KR20180126833A - 유전적으로 암호화된 전압 표시자에 포함되어 증가된 형광신호를 나타내는 링커 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicator; GEVI)에 있어서, 전압-감지 도메인과 형광 단백질 사이에 위치하여 이들을 연결하는 링커 펩타이드로서, 아르기닌 잔기를 하나 이상 포함하여 이를 불포함하는 링커 펩타이드에 비해 증가된 형광신호를 나타내는 것인 링커 펩타이드, 상기 링커 펩타이드를 포함하는 형광 단백질 전압 센서, 및 이를 포함하는 신경세포의 막전위 측정용 조성물에 관한 것이다.

Description

유전적으로 암호화된 전압 표시자에 포함되어 증가된 형광신호를 나타내는 링커 펩타이드{Linker peptide comprised in genetically encoded voltage indicator providing improved fluorescent signal}
본 발명은 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicator; GEVI)에 있어서, 전압-감지 도메인과 형광 단백질 사이에 위치하여 이들을 연결하는 링커 펩타이드로서, 아르기닌 잔기를 하나 이상 포함하여 이를 불포함하는 링커 펩타이드에 비해 증가된 형광신호를 나타내는 것인 링커 펩타이드, 상기 링커 펩타이드를 포함하는 형광 단백질 전압 센서, 및 이를 포함하는 신경세포의 막전위 측정용 조성물에 관한 것이다.
신경 시스템은 전압을 사용하여 정보를 암호화하고 전달한다. 이러한 활성을 지속적으로 관찰하기 위해서는, 크고 복잡한 전극을 사용하거나, 세포 원형질막 염색 염료를 사용한다. 이러한 염료의 형광 세기는 세포 원형질막의 전위 변화에 따라 변화하나, 접촉하는 모든 세포를 염색하기 때문에, 특정 뉴런 회로(circuits)를 표적화하기는 어렵다.
한편, DNA 발현은 세포-특이적이기 때문에, 형광 단백질은 특정 신경 회로로 표적화할 수 있다. 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicator; GEVI)인 이들 형광 단백질은 형광 단백질에 융합된 전압-감지 도메인(voltage-sensing domain; VSD)을 포함하여, 전압 변화를 광학 변화로 전환할 수 있다.
신경 세포의 활성에 대한 유전자 인코딩된 형광 센서는 개개의 신경 세포와 전체의 신경 세포 회로의 생리를 연구하기 위한 가능성을 제공한다. gCAMP 시리즈의 칼슘 센서는 Danio rerio 배아와 같은 투명한 물질에서 생체 내 스파이크 활동의 비침투적 측정을 가능하게 한다(Ahrens et al., Nat. Methods, 2013, 10: 413-420).
GEVIs는, 막관통 단백질이라는 이유에서, 이의 칼슘 채널을 이용한 센서에 비해 기술적으로 뒤떨어져 있다. 형광 막관통 단백질은 2가지 문제점을 가진다. 첫 번째는 비효율적인 세포막으로의 수송으로 인해 프로브의 신호-대-잡음 비를 감소시키는 내부의 비반응 형광을 초래한다는 점이다. 두 번째는 막 발현이 프로브의 양을 제한하여 전체 형광량을 낮추므로 이 또한 신호-대-잡음 비율을 감소시킨다는 점이다. 전압-개폐(voltage-gated) 채널에서 전압을 감지하는 도메인으로 사용되는 기존의 GEVIs의 낮은 막 발현은 Ciona intestinalis 전압-감지 탈인산화 효소(voltage-sensing phosphatase; VSP)의 전압-감지 도메인을 활용함으로써 극복되었다(Dimitrov et al., PLoS One, 2007, 2: e440). 프로브 hVOS는 형광을 세포막에 고정하기 위해서 파르네실화된(farnesylated)-GFP를 사용하여 전달의 문제점을 극복하였고 뇌 절편에서 잘 작동하였으나, 소광 물질의 필요조건은 생체 내에서의 유용성을 제한할 수도 있다.
GEVIs는 확률적으로 변화하는 형광 노이즈를 넘어서 측정 가능한 신호를 산출하기 위하여 큰 광학적 반응을 나타내야 한다. 이들의 개선은 주로 형광 도메인의 개선에 집중되었다. Super-ecliptic pHluorin(Ng, M. et al., Neuron, 2002, 36: 463-474)의 변종이 결합된 Ciona VSP의 VSD를 포함하는 ArcLight는 100 mV의 탈분극에 의한 30%의 형광 변화를 나타낸다. 로돕신에 기초한 GEVIs인 Arch는 막 탈분극에 반응하여 큰 광학적 신호를 나타내지만, 상대적으로 낮은 형광을 보인다. 또한 이러한 로돕신-기재 프로브와 오렌지색으로 변환된 형광 단백질의 결합은 막 전위에서의 변화를 광학적으로 나타냈다. ASAP-1 센서는 세포 바깥쪽에 원상순열화된(circularly permuted) GFP를 사용하여 광학적 신호의 속도를 향상시켰다. GEVIs는 생체 내에서 신경 세포 활성을 나타낼 수 있다.
GEVIs에 의한 뉴런 활성의 효율적인 이미징은 전압-유도 광학 반응의 규모(magnitude), 형광 변화의 속도, 광학적 신호를 유발하는 전압 범위 및 효율적인 원형질막 발현(한정된 내부 발현, limited internal expression)의 조합에 의존한다. 이러한 특성을 궁극적으로 생체 내 측정에서 중요한 요소인 신호-대-잡음 비(Signal-to-Noise Ratio; SNR)를 결정한다. 어느 하나의 특성을 개선하는 것은 SNR을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 다른 특성에서의 결핍을 상쇄할 수 있다. 예를 들어, ArcLight는 느린 반응 시간을 갖는 GEVI이나, 100 mV의 원형질막 탈분극에 대해 가장 큰 신호 크기를 갖는다. 또한 ArcLight는 억제활성으로부터 역치 미만의 시냅스 탈분극까지 나아가 활동 전위까지 모든 형태의 뉴런 활성을 검출할 수 있는 매우 넓은 전압 범위를 갖는다. 그러나, 이렇게 넓은 전압 범위를 갖는 것은 ArcLight의 느린 반응 속도와 더하여 많은 수의 세포를 갖는 시료를 이미징할 때 활동 전위로부터 시냅스 활성을 구별하기 어렵게 한다. 다른 GEVI인 Bongwoori는 향상된 속도 및 60 Hz에서 발화하는 활동 전위의 광학적 분석이 가능하도록 보다 양 전위로 이동된 전압-반응을 나타내는 ArcLight 유도체이다. Bongwoori가 제브라피쉬 배아에 발현되었을 때 생체 내 신호를 관찰할 수 있었던 반면, 신호의 크기가 작아 신경 활동의 검출은 어려웠다.
이에 본 발명자들은 형광 신호 변화율이 향상된, 전압-감지 도메인과 형광 단백질을 포함하는 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicator; GEVI)를 제공하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 상기 전압-감지 도메인과 형광 단백질 사이에 아르기닌 잔기를 하나 이상 포함하는 특정 서열의 링커 펩타이드를 포함하도록 고안한 경우, 이를 불포함하는 링커 펩타이드로 연결된 GEVI에 비해 활동 전위 발화시 20%까지 증가된 형광신호를 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicator; GEVI)에 포함되는, 전압-감지 도메인과 형광 단백질 사이에 위치하여 이들을 연결하는 링커 펩타이드로서, 아르기닌 잔기를 하나 이상 포함하여 이를 불포함하는 링커 펩타이드에 비해 증가된 형광신호를 나타내는 것인 링커 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 링커 펩타이드로 연결된, 전압-감지 도메인 및 형광 단백질을 포함하는, 형광 단백질 전압 센서(fluorescent protein voltage sensor)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형광 단백질 전압 센서를 포함하는 신경세포의 막전위 측정용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicator; GEVI)에 포함되는, 전압-감지 도메인과 형광 단백질 사이에 위치하여 이들을 연결하는 링커 펩타이드로서, 아르기닌 잔기를 하나 이상 포함하여 이를 불포함하는 링커 펩타이드에 비해 증가된 형광신호를 나타내는 것인 링커 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 특정 서열의 링커를 사용하여 전압-감지 도메인과 형광 단백질을 연결하여 융합 단백질을 형성하는 경우, 야생형 시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis)의 전압-민감성 인산화효소의 아미노산 서열(Accession code; AB183035) 유래의 전압-감지 펩타이드의 링커로부터 유래한 대조군 링커(서열번호 8: YSHQQMGDP)로 연결된 복합체에 비해 전압 감응성 형광신호 변화율이 증가하는 것을 발견한 데에 기초한다.
구체적으로, 본 발명의 링커 펩타이드는 5 내지 10개 아미노산으로 이루어진 것으로, 양으로 하전된 아미노산인 아르기닌 잔기를 새롭게 도입하거나, 다른 성질의 예컨대, 음으로 하전되거나, 극성 또는 비극성의 중성인 아미노산 잔기를 탈락 및/또는 치환하여, 하나 이상의 아르기닌 잔기를 포함하여 양으로 전반적으로 보다 양으로 하전된 것이 특징인, 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
예컨대, 본 발명의 링커에 의해 형광 단백질과 연결되어 유전적으로 암호화된 전압 표시자를 형성하는 상기 전압-감지 도메인은 야생형 시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis)의 전압-민감성 인산화효소의 아미노산 서열(Accession code; AB183035) 유래의 전압-감지 펩타이드 및 이의 변이체일 수 있다. 상기 전압-감지 인산화효소는 4개의 막광통 분절을 포함하며, N-말단으로부터 C-말단 방향으로 118 내지 137째 아미노산으로 이루어진 S1 분절, 145내지 170째 아미노산으로 이루어진 S2 분절, 182 내지 200째 아미노산으로 이루어진 S3 분절, 및 215 내지 234째 아미노산으로 이루어진 S4 분절을 포함할 수 있다. 상기 전압-감지 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 S1 막관통 분절, 서열번호 10, 13 또는 15의 아미노산 서열로 이루어지는 S2 막관통 분절, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 S3 막관통 분절, 및 서열번호 12 또는 14의 아미노산 서열로 이루어지는 S4 막관통 분절을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 전압-감지 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 S1 막관통 분절, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 S2 막관통 분절, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 S3 막관통 분절, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 S4 막관통 분절; 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 S1 막관통 분절, 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 S2 막관통 분절, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 S3 막관통 분절, 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 S4 막관통 분절; 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 S1 막관통 분절, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 S2 막관통 분절, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 S3 막관통 분절, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 S4 막관통 분절;을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 전압-감지 도메인으로는 당업계에 공지된 전압-감지 단백질의 전압-감지 도메인 및 이의 변이체를 제한없이 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 전압-감지 도메인은, 야생형 시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis)의 전압-민감성 인산화효소의 아미노산 서열(Accession code; AB183035)로부터 S4 분절의 C 말단에 위치한 링커 이하의 아미노산 서열을 제외한, 서열번호 16의 시오나 인테스티날리스의 전압-민감성 인산화효소 유래 전압-감지 도메인(CC1-VSD); 상기 서열번호 16의 전압-감지 도메인의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, S2 분절에 위치한 154번째 잔기인 알라닌(Ala; A)이 아스파르트산(Asp; D)으로, S4 분절에 위치한 217번째 잔기인 아르기닌(Arg; R)이 글루타민(Gln; Q)으로, 229번째 잔기인 아르기닌(Arg; R)이 이소루신(Ile; I)으로 치환된 서열번호 17의 변이체(Bongoori); 또는 상기 서열번호 16의 전압-감지 도메인의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, S2 분절에 위치한 164번째 잔기인 아스파르트산(Asp; D)이 아스파라긴(Asn; N)으로 치환된 서열번호 18의 변이체(D164N);일 수 있다.
