KR102428253B1 - Novel polysaccharide-protein conjugate and method for preparing same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 다당류-단백질 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 진단 도구 뿐만 아니라 1가 백신(monovalent vaccine) 또는 다가 조합 백신(multivalent combination vaccine)의 생산에도 사용될 수 있는, 카바메이트 화학을 사용하여 제조된 다당류-단백질 접합체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카바메이트 화학을 이용한 네이세리아 메닌기티디스 혈청군 X, A, C, Y 및 W135 다당류-담체 단백질 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a novel polysaccharide-protein conjugate and a method for preparing the same. More specifically, the present invention relates to a polysaccharide-protein conjugate prepared using carbamate chemistry, which can be used not only as a diagnostic tool but also in the production of monovalent vaccines or multivalent combination vaccines. More specifically, the present invention relates to Neisseria meningitidis serogroup X, A, C, Y and W135 polysaccharide-carrier protein conjugates using carbamate chemistry and a method for preparing the same.

Description

신규한 다당류-단백질 접합체 및 이의 제조방법Novel polysaccharide-protein conjugate and method for preparing same

본 발명은 신규한 다당류-단백질 접합체(polysaccharide-protein conjugates) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 진단 도구 뿐만 아니라 1가 백신(monovalent vaccine) 또는 다가 조합 백신(multivalent combination vaccines)의 제조에도 사용될 수 있는, 카바메이트(carbamate) 화학을 사용하여 제조된 다당류-단백질 접합체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카바메이트 화학을 이용한 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 혈청군(serogroup) X, A, C, Y 및 W135 다당류-담체 단백질(carrier protein) 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to novel polysaccharide-protein conjugates and a method for preparing the same. More specifically, the present invention relates to a polysaccharide-protein conjugate prepared using carbamate chemistry, which can be used not only as a diagnostic tool but also in the preparation of monovalent vaccines or multivalent combination vaccines. is about More specifically, the present invention relates to a Neisseria meningitidis serogroup X, A, C, Y and W135 polysaccharide-carrier protein conjugate using carbamate chemistry and a method for preparing the same .

엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) (수막구균: meningococcus)는 혈청학적으로 A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y 및 Z의 13 가지 혈청군으로 주로 분류된 호기성 그람 음성(gram-negative) 박테리아이다. 군화 시스템(grouping system)은 유기체(organism)의 캡슐형 다당류(capsular polysaccharide)를 기본으로 한다. WHO 공식 웹 사이트는 엔. 메닌기티디스가 세계적으로 박테리아 수막염(bacterial meningitis)의 가장 흔한 원인 중 하나이고, 수막염의 큰 전염병(epidemics)을 일으킬 수 있는 유일한 박테리아라고 언급한다. 특히, 사하라 사막 이남의 아프리카 지역에서 10 만명 당 1000 건까지의 발생률을 보이는 폭발적인 전염병이 보고되었다. n. N. meningitidis (meningococcus ) is serologically classified mainly into 13 serogroups: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y and Z. aerobic gram-negative bacteria. The grouping system is based on the capsular polysaccharide of the organism. The WHO official website is the yen. Meningitidis is one of the most common causes of bacterial meningitis worldwide and is said to be the only bacterium capable of causing major epidemics of meningitis. In particular, explosive epidemics with an incidence of up to 1,000 cases per 100,000 people have been reported in sub-Saharan Africa.

엔. 메닌기티디스는 에어로졸에 의해 전달되거나 환자 또는 건강한 사람 운반체의 호흡기 분비물과의 직접 접촉에 의해 전달된다. 일반적으로, 풍토병(endemic disease)은 어린이와 청소년에서 주로 발생하며 3 개월에서 12 개월 사이의 유아에서 가장 높은 발병률을 보인 반면, 전염병에서는 나이가 많은 어린이와 젊은 성인이 더 많이 관여될 수 있다. 그러나 수막구균성 질병(meningococcal disease)의 급속한 진행은 종종 발병후 1-2일 이내에 사망을 초래한다. 엔. 메닌기티디스 감염은 백신 접종으로 예방할 수 있다. n. Meningitidis is delivered by aerosol or by direct contact with respiratory secretions from a patient or healthy human carrier. In general, endemic disease occurs predominantly in children and adolescents and has the highest incidence in infants between 3 and 12 months of age, whereas in infectious diseases older children and young adults may be more involved. However, the rapid progression of meningococcal disease often results in death within 1-2 days of onset. n. Meningitidis Infection can be prevented by vaccination.

헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus infiuenzae) 유형 b는 주로 어린이에게서 수막염 및 급성 호흡기 감염을 일으키는 그람 음성 박테리아이다. WHO 공식 웹 사이트는 선진국 및 개발도상국 모두에서 소아에서 비-전염성(non-epidemic) 수막염의 중요한 원인이며, 항생제가 신속하게 투여되더라도 심각한 신경학적 비명(neurological squeal)과 관련이 있다고 언급한다. Haemophilus infiuenzae type b is a gram-negative bacterium that mainly causes meningitis and acute respiratory infections in children. The official WHO website states that it is an important cause of non-epidemic meningitis in children in both developed and developing countries, and is associated with severe neurological squeal even when antibiotics are administered rapidly.

헤모필루스 인플루엔자에 감염은 감염된 (반드시 증상이 있는 것은 아니지만) 사람의 소적(droplet)에 의해 전염된다. 에이치. 인플루엔자에(H. infiuenzae) 유형 b 감염은 백신 접종으로 예방할 수 있다. Haemophilus influenzae infection is transmitted by droplets from an infected (but not necessarily asymptomatic) person. eh. H. infiuenzae type b infection can be prevented by vaccination.

수막구균성 질병의 대부분은 A, B, C, Y, W135 및 X의 6 가지 혈청군에 의해 유발된다. 역사적으로, 수막염 벨트(meningitis belt)에서 사례의 대부분은 혈청군 A 수막구균(meningococci)에서 기인한다. 혈청군 C 수막구균은 1980년대 수막염 벨트에서 발병(outbreak)에 책임이 있고, 2015 년에는 니제르(Niger)에서도 새로운 발병이 있었던 반면, 2000 년 이후 혈청군 W (이전의 W-135)가 유행성 수막염의 원인으로 등장하였다. 혈청군 Y의 유행(prevalence)은 아프리카에서는 최소이다; 그러나, 상기 혈청군은 남아메리카 수막염 사례에서 더 분명하다. NCBI의 한 간행물에 따르면, 혈청군 X 수막구균은 산발성(sporadic) 수막염의 드문 원인으로 고려되어졌지만, 2006-2010년에는 니제르, 우간다, 케냐, 토고 및 부르키나 파소(Burkina Faso)에서 혈청군 X 수막염의 발병이 발생했으며, 후자는 6732 건의 보고된 사례 중 1300 건 이상의 혈청군 X 수막염의 사례가 발생했다. The majority of meningococcal diseases are caused by six serogroups: A, B, C, Y, W135 and X. Historically, the majority of cases in the meningitis belt are due to serogroup A meningococci. Serogroup C meningococcus was responsible for the outbreak in the meningitis belt in the 1980s and there was also a new outbreak in Niger in 2015, whereas serogroup W (formerly W-135) has been the cause of epidemic meningitis since 2000. appeared as The prevalence of serogroup Y is minimal in Africa; However, this serogroup is more pronounced in South American meningitis cases. According to a publication by the NCBI, serogroup X meningococci were considered a rare cause of sporadic meningitis, but in 2006-2010 there were reports of serogroup X meningitis in Niger, Uganda, Kenya, Togo and Burkina Faso. outbreaks have occurred, the latter having more than 1300 cases of serogroup X meningitis out of 6732 reported cases.

또 다른 NCBI 간행물에 따르면, 2006-2009 년 동안 토고에서 혈청군 X 수막구균이 702 개의 확인된 박테리아 수막염 사례의 16 %를 차지했다. 코자(Kozah) 지역은 2007 년 3 월에 혈청군 X 수막구균 발병을 경험하였는데, 혈청군 X 수막구균의 계절 누적 발병률은 33/100,000 이었다. 2007-2010 년 동안 부르키나 파소에서, 혈청군 X 수막구균은 778 개의 확인된 박테리아 수막염 사례의 7 %를 차지했으며, 2009 년에서 2010 년까지 증가했다(각각, 확인된 모든 사례의 4 % 내지 35 %). 2010 년에, 혈청군 X 수막구균 전염병은 부르키나 파소의 북부 및 중부 지역에서 발생하였고; 혈청군 X 수막구균의 가장 높은 지역 누적 발생은 3 월 ~ 4 월 동안 130/100,000으로 추정되었다.According to another NCBI publication, serogroup X meningococci accounted for 16% of 702 confirmed bacterial meningitis cases in Togo during 2006-2009. The Kozah region experienced a serogroup X meningococcal outbreak in March 2007, with a seasonal cumulative incidence of 33/100,000 serogroup X meningococcal. In Burkina Faso during 2007-2010, serogroup X meningococci accounted for 7% of 778 confirmed bacterial meningitis cases and increased from 2009 to 2010 (4% to 35% of all confirmed cases, respectively, respectively) ). In 2010, a serogroup X meningococcal epidemic occurred in the northern and central regions of Burkina Faso; The highest regional cumulative incidence of serogroup X meningococci was estimated at 130/100,000 during March-April.

