KR20180132835A

KR20180132835A - 담배잎 추출물 및 담배 중독의 치료를 위한 이의 용도

Info

Publication number: KR20180132835A
Application number: KR1020187032224A
Authority: KR
Inventors: 브뤼노 라퐁
Original assignee: 엔에프엘 바이오사이언시스
Priority date: 2016-04-07
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2018-12-12
Also published as: US11865156B2; ZA201807436B; BR112018070579B1; ES2971275T3; AU2017248103B2; CN109195616B; UA126794C2; CA3020055A1; IL262145A; CN109195616A; EP4285999A3; WO2017174787A1; KR102408766B1; PH12018502138A1; AU2017248103A1; US11123395B2; JP2019511516A; BR112018070579A2; IL262145B; ZA202201610B

Abstract

본 발명은 분자 질량이 10 kDa을 초과하는 단백질을, 추출물의 총 중량에 대해서, 적어도 5 중량%로 함유하고, 분자 질량이 10 kDa 미만인 분자가 본질적으로 없는 담배 잎 추출물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 추출물을 함유하는 약학 조성물 및 담배 중독의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

담배잎 추출물 및 담배 중독의 치료를 위한 이의 용도

본 발명은 담배잎 추출물, 뿐만 아니라 이러한 담배 잎 추출물을 함유하는 약학 조성물 및 담배 중독의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

일반적으로, 의존증 또는 중독은 세계 보건 기구에서 "물질의 사용이 한때 더 큰 가치를 가졌던 다른 행위보다 훨씬 더 높은 우선순위로 취해지는 증후군이다. 이의 극단적인 형태에서, 의존 상태는 이러한 의존증을 앓고 있는 개체가 이 물질을 충동적으로 찾도록 강제하는 물질에 대한 거부할 수 없는 욕구를 특징으로 한다"라고 정의하였다.

담배 의존증은 많은 흡연-관련 질환 예컨대 암 (폐, 인후, 입, 입술 등), 심혈관 질환, 만성 기관지염 등과 함께, 주요한 공공 보건 문제를 야기한다. 질환 그 자체 외에도, 흡연은 많은 부작용 (출산력 저하, 표피의 변질, 구강 및 비점막의 변질, 대뇌 동맥의 변질, 식도 및 위의 손상, 비타민 B 및 C의 결핍 등)을 갖는다.

부수적으로 작용하는 3가지 유형의 담배 의존증이 존재하는데, 본질적으로 담배 내 니코틴의 존재에 기인하고 욕구의 감정 (흡연에 대한 강력한 충동, 흥분성, 신경질, 동요감, 불안감, 수면 장애 등)으로서 발현되는 신체적 의존증; 즐거움, 이완감, 지적 자극, 불안완화, 항우울성 및 식욕 억제 작용을 제공하는 니코틴의 정신작용 효과와 연관된 정신적 의존증; 및 사회적 및 친분적 압박에 의존하는 환경 또는 행위 의존증이다. 신체적 의존증은 평균 수 주 내에 사라진다. 금단 징후는 흡연 후 대략 3일 내지 4일 쯤에 최고조에 달하고 몇주간 지속될 수 있다. 정신적 의존증은 약화되는데 더 긴 시간이 걸리고 수 개월간 지속될 수 있다.

담배 의존증은 긍정적 및 부정적 강화를 통해서 유지된다. 니코틴은 보상 회로의 신경전달물질인, 도파민의 방출을 담당한다. 흡연자는 도파민의 방출에 의해 야기되는 즐거운 감정을 재현하고 (이것이 담배의 긍정적 강화임) 또한 그의 도파민 수준이 너무 낮아졌을 때 금단 징후를 피하기 위해서 (이것이 담배의 부정적 강화임) 흡연을 한다.

담배 의존증의 약리학적 치료에 관해 3가지 주요 방법이 존재한다. 첫번째는 초기에 설정한 목표 금연일자에서 즉각적인 중단을 목표로 하는데, 약리학적 치료는 니코틴 대체물의 경우에는 이러한 목표 금연일 이후에 투여되고 부프로피온 또는 바레니클린의 경우에는 1주 전에 투여된다 (목표 금연일 시점에 충분한 혈장 농도에 도달하기 위함). 두번째는 금연 시도 이전에 그 소비를 감소시키는 것으로 이루어지며, 여기서 감소기는 약리학적 치료가 투여되는 동안의 예비치료에 해당된다. 세번째는 성공적인 금연 이후 재발 예방이다. 이들 3가지 방법에 금연 시도없이 축소가 첨가될 수 있다.

이들 각 방법의 효능은 흡연을 중단하고 그렇게 하려는 그의 동기부여를 강화할 필요성을 그 자신이 확신해야만 하는, 흡연자에 대한 준비 기간에 의해 강화된다. 따라서, 담배 의존증에 대한 약리학적 치료제에 관한 처방 정보는 금연 치료가 흡연을 멈추고자 동기부여된 환자에서 더 성공할 가능성이 있다는 것을 의미한다.

현재 담배 의존증을 위해 4가지 주요한 유형의 치료 (행동 정신요법, 침술 및 최면을 언급하지 않음), 즉 니코틴 대체물, 부프로피온, 바레니클린 및 동종요법이 존재한다. 이들 4가지 방법 각각의 작용 원리는 니코틴이 담배 의존증의 기전을 담당하는 분자라는 사실을 기반으로 한다.

니코틴 대체물은 다양한 방식으로, 즉 팻치의 형태로 경피적으로, 씹는 검, 로젠지 또는 설하 정제의 형태로 경구로, 또는 흡입기의 형태로 폐 경로를 통해서 투여될 수 있다. 니코틴 대체물의 투여는 주로 담배의 니코틴을 보상하는 대체물에 의해 제공되는 니코틴으로, 흡연자가 금연과 관련된 금단 징후를 느끼는 것을 가능한 많이 방지함으로써 담배의 부정적 강화의 감소를 가능하게 한다. 니코틴 대체물의 효능은 사용되는 방법에 따라 다양한데, 금연율이 일반적으로 15 내지 20% 범위이다. 니코틴 대체물은 즉각적인 금연의 시도 동안 사용되고 또한 점진적인 중단의 일부로서 그들 담배 소비를 감소시키려는 (중지까지 축소) 흡연자를 돕기 위한 중단 시도 이전의 예비치료로서 사용된다. 그들은 또한 담배 소비를 감소시키려는 유일한 목적으로 사용될 수도 있다. 재방 방지에서 그들 효과는 아직 입증되지 않았다.

GlaxoSmithKline Laboratories (상표명 Zyban®)에서 판매하는 부프로피온은, 일정한 뇌 신경전달물질 예컨대 카테콜아민, 노르아드레날린 및 도파민에 작용한다. 부프로피온은 항우울제 특성을 제공하는, 선택적인 카테콜아민 재흡수 억제제이다. 이의 효능은 니코틴 팻치의 사용 이후에 수득되는 것과 균등하다 (대략 20%의 금연율). 이것은 비슷한 효능에 대해 더 낮은 이득/위험 비율때문에 니코틴 대체물보다 덜 처방된다. 실제로, 이는 자살 시도를 초래할 수 있다.

Pfizer Laboratories (상표명 Chantix® 또는 Champix®)에서 판매하는 바레니클린은 니코틴성 아세틸콜린 수용체의 부분 효현제이다. 바레니클린은 이중 작용으로 이들 수용체를 표적화하는데, α4β2 수용체 부분 효현제는, 더 낮은 강도로 니코틴에 의해 유도되는 것과 유사한 반응을 일으키고 (따라서 금단 동안 욕구 효과를 감소시킴), 치료 시작 시에, 흡연자가 때때로 흡연하면서 치료할 때, 니코틴의 존재 하에서 신경화학적 자극을 약화시킨다 (α4β2 수용체 부분 길항제). 따라서, 바레니클린은 담배의 부정적 (금단 효과) 및 긍정적 (흡연 충동) 강화를 감소시키게 된다. 실제로, 바레니클린은 금연의 향후 성공을 위한 기준이 되는, 흡연의 즐거움을 감소시킨다. 이의 효능은 니코틴 대체물보다 훨씬 크다 (약 28%의 금연율). 바레니클린은 즉각적인 금연 시도에 사용되고 또한 점진적인 금연의 일부로서 그들 담배 소비를 감소시키려는 (흡연까지 축소) 흡연자를 돕기 위한 금연 시도 이전에 수 주 동안 예비 치료로서 사용된다. 최초 실험 (NCT00789074)에서, 흡연자의 35%가 바레니클린에 의한 3주의 예비치료 이후에 이루어진 시점에 따라서 적어도 50% 만큼 그들 담배 소비를 감소시킬 수 있었다. 2차 실험 (NCT00835900)에서, 바레니클린에 의한 4주 예비치료가 이루어진 시점에 따라 흡연된 담배 개수의 감소율을 42%였다. 3차 실험 (NCT01370356)에서, 흡연자의 47%가 바레니클린에 의한 4주 예비치료 이후에 이루어진 시점에 따라서 적어도 50%만큼 그들 담배 소비를 감소시킬 수 있었다. 재발 방지에서 이의 효능은 아직 입증되지 않았다. 그러나, 바레니클린은 빈번한 부작용 (구역질)을 유도하고 심장 문제 또는 자살 시도의 원인이 될 수 있다. 이들 부작용은 니코틴 대체물보다 우수한 효능에도 불구하고, 바레니클린이 종종 니코틴 대체물에 의한 실패 이후에 차선 요법으로서만 처방된다는 것을 의미한다.

4번째 금연 경로는 동종요법으로서, 이것은 제어하고자 하는 징후를 야기하는 물질의 극미량 사용을 기반으로 한다. "타바쿰 (tabacum)"의 추출물이 종종 금연에 사용된다. 아일랜드 특허 출원 IE 960 511은 특히 뉴런 기능의 복원 및 니코틴 금단 징후의 경감을 의도하는 의학 제품의 제조를 위한 담배 추출물의 동종요법 희석물의 사용을 기술하고 있다. 다른 비통상적인 금연 기술처럼, 이의 효능은 많이 피우는 골초 흡연자에게는 불충분하다.

이 분야에서 엄청난 연구에도 불구하고, 새로운 치료를 찾거나 또는 담배 의존증에 대한 현행 치료를 개선해야 하는 필요성이 여전히 존재한다.

국제 특허 출원 PCT/FR2007/000786에서, 출원인은 흡연자에게 담배 잎 추출물의 수용액을 주사하는 것이 상기 흡연자의 담배 의존증을 치료할 가능성이 있다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 출원인이 상기 수성 담배 잎 추출물이 소량의 니코틴을 함유한다는 것을 결정할 수 있었기 때문에 진심으로 예상밖이었다. 따라서, 이러한 수성 담배 잎 추출물을 사용하는 담배 의존증의 치료에 관여되는 작용 기전은 흡연자에게 니코틴의 공급은 아니다.

그러나, 상기 수성 담배 잎 추출물이 소량의 니코틴을 함유한다는 사실은 이의 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 정보를 제공하지 않았다. 수성 담배 잎 추출물의 니코틴 함량은 사실 많은 인자에 따라서 상당히 가변적일 수 있다.

담배 잎 내 니코틴 함량은 성장되는 담배의 주요 유형에 따라 0.5 내지 8%로 가변적일 수 있다 (Davis et al., "Production, Chemistry, and Technology", ISBN-13: 978-0632047918, Chapter 8, page 275).

버어리 (Burley) 담배는 메릴랜드 담배보다 약 2배 더 니코틴을 함유하고 오리엔탈 담배보다는 3배 더 많은 니코틴을 함유한다 (Leffingwell, "Chemical constituents of tobacco leaf and differences among tabacco types", Leffingwell Reports, Vol. 1 (No. 2), February, 2001).

질소 비료의 사용은 담배 잎의 니코틴 함량에 영향을 미치며 니코틴 함량은 하부 잎보다 중간 잎에서 더 높고, 중간 잎보다는 상부 잎에서 더 높다 (Xiao-Tang et al., "Yield and nicotine content of flue-cured tobacco as affected by soil nitrogen mineralization", Pedosphere 18(2): 227-235, 2008, ISSN 1002-0160/CN 32-1315/P).

윤작은 담배 잎의 니코틴 함량에 영향을 미친다 (Butorac et al., "The Effect of Tobacco Monoculture and Crop Rotations on Tobacco Leaf Composition", Agriculturae Conspectus Scientificus, Vol. 69 (2004) No. 4 (95-101)).