한편, 상기 전압-감지 도메인은 S1 분절의 N-말단, S1-S2 분절 사이, S2-S3 분절 사이 및 S3-S4 분절 사이에 위치하는 루프 서열을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열로 이루어진 전압-감지 도메인은 S1 내지 S4 분절 이외에 S1 분절의 N-말단에는 117개 아미노산으로 구성된 추가적인 서열을, 또한 각 S1 내지 S4 분절의 사이에는 수 내지 십수개의 추가적인 아미노산 서열을 포함하여 구성된다.
이때, 상기 루프 영역에는 아미노산 치환, 결실, 또는 추가로 도입된 제한효소 인식부위를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 제한효소 인식부위는 NheI, ClaI, Hind III, KpnI, 및 Eco RV로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제한효소 인식부위일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 제한효소를 사용하여 특이적으로 인식하여 절단 가능한 부위를 제한없이 사용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 링커 펩타이드로 연결된, 전압-감지 도메인 및 형광 단백질을 포함하는, 형광 단백질 전압 센서(fluorescent protein voltage sensor)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형광 단백질 전압 센서를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질주입된 숙주세포, 예컨대, 신경세포를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 작동 가능하도록 연결 가능한 뉴런-특이적 프로모터 또는 표적화 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 전압 센서용 융합 단백질은 전압-감지 도메인에 본 발명의 링커 펩타이드를 통해 형광 단백질이 직접 연결된 융합 단백질일 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 전압-감지 도메인으로는 서열번호 16의 시오나 인테스티날리스의 전압-민감성 인산화효소 유래 전압-감지 도메인(CC1-VSD); 상기 서열번호 16의 전압-감지 도메인의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, S2 분절에 위치한 154번째 잔기인 알라닌(Ala; A)이 아스파르트산(Asp; D)으로, S4 분절에 위치한 217번째 잔기인 아르기닌(Arg; R)이 글루타민으로, 229번째 잔기인 아르기닌(Arg; R)이 이소루신(Ile; I)으로 치환된 서열번호 17의 변이체(Bongoori); 또는 상기 서열번호 16의 전압-감지 도메인의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, S2 분절에 위치한 154번째 잔기인 아스파르트산(Asp; D)이 아스파라긴(Asn; N)으로 치환된 서열번호 18의 변이체(D164N);일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 형광 단백질은 리포터 단백질로서 전압은 감지하여 형광으로 전환함으로써 가시화하는 물질로서, 당업계에 공지된 다양한 형광 단백질 또는 이들의 변이체로 이루어지는 군에선 선택되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 형광 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 super ecliptic pHluorin 또는 상기 이의 227번째 잔기인 알라닌(Ala; A)이 아스파르트산(Asp; D)으로 치환된, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 변이체(SE A227D)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명에 따른 형광 단백질 전압 센서는, 서열번호 21 내지 29의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 또는 서열번호 30 내지 38의 염기서열에 의해 암호화되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 전압-감지 도메인 및 형광 단백질의 구체적인 예로써, 각각 시오나 인테스티날리스의 전압-민감성 인산화효소 유래 전압-감지 도메인(CC1-VSD)과 이의 변이체, 및 super ecliptic pHluorin과 이의 변이체를 예시하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 전압-감지 도메인과 형광 단백질 또는 이들의 변이체를 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형광 단백질 전압 센서를 포함하는 신경세포의 막전위 측정용 조성물을 제공한다.
신경세포는 전기적 자극 혹은 신경전달물질에 의해 세포막의 이온 투과도가 변하고, 이때 전압의 +극과 -극이 뒤바뀌는 역전현상이 일어난다. 이러한 현상을 활동전위(Action Potentials)라 부르는데, 하나의 활동전위는 1 내지 2 msec(1000분의 1초)로 빠르게 일어난다. 활동 전위는 냄새, 소리, 운동 등 뇌를 통해 일어나는 모든 반응을 전달하는 매개체가 되기 때문에 활동전위를 파악하는 것은 뇌 연구에 필수적이다.
특정한 전압 범위에만 반응하도록 조정된 프로브를 사용하는 실험전략(예를 들면, 활동 전위에만 반응하는)을 위해서는 서로 다른 종류의 신경 활동을 측정하기 위한 다수의 프로브가 필요하게 된다. 크고, 빠르고, 넓은 전압범위에서 직선형 형광 반응을 갖는 단일 프로브가 단일 세포의 신경 억제, 시냅스 활성 및 활동 전위를 측정할 수는 있지만, 상기 프로브를 발현하는 세포 집단에서 발생하는 신호는 해석하기 어렵다. 하나의 픽셀이 서로 다른 세포들로부터 발생하는 상이한 전압 변화를 맞닥뜨리게 될 수 있다. 세포-유형 특이적 발현을 하는 이상적인 경우에 있어서도, 뉴런 활성은 동시 통합화되어 나타나지 않는다. 따라서, 형광 방출은 그러한 뉴런 활성들의 총합이며 이에 정보의 손실을 초래하게 된다. 특정 전압 범위에만 튜닝된 프로브들은 이러한 신경세포 집단에서의 이미징에 있어 정보를 지키는 이점을 가질 수 있다.
현재까지 유전적으로-암호화된 형광 전압 프로브의 기능 향상은 주로 형광 단백질에 초점이 맞추어져 있다. 본 발명에서는, 프로브의 속도, 신호 크기 및 전압-의존성을 향상시킴에 있어서 VSD의 역할을 입증하였다. 프로브의 전압-민감도 조절은 뉴런 활성의 생체 내(in vivo) 분석에 매우 중요하다. 본 발명의 목적은 복잡하고 번거로운 전기 피펫을 빛으로 대체하는 것이다. 역치 이하의 탈분극 현상으로부터 활동전위를 광학적으로 구별하는 것은 활동전위에 적절히 반응하는 프로브가 없다면 매우 어렵다. 대부분의 현재 알려진 GeFVS는 과분극 조건하에서 반대 형광 신호를 발생하기 때문에, 신경 억제 특성을 규명하는 것은 극히 어렵다. 하나의 뉴런이 형광을 증가시키면, 다른 이웃하는 뉴런은 형광이 감소하여 형광 증가를 상쇄시킨다. VSD의 추가적인 변이 조작에 따라 결과적으로 활동전위, 시냅스 활성도, 그리고 잠재적으로는 신경억제를 광학적으로 분석할 수 있는 프로브를 만들 수 있게 될 것이다.
본 발명의 유전적으로 암호화된 전압 표시자를 발현하는 뉴런을 광학적으로 분석하여, 다양한 세포에서 많은 화합물을 동시에 시험할 수 있다. 본 발명의 유전적으로 암호화된 전압 표시자는 전압 센서(voltage sensor)이므로, 발생 비율, 시냅스 입력, 및 몇몇의 상황의 저해에 대한 효과를 광학적으로 관찰하여, 다양한 약학적 화합물의 활성에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 센서를 이용하여 하나의 신경회로 또는 여러 신경세포의 신경회로를 한눈에 실시간으로 볼 수 있게 되었고 전에 볼 수 없었던 기능적 뇌활성 지도를 제작할 수 있게 되었다. 머지않은 미래에는 정상과 비정상인 뇌의 변화를 확인할 수 있게 될 것이고, 이를 통해 질병의 근본적인 원인을 파악하여, 자폐증과 같은 뇌질환의 원인규명 및 치료제 개발에도 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 센서를 적용하는 예로는, 후각 신경구의 연구가 있다. 후각 신경구(olfactory bulb)는 지시를 통합하고 이러한 정보를 뇌에 전달한다. 봉우리를 사용하여 후각 신경구의 활성을 이미지화함으로써, 후각 시스템이 지시를 분화하는 기작을 더 잘 이해할 수 있다. 동물을 다양한 지시에 노출하여, 뉴런 활성을 유도하는 지시의 입력과 출력 지도를 만들 수 있다. 이러한 정보는 다른 감각 회로에서 또한 얻을 수 있으며 후각에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로는, 제브라피시 배아는 투명하기 때문에 이미징 기술에 이상적이다. 뇌의 다양한 부위에서 봉우리를 발현하는 배아를 사용하여 발달과정에서 일어나는 뉴런 활성의 지도를 제작할 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 전압센서는 고속처리(High Throughput) 약물 선별에 사용될 수 있으며, 봉우리는 뉴런활성을 광학적 신호로 빠르게 전환하기 때문에, 수개의 뉴런 활성을 동시에 관찰할 수 있다. 봉우리를 발현하는 세포를 사용하여, 다양한 약물이 뉴런 활성에 미치는 결과를 신속히 관찰할 수 있다.
본 발명의 링커 펩타이드는 이를 통해 연결된 전압-감지 도메인과 형광 단백질을 포함하는 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicator; GEVI)의 형광신호 변화율을 향상시켜 보다 민감한 검출을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 이를 포함하는 GEVI를 구비한 형광 단백질 전압 센서는 뉴런활성 연구 및 나아가 이와 관련된 질병 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 전압-의존적 광학 신호의 크기에 대한 링커 도메인의 전하 구성 변화의 효과를 나타낸 도이다. (A)는 GEVI의 개략도를 나타낸 것으로, 전압-감지 도메인은 파란색으로, 링커 부분은 빨간색으로, 그리고 형광 단백질(fluorescent protein; FP)은 초록생으로 표시하였다. (B)는 음으로 및 양으로 하전된 링커 구조물을 비교하여 나타낸 도이다. VSD는, 약 +80 mV의 V1/ 2을 갖는, Ciona intestinalis 유도 GEVI인 CC1이다. 링커 내에 음으로 하전된 아미노산의 도입은 파란색으로, 그리고 링커 내에서 양으로 하전된 아미노산은 빨간색으로 표시하였다. (C)는 전압에 반응하는 광학 신호를 볼츠만 함수(Boltzmann function)에 맞춘 뒤 정상화하여 나타낸 것이다. CC1-M240와 음의 링커 변이체(좌측) 및 양의 변이체(우측)를 비교하였다. (D)는 단계적인 전압 펄스에 반응하는 CC1-M240, CC1-Pos6 및 CC1-Neg4의 평균 광학 신호를 나타낸다. 삽입도는 CC1-Pos6가 발현된 HEK 293 세포 중 하나로, 200 mV 전압 펄스가 가해지는 동안 50% 이상의 큰 형광 신호를 나타낸다. 'Ref.'는 기준(reference)을 나타낸다. 음영 처리된 영역은 평균의 표준 오차를 나타낸다. 세포 수를 각 구조물에 대해 평균하였다(CC1-M240: 4, CC1-Neg1: 3, CC1-Neg2: 4, CC1-Neg3: 5, CC1-Neg4: 4, CC1-Pos5: 4, CC1-Pos6: 6, CC1-Pos7: 6, CC1-Pos8: 4). (D)에서 *는 비교된 평균들 간의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(*p＜0.05 및 ***p＜0.001).
