KR20180121564A - Novel polysaccharide-protein conjugates and methods for their preparation - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 다당류-단백질 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 진단 도구 뿐만 아니라 1가 백신(monovalent vaccine) 또는 다가 조합 백신(multivalent combination vaccine)의 생산에도 사용될 수 있는, 카바메이트 화학을 사용하여 제조된 다당류-단백질 접합체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카바메이트 화학을 이용한 네이세리아 메닌기티디스 혈청군 X, A, C, Y 및 W135 다당류-담체 단백질 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a novel polysaccharide-protein conjugate and a process for its preparation. More specifically, the present invention relates to polysaccharide-protein conjugates prepared using carbamate chemistry, which can be used for the production of diagnostic as well as monovalent or multivalent combination vaccines. More specifically, the present invention relates to the Nacelia meningitidis serogroup X, A, C, Y and W135 polysaccharide-carrier protein conjugates using carbamate chemistry and their preparation.
Description
본 발명은 신규한 다당류-단백질 접합체(polysaccharide-protein conjugates) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 진단 도구 뿐만 아니라 1가 백신(monovalent vaccine) 또는 다가 조합 백신(multivalent combination vaccines)의 제조에도 사용될 수 있는, 카바메이트(carbamate) 화학을 사용하여 제조된 다당류-단백질 접합체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카바메이트 화학을 이용한 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 혈청군(serogroup) X, A, C, Y 및 W135 다당류-담체 단백질(carrier protein) 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to novel polysaccharide-protein conjugates and methods for their preparation. More particularly, the present invention relates to a polysaccharide-protein conjugate prepared using carbamate chemistry, which can be used for the production of monovalent vaccines or multivalent combination vaccines as well as diagnostic tools . More specifically, the present invention relates to neisseria meningitidis serogroup X, A, C, Y and W135 polysaccharide-carrier protein conjugates using carbamate chemistry and methods for their preparation .
엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) (수막구균: meningococcus)는 혈청학적으로 A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y 및 Z의 13 가지 혈청군으로 주로 분류된 호기성 그람 음성(gram-negative) 박테리아이다. 군화 시스템(grouping system)은 유기체(organism)의 캡슐형 다당류(capsular polysaccharide)를 기본으로 한다. WHO 공식 웹 사이트는 엔. 메닌기티디스가 세계적으로 박테리아 수막염(bacterial meningitis)의 가장 흔한 원인 중 하나이고, 수막염의 큰 전염병(epidemics)을 일으킬 수 있는 유일한 박테리아라고 언급한다. 특히, 사하라 사막 이남의 아프리카 지역에서 10 만명 당 1000 건까지의 발생률을 보이는 폭발적인 전염병이 보고되었다. yen. Menin giti disk (N. meningitidis) (meningococcal: meningococcus) is serologically as A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y and mainly classified into 13 kinds of serogroup Z Gt; gram-negative < / RTI > bacteria. The grouping system is based on an organism's capsular polysaccharide. The official website of WHO is the yen. Menin giti a disk is one of the most common causes of bacterial meningitis worldwide (bacterial meningitis), to mention only the bacteria that can cause large epidemics (epidemics) of meningitis. In particular, an epidemic of up to 1,000 cases per 100,000 people has been reported in sub-Saharan Africa.
엔. 메닌기티디스는 에어로졸에 의해 전달되거나 환자 또는 건강한 사람 운반체의 호흡기 분비물과의 직접 접촉에 의해 전달된다. 일반적으로, 풍토병(endemic disease)은 어린이와 청소년에서 주로 발생하며 3 개월에서 12 개월 사이의 유아에서 가장 높은 발병률을 보인 반면, 전염병에서는 나이가 많은 어린이와 젊은 성인이 더 많이 관여될 수 있다. 그러나 수막구균성 질병(meningococcal disease)의 급속한 진행은 종종 발병후 1-2일 이내에 사망을 초래한다. 엔. 메닌기티디스 감염은 백신 접종으로 예방할 수 있다. yen. Meningitis is delivered by an aerosol or by direct contact with the respiratory secretions of a patient or healthy human carrier. In general, endemic diseases occur most frequently in children and adolescents, with the highest incidence in infants between 3 and 12 months, while in infectious diseases older children and young adults may be more involved. However, the rapid progression of meningococcal disease often results in death within 1-2 days of onset. yen. Meningitis Infection can be prevented by vaccination.
헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus infiuenzae) 유형 b는 주로 어린이에게서 수막염 및 급성 호흡기 감염을 일으키는 그람 음성 박테리아이다. WHO 공식 웹 사이트는 선진국 및 개발도상국 모두에서 소아에서 비-전염성(non-epidemic) 수막염의 중요한 원인이며, 항생제가 신속하게 투여되더라도 심각한 신경학적 비명(neurological squeal)과 관련이 있다고 언급한다. Haemophilus influenzae (Haemophilus infiuenzae) Type b is a gram-negative bacterium that causes meningitis and acute respiratory infections, mainly in children. The WHO official website states that in both developed and developing countries, it is an important cause of non-epidemic meningitis in children and is associated with severe neurological squeal even when antibiotics are administered rapidly.
헤모필루스 인플루엔자에 감염은 감염된 (반드시 증상이 있는 것은 아니지만) 사람의 소적(droplet)에 의해 전염된다. 에이치. 인플루엔자에(H. infiuenzae) 유형 b 감염은 백신 접종으로 예방할 수 있다. Infection with Haemophilus influenza is transmitted by a droplet of infected person (although not necessarily symptomatic). H. Infection with H. influenzae type b can be prevented by vaccination.
수막구균성 질병의 대부분은 A, B, C, Y, W135 및 X의 6 가지 혈청군에 의해 유발된다. 역사적으로, 수막염 벨트(meningitis belt)에서 사례의 대부분은 혈청군 A 수막구균(meningococci)에서 기인한다. 혈청군 C 수막구균은 1980년대 수막염 벨트에서 발병(outbreak)에 책임이 있고, 2015 년에는 니제르(Niger)에서도 새로운 발병이 있었던 반면, 2000 년 이후 혈청군 W (이전의 W-135)가 유행성 수막염의 원인으로 등장하였다. 혈청군 Y의 유행(prevalence)은 아프리카에서는 최소이다; 그러나, 상기 혈청군은 남아메리카 수막염 사례에서 더 분명하다. NCBI의 한 간행물에 따르면, 혈청군 X 수막구균은 산발성(sporadic) 수막염의 드문 원인으로 고려되어졌지만, 2006-2010년에는 니제르, 우간다, 케냐, 토고 및 부르키나 파소(Burkina Faso)에서 혈청군 X 수막염의 발병이 발생했으며, 후자는 6732 건의 보고된 사례 중 1300 건 이상의 혈청군 X 수막염의 사례가 발생했다. The majority of meningococcal diseases are caused by six serogroups A, B, C, Y, W135 and X. Historically, most cases in meningitis belts are caused by serogroup A meningococci. The serogroup C meningococcus is responsible for outbreaks in the meningococcal belt of the 1980s and has a new outbreak in Niger in 2015 while the serogroup W (formerly W-135) has been the cause of pandemic meningitis since 2000 Respectively. The prevalence of serogroup Y is minimal in Africa; However, the serogroup is more evident in South American meningitis cases. According to one NCBI publication, serogroup X meningococci have been considered as a rare cause of sporadic meningitis, but in 2006-2010, serogroup X meningitis in Niger, Uganda, Kenya, Togo and Burkina Faso And the latter resulted in more than 1,300 cases of serovar X meningitis among 6732 reported cases.
또 다른 NCBI 간행물에 따르면, 2006-2009 년 동안 토고에서 혈청군 X 수막구균이 702 개의 확인된 박테리아 수막염 사례의 16 %를 차지했다. 코자(Kozah) 지역은 2007 년 3 월에 혈청군 X 수막구균 발병을 경험하였는데, 혈청군 X 수막구균의 계절 누적 발병률은 33/100,000 이었다. 2007-2010 년 동안 부르키나 파소에서, 혈청군 X 수막구균은 778 개의 확인된 박테리아 수막염 사례의 7 %를 차지했으며, 2009 년에서 2010 년까지 증가했다(각각, 확인된 모든 사례의 4 % 내지 35 %). 2010 년에, 혈청군 X 수막구균 전염병은 부르키나 파소의 북부 및 중부 지역에서 발생하였고; 혈청군 X 수막구균의 가장 높은 지역 누적 발생은 3 월 ~ 4 월 동안 130/100,000으로 추정되었다.According to another NCBI publication, serogroup X meningococci accounted for 16% of 702 confirmed bacterial meningitis cases in Togo during 2006-2009. The Kozah region experienced a serogroup X meningococcal infection in March 2007, with a seasonal cumulative incidence of 33 / 100,000 in serogroup X meningococci. In Burkina Faso during 2007-2010, serogroup X meningococci accounted for 7% of 778 confirmed bacterial meningitis cases and increased from 2009 to 2010 (4% to 35% of all confirmed cases, respectively) ). In 2010, serogroup X meningococcal infections occurred in northern and central regions of Burkina Faso; The highest cumulative incidence of serogroup X meningococci was estimated to be 130 / 100,000 during March to April.
위의 사실을 바탕으로, 5가(pentavalent) ACYWX 다당류- 단백질 접합체 백신은 혈청군 B를 제외하고 수막구균성 질병에 대하여 더 광범위한 적용범위(coverage)를 제공할 수 있다. 예방 접종(immunization)은 수막구균성 질병을 조절하는 유일한 합리적인 접근법이다. 현재, 혈청군 A, C, Y 및 W135 다당류 접합체를 포함하는 다양한 1가 또는 다가 백신은 시장에서 판매 허가를 받았으나, 혈청군 X 수막구균에 대해서는 허가된 백신이 이용가능하지 않다. 혈청군 X 다당류 단백질 접합체는 공중 보건 필요성이 있는 경우 다가 수막구균성 접합체 백신 개발에 대한 새로운 추가 품목이 될 것이다.Based on the above facts, the pentavalent ACYWX polysaccharide-protein conjugate vaccine can provide a broader coverage for meningococcal disease except serogroup B. Immunization is the only rational approach to controlling meningococcal disease. Currently, various monovalent or polyvalent vaccines, including serogroup A, C, Y, and W135 polysaccharide conjugates, have been approved for marketing in the market, but no approved vaccine is available for serogroup X meningococci. The serogroup X polysaccharide protein conjugate will be a new addition to the development of a multicenter, transmembrane conjugate vaccine if public health care is needed.