위의 사실을 바탕으로, 5가(pentavalent) ACYWX 다당류- 단백질 접합체 백신은 혈청군 B를 제외하고 수막구균성 질병에 대하여 더 광범위한 적용범위(coverage)를 제공할 수 있다. 예방 접종(immunization)은 수막구균성 질병을 조절하는 유일한 합리적인 접근법이다. 현재, 혈청군 A, C, Y 및 W135 다당류 접합체를 포함하는 다양한 1가 또는 다가 백신은 시장에서 판매 허가를 받았으나, 혈청군 X 수막구균에 대해서는 허가된 백신이 이용가능하지 않다. 혈청군 X 다당류 단백질 접합체는 공중 보건 필요성이 있는 경우 다가 수막구균성 접합체 백신 개발에 대한 새로운 추가 품목이 될 것이다.Based on the above facts, the pentavalent ACYWX polysaccharide-protein conjugate vaccine can provide broader coverage against meningococcal disease except for serogroup B. Immunization is the only reasonable approach to controlling meningococcal disease. Currently, a variety of monovalent or polyvalent vaccines, including serogroups A, C, Y and W135 polysaccharide conjugates, are licensed for marketing in the market, but no licensed vaccines are available against serogroup X meningococci. Serogroup X polysaccharide protein conjugates will be a new addition to the development of multivalent meningococcal conjugate vaccines when there is a public health need.

몇몇 연구는 당류 잔기(moiety)의 크기가 접합체 백신의 면역원성(imm unogenicity)에 영향을 미칠 수 있다고 제안한다. 덱스트란-단백질 접합체의 면역 원성에 대한 초기 연구에서 닭 혈청 알부민(chicken serum albumin)에 접합된 저 분자량 덱스트란은 마우스에서 강한 항-덱스트란 반응을 유도하는 반면, 덱스트란 크기를 증가시키면 면역원성이 감소한다는 것을 발견했다. 라페리에르(Laferriere) 등은 마우스에서 폐렴구균(pneumococcal) 접합체 백신의 면역원성에 대한 탄수화물 사슬 길이의 영향을 거의 발견하지 못했다. 이 연구들은 다당류 사슬 길이와 접합체 백신의 면역원성 사이에 명확한 상관 관계가 없음을 시사한다. 그러나, 라나(Rana) 등은 면역원성 Hib 다당류 접합체 백신을 개발하기 위한 최적의 당류 사슬 길이를 확립하는 것이 중요하다는 것을 발견했다.Several studies suggest that the size of the saccharide moiety may affect the immunogenicity of the conjugate vaccine. In early studies of the immunogenicity of dextran-protein conjugates, low molecular weight dextran conjugated to chicken serum albumin induced a strong anti-dextran response in mice, whereas increasing dextran size resulted in immunogenicity. was found to decrease. Laferriere et al. found little effect of carbohydrate chain length on the immunogenicity of pneumococcal conjugate vaccines in mice. These studies suggest that there is no clear correlation between polysaccharide chain length and immunogenicity of the conjugate vaccine. However, Rana et al. found it important to establish an optimal saccharide chain length for developing immunogenic Hib polysaccharide conjugate vaccines.

다당류와 CDI의 반응은 여러 참고문헌에 나타나 있다. 특히 바람직한 시약인 카르보닐디이미다졸(Carbonyldiimidazole)은 히드록실기과 반응하여 다당류의 이미 다졸일우레탄(imidazolylurethane)을 형성하고, 예를 들어 니트로페닐-클로로포르메이트(nitrophenyl-chloroformate)를 포함하는 아릴 클로로포르메이트(aryl chloroformate)와 반응하여 다당류의 혼합 카보네이트(mixed carbonate)를 생성한다. 각각의 경우에, 결과적인 활성화된 다당류는 아민과 같은 친핵성 시약에 매우 민감하여 각각의 우레탄으로 변형된다.The reaction of polysaccharides with CDI is described in several references. Carbonyldiimidazole, a particularly preferred reagent, reacts with a hydroxyl group to form imidazolylurethane of polysaccharide, for example, nitrophenyl-chloroformate containing aryl chloroformate (nitrophenyl-chloroformate) It reacts with formate (aryl chloroformate) to form a mixed carbonate of polysaccharide. In each case, the resulting activated polysaccharide is highly sensitive to nucleophilic reagents such as amines and is transformed into the respective urethane.

임의의 접합 화학에 있어서 다당류 구조는 매우 중요한 역할을 한다. 임의의 다당류를 담체(carrier) 단백질에 접합시키기 위한 선택의 화학은 그 다당류 상의 이용가능한 작용기에 의존한다. 일부 다당류는 접합에 편리하게 이용될 수 있는 화학기(예: 아민, 카르복실 또는 알데히드)를 포함하지만, 많은 것들은 단백질에 커플링되기 전에 활성화 및 유도체화가 필요하다. 문헌에서 명백한 바와 같이, 다당류 단백질 접합체 백신은 링커를 갖거나 갖지않고 제조될 수 있으며, 여기서 링커는 다당류의 일부이거나 담체 단백질에 부착될 수 있다. The polysaccharide structure plays a very important role in any conjugation chemistry. The chemistry of choice for conjugating any polysaccharide to a carrier protein depends on the available functional groups on that polysaccharide. While some polysaccharides contain chemical groups (eg, amines, carboxyls or aldehydes) that can be conveniently used for conjugation, many require activation and derivatization before coupling to proteins. As is clear from the literature, a polysaccharide protein conjugate vaccine can be prepared with or without a linker, wherein the linker may be part of the polysaccharide or may be attached to a carrier protein.

현재의 기술은 미국 특허 출원 번호 US2015/0044253 호와 같은 문헌에서 네이세리아 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, W 및 Y를 포함하는 다양한 혈청군의 치료를 위한 백신을 개시하는데, 상기 문헌은 담체 단백질에 접합된, 에이치. 인플루엔자에 혈청유형(serotype) B (Hib), 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, W, Y 로부터 수득한 당류 단편을 포함하는 면역원성 조성물을 개시한다. 그러나, US2015/0044253에서 카바메이트(carbamate) 링커는 담체 단백질의 아미노기에 직접 결합하여 낮은 접합효율을 초래한다. Current technology discloses vaccines for the treatment of various serogroups, including Neisseria meningitidis serogroups A, B, C, W and Y, in documents such as US Patent Application No. US2015/0044253, which includes carrier proteins Spliced on, H. Influenza serotype B (Hib), N. An immunogenic composition comprising saccharide fragments obtained from meningitidis serogroups A, B, C, W, Y is disclosed. However, in US2015/0044253, the carbamate linker directly binds to the amino group of the carrier protein, resulting in low conjugation efficiency.

WO2004/019992는 또한 변형된 캡슐형 당류(capsular saccharide) 및, 환원성 아민화(reductive amination)에 의해 수득된 엔. 메닌기티디스 혈청군 A의 당류 단백질 접합체를 개시하지만, 이 출원은 혈청군 A에 대해서만 언급하고 있다.WO2004/019992 also discloses modified capsular saccharides and enes obtained by reductive amination . Although the saccharide protein conjugates of meningitidis serogroup A are disclosed, this application only refers to serogroup A.

환원성 아민화 접합 화학에 의해 수득된 엔. 메닌기티디스 혈청군 X의 접합체를 개시하는 WO2013/174832와 같은 엔. 메닌기티디스 혈청군 X에 대하여 이용할 수 있는 몇몇 개시가 있다. N obtained by reductive amination conjugation chemistry . N such as WO2013 /174832 disclosing conjugates of meningitidis serogroup X. There are several disclosures available for meningitidis serogroup X.

현존하는 종래 기술 개시의 주요 단점은 카바메이트 화학을 이용하는 선행 기술 중 어느 것도 접합 공정을 용이하게 하기위해 다당류의 유기 용매로의 용해를 개시하고 있지 않는다는 것이다. 현재 이용 가능한 접합체는 안정성(stability) 문제로 고통받는다. 보다 구체적으로, 엔. 메닌기티디스 혈청군 X에 대한 안정하고 상업적으로 가능한 접합체는 이용가능하지 않다.A major drawback of the existing prior art disclosures is that none of the prior art using carbamate chemistry discloses the dissolution of polysaccharides into organic solvents to facilitate the conjugation process. Currently available conjugates suffer from stability issues. More specifically, N. Stable and commercially available conjugates to meningitidis serogroup X are not available.

발명의 목적purpose of the invention

현존하는 종래 기술의 단점을 제거하기 위해, 본 발명의 주요 목적은 신규한 다당류-단백질 접합체를 제공하는 것이다.In order to eliminate the disadvantages of the existing prior art, the main object of the present invention is to provide novel polysaccharide-protein conjugates.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 접합체 백신의 제조에 사용될 수 있는 안정한 다당류-단백질 접합체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide stable polysaccharide-protein conjugates that can be used for the preparation of novel conjugate vaccines.

본 발명의 또 다른 목적은 현재 허가된 백신에 의해 예방되는 수막구균성 질병 발병의 더 높은 적용 범위를 확대시키기 위한 엔. 메닌기티디스 혈청군 X 다당류-담체 단백질 접합체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to expand the higher coverage of meningococcal disease outbreaks prevented by currently licensed vaccines . To provide a meningitidis serogroup X polysaccharide-carrier protein conjugate.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing the novel polysaccharide-protein conjugate.

본 발명의 또 다른 목적은 카바메이트 화학을 이용하여 상기 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing the novel polysaccharide-protein conjugate using carbamate chemistry.

본 발명의 또 다른 목적은 비-수성 비양성자성 용매(non-aqueous aprotic solvent)에서 다당류를 신속하게 가용화(solubilization)시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for rapidly solubilizing polysaccharides in a non-aqueous aprotic solvent.

본 발명의 또 다른 목적은 더 넓은 pH 범위에서 접합 반응을 수행하는 것이다.Another object of the present invention is to carry out the conjugation reaction in a wider pH range.

본 발명의 또 다른 목적은 고 수율로 매우 짧은 시간 범위에서 접합 공정을 완료하는 것이다.Another object of the present invention is to complete the bonding process in a very short time span with high yield.

본 발명의 또 다른 목적은 백신 및 진단 도구로서 이용될 수 있는 높은 면역 원성을 갖는 신규한 다당류-단백질 접합체를 수득하는 것이다.Another object of the present invention is to obtain novel polysaccharide-protein conjugates with high immunogenicity that can be used as vaccines and diagnostic tools.