도 2는 변화된 링커 전하 조성의 효과를 나타낸 도이다. (A)는 CC1-Pos6, 라이신 버전인 CC1-Pos6-Ks의 감소된 신호 크기 및 느려진 반응을 나타낸다. (B)는 단일 아미노산 형태로 구성된 링커 변이체에 대한 결과를 나타낸다. 양으로 하전된 링커는 200 mV 탈분극에 대한 신호 크기가 가장 적게 변하였으며, CC1-M240에 비해 통계적으로 현저한 차이를 나타내지 않았다. 음의 아미노산 링커는 신호 크기를 거의 15배 감소시켰다. 삽입도는 CC1-9Ds를 발현하는 HEK 293 세포를 나타낸다. 세린 또는 글루타민으로 구성된 극성 링커는 약 50%가량 신호를 감소시켰다. 전체가 알라닌으로 구성된 링커는 약 1/3 가량으로 신호를 감소시켰다. 음영 처리된 영역은 평균의 표준 오차를 나타낸다. 세포 수를 각 구조물에 대해 평균하였다(CC1-M240: 4, CC1-Pos6: 4, CC1-Pos6-Ks(800 msec 펄스): 4, CC1-9Rs: 4, CC1-9Ks: 4, CC1-9Ds: 3, CC1-9Es: 3, CC1-9Ss: 4, CC1-9Qs: 4, CC1-9As: 5). 스케일바=20 μm. 도 2B에서, 3개 그룹 간에는 유의미한 차이를 나타내지 않았다(no significant difference; n.s.).
도 3은 생리학적으로 의미있는(physiologically relevant) 전압 범위로의 전압 민감성 조절을 나타낸 도이다. (A)는 Pos6 링커에 융합된 상이한 VSD 도메인의 도표 및 단계적인 전압 펄스에 대하여 이들이 반응하는 광학 신호를 개략적으로 나타낸다. (B)는 (A)에서 보여진 데이터를 볼츠만 함수에 맞춘 뒤 정상화하여 나타낸 도이다. 배경색은 파란색으로 음영 처리된 억제성 시냅스 후 전위(inhibitory post-synaptic potentials; IPSPs)를 갖는, 노란색으로 음영 처리된 흥분성 시냅스 후 전위(excitatory post-synaptic potentials; EPSPs)를 갖는, 그리고 빨간색으로 음영처리된 활동 전위를 갖는, 상이한 형태의 뉴런 활성을 묘사한다. (C)는 광학 반응의 속도를 전압의 함수로서 나타내는 가중된 시간 상수를 나타낸다. (A)에서 Bongwoori-Pos6 자취에 대해 12번의 시도를 평균하였다. 음영 처리된 부분 및 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 세포 수를 각 구조물에 대해 평균하였다(CC1-M240: 4, CC1-Pos6: 6, Bongwoori-Pos6: 4, 및 D164N-Pos6: 6).
도 4는 링커 도메인의 아르기닌 스캐닝 결과를 나타낸 도이다. (A)는 S4 막관통 영역 및 FP 사이의 모든 위치에 도입된 아르기닌 잔기(빨간색)를 나타낸다. (B)는 A의 각 구조물에 대한 5개 다른 막전위에서의 광학 반응을 나타낸 바 그래프이다. (C)는 Bongwoori-R3의 광학 반응을 Bongwoori 및 Bongwoori-Pos6과 비교하여 나타낸 도이다. (D)는 (C)에 보여진 데이터를 볼츠만 함수에 맞춘 뒤 정상화하여 나타낸 도이다. 음영은 도 3에서와 같다. 음영 처리된 부분 및 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다. (E)는 Bongwoori-R3 발현하는 HEK 293 세포의 100 mV 탈분극 전압 펄스에 반응하는 2-광자 전압 이미징을 나타낸다. HEK 293 세포의 수를 각 구조물에 대해 평균하였다(Bongwoori: 4, Bongwoori-R1: 4, Bongwoori-R2: 5, Bongwoori-R3: 5, Bongwoori-R4: 4, Bongwoori-R5: 4, Bongwoori-R6: 4, Bongwoori-R7: 4, Bongwoori-R8: 4). (B)에서 *는 비교된 평균들 간의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(**p＜0.01 및 ***p＜0.001).
도 5는 다양한 GEVIs 및 이들의 활동 전위 분석 능력을 비교하여 나타낸 도이다. (A)는 전세포 전류 클램프 모드 하에서, ArcLight, ASAP-1, Bongwoori, Bongwoori-Pos6 및 Bongwoori-R3을 발현하는, 배양된 마우스 해마 뉴런의 3개 다른 영역(세포체-빨간색, 돌기-파란색 및 노란색)으로부터의 광학적 자취를 나타낸다. 각 자취 상의 숫자는 선택된 픽셀의 형광 세기(a.u., arbitrary unit)를 나타낸다. (B)는 다양한 GEVIs의 세포체에 상응하는 픽셀들로부터 평균화된 신호 크기를 비교하여 나타낸 도이다. 바 그래프 하단 흰색 영역은 원형질막의 역치 미만 탈분극에 대한 광학적 반응의 크기를 나타낸다. 회색 음영 처리된 영역은 활동 전위 스파이크 동안 광학적 신호의 크기에 상응한다. (C)는 (B)에서 평균화된 광학적 신호의 총 신호 크기에 대한 스파이크의 비율을 나타낸 도이다(n.s., 유의하지 않음). (D)는 Bongwoori-R3을 발현하는 두개의 해마 뉴런을 나타낸 도이다. 좌측의 세포는 65 Hz에서 발화한다. 우측의 세포는 비교적 낮은 형광 신호 세기를 나타내었으나, 여전히 활동 전위에 반응하여 준수한 광학 신호를 나타내었다. 에러바 및 음영 처리된 부분은 평균의 표준 오차를 나타낸다. 도 5B 및 5C에서 분석한 각 세포에 대해 평균한 활동 전위의 수는 다음과 같다; ArcLight에 대해 3, 5 및 4, ASAP1에 대해 5, 3 및 4, Bongwoori에 대해 3, 3 및 5, Bongwoori-Pos6에 대해 4, 4 및 3, Bongwoori-R3에 대해 4, 4 및 4. 도 5C에 대한 p-값은 ArcLight와 Bongwoori-R3에 대해 0.0349, ASAP1와 Bongwoori-R3에 대해 ＞0.9999, Bongwoori와 Bongwoori-R3에 대해 ＞0.9999, 및 Bongwoori-Pos6와 Bongwoori-R3에 대해 0.8284였다. (C)에서 *는 비교된 평균들 간의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(*p＜0.05). 스케일바=20 μm.
도 6은 활동 전위의 발화 동안 뉴런의 산성화에 의한 바탕선 이동을 나타낸 도이다. (A)는, pH-민감성인, 파르네실화된 버전의 FP, SE 227D를 발현하는 배양된 해마 뉴런을 나타낸다. 유도된 형광 효과에 대한 pH의 역할을 결정하기 위하여, 해마 뉴런의 원형질막에 고정된 버전의 SE 227D를 발현시키고 활동 전위를 측정하였다. (B)는 Bongwoori-R3을 발현하는 배양된 해마 뉴런을 나타낸다. pH 민감성 FP, SE 227D에 VSD 도메인을 융합시킴으로써, 세포가 다소 산성화되었을 때에도 활동 전위의 광학적 분석을 가능케 하였다. (C)는 (B)와 동일한 세포에서 세포체 부분과 돌기 부분의 바탕선 변화 정도의 차이를 나타낸다. 빨간색 자취는 세포체로부터의 신호를 나타낸다. 파란색과 노란색 자취는 돌기로부터 신호를 나타낸다. 스케일바=20 μm.
도 7은 전압에 대한 가장 높은 상관성의 형광 변화를 나타내는, 단회 시도, 단일 픽셀 자취를 나타낸 도이다. (A)는 전압에 대한 형광의 피어슨(Pearson) 상관 계수 행렬(correlation coefficient matrix)을 나타낸다. 가장 높은 계수 값을 흰색으로 기재하였다. (B)에서 빨간색 화살표는 가장 높은 상관 계수를 갖는 픽셀의 위치를 나타내며, 파란색 화살표는 비교적 낮은 형광 세기를 갖는 픽셀을 나타낸다. 각 이미지 아래의 숫자는 선택된 픽셀의 형광 세기(임의 단위(arbitrary units; a.u.))로 표기를 의미한다. 상단 및 중단의 픽셀 신호는 각각 필터되지 않은 신호와 저주파 필터된 신호를 나타낸다. 비교를 위해 하단에는 전기생리학적으로 측정된 전압신호(검정색)를 나타내었다. (C)는 상위 5%의 상관 계수를 나타내는 픽셀과 이로부터의 평균 자취를 나타낸다. (D)는 전압 신호에 대한 광학적 자취의 평균 제곱근 편차를 비교하여 나타낸 도이다. (E)는 가장 높은 상관 계수를 갖는 단일 픽셀로부터의 Bongwoori-R3 신호를 나타낸다. 100 Hz의 컷-오프 주파수를 갖는 저주파 통과 가우시안 필터를 필터링에 적용하였다. 에러바는 평균의 표준 오차이다. D에서 *는 통계적 유의성을 나타낸다(*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001 및 n.s.: 유의미하지 않음). 스케일바=20 μm.
도 8은 신경활성이 나타나는 관심영역을 뉴런 활성을 무전극법(electrode-free method)으로 결정한 결과를 나타낸 도이다. (A)는 대표적인 Bongwoori-R3 기록을 나타낸다. 상단은 도 7로부터의 Bongwoori-R3을 발현하는 뉴런의 전기적 기록을 나타낸다. 채색된 음영 박스는 상관성 분석에 사용된 서로 다른 시간창(time window)에 해당한다. 하단은 역치 미만(subthreshold, 초록색), 휴지상태(빨간색) 및 활동 전위(파란색) 동안 임의의 수, n=1000 픽셀 또는 n=2000 픽셀에 대해 관심 영역에서 계산된 결과를 나타낸다. (B)의 상단은 가중치 행렬(weight matrix) 및 이에 상응하는 가중된(weighted) ΔF/F 신호를 나타낸다. 하단은 전체 기록에 대해 1000 픽셀로 정의된 관심 영역 및 활동 전위 동안 이들 픽셀의 상응하는 평균을 나타낸다. (C)는 ArcLight(좌측), ASAP-1(중간) 및 Bongwoori-R3(우측)을 발현하는 세포에 Pixel-to-pixel method를 적용한 결과를 나타낸다. 스케일바=20 μm. 픽셀 수는 모두 1000이다.
도 9는, 전압 영역과 반응속도면에서 최적화되지 않은 GEVIs인 CC1-Pos6 및 D164N-Pos6을 발현하는 배양된 마우스 해마 뉴런으로부터 발생된 활동 전위의 광학적 이미지를 나타낸 도이다. 저주파 여과를 위해 가우시안 필터를 사용하였다. 상단의 자취는 여과되지 않았고, 하단의 자취는 저주파 여과되었다. 스케일바=20 μm.