몇몇 연구는 당류 잔기(moiety)의 크기가 접합체 백신의 면역원성(imm unogenicity)에 영향을 미칠 수 있다고 제안한다. 덱스트란-단백질 접합체의 면역 원성에 대한 초기 연구에서 닭 혈청 알부민(chicken serum albumin)에 접합된 저 분자량 덱스트란은 마우스에서 강한 항-덱스트란 반응을 유도하는 반면, 덱스트란 크기를 증가시키면 면역원성이 감소한다는 것을 발견했다. 라페리에르(Laferriere) 등은 마우스에서 폐렴구균(pneumococcal) 접합체 백신의 면역원성에 대한 탄수화물 사슬 길이의 영향을 거의 발견하지 못했다. 이 연구들은 다당류 사슬 길이와 접합체 백신의 면역원성 사이에 명확한 상관 관계가 없음을 시사한다. 그러나, 라나(Rana) 등은 면역원성 Hib 다당류 접합체 백신을 개발하기 위한 최적의 당류 사슬 길이를 확립하는 것이 중요하다는 것을 발견했다.Some studies suggest that the size of the sugar moiety may affect immuneogenicity of the conjugate vaccine. In an initial study of the immunogenicity of dextran-protein conjugates, a low molecular weight dextran conjugated to chicken serum albumin induced a strong anti-dextran response in mice, while an increase in dextran size resulted in a decrease in immunogenicity . Laferriere et al. Found little effect of carbohydrate chain length on the immunogenicity of the pneumococcal conjugate vaccine in mice. These studies suggest that there is no clear correlation between polysaccharide chain length and immunogenicity of the conjugate vaccine. However, Rana et al. Found that it is important to establish optimal saccharide chain lengths to develop immunogenic Hib polysaccharide conjugate vaccines.
다당류와 CDI의 반응은 여러 참고문헌에 나타나 있다. 특히 바람직한 시약인 카르보닐디이미다졸(Carbonyldiimidazole)은 히드록실기과 반응하여 다당류의 이미 다졸일우레탄(imidazolylurethane)을 형성하고, 예를 들어 니트로페닐-클로로포르메이트(nitrophenyl-chloroformate)를 포함하는 아릴 클로로포르메이트(aryl chloroformate)와 반응하여 다당류의 혼합 카보네이트(mixed carbonate)를 생성한다. 각각의 경우에, 결과적인 활성화된 다당류는 아민과 같은 친핵성 시약에 매우 민감하여 각각의 우레탄으로 변형된다.The reaction of polysaccharides with CDI is shown in several references. Carbonyldiimidazole, which is a particularly preferred reagent, reacts with a hydroxyl group to form a polysaccharide imidazolylurethane, and is formed, for example, with arylchloroform containing nitrophenyl-chloroformate And reacts with aryl chloroformate to produce polysaccharide mixed carbonate. In each case, the resulting activated polysaccharide is highly sensitive to nucleophilic reagents such as amines and is transformed into the respective urethanes.
임의의 접합 화학에 있어서 다당류 구조는 매우 중요한 역할을 한다. 임의의 다당류를 담체(carrier) 단백질에 접합시키기 위한 선택의 화학은 그 다당류 상의 이용가능한 작용기에 의존한다. 일부 다당류는 접합에 편리하게 이용될 수 있는 화학기(예: 아민, 카르복실 또는 알데히드)를 포함하지만, 많은 것들은 단백질에 커플링되기 전에 활성화 및 유도체화가 필요하다. 문헌에서 명백한 바와 같이, 다당류 단백질 접합체 백신은 링커를 갖거나 갖지않고 제조될 수 있으며, 여기서 링커는 다당류의 일부이거나 담체 단백질에 부착될 수 있다. In any conjugation chemistry, the polysaccharide structure plays a very important role. The chemistry of choice for conjugating any polysaccharide to a carrier protein depends on the available functional groups on the polysaccharide. Some polysaccharides contain chemical reagents (eg, amines, carboxyls or aldehydes) that can be conveniently used for conjugation, but many require activation and derivatization before coupling to proteins. As is apparent in the literature, a polysaccharide protein conjugate vaccine can be prepared with or without a linker, wherein the linker can be part of a polysaccharide or attached to a carrier protein.
현재의 기술은 미국 특허 출원 번호 US2015/0044253 호와 같은 문헌에서 네이세리아 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, W 및 Y를 포함하는 다양한 혈청군의 치료를 위한 백신을 개시하는데, 상기 문헌은 담체 단백질에 접합된, 에이치. 인플루엔자에 혈청유형(serotype) B (Hib), 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, W, Y 로부터 수득한 당류 단편을 포함하는 면역원성 조성물을 개시한다. 그러나, US2015/0044253에서 카바메이트(carbamate) 링커는 담체 단백질의 아미노기에 직접 결합하여 낮은 접합효율을 초래한다. Current techniques disclose vaccines for the treatment of various serogroups, including Nacelia meningitidis serogroups A, B, C, W, and Y, as described in US Patent Application No. US2015 / 0044253, Lt; / RTI > Serum to influenza type (serotype) B (Hib), yen. Discloses an immunogenic composition comprising a saccharide fraction obtained from Meningitides serogroups A, B, C, W, However, in US2015 / 0044253 carbamate linkers bind directly to the amino group of the carrier protein resulting in low conjugation efficiency.
WO2004/019992는 또한 변형된 캡슐형 당류(capsular saccharide) 및, 환원성 아민화(reductive amination)에 의해 수득된 엔. 메닌기티디스 혈청군 A의 당류 단백질 접합체를 개시하지만, 이 출원은 혈청군 A에 대해서만 언급하고 있다.WO2004 / 019992 also discloses modified capsular saccharides and enantiomers obtained by reductive amination . Discloses a saccharide protein conjugate of Meningitides serogroup A, but this application refers only to serogroup A.
환원성 아민화 접합 화학에 의해 수득된 엔. 메닌기티디스 혈청군 X의 접합체를 개시하는 WO2013/174832와 같은 엔. 메닌기티디스 혈청군 X에 대하여 이용할 수 있는 몇몇 개시가 있다. The yen obtained by reductive amination bonding chemistry . Menin giti discharge serogroup yen as WO2013 / 174832 for starting the X of the conjugate. There are several disclosures available for meningitidis serogroup X.
현존하는 종래 기술 개시의 주요 단점은 카바메이트 화학을 이용하는 선행 기술 중 어느 것도 접합 공정을 용이하게 하기위해 다당류의 유기 용매로의 용해를 개시하고 있지 않는다는 것이다. 현재 이용 가능한 접합체는 안정성(stability) 문제로 고통받는다. 보다 구체적으로, 엔. 메닌기티디스 혈청군 X에 대한 안정하고 상업적으로 가능한 접합체는 이용가능하지 않다.A major drawback of the existing prior art disclosure is that none of the prior art using carbamate chemistry has initiated dissolution of the polysaccharide into the organic solvent to facilitate the bonding process. Currently available conjugates suffer from stability problems. More specifically, the yen. Stable and commercially feasible conjugates for meningitidis serogroup X are not available.
발명의 목적Object of the invention
현존하는 종래 기술의 단점을 제거하기 위해, 본 발명의 주요 목적은 신규한 다당류-단백질 접합체를 제공하는 것이다.In order to obviate the disadvantages of the existing prior art, the main object of the present invention is to provide a novel polysaccharide-protein conjugate.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 접합체 백신의 제조에 사용될 수 있는 안정한 다당류-단백질 접합체를 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide stable polysaccharide-protein conjugates that can be used in the production of novel conjugate vaccines.
본 발명의 또 다른 목적은 현재 허가된 백신에 의해 예방되는 수막구균성 질병 발병의 더 높은 적용 범위를 확대시키기 위한 엔. 메닌기티디스 혈청군 X 다당류-담체 단백질 접합체를 제공하는 것이다.A further object is yen for expanding a higher coverage of cases of meningococcal disease prevention by the currently licensed vaccine in the present invention. Meningitidis serogroup X polysaccharide-carrier protein conjugate.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a process for preparing the novel polysaccharide-protein conjugate.
본 발명의 또 다른 목적은 카바메이트 화학을 이용하여 상기 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a process for preparing the novel polysaccharide-protein conjugate using carbamate chemistry.
본 발명의 또 다른 목적은 비-수성 비양성자성 용매(non-aqueous aprotic solvent)에서 다당류를 신속하게 가용화(solubilization)시키는 방법을 제공하는 것이다.It is a further object of the present invention to provide a method for rapid solubilization of polysaccharides in a non-aqueous aprotic solvent.
본 발명의 또 다른 목적은 더 넓은 pH 범위에서 접합 반응을 수행하는 것이다.It is another object of the present invention to carry out the bonding reaction in a wider pH range.
본 발명의 또 다른 목적은 고 수율로 매우 짧은 시간 범위에서 접합 공정을 완료하는 것이다.Another object of the present invention is to complete the bonding process in a very short time range at a high yield.
본 발명의 또 다른 목적은 백신 및 진단 도구로서 이용될 수 있는 높은 면역 원성을 갖는 신규한 다당류-단백질 접합체를 수득하는 것이다.It is another object of the present invention to obtain novel polysaccharide-protein conjugates with high immunogenicity that can be used as vaccines and diagnostic tools.
발명의 요약SUMMARY OF THE INVENTION
따라서, 본 발명은 신규한 다당류-단백질 접합체 및 이의 제조방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 접합체 백신의 제조를 위하여 카바메이트 화학에 의한 다당류-단백질 접합체를 수득하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카바메이트 화학을 이용하는, 엔. 메닌기티디스 혈청군 X, A, C, Y 및 W135 다당류-담체 단백질 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.Accordingly, the present invention provides novel polysaccharide-protein conjugates and methods for their preparation. More specifically, the present invention relates to obtaining polysaccharide-protein conjugates by carbamate chemistry for the production of novel conjugate vaccines. More particularly, the present invention utilizes a carbamate chemistry, yen. Meningitidis serogroup X, A, C, Y and W135 polysaccharide-carrier protein conjugates and methods for their preparation.
본 발명은 접합 공정에 관한 것으로, 여기서 캡슐형 다당류(capsular polysaccharide)가 담체 단백질과의 접합에 적합한 더 작은 크기로 분해되어 더 높은 항원성(antigenicity)을 갖는 접합체를 수득한다.The present invention relates to a conjugation process wherein the capsular polysaccharide is degraded to a smaller size suitable for conjugation with the carrier protein, resulting in a conjugate with higher antigenicity.
담체 단백질은 TT (파상풍 톡소이드: tetanus toxoid), DT (디프테리아 톡소이드: Diphtheria toxoid), CRM197 (DT의 비-독성 돌연변이체), OMPV (외막 단백질 소낭: Outer membrane protein vesicles) 또는 다른 적합한 담체 단백질로부터 선택된다. 다당류 단편은 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b (Hib), 네이세리아 메닌기티디스 (Men), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)를 포함하나 이에 제한되지 않는 그람 음성 박테리아 군으로부터 수득된다. The carrier protein is selected from TT (tetanus toxoid), DT (Diphtheria toxoid), CRM197 (non-toxic mutant of DT), OMPV (Outer membrane protein vesicles) do. Polysaccharide fragment type b (Hib), Nathan Serie menin giti display (Men), Streptococcus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae) to the Haemophilus influenzae But are not limited to, the gram-negative bacterial group.
네이세리아 메닌기티디스 캡슐형 다당류, 보다 바람직하게는 Men A, C, Y, W 또는 X 캡슐형 다당류의 접합 공정은 분해된다. 이러한 분해는 선행 기술에서 이용 가능한 몇 가지 기술을 이용하여 수행된다. 보다 바람직하게는, 분해는 실험실 규모에서 프로브 초음파 처리(probe sonication) 및/또는 울트라-초음파 처리(ultra-sonication)에 의해 수행되고, 더 큰 규모에서 마이크로 유동화기(micro fluidizer)에 의해 수행된다. 천연 엔. 메닌기티디스 캡슐형 다당류는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 상에서 겔-투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 측정된 바와 같이 0.38 + 0.06 kD의 분포 계수의 크기 범위에서 분해된다.The bonding process of the Nacelian meningitidis encapsulated polysaccharide, more preferably Men A, C, Y, W or X capsular polysaccharides, is degraded. This decomposition is performed using several techniques available in the prior art. More preferably, the degradation is performed by probe sonication and / or ultra-sonication on a laboratory scale and is performed by a micro fluidizer on a larger scale. Natural yen. Meningitidis encapsulated polysaccharides are degraded in size ranges of distribution coefficients of 0.38 + 0.06 kD as determined by gel-permeation chromatography (GPC) on high performance liquid chromatography (HPLC).