담배 잎의 화학적 조성 및 니코틴 함량은 자외선 조사 및 빛의 세기에 의해 영향을 받는다 (Andersen et al., "Chemical composition of tobacco leaves altered by near-ultraviolet and intensity of visible light", Plant Physiol. (1973) 51, 723-726).

추출물 제조 방법, 특히 침용 횟수 및 조건, 멸균 방법, 및 물리적 및 화학적 분리가 또한 니코틴 함량에 영향을 미친다.

담배 추출물 예컨대 국제 특허 출원 PCT/FR2007/000786에 기술된 것은 저 분자 질량, 즉 10 kDa 미만의 분자를 포함한다. 이들 저분자량 분자는 비휘발성 알칼로이드로부터 유래되는 담배-특이적 N-니트로사민 (TSNA) 및 N-니트로소아미노산, 휘발성 알데히드, 다핵성 방향족 탄화수소 (예컨대 벤조[a]피렌), 락톤, 우레탄, 또는 금속 예컨대 예를 들어 카드뮴을 포함한다 (문헌 [Wagner et al., Plant Physiol. 1986, 82, 274-279] 및 [IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Human, vol. 49]를 참조함). 이들 화합물은 발암성, 돌연변이유발성 또는 독성일 수 있고 암 뿐만 아니라 신장과 뼈 문제를 야기시킬 수 있다. 따라서 이들 화합물은 상기 화합물을 함유하는 조성물이 투여된 환자의 건강에 유해하다.

이러한 담배 추출물은 모든 분자량의 많은 단백질을 포함한다. 예를 들어, Swiss-Prot 데이타베이스는 759종의 담배 단백질을 동정하였다. RuBisCO 단백질이 단독으로 가용성 단백질의 30 내지 50%를 대표할 수 있다. 완전한 RuBisCO 단백질은 전형적으로 약 540 kDa의 단백질 복합체를 형성하는 8개 서브유닛을 갖는다. 용액 중 피하로 투여되는 이들 단백질의 독성은 그들 전부 또는 일부가 임의의 치료적 효과에 관여될 수 있을지라도 알려져 있지 않다.

본 발명의 목적은 담배 중독에 효과적인 치료를 제공하는 것이다. 유리하게는, 이러한 치료는 무독성이고, 환자가 잘 견디며, 원칙적으로 치료적 효과를 갖지 않는 미지 독성의 분자의 투여를 가능한 많이 감소시켜서 제한된 위험성을 나타낸다.

담배 추출물이 수천개의 화합물을 함유하지만, 출원인은 놀랍게도 담배 잎 추출물 유래의 단백질이 금연을 촉진하는 특이적 IgG 면역 반응을 유도한다는 것을 발견하였다. 따라서, 높은 단백질 함량 및 특정 단백질 조성을 갖는 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 금연을 촉진하는 특이적 IgG 면역 반응을 유도한다.

이러한 발견은 수성 담배 잎 추출물이 수천개의 화합물을 함유하나, 단백질은 다른 것들 중에서도 화합물의 오직 한 패밀리를 구성하므로 더욱 더 놀랍다. 담배 단백질은 담배 중독에서 역할을 하는 것으로 알려져 있지 않고 따라서 금연에서 그들을 사용해야 하는 동기가 존재하지 않는다.

출원인은 특히 본 발명에 따른 담배 잎 추출물이 높은 단백질 함량 및 특정 단백질 조성을 갖는다는 것을 확인하였다. 이러한 특정 단백질 조성은 특히 건조된 담배 잎을 사용할 때 수득할 수 있다. 건조 (curing) 는 예를 들어 가수분해 기전을 통한, 단백질의 분해, 및 담배 잎 내 자유 아미노산의 증가를 촉진한다 (Hamilton & Lowe, 1978; Long & Weybrew, 1981; Burton, et al., 1983).

출원인은 놀랍게도, 본 발명에 따라서 담배 잎 추출물 유래의 단백질이 금연을 촉진하는 특이적 IgG 항체의 생성을 유도한다는 것을 발견하였다. 출원인은 본 발명에 따른 담배 잎 추출물의 투여가, 그 추출물에 면역 반응을 촉진시킬 수 있는 보조제를 첨가하지 않고도, 특이적 IgG 면역 반응을 유도하고 담배 중독에 효과적인 치료를 수득하는 것을 가능하게 한다는 것을 확인하였다. 출원인은 특이적 IgG 면역 반응, 담배 중독의 치료, 및 금연이 건조된 담배 잎의 추출물을 사용할 때 특히 효과적이라는 것을 확인하였다.

이러한 발견은 담배 잎 추출물 단백질에 특이적인 IgG 항체가 흡연자가 흡연을 줄이거나 또는 중지하는데 도움을 줄 개연성이 있음을 시사하는 것이 선행 기술에서는 없었기 때문에 더욱 더 놀랍다. 담배 추출물의 투여 이후 특이적 IgG 면역 반응의 활성화 및 금연에서 담배 추출물의 역할은 지금까지 전혀 설명된 적이 없었다. 금연을 촉진할 수 있는 면역계 (특히 특이적 IgG 항체의 생산에 관여)와 신경계 (특히 흡연 행동 및 행위의 지각에 관여) 사이의 이러한 연결성은 지금까지 설명된 적이 없었다.

유리하게는, 본 발명에 따른 담배 중독의 치료는 본 발명에 따른 약학 조성물의 단지 수회의 투여, 유리하게는 오직 1회 투여만을 요구하여서, 담배의 강화 효과를 환자가 더 이상 느끼지 않거나 또는 상당히 덜 느끼게 되며, 특히 흡연하고 싶은 충동 (긍정적 강화) 및 담배의 기호성이 감소된다.

제1 양상에서, 본 발명은 건조 추출물의 총 중량을 기준으로, 적어도 5 중량%의 10 kDa을 초과하는 분자 질량의 단백질을 함유하고, 10 kDa 미만의 분자 질량의 분자가 본질적으로 없는 담배 잎 추출물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 단백질은 하기의 단백질 패밀리로 이루어진 군으로부터 선택된다: 리그닌-형성 음이온성 퍼옥시다제, 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제, 엔도키티나제, 병원성-관련 단백질, 오스모틴 및 프로테이나제 억제제 및 이의 혼합물.

본 발명은 더 나아가서 상기 담배 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물 및 담배 중독의 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가서 상기 담배 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물 및 금연에서 이의 용도에 관한 것이다.

더 나아가서 본 발명은 담배 중독 또는 의존증을 앓는 대상체에게 상기 담배 잎 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 담배 중독을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

더 나아가서 본 발명은 담배 중독을 앓고 있는 대상체에게 상기 담배 잎 추출물을 포함하는 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 담배 중독을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 문맥에서, 담배 의존증 또는 중독의 치료는 모든 형태의 담배 소비, 즉 제조 담배 또는 말린 (rolled) 담배, 가는 담배 (cigarillo) 또는 시가, 파이프 담배 형태의 흡연 담배뿐만 아니라, 무연 담배 예컨대 코담배, 씹는 담배 또는 스누스를 포괄한다.

본 발명은 또한 건조 추출물의 총 중량을 기준으로 적어도 5 중량%의 10 kDa을 초과하는 분자 질량의 단백질을 함유하고, 10 kDa 미만의 분자 질량의 분자가 본질적으로 없는 상기 담배 잎 추출물을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:

a. 담배 잎을 건조시키는 단계,

b. 건조된 담배 잎을 분쇄하여 분쇄된 건조 담배 잎을 수득하는 단계,

c. 용매, 예를 들어 수성 용매, 바람직하게는 pH가 6.0 내지 8.5인 수성 완충 용액으로 기계적 교반 하에서 분쇄된 건조 담배 잎을 추출하는 단계,

d. 여과 또는 원심분리에 의해서 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액으로부터 고형 잔류물을 분리하여 고형 잔류물-무함유의 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액을 수득하는 단계,

e. 추출물의 부피를 기준으로 2 내지 12배 부피, 바람직하게는 3 내지 10배 부피, 바람직하게는 4 내지 8배 부피, 바람직하게는 6배 부피 범위의 양으로, 용매, 바람직하게는 수성 용매, 및 10 kDa 컷오프 멤브레인을 사용하여 단계 d에서 수득된 용액을 일정 부피 여과시키는 단계,

f. 임의로 단계 e에서 수득된 단백질 용액을 동결건조시키는 단계.

본 발명은 또한 건조 추출물의 총 중량을 기준으로 적어도 5 중량%의 10 kDa 초과의 분자 질량의 단백질을 함유하고, 10 kDa 미만의 분자 질량의 분자가 본질적으로 없는 상기 담배 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

도 1. 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 전기영동 프로파일의 예시도: MES 완충액 중에서 환원제의 존재 하에 4% 내지 12% NuPage 겔 상에서의 분획화.
도 2. 마우스에서 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 주사 이후 IgG 유도.
도 3. 활성화된 면역 세포의 특징규명을 위한 면역표현형의 예시도.
도 4. 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물에 의한 자연 살해 세포의 활성화.
도 5. T 및 B 림프구에 대한 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 활성.
도 6. 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물에 의한 전염증성 사이토카인 및 IFNγ의 유도.
도 7. 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물에 의한 TH2 사이토카인 및 케모카인 및 조혈 성장 인자의 유도.
도 8 및 9. 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 투여에 의해 치료된 환자에서 담배 소비의 변화.

담배 잎 추출물

본 발명은 건조 추출물의 총 중량을 기준으로, 적어도 5 중량%, 바람직하게는 적어도 10 중량%, 바람직하게는 적어도 15 중량%, 바람직하게는 약 20 중량%의 10 kDa을 초과하는 분자 질량의 단백질을 함유하고 10 kDa 미만의 분자 질량의 분자가 본질적으로 없는 담배 잎 추출물에 관한 것이다.

건조 추출물은 유리하게는 본 발명에 따라서 담배 잎 추출물의 동결건조 이전에 수득된 후, 일정 질량의 추출물이 수득될 때까지, 진공 벨-쟈 하에, 바람직하게는 P₂O₅의 존재 하에 배치된다.

유리하게는, 10 kDa 미만의 분자 질량의 분자의 함량은 추출물의 총 중량을 기준으로 5 중량% 미만, 바람직하게는 2.5 중량% 미만, 더욱 더 좋게는 1 중량% 미만이다.

본 발명의 목적을 위해서, "약"은 측정 불확실성에 기인하여 1%를 더하거나 또는 뺀 것을 의미한다.

담배 잎 추출물에서 일반적으로 측정되는 10 kDa을 초과하는 분자 질량의 단백질의 함량은 약 1%이다. 그러므로, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 10 kDa을 초과하는 분자 질량의 단백질의 함량이 이전에 알려진 것보다 훨씬 더 높다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 추출물에 존재하는 단백질은 하기 단백질 패밀리로 이루어진 군으로부터 선택된다: 리그닌-형성 음이온성 퍼옥시다제, 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제, 엔도키티나제, 병원성-관련 단백질, 오스모틴 및 프로테이나제 억제제 및 이의 혼합물.

본 발명에 따른 추출물에 존재하는 단백질을 표시하는 명칭은 단백질 서열을 열거하는 생물학적 데이타베이스인 Swiss-Prot 데이타베이스에 제공된 명칭에 상응한다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제 패밀리에 속하고, 바람직하게는 베타-1,3-엔도글루카나제 산성 이소폼 PR-Q'(UniProt 데이타베이스에 따라 PR36401), 베타-1,3-엔도글루카나제 염기성 액포 이소폼 GLB (UniProt 데이타베이스에 따라 P27666), 및 이의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 포함한다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 엔도키티나제 패밀리에 속하고, 바람직하게는 산성 엔도키티나제 P (UniProt 데이타베이스에 따라 P17513), 산성 엔도키티나제 Q (UniProt 데이타베이스에 따라 P17514), 엔도키티나제 B (UniProt 데이타베이스에 따라 P24091), 및 이의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 포함한다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 적어도 오스모틴 (UniProt 데이타베이스에 따라 P14170)을 포함한다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 적어도 하나의 리그닌-형성 음이온성 퍼옥시다제 (UniProt 데이타베이스에 따라 P11965)를 포함한다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 적어도 하나의 병원성-관련 단백질로서, 바람직하게는 병원성-관련 단백질 R (UniProt 데이타베이스에 따라 P13046), 병원성-관련 단백질 PR-4A (UniProt 데이타베이스에 따라 PR29062), 병원성-관련 단백질 PR-4B (UniProt 데이타베이스에 따라 PR29063), 및 이의 혼합물로부터 선택된 것을 포함한다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 프로테이나제 억제제 패밀리에 속하고, 바람직하게는 프로테이나제 억제제 I-B (UniProt 데이타베이스에 따 라 Q03199), 프로테이나제 억제제 I-A (UniProt 데이타베이스에 따라 Q03198), 및 이의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 포함한다.