도 10은 Bongwoori-R3으로 측정한 ΔF/F의 바탕선 변화와 발생하는 활동 전위의 수와의 상관성을 나타낸 도이다. 세포체의 바탕선 변화 크기를 발생된 활동 전위의 수에 대해 플롯하였다. 정상 완충능(5 mM HEPES) 또는 높은 완충능(100 mM HEPES)을 갖는 피펫 용액을 사용하고 별도로 플롯하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 플라스미드 DNA 구축
통상적인 단일 단계 PCR 또는 2단계 중복 신장 PCR(overlap extension PCR)을 사용하여 링커 변이체 구조물(linker variant constructs)을 제조하였다. CC1로부터 CC1-Neg1을 유도하였다(Piao, H.H. et al., J. of Neuroscience, 2015, 35(1): 372-385). 초기 PCR은 프라이머 RK024(forward; 5'-aagctggctagcaccATGGAGGGATTCGACGGTTCAG-3'; 서열번호 39) 및 neg1-B(reverse; 5'-GGGATCCCCCATCTCTTGGTGGGAGTCAAATATTCTTGC-3'; 서열번호 40)를 사용하여 CC1의 전압-감지 도메인(voltage-sensing domain; VSD)을 증폭시켰다. SE A227D(super ecliptic pHluorin A227D)에 대한 FP(fluorescent protein) 부분은 Bongwoori를 템플레이트로 하여 neg1-A(forward; 5'-GAATATTTGACTCCCACCAAGAGATGGGGGATCCCATGAG-3'; 서열번호 41) 및 RK-27(reverse; 5'-ttttctcgAGTTCTAGATCATTTGTATAGTTCATCC-3'; 서열번호 42)을 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다. 두 개의 PCR 생성물로부터 중첩된 링커 영역은 2차 PCR 반응에서 서로 어닐링되고, 이후 양측면 말단에 결합하는 프라이머(flanking primers), RK024 및 RK027에 의해 증폭되었다. 최종 PCR 생성물은 Nhe1과 Xho1으로 절단한 후 pcDNA3.1 / Hygro (+) 골격 벡터(Invitrogen, USA) 내에 결찰되었다. 이어서, 템플레이트 DNA로 CC1-Neg1을 사용하여 다른 링커 변이체들(CC1-Neg2, CC1-Neg3, CC1-Neg4, CC1-Pos5, CC1-Pos6, CC1-Pos7, CC1-Pos8 및 CC1-M240)을 클론하였다. 링커 부분이 단일 형태(single type)의 아미노산 잔기로 구성된 구조물(CC1-9Ds, CC1-9Es, CC1-9Ks, CC1-9Rs, CC1-9Ss, CC1-9Qs 및 CC1-9As)은 CC1-M240(WT)로부터 변형하여 제조하였다. CC1-Pos6를 D164N-Pos6 및 CC1-Pos6-K 유전자 구조물의 제조를 위한 템플레이트 DNA 구조물로서 사용하였다. Bongwoori-Pos6의 제조를 위하여, CC1-Pos6의 링커 서열을 인코딩하는 두 가지 서로 다른 프라이머를 Bongwoori에 대한 PCR 반응과 CC1-Pos6에 대한 다른 PCR 반응을 위해 사용하였다. 결과로 획득한 두가지 PCR 생성물을 함께 어닐링한 후 RK024와 RK027로 증폭시켰다. 각각 8개 다른 링커 위치에 아르기닌을 도입하기 위하여 고안된 프라이머로 Bongwoori-아르기닌 스캐닝 실험을 위한 8개 구조물을 Bongwoori로부터 변형시켰다. 모든 프라이머의 합성 및 제조된 DNA 구조물의 염기서열 분석은 코스모진텍 사(Cosmogenetech, South Korea)에 의해 이루어졌다. 프라이머 서열은 하기 표 1에 개시하였다.
Figure pat00001
제조예 2: 세포 배양 및 형질주입
HEK 293 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco, USA)를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco, USA)에 배양하였다. 형질주입 당일에, HEK 293 세포를 0.25% 트립신-EDTA 용액(Gibco, USA)으로 탈착시켜 회수하여, 폴리-L-라이신(Sigma-Aldrich, USA) 코팅된 #0 커버슬립(0.08-0.13 mm 두께 및 10 mm 직경, Ted Pella, USA)에 분주하였다. 이후 리포펙타민 2000(Invitrogen, USA)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 일시적 형질주입(transient transfection)을 수행하였다.
1차 뉴런 배양을 위해 기존 방법(Fath, T. et al., Nature Protocols, 2009, 4: 78-85, doi:10.1038/nprot.2008)을 일부 변형하여 17 배아일(embryonic day)의 C57BL/6 마우스(Koatech)의 해마를 얻었다. 적출한 해마를 0.125% 트립신-EDTA 용액(Gibco, USA)와 37℃ 수조에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 기계적 분쇄(mechanical trituration)에 앞서, 세포의 뭉침(clogging)을 최소화하기 위하여 DNase1(Sigma-Aldrich, USA)를 튜브에 첨가하여 30초 동안 처리한 후, DMEM에 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, USA)를 함유하는 플레이팅 배지(plating medium; PM)로 세척하였다. 분리된 뉴런을 폴리-D-라이신(Sigma-Aldrich, USA) 코팅된 #0 커버슬립에 50,000 세포/mL 농도로 분주하였다. 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에 3시간 동안 인큐베이션한 후, PM을, 신경세포배지(neurobasal medium)에 2% B-27 보충물(supplement)(Gibco, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.25% 글루타멕스(Glutamax, Gibco, USA)를 첨가한, 보존배지(maintenance medium; MM)로 변경하였다. 신선한 MM을 사용하여 배양 기간에 걸쳐 매 3일째에 각 웰의 배지를 절반씩 교환하였다. 리포펙타민 2000을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 배양된 마우스 해마 뉴런에 대한 일시적 형질주입을 시험관 내 배양 5 내지 7일(days in vitro (DIV) 5-7)에 수행하고, DIV 8 내지 12일에 실험하였다.
실험예 1: 전기생리학
일시적으로 형질주입된 세포를 포함한 커버슬립을, 동시 형광 이미지 획득을 위하여 #0 두께 커버 글라스로 덮인 바닥면을 갖는, 패치 챔버(Warner instruments, USA)로 옮겼다. 실험하는 동안 챔버는 33℃로 유지하고, 세포 외 용액(150 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM D-글루코스 및 5 mM HEPES, pH=7.4)으로 관류시켰다. 각 실험에 앞서 마이크로피펫 제작기(micropipette puller, Sutter, USA)로 가는 유리 모세관(filamented glass capillary tubes, 1.5 mm/0.84 mm, World Precision Instruments, USA)을 HEK 293 세포용으로는 3 내지 5 MΩ, 배양된 일차 뉴런용으로 3 내지 6 MΩ의 저항성을 갖도록 뽑았다. 피펫을 세포 내 용액(intracellular solution, 120 mM K-aspartate, 4 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM EGTA, 3 mM Na2ATP 및 5 mM HEPES, pH=7.2)으로 채우고, 미세조작기(micromanipulator, Scientifica, UK)에 탑재된 피펫 홀더(HEKA, Germamy)에 끼웠다. 패치 클램프용 앰플리파이어(patch clamp amplifier, HEKA, Germany)를 이용하여 형질주입된 세포의 전세포 전압 클램프 및 전류 클램프 측정(whole cell voltage clamp and current clamp recording)을 수행하였다. 배양된 뉴런의 신경활성측정(neuronal recording)에서 전류 클램프 모드로 전환할 때까지를 포함한 모든 패치 클램프 측정을 위해 -70 mV의 휴지기전위(holding potential)를 사용하였다. 높은 완충능을 갖는 내부 용액(internal solution)(100 mM HEPES, pH=7.2)은 기존에 보고된 방법에 따라 준비하였다(Kang, B. E. et al., Sci. Rep., 2016, 6: 23865, doi:10.1038/srep23865).
실험예 2: 형광 분광학
1.35-개구수(numerical aperture)의 60× 유침용(oil-immersion) 대물렌즈를 구비한 도립현미경(inverted microscope, IX71, Olympus, Japan)을 사용하여 형광 이미지(epifluorescence imaging)를 측정하였다. 광원으로는 램프 하우징(lamp housing, Cairn, UK) 내에 위치한 75W 제논 아크 램프(Osram, Germany)을 사용하였다. 여기 필터(FF02-472/30), 색선별 거울(dichroic mirror, FF495-Di03), 및 방출 필터(FF01-497/LP)(모두 Semrock, USA)로 구성된 필터 큐브를 여기 및 방출되는 녹색 형광 수집에 사용하였다. 듀얼 포트 카메라 어댑터(Olympus, Japan)를 통해 두 대의 카메라를 현미경 상에 장착하였다. 패치 클램프 실험을 진행하는 동안 세포 및 피펫의 위치를 찾는 것을 돕기 위해 저속 컬러 전하결합소자(slow speed color charge-coupled-device) 카메라(Hitachi, Japan)를 사용하였다. 전압 표시자(voltage indicator)의 형광 변화를 1 kHz 프레임 속도로 고속 CCD 카메라(RedShirtImaging, USA)를 이용하여 기록하였다. 패치 클램프 형광 분석 실험 동안 진동 소음도 차단하기 위하여 모든 관련된 광학 장치를 광학용 방진테이블 상에 위치시켰다.
FV1000 MPE 다중광자 레이저 주사 현미경 시스템(multiphoton laser scanning microscope system, Olympus, Japan)을 이용하여 HEK 293 세포의 2-광자 이미징을 수행하였다. 25× 1.05 NA 침수 대물렌즈(water immersion objective lens)(Olympus, Japan)를 통해 940 nm 파장에서 펨토초-펄스 레이저 조사(Mai Tai DeepSee, Spectra-Physics, USA)를 제공하였다. 대물렌즈의 말단에서 측정된 레이저 출력은 5.2 mW였다. 기록의 수집 속도는 128×128 픽셀에 대해 5.3 Hz였다. 형광 단백질로부터 방출된 빛은 먼저 색선별 거울(dichroic mirror, RDM690)을 통과한 후, 빔 스플리터(DM 570)와 495 내지 540 nm 대역폭을 갖는 대역필터(band pass filter)를 구비한 필터 큐브를 통과하였다(모두 Olympus, Japan). 광학 신호는 다중 알칼리 광전증배관(multi alkali photomultiplier tube, Olympus, Japan)으로 수집하였다. Fluoview FV1000 소프트웨어(Olympus, Japan)를 사용하여 현미경 시스템 및 결과 이미지의 수집을 조절하였다. 온도, 내부 용액 및 수조 용액과 같은 패치 클램프 기록 조건은 단일-광자 형광 현미경 이미지에 대한 것과 동일하게 하였다. 멀티클램프 700B 증폭기 및 Digidata 1440A 디지타이저(both by Molecular devices, USA)로 전세포 전압 클램프 기록으로부터의 전기적 신호를 증폭시키고 수치화하였다.
실험예 3: 데이터 수집 및 분석
패치 클램프 형광 분석으로부터 이미지를 획득하고, 형광 변화[ΔF=Fx-F0] 또는 형광 변환 분율값(fractional fluorescence change values)[ΔF/F=(Fx-F0)/F0×100]을 뉴로플렉스(RedShirtImaging, USA)와 마이크로소프트 엑셀(Microsoft, USA)로 계산하였다.