발명의 요약Summary of the invention

따라서, 본 발명은 신규한 다당류-단백질 접합체 및 이의 제조방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 접합체 백신의 제조를 위하여 카바메이트 화학에 의한 다당류-단백질 접합체를 수득하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카바메이트 화학을 이용하는, 엔. 메닌기티디스 혈청군 X, A, C, Y 및 W135 다당류-담체 단백질 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.Accordingly, the present invention provides a novel polysaccharide-protein conjugate and a method for preparing the same. More particularly, the present invention relates to obtaining polysaccharide-protein conjugates by carbamate chemistry for the preparation of novel conjugate vaccines. More specifically, the present invention utilizes carbamate chemistry, N. Meningitidis serogroup X, A, C, Y and W135 polysaccharide-carrier protein conjugates and a method for preparing the same.

본 발명은 접합 공정에 관한 것으로, 여기서 캡슐형 다당류(capsular polysaccharide)가 담체 단백질과의 접합에 적합한 더 작은 크기로 분해되어 더 높은 항원성(antigenicity)을 갖는 접합체를 수득한다.The present invention relates to a conjugation process, wherein a capsular polysaccharide is degraded into a smaller size suitable for conjugation with a carrier protein to obtain a conjugate with higher antigenicity.

담체 단백질은 TT (파상풍 톡소이드: tetanus toxoid), DT (디프테리아 톡소이드: Diphtheria toxoid), CRM197 (DT의 비-독성 돌연변이체), OMPV (외막 단백질 소낭: Outer membrane protein vesicles) 또는 다른 적합한 담체 단백질로부터 선택된다. 다당류 단편은 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b (Hib), 네이세리아 메닌기티디스 (Men), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)를 포함하나 이에 제한되지 않는 그람 음성 박테리아 군으로부터 수득된다. The carrier protein is selected from TT (tetanus toxoid), DT (Diphtheria toxoid), CRM197 (non-toxic mutant of DT), OMPV (Outer membrane protein vesicles) or other suitable carrier protein. do. Polysaccharide fragments are Haemophilus influenzae type b ( Hib ), Neisseria meningitidis ( Men ), Streptococcus pneumoniae ( Streptococcus pneumoniae) obtained from a group of gram-negative bacteria, including but not limited to.

네이세리아 메닌기티디스 캡슐형 다당류, 보다 바람직하게는 Men A, C, Y, W 또는 X 캡슐형 다당류의 접합 공정은 분해된다. 이러한 분해는 선행 기술에서 이용 가능한 몇 가지 기술을 이용하여 수행된다. 보다 바람직하게는, 분해는 실험실 규모에서 프로브 초음파 처리(probe sonication) 및/또는 울트라-초음파 처리(ultra-sonication)에 의해 수행되고, 더 큰 규모에서 마이크로 유동화기(micro fluidizer)에 의해 수행된다. 천연 엔. 메닌기티디스 캡슐형 다당류는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 상에서 겔-투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 측정된 바와 같이 0.38 + 0.06 Kd의 분포 계수의 크기 범위에서 분해된다.The conjugation process of Neisseria meningitidis capsular polysaccharides, more preferably Men A, C, Y, W or X capsular polysaccharides, is degraded. This decomposition is performed using several techniques available in the prior art. More preferably, the digestion is carried out by probe sonication and/or ultra-sonication on a laboratory scale, and on a larger scale by a micro fluidizer. natural yen. Meningitidis capsular polysaccharides are degraded in the size range of the distribution coefficient of 0.38 + 0.06 Kd as measured by gel-permeation chromatography (GPC) on high performance liquid chromatography (HPLC).

분해 공정 후, 상기 분해된 다당류는 리튬 할라이드(Lithium halide), 염화 리튬(Lithium chloride) 및 4차 암모늄 할라이드 수화물(Quaternary ammonium halide hydrate)을 포함하나 이에 제한되지 않는, 카운터 이온(counter ion) 교환 용의 강한 전해질 염(electrolytic salt)에 용해된다. 용액은 60 ± 30 분 동안 적절하게 혼합되도록 한다. 결과적인 캡슐형 다당류로부터 회전-증발과 같은 임의의 건조 기술에 의해 수분이 제거된다. 이어서, 건조된 캡슐형 다당류를 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO), 디메틸 포름아미드(DMF), N-메틸 피롤리돈(NMP: N-Methyl pyrrolidone) 또는 디메틸 아세트아미드를 포함하나 이에 제한되지 않는 비-수성 비양성자성 용매에 용해시킨다. 비-수성 비양성자성 용매 중의 상기 분해 및 건조된 캡슐형 다당류는 5 내지 50 몰 초과 농도의, N,N'-카르보닐 디 이미다졸(CDI: N,N'-Carbonyl Di imidazole), N,N'-디-숙신이미딜 카보네이트(DSC: N,N'-Di-succinimidyl carbonate) 또는 N,N'-디-숙신이미딜 옥살레이트(DSO: N,N'-Di-succinimidyl oxalate)를 포함하나 이에 제한되지 않는 무수분(moisture free) 활성제와 반응시키고, 혼합물을 4-디메틸아미노피리딘(DMAP: 4-dimethylaminopyridine) 또는 피리딘의 존재하에 소정의 시간 동안 유지하여 반응을 완결시킨다.After the decomposition process, the decomposed polysaccharides include, but are not limited to, lithium halide, lithium chloride, and quaternary ammonium halide hydrate, for counter ion exchange soluble in strong electrolytic salts of The solution is allowed to mix properly for 60 ± 30 minutes. Moisture is removed from the resulting capsular polysaccharide by any drying technique such as rotary-evaporation. The dried capsular polysaccharide is then subjected to non-non-limiting examples including, but not limited to, anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl formamide (DMF), N-methyl pyrrolidone (NMP: N-Methyl pyrrolidone) or dimethyl acetamide. Dissolve in an aqueous aprotic solvent. The decomposed and dried capsular polysaccharide in a non-aqueous aprotic solvent contains a concentration of 5 to 50 molar excess of N,N'-Carbonyl Di imidazole (CDI: N,N'-Carbonyl Di imidazole), N, Contains N'-di-succinimidyl carbonate (DSC: N,N'-Di-succinimidyl carbonate) or N,N'-di-succinimidyl oxalate (DSO: N,N'-Di-succinimidyl oxalate) However, the reaction is completed by reacting with a moisture free activator, but not limited thereto, and maintaining the mixture in the presence of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) or pyridine for a predetermined time.

수득되는 활성화된 캡슐형 다당류는 이러한 다당류를 과량의, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, n-부틸 아세테이트 또는 이들의 상이한 비율의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 저극성(low polarity) 용매에 침전시켜 정제하고, 침전된 다당류를 수성 완충 식염수에 용해시켜 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 수득한다.The resulting activated capsular polysaccharide is purified by precipitation of such polysaccharide in an excess of, low polarity solvent including, but not limited to, ethyl acetate, dichloromethane, n-butyl acetate or mixtures of different ratios thereof; , the precipitated polysaccharide is dissolved in aqueous buffered saline to obtain purified activated capsular polysaccharide.

이렇게 수득한 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 활성화된 담체 단백질을 갖는 수성 완충제(aqueous buffer)에 용해시킨다. 활성화된 담체 단백질은 카보히드라 지드 표지된(Carbohydrazide labelled) 또는 ADH 표지된 또는 히드라진(Hydrazine)표지된 것일 수 있다.The purified activated capsular polysaccharide thus obtained is dissolved in an aqueous buffer having an activated carrier protein. The activated carrier protein may be Carbohydrazide labeled or ADH labeled or Hydrazine labeled.

정제된 활성화된 캡슐형 다당류 및 활성화된 담체 단백질의 용액을, 상기 다당류가 CDI 활성화, DSC 활성화 또는 DSO 활성화 되었는지 여부에 따라 상이한 pH 범위에서 소정 시간, 바람직하게는 15 ± 5 시간 동안 실온에서 혼합되도록 한다. CDI 활성화된 다당류의 pH 범위는 8-10 인 반면, DSC 활성화 또는 DSO 활성화된 다당류의 pH 범위는 6-9 이다. 이 반응 동안, 단백질상의 히드라지드 잔기의 아민 및 활성화된 다당류상의 카바메이트 또는 카보네이트(carbonate) 잔기의 -N- 함유 방향족 잔기가 반응하여 안정한 카바메이트 결합 -0-(C=O)-N-을 갖는 다당류-단백질 접합체가 형성된다. 따라서 화학식 PS-L1-L2-CR의 최종 접합체가 제조되는데, 여기서 PS는 다당류이고, L1은 카바메이트 결합이고, L2는 히드라지드 결합이며, CR은 담체 단백질이다. 정제된 접합체는 한외여과(ultrafiltration), 황산 암모늄 침전(ammonium sulphate precipitation), 겔 투과 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는 정제 공정에 의해 수득된다.A solution of purified activated capsular polysaccharide and activated carrier protein is mixed at room temperature for a predetermined time, preferably 15 ± 5 hours, at different pH ranges depending on whether the polysaccharide is CDI activated, DSC activated or DSO activated. do. The pH range of CDI-activated polysaccharides is 8-10, whereas the pH range of DSC-activated or DSO-activated polysaccharides is 6-9. During this reaction, the amine of the hydrazide moiety on the protein and the -N- containing aromatic moiety of the carbamate or carbonate moiety on the activated polysaccharide react to form a stable carbamate bond -0-(C=O)-N- A polysaccharide-protein conjugate with A final conjugate of formula PS-L1-L2-CR is thus prepared, wherein PS is a polysaccharide, L1 is a carbamate bond, L2 is a hydrazide bond, and CR is a carrier protein. Purified conjugates are obtained by purification processes including, but not limited to, ultrafiltration, ammonium sulphate precipitation, and gel permeation chromatography.

