KR20190007195A

KR20190007195A - 신규한 아크레모니움 균주 및 이의 배양물로부터 분리된 생물학적 계면활성제

Info

Publication number: KR20190007195A
Application number: KR1020170088272A
Authority: KR
Inventors: 김종식
Original assignee: 재단법인 경북해양바이오산업연구원
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2019-01-22
Also published as: KR101945448B1

Abstract

본 발명은 아크레모니움 종(Acremonium sp.) DY07091-2-3-3 (KCCM11891P)으로부터 생산되는 생물학적 계면활성제의 활성을 가지는 신규 화합물에 관한 것이다.
생물학적 계면활성제의 활성성분을 가지는 화합물의 구조를 분광법을 이용하여 확인하였다.
본 발명의 생물학적 계면활성제의 활성성분은 다양한 용도로 이용이 가능하며, 예컨대 세정 및 정화용 조성물 등으로 이용할 수 있으며, 그 이외에도 의약품, 식품, 화장품, 육상과 해상의 유류 오염 정화, 처리조의 유지방 분해 등 화학합성 계면활성제가 사용되는 대부분의 다양한 산업분야에서 사용할 수 있다.

Description

신규한 아크레모니움 균주 및 이의 배양물로부터 분리된 생물학적 계면활성제{A NOVEL ACREMONIUM SP. STRAIN AND A BIOSURFACTANT ISOLATED FROM THE SAME}

본 발명은 아크레모니움 균주로 및 이의 배양물로부터 분리된 화합물의 생물학적 계면활성제로서의 용도에 관한 것이다.

계면활성제는 의약학, 농업, 향장산업 등의 다양한 산업에서 폭넓게 활용되고 있다.

현재 상업적으로 이용되는 계면활성제는 대부분 석유로 만든 화학합성 계면활성제로서 그 생산량은 세계적으로 매년 약 1천만톤에 이른다. 이와 같은 계면활성제는 화학합성으로 제조하기 때문에 그 과정에서 오염원이 배출되는 등의 문제점이 있었다.

따라서 최근 환경오염에 대한 인식의 확대와 친환경소재에 대한 선호도의 증가에 따라 이를 대체할 수 있는 환경친화적인 계면활성제의 개발이 시급한 실정이다.

최근 생물공학의 발달은 미생물의 biosurfactant(생물학적 계면활성제)를 그 대안으로 급부상시켰다.

생물학적 계면활성제는 미생물이 생산하는 양친매성 물질로서 생분해성 계면활성제를 의미한다.

생물학적 계면활성제는 화학합성 계면활성제와 비교하여 생분해가 가능하고, 극한의 온도나 pH에서 활성을 유지하며, 독성이 낮고, 발효에 의한 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.

이에 생물학적 계면활성제는 원유 회수, 의약품 및 식품산업, 화장품, 비누, 경피용 DDS(drug delivery system) 등 다양한 산업에서의 활용 가능성이 대두되어 그에 따른 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근까지 미생물로부터 수종의 계면활성제가 분리되어 이용되고 있으나 더 강한 효과를 나타내는 다양한 종의 미생물 확보 및 이로부터 강력한 생물학적 계면활성제의 발굴이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자는 한국등록번호 10-1446219호, 한국등록번호 10-1365711호, 한국등록번호 10-1278272호 등 균주로부터 분리한 신규한 화합물의 생물학적 계면활성제로서의 용도를 여럿 밝혀온 바 있다.

본 발명은 위의 연구에서 더 나아가 강력한 생물학적 계면 활성을 지닌 새로운 미생물소재를 탐색 및 발견하고, 이로부터 활성성분을 분리, 정제한 뒤, 분광분석방법으로 화학구조를 규명한 것이다.

본 명세서는 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌을 참조하고, 그 인용을 표시하였다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용을 명확하게 설명하는데 활용될 수 있다.

한국등록번호 10-1446219호 한국등록번호 10-1365711호 한국등록번호 10-1278272호

본 발명자들은 천연물 기반 계면활성제로서 인체에 안전하고, 강력한 계면활성 효과를 나타내는 화합물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 효모로부터 분리된 신규한 화합물이 뛰어난 계면활성 효과를 보유한다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 효모로부터 분리된 신규한 화합물 및 이들의 생물학적 계면활성제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 생물학적 계면활성제는 강력한 계면활성 효과를 보유하며, 생분해가 가능하고 독성이 낮아 인체에 안전하다. 또한, 본 발명의 생물학적 계면활성제는 미생물의 배양에 의해 대량생산이 가능하여 환경 친화적이다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 계면활성제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 효모로부터 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 하기 화학식1의 화합물을 제공한다.