HEK 293 세포의 전세포 전압 클램프 실험으로부터 획득한 형광신호 데이터는, 별도의 표시가 없는 한, 16회 측정하여 평균하였다. 테스트한 전압 펄스에 대한 ΔF/F 값을 오리진 프로 2016(OriginPro 2016, OriginLab, USA)으로 플롯하고, 이전에 공지된 방법으로 볼츠만 함수(Boltzmann function)에 맞춘 뒤 정상화된 전압 민감도를 획득하였다(Piao, H. H. et al., The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 2015, 35: 372-385, 608 doi:10.1523/JNEUROSCI.3008-14.2015). 각 세포에 대한 ΔF/F 궤적 대 시간 그래프 또한 오리진 프로 2016에서 단일 또는 이중 지수 감쇠(exponential decay) 함수에 맞추어 분석하였다. 뉴런에서의 측정은 전세포 전류 클램프 모드 조건에서 단일 시도로 이미징하였다. 각각의 프로브에 대해 우수한 막 발현, 신호 크기 및 200 msec 전류 펄스 동안 15 내지 25 Hz의 속도로 발화하는 3개의 대표적인 세포를 분석하여 총 5개 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicators; GEVIs)를 비교하였다. 휴지 상태(resting state)에서의 밝기(brightness), ΔF, ΔF/F 및 총합(휴지 상태로부터 피크까지)에 대한 활동 전위 스파이크(action potential spike)(역치(threshold)로부터 피크까지)의 광학 신호 크기비를 뉴로플렉스와 엑셀을 사용하여 분석하였다. 15회 기록에 대해 모든 픽셀의 ΔF/F 값과 전기적으로 측정된 전압 신호 사이의 상관계수(correlation coefficient)를 MATLAB(mathworks, USA)에서 직접 작성한 코드(custom codes)를 사용하여 계산하였다. 모든 기록에 대한 상관계수값(R값)의 행렬을 정렬하여 연속적인 단일 픽셀 이미지 분석(subsequent single pixel imaging analysis)에 대해 최대 계수를 갖는 픽셀을 찾아내었다. AP 피크 시점에서의 ΔF/F 값을 전기적 자극이 가해지기 전 최초 100 프레임의 표준 편차에 의해 결정되는 노이즈 값으로 나누어 신호 대 잡음 비(signal-to-noise ratios; SNRs)를 계산하였다. 단일 픽셀 이미지 결과의 SNR은 100의 컷-오프 빈도(frequency)를 갖는 가우시안 필터로 저주파 여과된 자취(trace)로부터 계산하였다.
또한, 몇가지 서로 다른 관심 시점 영역에서 각 픽셀의 ΔF/F 값들과 모든 다른 픽셀의 ΔF/F 값들 간의 상관관계를 계산하여 상관행렬을 얻었다. 행렬을 분류하여, 가장 상관성 있는 픽셀 쌍을 추출하여 이미지 마스크 상에 재구현하였다(n번째 가장-상관있는 픽셀 쌍의 하나에 속하는 것으로 동정된 경우 1, 이외의 경우 0). 관심있는 3개 다른 시간 동안, 각각 100 프레임(도 8C) 또는 150 프레임(도 8A)으로 구성된, 역치 미만, 휴지 상태 및 활동 전위에 대해, 이러한 과정을 사용하였다. Kralj에 의해 보고된 픽셀 가중치 알고리즘(pixel weighting algorithm)의 경우 알고리즘을 다운로드하여 해당 논문에서 제시한 세부 지침에 따라 분석을 수행하였다(Kralj, J. M. et al., Nature methods, 2012, 9: 657 90-95, doi:10.1038/nmeth.1782). 본 발명에서 시도한 분석방법과의 비교를 위하여 ΔF/F를 계산하였다.
실험예 4: 통계
컬럼 그래프에서 에러바 및 평균 광학 자취(averaged optical traces)에서 그늘진 영역은 평균의 표준 오차(standard error of the mean; SEM)를 나타내며, 평균 값은 평균(mean)±SEM으로 나타내었다. 시료 크기는 통계적 방법에 의해 결정되지 않았으나, 당업자에 의해 사용되는 것과 유사한 방식으로 결정하였다. 상이한 군들로부터의 평균을 비교하기 위한 통계적 분석에 앞서, Shapiro-Wilk 테스트로 데이터의 정상성을 결정하였다. 정상 분포를 따르는 2개 상이한 군으로부터의 평균은 두 표본 t-검정법(two tailed Student's t-test)로 비교하였다. 3개 이상의 군으로부터의 평균을 비교하기 위하여, 사후 Tukey 테스트(post-hoc Tukey test)로 이어지는 일원 변량 분석(one way analysis of variance; ANOVA)을 수행하여 평균 간의 통계적 차이를 먼저 확인하고, 서로의 평균을 비교하였다. 정상 분포를 따르지 않는 군들에 대해서는 Dunn의 다중 비교 테스트(Dunn's multiple comparisons test)로 이어지는 ANOVA를 사용하였다. 모든 비교에서 0.05의 유의 수준을 사용하였다. 모든 통계적 분석은 오리진프로 2016 및 프리즘 7(GraphPad, USA)을 사용하여 수행하였다.
실험예 5: 뉴런의 바탕선 변화 분석
유발된 활동 전위(evoked action potentials)와 바탕선 변화(baseline change)의 폭(amplitude) 간의 관계에 대한 분석은 프로브 간의 차이(probe-to-probe variation)를 배제하기 위해 Bongwoori-R3을 발현하는 뉴런만으로 분석하였다. 14개의 세포에서 200 msec와 800 msec의 전류 펄스 동안 정상 및 고완충능의 피펫 용액을 사용하여 수행된 실험값을 모두 사용하였다. 전류 펄스 주입 전과 후의 바탕선 ΔF/F 차이를 계산하였으나, 전기적으로 측정된 전압 값에 3 mV 이상의 차이가 있는 경우는 분석으로부터 배제하여 실제 막전위 변화에 반응하는 광학 신호 변화가 포함되지 않도록 하였다.
실시예 1: 양으로 하전된 링커 영역에서 전압 변화에 반응하는 광학 신호 크기의 향상 및 음으로 하전된 링커 영역에서의 신호 크기 감소
전압-감지 도메인의 S4와 FP 사이의 링커의 길이 및 아미노산 조성은 GEVIs의 광학적 특성에 영향을 준다. 이를 설명하기 위한 하나의 가능한 기전은 FP와 VSD를 연결하는 아미노산들인 링커 부분이 원형질막에 가까이 위치하므로 전압장에서의 변화를 감지할 수 있다는 것이다. 이를 확인하기 위하여, CC1-M240으로부터 양으로 및 음으로 하전된 다양한 링커 조성을 갖는 VSD로 구성된 GEVIs 패널을 HEK 293 세포에서 테스트하였다(도 1). GEVI, CC1-M240은 약 +80 mV의 V1/ 2을 갖는다(표 2). S4 막관통 부분의 움직임이 광학적 신호를 유도하므로, 원형질막의 약 100 mV의 강한 탈분극을 요구하는 VSD를 사용하여 광학적 신호를 이끌어냈다. CC1-M240 VSD의 사용은 비교적 약한 탈분극 동안에는 S4의 움직임을 제한하므로 전압에 반응하여 링커 부분에 의해 유도되는 형광 변화를 찾아내는 데 용이하다.
Constructs V1/2(mV)
CC1-M240 81±4
CC1-Neg1 98±13
CC1-Neg2 100±7
CC1-Neg3 92±16
CC1-Neg4 116±30
CC1-Pos5 84±1
CC1-Pos6 78±7
CC1-Pos7 85±1
CC1-Pos8 88±1
D164N-Pos6 37±6
Bongwoori-Pos6 -28±3
Bongwoori-R3 -3±1
Bongwoori 6±1
서로 다른 수와 위치의 하전된 아미노산을 갖는, 음으로 하전된 링커를 갖는 4개 GEVIs(CC1-Neg 1-4) 및 양으로 하전된 링커 부분을 갖는 4개 GEVIs(CC1-Pos 5-8)를 HEK 세포에서 발현시키고, 전세포 전압 클램프를 사용하여 실험하였다. 도 1C에 나타난 바와 같이, 이들 GEVIs 중 어떤 것도 +30 mV 미만의 막전위에서 광학 신호를 나타내지 않았다. 음으로 하전된 링커는 광학적 신호의 크기를 감소시켰다. 양으로 하전된 링커 부분을 갖는 GEVIs는 프로브의 전압 민감성에 눈에 띄는 영향을 미치지 않는 반면 광학 신호의 크기면에서 그 중 하나인 CC1-Pos6의 1개 세포에서의 실험결과는 200 mV 탈분극 시 55% ΔF/F를 나타내는 등 대체로 향상되었다(도 1D).
실시예 2: 링커 조성에 따른 FP의 배향에 의한 광학 신호의 향상
링커 부분에서 양의 전하의 역할을 추가로 확인하기 위하여, CC1-Pos6의 아리기닌을 라이신으로 변경하였다(CC1-Pos6-K). 도 2A에 나타난 바와 같이, CC1-Pos6-K의 광학 신호 크기는 거의 절반으로 감소되었다. 반응 시간 역시 CC1-Pos6-K에서 훨씬 더 느려졌다. 이런 결과는 전하만으로는 CC1-Pos6의 광학 신호를 향상시킨 것을 설명하기에 충분하지 않음을 나타낸다. 링커 도메인의 전체 구조가 중요한 것으로 확인되었으며, 아르기닌 또는 라이신으로만 링커 부분이 구성된 GEVIs들의 실험 결과가 이를 뒷받침하였다. 링커가 9개 아르기닌 또는 9개 라이신으로 구성되었을 때, 본래 CC1-M240 프로브에 비해 전압-의존적 광학 신호의 반응 속도나 크기에서 통계적인 차이를 나타내지 않았다(도 2B). 즉, 양 전하의 수의 증가는 신호를 향상시키지 않았다.
링커에 있어서 전체가 음으로 하전된 아미노산 잔기(D 또는 E)로 구성된 2개의 프로브 또한 테스트하였다(도 2B). 놀랍게도 우수한 막 발현을 가짐에도 이들 프로브에 대한 전압-의존적 광학 신호는 거의 사라졌다(도 2B 삽입도). CC1-9Ds 및 CC1-9Es에 더하여, 다른 형태의 아미노산 잔기를 갖는 서너개 프로브를 테스트하였다. 링커의 아르기닌 또는 극성 잔기(9개 세린 또는 9개 글루타민) 함유 여부와 무관하게, 신호 크기는 CC1-Pos6만큼 크지 않았다. 따라서, CC1-Pos6을 이후 실험에 사용하였다.