본 발명은 또한 바람직하게는 카바메이트인 하나의 링커(linker)를 다당류에 부착시키고, 바람직하게는 히드라진인 제2 링커를 담체 단백질에 부착시킨 다음, 활성화된 다당류와 별도의 링커를 갖는 활성화된 단백질을 반응시켜 접합체를 생성하는 것을 개시한다.The present invention also relates to an activated protein having one linker, preferably a carbamate, attached to the polysaccharide, and a second linker, preferably hydrazine, attached to a carrier protein, followed by a linker separate from the activated polysaccharide. react to form a conjugate.

본 발명의 개선된 접합 공정은 더 짧은 시간 범위에서 완료되며 넓은 작용 범위의 pH에서 더 안정한 공유 결합의 접합체를 생산한다. 본 발명의 신규한 다당류-단백질 접합체는 더 높은 안정성, 고 수율 및 높은 면역원성을 나타낸다.The improved conjugation process of the present invention is completed in a shorter time span and produces more stable covalently bonded conjugates over a wide working range of pH. The novel polysaccharide-protein conjugates of the present invention exhibit higher stability, higher yield and higher immunogenicity.

본 발명은 또한 비-수성 비양성자성 용매에 다당류를 용해시키는 방법을 개시하는데, 이는 다당류와 카바메이트 형성제(forming agent) 사이의 접합 반응을 촉진시켜 더 짧은 시간 범위에서 접합 공정을 완료한다. The present invention also discloses a method of dissolving a polysaccharide in a non-aqueous aprotic solvent, which accelerates the conjugation reaction between the polysaccharide and the carbamate forming agent to complete the conjugation process in a shorter time span.

본 발명의 개선된 공정의 가장 중요한 결과는 백신 또는 진단 도구로서 사용될 수 있는 신규한 다당류-단백질 접합체를 제공하는 것이다. 상기 신규한 다당류-단백질 접합체는 특이적이고 동종의 면역 반응을 유도하며, 따라서 진단 도구 뿐만 아니라 1가 백신 또는 다가 조합 백신의 제조에도 유용하다.The most important result of the improved process of the present invention is to provide novel polysaccharide-protein conjugates that can be used as vaccines or diagnostic tools. The novel polysaccharide-protein conjugate induces a specific and homogeneous immune response, and is therefore useful not only as a diagnostic tool but also in the preparation of monovalent or multivalent combination vaccines.

도 1은 EDC (카르보디이미드:carbodiimide) 가교 결합 반응 도식(cross-linking reaction scheme)을 나타낸다(R-NH2는 히드라진(H2N-NH2) 또는 아디프산디히드라지드(ADH: Adipic Acid Dihydrazide) (NH2NHCO(CH2)4CONHNH2).
도 2는 Men X 캡슐형 다당류의 단량체(monomer) 단위- 화학 구조를 나타낸다.
도 3은 유속 1 ml/min의 TSK겔 PWXL5000 - PWXL4000 컬럼에서 용출 부피를 보여주고, 공극 부피, 총 부피 및 샘플 용출 부피를 보여주는 HPLC-SEC 프로파일을 나타낸다.
도 4는 천연 MenX 다당류 및 크기화된(sized) 다당류의 HPLC-SEC 프로파일 비교를 나타낸다.
도 5는 히드라진 유도체화된 TT 및 천연 TT의 HPLC-SEC 프로파일 비교를 나타낸다.
도 6은 세파덱스 G25 상에서 히드라지드 유도체화된 TT의 정제를 보여주는 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 완전한 카바메이트 접합 도식을 나타낸다.
도 8은 히드라진 유도체화된 TT 및 조(crude) Men X 접합체의 HPLC-SEC 프로파일 비교를 나타낸다.1 shows an EDC (carbodiimide) cross-linking reaction scheme (R-NH 2 is hydrazine (H 2 N-NH 2 ) or adipic acid dihydrazide (ADH: Adipic Acid) Dihydrazide) (NH 2 NHCO(CH 2 ) 4 CONHNH 2 ).
2 shows the monomer unit-chemical structure of Men X capsular polysaccharide.
Figure 3 shows the elution volume on a TSK gel PWXL5000 - PWXL4000 column at a flow rate of 1 ml/min, and an HPLC-SEC profile showing the pore volume, total volume and sample elution volume.
4 shows a comparison of HPLC-SEC profiles of native MenX polysaccharides and sized polysaccharides.
Figure 5 shows a comparison of HPLC-SEC profiles of hydrazine derivatized TT and native TT.
6 shows a chromatogram showing the purification of hydrazide derivatized TT on Sephadex G25.
7 shows a complete carbamate bonding scheme.
8 shows a comparison of HPLC-SEC profiles of hydrazine derivatized TT and crude Men X conjugates.

삽화 및 실시예와 함께 발명의 상세한 설명DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION WITH ILLUSTRA TIONS AND EXAMPLES

본 발명은 신규한 다당류-단백질 접합체 및 이의 제조방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 카바메이트 화학에 의해 화학적으로 안정한 다당류-단백질 접합체를 수득하는 것에 관한 것이다. 다당류 단편은 헤모필루스 인플루엔자에 유형 b (Hib), 네이세리아 메닌기티디스 (Men), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 보다 바람직하게는 엔. 메닌기티디스 혈청군 Men A, C, Y, W 및 바람직하게는 Men X를 포함하나 이에 제한되지 않는 그람 음성 박테리아 군으로부터 수득된다. 본 발명은 또한 단독으로 또는 조합으로 백신으로 사용될 수 있거나 진단 도구로서 사용될 수 있는, 높은 면역원성을 갖는 신규한 다당류-단백질 접합체를 수득하는 것에 관한 것이다.The present invention provides a novel polysaccharide-protein conjugate and a method for preparing the same. More particularly, the present invention relates to obtaining chemically stable polysaccharide-protein conjugates by carbamate chemistry. Polysaccharide fragments are H. influenzae type b ( Hib ), Neisseria meningitidis ( Men ), Streptococcus pneumoniae, more preferably N. Meningitidis serogroups are obtained from a group of gram negative bacteria including but not limited to Men A, C, Y, W and preferably Men X. The present invention also relates to obtaining novel polysaccharide-protein conjugates with high immunogenicity, which can be used alone or in combination as a vaccine or as a diagnostic tool.

또한, 본 발명은 접합 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 캡슐형 다당류는 담체 단백질과의 접합에 적합한 더 작은 크기로 분해되어 더 높은 항원성을 갖는 접합체를 수득한다. The present invention also relates to a conjugation method, wherein the capsular polysaccharide is degraded to a smaller size suitable for conjugation with a carrier protein to obtain a conjugate with higher antigenicity.

본 발명은 히드록실기 활성화를 위해 CDI를 사용하여 카바메이트 화학에 의해 다당류-단백질 접합체를 형성하는 접합 방법을 제공한다.The present invention provides a conjugation method for forming polysaccharide-protein conjugates by carbamate chemistry using CDI for hydroxyl group activation.

담체 단백질은 TT (파상풍 톡소이드), DT (디프테리아 톡소이드), CRM197 (DT의 비-독성 돌연변이체), OMPV (외막 단백질 소낭) 또는 다른 적합한 담체 단백질로부터 선택된다.The carrier protein is selected from TT (tetanus toxoid), DT (diphtheria toxoid), CRM197 (a non-toxic mutant of DT), OMPV (outer membrane protein vesicle) or other suitable carrier protein.

상기 캡슐형 다당류는 종래 기술에서 이용 가능한 몇 가지 기술을 이용하여 분해된다. 보다 바람직하게는, 분해는 실험실 규모에서 프로브 초음파 처리 및/또는 울트라-초음파 처리에 의해 수행되고, 더 큰 규모에서 마이크로 유동화기에 의해 수행된다. 천연 엔. 메닌기티디스 캡슐형 다당류는 0.38 + 0.06 Kd의 분포 계수의 크기 범위에서 분해된다. 다당류의 크기는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)상에서 겔-투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 결정된다.The capsular polysaccharide is degraded using several techniques available in the prior art. More preferably, the disintegration is performed by probe sonication and/or ultra-sonication on a laboratory scale, and by a microfluidizer on a larger scale. natural yen. Meningitidis capsular polysaccharides are degraded in the size range of the distribution coefficient of 0.38 + 0.06 Kd. The size of polysaccharides is determined by gel-permeation chromatography (GPC) on high performance liquid chromatography (HPLC).