[화학식1]

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화합물은 균주로부터 분리된 것이다.

본 발명에서 이용할 수 있는 균주는 아크레모니움 종(Acremonium sp.), 보다 바람직하게는 기탁번호 KCCM11891P의 아크레모니움 종이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화합물은 생물학적 계면활성제로서 특징을 갖는다.

생물학적 계면활성제는 종래의 화학합성 계면활성제와 비교하여 낮은 독성 및 높은 생분해 효과에 의해 종래의 환경오염 문제를 극복할 수 있다. 또한, 생물학적 계면활성제는 기존의 방법으로는 합성하기 어려운 복잡한 화학구조를 갖고 있어 특수한 목적으로 사용될 수 있고, 표면장력 저하능력, 온도, pH에 대한 안정성 등 계면활성제의 물리·화학적 면에서 기존의 화학합성 계면활성제와 거의 대등한 효과를 갖고 있어 사용가치가 매우 높다(Ishigami et al., 1987. Chem . Lett ., 763).

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 세정 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 생물학적 계면활성제로서 사용될 수 있는 화합물은 강력한 계면활성 효과를 보유하고 있으며, 특히 직물의 세척 및 세정 적용을 위해 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 계면활성제는 경질 표면의 세정 및 광택을 위해 사용될 수도 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 화장용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 생물학적 계면활성제로서 사용될 수 있는 화합물은 비누, 샴푸, 크림 또는 로션에서 유화제로서 유리하게 사용될 수 있다.

상기 용도 외에도 본 발명의 화합물은 의약품, 식품, 원유의 2차 회수, 펄프와 제지 산업, 육상과 해상의 유류 오염 정화, 처리조의 유지방 분해 등 화학합성 계면활성제가 사용되는 대부분의 다양한 산업분야에서 사용될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 아크레모니움 종(Acremonium sp.) DY07091-2-3-3 (KCCM11891P)로부터 상기 화학식1의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 생산하는 아크레모니움 종(Acremonium sp.) DY07091-2-3-3 (KCCM11891P)를 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 균주로부터 분리된 신규한 화합물을 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 화합물의 생물학적 계면활성제로서의 용도를 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 생물학적 계면활성제는 강력한 계면활성 효과를 보유하며, 생분해가 가능하고 독성이 낮아 인체에 안전하다. 또한, 본 발명의 생물학적 계면활성제는 미생물의 배양에 의해 대량생산이 가능하여 환경 친화적이다.

도 1은 아크레모니움 종(Acremonium sp.) DY07091-2-3-3 (KCCM11891P)의 배양상등액의 Dianion HP-20 column chromatography 후 분획물의 계면활성을 측정한 결과이다.
도 2는 silica gel column chromatography 후 분획물의 silica gel TLC(thin-layer chromatography) 분석 결과이다.
도 3은 silica gel column chromatography 후 분획물의 ODS(octadecyl-silanized) TLC 분석 결과이다.
도 4는 silica gel column chromatography 후 분획물의 계면활성을 측정한 결과이다.
도 5는 sephadex LH-20 column chromatography 후 분획물의 silica gel TLC 분석 결과이다.
도 6은 sephadex LH-20 column chromatography 후 분획물의 ODS TLC 분석 결과이다.
도 7은 sephadex LH-20 column chromatography 후 분획물의 계면활성을 측정한 결과이다.
도 8은 ODS medium pressure liquid chromatography 후 분획물의 ODS TLC 분석 결과이다.
도 9는 화합물 3-3-C1의 ¹H NMR spectrum을 나타낸 도면이다.
도 10은 화합물 3-3-C1의 ¹³C NMR spectrum을 나타낸 도면이다.
도 11은 화합물 3-3-C1의 ¹H-¹H COSY spectrum을 나타낸 도면이다.
도 12는 ¹H-¹H COSY spectrum에 의하여 규명된 화합물 3-3-C1의 부분구조를 나타낸 도면이다.
도 13은 화합물 3-3-C1의 HMQC spectrum을 나타낸 도면이다.
도 14는 화합물 3-3-C1의 HMBC spectrum을 나타낸 도면이다.
도 15는 화합물 3-3-C1의 proton 및 carbon peak assignment을 나타낸 도면이다.
도 16은 HMBC correlation에 의하여 규명된 화합물 3-3-C1의 구성 유닛을 나타낸 도면이다.
도 17은 화합물 3-3-C1의 LC-ESI-MS/MS spectrum을 나타낸 도면이다.
도 18은 LC-ESI-MS/MS spectrum에 의하여 규명된 화합물 3-3-C1의 화학구조를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 발명의 요지가 변경되지 않는 한 다양한 형태로 변형될 수 있다. 그러나 본 발명의 권리범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되면 공지 구성 및 기능에 대한 설명은 생략한다. 본 명세서에서 "포함"한다는 것은 특별한 기재가 없는 한 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명에서 사용한 분석기기는 다음과 같다.