일 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 또한 10 kDa을 초과하는 분자 질량의 다당류, 바람직하게는 수용해성인 것을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 건조 추출물의 총 중량을 기준으로, 적어도 5 중량%, 바람직하게는 적어도 10 중량%, 바람직하게는 적어도 15 중량%, 바람직하게는 약 20 중량%의 하기 단백질 패밀리로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다: 리그닌-형성 음이온성 퍼옥시다제, 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제, 엔도키티나제, 병원성-관련 단백질, 오스모틴 및 프로테이나제 억제제 및 이의 혼합물.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물에는 고 분자 질량 단백질이 본질적으로 없다.

본 발명의 목적을 위해서, "고 분자 질량 단백질"은 그 분자 질량이 500 kDa을 초과하는, 바람직하게는 그 분자 질량이 400 kDa을 초과하는, 보다 바람직하게는 그 분자 질량이 300 kDa을 초과하는, 우선적으로 그 분자 질량이 200 kDa을 초과하는, 보다 더 우선적으로 그 분자 질량이 150 kDa를 초과하는, 더욱 더 좋게는 그 분자 질량이 100 kDa을 초과하는 단백질을 의미한다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물에는 그 분자 질량이 50 kDa을 초과하는 단백질이 본질적으로 없다.

본 발명의 목적을 위해서, "실질적으로 없는"은 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 15 중량% 미만의 분자 함량, 바람직하게는 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 10 중량% 미만의 분자 함량, 보다 바람직하게는 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 7.5 중량% 미만, 보다 바람직하게는 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 5 중량% 미만, 우선적으로 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 2.5 중량% 미만, 보다 우선적으로 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 1 중량% 미만, 더욱 더 좋게는 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 0.5 중량% 미만을 의미한다.

유리하게는, 고 분자 질량 단백질의 함량은 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 15 중량% 미만, 바람직하게는 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 10 중량% 미만, 보다 바람직하게는 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 7.5 중량% 미만, 보다 바람직하게는 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 5 중량% 미만, 우선적으로 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 2.5 중량% 미만, 더 우선적으로, 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 1 중량% 미만, 더욱 더 좋게는 추출물의 총 단백질 중량을 기준으로 0.5 중량% 미만이다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물에는 RuBisCO 단백질이 본질적으로 없다.

일 구체예에 따라서, 담배 잎은 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana Tabacum) 품종 또는 니코티아나 루스티카 (Nicotiana Rustica) 품종이다. 담배 잎은 갈색 또는 금색 담배로부터 생산될 수 있고, 버지니아 담배, 버어리 담배, 오리엔탈 담배, 라타키아 담배, 페리크 담배, 메릴랜드 담배, 켄터키 담배, 캘리포니아 담배, 텍스 멕스 담배, 및 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

물론, 추출물은 반드시 담배 잎의 순수한 추출물로 이루어지는 것은 아니고, 대마로부터 추출된 단백질이 담배 및 대마 의존증 둘 모두를 치료하기 위해 첨가될 수 있다.

특정 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 갈색 담배, 버지니아 담배 및 버어리 담배의 1/1/1 블렌드로부터 수득된다.

특정 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 버어리 담배로부터 수득된다.

일 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 건조된 담배 잎으로부터 수득된다.

특정 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 자연풍-건조된 담배 잎으로부터 수득된다.

특정 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 지역 기후 조건에 적합화된 기간 동안, 바람직하게는 1개월의 최소 기간 동안 자연풍-건조된 담배 잎으로부터 수득된다.

본 발명의 목적을 위해서, "자연풍-건조" 또는 "자연 건조"는 자연적인 외부 또는 내부 공기의 존재 하에서 수행되는 건조를 의미한다. 자연풍-건조는 개방 또는 밀폐, 덮개 또는 비덮개 구조물에서 수행될 수 있다. 자연풍-건조는 예를 들어 자연 건조실에서 수행될 수 있다. 이러한 경우에서, 신선하게 수확되거나 또는 사전 건조된 담배 잎을 외기의 효과 하에서 자연적으로 건조되도록 둔다. 담배 잎은 예를 들어 비가열된 환기실에 매달아 둘 수 있다. 담배 잎은 예를 들어 그들이 갈색으로 변할 때까지 자연적으로 건조되도록 둘 수 있다. 이 단계에서, 사실상 잎에 당류가 남지 않게 된다. 유리하게는, 건조는 지역 기후 조건에 적합화된 기간 동안, 바람직하게는 1개월의 최소 기간 동안 수행된다. 예로서, 건조는 중부 프랑스에서 수확을 위한 9월 내지 12월 사이에 수행될 수 있다. 담배 잎은 균일한 건조를 가능하게 하고 잎의 부패 또는 분해 및 응결의 형성을 피하기 위해서, 건조 동안 1회 이상 공기를 통하게 하거나 또는 뒤집어 놓을 수 있다. 자연풍-건조 방법은 예를 들어 버어리 품종 담배에 사용될 수 있다.

특정 구체예에 따라서, 담배 잎의 추출물은 자연적인 건조실에서 건조된 담배 잎으로부터 수득된다.

다른 특정 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 가열된 건조실에서 건조되는 담배 잎으로부터 수득된다. 이 경우에서, 건조는 적합한 온도로 가열된 건조실 또는 구조물에서 수행될 수 있다.

다른 특정 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 열풍-건조된 담배 잎으로부터 수득된다. 이러한 경우에서, 건조는 적합한 온도로 가열된 구조물 또는 건조실에서 수행될 수 있다. 열은 외부 열원에 접속된 도관을 통해서 구조물 또는 건조실로 유입될 수 있다. 이렇게 제어된 가열은 황색-오렌지색 잎을 생성시킨다. 따라서 이들 잎은 높은 당류 함량을 함유한다. 예를 들어, 버지니아 담배가 이 방법에 따라 건조될 수 있다.

다른 특정 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 햇빛-건조된 담배 잎으로부터 수득된다. 이러한 경우에서, 담배 잎은 받침대 위에 펼쳐두고 12일 내지 30일 동안 햇빛에 노출시킬 수 있다. 햇빛으로부터의 직사광 및 열기 하에서, 잎은 황색 또는 오렌지색으로 변하고 높은 당류 함량을 유지한다. 일반적으로, 오리엔탈 담배가 이러한 방법을 사용해 건조된다.

다른 특정 구체예에 따라서, 담배 잎 추출물은 직화-건조된 담배 잎으로부터 수득된다. 이러한 경우에서, 작은 조각의 나무를 담배 잎 아래에서 태울 수 있고, 그 담배 잎은 "훈연" 아로마를 흡수하면서 건조된다.

본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 유리하게는 수성 추출물이다.

본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 유리하게는 색상이 갈색인 수성 추출물이다.

바람직하게는, 담배 잎 추출물은, 예를 들어 수성 용매를 사용하는, 분쇄된 건조 담배 잎의 용매 추출 공정에 후속하여, 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액으로부터 고형 잔류물을 분리시킨 후, 추출물의 부피를 기준으로 2 내지 12배 부피, 바람직하게는 3 내지 10배 부피, 바람직하게는 4 내지 8배 부피, 바람직하게는 6배 부피 범위의 양의 수성 용매, 및 10 kDa 컷오프 멤브레인를 사용하는 고형 잔류물-무함유의 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액의 일정-부피 투석여과를 통해서 수득될 수 있다.

물론, 다른 유형의 용매가 담배 잎 추출물의 추출 공정을 수행하는데 사용될 수 있다. 단계 c의 추출은 유기 또는 무기 용매, 또는 유기 및/또는 무기 용매의 혼합물로 수행될 수 있다.

양호한 추출 효율 및 수율을 보장하고, 바람직한 순도 특성 및 조성을 갖는 양호한 품질의 추출물을 수득하기 위해서, 당업자는 다음의 기준에 따라서 적절한 용매 (들)를 어떻게 선택하는지 쉽게 알 것이다:

- 용매 또는 용매 혼합물의 극성 (극성 또는 비극성);

- 용매 또는 용매 혼합물의 물리적 상태 (예를 들어 액체, 고체, 초임계 또는 기체);

- 용매 또는 용매 혼합물의 화학적 성질 (예를 들어 유기 또는 무기);

- 용매 또는 용매 혼합물의 전하 (예를 들어 이온성 또는 비이온성);

- 용매 또는 용매 혼합물의 기원;

- 용매 또는 용매 혼합물의 혼화성;

- 용매 또는 용매 혼합물의 가용성.

당업자는 바람직한 추출 수율 및 추출 순도 및 조성을 기준으로, 그의 기준에 상응하는 용매 (들)를 선택하는데 어떠한 기술을 사용하는지 알 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 하기 기술된 담배 잎 제조 방법에 의해 수득된다.

약학 조성물

제2 양상에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 담배 잎 추출물을 유효 성분으로서 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 약학적으로 허용가능한 용매, 예를 들어 물을 더 포함한다.

유리하게는, 약학 조성물은 1 내지 1 000 ㎍/mL, 바람직하게는 10 내지 500 ㎍/mL, 바람직하게는 50 내지 300 ㎍/mL, 바람직하게는 60 내지 200 ㎍/mL, 바람직하게는 80 내지 150 ㎍/mL 범위의 함량으로 본 발명에 따른 담배 잎 추출물에 존재하는 단백질을 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 바람직하게는 수성 조성물이다.

특정 구체예에 따라서, 약학 조성물은 부정적 강화에 작용하는 활성제, 예컨대 예를 들어 니코틴 대체물, 바레니클린 또는 부프로피온을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 따라서, 약학 조성물은 보조제를 더 포함한다. 보조제의 예는 팽윤제 예컨대 예를 들어 당류 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 솔비톨, 글루코스, 라피노스, 만니톨, 바람직하게는 락토스, 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 또는 만니톨, 아미노산 예컨대 아르기닌, 글리신 또는 히스티딘, 바람직하게는 글리신, 또는 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜 유형의 중합체, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 이러한 구체예에 따라서, 약학 조성물은 약학 조성물의 총 중량을 기준으로, 50 내지 99 중량%의 보조제, 바람직하게는 80 내지 97 중량%의 보조제를 포함한다.

특정 구체예에 따라서, 약학 조성물은 대마로부터 추출되는 단백질을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 피하 투여에 적합한 형태로 제공된다.

다른 구체예에 따라서, 약학 조성물은 접착성 경피 치료 시스템의 수단을 통해 투여하기 적합한 형태로 제공된다. 유리하게는, 약학 조성물은 팻치 형태로 제공된다.

다른 구체예에 따라서, 약학 조성물은 분무법 또는 증발법에 의한 투여에 적합한 형태로 제공된다. 유리하게는, 약학 조성물은 분무기, 증발기 또는 에어로졸 형태로 제공된다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 바람직하게는 하기에 기술된 담배 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물을 제조하기 위한 방법에 따라 제조된다.

약학 조성물의 용도

제3 양상에서, 본 발명은 담배 중독의 치료를 위한 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 위해서, "담배 중독의 치료" 또는 "담배 의존증의 치료"는 보다 상세하게 담배의 중독성 강화의 감소를 의미한다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여는 특별히 담배의 긍정적 강화 및 특히 흡연 충동을 감소시킨다.

본 발명은 또한 담배 중독의 치료에서 사용을 위한 상기 정의된 바와 같은 담배 잎 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

달리 말해서, 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 담배 잎 추출물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 담배 중독 또는 의존증을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 조성물의 투여는 환자가 담배의 긍정적 강화 및 특히 흡연 충동을 약화시킴으로써 환자가 흡연을 중단할 수 있거나, 그의 소비를 감소시킬 수 있거나 또는 금연 후 그의 재발을 예방할 수 있게 하고, 따라서 금연을 용이하게 할 수 있다. 유리하게는, 조성물의 투여는 임의 유형의 흡연자, 즉 많이 피우는 골초 흡연자를 포함하여, 임의 유형의 흡연자가 흡연을 중단하고 금연 이후에 재발을 감소시키거나 또는 피할 수 있게 보조한다.