분해 공정 후, 상기 분해된 다당류는 리튬 할라이드(Lithium halide), 염화 리튬(Lithium chloride) 및 4차 암모늄 할라이드 수화물(Quaternary ammonium halide hydrate)을 포함하나 이에 제한되지 않는, 카운터 이온(counter ion) 교환 용의 강한 전해질 염(electrolytic salt)에 용해된다. 용액은 60 ± 30 분 동안 적절하게 혼합되도록 한다. 결과적인 캡슐형 다당류로부터 회전-증발과 같은 임의의 건조 기술에 의해 수분이 제거된다. 이어서, 건조된 캡슐형 다당류를 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO), 디메틸 포름아미드(DMF), N-메틸 피롤리돈(NMP: N-Methyl pyrrolidone) 또는 디메틸 아세트아미드를 포함하나 이에 제한되지 않는 비-수성 비양성자성 용매에 용해시킨다. 비-수성 비양성자성 용매 중의 상기 분해 및 건조된 캡슐형 다당류는 5 내지 50 몰 초과 농도의, N,N'-카르보닐 디 이미다졸(CDI: N,N'-Carbonyl Di imidazole), N,N'-디-숙신이미딜 카보네이트(DSC: N,N'-Di-succinimidyl carbonate) 또는 N,N'-디-숙신이미딜 옥살레이트(DSO: N,N'-Di-succinimidyl oxalate)를 포함하나 이에 제한되지 않는 무수분(moisture free) 활성제와 반응시키고, 혼합물을 4-디메틸아미노피리딘(DMAP: 4-dimethylaminopyridine) 또는 피리딘의 존재하에 소정의 시간 동안 유지하여 반응을 완결시킨다.After the degradation process, the degraded polysaccharide may be used for counter ion exchange, including, but not limited to, lithium halide, lithium chloride, and quaternary ammonium halide hydrate. Lt; RTI ID = 0.0 > (electrolytic salt). ≪ / RTI > Allow the solution to mix properly for 60 ± 30 minutes. Moisture is removed from the resulting capsular polysaccharide by any drying technique, such as spin-evaporation. The dried capsular polysaccharide may then be mixed with a non-aqueous solution of a non-toxic salt such as, but not limited to, dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP) Is dissolved in an aqueous aprotic solvent. The degraded and dried encapsulated polysaccharide in a non-aqueous aprotic solvent may contain N, N'-Carbonyl diimidazole (CDI), N, N'- N, N'-Di-succinimidyl carbonate (DSC) or N, N'-Di-succinimidyl oxalate (DSO) With a moisture-free active agent, which is not limited thereto, and the mixture is maintained in the presence of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) or pyridine for a predetermined time to complete the reaction.
수득되는 활성화된 캡슐형 다당류는 이러한 다당류를 과량의, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, n-부틸 아세테이트 또는 이들의 상이한 비율의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 저극성(low polarity) 용매에 침전시켜 정제하고, 침전된 다당류를 수성 완충 식염수에 용해시켜 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 수득한다.The resulting activated capsular polysaccharide is purified by precipitating such polysaccharides in excess of a low polarity solvent, including, but not limited to, ethyl acetate, dichloromethane, n-butyl acetate or mixtures of different ratios thereof , And the precipitated polysaccharide is dissolved in aqueous buffered saline to obtain a purified activated capsular polysaccharide.
이렇게 수득한 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 활성화된 담체 단백질을 갖는 수성 완충제(aqueous buffer)에 용해시킨다. 활성화된 담체 단백질은 카보히드라 지드 표지된(Carbohydrazide labelled) 또는 ADH 표지된 또는 히드라진(Hydrazine)표지된 것일 수 있다.The thus obtained purified activated capsular polysaccharide is dissolved in an aqueous buffer having an activated carrier protein. The activated carrier protein may be carbohydrazide labeled or ADH labeled or hydrazine labeled.
정제된 활성화된 캡슐형 다당류 및 활성화된 담체 단백질의 용액을, 상기 다당류가 CDI 활성화, DSC 활성화 또는 DSO 활성화 되었는지 여부에 따라 상이한 pH 범위에서 소정 시간, 바람직하게는 15 ± 5 시간 동안 실온에서 혼합되도록 한다. CDI 활성화된 다당류의 pH 범위는 8-10 인 반면, DSC 활성화 또는 DSO 활성화된 다당류의 pH 범위는 6-9 이다. 이 반응 동안, 단백질상의 히드라지드 잔기의 아민 및 활성화된 다당류상의 카바메이트 또는 카보네이트(carbonate) 잔기의 -N- 함유 방향족 잔기가 반응하여 안정한 카바메이트 결합 -0-(C=O)-N-을 갖는 다당류-단백질 접합체가 형성된다. 따라서 화학식 PS-L1-L2-CR의 최종 접합체가 제조되는데, 여기서 PS는 다당류이고, L1은 카바메이트 결합이고, L2는 히드라지드 결합이며, CR은 담체 단백질이다. 정제된 접합체는 한외여과(ultrafiltration), 황산 암모늄 침전(ammonium sulphate precipitation), 겔 투과 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는 정제 공정에 의해 수득된다.A solution of the purified activated capsular polysaccharide and the activated carrier protein is allowed to mix at room temperature for a predetermined time, preferably 15 5 hours, at different pH ranges depending on whether the polysaccharide is CDI activated, DSC activated or DSO activated do. The pH range of CDI-activated polysaccharides is 8-10, whereas the pH range of DSC-activated or DSO-activated polysaccharides is 6-9. During this reaction, the amine of the hydrazide moiety on the protein and the -N-containing aromatic moiety of the carbamate or carbonate moiety on the activated polysaccharide react to form a stable carbamate bond -O- (C = O) -N- Polysaccharide-protein conjugate is formed. Thus, the final conjugate of formula PS-L1-L2-CR is prepared, wherein PS is a polysaccharide, L1 is a carbamate bond, L2 is a hydrazide bond, and CR is a carrier protein. The purified conjugate is obtained by a purification process including, but not limited to, ultrafiltration, ammonium sulphate precipitation, gel permeation chromatography.
본 발명은 또한 바람직하게는 카바메이트인 하나의 링커(linker)를 다당류에 부착시키고, 바람직하게는 히드라진인 제2 링커를 담체 단백질에 부착시킨 다음, 활성화된 다당류와 별도의 링커를 갖는 활성화된 단백질을 반응시켜 접합체를 생성하는 것을 개시한다.The present invention also relates to a method of attaching a linker, preferably a carbamate, to a polysaccharide, attaching a second linker, which is preferably hydrazine, to the carrier protein, and then reacting the activated protein with an activated polysaccharide and a separate linker To produce a conjugate.
본 발명의 개선된 접합 공정은 더 짧은 시간 범위에서 완료되며 넓은 작용 범위의 pH에서 더 안정한 공유 결합의 접합체를 생산한다. 본 발명의 신규한 다당류-단백질 접합체는 더 높은 안정성, 고 수율 및 높은 면역원성을 나타낸다.The improved conjugation process of the present invention is completed in a shorter time span and produces a more stable covalent conjugate at pH over a wide working range. The novel polysaccharide-protein conjugates of the present invention exhibit higher stability, higher yield and higher immunogenicity.
본 발명은 또한 비-수성 비양성자성 용매에 다당류를 용해시키는 방법을 개시하는데, 이는 다당류와 카바메이트 형성제(forming agent) 사이의 접합 반응을 촉진시켜 더 짧은 시간 범위에서 접합 공정을 완료한다. The present invention also discloses a method of dissolving a polysaccharide in a non-aqueous aprotic solvent, which facilitates the conjugation reaction between the polysaccharide and the carbamate forming agent to complete the conjugation process in a shorter time span.
본 발명의 개선된 공정의 가장 중요한 결과는 백신 또는 진단 도구로서 사용될 수 있는 신규한 다당류-단백질 접합체를 제공하는 것이다. 상기 신규한 다당류-단백질 접합체는 특이적이고 동종의 면역 반응을 유도하며, 따라서 진단 도구 뿐만 아니라 1가 백신 또는 다가 조합 백신의 제조에도 유용하다.The most important result of the improved process of the present invention is to provide a novel polysaccharide-protein conjugate which can be used as a vaccine or diagnostic tool. The novel polysaccharide-protein conjugates induce specific and homologous immune responses and are therefore useful for the production of monovalent or multivalent combination vaccines as well as diagnostic tools.
도 1은 EDC (카르보디이미드:carbodiimide) 가교 결합 반응 도식(cross-linking reaction scheme)을 나타낸다(R-NH2는 히드라진(H2N-NH2) 또는 아디프산디히드라지드(ADH: Adipic Acid Dihydrazide) (NH2NHCO(CH2)4CONHNH2).
도 2는 Men X 캡슐형 다당류의 단량체(monomer) 단위- 화학 구조를 나타낸다.
도 3은 유속 1 ml/min의 TSK겔 PWXL5000 - PWXL4000 컬럼에서 용출 부피를 보여주고, 공극 부피, 총 부피 및 샘플 용출 부피를 보여주는 HPLC-SEC 프로파일을 나타낸다.
도 4는 천연 MenX 다당류 및 크기화된(sized) 다당류의 HPLC-SEC 프로파일 비교를 나타낸다.
도 5는 히드라진 유도체화된 TT 및 천연 TT의 HPLC-SEC 프로파일 비교를 나타낸다.
도 6은 세파덱스 G25 상에서 히드라지드 유도체화된 TT의 정제를 보여주는 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 완전한 카바메이트 접합 도식을 나타낸다.
도 8은 히드라진 유도체화된 TT 및 조(crude) Men X 접합체의 HPLC-SEC 프로파일 비교를 나타낸다.Figure 1 shows an EDC (carbodiimide) cross-linking reaction scheme (R-NH 2 is hydrazine (H 2 N-NH 2 ) or adipic acid Dihydrazide) (NH 2 NHCO (CH 2) 4 CONHNH 2).
Figure 2 shows the monomer unit-chemical structure of the Men X capsular polysaccharide.
Figure 3 shows the HPLC-SEC profile showing elution volume in a TSK gel PWXL5000-PWXL4000 column at a flow rate of 1 ml / min and showing pore volume, total volume, and sample elution volume.
Figure 4 shows HPLC-SEC profile comparisons of native MenX polysaccharides and sized polysaccharides.
Figure 5 shows HPLC-SEC profile comparisons of hydrazine derivatized TT and native TT.
Figure 6 shows a chromatogram showing the purification of hydrazide derivatized TT on Sephadex G25.
Figure 7 shows a complete carbamate junction scheme.