질량분석 스펙트럼( mass spectrum )의 측정

FAB-mass는 Jeol(Japan)사의 JMS-700 MSTATION mass spectrometer를 사용하였으며, mass 측정 시 matrix로는 glycerol 혹은 m-nitrobenzyl alcohol을 사용하였다. High-resolution FAB-mass 측정 시 internal standard로서 polyethylene glycol을 사용하였다.

핵자기공명 스펙트럼( NMR spectrum )의 측정

핵자기공명 스펙트럼은 JEOL사(Japan)의 JNM-ECA600 600MHz FT-NMR spectrometer를 사용하였으며, 내부표준물질로는 TMS(tetramethylsilane)를 사용하였다. 용매로는 CDCl₃를 사용하였으며, chemical shift는 ppm(δ)으로 나타내었다. NMR spectrum은 ¹H NMR, ¹³C NMR 등의 1차원 NMR(one-dimensional NMR)을 비롯하여 ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC 등의 2차원 NMR(two-dimensional NMR)을 측정하였다.

시약

각 정제과정 및 column chromatography에서 사용한 hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol, acetone 등의 용매는 SK케미칼(Korea), 대정화금(Korea) 제품을, HPLC 용매는 Merck(Germany), Baxter(Burdick & Jackson, USA) 제품을 사용하였고, NMR 용매인 CDCl₃ 등은 Aldrich(USA) 제품을 사용하였다. 물질의 분리 및 정제를 위하여 순상 TLC(Merck, Kieselgel 60F, 70-230 mesh, USA) 및 역상 TLC (Merck, RP-18, F₂₅₄, USA), Sephadex LH-20(Pharmacia, bead size 25-100 ㎛, Sweden), ODS sep-pak cartridge(Alltech, RP-18, USA) 등을 사용하였다.

본 발명에 있어서 균주의 선별, 활성성분의 분리 시 계면활성제로서의 활성은 물에 녹인 시료 또는 화합물 20㎕를 파라 필름에 올린 뒤, 퍼지는 정도로 측정하였다. 이때 동량의 증류수를 비교구로 사용하였다.

실시예1 : 균주의 배양

어류인 임연수의 아가미로부터 아크레모니움 종(Acremonium sp.) DY07091-2-3-3 균주를 분리하였다. 상기 아크레모니움 종(Acremonium sp.) DY07091-2-3-3 균주는 2016년 9월 12일자로 한국미생물보존센터에 기탁되었다(기탁번호 KCCM11891P).

아크레모니움 종(Acremonium sp.) DY07091-2-3-3 (KCCM11891P)을 25ℓ의 GPY(glucose-peptone-yeast extract) 배지에서 5일간 배양하였다. 이 때, 4%의 글루코스(glucose)를 탄소원으로 첨가하였다.

배양액을 원심분리하여 약 20ℓ의 상등액을 회수하였다.

실시예2 : 활성성분의 분리 및 정제

상기 아크레모니움 종(Acremonium sp.) DY07091-2-3-3 (KCCM11891P)의 배양상등액에서 활성성분을 분리 및 정제하였다. 구체적인 방법은 아래와 같다.

상기 배양상등액의 농축물을 Dianion HP-20 resin에 흡착시킨 뒤, 각각 50%, 100% 메탄올(methanol)로 용출시켰다. 각 분획물의 계면활성 결과는 도 1과 같다.