유리하게는, 대마로부터 추출되는 단백질을 더 포함하는 본 발명에 따른 조성물의 투여는 동시에 담배 및 대마에 대한 의존증 및 중독을 치료하는 것을 가능하게 만든다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 이러한 구체예에 따라서, 약학 조성물은 피하 투여에 적합한 형태로 제공된다.

일 구체예에 따라서, 약학 조성물은 0.03 mL 내지 10 mL, 바람직하게는 0.1 mL 내지 5 mL, 바람직하게는 0.5 내지 2 mL의 제형으로 제공된다. 따라서, 약학 조성물은 바람직하게는 0.03 mL 내지 10 mL, 바람직하게는 0.1 내지 5 mL, 바람직하게는 0.5 mL 내지 2 mL의 양으로 피하 주사를 통해 투여된다.

일 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 상기 정의된 바와 같은 담배 잎 추출물을 함유하는 접착성 경피 치료 시스템의 수단을 통해 투여된다. 이러한 구체예에 따라서, 약학 조성물은 접착성 경피 치료 시스템의 수단에 의한 투여에 적합한 형태로 제공된다. 유리하게는, 약학 조성물은 팻치 형태로 제공된다.

팻치는 매트릭스-유형 팻치이거나 또는 하나 이상의 구획을 구비한 리저버-유형 팻치의 형태일 수 있다. 팻치의 실제 실행은 팻치 도포의 전체 기간 동안, 예를 들어 약 2시간 내지 24시간의 기간 동안, 담배 잎 추출물의 제어형 및 지속형 전신 투여를 수득하도록 대상체에 관한 그의 일반적인 지식을 기반으로 당업자가 결정할 것이다.

리저버-유형 팻치는 유효 성분(들)의 방출 속도를 조정할 수 있게 하는 반투과성 중합체 멤브레인을 통해서 피부와 접촉하게 되는 중합체 매트릭스에 현탁시키거나 또는 용액 중에 유효 성분(들) (담배 잎 추출물 포함)을 함유하는 하나 이상의 개별 리저버(들)를 포함할 것이다.

매트릭스-유형 팻치는 유효 성분(들)이 적절한 비율로 용해되어 있거나 또는 분산되어 있는 중합성 매스를 포함할 것이다. 이들 유효 성분은 상기 매트릭스의 중합체 사슬을 통한 확산에 의해 방출된다.

이러한 유형의 팻치의 특정 구체예에 따라서, 접착제가 매트릭스의 전체 방출 표면을 덮고 후자의 일체부가 된다. 그러므로, 이것은 당업자에게 잘 알려진 활성 접착제-유형 팻치로서, 제조가 단순하고 환자의 피부 상에 편안한 도포를 가능하게 하는 얇고, 적합하게 탄성인 팻치의 생성을 가능케 한다.

적절한 용량으로, 적절한 확산 속도에서, 적절한 기간 동안, 피하로 또는 혈류로 이들 유효 성분의 양호한 주입을 보장하기 위해서, 당업자는 다음의 변수들을 쉽게 설정할 수 있다:

- 팻치의 각 구획의 부피 및 표면적의 비율;

- 하나 이상의 친수성 첨가제(들)의 임의 첨가;

- 하나 이상의 확산 활성제(들) 또는 억제제(들)의 임의 첨가;

- 하나 이상의 가용화제(들)의 임의 첨가;

- 하나 이상의 안정화제(들)의 임의 첨가;

- 하나 이상의 흡수 촉진제(들)의 임의 첨가; 및

- 보다 일반적으로, 담배 잎 추출물의 유동성 및 안정성의 양호한 제어를 가능하게 하는 당업자에게 잘 알려진 모든 유형의 첨가제.

당업자는 바람직한 가용성 및 안정성을 기반으로 상기 열거된 변수를 설정하는데 어떠한 기술을 사용하는지 알 것이다.

팻치의 다양한 제조 변수들은 바람직한 용량에 도달하도록 당업자가 쉽게 적합화시킬 것이다.

자체로 공지된 방식으로, 이러한 팻치는 팻치가 제작된 이후에 이의 저장 기간 전반에서 피부에 도포되는 접착면을 보존하려는 의도로 제거가능한 보호 필름을 포함한다. 자체로 공지된 방식으로, 당업자는 예를 들어, 그 한쪽 면을 접착 방지 실리콘으로 처리할 수 있는, 폴리에스테르 필름을 사용할 것이다.

다른 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 상기 정의된 바와 같은 담배 잎 추출물을 함유하는 분무 또는 증발 시스템의 수단에 의해 투여된다. 이러한 구체예에 따라서, 약학 조성물은 분무 또는 증발에 의한 투여에 적합한 형태로 제공된다. 유리하게는, 약학 조성물은 분무기, 증발기, 또는 에어로졸 형태로 제공된다.

분무기, 증발기 또는 에어로졸은 하나 이상의 구획이 구비된 리저버를 갖는분무기, 증발기 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 분무기, 증발기 또는 에어로졸의 실제 실행은 담배 잎 추출물의 제어형 및 지속형 전신 투여를 수득하기 위해 대상체에 대한 그의 일반 지식을 기반으로 당업자가 결정할 것이다.

분무기, 증발기 또는 에어로졸은 유효 성분(들) (담배 잎 추출물 포함)을 용액 또는 현탁액에 함유하는 하나 이상의 개별 리저버(들)를 가질 것이다. 이후에 유효 성분(들)은 치료하려는 신체 영역 상에 분무 또는 증발에 의해 투여된다. 분무 또는 증발은 예를 들어 피부 상에서 수행될 수 있다. 유효 성분(들)은 점막에 분무 또는 증발에 의해 투여될 수 있다.

적절한 용량으로, 적절한 확산 속도로, 적절한 기간 동안, 피하로 또는 혈류로 이들 유효 성분의 양호한 주입을 보장하기 위해서, 당업자는 다음의 변수들을 쉽게 설정할 수 있다:

- 분무기, 증발기 또는 에어로졸의 각 구획 또는 리저버의 표면적 및 부피의 비율;

- 하나 이상의 친수성 첨가제(들)의 임의 첨가;

- 하나 이상의 가용화제(들)의 임의 첨가;

- 하나 이상의 안정화제(들)의 임의 첨가;

- 하나 이상의 흡수 촉진제(들)의 임의 첨가, 및;

분무기, 증발기 또는 에어로졸의 상이한 제조 변수는 바람직한 용량에 도달하도록 당업자가 쉽게 적합화할 것이다.

제1 구체예에 따라서, 약학 조성물은 오직 1회 투여되도록 의도된 형태로 제공된다. 이러한 구체예에 따라서, 약학 조성물은 오직 1회 투여되고, 그에 따라 담배의 긍정적 강화, 및 특히 흡연 충동의 감소 또는 억제가 가능하다.

다른 구체예에 따라서, 약학 조성물은 수회, 바람직하게는 2회 또는 3회 투여되도록 의도된 형태로 제공된다. 이러한 구체예에 따라서, 약학 조성물은 바람직하게는 0일 및 10일 또는 0일, 10일 및 30일에 투여되고, 그에 따라 담배의 긍정적 강화, 및 특히 흡연 충동의 감소 또는 억제가 가능하다. 이러한 구체예에서, 2회차, 및 임의로 3회차에 주사되는 용량은 1회차에 주사된 용량과 동일하다.

특정 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 부정적 강화에 작용하는 활성제, 예컨대 니코틴 대체물, 바레니클린, 부프로피온 또는 이의 혼합물을 포함하는 조성물과 함께 투여될 수 있다. 이러한 구체예에 따라서, 몇몇 특별한 투여 방식이 계획될 수 있다:

(i) 흡연을 중단하려는 시도 이전에, 담배 소비를 감소시키기 위해 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여, 후속하여 부정적 강화의 효과, 및 특히 금단 느낌을 제한하기 위해서 부정적 강화에 작용하는 활성제의 투여;

(ii) 즉각적인 금연의 목적으로, 흡연을 중단하려고 시도할 때 본 발명에 따른 약학 조성물과 부정적 강화에 작용하는 활성제의 동시적 투여;

(iii) 흡연을 중단하려고 시도할 때, 예를 들어, 금연 시도 이후 12주 동안, 부정적 강화에 작용하는 활성제의 투여, 후속하여 재발을 예방하기 위한 목적으로, 부정적 강화에 작용하는 활성제의 투여 종료 이후 2주 동안, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여.

담배 잎 추출물의 제조

제4 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 담배 잎 추출물의 제조에 관한 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 담배 잎 추출물을 제조하기 위한 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

a. 담배 잎을 건조하는 단계,

d. 여과 또는 원심분리에 의해 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액으로부터 고형 잔류물을 분리하여 고형 잔류물-무함유의 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액을 수득하는 단계,

e. 추출물의 부피를 기준으로 2 내지 12배 부피, 바람직하게는 3 내지 10배 부피, 바람직하게는 4 내지 8배 부피, 바람직하게는 6배 부피 범위의 양으로 용매, 바람직하게는 수성 용매, 및 10 kDa 컷오프 멤브레인을 사용하여 단계 d에서 수득된 용액을 일정-부피 여과하는 단계,

특정 구체예에 따라서, 단계 a의 건조는 자연 건조라고 하는 바깥 공기에서 수행된다. 이러한 경우에서, 건조는 자연적인 바깥 공기의 존재 하에서, 외부에서 또는 실내에서 수행된다. 건조는 개방 또는 밀폐, 덮개 또는 비덮개 구조물에서 수행될 수 있다. 자연풍-건조는 예를 들어 자연적인 건조실에서 수행될 수 있다. 이러한 경우에서, 신선하게 수확되거나 또는 예비 건조된 담배 잎은 외기의 효과 하에서 자연적으로 건조되도록 놓아 둔다. 담배 잎은 예를 들어 비가열된 환기실에 매달아 둘 수 있다. 담배 잎은 예를 들어 그들이 갈색으로 변할 때까지 자연적으로 건조되도록 놓아 둘 수 있다. 이러한 단계에서, 실제로 잎에 당류가 남아있지 않는다. 유리하게는, 건조는 지역 기후 조건에 적합화된 기간 동안, 바람직하게는 1개월의 최소 기간 동안 수행된다. 예로서, 건조는 중부 프랑스에서 수확을 위한 9월 내지 12월 사이에 수행될 수 있다. 담배 잎은 균일한 건조가 가능하고 잎의 부패 또는 분해 및 응결 형성을 피하기 위해서 건조 동안 1회 이상 뒤집어 줄 수 있다. 자연풍-건조 방법은 예를 들어 버어리 품종 담배에 사용될 수 있다. 특정 구체예에 따라서, 단계 a의 건조는 자연 건조실에서 수행된다.

다른 특정 구체예에 따라서, 단계 a의 건조는 가열 건조실에서 수행된다. 이러한 경우에서, 건조는 적합한 온도로 가열된 건조실 또는 구조물에서 수행될 수 있다.

다른 특정 구체예에 따라서, 단계 a의 건조는 열풍 건조에 의해 수행된다. 이러한 경우에서, 건조는 적합한 온도로 가열된 구조물 또는 건조실에서 수행될 수 있다. 열기는 외부 열원에 접속된 도관을 통해서 구조물 또는 건조실에 유입될 수 있다. 이렇게 제어된 가열은 황색-오렌지색 잎을 생산한다. 따라서, 이러한 잎들은 높은 당류 함량을 함유한다. 예를 들어, 버지니아 담배가 이 방법을 사용해 건조될 수 있다.

다른 특정 구체예에 따라서, 단계 a의 건조는 햇빛 건조에 의해 수행된다. 이러한 경우에서, 담배 잎은 받침대 상에 펼쳐두고 12일 내지 30일 동안 햇빛에 노출될 수 있다. 햇빛으로부터의 직사광 및 열기 하에서, 잎은 황색 또는 오렌지색으로 변하고 높은 당류 함량을 유지하게 된다. 일반적으로 오리엔탈 담배가 이 방법을 사용해 건조된다.

다른 특정 구체예에 따라서, 단계 a의 건조는 직화 건조에 의해 수행된다. 이러한 경우에서, 작은 나무 조각을 담배 잎 아래에서 태울 수 있고, 담배 잎은 "훈연" 아로마를 흡수하면서 건조된다.

유리하게는, 단계 a의 건조는 고 분자 질량 담배 단백질, 예컨대 RuBisCO의 분해를, 예를 들어 가수분해 기전에 의해 촉진한다.