Figure 8 shows HPLC-SEC profile comparisons of hydrazine derivatized TT and crude Men X conjugates.
삽화 및 실시예와 함께 발명의 상세한 설명Detailed Description of the Invention < RTI ID = 0.0 >
본 발명은 신규한 다당류-단백질 접합체 및 이의 제조방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 카바메이트 화학에 의해 화학적으로 안정한 다당류-단백질 접합체를 수득하는 것에 관한 것이다. 다당류 단편은 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b (Hib), 네이세리아 메닌기티디스 (Men), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 보다 바람직하게는 엔. 메닌기티디스 혈청군 Men A, C, Y, W 및 바람직하게는 Men X를 포함하나 이에 제한되지 않는 그람 음성 박테리아 군으로부터 수득된다. 본 발명은 또한 단독으로 또는 조합으로 백신으로 사용될 수 있거나 진단 도구로서 사용될 수 있는, 높은 면역원성을 갖는 신규한 다당류-단백질 접합체를 수득하는 것에 관한 것이다.The present invention provides novel polysaccharide-protein conjugates and methods for their preparation. More particularly, the present invention relates to obtaining chemically stable polysaccharide-protein conjugates by carbamate chemistry. The polysaccharide fragments are resistant to Haemophilus influenzae type b ( Hib ), Neceria meningitidis ( Men ), Streptococcus pneumoniae, and more preferably Yen. Meningitidis serogroups Men A, C, Y, W, and preferably Men X. The present invention also relates to obtaining novel polysaccharide-protein conjugates having high immunogenicity, which can be used as vaccines, alone or in combination, or as diagnostic tools.
또한, 본 발명은 접합 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 캡슐형 다당류는 담체 단백질과의 접합에 적합한 더 작은 크기로 분해되어 더 높은 항원성을 갖는 접합체를 수득한다. The present invention also relates to a method of conjugation wherein the capsular polysaccharide is degraded to a smaller size suitable for conjugation with a carrier protein, resulting in a conjugate with higher antigenicity.
본 발명은 히드록실기 활성화를 위해 CDI를 사용하여 카바메이트 화학에 의해 다당류-단백질 접합체를 형성하는 접합 방법을 제공한다.The present invention provides a conjugation method for forming a polysaccharide-protein conjugate by carbamate chemistry using CDI for hydroxyl group activation.
담체 단백질은 TT (파상풍 톡소이드), DT (디프테리아 톡소이드), CRM197 (DT의 비-독성 돌연변이체), OMPV (외막 단백질 소낭) 또는 다른 적합한 담체 단백질로부터 선택된다.The carrier protein is selected from TT (tetanus toxoid), DT (diphtheria toxoid), CRM197 (non-toxic mutant of DT), OMPV (outer membrane protein vesicle) or other suitable carrier proteins.
상기 캡슐형 다당류는 종래 기술에서 이용 가능한 몇 가지 기술을 이용하여 분해된다. 보다 바람직하게는, 분해는 실험실 규모에서 프로브 초음파 처리 및/또는 울트라-초음파 처리에 의해 수행되고, 더 큰 규모에서 마이크로 유동화기에 의해 수행된다. 천연 엔. 메닌기티디스 캡슐형 다당류는 0.38 + 0.06 kD의 분포 계수의 크기 범위에서 분해된다. 다당류의 크기는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)상에서 겔-투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 결정된다.The capsular polysaccharide is degraded using several techniques available in the prior art. More preferably, degradation is performed by probe ultrasonication and / or ultrasound treatment on a laboratory scale and is performed by a micro-fluidizer on a larger scale. Natural yen. Meningitidis capsular polysaccharides are degraded in the size range of the distribution coefficient of 0.38 + 0.06 kD. The size of the polysaccharide is determined by gel-permeation chromatography (GPC) on high performance liquid chromatography (HPLC).
분해 공정 후, 상기 분해된 다당류는 리튬 할라이드, 염화 리튬 및 4차 암모늄 할라이드 수화물을 포함하나 이에 제한되지 않는, 카운터 이온 교환 용의 강한 전해질 염에 용해된다. 용액은 60 ± 30 분 동안 적절하게 혼합되도록 한다. 수득되는 캡슐형 다당류로부터 회전-증발과 같은 임의의 건조 기술에 의해 수분이 제거된다. 이어서, 건조된 캡슐형 다당류를 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO), 디메틸 포름아미드(DMF), N-메틸 피롤리돈(NMP) 또는 디메틸 아세트아미드를 포함하나 이에 제한되지 않는 비-수성 비양성자성 용매에 용해시킨다. 비-수성 비양성자성 용매 중의 상기 분해 및 건조된 캡슐형 다당류는 5 내지 50 몰 초과 농도의, N,N'-카르보닐 디 이미다졸(CDI), N,N'-디-숙신이미딜 카보네이트(DSC) 또는 N,N'-디-숙신이미딜 옥살레이트(DSO)를 포함하나 이에 제한되지 않는 무수분 활성제와 반응시키고, 혼합물을 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 또는 피리딘의 존재하에 소정의 시간 동안 유지하여 반응을 완결시킨다. Men PS는 이의 반복 단위에 유리 히드록실기를 가지고, 이는 카르보닐-디이미다졸 (CDI)에 반응하여 중간체 이미다졸일 카바메이트 및 이미다졸 부산물을 형성한다.After the degradation process, the degraded polysaccharide is dissolved in a strong electrolyte salt for counter ion exchange, including but not limited to lithium halide, lithium chloride and quaternary ammonium halide hydrate. Allow the solution to mix properly for 60 ± 30 minutes. Moisture is removed from the resulting encapsulated polysaccharide by any drying technique, such as spin-evaporation. The dried encapsulated polysaccharide is then dissolved in a non-aqueous aprotic solvent such as but not limited to dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP) or dimethylacetamide Lt; / RTI > The above degraded and dried encapsulated polysaccharide in a non-aqueous aprotic solvent may contain N, N'-carbonyldiimidazole (CDI), N, N'-di-succinimidyl carbonate (DSC) or N, N'-di-succinimidyl oxalate (DSO), and the mixture is reacted with a water-soluble active agent, including but not limited to, 4-dimethylaminopyridine (DMAP) For a period of time to complete the reaction. Men PS has a free hydroxyl group in its repeating unit, which reacts with carbonyl-diimidazole (CDI) to form an intermediate imidazolyl carbamate and an imidazole byproduct.
결과적인 활성화된 캡슐형 다당류는 다당류를 과량의, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, n-부틸 아세테이트 또는 이들의 상이한 비율의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 저극성용매에 침전시키고, 침전된 다당류를 수성 완충 식염수에 용해시켜 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 수득함으로써 정제한다.The resulting activated capsular polysaccharide can be prepared by precipitating the polysaccharide in an excess of a low polarity solvent, including, but not limited to, ethyl acetate, dichloromethane, n-butyl acetate or mixtures of different ratios thereof, And purified by dissolving in saline to obtain purified activated capsular polysaccharide.
담체 단백질은 히드라진 또는 ADH의 존재하에 수용성 카르보디이미드 EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드)와 반응하여 연장된 말단 히드라지드기를 갖는 안정한 이미드(imide) 결합을 생성한다. EDC는 이용가능한 카르복실레이트(carboxylate) 그룹과 반응하여 중간체, 반응성이 높은, o-아실이소우레아(o-acylisourea)를 형성한다. 이 활성 에스테르는 히드라지드와 같은 친핵체(nucleophile)와 추가로 반응하여 안정한 최종 생성물을 생성한다(도 1). EDC 가교 결합 도식 (R-NH2)는 히드라진 또는 ADH이다.The carrier protein is reacted with a water soluble carbodiimide EDC (N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride) in the presence of hydrazine or ADH to form a stable imide having an extended terminal hydrazide group. Lt; / RTI > EDC reacts with an available carboxylate group to form an intermediate, highly reactive, o-acylisourea. This active ester reacts further with a nucleophile such as hydrazide to produce a stable end product (Figure 1). EDC crosslinking scheme (R-NH 2) is hydrazine or ADH.
카르보닐은 pH 5-7에서 히드라지드 및 아민과 반응한다. EDC의 가수 분해(hydrolysis)는 커플링 동안의 경쟁 반응이며, 온도, pH 및 완충제 조성에 의존한다. 4-모르폴리노에탄설폰산(MES: 4-Morpholinoethanesulfonic acid)은 효과적인 카르보디이미드 반응 완충제이다. 포스페이트 완충제는 EDC의 반응 효율을 감소시키지만, EDC의 양을 증가시키면 감소된 효율을 보완할 수 있다. 트리스, 글리신 및 아세테이트 완충제는 접합 완충제로 사용될 수 없다.The carbonyl reacts with hydrazides and amines at pH 5-7. The hydrolysis of EDC is a competitive reaction during coupling and depends on temperature, pH and buffer composition. 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) is an effective carbodiimide reaction buffer. Phosphate buffers reduce the reaction efficiency of EDC, but increasing the amount of EDC can compensate for reduced efficiency. Tris, glycine and acetate buffers can not be used as a junction buffer.
TT 상의 히드라지드 표지는 TNBS 분석에 의해 결정되고; 단백질 농도는 로우리(Lowry's) 분석법에 의해 결정된다. 유도체화 정도는 생성된 히드라지드의 몰 수를 단백질 몰 수로 나누어 계산한다.The hydrazide label on TT is determined by TNBS analysis; Protein concentration is determined by Lowry's assay. The degree of derivatization is calculated by dividing the number of moles of hydrazide produced by the number of moles of protein.
이렇게 수득한 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 활성화된 담체 단백질을 갖는 수성 완충제에 용해시킨다. 활성화된 담체 단백질은 카르보히드라지드 표지된 또는 ADH 표지된 또는 히드라진 표지된 것일 수 있다.The thus obtained purified activated capsular polysaccharide is dissolved in an aqueous buffer with activated carrier protein. The activated carrier protein may be carbhydrazide labeled or ADH labeled or hydrazine labeled.
정제된 활성화된 캡슐형 다당류 및 활성화된 담체 단백질의 용액을, 상기 다당류가 CDI 활성화, DSC 활성화 또는 DSO 활성화되었는지 여부에 따라 상이한 pH 범위에서 15 ± 5 시간 동안 실온에서 혼합되도록 한다. CDI 활성화된 다당류의 pH 범위는 8-10 인 반면, DSC 활성화 또는 DSO 활성화된 다당류의 pH 범위는 6-9 이다. 이 반응 동안, 단백질상의 히드라지드 잔기의 아민 및 활성화된 다당류상의 카바메이트 또는 카보네이트 잔기의 -N- 함유 방향족 잔기가 반응하여 안정한 카바메이트 결합 -0-(C=O)-N-을 갖는 다당류-단백질 접합체가 형성된다. 따라서, 화학식 PS-L1-L2-CR의 최종 접합체가 제조되는데, 여기서 PS는 다당류이고, L1은 카바메이트 결합이고, L2는 히드라지드 결합이며, CR은 담체 단백질이다. 정제된 접합체는 한외여과, 황산 암모늄 침전, 겔 투과 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는 정제 공정에 의해 수득된다.A solution of the purified activated capsular polysaccharide and activated carrier protein is allowed to mix at room temperature for 15 5 hours at different pH ranges depending on whether the polysaccharide is CDI activated, DSC activated or DSO activated. The pH range of CDI-activated polysaccharides is 8-10, whereas the pH range of DSC-activated or DSO-activated polysaccharides is 6-9. During this reaction, the amine of the hydrazide moiety on the protein and the carbamate on the activated polysaccharide or the -N-containing aromatic moiety of the carbonate moiety are reacted to form a polysaccharide moiety having a stable carbamate bond -O- (C = O) -N- Protein conjugate is formed. Thus, a final conjugate of the formula PS-L1-L2-CR is prepared, wherein PS is a polysaccharide, L1 is a carbamate bond, L2 is a hydrazide bond, and CR is a carrier protein. The purified conjugate is obtained by a purification process including, but not limited to, ultrafiltration, ammonium sulfate precipitation, gel permeation chromatography.