실시예 3: VSD 종류에 따른, GEVI의 전압 반응 영역의 이동에 대한 Pos6 링커의 영향
Nakajima 등에 의해 언급된 바와 같이(Nakajima, R. et al., Front. Synaptic Neurosci., 2016, 8: 22, doi:10.3389/fnsyn.2016.00022), GEVI의 반응 전압 범위는 광학적인 분석에 있어서 뉴런 활성의 종류를 결정하는데 중요한 요소이다. VSD 부분에 대한 돌연변이의 도입은 광학 신호의 전압 범위 및 속도를 변화시킬 수 있다. 생리학적으로 의미있는 전위에 CC1-Pos6을 "조율"하기 위하여, 2 세트의 돌연변이를 VSD에 도입하였다. 돌연변이의 첫번째 세트는 GEVI, Bongwoori (1)로, S2 막관통 부분에서 하나의 돌연변이(A154D), 및 S4 막관통 부분에서 두개의 돌연변이(R217Q/R229I)의 3가지 변화로 구성되었다. Bongwoori-Pos6으로 지정된, Pos6 링커를 갖는 Bongwoori VSD의 결합으로 6±1 msec의 Tauon 및 8±1 msec의 Tauoff를 갖는 보다 빠른 반응 속도의 GEVI를 얻었다(도 3 및 표 2). 또한 신호 크기는 원형질막의 100 mV 탈분극 당 20% ΔF/F 가까이 향상되었다. 그러나, Bongwoori-Pos6 링커는 GEVI의 전압 의존성을 예상했던 것보다 더 음의 전위로 이동시켰다. 본 발명에서의 실험 결과에 따르면, Bongwoori는 이전에 보고된 -3 mV의 V1/2와 일관되는 6 mV의 V1/ 2을 가졌다. 반면, Bongwoori-Pos6은 -28 mV의 V1/ 2을 가졌다.
CC1-Pos6의 전압 반응을 "조율"하기 위한 두번째 시도는 S2 도메인에 하나의 돌연변이이다(D164N). D164N 돌연변이를 포함하는 Ciona 포스파타아제의 VSD가 6 mV의 V1/ 2을 갖는 것으로 보고되었다(Piao, H.H. et al., J. of Neuroscience, 2015, 35(1): 372-385). D164N VSD에의 Pos6 링커 융합은 전압 반응을 보다 양 전위로 이동시켰다(도 3 및 표 2). D164N-Pos6은 +37 mV의 V1/ 2을 가졌다. Pos6 링커는 Bongwoori의 광학 반응을 보다 음의 전위로 이동시킨 반면, D164N VSD에 융합된 Pos6 링커는 광학 반응을 보다 양 전위로 이동시켰다. D164N-Pos6의 링커 길이는, 프로브의 전압 민감성에 영향을 줄 수 있는, Piao 등에 의해 보고된 구조에 비해 더 짧았다. D164N-Pos6은 또한 48±3 msec의 가중된 Tauon 및 단일 지수에 의해 최적화된 21±2 msec의 Tauoff를 갖는 훨씬 더 느린 반응속도를 나타내었다.
CC1-Pos6을 생리학적으로 관련된 전위로 조율하기 위한 2가지 시도 모두 성공적으로 전압-의존적 광학 반응의 반응 영역을 음 전위 쪽으로 이동시켰다. 그러나, Bongwoori-Pos6는 V1/ 2을 훨씬 더 음 전위 방향으로 이동시키는 반면, D164N-Pos6은 전압 반응을 충분히 이동시키지 않았다. 이러한 결과는 링커 영역의 최적의 아미노산 구성을 실험적으로 결정할 필요가 있음을 나타내는 것이다.
실시예 4: 링커 도메인의 아르기닌 스캐닝에 의한 Bongwoori의 광학 신호 크기 향상 및 전압 민감성 유지
서로 다른 VSDs와 상이한 링커 도메인의 결합에서 나타나는 예측하지 못한 결과는 Bongwoori의 신호 크기를 향상시키기 위한 전략에 변화를 요구하였다. CC1-Pos6 구조는 링커 도메인 내에서 아르기닌의 위치가 광학 신호 향상에 중요함을 제안하였다. 그러나, Bongwoori-Pos6과 D164N-Pos6의 V1/ 2은 Bongwoori에 대한 링커에서 아르기닌의 최적 위치가 CC1-M240에 대한 것과는 상이할 수 있음을 보였다. 이에 Bongwoori에 대한 링커 도메인의 아르기닌 스캐닝을 수행하였다. Bongwoori VSD를 이용하여, 링커 내의 모든 위치에서 아르기닌을 테스트하여 8개의 신규한 프로브를 제작하였고, 이의 신호 크기를 도 4B에 나타내었다. 링커 도메인 내에서 H237R 돌연변이만이 향상된 신호 세기를 갖는 GEVI를 제공하였다. 상기 구조는 링커의 3번째 위치에서 변이되었으므로, 이를 Bongwoori-R3으로 지정하였다.
Bongwoori-R3은 본래의 Bongwoori 구조와 유사한 반응 속도를 나타내었다. 반응 크기의 90%를 구성하는 Tauon의 빠른 성분은 6 내지 8 msec였다(도 4C 및 표 3). 아울러 총 크기의 90%를 차지하는 Tauoff의 빠른 성분은 5 내지 7 msec였다. Bongwoori, Bongwoori-Pos6 및 Bongwoori-R3에 대한 광학 반응을 비교하여 도 4C에 나타내었다. Bongwoori-Pos6 및 Bongwoori-R3은 모두 원형질막의 100 mV 탈분극에 대해 Bongwoori에 비해 향상된 신호 크기를 나타내었다. Bongwoori-R3의 광학 신호는, V1/ 2이 0 mV에 가까워짐으로 인해, 원형질막의 탈분극이 더 강해짐에 따라 계속 증가하였다(도 4D).
또한, Bongwoori-R3은 2-광자 현미경 하에서 1-광자 현미경에서의 실험 결과와 유사한 수준의 전압-유도 광학 신호를 제공한다(도 4E). 2-광자 현미경의 프레임 속도는 전압에 비해 칼슘 이미징에 적합하였다. 그러나, 근래에 2-광자 현미경의 속도가 향상됨에 따라, 1-광자 및 2-광자 이미징 모두가 가능한 GEVIs의 개발이 중요하다. Bongwoori-R3은 원형질막의 100 mV 탈분극 당 21% ΔF/F를 제공하였으며, 이는 Bongwoori-R3이 광-유도 전류를 갖는 로돕신-기반 GEVIs와 달리 2-광자 이미징에 유리함을 나타내는 것이다.
Constructs State Weighted τ(msec) Fast τ(msec) Slow τ(msec) % fast
CC1-M240 On 28±7 15±3 56±16 72±16
Off 10±1 8±1 24±1 83±7
CC1-Pos6 On 25±4 10±1 56±7 70±8
Off 7±1 6±1 - 100
D164N-Pos6 On 48±3 21±10 55±2 41±16
Off 21±2 21±2 - 100
Bongwoori-Pos6 On 6±1 6±1 - 100
Off 10±2 8±1 80* 97±3
Bonwoori-R3 On 11±1 7±1 45±1 90±1
Off 10±2 6±1 46±6 91±1
Bongwoori On 17±1 9±1 40±4 76±2
Off 14±1 8±1 52±9 86±1
* Bongwoori-Pos6의 100 mV에서의 평균값 중 단 하나의 세포만이 Tauoff에 대한 느린 성분을 나타내었다.
실시예 5: 증가된 신호 크기와 0 mV에 가까운 V 1/2 를 가짐으로 인한 활동 전위의 광학적 검출능 향상
Bongwoori-R3이 여전히 유사한 반응 속도를 갖는 Bongwoori에 비해 더 큰 광학 신호를 나타내었기 때문에, 활동 전위의 광학적 검출에 있어서 더 나은 센서가 될 가능성이 있다고 판단하였다. 뉴런 활성을 모니터링 하는데 있어서 Bongwoori-R3의 유용성을 결정하기 위하여, Bongwoori-R3을 발현하는 해마 뉴런에서 유도된 활동 전위로부터 나타나는 광학 신호를, ArcLight, ASAP-1 및 Bongwoori를 포함하는 전압-감지 포스파타아제 단백질로부터 유도된 VSDs를 사용하는, 다른 GEVIs의 것과 비교하였다. 도 5에 세포체(soma, 빨간색 자취) 및 두 개의 분리된 돌기(진한 파란색 및 노란색 자취)인, 세포의 3개 다른 영역으로부터의 활동 전위에 반응하는 이들 GEVIs의 광학 신호를 비교하였다. 모든 프로브들이 조사한 세포의 부위와 무관하게 광학적으로 활동 전위를 분석할 수 있었던 반면, Bongwoori-R3의 경우 활동 전위에 대해 가장 확실한 광학 신호를 지속적으로 보여주었다. Bongwoori-R3은 ArcLight에 필적하며, ASAP-1의 2배에 달하는 SNR을 가지고 있다(표 4). ASAP-2f는 실험하지 않았는데, 이것은 -70mV로부터 -120 mV까지 막전위를 과분극할 때 ASAP-2f가 더 큰 신호를 제공하는 것을 제외하고는 물리적 파라미터들이 사실상 ASAP-1과 동일하기 때문이었다. 로돕신 기반 탐침의 경우 광-유도 전류를 갖기 때문에, 더 나은 VSD 기반의 GEVIs에 좀 더 신중해야 할 것으로 보인다.
Soma
(Spatially averaged)		 ArcLight A242 ASAP-1 Bongwoori Bongwoori-Pos6 Bongwoori-R3
Brightness (a.u.) 1923±350 1162±57 558±41 1034±74 1055±91
ΔF/F- total (%) 15.5±0.5 5.7±0.1 7.7±0.3 7.7±0.4 11.3±0.4
ΔF/F- spike (%) 2.7±0.2 2.8±0.1 3.7±0.2 3.1±0.2 5.9±0.2
Spike to total signal size ratio 0.18±0.02 0.49±0.03 0.48±0.02 0.41±0.03 0.52±0.02
Signal to Noise Ratio 68±7 26±1 19±1 33±2 52±4
Action potential amplitude (mV) 86±1 85±3 96±2 85±4 80±2
광학 신호에 대한 GEVI의 전압-의존성의 효과를 도 5에 또한 나타내었다. 0 mV에 가까운 V1/ 2을 갖는 Bongwoori-R3은 뉴런의 스파이킹 활성을 보다 대조적으로 구별하여 보여준다. Bongwoori-Pos6은 Bongwoori-R3과 유사한 반응속도를 가지는 반면, V1/ 2은 역치 미만(subthreshold)의 전위 쪽으로 이동되어 스파이킹 활성에 대한 대비를 감소시켰다(도 5C). Bongwoori-R3은 ASAP-1(약 2 msec의 Tau)만큼 빠르지 않음에도 불구하고, 이의 더 큰 신호 크기(및 적절한 속도)는 Bongwoori-R3이 65 Hz의 높은 주파수에서 발화하는 활동 전위를 보다 잘 분석할 수 있도록 한다(도 5D).
실시예 6: Bongwoori가 발현된 뉴런에서 활동 전위 발화시 나타나는 형광 바 탕선의 변화에 대한 세포의 산성화의 효과
Bongwoori에 대한 이전의 연구에서 하나의 문제점은 뉴런 측정 결과에 있어서 형광 바탕선이 이동하는 경향을 갖는 것이었다. 바탕선 변화가 60 Hz에서 발화하는 활동 전위의 분석을 방해하지 않음에도 불구하고, 이러한 변화가 뉴런 측정에서만 나타나며 HEK 세포에서 Bongwoori를 발현하여 실험했을 때는 나타나지 않는 점에 주목하였다.