단계 c 내지 e는 미국 특허 제5,770,698호 (컬럼 6, 47번째 줄 내지 컬럼 7, 7번째 줄) 및 미국 특허 출원 제2009/0162403호 (단락 [0032] 내지 [0040])에 기술된 유형의 추출, 여과 및 투석여과 단계에 상응한다.

바람직하게는, 단계 c에서 추출은 4 내지 20℃, 바람직하게는 4 내지 10℃의 온도에서 수행된다.

바람직하게는, 단계 c에서 추출은 12시간 내지 36시간, 바람직하게는 22시간 내지 26시간, 바람직하게는 24시간 동안 수행된다.

특정 구체예에 따라서, 단계 c에서 사용되는 용매는 수성 용매이다. 바람직하게는, 단계 c에서 사용되는 수성 용매는 바람직하게는 2 내지 6 g/L, 바람직하게는 4 g/L 농도의, 암모늄 바이카보네이트의 수성 완충 용액이다.

물론, 다른 유형의 용매가 단계 c의 추출을 수행하는데 사용될 수 있다. 단계 c의 추출은 유기 또는 무기 용매, 또는 유기 및/또는 무기 용매의 혼합물로 수행될 수 있다.

양호한 추출 효율 및 수율을 보장하고, 바람직한 순도 특성 및 조성을 갖는 양호한 품질의 추출물을 수득하기 위해서, 당업자는 하기의 기준에 따라서 적절한 용매(들)를 어떻게 선택하는지 쉽게 알 것이다:

- 용매 또는 용매 혼합물의 극성 (극성 또는 비극성);

- 용매 또는 용매 혼합물의 물리적 상태 (예를 들어, 액체, 고체, 초임계, 기체);

- 용매 또는 용매 혼합물의 기원;

- 용매 또는 용매 혼합물의 혼화성;

- 용매 또는 용매 혼합물의 가용성.

당업자는 바람직한 추출 수율 및 추출물 순도 및 조성을 기준으로, 이들 기준에 상응하는 용매(들)를 선택하는데 어떠한 기술을 사용하는지 알 것이다.

바람직하게는, 단계 c에서 추출은 완충 용액에 분쇄된 건조 담배 잎을 현탁시켜서, 바람직하게는 완충 용액에 분쇄된 건조 담배 잎을 30 내지 70 g/L, 바람직하게는 40 내지 60 g/L, 및 더 우선적으로 50 g/L 농도로 현탁시켜 수행된다. 이후에, 현탁된 고형 잔류물은 고형 잔류물이 없는 분쇄된 건조 담배 잎을 수득하기 위해서, 여과, 예를 들어 뷔히너 여과에 의해 제거한다 (단계 d).

바람직하게는, 단계 d에서 사용되는 수성 용매는 주사용 물 (WFI)이다.

유리하게는, 단계 e는 10 kDa 미만의 분자 질량의 분자 및 특히 10 kDa 미만의 분자 질량의 자유 아미노산, 단백질 및 펩티드, 및 단계 a의 단백질의 분해로부터 생성된 10 kDa 미만의 분자 질량의 단백질 잔류물을 99%를 초과하게 제거한다.

바람직하게는, 단계 e에서 수득된 단백질 용액에 대해, 단계 f 이전에, 멸균 여과의 단계 e'를 수행한다.

상기 기술된 방법의 종료시에 수득되는 본 발명에 따른 담배 잎 추출물은 멸균 여과의 단계 d'의 종료 시에 수득된 바와 같이 저장될 수 있거나, 또는 단계 f의 종료시에 수득된 바와 같이 동결건조될 수 있다.

담배 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물의 제조

제5 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 담배 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물의 제조에 관한 것이다.

약학 조성물은 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

a. 상기 정의된 바와 같은 담배 잎 추출물의 제조 단계,

b. 100 내지 200 ㎍/mL 범위의 단백질 농도를 수득하기 위한 단백질 농도의 조정 단계,

c. 약학적으로 허용가능한 부형제(들)의 첨가 단계, 및

d. 임의로, 이 추출물에 보조제(들)의 첨가, 바람직하게는 만니톨의 첨가 단계.

단계 b에서 사용되는 담배 잎 추출물은 10 kDa 컷오프 멤브레인 상에서 투석여과의 단계 이후에 직접적으로 수득되는 것이거나, 또는 멸균 투석여과의 단계 이후에 수득될 수 있는 것이거나, 또는 동결건조시킨 후 예를 들어 염수 용액 또는 물에 재구성시킨 된 담배 잎 추출물일 수 있다.

유리하게는, 단계 b에서 농도는

- 단백질 농도를 낮추기 위해서 물로 희석하거나, 또는

- 단백질 농도를 증가시키기 위해서 투석여과에 의해

조정될 수 있다.

단계 c에서 특히 바람직한 약학적으로 허용가능한 부형제는 물이다.

단계 d에서 첨가할 수 있는 보조제는 특히 팽윤제 예컨대 예를 들어 당류 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 솔비톨, 글루코스, 라피노스, 만니톨, 바람직하게는 락토스, 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 또는 만니톨, 아미노산 예컨대 아르기닌, 글리신 또는 히스티딘, 바람직하게는 글리신, 또는 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜 유형의 중합체; 또는 이의 혼합물일 수 있다.

특정 구체예에 따라서, 단계 d는 적어도 만니톨의 첨가를 포함한다.

담배 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물을 포함하는 키트

제6 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 담배 잎 추출물 또는 약학 조성물의 용량을 포함하는 키트에 관한 것이다.

제1 구체예에 따라서, 키트는, 바람직하게는 동결건조된 형태로, 담배 잎 추출물의 하나 이상의 용량(들), 뿐만 아니라 투여 직전에 본 발명에 따른 약학 조성물을 제조하기 위한 염수 용액 또는 WFI의 하나 이상의 용량(들)을 포함한다.

다른 구체예에 따라서, 키트는 환자에게 투여하려고 준비된 약학 조성물의 하나 이상의 용량(들)을 포함한다.

키트는 약학 조성물을 피하 주사를 통해 투여하기 위해 하나 이상의 시린지(들)를 임의로 포함할 수 있다.

키트는 약학 조성물을 경피적으로 투여하기 위해 하나 이상의 팻치(들)를 임의로 포함할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하려는 것을 목적으로 한다.

실시예

실시예 1: 본 발명에 따른 담배 잎 추출물의 제조

버어리 담배 잎을 사용하여 추출물을 제조하였다.

약 3개월 동안 자연적으로 건조시킨 (중부 프랑스에서, 9월 내지 12월 경에) 100 g의 버어리 담배 잎을 분쇄하였다. 분쇄된 잎을 24시간 동안 4 내지 10℃의 온도에서 8 g의 암모늄 바이카보네이트가 첨가된 1 892 g의 WFI에 현탁시켰다. 다음으로, 현탁된 고형 잔류물을 뷔히너 여과에 의해 제거하였다.

이어서, 추출물의 0.2 ㎛ 정화 여과를 수행한다. 수득된 추출물은 색상이 갈색이다. 다음으로, 추출물을 칭량하여 일정-부피 투석여과 단계에 사용되는 WFI의 부피를 결정한다; 이 경우에서 액상 추출물의 질량은 1 680 g이다.

이러한 고형 잔류물-무함유의 분쇄된 건조 담배 잎 추출물의 단백질의 추출을 수행하였다: 그 후 10 080 g의 WFI을 고형 잔류물-무함유의 분쇄된 건조 담배 잎 추출물에 첨가한다. 이렇게 수득된 11 760 g의 용액을 투석유물의 질량이 1 680 g까지 감소될 때까지 10 kDa 컷오프 (MerckMillipore)로 6배 부피에 대하여 일정 부피에서 투석여과시킨다.

투석여과 후에 수득된 투석유물은 분자 질량이 10 kDa 미만인 단백질이 그들의 초기 농도보다 99% 낮아진 농도로 검출되는 단백질 혼합물이다. 수득된 투석유물의 색상은 [EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0, 2.2.2, Degree of coloration of liquids]에 정의된 측정 스케일에 따라서 B2와 B3 사이이다.

이 투석여과물은 만니톨의 첨가 이후에, 예를 들어 SMH 150 동결건조기를 사용하여 동결건조하여 동결건조된 담배 잎 추출물을 수득할 수 있다.

실시예 2: 실시예 1에 따라 제조된 담배 잎 추출물의 단백질 조성의 결정

실시예 1의 담배 잎 추출물의 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 상에서 먼저 분리시킨다. 이를 위해서, 분석하려는 추출물을 NuPage® Bis-Tris 겔 (4-12 %)에 첨가하고, 전기영동은 200 V에서 35분간 수행한 후에, 1시간 동안 20 mL의 인스턴트 블루와 접촉시키고 나서 밤새 물로 세정한다. 선택된 폴리아크릴아미드 겔 밴드를 자르고 (6개 밴드) 이어서 50 mM NH₄CO₃/CH₃CN (50/50) 완충액으로 탈염색시킨다. 다이설파이드 브릿지를 이어서, 10 mM 디티오트레이톨/50 mM NH₄CO₃ 용액으로 40분간 55℃에서 환원시킨다. 다음으로, 환원된 시스테인을 100 mM 요오도아세타미드/50 mM NH₄CO₃ 용액으로 30분 동안 실온 및 암실에서 알킬화시킨다.

이렇게 수득된 단백질 용액을 효소로 분해시켜 단백질 또는 펩티드 단편을 수득한다: 분해는 밤새 37℃에서 50 mM NH₄CO₃ 용액 중에서 폴리아크릴아미드 겔 밴드의 염색에 적합화된 양으로 트립신 (trypsin V5111, Promega)을 사용해 수행한다.

다음으로 펩티드 분해물의 펩티드를 PepMap C18 마이크로-프리컬럼 (5 ㎛; 100 Å; 300 ㎛ x 5 ㎜; ThermoFisher Scientific) 상에서의 예비농축과 이어서, 선형 농도구배 방식으로 PepMap C18 나노컬럼 (3 ㎛; 100 Å; 75 ㎛ x 250 ㎜; ThermoFisher Scientific) 상에서 용리하는 액상 나노크로마토그래피 (U3000 NanoLC System, ThermoFischer Scientific)에 의해 분리시킨다; 완충액 A H₂O/CH₃CN (95/5) 중 0.1 % HCOOH, 완충액 B H₂O/CH₃CN (20/80) 중 0.1 % HCOOH, 60분간 농도구배 0 내지 60 % B, 유속 300 ㎕/분).

다음으로 펩티드는 나노스프레이 소스 (ThermoFisher Scientific)가 구비되고 U3000 NanoLC 장치에 연결된 LTQ Velos 장비 (Dual Pressure Linear Ion Trap; ThermoFisher Scientific) 상에서 질량 분광분석법으로 분석한다. 데이타는 "분해 강화" 모드로 m/z 400 내지 1600의 MS 스캔과 이후에 35 eV의 충돌 에너지의 헬륨 하의 CID 모드로 20 최고 세기 MS 이온 (충전 2 및 그 이상) 에 대한 "정상 분해" 모드의 MSMS 스캔의 사이클에 의해 포지티브 모드로 Excalibur 2.1 소프트웨어 (ThermoFisher Scientific)를 사용해 획득된다. 이전에 단편화된 MS 이온은 50 mmu의 질량 허용오차로 30초 동안 동적으로 배제된다.

펩티드 및 그들 단편의 질량은 동정의 목적을 위해 데이타베이스에 존재하는 데이타와 비교된다. 이러한 목적을 위해서, MS 및 MSMS 데이타는 MASCOT 검색 알고리즘 (버전 2.4)에 따라서 ProteomeDiscoverer 1.4 소프트웨어로 처리하고 TOBAC 종으로 축소된 UniprotKB/Swiss-Prot 데이타베이스 (2015년 4월 발간)를 문의한다.

단백질의 동정은 0.05 미만의 신뢰값 p에 따라 인증한다. 최대 신뢰도의 적어도 2 펩티드로 동정된 단백질만을 유지시킨다.

이렇게 동정된 각 단백질의 점수는 그들 사이에서 단백질의 상대적 분류만을 허용하며, 이 분류는 이들 단백질의 농도와 상관된다. 이들 점수의 절대값은 작동 조건, 시험 샘플 및 수탁량에 따라 좌우된다.