카바메이트 화학을 이용하여 제조된 접합체를 시험하여 접합체 중의 다당류/단백질 비율, 유리 다당류의 양 및, 분자 크기 분포를 결정하였다. 본 발명에서 다양한 최적화 실험을 수행하여 0.30 내지 1.0 범위의 다당류/단백질 비율 및 평균 30 ± 5 %의 접합 수율 60 % 이하를 달성하였다.The conjugates prepared using carbamate chemistry were tested to determine the polysaccharide / protein ratio, amount of free polysaccharide, and molecular size distribution in the conjugate. Various optimization experiments were performed in the present invention to achieve a polysaccharide / protein ratio in the range of 0.30 to 1.0 and an average yield of 60% or less of 30 +/- 5%.
하나의 바람직한 실시양태에서, 박테리아 발효로부터 유래된 Men PS를 하기(downstream) 정제 공정에 의해 정제하고, 정제 후 모든 중요한 품질 파라미터를 분석한다. Men PS의 화학 구조는 유리 히드록실 그룹(들)을 갖는 반복 단위로 구성된다 예: MenX PS (도 2)는 포스페이트 골격 및 위치 3에 N-아세틸화를 갖는 반복 단위로 구성된다. 위치번호 4 및 7의 히드록실기는, CDI와 같은 카바메이트 유도 화학물질과의 접합을 위한 반응성 작용기로 작용한다. 단량체 반복 단위는 단당류(monosaccharide)로 불리고, 단당류 단위 사이의 공유 결합에 의해 형성된 긴 사슬은 다당류를 구성한다. 단당류 유형은 특정 혈청군에 특이적이다 (표 1).In one preferred embodiment, Men PS derived from bacterial fermentation is purified by a downstream purification process and all important quality parameters are analyzed after purification. The chemical structure of Men PS consists of repeating units with free hydroxyl group (s). Example: MenX PS (Fig. 2) consists of a phosphate backbone and repeating units with N-acetylation at position 3. The hydroxyl groups at
표 1: 상이한 엔. 메닌기티디스 혈청군의 캡슐형 다당류의 화학 구조 Table 1: Different Yen. Chemical structure of encapsulated polysaccharide of Meningitidis serogroup
천연 Men PS는 풀루란(pullulan) 표준을 사용하여 HPLC 상에서 SEC로 결정된바와 같이 0.38 + 0.06 kD의 분포 계수의 크기 범위를 갖는다. 본 발명의 카바메이트 화학 및 다당류 구조는 단독으로 또는 조합으로 백신 후보 물질로 이용되는 안정한 다당류-단백질 접합체의 형성에 기여한다.The native Men PS has a size range of distribution coefficients of 0.38 + 0.06 kD as determined by SEC on HPLC using the pullulan standard. The carbamate chemistry and polysaccharide structures of the present invention contribute to the formation of stable polysaccharide-protein conjugates that are used as vaccine candidates, alone or in combination.
분해된 다당류의 함량은 MenX 및 MenA에 대하여 물리-화학적 분석 예를 들어, 인 분석법(phosphorus assay)에 의해 결정되었고, 초기 다당류 함량의 그것과 유사한 것으로 밝혀졌다.The content of degraded polysaccharide was determined by the physico-chemical analysis, for example, phosphorus assay, on MenX and MenA and was found to be similar to that of the initial polysaccharide content.
0.38 ±0.06 kD의 최적 범위로 분포 계수를 최적화하고 달성하기 위해 상이한 실험을 수행하였다. 조건은 각 다당류의 초기 분자 크기 및 구조에 의존하여 상이한 배치(batch)에 따라 달라질 수 있으므로 다양한 조건을 이용하였다.Different experiments were performed to optimize and achieve the distribution coefficients in the optimal range of 0.38 + - 0.06 kD. The conditions were varied depending on the initial molecular size and structure of each polysaccharide and could be different for different batches, so various conditions were used.
하나의 바람직한 실시양태에서, MenX 다당류는 높은 항원성을 갖는 접합체를 수득하기 위해 담체 단백질과의 접합에 적합한 더 작은 크기로 분해된다. 파상풍 톡소이드 (TT)는 담체 단백질로 이용된다. 상기 분해된 MenX 다당류는 염화리튬에 용해된다. 용액은 60 ± 30 분 동안 적절한 혼합이 가능하도록 한다. 회전-증발과 같은 임의의 공지된 건조 기술에 의해 결과적인 캡슐형 다당류로부터 수분이 제거된다. 분해 및 건조된 캡슐형 다당류를 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시킨다. 비-수성 비양성자성 용매 중의 건조된 캡슐형 다당류를 활성화제 N,N'-카르보닐 디 이미다졸(CDI)의 5-50 몰 과량, 바람직하게는 30 몰 과량의 농도와 반응시키고, 혼합물을 2 시간 내지 3 시간 동안 혼합을 유지하여 반응을 완료한다. 반응 혼합물의 pH는 7-10, 바람직하게는 9.0으로 유지한다. 수득되는 활성화된 MenX 다당류는 다당류를 과량의 저극성 용매 에틸 아세테이트에서 침전시키고, 침전된 다당류를 수성 완충 식염수에 용해시켜 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 수득함으로써 정제한다.In one preferred embodiment, the MenX polysaccharide is degraded to a smaller size suitable for conjugation with the carrier protein to obtain a conjugate with high antigenicity. Tetanus toxoid (TT) is used as a carrier protein. The degraded MenX polysaccharide is dissolved in lithium chloride. The solution should be mixed for 60 ± 30 minutes. Water is removed from the resulting encapsulated polysaccharide by any known drying technique, such as spin-evaporation. The degraded and dried encapsulated polysaccharide is dissolved in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO). The dried encapsulated polysaccharide in a non-aqueous aprotic solvent is reacted with a 5 to 50 molar excess, preferably 30 molar excess, of the activator N, N'-carbonyl diimidazole (CDI) The reaction is completed by maintaining the mixture for 2 to 3 hours. The pH of the reaction mixture is maintained at 7-10, preferably 9.0. The resulting activated MenX polysaccharide is purified by precipitating the polysaccharide in an excess of the low polarity solvent ethyl acetate and dissolving the precipitated polysaccharide in aqueous buffered saline to obtain a purified activated capsular polysaccharide.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 링커는 담체 단백질에 부착된 히드라진 또는 이의 유도체이다. 크기화된 활성 다당류 및 유도체화된 담체 단백질은 pH 7.0-10.0, 바람직하게는 0.1M 탄산나트륨(Sodium carbonate), 01M NaCl, pH 9.0의 완충제 중에서 0.5 : 1 내지 1 : 0.5 w/w, 보다 바람직하게는 1 : 1 w/w의 비율로 혼합 된다. 이 반응 동안 단백질상의 히드라지드 잔기의 아민 및 활성화된 다당류상의 카바메이트 또는 카보네이트 잔기의 -N- 함유 방향족 잔기가 반응하여 매우 안정한 카바메이트 결합 -O-(C=O)-N- 을 갖는 다당류-단백질 접합체가 형성된다. 상기 접합체는 공지된 기술에 의해 정제되고, 총 다당류 함량, 단백질 함량, 유리 다당류, 다당류-단백질 비율 및 접합체 수율에 대해 분석된다. 정제된 접합체는 2 내지 8 ℃에서 보관된다.In another preferred embodiment, the linker is hydrazine or a derivative thereof attached to a carrier protein. The sizeed active polysaccharide and derivatized carrier protein are preferably used in a buffer of pH 7.0-10.0, preferably 0.1 M sodium carbonate, 01M NaCl, pH 9.0, 0.5: 1 to 1: 0.5 w / w, Are mixed at a ratio of 1: 1 w / w. During this reaction, the amine of the hydrazide moiety on the protein and the N-containing aromatic moiety of the carbamate or carbonate moiety on the activated polysaccharide on the protein react to form a polysaccharide having a very stable carbamate bond -O- (C = O) -N- Protein conjugate is formed. The conjugates are purified by known techniques and analyzed for total polysaccharide content, protein content, free polysaccharide, polysaccharide-protein ratio and conjugate yield. The purified conjugate is stored at 2-8 [deg.] C.
본 발명의 접합체는 37 ℃의 고온 조건에 노출되었을 때 안정하다. 본 발명의 Men 접합체는 혈청 살균 분석 (SBA: Serum Bactericidal Assay) 및 ELISA와 같은 다양한 면역원성 분석(immunogenic assays)에 의해 밝혀진 바와 같이 높은 항원성 및 높은 면역원성을 나타낸다.The conjugate of the present invention is stable when exposed to high temperature conditions of 37 캜. The Men conjugates of the present invention exhibit high antigenicity and high immunogenicity as revealed by various immunogenic assays such as Serum Bactericidal Assay (SBA) and ELISA.
비-제한적인 실시예Non-limiting embodiments
실시예 1: Men X 다당류의 크기화(sizing)Example 1: sizing of Men X polysaccharides
Men X 다당류 200mg을 얼음 욕(ice bath) 상의 유리 비커에 10 mg/ml의 농도로 취하였다. 3 시간 동안 20% 진폭으로 초음파 진동기를 작동시킨다. 분해된 다당류의 크기는 굴절률 (RI: refractive index) 검출기를 이용하여 HP-GPC (표 2) 상에 수행함으로써 분포 계수 (Kd)로 결정된다. 샘플은 pH 7.2의 0.1M NaNO3에서 TSK 겔 G5000 PWXL + G4000 PWXL 컬럼의 등용매(isocratic) 모드에서 연속적으로 용출된다. 용출 부피는 체류 시간(retention time)으로 측정된다. 각각, 칼럼의 공극 부피 (Vo)는 고 분자량 덱스트란 주입 체류 시간으로부터 계산되며, 칼럼의 총 부피 (Vt)는 나트륨 아자이드(sodium azide) 주입 체류 시간에 의해 결정된다. Kd는 식 Kd = (Ve-Vo/Vt-Vo)로부터 계산된다. Ve는 샘플의 용출 부피의 체류 시간 (RT)이다(도 3). RI 검출기를 사용하여 기록된 데이터는 오른쪽으로 피크가 이동하여 천연 다당류의 해중합(depolymerisation)을 시사한다(도 4).200 mg of Men X polysaccharide was taken at a concentration of 10 mg / ml in a glass beaker on an ice bath. Operate ultrasonic vibrator with 20% amplitude for 3 hours. The size of the degraded polysaccharide is determined by the distribution coefficient (Kd) by performing on HP-GPC (Table 2) using a refractive index (RI) refractive index detector. Samples are continuously eluted in isocratic mode on a TSK gel G5000 PWXL + G4000 PWXL column in 0.1 M NaNO 3 at pH 7.2. The elution volume is measured by the retention time. The void volume (Vo) of each column is calculated from the high molecular weight dextran injection retention time, and the total volume (Vt) of the column is determined by the sodium azide injection residence time. Kd is calculated from the equation Kd = (Ve-Vo / Vt-Vo). And Ve is the residence time (RT) of the elution volume of the sample (Fig. 3). The data recorded using the RI detector shows the depolymerisation of the native polysaccharide by shifting the peak to the right (FIG. 4).