활성을 보이는 100% 메탄올의 분획물을 농축하여 메탄올을 제거한 뒤, 동량의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 부가하여 분배 추출하였다. 에틸아세테이트 분획을 농축한 뒤, chloroform-methanol(30:1→1:1, v/v)을 용출용매로 하여 silica gel column chromatography를 수행하였다.

분획물에 대하여 choroform-methanol(5:1, v/v)을 용출용매로 하여 silica gel TLC(thin-layer chromatography) 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 2와 같다.

또한 상기 분획물에 대하여 70% 메탄올을 용출용매로 하여 ODS(octadecyl-silanized) TLC 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 3과 같다.

각 분획물에 대한 계면활성 결과는 도 4와 같다.

도 2 내지 도 4에 있어서, 분획 49번 내지 60번이 활성을 보였고, 이를 취합 및 농축한 뒤 메탄올을 용출용매로 하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 수행하였다.

분획물에 대하여 choroform-methanol(5:1, v/v)을 용출용매로 하여 silica gel TLC 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 5와 같다.

또한 상기 분획물에 대하여 80% 메탄올을 용출용매로 하여 ODS TLC 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 6과 같다.

각 분획물에 대한 계면활성을 평가하였고, 그 결과는 도 7과 같다.

도 5 내지 도 7에 있어서, 분획 11번 내지 14번이 활성을 보였고, 이를 취합 및 농축한 뒤 methanol-water(60:40→100:0, v/v)를 용출용매로 하여 ODS medium pressure liquid chromatography를 수행하였다.

분획물에 대하여 80% 메탄올을 용출용매로 하여 ODS TLC 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 8과 같다. 결과적으로 계면활성이 가장 높은 분획인 화합물 3-3-C1(이하, '3-3-C1'이라 함)을 분리 및 정제할 수 있었다.

실시예3 : 3-3- C1 의 화학구조 해석

실시예2에서 분리 및 정제한 3-3-C1의 화학구조를 밝히기 위하여 ¹H NMR, ¹³C NMR 등의 1차원 NMR과 ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC 등의 2차원 NMR spectrum을 측정하여 해석하였고, 분자량 및 화학구조의 확인을 위하여 LC-ESI-MS/MS spectrum을 측정하여 해석하였다.

1) NMR ( Nuclear Magnetic Resonance ) 스펙트럼의 측정 및 해석

3-3-C1을 CD₃OD에 녹인 후 ¹H NMR, ¹³C NMR, ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC spectrum을 측정하였다.

¹ H NMR spectrum 의 측정 및 해석 : ¹H NMR spectrum을 측정한 결과를 도 9에 도시하였다.

도 9를 참조하면,

- 5.07, 4.20, 4.07, 3.73ppm에서 oxygenated methine,

- 1.2 ~ 2.6ppm에서 methylene,

- 1.14, 0.91ppm에서 methyl기에서 유래하는 proton이 관찰되었음을 알 수 있다.

이들 각각의 피크들은 매우 겹쳐진 상태로 나타났기 때문에 3-3-C1은 동일한 유닛(unit)이 반복되는 화학구조를 지닌 것으로 유추되었다. 또한 일부의 불순물에 기인하는 시그널들이 겹쳐져 관찰되었다.

¹³ C NMR spectrum 의 측정 및 해석 : ¹³C NMR spectrum을 측정한 결과를 도 10에 도시하였다.

도 10을 참조하면,

- 173.1ppm에서 겹쳐진 carbonyl carbon,

- 73.4, 71.0, 68.5, 68.4, 66.8ppm에서 약 열 개의 oxygenated methine carbon,

- 22 ~ 45ppm에서 다수의 methylene carbon,

- 23.6, 14.5ppm에서 겹쳐진 methyl carbon이 관찰되었음을 알 수 있다.

또한 이들 각각의 피크들은 ¹H NMR spectrum 결과와 유사하게 매우 겹쳐진 상태로 나타났다. 따라서 앞서 유추한 바와 같이 3-3-C1은 동일한 유닛이 반복되는 화학구조를 지닌 것으로 추정되었다.

¹ H- ¹ H COSY spectrum 의 측정 및 해석 : 3-3-C1의 화학구조를 규명하기 위해 상호 이웃한 수소 간의 상관관계(³ J _H _-H)를 규명할 수 있는¹H-¹H COSY spectrum을 측정하였다. 그 결과를 도 11에 도시하였다.