따라서 그들 점수의 내림 차수 (최대 존재부터 최저 존재로)에 따라 동정되고 분류된 12종의 단백질 목록은 다음과 같다:

- P36401; E13H_TOBAC; 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제, 산성 이소폼 PR-Q' (EC 3.2.1.39) ((1->3)-베타-글루칸 엔도히드롤라제) ((1->3)-베타-글루카나제) (베타-1,3-엔도글루카나제) (PR-35); MM: 36995 Da

- P17513; CHIP_TOBAC; 산성 엔도키티나제 P (EC 3.2.1.14) (병원성-관련 단백질 P) (PR-P); MM: 27469 Da

- P17514; CHIQ_TOBAC; 산성 엔도키티나제 Q (EC 3.2.1.14) (병원성-관련 단백질 Q) (PR-Q); MM: 27633 Da

- P27666; E13F_TOBAC; 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제, 염기성 액포 이소폼 GLB (EC 3.2.1.39) ((1->3)-베타-글루칸 엔도히드롤라제) ((1->3)-베타-글루카나제) (베타-1,3-엔도글루카나제, 염기성) (글루카나제 GLB); MM: 40443 Da

- P14170; OSMO_TOBAC; 오스모틴; MM: 26681 Da

- P24091; CHI2_TOBAC; 엔도키티나제 B (CHN-B) (EC 3.2.1.14); MM: 34721 Da

- P11965; PERX_TOBAC; 리그닌-형성 음이온성 퍼옥시다제 (EC 1.11.1.7) (TOPA); MM: 34674 Da

- P13046; PRR1_TOBAC; 병원성-관련 단백질 R 주요 형태 (타우마틴-유사 단백질 E22); MM: 24667 Da

- P29062; PR4A_TOBAC; 병원성-관련 단백질 PR-4A; MM: 16221 Da

- Q03199; IPIB_TOBAC; 프로테이나제 억제제 I-B (PI-IB) (미생물 세린 프로테이나제 주요 이소폼의 억제제); MM: 11916 Da

- Q03198; IPIA_TOBAC; 프로테이나제 억제제 I-A (PI-IA) (미생물 세린 프로테이나제 소수 이소폼의 억제제); MM: 11880 Da

- P29063; PR4B_TOBAC; 병원성-관련 단백질 PR-4B; MM: 16235 Da

따라서, 담배 잎 추출물 제조 방법은 일정 단백질을 농축시키고 다른 것들을 제거하는 것을 가능하게 만든다. 따라서, Swiss-Prot에 열거된 759종의 니코티아나 타바쿰 단백질 중에서, 오직 6개 패밀리 및 12종 단백질이 실시예 1에 따라 제조된 담배 잎 추출물에서 우세하게 존재한다. 실시예 1에 따라 제조된 담배 잎 추출물에 우세하게 존재하는 12종 단백질은 10 내지 50 kDa의 분자 질량을 갖는다.

실시예 3: 단백질 함량의 결정

실시예 1에 따른 담배 잎 추출물 중 단백질 함량 (투석여과 단계 이전 및 이후)은 브래드포드 방법에 따라 결정하였다.

실시예 1의 추출물은 염수 용액에 용해시킨다.

3가지 표준 단백질 용액을 제조하였다: 50 ㎕의 2 mg/mL 소 혈청 알부민 용액 (Sigma Aldrich, 제품 번호 P0834)은 정확하게 100 ㎍/mL의 표준 용액을 수득하기 위해서 950 ㎕의 염수 용액으로 20배 희석한다.

시험되는 각 튜브는 80 ㎕의 단백질 샘플 및 920 ㎕의 브래드포드 시약 (Sigma Aldrich, 제품 번호 B6916)을 함유한다. 브래드포드 시약을 각 튜브에 첨가한 후에, 튜브를 부드럽게 흔들어 와류를 생성시킨 후, 5분간 실온에서 인큐베이션시킨다. 샘플을 1.5 mL 큐벳으로 옮기고 그들의 흡광도를 595 nm에서 1시간 동안 측정한다.

단백질 농도는 제조된 표준 단백질 용액과 비교하여 결정하였다.

측정된 단백질 양은 다음과 같다:

- 투석여과 이전: 295.45 +/- 9.91 ㎍/mL

- 투석여과 이후: 160.61 +/- 1.31 ㎍/mL.

실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 전기영동 프로파일은 투석여과 단계 이후에 결정하였다. 2, 5, 10 및 15 ㎍ 양의 단백질을 NuPage 겔 상에 침전시켰다.

4% 내지 12 % Nupage 겔은 35분간 제조하였고 20 mL의 쿠마시 블루에 1시간 동안 위치시켰으며 물로 밤새 세정하였다. 겔은 Image Lab™ 소프트웨어가 구비된 Biorad의 ChemiDoc™ XRS 시스템을 사용해 분석하였다.

3개의 주요 밴드가 대략 15 kDa 및 30 kDa에서 검출된다 (도 1). 2개의 다른 밴드가 역시 약 40 kDa에서 인지가능하다.

결과는 이 담배 잎 추출물 내에서, 검출된 분자 질량이 100 kDa을 초과하는 단백질의 양이 분자 질량이 10 내지 50 kDa인 단백질의 양과 비교하여 작다는 것을 보여준다.

실시예 4: 본 발명에 따른 담배 잎 추출물 중 분자 질량이 10 kDa 미만인 분자의 제거에 대한 투석여과 부피의 영향

실시예 1에 따른 담배 잎 추출물 중 분자량이 10 kDa 미만인 분자의 제거는 사용된 투석여과 부피에 따라서 투석여과 단계 동안 모니터링하였다. 모니터링은 분자 질량이 10 kDa 미만인 분석 추적자 (니코틴)의 가스 크로마토그래피 어세이에 의해 수행된다.

결과는 하기 표에 표시한다:

분자량이 10 kDa 미만인 분자의 제거는 투석여과 부피가 증가될 때 점점 더 효과적이고 투석여과 부피가 초기 부피의 6배가 될 때 완전하다.

실시예 5: 시험관내 인간 단핵 세포 및 생체내 마우스에서 실시예 1의 추출물의 생물학적 활성

재료 및 방법:

- 사용된 제품

PMA/아이오노마이신 (Sigma-Aldrich 제품 번호 P8139/I0634)

BSA (Sigma Aldrich 제품 번호 A7020)

PBS (PAA Laboratories 제품 번호 H15-002)

Tween 20 (Sigma Aldrich 제품 번호 P1379)

염소 항-마우스 IgG (g 사슬 특이적) - 알칼리 포스파타제 (Southern Biotech 제품 번호 1030-04)

바이오틴-항 마우스 IgE (Biolegend 제품 번호 BLE406904)

스트렙타비딘 - 알칼리 포스파타제 (Southern Biotech 제품 번호 7100-04)

- 세포 제조 및 자극 방식

상이한 건강한 도너 유래의 말초 혈액 단핵 세포를 밀도 구배 상에서 원심분리를 통해 단리하였다 (분리 매질: LMS 1077 PAA Laboratories). 수득된 단핵 세포를 24시간 또는 48시간 동안 상이한 희석으로 실시예 1에 따른 추출물로 자극시켰다. 상청액을 제거하고 Luminex 기술을 사용하여 사이토카인 프로파일 분석을 위해 24시간 또는 48시간 자극 이후 -80℃에 저장하였다. 24시간 자극 이후 세포를 또한 유세포측정법에 의한 표현형 분석을 위해 채취하였다.

- 세포계측 표현형 분석

세포를 먼저 생존능 마커 (Dye eFluor 450 (65-0863-14 eBioscience)로 염색하였고 이후에 상이한 막 마커의 검출을 위해 형광색소에 직접 커플링된 항체로 염색하였다. T 및 B 림프구 개체군은 마커 CD3 및 CD19로 동정하였다. NK 세포는 마커 NKp46 또는 마커 CD56 및 CD16의 조합으로 또는 CD3 부재 하에서 CD56 발현에 의해 검출하였다. 이들 세포 개체군으로부터 "게이트"는 상이한 활성 마커 (CD69, CD25, HLA-DR)를 분석하도록 설정되었다.

표현형 세포계측 분석을 위해 사용된 항체 목록을 하기 표에 제공한다:

이소타입 대조군을 각 실험에서 사용하였고 보상 매트릭스를 이러한 다중변수 표현형 분석을 위해 생성시켰다.

염색된 샘플은 튜브 당 100 000 사건의 최소 획득으로 Navios 세포계측기 (Beckman Coulter 10-colour) 상에서 분석하였다. 획득된 데이타는 이후에 Kaluza 소프트웨어 상에서 분석하였다.

- Luminex 및 ELISA에 의한 사이토카인 분비 프로파일의 분석

ELISA 및 세포계측 원리를 기반으로 하는 이 기술은 몇개의 피분석물을 동시에 어세이할 수 있게 한다.

고유한 색상-코드의 마이크로비드를 각 피분석물에 특이적인 포획 항체에 커플링시킨다. 어세이하려는 샘플과 인큐베이션 후, 형광색소에 커플링된 검출 항체는 이중-레이저 광학 시스템 (Bio-plex 200 system Bio-rad)을 통해 분석될 수 있을 것이다. 제1 레이저는 마이크로비드를 동정하고 제2 레이저는 형광색소에 커플링된 검출 항체를 정량한다. 17종의 피분석물을 세포 상에서 수행된 다양한 자극 실험 동안 채취된 샘플에 대해 Bio-Plex 프로 인간 사이토카인 Grp1 패널 17 플렉스 키트 (Bio-rad)로 어세이할 수 있다. 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물이 없는 배양 배지로 자극된 세포는 각 사이토카인에 대한 기준 수준을 수득하는 것을 가능하게 한다.

IL-8 ELISA는 통상적인 면역효소 샌드위치 기술을 기반으로 한다. 사용되는 통상의 키트는 Eurobio-Diaclone (Besancon)에서 구매한다.

- 실시에 1에 따른 담배 잎 추출물로 마우스의 면역화

7주령 암컷 C57BL/6 및 Balb/c 마우스를 Charles River (L'Arbresles, France)에서 구매하였다. 동결건조시키고 5 mL의 염수 용액에 재구성시킨 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물 200 ㎕로 0일 및 21일에 마우스를 복강내로 면역화시켰다. 면역화 이전 및 이후에 모든 마우스로부터 혈액을 채혈하였다. 원심분리 이후에, 혈청은 -20℃에 냉동시켰다.

- IgG 및 IgE ELISA

ELISA 실험을 위해서, 생성물의 한개 바이알을 2.5 mL의 카보네이트-바이카보네이트 완충액 (0.1M, pH 9)으로 재구성시켰다. Nunc Maxisorb 96W 플레이트를 실시예 1에 따라 동결건조시킨 후 재구성시키고 18시간 동안 인큐베이션시킨 담배 잎 추출물 100 ㎕와 인큐베이션시켰다. PBS-0.05 % Tween 완충액으로 플레이트를 세척한 후, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 200 ㎕의 PBS-1% BSA 완충액으로 포화시킨다. PBS-0.05% Tween 완충액으로 플레이트를 세척한 후, PBS-1% BSA에 1/20으로 희석시킨, 100 ㎕의 마우스 혈청을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.

ELISA IgG:

PBS-Tween 20 완충액으로 세척한 후, 알칼리 포스파타제에 커플링되고 PBS-1% BSA에 희석시킨 100 ㎕의 염소 항-마우스 IgG 2차 항체 (Southern Biotechnology 제품 번호 1030-04)를 1시간 동안 온도에서 인큐베이션시켰다. PBS-0.05% Tween으로 세척한 후, 100 ㎕의 알칼리 포스파타제의 p-니트로페닐 포스페이트 기질 (Sigma pNPP)을 첨가하고 15분 동안 실온 암실에 방치하였다. 이후에 반응은 50 ㎕의 3M NaOH를 첨가하여 중지시키고 광학 밀도 (OD)를 405 nm에서 판독한다.

ELISA IgE

PBS-Tween 20 완충액으로 세척 후, 바이오틴에 커플링되고 PBS-1% BSA에 희석된 100 ㎕의 래트 항-마우스 IgE 2차 항체 (Biolegend 제품 번호 BLE406904)를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. PBS-0.05% Tween으로 세척 후, 100 ㎕의 알칼리 포스파타제에 커플링된 스트렙타비딘 (Southern Biotechnology 제품 번호 7100-04)을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨다 (공급자의 추천에 따라서 PBS-1% BSA에 112000배 희석함). PBS-0.05% Tween으로 추가 세척 후, 100 ㎕의 알칼리 포스파타제의 pNPP 기질을 첨가하고 15분간 실온에서 암실에 방치시킨다. 반응은 이후에 50 ㎕의 3M NaOH를 첨가하여 중지시키고 광학 밀도 (OD)를 405 nm에서 판독한다.