표 2: TSK 겔 G5000 PWXL + G4000 PWXL 칼럼 상의 HP-SEC에 의한 수막구균성 다당류 혈청군 X의 크기 분포를 보여주는 결과. Table 2: Results showing the size distribution of the meningococcal polysaccharide serogroup X by HP-SEC on the TSK gel G5000 PWXL + G4000 PWXL column.
실시예 2 : CDI를 사용한 다당류 활성화Example 2: Activation of polysaccharides using CDI
크기화된 다당류 200mg과 LiCl을 실온에서 1 시간 동안 천천히 교반하면서 혼합한 다음 40 ℃에서 회전증발 건조시켰다. 그런다음 15ml의 건조 DMSO에 재용 해시키고 2 시간 동안 혼합을 계속한다. 그 후, 다당류에 대한 카르보닐 디-이미다졸 (CDI) 30X 몰을 첨가한다. 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하여 pH를 9.0으로 조정 하였다. 2 시간 동안 실온에서 천천히 교반하고 샘플을 얼음으로 식혀 반응을 멈추게한다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 상단으로부터 상층액을 제거하였다. 다시 에틸 아세테이트를 첨가하고 상단으로부터 상층액을 제거하였다. 고 진공(high vacuum)에서 30 분 동안 건조시킨다.200 mg of the polysaccharide and LiCl were mixed at room temperature for 1 hour with gentle stirring and then dried by rotary evaporation at 40 ° C. It is then resuspended in 15 ml of dry DMSO and mixing is continued for 2 hours. Thereafter, 30X mol of carbonyl di-imidazole (CDI) is added to the polysaccharide. Triethylamine (TEA) was added to adjust the pH to 9.0. Slowly stir at room temperature for 2 hours and cool the sample with ice to stop the reaction. Ethyl acetate was added and the supernatant was removed from the top. Ethyl acetate was added again and the supernatant was removed from the top. And dried in a high vacuum for 30 minutes.
실시예 3 : TT 활성화Example 3: Activation of TT
250 mg TT를 50 kDa 분자량 차단 (MWCO: molecular weight cut off) 원심분리 필터를 이용하여 농축시켜 최종 10 ml를 만든다. TT의 10X 중량에 해당하는, 스톡(stock) 5M로부터 2.75㎖의 히드라진 일수화물(monohydrate) 또는 2.5gm의 ADH를 10ml의 반응 완충제, 즉, 0.2M NaCl를 포함하는 0.15M MES 완충제, pH 5.75에 첨가하고 상기 TT에 첨가하였다. 이 혼합물에 1ml의 반응 완충제중의 등량의 EDAC (250mg)를 첨가하여 약 30mM의 최종 농도를 만든다. 반응 혼합물의 pH를 5.85로 조정하고 반응 혼합물의 최종 부피를 25 ml로 조정하였다. 반응 혼합물 중의 TT의 농도는 10 mg/ml이다. 반응 혼합물을 얼음 욕에서 1.0 시간 동안 천천히 교반하였다. 유도체화된 TT를 추가로 정제하고 피크 프로파일을 모니터링하기 위하여 활성화도(degree of activation) 및 SEC-HPLC를 분석한다. 히드라진 활성화된 TT 및 천연 TT의 HPLC-SEC 프로파일 비교를 도 5에 나타내었으며, 여기서 샘플은 등용매 모드의 크로마토그래피 컬럼에서 수행되었고, 데이터는 PDA 검출기를 사용하여 기록되었다.250 mg TT is concentrated using a 50 kDa molecular weight cutoff (MWCO) centrifugal filter to give a final volume of 10 ml. 2.75 ml of hydrazine monohydrate or 2.5 gm of ADH from stock 5M, corresponding to a 10X weight of TT, was dissolved in 10 ml of reaction buffer, 0.15 M MES buffer containing 0.2 M NaCl, pH 5.75 And added to the TT. To this mixture is added an equal volume of EDAC (250 mg) in 1 ml reaction buffer to give a final concentration of about 30 mM. The pH of the reaction mixture was adjusted to 5.85 and the final volume of the reaction mixture was adjusted to 25 ml. The concentration of TT in the reaction mixture is 10 mg / ml. The reaction mixture was slowly stirred in an ice bath for 1.0 hour. The derivatized TT is further purified and analyzed for degree of activation and SEC-HPLC to monitor the peak profile. A comparison of the HPLC-SEC profiles of hydrazine activated TT and native TT is shown in Figure 5, where the samples were run in isocratic mode chromatography columns and the data were recorded using a PDA detector.
실시예 4 : 활성화된 TT의 정제Example 4: Purification of activated TT
정제는 공정 및 TT 활성화에서 가장 중요한 단계 중 하나이다. 미-반응된(un-reacted) 히드라진 또는 ADH를 가능한 최대한으로 제거하는 것을 확실히 할 필요가 있다. 정제는 Sephadex G-25 탈염(desalting) 방법으로 수행된다. 반응 혼합물을 75mM NaCl을 포함하는 50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.5에 대한 세파덱스 G25 컬럼상에서 탈염을 수행하여 유도체화된 단백질을 정제한다. 75mM NaCl을 포함하는 50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.5로 크로마토그래피 컬럼을 평형화시키고, 이어서 샘플을 적재(loading) 하고 110 cm/hr에서 용출한다. 각 10 ㎖의 용출된 분획(fraction)을 수집하고, UV 280 ㎚에서 피크에 상응하는 분획을 모아서 50 kDa MWCO 아미콘(Amikon)막으로 농축시킨다. TT를 갖는 선택된 분획은 TT 농도가 약 30-50 mg/ml가 되도록 상기 부피로 농축된다 (탈염 후 활성화된 TT의 약 75 %의 회수를 고려함). 최종 활성화된 TT는 로우리 분석법으로 단백질 농도를 분석하고, TNBS 분석으로 히드라지드 표지를 분석한다. 상기 두 값은 TT의 활성화도(DOA) 계산에 사용하였다. 활성화된 TT는 PWXL 5000 - PWXL 4000 컬럼을 연속으로 사용하여 1 mg/ml의 농도로 HPLC에서 수행되어 이의 완전성(integrity)에 대해 피크 프로파일을 확인한다.Tablets are one of the most important steps in process and TT activation. It is necessary to ensure that un-reacted hydrazine or ADH is removed as much as possible. The purification is carried out by the Sephadex G-25 desalting method. The reaction mixture is desalted on a Sephadex G25 column for 50 mM phosphate buffer pH 7.5 containing 75 mM NaCl to purify the derivatized protein. The chromatographic column was equilibrated with 50 mM phosphate buffer pH 7.5 containing 75 mM NaCl, and then the sample was loaded and eluted at 110 cm / hr. Each 10 ml eluted fraction is collected and the fraction corresponding to the peak at 280 nm is collected and concentrated to a 50 kDa MWCO Amikon membrane. Selected fractions with TT are concentrated to the volume to give a TT concentration of about 30-50 mg / ml (taking into account recovery of about 75% of activated TT after desalting). The final activated TT is analyzed for protein concentration by Lowry analysis and analyzed for hydrazide label by TNBS analysis. These two values were used to calculate the activation (DOA) of TT. Activated TT is performed on the HPLC at a concentration of 1 mg / ml using the PWXL 5000-PWXL 4000 column in series to confirm the peak profile for its integrity.
본 발명의 공정은 상이한 다당류, 바람직하게는 MenX PS의 히드록실기를 상이한 활성화제, 바람직하게는 카르보닐 디-이미다졸로 활성화시켜 안정한 PS-TT 접합체를 형성하도록 담체 단백질에 대해 반응성이 있도록 만든다(도 7).The process of the present invention makes the hydroxyl groups of different polysaccharides, preferably MenX PS, activated with different activators, preferably carbonyl di-imidazole, to be reactive with the carrier protein to form a stable PS-TT conjugate (Fig. 7).
실시예 5 : 활성화된 MenX 및 유도체화된 TT의 접합 반응Example 5: Binding reaction of activated MenX and derivatized TT
유도체화된 TT는 0.1M 탄산나트륨, 0.1M NaCl 완충제 pH 9.0 용액 3ml 중의활성화된 Men X PS에 직접 첨가되었고, pH를 9.0으로 유지한다. 활성화된 다당류 및 유도체화된 TT는 접합 반응을 위해 1:1 w/w의 비율로 혼합된다. 접합체의 형성은 3 시간의 시간에만 확인되지만, 조 접합체 혼합물은 실온에서 밤새 계속 혼합한다. 글리신과 같은 아민-함유 시약을 5-10 몰 과량으로 사용하여 반응을 퀀칭(quenching)시킨다.The derivatized TT was added directly to the activated Men X PS in 3 ml of 0.1 M sodium carbonate, 0.1 M NaCl buffer pH 9.0 solution, and the pH was kept at 9.0. The activated polysaccharide and derivatized TT are mixed at a ratio of 1: 1 w / w for the conjugation reaction. Formation of the conjugate is confirmed only at the time of 3 hours, but the crude conjugate mixture is continuously mixed at room temperature overnight. The reaction is quenched using 5-10 molar excess of an amine-containing reagent such as glycine.
접합 과정은 활성화된 TT의 체류 시간의 변화 및 좌측으로의 피크 이동을 갖는 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링된다. 접합체의 HPLC-SEC 프로파일은 접합 반응이 3 내지 4 시간 내에 최대로 완료됨을 나타낸다. 천연 및 활성화된 TT 및 접합체의 SEC-HPLC 프로파일은 활성화시 활성화된 TT의 크기는 천연 TT로부터 변하지 않고 유지됨을 나타내므로, 응집(aggregation)이 거의 또는 전혀 발생하지 않음을 시사한다. 샘플은 등용액 모드에서 0.1M 질산 나트륨(sodium nitrate), pH 7.2 완충제를 이용하여 유속 1.0 ml/분으로 크로마토그래피 컬럼에서 수행하였으며, 데이터는 PDA 검출기를 사용하여 기록하였다. 접합 후, 고 분자량 피크가 유도체화된 TT 피크의 왼쪽에 나타나며, 이는 PS-TT 접합체의 형성을 나타낸다(도 8).The conjugation process is monitored by SEC-HPLC analysis with a change in residence time of the activated TT and a peak shift to the left. The HPLC-SEC profile of the conjugate indicates that the conjugation reaction is maximally complete within 3 to 4 hours. The SEC-HPLC profile of native and activated TTs and conjugates indicates that the size of the activated TT during activation remains unchanged from the native TT, suggesting little or no aggregation. Samples were run in isocratic mode with 0.1 M sodium nitrate, pH 7.2 buffer at a flow rate of 1.0 ml / min in a chromatographic column and data were recorded using a PDA detector. After conjugation, a high molecular weight peak appears to the left of the derivatized TT peak, indicating the formation of a PS-TT conjugate (Figure 8).