도 11에서 해석된 상호 이웃한 수소 간의 상관관계로부터 3-3-C1의 구성단위인 3,5-dihydroxydecanoyl moiety 및 3,5,9-trihydroxydecanoyl moiety의 존재가 유추되었다.

도 12는 최종적으로 구조가 규명된 3-3-C1의 화학구조에서 본 ¹H-¹H COSY spectrum을 통해 해석된 부분구조를 굵게 표시하여 도시한 것이다.

HMQC spectrum 의 측정 및 해석 : 3-3-C1의 화학구조를 규명하기 위하여 수소-탄소간의 상관관계(¹ J _C _-H)를 규명할 수 있는HMQC spectrum을 측정하였다. 그 결과를 도 13에 도시하였다. 이를 통해 3-3-C1을 구성하는 모든 수소와 탄소 간의 상관관계를 규명할 수 있었다.

HMBC spectrum 의 측정 및 해석 : 3-3-C1의 화학구조를 규명하기 위하여 수소-탄소간의 2-bond 혹은 3-bond 결합 관계(² J _C _-H, ³ J _C _-H)를 규명할 수 있는HMBC spectrum을 측정하였다. 그 결과를 도 14에 도시하였다.

- 0.91ppm의 methyl proton으로부터 32.8, 23.7ppm의 methylene carbon에 long-range correlation이 관찰되었고,

- 1.14ppm의 methyl proton으로부터 68.5ppm의 oxygenated methine carbon과 40.2ppm의 methylene carbon에 long-range correlation이 관찰되었으며,

- 2.52, 2.43ppm의 methylene proton으로부터 carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었다.

- 또한 5.07ppm의 oxygenated methine proton은 carbonyl carbon과 결합하여 ester bond를 형성하고 있음을 알 수 있었다.

각각의 proton 및 carbon peak의 귀속을 도 15에 나타내었다.

이상의 결과로부터 3-3-C1은 도 16에 도시된 바와 같이 두 개의 3,5-dihydroxydecanoyl moiety와 두 개의 3,5,9-trihydroxydecanoyl moiety로 구성된 화합물임을 알 수 있었다. 그러나 이들 유닛의 결합 순서는 각 시그널의 겹침으로 인해 규명할 수 없었다. 따라서 각 유닛의 결합순서는 이하 MS/MS 측정을 통하여 규명하였다.

2) ESI - MS / MS spectrum 의 측정 및 해석

negative mode에서 3-3-C1에 대한 LC-ESI-MS/MS spectrum을 측정하였다. 그 결과는 도 17과 같다.

도 17을 참조하면, m/z 793.5에서 [M+H]⁺피크가 관찰되어 3-3-C1의 분자량이 794임을 밝혔고, 이는 추정된 분자량과 정확히 일치하였다.

또한 3-3-C1를 구성하는 유닛의 순서를 결정하기 위하여 MS/MS spectrum을 측정한 결과, m/z 591, 405, 219, 203에서 fragment peak가 관찰되었는바 3-3-C1은 이하 화학식1 및 도 18과 같이 trihydroxy-dihydroxy-dihydroxy-trihydroxydecanoyl의 순서로 각 유닛이 결합된 화합물임을 확인하였다.

[화학식1]

규명된 화학구조를 바탕으로 database 검색 및 문헌 검색을 수행한 결과 동일한 구조의 화합물이 발견되지 않았다. 이에 3-3-C1은 신규 화합물로 판명되었다.

이상으로 본 발명에 대해 상세히 설명하였다. 다만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 않고, 이하의 특허청구범위에 의해 정해진다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11891P

20160912

Claims

하기 화학식1로 표기되는 화합물.
[화학식1]
제1항에 있어서,
상기 화합물은 Acremonium sp. DY07091-2-3-3 (KCCM11891P) 균주로부터 분리되는 것인 화합물.
제1항 또는 제2항의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 계면활성제.
Acremonium sp. DY07091-2-3-3 (KCCM11891P) 균주로부터 하기 화학식1의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법.
[화학식1]
하기 화학식1의 화합물을 생산하는 Acremonium sp. DY07091-2-3-3 (KCCM11891P) 균주.
[화학식1]