결과:

- 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물은 특이적 IgG 체액성 반응을 마우스에서 야기시킨다

실시예 1에 따라 동결건조하고 5 mL의 염수 용액에 재구성시킨 담배 잎 추출물로 마우스를 2회 면역화시킨 후, IgG 유도를 생성물의 성분에 대하여 관찰하였다. 따라서, 4/5 C57BL/6 마우스 및 4/5 Balb/c 마우스는 28일에, 즉 2차 백신접종 이후 7일에 담배 잎 추출에 대항하여 그들의 IgG의 증가를 보였다 (도 2). 반응하지 않은 각 그룹의 유일한 마우스는 기본 IgG 항체 수준을 가졌다. 항체 역가는 C57BL/6 마우스보다 Balb/c 마우스에서 더 낮게 나타난다 (도 2).

그러나, 담배 잎 추출물로 마우스의 2회 백신접종 후 IgE 체액성 반응은 검출되지 않았다. 광학 밀도 (OD)는 상이한 혈청에 대해 수행된 모든 어세이에서 0.05 미만이었다.

- 담배 잎 추출물은 우선적으로 말초 혈액 자연 살해 세포를 활성화시킨다

밀도 구배 (Ficoll)에 의해서 말초 혈액으로부터 단핵 세포의 단리 이후에, 상이한 세포 개체군 (T 및 B 림프구, NK 세포 등)을 특징규명할 수 있다 (도 3). 따라서, NK세포는 CD3 음성 개체군에서 마커 CD56 및 CD16에 의해 또는 마커 NKp46에 의해 동정되었다. 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물과 단핵 세포의 인큐베이션 이후에, 활성화 마커 CD69, CD25 및 HLA-DR의 발현의 증가가 마커 CD16+CD56+ (CD3-) (도 4A) 에 의해 및 마커 NKp46 (도 4B) 에 의해 둘 모두 동정된, NK 세포 상에서 관찰되었다. 결과는 ½로 희석된 담배 잎 추출물에서 및 CD69 발현에 관해 훨씬 뚜렷하다. 따라서, 60%를 초과하는 NK 세포가 담배 잎 추출물과 접촉한 후 24시간에 마커 CD69를 발현한다 (도 4A-B). 휴지 시, 5% 미만의 혈액 NK 세포가 CD69를 발현한다.

말초 혈액 림프구에 대한 담배 잎 추출물의 효과는 훨씬 더 약하다. 따라서, 휴지 시 2%의 T 림프구는 CD69를 발현하고 이 발현은 담배 잎 추출물과 배양 24시간 이후에 6%까지 증가된다 (도 5A). CD25 발현은 담배 잎 추출물로 감작된 T 림프구 상에서 증가되지 않는다 (도 5A). 유사하게, 말초 혈액 B 림프구에 대해서, 담배 잎 추출물은 유의한 활성을 갖지 않으며, 3% 미만의 B 림프구가 이 추출물과 공동배양 24시간 후에 CD69를 발현한다 (도 5B).

- 인간 혈액 단핵 세포에 대한 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물에 의해 유도된 사이토카인의 프로파일

말초 혈액 단핵 세포는 실시예 1에 따라서 동결건조시키고 상이한 희석(1/2 또는 1/20)으로 5 mL PBS에 재구성시킨 담배 잎 추출물과 24시간 동안 접촉시켰고 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 어세이를 상청액 중에서 Luminex에 의해 수행하였다.

도 6은 담배 잎 추출물에 의한 전염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNFα, IL-17)의 강력한 유도를 보여준다. 예를 들어, 단핵 세포가 담배 잎 추출물의 존재 하에 놓여지지 않을 때 이들 사이토카인의 기준 수준은 10 pg/mL 미만이다 (도 6A).

사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNFα의 농도는 ½로 희석된 담배 잎 추출물과 인큐베이션 이후에 1 000 pg/mL 이상으로 측정된다 (도 6A). 전염증성 사이토카인의 이러한 분명한 유도는 또한 담배 잎 추출물을 1/20로 희석했을때도 관찰된다 (도 6A). 결과는 시험된 상이한 도너 사이에서 상당히 균등하였다. 세포-매개 면역성을 촉진하는 TH1 사이토카인 (IL-2, IFNγ, IL-12) 중에서, IFNγ 만이 1/2 및 1/20로 희석된 담배 잎 추출물에 의해 유의하게 자극된다 (도 6B). 담배 잎 추출물은 대략 수 pg/mL의 매우 낮은 농도의 TH2 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-13)을 유도시킨다 (도 7A). 대조적으로, 담배 잎 추출물은 단핵 세포에 의한 IL-10 생산을 자극하며, 1/2로 희석된 담배 잎 추출물과 접촉되는 세포의 상청액에서 750 pg/mL의 수준이 확인되었다 (도 7A). IL-10은 본래 TH2 사이토카인으로 간주되었지만 Tr1이라고 하는 조절성 T 림프구에 의해서도 생산될 수 있다.

우리는 담배 잎 추출물이 또한 마크로파지에 대한 주화성 효과를 발휘하는 것으로 알려진 MCP-1과 같은 케모카인 및 호중구의 증식 및 동원을 촉진하는 조혈 성장 인자 예컨대 G-CSF의 생산을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다 (도 7B). 그러나, 담배 잎 추출물은 다른 성장 인자 예컨대 IL-7 또는 GM-CSF를 유의하게 자극하는 것으로 보이지는 않는다 (도 7B). 어세이가 담배 잎 추출물과 배양 후 48시간에 채취된 상청액에 대해 수행되었을 때 동일한 사이토카인/케모카인 프로파일이 확인되었다.

결론

실시예 1에 따른 담배 잎 추출물은 상이한 유전자 배경의 2종 마우스 계통에서 생성물에 존재하는 단백질에 대하여 특이적 IgG 체액성 반응을 유도시킬 수 있다.

IgE 체액성 반응은 이들 동일 마우스에서 물질의 2회 투여 이후에 관찰되지 않았다.

시험관내에서, 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물은 우선적으로 말초 혈액 단핵 세포 중에서 NK 세포의 활성화를 유도한다. 이러한 활성화는 CD69, CD25 및 HLA-DR 분자의 증가된 발현에 의해 반영된다.

실시예 1에 따른 담배 잎 추출물은 시험관내에서 전염증성 사이토카인 예컨대 IL-1β, IL6, IL-17, IL-8 및 TNFα를 유도한다. 이들 사이토카인은 자극 이후 24시간에 채취된 배양 상청액에서 높은 농도로 존재한다.

실시예 1에 따른 담배 잎 추출물은 또한 IFNγ, IL-10, G-CSF 및 MCP-1을 유도한다. 그러나, 이러한 추출물은 TH2 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-13)의 생산을 유의하게 유도하지 않는다.

실시예 6: 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 독성학적 실험

재료 및 방법:

하기의 모든 실험은 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물로 수행되었다.

투여 경로는 모든 경우에서 피하이다. 독성학 실험은 설치류에서 수행되었다 (Han Wistar 래트). 독성학적 실험은 우수 실험실 관리 기준의 OECD 원칙 (데이타 평가시에 데이타의 상호 인증 (MAD), 1997년 11월 26일, (C(97) 186 최종) 및 프랑스 고용 노동부 (French Ministry of Employment and Solidarity)가 발행한 우수 실험실 관리 기준 (GLP) (No 2000/5bis, 2000년 3월 14일의 명령, JO 23/03/2000)에 따라서 수행되었다.

- 14일에 피하 독성의 실험

이 실험의 목적은 피하 투여 (2주 동안 주 1회) 이후에 래트에서 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 독성을 결정하기 위한 것이었다.

실험은 다음과 같이 수행되었다:

다음의 실험 결과가 확인되었다:

- 어떠한 용량에서도 폐사가 관찰되지 않는다;

- 치료-관련 임상 징후가 관찰되지 않고 피하 투여는 국소적으로 충분히 내성이다 (임상 징후 및 국소 내성 (local tolerance) 은 주사 이전 및 이후에, 및 치료가 투여되지 않을 때 1일 1회 관찰되었다);

- 체중 및 음식 소비에 대한 효과 (대조군과 비교)는 유해하지 않다;

- 치료 및 미치료 설치류 간 백혈구 계측치에 생물학적으로 유의한 차이가 있지만 이들 차이는 독성 효과를 갖지 않는다;

- 단백질 및 콜레스테롤 농도에 있어서 치료군 및 미치료군 간에 편차가 관찰되었지만, 이들 편차는 대조군의 값 이내이거나 또는 그에 가깝게 유지되었다. 이들 효과는 유해하지 않다;

- 치료군 및 대조군 간 장기 무게에 변화가 관찰되지 않았다.

따라서 11.2 및 56 ㎍ 단백질/kg/adm의 용량으로 2주 동안 주 1회로 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 Wistar 래트에 대한 피하 투여는 충분히 내성이었다.

- 피하 독성의 4주 실험

목적은 Wistar 래트에 주 1회 피하 투여 이후 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 독성을 확인하고 치료없이 4주 기간 동안 임의 독성 징후의 퇴행을 확인하는 것이었다.

잠재적인 면역학적 현상에 특히 주의를 기울였다.

실험은 다음과 같이 수행되었다:

치료 기간 동안, 래트는 투여 이전 및 투여 이후 적어도 3회 관찰하였다. 관찰 기간 동안, 래트는 1일 1회 관찰하였다.

완전한 임상 검사는 주 1회 수행하였다. 국소 내성은 각각의 주사 이전 및 이후에, 제1 주 동안은 1일 1회로, 그 이후에는 관찰 기간 종료까지 주 2회 확인하였다.

체온은 각 투여 다음 날 (1일, 8일, 15일 및 22일) 에 측정하였다.

안과학적 검사는 검사 이전, 뿐만 아니라 투여 첫 날과 마지막 날의 다음 날 (1일 및 22일) 에 수행되었다.

개별 체중 및 음식 소비는 주 2회 측정하였다.

혈액학적, 응고, 혈청, 임상 화학 변수 및 림프구 분석은 23일 및 49/48 일 (각각 수컷/암컷)에 수행되었다. 소변 검사는 23일에 수행되었다.

모든 동물은 마지막 투여 이후 또는 4주 관찰 기간 이후 2일에 희생시켜서 검시하였다. 일정 장기들을 칭량하였고 조직병리학적 검사에 사용하였다.

다음의 실험 결과들이 확인되었다:

- 어떠한 용량에서도 폐사가 관찰되지 않는다;

- 16.8, 33.6 및 112.0 ㎍/kg/adm의 단백질로서 표시되는 용량에서 피하 투여는 국소적으로 충분히 내성이었다;

- 치료-관련 임상 징후는 관찰되지 않는다;

- 체온은 영향받지 않는다;

- 치료-관련 안과학적 효과는 관찰되지 않았다;

- 체중 및 음식 소비는 영향받지 않는다;

- 혈액학, 응고 및 소변에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다;

- 크레아틴 키나제 효소 활성은 치료 기간 종료시에 암컷 그룹 3 및 4 (중간 용량 및 고용량; 각각 33.6 및 112 ㎍/kg/adm)에서 감소되었다. 이들 편차는 그들이 조직병리학적 특성과 연관된 것이 아닌 것인 한 유해한 것으로 간주하지 않았다;

- 중간 용량 및 고용량 (그룹 3 및 4)으로 처리된 수컷 및 처리된 암컷에서 순환 NK 세포 수가 약간 감소한다;

- 관찰 기간 종료시에, 고용량 (그룹 4)으로 처리된 수컷에서 순환 NK 세포의 평균 수가 저하되었다;

- 장기 무게의 변화는 관찰되지 않았다;

- 암점이 주사 부위에서 관찰되었고, 이것은 조직병리학적 평가 동안 피하 출혈에 상응한다. 이러한 관찰은 투여 과정과 관련없는 것으로 간주된다.

치료 종료 시에, 최소 또는 약간의 염증성 피부 변화가 그룹 3 및 4의 주사 부위에서 관찰된 한편, 염증성 변화가 그룹 1 및 2에서는 거의 전혀 관찰되지 않았다.