실시예 6 : 황산 암모늄 침전에 의한 조 접합체로부터 미-반응된(유리) 다당류의 제거.Example 6: Removal of unreacted (free) polysaccharide from coarse conjugate by ammonium sulfate precipitation.
또한, 조 접합체는 단백질 침전법으로 정제하여 유리 또는 미-반응된 다당류를 제거한다. 접합체가 용액으로부터 침전될 때까지 반응 혼합물에 고체 황산 암모늄을 천천히 첨가하여 정제를 수행한다. 침전물은 5000 x g에서 45 분 동안 원심 분리하여 분리한다. 상층액을 버리고, 100 mM NaCl, pH 6.5를 포함하는 50 mM MES 완충제 30 ml에 침전물을 재용해시킨다. In addition, the crude conjugate is purified by protein precipitation to remove free or unreacted polysaccharides. Purification is carried out by slowly adding solid ammonium sulfate to the reaction mixture until the conjugate precipitates out of solution. The precipitate is separated by centrifugation at 5000 x g for 45 minutes. The supernatant is discarded and the precipitate is redissolved in 30 ml of 50 mM MES buffer containing 100 mM NaCl, pH 6.5.
실시예 7 : 접선 유동 여과 (TFF)에 의한 다당류-단백질 접합체의 정제. Example 7: Purification of polysaccharide-protein conjugate by Tangential Flow Filtration (TFF).
황산암모늄 정제 후의 접합체 샘플을 Pall의 300 kDa MWCO 카세트(cassette)를 이용하여 추가로 정제하였다. 이 단계는 접합체로부터 유리 단백질을 제거하고 접합된 PS로부터 유리 PS를 더 분리하는 것을 보장한다. 접합체를 20 x 부피의 MES 완충제, pH 6.5으로 정용여과(diafilter)하고 최종적으로 35 ml의 부피로 농축시킨다. Samples of the conjugate after ammonium sulfate purification were further purified using Pall's 300 kDa MWCO cassette. This step removes the free protein from the conjugate and further separates the free PS from the conjugated PS. The conjugate is diafiltered with 20 x volume of MES buffer, pH 6.5 and finally concentrated to a volume of 35 ml.
따라서, 모든 접합 공정 동안 사용된 시약 잔류물의 제거는 네가지 상이한 당계에서 보장되는데, PS를 위한 제1 단계: 활성화된 PS 침전 단계, 담체 단백질을 위한 제2 단계: GPC 정제 단계, 전체 접합 공정을 위한 제3 단계: 황산 암모늄 침전 및, 제4 단계: 300kDa 정용여과 단계이다. 최종적으로 0.2μ 필터로 추가로 여과하고 2-8 ℃에서 보관한다. Thus, the removal of reagent residues used during all conjugation processes is ensured in four different sugar systems: first step for PS: activated PS precipitation step, second step for carrier protein: GPC purification step, Step 3: Ammonium sulfate precipitation, and Step 4: 300 kDa filtration step. Finally, further filter with 0.2μ filter and store at 2-8 ° C.
실시예 8: MenX-TT 접합체의 특성화:Example 8: Characterization of MenX-TT conjugates:
정제된 접합체를 MenX-TT 접합체에 대하여 인 분석을 통해 총 다당류 함량을 분석한다. 단백질 함량은 로우리 분석법으로 결정한다. 나트륨 데옥시콜레이트 방법(sodium deoxycholate method)을 사용한 침전 방법으로 결정된 유리 다당류 및 상층액을 각각의 비색 분석법으로 분석한다. 다양한 잔류물을 결정하기 위한 상이한 분석법이 제제화를 위해 이를 추가로 사용하기 전에 수행된다. 정제된 접합체는 2 내지 8 ℃에서 저장한다. The purified polysaccharide content is analyzed by phosphorylation of the purified conjugate against the MenX-TT conjugate. Protein content is determined by the Lowry method. The free polysaccharide and supernatant determined by the precipitation method using the sodium deoxycholate method are analyzed by the respective colorimetric assay. Different assays for determining the various residues are carried out before further use thereof for formulation. The purified conjugate is stored at 2-8 [deg.] C.
다양한 품질 파라미터에 대해 분석하였을 때(표 3), 본 발명의 접합체는 0.3 - 0.7 (w/w) 범위의 다당류/단백질 비율를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 유리 다당류의 양은 상이한 접합체에 대해 상이하지만, 모든 유리 다당류는 정제된 접합체에서 10 % 미만이다. 접합 수율 또한 상이한 접합체에 대해 18 % 내지 43 %로 다양하다. 본 발명에서는 20 mg에서 230 mg까지 다양한 접합 규모를 시도한다.When analyzed for various quality parameters (Table 3), the conjugates of the present invention were found to provide polysaccharide / protein ratios in the range of 0.3 - 0.7 (w / w). The amount of free polysaccharide is different for different conjugates, but all free polysaccharides are less than 10% in the purified conjugate. The yield of bonding also varies from 18% to 43% for different conjugates. In the present invention, various bonding scales from 20 mg to 230 mg are tried.
표 3: 상이한 Men X-TT 접합체 로트(lot)의 특성화 Table 3: Characterization of different Men X-TT conjugate lots
실시예 9: 카바메이트 화학에 의해 수득된 Men A, C, Y, W 접합체의 특성화Example 9 Characterization of Men A, C, Y, W Conjugates Obtained by Carbamate Chemistry
Men X와 유사한 방식으로, 본 발명을 이용하여 혈청군 Men A, C, Y 및 W 접합체를 제조하였다. 모든 접합체는 다양한 품질 파라미터에 대해 특징지어졌고 원하는 결과를 제공하는 것으로 나타났다 (표 4).In a manner similar to Men X, serogroups Men A, C, Y and W conjugates were prepared using the present invention. All conjugates were characterized for various quality parameters and appeared to provide the desired results (Table 4).
표 4: 상이한 Men-TT 접합체의 특성화 Table 4 : Characterization of different Men-TT conjugates
실시예 10: MenX-TT 접합체의 안정성:Example 10: Stability of MenX-TT conjugates:
본 발명의 접합체는 28 일 동안 37 ℃의 고온 조건에 노출된다. 생성된 유리 다당류를 모니터링하기 위해 샘플을 7, 14, 21 및 28 일에 꺼냈다. 정의된 카바메이트 화학에 의해 본 실시양태에서 제조된 Men X 접합체의 안정성은 극한의 안정한 접합체를 생성하는 공정에의 적용성을 입증했다(표 5). The conjugate of the present invention is exposed to high temperature conditions of 37 DEG C for 28 days. Samples were taken at 7, 14, 21 and 28 days to monitor the resulting free polysaccharide. The stability of the Men X conjugate prepared in this embodiment by the defined carbamate chemistry proved its applicability to processes producing extreme stable conjugates (Table 5).
표 5: 본 발명의 화학에 의해 제조된 Men X-TT 접합체 로트(lot)에 대한 안정성 데이터 Table 5: Stability data for the Men X-TT conjugate lot prepared by the chemistry of the present invention
실시예 11: MenX 접합체의 면역원성Example 11: Immunogenicity of the MenX conjugate
5-9 주령의 암컷 BALB/c 마우스 8 마리의 군을 1 ㎍ 용량 수준으로 정상 식염수로 제제화된 MenX 접합된 PS 항원의 2 개의 상이한 로트로 0 일, 14 일 및 28 일에 예방 접종하였다(표 6). 모든 예방 접종은 200 ㎕의 백신 희석액을 피하 경로를 통해 투여함으로써 수행된다. 정상 식염수 만이 음성 대조군으로 사용된다. 혈청은 2 회- 및 3 회-투여 후 7-14 일에 수집한다. 특이적인 항-PS IgG 항체 역가(titer)는 2 회 및 3 회-투여 후에 대해 ELISA에 의해 추정한다.Groups of eight 5-9 week old female BALB / c mice were vaccinated at day 0, day 14, and day 28 with two different lots of MenX conjugated PS antigen formulated with normal saline at a dose of 1 [mu] g 6). All vaccinations are performed by subcutaneous administration of 200 μl vaccine diluent. Only normal saline is used as a negative control. Serum is collected two to three times - 7 to 14 days after administration. Specific anti-PS IgG antibody titer is estimated by ELISA for two and three-after-doses.
MenX 접합체에 대한 최대 IgG 역가는 2 회 접종(booster) 후 달성된다. MenX의 경우, 3 회 투여 후 역가 값의 증가는 음성 대조군과 비교하여 Men X 접합체 로트 1에서는 약 100 배, Men X 접합체 로트 2에서는 150 배 증가한 것으로 관찰되었다(표 6).The maximum IgG potency for the MenX conjugate is achieved after two booster doses. In the case of MenX, the increase in the potency value after 3 doses was observed to increase about 100 times in the Men X
표 6: 마우스 모델에서 MenX-TT 제제를 2 회- 및 3 회- 투여 후(3 회-투여 후에 대한 +,- 95% 신뢰 구간(Confidence Interval)) ELISA에 의한 IgG 역가에 대한 기하 평균, 0 일, 14 일 및 28 일에 l ㎍ 항원으로 예방 접종한 후. Table 6: Geometric mean of IgG titers by ELISA +, - 95% Confidence Interval for three times - after two and three doses of the MenX-TT formulation in a mouse model, 0 After vaccination with 1 ㎍ antigen on days, 14 and 28.
실시예 12: MenX 접합체에 대한 혈청 살균 분석법 (SBA)Example 12 Serum Sterilization Assay for MenX Conjugate (SBA)
마우스의 군에 속하는 각 혈청 샘플로부터의 동일한 부피를 함께 모아서 혈청 살균 분석법에 의한 시험을 위한 군 혈청 풀(group sera pool)을 만든다. 분석은 다음과 같이 수행된다:The same volume from each serum sample belonging to the mouse group is collected together to make a group sera pool for testing by serum sterilization assay. The analysis is performed as follows:
단일 콜로니 분리를 위해 엔. 메닌기티디스 혈청군 X 표적 균주를 스트리킹(Streaking)하고, 양 혈액 한천 플레이트(Sheep blood agar plate) 상에 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양한다. 이 균주는 다른 양 혈액 한천 플레이트의 전체 표면에 세포를 퍼뜨려(spreading) 계대 배양(subculture)한 다음 37 ℃, 5% CO2에서 신선한 성장을 위해 배양한다. 박테리아는 ~ 5 ml의 살균 분석 완충제에 재현탁시킨다. 현탁액 OD650는 약 1x105 cfu/ml의 등가 콜로니 수로 조정한다. 혈청을 연속으로 2 배 희석하고 분석 완충제를 대조군 웰(well)에 첨가한다. 10 ㎕의 박테리아 작용 용액 을 모든 웰에 첨가한다. 10 ㎕의 열 비활성화된(56 ℃에서 30 분 보관) 보체(complement)를 모든 비활성 보체 대조군 웰에 첨가하고, 10 ㎕의 상기 비활성화된 보체를 혈청 포함 웰 및 활성 보체 대조군 웰에 첨가한다. 플레이트를 흔들어 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.For single colony separation . Menin giti the X discharge serogroup target strains were streaked (Streaking), and sheep blood agar plates incubated overnight at (Sheep blood agar plate) 37 ℃ on, 5% CO 2. This strain is subcultured by spreading the cells on the entire surface of other blood agar plates and then cultured for fresh growth at 37 ° C, 5% CO 2 . Bacteria are resuspended in ~ 5 ml of bactericidal assay buffer. The suspension OD 650 is adjusted to an equivalent number of colonies of about 1 x 10 5 cfu / ml. Serum is serially diluted 2-fold and assay buffer is added to the control wells. 10 [mu] l of bacterial working solution is added to all wells. 10 [mu] l of heat inactivated (30 min at 56 [deg.] C) complement is added to all inactive complement control wells and 10 [mu] l of the inactivated complement is added to serum containing wells and active complement control wells. The plate is shaken and incubated at 37 DEG C for 1 hour.