분해 공정 후, 상기 분해된 다당류는 리튬 할라이드, 염화 리튬 및 4차 암모늄 할라이드 수화물을 포함하나 이에 제한되지 않는, 카운터 이온 교환 용의 강한 전해질 염에 용해된다. 용액은 60 ± 30 분 동안 적절하게 혼합되도록 한다. 수득되는 캡슐형 다당류로부터 회전-증발과 같은 임의의 건조 기술에 의해 수분이 제거된다. 이어서, 건조된 캡슐형 다당류를 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO), 디메틸 포름아미드(DMF), N-메틸 피롤리돈(NMP) 또는 디메틸 아세트아미드를 포함하나 이에 제한되지 않는 비-수성 비양성자성 용매에 용해시킨다. 비-수성 비양성자성 용매 중의 상기 분해 및 건조된 캡슐형 다당류는 5 내지 50 몰 초과 농도의, N,N'-카르보닐 디 이미다졸(CDI), N,N'-디-숙신이미딜 카보네이트(DSC) 또는 N,N'-디-숙신이미딜 옥살레이트(DSO)를 포함하나 이에 제한되지 않는 무수분 활성제와 반응시키고, 혼합물을 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 또는 피리딘의 존재하에 소정의 시간 동안 유지하여 반응을 완결시킨다. Men PS는 이의 반복 단위에 유리 히드록실기를 가지고, 이는 카르보닐-디이미다졸 (CDI)에 반응하여 중간체 이미다졸일 카바메이트 및 이미다졸 부산물을 형성한다.After the decomposition process, the decomposed polysaccharide is dissolved in a strong electrolyte salt for counter ion exchange, including but not limited to lithium halide, lithium chloride and quaternary ammonium halide hydrate. The solution is allowed to mix properly for 60 ± 30 minutes. Moisture is removed from the resulting capsular polysaccharide by any drying technique such as rotary-evaporation. The dried capsular polysaccharide is then subjected to a non-aqueous aprotic solvent including, but not limited to, anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl formamide (DMF), N-methyl pyrrolidone (NMP) or dimethyl acetamide. dissolved in The decomposed and dried capsular polysaccharide in a non-aqueous aprotic solvent is present at a concentration of 5-50 molar excess of N,N'-carbonyl diimidazole (CDI), N,N'-di-succinimidyl carbonate (DSC) or N,N'-di-succinimidyl oxalate (DSO) is reacted with an anhydrous active agent, including but not limited to, and the mixture is reacted with the desired concentration in the presence of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) or pyridine Hold for an hour to complete the reaction. Men PS has a free hydroxyl group in its repeat unit, which reacts with carbonyl-diimidazole (CDI) to form the intermediate imidazolyl carbamate and imidazole byproduct.

결과적인 활성화된 캡슐형 다당류는 다당류를 과량의, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, n-부틸 아세테이트 또는 이들의 상이한 비율의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 저극성용매에 침전시키고, 침전된 다당류를 수성 완충 식염수에 용해시켜 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 수득함으로써 정제한다.The resulting activated capsular polysaccharide is formed by precipitating the polysaccharide in an excess of a low polarity solvent including, but not limited to, ethyl acetate, dichloromethane, n-butyl acetate, or mixtures of different proportions thereof, and the precipitated polysaccharide in an aqueous buffer Purification is obtained by dissolving in saline to obtain purified activated capsular polysaccharide.

담체 단백질은 히드라진 또는 ADH의 존재하에 수용성 카르보디이미드 EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드)와 반응하여 연장된 말단 히드라지드기를 갖는 안정한 이미드(imide) 결합을 생성한다. EDC는 이용가능한 카르복실레이트(carboxylate) 그룹과 반응하여 중간체, 반응성이 높은, o-아실이소우레아(o-acylisourea)를 형성한다. 이 활성 에스테르는 히드라지드와 같은 친핵체(nucleophile)와 추가로 반응하여 안정한 최종 생성물을 생성한다(도 1). EDC 가교 결합 도식 (R-NH2)는 히드라진 또는 ADH이다.The carrier protein is reacted with a water-soluble carbodiimide EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) in the presence of hydrazine or ADH to form a stable imide with an extended terminal hydrazide group. create a bond EDC reacts with available carboxylate groups to form an intermediate, highly reactive, o-acylisourea. This active ester is further reacted with a nucleophile such as hydrazide to give a stable final product (Figure 1). The EDC cross-linking scheme (R-NH 2 ) is hydrazine or ADH.

카르보닐은 pH 5-7에서 히드라지드 및 아민과 반응한다. EDC의 가수 분해(hydrolysis)는 커플링 동안의 경쟁 반응이며, 온도, pH 및 완충제 조성에 의존한다. 4-모르폴리노에탄설폰산(MES: 4-Morpholinoethanesulfonic acid)은 효과적인 카르보디이미드 반응 완충제이다. 포스페이트 완충제는 EDC의 반응 효율을 감소시키지만, EDC의 양을 증가시키면 감소된 효율을 보완할 수 있다. 트리스, 글리신 및 아세테이트 완충제는 접합 완충제로 사용될 수 없다.Carbonyls react with hydrazides and amines at pH 5-7. Hydrolysis of EDC is a competitive reaction during coupling and is dependent on temperature, pH and buffer composition. 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) is an effective carbodiimide reaction buffer. Phosphate buffer reduces the reaction efficiency of EDC, but increasing the amount of EDC can compensate for the reduced efficiency. Tris, glycine and acetate buffers cannot be used as conjugation buffers.

TT 상의 히드라지드 표지는 TNBS 분석에 의해 결정되고; 단백질 농도는 로우리(Lowry's) 분석법에 의해 결정된다. 유도체화 정도는 생성된 히드라지드의 몰 수를 단백질 몰 수로 나누어 계산한다.The hydrazide label on TT is determined by TNBS analysis; Protein concentration is determined by Lowry's assay. The degree of derivatization is calculated by dividing the number of moles of hydrazide produced by the number of moles of protein.

이렇게 수득한 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 활성화된 담체 단백질을 갖는 수성 완충제에 용해시킨다. 활성화된 담체 단백질은 카르보히드라지드 표지된 또는 ADH 표지된 또는 히드라진 표지된 것일 수 있다.The purified activated capsular polysaccharide thus obtained is dissolved in an aqueous buffer with activated carrier protein. The activated carrier protein may be carbohydrazide labeled or ADH labeled or hydrazine labeled.

정제된 활성화된 캡슐형 다당류 및 활성화된 담체 단백질의 용액을, 상기 다당류가 CDI 활성화, DSC 활성화 또는 DSO 활성화되었는지 여부에 따라 상이한 pH 범위에서 15 ± 5 시간 동안 실온에서 혼합되도록 한다. CDI 활성화된 다당류의 pH 범위는 8-10 인 반면, DSC 활성화 또는 DSO 활성화된 다당류의 pH 범위는 6-9 이다. 이 반응 동안, 단백질상의 히드라지드 잔기의 아민 및 활성화된 다당류상의 카바메이트 또는 카보네이트 잔기의 -N- 함유 방향족 잔기가 반응하여 안정한 카바메이트 결합 -0-(C=O)-N-을 갖는 다당류-단백질 접합체가 형성된다. 따라서, 화학식 PS-L1-L2-CR의 최종 접합체가 제조되는데, 여기서 PS는 다당류이고, L1은 카바메이트 결합이고, L2는 히드라지드 결합이며, CR은 담체 단백질이다. 정제된 접합체는 한외여과, 황산 암모늄 침전, 겔 투과 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는 정제 공정에 의해 수득된다.Solutions of purified activated capsular polysaccharide and activated carrier protein are allowed to mix at room temperature for 15 ± 5 hours at different pH ranges depending on whether the polysaccharide is CDI activated, DSC activated or DSO activated. The pH range of CDI-activated polysaccharides is 8-10, whereas the pH range of DSC-activated or DSO-activated polysaccharides is 6-9. During this reaction, the amine of the hydrazide moiety on the protein and the -N- containing aromatic moiety of the carbamate or carbonate moiety on the activated polysaccharide react to form a polysaccharide with a stable carbamate bond -0-(C=O)-N- A protein conjugate is formed. Thus, a final conjugate of the formula PS-L1-L2-CR is prepared, wherein PS is a polysaccharide, L1 is a carbamate bond, L2 is a hydrazide bond, and CR is a carrier protein. Purified conjugates are obtained by purification processes including, but not limited to, ultrafiltration, ammonium sulfate precipitation, and gel permeation chromatography.

카바메이트 화학을 이용하여 제조된 접합체를 시험하여 접합체 중의 다당류/단백질 비율, 유리 다당류의 양 및, 분자 크기 분포를 결정하였다. 본 발명에서 다양한 최적화 실험을 수행하여 0.30 내지 1.0 범위의 다당류/단백질 비율 및 평균 30 ± 5 %의 접합 수율 60 % 이하를 달성하였다.Conjugates prepared using carbamate chemistry were tested to determine the polysaccharide/protein ratio, amount of free polysaccharide, and molecular size distribution in the conjugate. Various optimization experiments were performed in the present invention to achieve a polysaccharide/protein ratio ranging from 0.30 to 1.0 and an average conjugation yield of 30 ± 5% of 60% or less.

하나의 바람직한 실시양태에서, 박테리아 발효로부터 유래된 Men PS를 하기(downstream) 정제 공정에 의해 정제하고, 정제 후 모든 중요한 품질 파라미터를 분석한다. Men PS의 화학 구조는 유리 히드록실 그룹(들)을 갖는 반복 단위로 구성된다 예: MenX PS (도 2)는 포스페이트 골격 및 위치 3에 N-아세틸화를 갖는 반복 단위로 구성된다. 위치번호 4 및 7의 히드록실기는, CDI와 같은 카바메이트 유도 화학물질과의 접합을 위한 반응성 작용기로 작용한다. 단량체 반복 단위는 단당류(monosaccharide)로 불리고, 단당류 단위 사이의 공유 결합에 의해 형성된 긴 사슬은 다당류를 구성한다. 단당류 유형은 특정 혈청군에 특이적이다 (표 1).In one preferred embodiment, Men PS derived from bacterial fermentation is purified by a downstream purification process and all important quality parameters are analyzed after purification. The chemical structure of Men PS consists of repeating units with free hydroxyl group(s). Example: MenX PS (FIG. 2) consists of a phosphate backbone and repeating units with N-acetylation at position 3. The hydroxyl groups at positions 4 and 7 act as reactive functional groups for conjugation with carbamate-derived chemicals such as CDI. The monomer repeat units are called monosaccharides, and long chains formed by covalent bonds between monosaccharide units constitute polysaccharides. Monosaccharide types are specific for specific serogroups (Table 1).

