인한 결과이다. 일정한 양의 3B 중합체 및 다양한 농도의 비스페놀 A 시료를 일정한 양의 형광 자성입자(MP)와 반응시켜 비스페놀 A 농도에 따른 형광신호 변화를 관측하고, 표준검량 곡선을 통계적으로 처리하여 R2>0.991를 만족하는 선형 추세선을 얻을 수 있었다. 이를 기준으로 비스페놀 A 측정 농도 구간으로 정의하였으며, 5회 반복 측정 후 평균화한 결과를 보여주고 있다.
비스페놀 A 친화성 펩타이드 기반의 형광 자성입자(MP)를 이용한 비스페놀 A 측정 성능을 평가하기 위해 형광 자성입자 표면에 고정화되어 있는 비스페놀 A 친화성 펩타이드와 결합하기 위해 경쟁하는 비스페놀 A와 3B 중합체는 각각 0.01~10240 ng/mL, 150 μg/mL로 준비하였다. 경쟁 반응 후, 형광 자성입자(MP)에 존재하는 비스페놀 A 친화성 펩타이드와 결합한 최종 3B 중합체의 양은 3B 중합체에 붙어있는 비오틴(biotin)과 특이적으로 반응하는 SA-PE 결합으로 검출되는 형광신호를 측정하여 결정하였다.
시료에 존재하는 비스페놀 A 농도에 따라 BPA-peptide@MP에 존재하는 BPA-peptide의 흡착 분율(fraction of adsorption)이 달라진다. 50 μL의 3B 중합체를 추가로 웰에 도입함에 따라, BPA-peptide@MP에 존재하는 비스페놀 A 친화성 펩타이드와 미리 결합하고 있는 비스페놀 A와 용액상(solution-phase)에 존재하는 3B 중합체 사이에 BPA-peptide@MP에 존재하는 비스페놀 A 친화성 펩타이드의 결합사이트(binding site)를 차지하려는 경쟁이 진행된다. 결과적으로, BPA-peptide@MP에 최종적으로 흡착되는 3B 중합체의 양은 시료 상에 원래 존재했던 비스페놀 A의 농도에 반비례하게 된다. 흡착된 3B 중합체가 SA-PE와 반응함에 따라 측정된 MFI 값과 시료에 존재하는 비스페놀 A 농도와의 반비례 선형 관계를 나타낸다. 즉, NET MFI는 비스페놀 A의 농도가 0.01 ng/mL 이하인 지점부터 관측되기 시작하여 10~1280 ng/mL의 농도 범위에서 R2 =0.991의 선형 관계를 보인다.
측정시간 측면에서, 형광 자성입자(MP) 기반 비스페놀 A 바이오센싱 기술은 다음과 같은 순서에 의해 약 52분의 측정시간을 가지는 것으로 평가된다. 먼저, BPA-peptide 고정화 형광자성입자(MP)와 비스페놀 A와 3B 중합체 경쟁 반응(30 min) 및 반응 후 3분 동안 세척한다. SA-PE 도입(15 min) 및 반응 후 3분 동안 세척한다. 버퍼(buffer)로 서스펜션(suspension) 1분 후 MAGPIX 장비로 형광신호 측정하였다. 정밀도(Precision) 측면에서, 비스페놀 A를 함유하는 시료에 대해 5회 반복 측정하여 분석되는 농도 값의 %CV(coefficient of variation)를 구했다. BPA-peptide 고정화 형광 자성입자(MP)에 도 20에서 얻어진 표준검량 곡선의 중간에 해당하는 100 ng/mL 농도의 비스페놀 A 시료를 반응시킨 후, 측정되는 형광신호를 5회 반복 측정 후 얻어지는 평균값과 표준편차의 비율(변동계수, coefficient of variation)을 확인한 결과 3.74%로 나타났다. 이때, CV%=(SD/Mean)*100%)이다.
정확도(recovery) 측면에서, 비스페놀 A 친화성 펩타이드 기반 바이오센싱 키트를 이용하여 시료에 다른 성분들이 들어 있어도 비스페놀 A를 측정할 수 있는 것을 확인하기 위해서 스파이크 정확도 테스트(spike recovery test)를 실시하였다. 따라서 3가지 플라스틱류 제품을 이용하여 비스페놀 A 및 다른 성분들 농출된 시료(mock sample)를 준비하고 시료에 존재했던 비스페놀 A량을 측정하였다. 동시에 100 ng/mL의 비스페놀 A 용액을 추가로 스파이킹(spiking)한 시료에 존재한 비스페놀 A량도 측정하였다. 이를 통해 스파이크 정확도(spike recovery)를 확인한 결과는 110%, 105%, 92%이었다. 이를 표 3에 나타내었다.
Figure pat00003
이상, 본 발명은 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims (1)

  1. 비스페놀 A(Bisphenol A; BPA) 친화성 리간드(ligand)를 부착한 형광 자성입자 형태의 다중분석 플랫폼 비스페놀 A 바이오센싱 키트에 있어서, 비스페놀 A 친화성 펩타이드(peptide) 리간드의 특이적 반응을 이용하여 여러 성분이 혼합되어 있는 임상 시료, 추출물 등의 복합 시료에서 간단하게 비스페놀 A 농도를 측정할 수 있는 형광 자성입자 배열을 이용한 비스페놀 A 바이오센싱 키트.
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