배양 후, 각 웰로부터의 10 ㎕를 기울어진 혈액 한천 플레이트에 스폿(spot)한다. 모든 한천 플레이트를 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양한다. 플레이트의 각 지점 에 있는 콜로니의 수를 센다. 보체 대조군과 비교하여 박테리아가 50 % 이상 죽는 것을 보이는 최고 혈청 희석은 그 혈청 샘플의 SBA 역가로 고려된다.After incubation, 10 [mu] l from each well is spotted on a slanted blood agar plate. All agar plates are incubated overnight at 37 ° C, 5% CO 2 . Count the number of colonies at each point on the plate. The supernatant dilution that appears to cause more than 50% bacterial death compared to the complement control is considered in the SBA region of the serum sample.
SBA 데이터는 3 회 투여 후 비히클 예방 접종으로부터의 무시할 수 있는 반응을 나타낸 반면, 시험 중인 Men X 접합체 모든 로트는 비히클 대조군과 비교하여 현저히 높은 SBA 역가를 나타냈는데, 이는 마우스 모델에서 생체 내에서 효과적인 백신임을 나타낸다 (표 7).SBA data showed a negligible response from the vehicle vaccination after 3 doses, whereas all lots of the Men X conjugate under study exhibited significantly higher SBA titers compared to the vehicle control, indicating that in vivo an effective vaccine (Table 7).
표 7: 마우스 모델에서 MenX-TT 제제를 2 회- 및 3 회- 투여 후(3 회-투여 후에 대한 +,- 95% 신뢰 구간) SBA에 대한 기하 평균 역가, 0 일, 14 일 및 28 일에 l ㎍ 항원으로 예방 접종한 후. Table 7: Geometric mean titers for SBA, 0, 14, and 28 days after administration of the MenX-TT formulation twice and three times (+, - 95% confidence interval after 3 doses) After vaccination with l 항 antigen.
Claims (26)
- 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus infiuenzae) 유형 b (Hib), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) (Men), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에( Streptococcus pneumoniae)를 포함하나 이에 제한되지 않는 그람 음성 박테리아(gram negative bacteria)의 군으로부터 수득된 하나 이상의 다당류;
- 하나 이상의 담체 단백질(carrier protein)로 구성되고, 여기서
- 상기 다당류-단백질 접합체는 안정한 카바메이트 결합 -O-(C=O)-N- 을 갖고,
- 상기 접합체의 화학식은 PS-L1-L2-CR이고, 여기서 PS는 다당류이고, L1은 카바메이트 결합이고, L2는 히드라지드(hydrazide) 결합이며 CR은 담체 단백질인, 신규한 다당류-단백질 접합체.
A novel polysaccharide-protein conjugate having high immunogenicity, said polysaccharide-protein conjugate comprising
- the Haemophilus influenzae (Haemophilus infiuenzae) type b (Hib), Ney ceria menin giti disk (Neisseria meningitidis) (Men), streptococcus pneumoniae to one including (Streptococcus pneumoniae) The gram-unrestricted-negative bacteria (gram one or more polysaccharides obtained from the group of negative bacteria;
- consists of one or more carrier proteins, wherein
Said polysaccharide-protein conjugate has a stable carbamate bond -O- (C = O) -N-,
Wherein the formula of the conjugate is PS-L1-L2-CR, wherein PS is a polysaccharide, L1 is a carbamate bond, L2 is a hydrazide bond and CR is a carrier protein.
The method of claim 1, wherein the polysaccharide is preferably Ney ceria menin giti des capsular polysaccharides (capsular polysaccharide), more preferably from serogroup (serogroup) A, a C, Y, W or X Ney ceria menin giti des capsule A novel polysaccharide-protein conjugate, a polysaccharide.
The novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 2, wherein the polysaccharide is a Nacelia meningitidis encapsulated polysaccharide of serogroup X.
The method of claim 1, wherein the carrier protein is selected from but not limited to TT (tetanus toxoid), DT (diphtheria toxoid), CRM197 (non-toxic mutant of DT), OMPV (Outer membrane protein vesicles) ≪ / RTI >
The novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 1, wherein said conjugate is stable and can be used singly or in combination as a vaccine candidate substance.
The novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 1, wherein the conjugate is stable at room temperature.
The novel polysaccharide-protein conjugate of claim 1, wherein the conjugate has a free polysaccharide increment of less than 10.5% when stored at 37 ° C for 28 days.
2. The novel polysaccharide-protein conjugate of claim 1, wherein the high immunogenicity of the conjugate increases from 100 times to 150 times the titer value after three administrations as compared to the negative control.
The conjugate according to claim 1, wherein the conjugate exhibits a serum bactericidal assay titre ranging from 32 to 128 times after two doses compared to vehicle control and from 118 to 198 times after three doses Lt; RTI ID = 0.0 > polysaccharide-protein < / RTI >
(a) 하나 이상의 캡슐형 다당류를 최적 크기 범위로 분해하는 단계,
(b) 단계 (a)의 상기 분해된 다당류를 강한 전해질 염(electrolytic salt)에 용해시키고, 수득되는 혼합물을 소정의 시간 동안 적절하게 혼합시키는 단계로서, 상기 소정의 시간은 30 분 내지 90 분의 범위인 단계,
(c) 동결 건조, 회전 증발 또는 진공 건조를 포함 하나 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 단계 (b)에서 수득된 결과적인 혼합물로부터 수분을 제거하여 건조된 다당류를 수득하는 단계,
(d) 단계 (c)의 건조된 다당류를 하나 이상의 비-수성 비양성자성(aprotic) 용매에 용해시키는 단계,
(e) 단계 (d)의 결과적인 용액을 하나 이상의 무수분(moisture free) 활성제의 소정의 농도와 반응시키는 단계,
(f) 활성화된 다당류인 하나 이상의 링커를 갖는 다당류를 수득하기 위해 소정의 시간 동안 단계 (e)의 결과적인 혼합물을 유지시키는 단계로서, 상기 소정의 시간은 2 시간 내지 3 시간 범위인 단계,
(g) 황산 암모늄 침전(ammonium sulphate precipitation), 정용여과(diafiltration), 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 이들의 조합을 포함 하나 이에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 단계 (f)의 상기 활성화된 다당류를 정제하는 단계,
(h) 단계 (g)의 상기 정제된 활성화된 다당류를 넓은 pH 범위에서 소정의 시간 동안 하나 이상의 내장된(in-built) 링커를 갖는 하나 이상의 활성화된 담체 단백질과 반응시키는 단계로서, 상기 소정의 시간은 2시간 내지 20시간 범위인 단계.
A process for preparing a novel polysaccharide-protein conjugate having high immunogenicity, comprising the steps of:
(a) decomposing one or more capsular polysaccharides to an optimum size range,
(b) dissolving the degraded polysaccharide of step (a) in a strong electrolytic salt and appropriately mixing the resulting mixture for a predetermined period of time, wherein the predetermined period of time is from 30 minutes to 90 minutes Steps in the range,
(c) removing moisture from the resulting mixture obtained in step (b) by known techniques, including, but not limited to, lyophilization, rotary evaporation or vacuum drying to obtain a dried polysaccharide,
(d) dissolving the dried polysaccharide of step (c) in one or more non-aqueous aprotic solvents,
(e) reacting the resulting solution of step (d) with a predetermined concentration of one or more moisture free active agents,
(f) maintaining the resulting mixture of step (e) for a predetermined time to obtain a polysaccharide having at least one linker that is an activated polysaccharide, said predetermined time being in the range of 2 hours to 3 hours,
(g) contacting the activated polysaccharide of step (f) by known methods including, but not limited to, ammonium sulphate precipitation, diafiltration, size exclusion chromatography, and / Purification step,
(h) reacting the purified activated polysaccharide of step (g) with one or more activated carrier proteins having one or more in-built linkers over a wide pH range for a predetermined period of time, Wherein the time ranges from 2 hours to 20 hours.
11. The method of claim 10, wherein the optimal size range of the degraded polysaccharide ranges from a distribution coefficient of 0.38 + 0.06 kD.
The method of claim 10, wherein the non-aqueous aprotic solvent is selected from dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), or dimethylacetamide But is not limited to, a method for producing a novel polysaccharide-protein conjugate.
11. The method of claim 10, wherein the at least one anhydrous water active agent is selected from the group consisting of N, N'-Carbonyl Diimidazole (CDI), N, N'-Disuccinimidyl carbonate (DSC: N , N'-disuccinimidyl carbonate) or N, N'-disuccinimidyl oxalate (DSO: N, N'-Disuccinimidyl oxalate).
11. The method of claim 10, wherein said one or more activated carrier proteins are selected from but not limited to TT (tetanus toxoid), DT (diphtheria toxoid), CRM197 (a non-toxic mutant of DT), OMPV ≪ / RTI >
11. The method of claim 10, wherein the predetermined concentration of the one or more anhydrous water active agents is in the range of greater than 5 to 50, preferably greater than 30 moles.
11. The method of claim 10, wherein the wide pH range is from pH 6 to pH 10.
11. The method of claim 10, wherein the polysaccharide-protein conjugate has a stable carbamate bond -O- (C = O) -N-.
The method of claim 10, wherein the process produces a conjugate of the formula PS-Ll-L2-CR wherein PS is a polysaccharide, Ll is a carbamate bond, L2 is a hydrazide bond and CR is a carrier protein. Wherein the polysaccharide-protein conjugate is a polysaccharide-protein conjugate.
11. The method of claim 10, wherein the at least one linker on the activated polysaccharide is a carbamate.
11. The method of claim 10, wherein the at least one linker on the activated carrier protein is hydrazide.
11. The method of claim 10, wherein the degraded and activated polysaccharide and the activated carrier protein are present in a ratio of from 0.5: 1 to 1: 0.5 w / w in a buffer of pH 7.0-10.0, preferably pH 9.0, More preferably 1: 1 w / w, based on the total weight of the polysaccharide-protein conjugate.
22. The method of claim 21, wherein the buffer is selected from, but not limited to, carbonate buffer, borate buffer.
11. The method of claim 10, wherein the polysaccharide / protein ratio in the conjugate is in the range of 0.3 to 1.0 (w / w).
11. The method of claim 10, wherein the conjugate has less than 10% free polysaccharide in the purified conjugate.
The process for producing a novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 10, wherein the yield of the conjugate obtained by the step of conjugation is not more than 60%.
11. The process for producing a novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 10, wherein the average yield of the conjugate obtained by said joining step is 30 5%.
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