표 1: 상이한 엔. 메닌기티디스 혈청군의 캡슐형 다당류의 화학 구조 Table 1: Different Yen. Chemical structure of capsular polysaccharide of meningitidis serogroup

Figure 112018095472426-pct00001
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천연 Men PS는 풀루란(pullulan) 표준을 사용하여 HPLC 상에서 SEC로 결정된바와 같이 0.38 + 0.06 Kd의 분포 계수의 크기 범위를 갖는다. 본 발명의 카바메이트 화학 및 다당류 구조는 단독으로 또는 조합으로 백신 후보 물질로 이용되는 안정한 다당류-단백질 접합체의 형성에 기여한다.Natural Men PS has a size range of distribution coefficient of 0.38 + 0.06 Kd as determined by SEC on HPLC using pullulan standards. The carbamate chemistry and polysaccharide structure of the present invention, alone or in combination, contributes to the formation of stable polysaccharide-protein conjugates used as vaccine candidates.

분해된 다당류의 함량은 MenX 및 MenA에 대하여 물리-화학적 분석 예를 들어, 인 분석법(phosphorus assay)에 의해 결정되었고, 초기 다당류 함량의 그것과 유사한 것으로 밝혀졌다.The content of the degraded polysaccharide was determined by physico-chemical analysis for MenX and MenA, eg phosphorus assay, and found to be similar to that of the initial polysaccharide content.

0.38 ±0.06 Kd의 최적 범위로 분포 계수를 최적화하고 달성하기 위해 상이한 실험을 수행하였다. 조건은 각 다당류의 초기 분자 크기 및 구조에 의존하여 상이한 배치(batch)에 따라 달라질 수 있으므로 다양한 조건을 이용하였다.Different experiments were performed to optimize and achieve the distribution coefficient with an optimal range of 0.38 ± 0.06 Kd. Various conditions were used because the conditions may vary for different batches depending on the initial molecular size and structure of each polysaccharide.

하나의 바람직한 실시양태에서, MenX 다당류는 높은 항원성을 갖는 접합체를 수득하기 위해 담체 단백질과의 접합에 적합한 더 작은 크기로 분해된다. 파상풍 톡소이드 (TT)는 담체 단백질로 이용된다. 상기 분해된 MenX 다당류는 염화리튬에 용해된다. 용액은 60 ± 30 분 동안 적절한 혼합이 가능하도록 한다. 회전-증발과 같은 임의의 공지된 건조 기술에 의해 결과적인 캡슐형 다당류로부터 수분이 제거된다. 분해 및 건조된 캡슐형 다당류를 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시킨다. 비-수성 비양성자성 용매 중의 건조된 캡슐형 다당류를 활성화제 N,N'-카르보닐 디 이미다졸(CDI)의 5-50 몰 과량, 바람직하게는 30 몰 과량의 농도와 반응시키고, 혼합물을 2 시간 내지 3 시간 동안 혼합을 유지하여 반응을 완료한다. 반응 혼합물의 pH는 7-10, 바람직하게는 9.0으로 유지한다. 수득되는 활성화된 MenX 다당류는 다당류를 과량의 저극성 용매 에틸 아세테이트에서 침전시키고, 침전된 다당류를 수성 완충 식염수에 용해시켜 정제된 활성화된 캡슐형 다당류를 수득함으로써 정제한다.In one preferred embodiment, the MenX polysaccharide is digested to a smaller size suitable for conjugation with a carrier protein to obtain a conjugate with high antigenicity. Tetanus toxoid (TT) is used as a carrier protein. The decomposed MenX polysaccharide is dissolved in lithium chloride. Allow the solution to mix properly for 60 ± 30 min. Moisture is removed from the resulting capsular polysaccharide by any known drying technique, such as rotary-evaporation. The decomposed and dried capsular polysaccharide is dissolved in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO). The dried capsular polysaccharide in a non-aqueous aprotic solvent is reacted with a concentration of 5-50 molar excess, preferably 30 molar excess, of the activator N,N'-carbonyl diimidazole (CDI), and the mixture is The reaction is completed by maintaining mixing for 2 to 3 hours. The pH of the reaction mixture is maintained at 7-10, preferably 9.0. The obtained activated MenX polysaccharide is purified by precipitating the polysaccharide in an excess of low polarity solvent ethyl acetate, and dissolving the precipitated polysaccharide in aqueous buffered saline to obtain purified activated capsular polysaccharide.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 링커는 담체 단백질에 부착된 히드라진 또는 이의 유도체이다. 크기화된 활성 다당류 및 유도체화된 담체 단백질은 pH 7.0-10.0, 바람직하게는 0.1M 탄산나트륨(Sodium carbonate), 01M NaCl, pH 9.0의 완충제 중에서 0.5 : 1 내지 1 : 0.5 w/w, 보다 바람직하게는 1 : 1 w/w의 비율로 혼합 된다. 이 반응 동안 단백질상의 히드라지드 잔기의 아민 및 활성화된 다당류상의 카바메이트 또는 카보네이트 잔기의 -N- 함유 방향족 잔기가 반응하여 매우 안정한 카바메이트 결합 -O-(C=O)-N- 을 갖는 다당류-단백질 접합체가 형성된다. 상기 접합체는 공지된 기술에 의해 정제되고, 총 다당류 함량, 단백질 함량, 유리 다당류, 다당류-단백질 비율 및 접합체 수율에 대해 분석된다. 정제된 접합체는 2 내지 8 ℃에서 보관된다.In another preferred embodiment, the linker is a hydrazine or derivative thereof attached to a carrier protein. The sized active polysaccharide and the derivatized carrier protein are 0.5:1 to 1:0.5 w/w, more preferably in a buffer of pH 7.0-10.0, preferably 0.1M sodium carbonate, 01M NaCl, pH 9.0. is mixed in a ratio of 1:1 w/w. During this reaction the amine of the hydrazide moiety on the protein and the -N- containing aromatic moiety of the carbamate or carbonate moiety on the activated polysaccharide react to form a polysaccharide with a very stable carbamate bond -O-(C=O)-N- A protein conjugate is formed. The conjugate is purified by known techniques and analyzed for total polysaccharide content, protein content, free polysaccharide, polysaccharide-protein ratio and conjugate yield. The purified conjugate is stored at 2-8°C.

본 발명의 접합체는 37 ℃의 고온 조건에 노출되었을 때 안정하다. 본 발명의 Men 접합체는 혈청 살균 분석 (SBA: Serum Bactericidal Assay) 및 ELISA와 같은 다양한 면역원성 분석(immunogenic assays)에 의해 밝혀진 바와 같이 높은 항원성 및 높은 면역원성을 나타낸다.The conjugates of the present invention are stable when exposed to high temperature conditions of 37°C. The Men conjugate of the present invention exhibits high antigenicity and high immunogenicity as revealed by various immunogenic assays such as Serum Bactericidal Assay (SBA) and ELISA.

비-제한적인 실시예Non-limiting examples

실시예 1: Men X 다당류의 크기화(sizing)Example 1: Sizing of Men X polysaccharides

Men X 다당류 200mg을 얼음 욕(ice bath) 상의 유리 비커에 10 mg/ml의 농도로 취하였다. 3 시간 동안 20% 진폭으로 초음파 진동기를 작동시킨다. 분해된 다당류의 크기는 굴절률 (RI: refractive index) 검출기를 이용하여 HP-GPC (표 2) 상에 수행함으로써 분포 계수 (Kd)로 결정된다. 샘플은 pH 7.2의 0.1M NaNO3에서 TSK 겔 G5000 PWXL + G4000 PWXL 컬럼의 등용매(isocratic) 모드에서 연속적으로 용출된다. 용출 부피는 체류 시간(retention time)으로 측정된다. 각각, 칼럼의 공극 부피 (Vo)는 고 분자량 덱스트란 주입 체류 시간으로부터 계산되며, 칼럼의 총 부피 (Vt)는 나트륨 아자이드(sodium azide) 주입 체류 시간에 의해 결정된다. Kd는 식 Kd = (Ve-Vo/Vt-Vo)로부터 계산된다. Ve는 샘플의 용출 부피의 체류 시간 (RT)이다(도 3). RI 검출기를 사용하여 기록된 데이터는 오른쪽으로 피크가 이동하여 천연 다당류의 해중합(depolymerisation)을 시사한다(도 4).200 mg of Men X polysaccharide was taken at a concentration of 10 mg/ml in a glass beaker on an ice bath. Operate the ultrasonic vibrator at 20% amplitude for 3 h. The size of the degraded polysaccharide is determined by the distribution coefficient (Kd) by performing it on HP-GPC (Table 2) using a refractive index (RI) detector. Samples are eluted continuously in isocratic mode of a TSK gel G5000 PWXL + G4000 PWXL column in 0.1M NaNO 3 at pH 7.2. Elution volume is measured as retention time. Respectively, the pore volume (Vo) of the column is calculated from the high molecular weight dextran injection residence time, and the total volume (Vt) of the column is determined by the sodium azide injection residence time. Kd is calculated from the formula Kd = (Ve-Vo/Vt-Vo). Ve is the residence time (RT) of the elution volume of the sample ( FIG. 3 ). Data recorded using the RI detector suggest a depolymerisation of the native polysaccharide with a shift of the peak to the right (Figure 4).

표 2: TSK 겔 G5000 PWXL + G4000 PWXL 칼럼 상의 HP-SEC에 의한 수막구균성 다당류 혈청군 X의 크기 분포를 보여주는 결과. Table 2: Results showing the size distribution of meningococcal polysaccharide serogroup X by HP-SEC on TSK gel G5000 PWXL + G4000 PWXL columns.