Bongwoori, Bongwoori-Pos6 및 Bongwoori-R3 모두는, β-can 구조의 외부에 음의 전하를 갖는, 생리활성 pH에 민감한 FP를 포함한다. 본 발명자들은 선행 연구에서 동일한 FP가 전압-개폐 수소 채널로부터 유래한 VSD에 융합된 GEVI인 Pado의 광학 신호에 대한 pH의 효과를 보고하였다(Kang, B.E. and Baker, B.J., Sci. Rep., 2016, 6: 23865). Pado에 의한 형광 바탕선의 변화가 세포 내 pH 변화에 대한 반응이었으므로, Bongwoori-R3 또한 활동 전위의 발화 과정 동안 뉴런의 산성화에 반응하는 것인지를 확인하고자 하였다. pH의 효과를 가시화하기 위하여, 전압 변화에는 반응하지 않지만 생리활성 pH에는 민감한 파르네실화된 버전의 SE 227D를 뉴런에 형질주입시키고 활동 전위 유도를 위해 전류 클램프를 수행하였다. 도 6은 활동 전위의 발화에 대한 반응으로 형광 바탕선의 명확한 감소를 나타내었다. 전류 주입이 완료된 후에도 바탕선이 안정적으로 유지되는 것을 고려할 때, 이는 광탈색이 아니었다. 형광 바탕선 변화는, 도 6B에 나타난 바와 같이, Bongwoori-R3에 의한 활동 전위의 분석을 저해하지 않았다. 바탕선 변화의 정도는 돌기 부분보다 체세포 부분에서 더 크게 나타났는데 이것은 체세포의 상대적으로 높은 완충능으로 인한 것일 수 있다(도 6C). 바탕선 형광 변화는 발화된 활동 전위의 수와 상관 관계를 나타내었다(도 10).
실시예 7: 형광 변화에 대한 픽셀들 간의 상관 관계 분석에 의한 뉴런 활성 기반 세포 이미지의 광학적 재구성
뇌 절편 또는 생체 내 전압 이미징을 위한 새로운 도전은 수집된 데이터를 처리하는 방법에 관한 것이다. 궁극적인 목표는 뉴런 기록을 위해 더이상 전극을 사용하지 않고 빛 만을 사용하는 것이다. 연구하고자 하는 관심 영역에서 어떠한 픽셀들을 골라 분석할 것인지와 관련하여, ArcLight, ASAP-1, Bongwoori-Pos6 또는 Bongwoori-R3을 발현하는 최상의 뉴런으로부터 각 픽셀에 대하여 전압 변화에 대한 형광 변화의 피어슨 상관 계수를 계산하고(도 7A), 각 프로브에 대해 가장 높은 계수를 나타내는 픽셀을 결정하여 나타내었다(도 7B). Bongwoori-R3을 발현하는 신경세포 이미징 결과의 단일 픽셀로부터 여과되지 않은 자취는 활동 전위를 광학적으로 분석할 수 있었다. Bongwoori-R3을 발현하는 뉴런으로부터는 보다 낮은 밝기 및 이에 따라 더 낮은 SNR 값을 갖는 단일 픽셀로도 활동 전위를 분석할 수 있었다(도 7A, 파란색 자취).
전기적으로 측정된 전압 신호와의 상관관계 분석에서 상위 5% 픽셀을 차지하는 픽셀들을 포함하여 관심 영역을 넓혀(상위 5%에 해당하는 픽셀의 수만큼) 분석했을 때 SNR이 향상되는 것으로 나타났다(도 7C). 이들 광학적 반응이 전기적 신호와 얼마나 잘 맞는지 정량하기 위하여, 신호 크기를 정상화한 뒤 평균 제곱근 편차를 계산하였다(도 7D). ArcLight가 발생된 활동 전위에 대해 가장 큰 신호 크기 및 SNR을 나타내는 반면, ArcLight는 전압 신호에 대한 광학적 반응의 비교에서 가장 큰 편차를 나타내었다. Bongwoori-Pos6는 이의 좌측으로 이동된 전압 감도(left-shifted voltage sensitivity)로 인해 전압 신호에 대한 광학적 신호의 편차가 비교적 더 컸다. 분석 결과 Bongwoori-R3 및 ASAP-1의 상관 관계 계수 상위 5% 픽셀들로부터의 평균치가 가장 우수하게 전압 신호와 일치하였다.
다음으로 단일 픽셀(뉴런 원형질막의 약 1 μm2)만으로도 신경 활성을 이미징할 수 있다는 장점을 이용하여 전기적 기록에 독립적인 관심 영역을 규정하기 위한 방법을 개발하고, 활동 전위를 분석하기 위하여 취하였다. Kralj 등은 세포의 막전위를 예측하기 위하여, 실제 전기적 기록 데이터를 요구하지 않는 방법으로 전압-반응성 픽셀을 찾아 확인하고 가중화하기 위한 방법을 개발하였다. 이러한 접근법은 상대적으로 희미한 광학적 이미징 또는 작은 크기를 갖는 세포로부터의 형광 자취의 질을 향상시키는데 특히 유용하다. 그러나, 이는 막전위의 즉각적인 변화를 추정할 수 있는 충분히 빠른 전압 표지자를 필요로 하며, 여러 개의 세포 활성을 동시에 처리하지 않으므로 막전위에 대한 고유한 값을 요구한다. 본 발명에서는 형광 자취의 pixel-to-pixel의 상관성 분석을 통해 선택된 픽셀 수(n)의 마스크를 구축하고 객관적으로 관심 영역을 규정하는 더 간단한 방법을 제안하였다. 먼저 상기 분석을 관찰한 광학 이미징 기록 상에 서로 다른 시간 영역을 사용하도록 제한하였다. 노이즈 부분의 상관성 분석에서 예상되었던 바와 같이, 역치 미만과 휴지 상태의 시간 영역을 선택하여 상기 분석을 시행했을 경우에는 임의의 ROIs를 나타낸 반면, 활동 전위의 발화 영역대에서 시행한 분석은 세포의 모양을 정확히 재건축하였다(도 8A). 이 방법은 여러 개의 세포가 산재하여 서로 다른 시간대에 활동 전위를 발화할 때 서로 다른 영역에 있는 신경세포들 간에 발생할 수 있는 잠재적인 동기화 활성을 확인할 수 있다.
마지막으로, 2가지 다른 방법으로 획득한 광학적 신호를 비교하였다. 비록 Kralj 등에 의한 알고리즘이 막전위의 추정치를 계산하도록 만들어진 것이긴 하지만, 가중된 ΔF/F를 계산하기 위하여 원본 형광 신호에 픽셀 가중 행렬(pixel weight matrix)을 사용하였다. 매우 낮은 계수로 가중되기는 했지만, 바탕에 속하는 픽셀을 포함하므로, 신호의 크기는 pixel-to-pixel 상관법으로 검출된 1000 픽셀로부터 계산된 평균 신호 크기에 비해 더 작았다(도 8B). 상이한 시간 창에서, 그리고 전기적 기록에 무관한 객관적인 관심 영역을 규정하기 위한 pixel-to-pixel 상관법은 전압 표지자의 종류와 단일 픽셀로부터 나오는 신호의 질에 의존적이다.
도 8C에는 ArcLight, ASAP-1, 및 Bongwoori-R3에 대한 본 발명의 형광 상관 분석 결과를 비교하였다. ArcLight는 세포 영역을 확인할 수 있었으나, ASAP-1는 불가하였다. 이것은 ArcLight와 ASAP-1의 분석을 위해 사용된 측정의 질이 떨어지기 때문은 아닌 것으로 사료되는데, 그 이유는 도 7C에서 확인한 바와 같이 복수의 픽셀을 포함하는 관심 영역으로부터 계산된 신호가 ArcLight(Jin, L. et al., Neuron, 2012, 75: 779-785, doi:10.1016/j.neuron.2012.06.040) 및 ASAP-1(St-Pierre, F. et al., Nature neuroscience, 2014, 17: 884-889, doi:10.1038/nn.3709) 모두의 경우에서 각각의 원본 문헌에서 보고한 것보다 질적으로 나았기 때문이다.
<결론>
GEVI, Bongwoori-R3은, 막전위 변화를 광학 신호로 변환하는데 참여하는, 3개의 기능적으로 구별된 도메인으로 구성된다. VSD는 원형질막 내에 위치하며 이의 형태 변화에 따른 전압 변화에 반응한다. 링커 도메인은 VSD의 형태 변화에 따른 FP의 움직임을 매개한다. FP 도메인은 광학적 출력을 제공한다. FP 도메인은 이량화하여 VSD에서의 형태 변화에 따라 발색단의 환경을 변화시킬 수 있으므로 형광 신호를 유발할 수 있다. 이량화하는 FP의 결합력을 감소시키는 돌연변이의 도입은 70% 이상까지 광학 신호를 감소시킨다. VSD의 돌연변이는 광학 신호의 속도 및 전압 범위를 향상시켰다. 본 발명에서는 링커의 전하 구성 역시 전압-의존적 광학 신호의 특성에 영향을 줄 수 있음을 보임으로써 신경 활성의 이미징을 향상시키기 위한 GEVI 개발자들의 노력에 다양한 옵션을 제공하였다.
본 발명에서 사용한 GEVIs의 링커 도메인과 관련하여 이것이 어떤 방식으로 광학 활성에 영향을 주는지에 대한 다양한 견해가 있다. 그 중 하나는 링커가 전압에 반응할 수 있다는 것으로, 이를 입증하기 위하여, VSD의 움직임을 제한하여, 링커가 보다 음으로 하전되었을 때, 감소된 광학 신호를 갖는 프로브를 유도하였다. 링커가 보다 양으로 하전되었을 때, 프로브의 전압 범위는 영향을 받지 않았으나, 신호 크기는 증가하였다(도 1). 이러한 결과는 링커가 FP의 배향에 중요한 역할을 하며, 막 전위의 변화에는 직접 반응하지 않음을 나타내는 것이다. 이전의 결과는 링커의 길이 뿐만 아니라 FP 융합 자리에서 아미노산 조성의 변화 역시 FP의 배향에 중요함을 제안하였다. 또한, 전압-감지 포스파타아제의 링커는 포스파타아제의 효소 활성과 전압의 결합에 중요한 아르기닌으로 구성된 막 결합 자리를 갖는 것으로 나타났다. Bongwoori-R3 링커에서 양의 잔기는 지질 이중층의 인지질 헤드 그룹과 결합함으로써 유사한 역할을 하는 것으로 사료된다. 링커의 구조 역시 FP의 움직임에 영향을 줄 수 있었다. FP의 β-배럴의 외부에 위치한 음 전하가 ArcLight 및 Pado의 큰 광학 신호를 유발하는 것을 고려할 때, 링커 또한 GEVI의 형광 신호를 변화시키는 S4의 움직임 동안 음 전하의 이동 경로에 영향을 줄 수 있었다.
Bongwoori-R3은 단일 픽셀에서 활동 전위 당 20% ΔF/F 만큼 큰 신호를 제공하여 본래 Bongwoori에 비해 2배 이상의 광학 신호 크기를 갖는다. 이와 같이 향상된 신호는 프로브의 광학 반응 속도와 전압 범위의 조합에 기인한다. 프로브의 전압 범위는 GEVI가 나타낼 수 있는 최대 형광 변화를 결정한다. GEVI의 Tauon의 속도는 프로브가 유도할 수 있는 최대 형광 변화의 백분율을 예측한다. Tauoff의 속도는 GEVI가 분석할 수 있는 전압 변화의 빈도에 대한 좋은 추정값을 제공할 수 있을 것이다. 따라서, 더 느린 탐침은, HEK 세포에서 관찰된 전위 최대값으로부터 감소된 신호 세기를 갖더라도, 여전히 활동 전위를 관찰할 수 있다. ASAP-1는 Bongwoori-R3보다 빠르나, Bongwoori-R3은 더 큰 광학적 신호를 제공한다. 또한 프로브의 전압 민감도는 역치 미만 탈분극에 대해 관찰되는 것에 대한 활동 전위 스파이크의 광학적 반응의 비율을 좌우하는 역할을 한다(도 5 및 7). 이러한 물리적 특성의 조합이 활동 전위를 광학적으로 분석하는 GEVI의 능력을 결정한다.