관찰 기간 종료시에, 그룹 4에 대해서 이전에 관찰된 염증 변화는 거의 완전하게 회복된 것으로 확인되었다.

112 ㎍/kg/adm의 용량까지 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 4회 피하 주사는 충분히 내성이었고 미치료 래트와 비교하여 치료된 래트에서 오직 최소의 가역적인 염증성 변화만이 일어났었다.

결론적으로, 상기 정의된 실험 조건 하에서, 16.8, 33.6 및 112 ㎍/kg/adm의 용량으로 4주 동안 주 1회로, 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 Wistar 래트에 대한 피하 투여는 충분히 내성이었고 임의의 부작용과 연관되지 않았다.

실시예 7: 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물의 투여 후 임상 실험

100 ㎍ 또는 200 ㎍의 단백질 및 만니톨을 함유하는, 실시예 1에 따른 담배 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물을 0일에 1차 및 29일에 2차 (각 시점에 각 팔에 1 mL)로 24명 흡연자에게 피하 주사를 통해 투여하였다. 코호트 확장 원리에 따라 포함시켰고, 100 ㎍을 받은 6명의 초기 환자가 먼저 포함되었고, 이후에 100 ㎍을 받은 6명의 추가 환자가 포함되기 전에, 200 ㎍을 받은 6명의 초기 환자가 포함되었다. 치료되는 대상체의 개체군은 평균 연령 44.5세인 30세 내지 65세 연령의, 14명 남성 및 10명 여성의 24명으로 구성되었다.

어떠한 용량도 국립 암 센터의 이상반응에 대한 공통 용어 기준 (Common Terminology Criteria for Adverse Events) (CTCAE) v4.0의 독성 등급에 따라서 3 내지 4 수준의 독성을 발생시키지 않았다는 점에 주목해야 한다.

담배 소비에 관하여 대상체의 초기 특징은 하기 표에 표시한다.

도 8 및 9는 담배 소비의 진화를 보여준다.

담배 수 감소를 계산하기 위한 식은 다음과 같다:

(방문n시 담배수 - 포함시 담배수) / 포함시 담배수.

4주의 시점은 16명의 흡연자 (흡연자의 67%)가 흡연을 중단하거나 또는 그들의 1일 담배 소비가 적어도 50%까지 감소되었고 24명 흡연자의 1일 담배 소비가 60%까지 감소된 것을 보여주었다.

12주 시점은 15명의 흡연자 (흡연자의 63%)가 흡연을 중단하거나 또는 그들의 1일 담배 소비가 적어도 50%까지 감소되었고 24명 흡연자의 1일 담배 소비가 60%까지 감소된 것을 보여주었다.

마지막 12명 흡연자 (24명 중 12명)는 임상 실험 센터와 그들의 최초 접촉과 실시예 1에 따른 담배 추출물의 주사 사이의 보다 긴 지연 (때때로 1개월 또는 그 이상)으로 이득을 얻었는데 반해, 처음 12명의 흡연자는 보다 짧은 지연 (종종 단지 수 일)이 있었다는 것이 흥미롭다. 보다 긴 지연으로 이득을 얻은 이들 12명 흡연자의 경우, 3주 및 4주에 흡연을 중단하거나 또는 적어도 50%까지 그들 소비를 감소시킨 흡연자의 백분율은 83% (12명 중 10명 흡연자)인데 반해, 단기 지연으로 이득을 얻은 12명 흡연자의 경우는 50% (12명 중 6명 흡연자)이다. 이러한 우수한 효능은 실시예 1에 따른 담배 추출물의 주사를 받기 전에 그들 동기부여를 강화시키는데 더 많은 시간을 가졌던 흡연자들의 더 나은 준비로 설명되었다. 마지막 12명 흡연자 중에서, 5명은 치료의 종료 이후 1주부터 12주 (추적 종료) 까지 계속적으로 절제하였고, 8명은 12주에 마지막 7일동안 계속적으로 절제하였다.

치료된 흡연자는 담배에 대한 그들의 끌림 및 그들의 흡연 충동의 감소 뿐만 아니라 담배에 대한 일부 무관심의 개시를 기술한다. 그들은 담배의 기호성 감소를 인식한다. 일부는 담배 맛의 변화를 이야기한다. 금연에 대한 그들의 동기 부여가 강화된다.

약학 조성물의 투여 이전에, 약학 조성물에 대한 IgG 항체는 모든 환자에서 검출되었다. 치료 전에, 약학 조성물에 대한 IgG의 평균 농도는 6.07 microg/mL이었다 (표준 편차: 2.98 microg/mL).

약학 조성물의 투여 이후, 항-약학 조성물 IgG의 농도에서 유의한 증가가 관찰되었다. 따라서, 약학 조성물의 투여 이후 29일에 측정된 IgG 농도는 7.19 microg/mL (표준 편차: 4.04 microg/mL)이었고, 이들 농도는 약학 조성물의 처음 투여 이후 8주에 측정시 7.5 microg/mL (표준 편차: 4.28 microg/ml)까지 증가되었다. IgG 농도의 편차는 29일과 0일 사이 (p = 0.02) 및 8주 및 0일의 측정 사이 (p = 0.006)에 유의하였다 (t-검정법 유의성 한계치 p<0.05). 8주 및 29일에 항-약학 조성물 IgG의 농도 사이에 유의한 차이가 또한 관찰되었다 (p = 0.029).

흡연 중단 및 약학 조성물에 대한 IgG의 농도를 교차하는 통계적 분석은 흡연 중단과 약학 조성물에 대한 더 높은 수준의 IgG 간 상관성 (Wilcoxon 검정법, 유의성 한계치 p<0.05)을 보여주었다.

약학 조성물의 제1 투여 이후 1주에 적어도 50% 까지 그들 소비가 감소된 환자는 29일 (p=0.034) 및 8주 (p=0.044)에 약학 조성물에 대해서 더 높은 수준의 IgG를 가졌다.

36일에 연속 7일 동안 절제한 환자 (우세한 절제)는 29일 (p<0.001) 및 8주 (p<0.001)에 약학 조성물에 대해서 더 높은 수준의 IgG를 가졌다.

12주에 연속 7일 동안 절제한 환자 (우세한 절제)는 29일 (p=0.013) 및 8주 (p=0.016)에 약학 조성물에 대해서 더 높은 수준의 IgG를 가졌다.

12주까지 계속적으로 절제한 환자는 29일 (p=0.007) 및 8주 (p=0.009)에 약학 조성물에 대해서 더 높은 수준의 IgG를 가졌다.

IgE 항체는 약학 조성물의 투여 이후에 검출되지 않았다.

Claims

분자 질량이 10 kDa을 초과하는 단백질을, 건조 추출물의 총 중량을 기준으로, 적어도 5 중량%로 함유하고, 분자 질량이 10 kDa 미만인 분자가 본질적으로 없는 담배 잎 추출물로서, 상기 단백질은 바람직하게는 하기 단백질 패밀리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 담배 잎 추출물: 리그닌-형성 음이온성 퍼옥시다제, 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제, 엔도키티나제, 병원성-관련 단백질, 오스모틴 및 프로테이나제 억제제 및 이의 혼합물.
제1항에 있어서, 고 분자 질량 단백질이 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 그 분자 질량이 500 kDa을 초과하는, 바람직하게는 그 분자 질량이 400 kDa을 초과하는, 보다 바람직하게는 그 분자 질량이 300 kDa을 초과하는, 우선적으로 그 분자 질량이 200 kDa을 초과하는, 더 우선적으로 그 분자 질량이 150 kDa을 초과하는, 보다 더 우선적으로 그 분자 질량이 100 kDa을 초과하는, 더욱 더 좋게는 그 분자 질량이 50 kDa을 초과하는 단백질이 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 질량이 10 kDa 미만인 분자 의 함량이 추출물의 총 중량을 기준으로 5 중량% 미만, 바람직하게는 2.5 중량% 미만, 더욱 더 좋게는 1 중량% 미만인 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분쇄된 건조 담배 잎의, 예를 들어 수성 용매를 사용하는, 용매 추출 공정 이후에, 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액으로부터 고형 잔류물의 분리 후, 추출물의 부피를 기준으로 2 내지 12배 부피, 바람직하게는 3 내지 10배 부피, 바람직하게는 4 내지 8배 부피, 바람직하게는 6배 부피 범위의 양의 수성 용매, 및 10 kDa 컷오프 멤브레인을 사용하는 고형 잔류물-무함유의 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액의 일정-부피 투석여과에 의하여 수득할 수 있는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제의 패밀리에 속하고, 바람직하게는 베타-1,3-엔도글루카나제 산성 이소폼 PR-Q′ (UniProt 데이타베이스에 따라 PR36401), 베타-1,3-엔도글루카나제 염기성 액포 이소폼 GLB (UniProt 데이타베이스에 따라 P27666), 및 이의 혼합물로부터 선택되는, 적어도 하나의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도키티나제의 패밀리에 속하고, 바람직하게는 산성 엔도키티나제 P (UniProt 데이타베이스에 따라 P17513), 산성 엔도키티나제 Q (UniProt 데이타베이스에 따라 P17514), 엔도키티나제 B (UniProt 데이타베이스에 따라 P24091), 및 이의 혼합물로부터 선택되는, 적어도 하나의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 오스모틴 (UniProt 데이타베이스에 따라 P14170)을 포함하는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 리그닌-형성 음이온성 퍼옥시다제 (UniProt 데이타베이스에 따라 P11965)를 포함하는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 병원성-관련 단백질 R (UniProt 데이타베이스에 따라 P13046), 병원성-관련 단백질 PR-4A (UniProt 데이타베이스에 따라 PR29062), 병원성-관련 단백질 PR-4B (UniProt 데이타베이스에 따라 PR29063), 및 이의 혼합물로부터 선택되는, 적어도 하나의 병원성-관련 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테이나제 억제제의 패밀리에 속하고, 바람직하게는 프로테이나제 억제제 I-B (UniProt 데이타베이스에 따라 Q03199), 프로테이나제 억제제 I-A (UniProt 데이타베이스에 따라 Q03198), 및 이의 혼합물로부터 선택되는, 적어도 하나의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 건조 추출물 중 단백질 함량이 건조 추출물의 총 중량을 기준으로 적어도 10 중량%, 바람직하게는 적어도 15 중량%, 바람직하게는 적어도 20 중량%인 것을 특징으로 하는 담배 잎 추출물.
유효 성분으로서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 담배 잎 추출물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 담배 잎 추출물에 존재하는 단백질은 1 내지 1 000 ㎍/mL, 바람직하게는 10 내지 500 ㎍/mL, 바람직하게는 50 내지 300 ㎍/mL, 바람직하게는 60 내지 200 ㎍/mL, 바람직하게는 80 내지 150 ㎍/mL 범위의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제13항 또는 제14항에 있어서, 대마로부터 추출된 단백질을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 피하 주사에 의한 투여에 적합한 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 담배 중독의 치료에 사용을 위한 약학 조성물.
제15항에 있어서, 담배 및 대마 중독의 공동 치료에 사용을 위한 약학 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서, 약학 조성물은 0.03 mL 내지 10 mL, 바람직하게는 0.1 mL 내지 5 mL, 바람직하게는 0.5 mL 내지 2 mL의 용량 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 담배 잎 추출물을 제조하기 위한 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 것인 제조 방법:
a. 담배 잎을 건조시키는 단계,
b. 건조된 담배 잎을 분쇄하여 분쇄된 건조 담배 잎을 수득하는 단계,
c. 용매, 예를 들어 수성 용매, 바람직하게는 pH가 6.0 내지 8.5인 수성 완충 용액으로 기계적 교반 하에서 분쇄된 건조 담배 잎을 추출하는 단계,
d. 여과 또는 원심분리에 의해서 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액으로부터 고형 잔류물을 분리하여 고형 잔류물-무함유의 분쇄된 건조 담배 잎 추출물 용액을 수득하는 단계,
e. 추출물의 부피를 기준으로 2 내지 12배 부피, 바람직하게는 3 내지 10배 부피, 바람직하게는 4 내지 8배 부피, 바람직하게는 6배 부피 범위의 양으로 용매, 바람직하게는 수성 용매, 및 10 kDa 컷오프 멤브레인을 사용하여 단계 c에서 수득된 용액을 일정-부피 여과시키는 단계,
f. 임의로 단계 d에서 수득된 단백질 용액을 동결건조시키는 단계.