Figure 112018095472426-pct00002
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실시예 2 : CDI를 사용한 다당류 활성화Example 2: Polysaccharide Activation Using CDI

크기화된 다당류 200mg과 LiCl을 실온에서 1 시간 동안 천천히 교반하면서 혼합한 다음 40 ℃에서 회전증발 건조시켰다. 그런다음 15ml의 건조 DMSO에 재용 해시키고 2 시간 동안 혼합을 계속한다. 그 후, 다당류에 대한 카르보닐 디-이미다졸 (CDI) 30X 몰을 첨가한다. 트리에틸아민 (TEA)을 첨가하여 pH를 9.0으로 조정 하였다. 2 시간 동안 실온에서 천천히 교반하고 샘플을 얼음으로 식혀 반응을 멈추게한다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 상단으로부터 상층액을 제거하였다. 다시 에틸 아세테이트를 첨가하고 상단으로부터 상층액을 제거하였다. 고 진공(high vacuum)에서 30 분 동안 건조시킨다.200 mg of the sized polysaccharide and LiCl were mixed with slow stirring at room temperature for 1 hour, followed by rotary evaporation at 40 °C. Then redissolve in 15 ml of dry DMSO and continue mixing for 2 h. Then, 30X moles of carbonyl di-imidazole (CDI) relative to the polysaccharide are added. The pH was adjusted to 9.0 by addition of triethylamine (TEA). Stir slowly at room temperature for 2 h and cool the sample on ice to stop the reaction. Ethyl acetate was added and the supernatant was removed from the top. Ethyl acetate was added again and the supernatant was removed from the top. Dry in high vacuum for 30 minutes.

실시예 3 : TT 활성화Example 3: TT activation

250 mg TT를 50 kDa 분자량 차단 (MWCO: molecular weight cut off) 원심분리 필터를 이용하여 농축시켜 최종 10 ml를 만든다. TT의 10X 중량에 해당하는, 스톡(stock) 5M로부터 2.75㎖의 히드라진 일수화물(monohydrate) 또는 2.5gm의 ADH를 10ml의 반응 완충제, 즉, 0.2M NaCl를 포함하는 0.15M MES 완충제, pH 5.75에 첨가하고 상기 TT에 첨가하였다. 이 혼합물에 1ml의 반응 완충제중의 등량의 EDAC (250mg)를 첨가하여 약 30mM의 최종 농도를 만든다. 반응 혼합물의 pH를 5.85로 조정하고 반응 혼합물의 최종 부피를 25 ml로 조정하였다. 반응 혼합물 중의 TT의 농도는 10 mg/ml이다. 반응 혼합물을 얼음 욕에서 1.0 시간 동안 천천히 교반하였다. 유도체화된 TT를 추가로 정제하고 피크 프로파일을 모니터링하기 위하여 활성화도(degree of activation) 및 SEC-HPLC를 분석한다. 히드라진 활성화된 TT 및 천연 TT의 HPLC-SEC 프로파일 비교를 도 5에 나타내었으며, 여기서 샘플은 등용매 모드의 크로마토그래피 컬럼에서 수행되었고, 데이터는 PDA 검출기를 사용하여 기록되었다.250 mg TT was concentrated using a 50 kDa molecular weight cut off (MWCO) centrifugal filter to make a final 10 ml. 2.75 ml of hydrazine monohydrate or 2.5 gm of ADH from stock 5M, corresponding to 10X weight of TT, in 10 ml of reaction buffer, i.e. 0.15M MES buffer containing 0.2M NaCl, pH 5.75 and added to the TT. To this mixture is added an equivalent amount of EDAC (250 mg) in 1 ml of reaction buffer to a final concentration of about 30 mM. The pH of the reaction mixture was adjusted to 5.85 and the final volume of the reaction mixture was adjusted to 25 ml. The concentration of TT in the reaction mixture is 10 mg/ml. The reaction mixture was stirred slowly in an ice bath for 1.0 h. The derivatized TT is further purified and analyzed for degree of activation and SEC-HPLC to monitor the peak profile. A comparison of the HPLC-SEC profiles of hydrazine activated TT and native TT is shown in FIG. 5 , where samples were run on a chromatography column in isocratic mode and data were recorded using a PDA detector.

실시예 4 : 활성화된 TT의 정제Example 4: Purification of activated TT

정제는 공정 및 TT 활성화에서 가장 중요한 단계 중 하나이다. 미-반응된(un-reacted) 히드라진 또는 ADH를 가능한 최대한으로 제거하는 것을 확실히 할 필요가 있다. 정제는 Sephadex G-25 탈염(desalting) 방법으로 수행된다. 반응 혼합물을 75mM NaCl을 포함하는 50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.5에 대한 세파덱스 G25 컬럼상에서 탈염을 수행하여 유도체화된 단백질을 정제한다. 75mM NaCl을 포함하는 50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.5로 크로마토그래피 컬럼을 평형화시키고, 이어서 샘플을 적재(loading) 하고 110 cm/hr에서 용출한다. 각 10 ㎖의 용출된 분획(fraction)을 수집하고, UV 280 ㎚에서 피크에 상응하는 분획을 모아서 50 kDa MWCO 아미콘(Amikon)막으로 농축시킨다. TT를 갖는 선택된 분획은 TT 농도가 약 30-50 mg/ml가 되도록 상기 부피로 농축된다 (탈염 후 활성화된 TT의 약 75 %의 회수를 고려함). 최종 활성화된 TT는 로우리 분석법으로 단백질 농도를 분석하고, TNBS 분석으로 히드라지드 표지를 분석한다. 상기 두 값은 TT의 활성화도(DOA) 계산에 사용하였다. 활성화된 TT는 PWXL 5000 - PWXL 4000 컬럼을 연속으로 사용하여 1 mg/ml의 농도로 HPLC에서 수행되어 이의 완전성(integrity)에 대해 피크 프로파일을 확인한다.Purification is one of the most critical steps in the process and TT activation. It is necessary to ensure that un-reacted hydrazine or ADH is removed as much as possible. Purification is carried out by Sephadex G-25 desalting method. The derivatized protein is purified by desalting the reaction mixture on a Sephadex G25 column in 50 mM phosphate buffer pH 7.5 containing 75 mM NaCl. The chromatography column is equilibrated with 50 mM phosphate buffer pH 7.5 containing 75 mM NaCl, followed by loading the sample and eluting at 110 cm/hr. Each 10 ml of the eluted fraction was collected, and the fractions corresponding to the peak at UV 280 nm were collected and concentrated with a 50 kDa MWCO Amikon membrane. The selected fraction with TT is concentrated to this volume to a TT concentration of about 30-50 mg/ml (taking into account recovery of about 75% of the activated TT after desalting). The final activated TT was analyzed for protein concentration by Lowry assay and hydrazide labeling by TNBS assay. These two values were used to calculate the degree of activation (DOA) of TT. Activated TT was performed in HPLC at a concentration of 1 mg/ml using a PWXL 5000 - PWXL 4000 column in series to check the peak profile for its integrity.

본 발명의 공정은 상이한 다당류, 바람직하게는 MenX PS의 히드록실기를 상이한 활성화제, 바람직하게는 카르보닐 디-이미다졸로 활성화시켜 안정한 PS-TT 접합체를 형성하도록 담체 단백질에 대해 반응성이 있도록 만든다(도 7).The process of the present invention activates the hydroxyl groups of different polysaccharides, preferably MenX PS, with different activators, preferably carbonyl di-imidazole, to make them reactive towards the carrier protein to form stable PS-TT conjugates. (Fig. 7).

실시예 5 : 활성화된 MenX 및 유도체화된 TT의 접합 반응Example 5: Conjugation reaction of activated MenX and derivatized TT

유도체화된 TT는 0.1M 탄산나트륨, 0.1M NaCl 완충제 pH 9.0 용액 3ml 중의활성화된 Men X PS에 직접 첨가되었고, pH를 9.0으로 유지한다. 활성화된 다당류 및 유도체화된 TT는 접합 반응을 위해 1:1 w/w의 비율로 혼합된다. 접합체의 형성은 3 시간의 시간에만 확인되지만, 조 접합체 혼합물은 실온에서 밤새 계속 혼합한다. 글리신과 같은 아민-함유 시약을 5-10 몰 과량으로 사용하여 반응을 퀀칭(quenching)시킨다.Derivatized TT was added directly to activated Men X PS in 3 ml of 0.1 M sodium carbonate, 0.1 M NaCl buffer pH 9.0 solution, maintaining the pH at 9.0. Activated polysaccharide and derivatized TT are mixed in a ratio of 1:1 w/w for conjugation reaction. The formation of the conjugate is confirmed only at a time of 3 h, but the crude conjugate mixture continues to mix overnight at room temperature. The reaction is quenched using an amine-containing reagent such as glycine in a 5-10 molar excess.

접합 과정은 활성화된 TT의 체류 시간의 변화 및 좌측으로의 피크 이동을 갖는 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링된다. 접합체의 HPLC-SEC 프로파일은 접합 반응이 3 내지 4 시간 내에 최대로 완료됨을 나타낸다. 천연 및 활성화된 TT 및 접합체의 SEC-HPLC 프로파일은 활성화시 활성화된 TT의 크기는 천연 TT로부터 변하지 않고 유지됨을 나타내므로, 응집(aggregation)이 거의 또는 전혀 발생하지 않음을 시사한다. 샘플은 등용액 모드에서 0.1M 질산 나트륨(sodium nitrate), pH 7.2 완충제를 이용하여 유속 1.0 ml/분으로 크로마토그래피 컬럼에서 수행하였으며, 데이터는 PDA 검출기를 사용하여 기록하였다. 접합 후, 고 분자량 피크가 유도체화된 TT 피크의 왼쪽에 나타나며, 이는 PS-TT 접합체의 형성을 나타낸다(도 8).The conjugation process is monitored by SEC-HPLC analysis with changes in the residence time of activated TT and a shift of the peak to the left. The HPLC-SEC profile of the conjugate shows that the conjugation reaction is maximally complete within 3-4 hours. SEC-HPLC profiles of native and activated TT and conjugates show that upon activation, the size of activated TT remains unchanged from native TT, suggesting little or no aggregation. Samples were run on a chromatography column using 0.1M sodium nitrate, pH 7.2 buffer in isosolution mode at a flow rate of 1.0 ml/min, and data were recorded using a PDA detector. After conjugation, a high molecular weight peak appears to the left of the derivatized TT peak, indicating the formation of a PS-TT conjugate ( FIG. 8 ).