또한, Bongwoori-R3은 뉴런 활성화에 대해 약간의 바탕선 형광 변화를 나타내었다. 이는 도 6에 나타난 파르네실화된 FP(SE227D)의 광학적 반응에 의해 나타난 바와 같이 세포 내 pH의 변화에 주로 기인하였다. 바탕선 변화는 세포체의 큰 부피 및 이에 따른 더 높은 완충능으로 인해 세포체에서보다 돌기에서 보다 확연하였다. 세포 내 pH 변화는 광학적으로 활동 전위를 분석하는 Bongwoori-R3의 능력에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 사실 이는 단일 세포 이미징 동안 산성화의 검출 또한 가능하게 한다.
당업계에 알려진 많은 사용 가능한 GEVIs가 있으며, 모두 상이한 장단점을 갖는다. 본 발명자들은, 65 Hz에서 활동 전위를 분석할 수 있는 속도에서의 형광에 큰 변화를 제공하는, 새로운 버전의 Bongwoori인 Bongwoori-R3을 개발하였다(도 5D). 또한 Bongwoori-R3은, 광-유도 전류를 나타내는 로돕신-기반 탐침의 약점인, 2-광자 이미징 동안에도 우수한 광학적 신호 크기를 제공한다(도 4E).
Bongwoori-R3의 향상된 광학적 신호는 형광 변화만을 사용하여 뉴런 이미지의 형태적 재구성을 가능하게 한다. 상관 관계가 있는 형광 변화를 갖는 픽셀들을 골라 분석함으로써 신경 활성에 기초하여 뉴런을 재구성하였다. 상관관계를 위한 적절한 프레임을 선택함으로써, 뉴런 활성을 나타내는 픽셀을 확인할 수 있었다. 단일 세포의 이미징시에는 휴지기에서의 형광을 확인하는 것만으로도 세포의 어느 부위에 신경 활성이 위치하는지를 쉽게 알 수 있기 때문에 전술한 방법이 유용하지는 않다. 그러나, 세포의 집단을 연구하기 위하여, 형광 변화에만 기초하여 상관관계를 결정하는 능력은 뉴런 회로의 활성 분석에 도움이 될 수 있다. 현재까지, 광학 신호 분석을 위한 관심 영역의 대부분은 임의로 결정되었다. 뉴런 활성에 해당하는 더 큰 형광 변화를 제공할 수 있는 프로브를 갖게 되면 뉴런 활성 위치를 결정함에 있어 실험자의 편향을 제거한 픽셀 상관관계 분석이 가능해진다. 이러한 특성은 뇌절편 및 생체 내 세포의 집단 영상화에 유용할 것이며 신경회로가 어떻게 작동하는지에 대한 이해를 향상시킬 수 있을 것이다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Seoul National University R&DB Foundation <120> Linker peptide comprised in genetically encoded voltage indicator providing improved fluorescent signal <130> KPA161643-KR <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R3 Linker <400> 1 Tyr Ser Arg His Gln Gly Asp Pro 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pos6 Linker <400> 2 Arg Ser His Arg Arg Met Gly Arg Pro 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pos7 Linker <400> 3 Tyr Arg His Gln Arg Met Gly Arg Pro 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pos8 Linker <400> 4 Tyr Ser Arg Gln Gln Arg Gly Arg Pro 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pos6-A Linker <400> 5 Tyr Ser His Arg Arg Met Gly Arg Pro 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pos6-C Linker <400> 6 Arg Ser His Arg Gln Met Gly Arg Pro 1 5 <210> 7 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ttcttgttat 480 ttcatgctgg atttaggatt aaggatattt gcctacgggc ccaagctttt cttcaccaac 540 ccttgggagg tggctgatgg tttgattatc gttgtcacat tcgtcgtcac gatattttac 600 actgtgttag atgaatacgg taccgaaaca ggagccgatg gtttggggcg gttggttgtg 660 ttggcccgtt tgctgcgtgt ggttcggtta gcaagaatat ttagatccca cagaaggatg 720 gggaggccta tgagtaaagg agaagaactt ttcactggag ttgtcccaat tcttgttgaa 780 ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg gagagggtga aggtgatgca 840 acatacggaa aacttaccct taaatttatt tgcactactg gaaaactacc tgttccatgg 900 ccaacacttg tcactacttt aacttatggt gttcaatgct tttcaagata cccagatcat 960 atgaaacggc atgacttttt caagagtgcc atgcccgaag gttatgtaca ggaaagaact 1020 atatttttca aagatgacgg gaactacaag acacgtgctg aagtcaagtt tgaaggtgat 1080 acccttgtta atagaatcga gttaaaaggt attgatttta aagaagatgg aaacattctt 1140 ggacacaaat tggaatacaa ctataacgat caccaggtgt acatcatggc agacaaacaa 1200 aagaatggaa tcaaagctaa cttcaaaatt agacacaaca ttgaagatgg aggcgttcaa 1260 ctagcagacc attatcaaca aaatactcca attggcgatg ggcccgtcct tttaccagac 1320 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ttatggtgtt caatgctttt caagataccc agatcatatg 960 aaacggcatg actttttcaa gagtgccatg cccgaaggtt atgtacagga aagaactata 1020 tttttcaaag atgacgggaa ctacaagaca cgtgctgaag tcaagtttga aggtgatacc 1080 cttgttaata gaatcgagtt aaaaggtatt gattttaaag aagatggaaa cattcttgga 1140 cacaaattgg aatacaacta taacgatcac caggtgtaca tcatggcaga caaacaaaag 1200 aatggaatca aagctaactt caaaattaga cacaacattg aagatggagg cgttcaacta 1260 gcagaccatt atcaacaaaa tactccaatt ggcgatgggc ccgtcctttt accagacaac 1320 cattacctgt ttacaacttc tactctttcg aaagatccca acgaaaagag agaccacatg 1380 gtccttcttg agtttgtaac agctgatggg attacacatg gcatggatga actatacaaa 1440 tga 1443 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer RK024 <400> 39 aagctggcta gcaccatgga gggattcgac ggttcag 37 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer neg1-B <400> 40 gggatccccc atctcttggt gggagtcaaa tattcttgc 39 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer neg1-A <400> 41 gaatatttga ctcccaccaa gagatggggg atcccatgag 40 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer RK-27 <400> 42 ttttctcgag ttctagatca tttgtatagt tcatcc 36

Claims (12)

  1. 유전적으로 암호화된 전압 표시자(genetically encoded voltage indicator; GEVI)에 포함되는, 전압-감지 도메인과 형광 단백질 사이에 위치하여 이들을 연결하는 링커 펩타이드로서, 아르기닌 잔기를 하나 이상 포함하여 이를 불포함하는 링커 펩타이드에 비해 증가된 형광신호를 나타내는 것인 링커 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인 링커 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전압-감지 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 S1 막관통 분절, 서열번호 9, 12 또는 14의 아미노산 서열로 이루어지는 S2 막관통 분절, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 S3 막관통 분절, 및 서열번호 11 또는 13의 아미노산 서열로 이루어지는 S4 막관통 분절을 포함하는 것인 링커 펩타이드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 전압-감지 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 S1 막관통 분절, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 S2 막관통 분절, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 S3 막관통 분절, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 S4 막관통 분절; 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 S1 막관통 분절, 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 S2 막관통 분절, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 S3 막관통 분절, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 S4 막관통 분절; 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 S1 막관통 분절, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 S2 막관통 분절, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 S3 막관통 분절, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 S4 막관통 분절;을 포함하는 것인 링커 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전압-감지 도메인은 서열번호 15의 시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis)의 전압-민감성 인산화효소 유래 전압-감지 도메인(CC1-VSD); 상기 서열번호 15의 전압-감지 도메인의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, S2 분절에 위치한 154번째 잔기인 알라닌(Ala; A)이 아스파르트산(Asp; D)으로, S4 분절에 위치한 217번째 잔기인 아르기닌(Arg; R)이 글루타민(Gln; Q)으로, 229번째 잔기인 아르기닌(Arg; R)이 이소루신(Ile; I)으로 치환된 서열번호 16의 변이체(Bongoori); 및 상기 서열번호 15의 전압-감지 도메인의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, S2 분절에 위치한 164번째 잔기인 아스파르트산(Asp; D)이 아스파라긴(Asn; N)으로 치환된 서열번호 17의 변이체(D164N);로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 링커 펩타이드.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 전압-감지 도메인은 S1 분절의 N-말단, S1-S2 분절 사이, S2-S3 분절 사이 및 S3-S4 분절 사이에 위치하는 루프 서열을 추가로 포함하는 것인 링커 펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 루프 영역에 아미노산 치환, 결실, 또는 추가로 도입된 제한효소 인식부위를 포함하는 것인 링커 펩타이드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제한효소 인식부위는 NheI, ClaI, Hind III, KpnI, 및 Eco RV로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제한효소 인식부위인 것인 링커 펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 링커 펩타이드로 연결된, 전압-감지 도메인 및 형광 단백질을 포함하는, 형광 단백질 전압 센서(fluorescent protein voltage sensor).
  10. 제9항에 있어서,
    상기 전압-감지 도메인은 서열번호 15의 시오나 인테스티날리스의 전압-민감성 인산화효소 유래 전압-감지 도메인(CC1-VSD); 상기 서열번호 15의 전압-감지 도메인의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, S2 분절에 위치한 154번째 잔기인 알라닌(Ala; A)이 아스파르트산(Asp; D)으로, S4 분절에 위치한 217번째 잔기인 아르기닌(Arg; R)이 글루타민으로, 229번째 잔기인 아르기닌(Arg; R)이 이소루신(Ile; I)으로 치환된 서열번호 16의 변이체(Bongoori); 또는 상기 서열번호 15의 전압-감지 도메인의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, S2 분절에 위치한 154번째 잔기인 아스파르트산(Asp; D)이 아스파라긴(Asn; N)으로 치환된 서열번호 17의 변이체(D164N);로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 형광 단백질 전압 센서.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 형광 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 super ecliptic pHluorin 또는 상기 이의 227번째 잔기인 알라닌(Ala; A)이 아스파르트산(Asp; D)으로 치환된, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 변이체(SE A227D)인 것인 형광 단백질 전압 센서.
  12. 제9항의 형광 단백질 전압 센서를 포함하는 신경세포의 막전위 측정용 조성물.
KR1020170061749A 2017-05-18 2017-05-18 유전적으로 암호화된 전압 표시자에 포함되어 증가된 형광신호를 나타내는 링커 펩타이드 KR101951895B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Jung A. et al, Neurophotonics 2(2) 021012 (2015. 4.) *
Lee S. et al, Proceedings of the UK-Korea Neuroscience Forum 2016:41 (2016. 9.1.)* *
Piao H.H. et al, J. Neurosci., 35(1):pp.372-385(2015. 1. 7.) *

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