실시예 6 : 황산 암모늄 침전에 의한 조 접합체로부터 미-반응된(유리) 다당류의 제거.Example 6: Removal of unreacted (free) polysaccharides from crude conjugates by ammonium sulfate precipitation.

또한, 조 접합체는 단백질 침전법으로 정제하여 유리 또는 미-반응된 다당류를 제거한다. 접합체가 용액으로부터 침전될 때까지 반응 혼합물에 고체 황산 암모늄을 천천히 첨가하여 정제를 수행한다. 침전물은 5000 x g에서 45 분 동안 원심 분리하여 분리한다. 상층액을 버리고, 100 mM NaCl, pH 6.5를 포함하는 50 mM MES 완충제 30 ml에 침전물을 재용해시킨다. In addition, the crude conjugate is purified by protein precipitation to remove free or unreacted polysaccharides. Purification is performed by slowly adding solid ammonium sulfate to the reaction mixture until the conjugate precipitates out of solution. The precipitate is separated by centrifugation at 5000 x g for 45 min. Discard the supernatant and redissolve the precipitate in 30 ml of 50 mM MES buffer containing 100 mM NaCl, pH 6.5.

실시예 7 : 접선 유동 여과 (TFF)에 의한 다당류-단백질 접합체의 정제. Example 7: Purification of polysaccharide-protein conjugates by tangential flow filtration (TFF).

황산암모늄 정제 후의 접합체 샘플을 Pall의 300 kDa MWCO 카세트(cassette)를 이용하여 추가로 정제하였다. 이 단계는 접합체로부터 유리 단백질을 제거하고 접합된 PS로부터 유리 PS를 더 분리하는 것을 보장한다. 접합체를 20 x 부피의 MES 완충제, pH 6.5으로 정용여과(diafilter)하고 최종적으로 35 ml의 부피로 농축시킨다. The conjugate sample after ammonium sulfate purification was further purified using Pall's 300 kDa MWCO cassette. This step ensures that the free protein is removed from the conjugate and further separates the free PS from the conjugated PS. The conjugate is diafiltered with 20 x volumes of MES buffer, pH 6.5 and finally concentrated to a volume of 35 ml.

따라서, 모든 접합 공정 동안 사용된 시약 잔류물의 제거는 네가지 상이한 당계에서 보장되는데, PS를 위한 제1 단계: 활성화된 PS 침전 단계, 담체 단백질을 위한 제2 단계: GPC 정제 단계, 전체 접합 공정을 위한 제3 단계: 황산 암모늄 침전 및, 제4 단계: 300kDa 정용여과 단계이다. 최종적으로 0.2μ 필터로 추가로 여과하고 2-8 ℃에서 보관한다. Thus, removal of used reagent residues during all conjugation processes is ensured in four different sugar systems: 1st step for PS: activated PS precipitation step, 2nd step for carrier protein: GPC purification step, for the overall conjugation process. Third step: ammonium sulfate precipitation and fourth step: 300 kDa diafiltration step. Finally, it is further filtered with a 0.2 μ filter and stored at 2-8 °C.

실시예 8: MenX-TT 접합체의 특성화:Example 8 Characterization of MenX-TT Conjugates:

정제된 접합체를 MenX-TT 접합체에 대하여 인 분석을 통해 총 다당류 함량을 분석한다. 단백질 함량은 로우리 분석법으로 결정한다. 나트륨 데옥시콜레이트 방법(sodium deoxycholate method)을 사용한 침전 방법으로 결정된 유리 다당류 및 상층액을 각각의 비색 분석법으로 분석한다. 다양한 잔류물을 결정하기 위한 상이한 분석법이 제제화를 위해 이를 추가로 사용하기 전에 수행된다. 정제된 접합체는 2 내지 8 ℃에서 저장한다. Purified conjugates are analyzed for total polysaccharide content by phosphorus assay against MenX-TT conjugates. Protein content is determined by Lowry assay. The free polysaccharides determined by the precipitation method using the sodium deoxycholate method and the supernatant were analyzed by colorimetric analysis, respectively. Different assays to determine the various residues are performed prior to their further use for formulation. The purified conjugate is stored at 2-8°C.

다양한 품질 파라미터에 대해 분석하였을 때(표 3), 본 발명의 접합체는 0.3 - 0.7 (w/w) 범위의 다당류/단백질 비율를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 유리 다당류의 양은 상이한 접합체에 대해 상이하지만, 모든 유리 다당류는 정제된 접합체에서 10 % 미만이다. 접합 수율 또한 상이한 접합체에 대해 18 % 내지 43 %로 다양하다. 본 발명에서는 20 mg에서 230 mg까지 다양한 접합 규모를 시도한다.When analyzed for various quality parameters (Table 3), the conjugates of the present invention were found to provide polysaccharide/protein ratios in the range of 0.3 - 0.7 (w/w). The amount of free polysaccharide is different for the different conjugates, but all free polysaccharides are less than 10% in the purified conjugate. The conjugation yield also varies from 18% to 43% for the different conjugates. In the present invention, various conjugation scales from 20 mg to 230 mg are attempted.

표 3: 상이한 Men X-TT 접합체 로트(lot)의 특성화 Table 3: Characterization of different Men X-TT conjugate lots

Figure 112018095472426-pct00003
Figure 112018095472426-pct00003

실시예 9: 카바메이트 화학에 의해 수득된 Men A, C, Y, W 접합체의 특성화Example 9: Characterization of Men A, C, Y, W Conjugates Obtained by Carbamate Chemistry

Men X와 유사한 방식으로, 본 발명을 이용하여 혈청군 Men A, C, Y 및 W 접합체를 제조하였다. 모든 접합체는 다양한 품질 파라미터에 대해 특징지어졌고 원하는 결과를 제공하는 것으로 나타났다 (표 4).In a similar manner to Men X, serogroup Men A, C, Y and W conjugates were prepared using the present invention. All conjugates were characterized for various quality parameters and shown to provide the desired results (Table 4).

표 4: 상이한 Men-TT 접합체의 특성화 Table 4 : Characterization of different Men-TT conjugates

Figure 112018095472426-pct00004
Figure 112018095472426-pct00004

실시예 10: MenX-TT 접합체의 안정성:Example 10 Stability of MenX-TT Conjugates:

본 발명의 접합체는 28 일 동안 37 ℃의 고온 조건에 노출된다. 생성된 유리 다당류를 모니터링하기 위해 샘플을 7, 14, 21 및 28 일에 꺼냈다. 정의된 카바메이트 화학에 의해 본 실시양태에서 제조된 Men X 접합체의 안정성은 극한의 안정한 접합체를 생성하는 공정에의 적용성을 입증했다(표 5). The conjugates of the present invention are exposed to high temperature conditions at 37° C. for 28 days. Samples were taken on days 7, 14, 21 and 28 to monitor the free polysaccharides produced. The stability of the Men X conjugates prepared in this embodiment by the defined carbamate chemistry demonstrated applicability to processes producing extremely stable conjugates (Table 5).

표 5: 본 발명의 화학에 의해 제조된 Men X-TT 접합체 로트(lot)에 대한 안정성 데이터 Table 5: Stability data for lots of Men X-TT conjugates prepared by the chemistry of the present invention

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Figure 112018095472426-pct00005

실시예 11: MenX 접합체의 면역원성Example 11: Immunogenicity of MenX Conjugates

5-9 주령의 암컷 BALB/c 마우스 8 마리의 군을 1 ㎍ 용량 수준으로 정상 식염수로 제제화된 MenX 접합된 PS 항원의 2 개의 상이한 로트로 0 일, 14 일 및 28 일에 예방 접종하였다(표 6). 모든 예방 접종은 200 ㎕의 백신 희석액을 피하 경로를 통해 투여함으로써 수행된다. 정상 식염수 만이 음성 대조군으로 사용된다. 혈청은 2 회- 및 3 회-투여 후 7-14 일에 수집한다. 특이적인 항-PS IgG 항체 역가(titer)는 2 회 및 3 회-투여 후에 대해 ELISA에 의해 추정한다.Groups of 8 female BALB/c mice 5-9 weeks old were vaccinated on days 0, 14 and 28 with two different lots of MenX conjugated PS antigen formulated in normal saline at a 1 μg dose level (Table 6). All vaccinations are performed by subcutaneous administration of 200 μl of the vaccine dilution. Only normal saline is used as a negative control. Serum is collected 7-14 days after the 2nd- and 3rd-dose. Specific anti-PS IgG antibody titers are estimated by ELISA after 2 and 3 doses.

MenX 접합체에 대한 최대 IgG 역가는 2 회 접종(booster) 후 달성된다. MenX의 경우, 3 회 투여 후 역가 값의 증가는 음성 대조군과 비교하여 Men X 접합체 로트 1에서는 약 100 배, Men X 접합체 로트 2에서는 150 배 증가한 것으로 관찰되었다(표 6).Maximum IgG titers for MenX conjugates are achieved after two boosters. For MenX, an increase in titer values after 3 doses was observed to be approximately 100-fold in Men X conjugate lot 1 and 150-fold in Men X conjugate lot 2 compared to the negative control group (Table 6).

표 6: 마우스 모델에서 MenX-TT 제제를 2 회- 및 3 회- 투여 후(3 회-투여 후에 대한 +,- 95% 신뢰 구간(Confidence Interval)) ELISA에 의한 IgG 역가에 대한 기하 평균, 0 일, 14 일 및 28 일에 l ㎍ 항원으로 예방 접종한 후. Table 6: Geometric mean for IgG titers by ELISA after 2- and 3-dose (+,- 95% Confidence Interval for 3-dose) MenX-TT formulations in a mouse model, 0 After vaccination with l μg antigen on days, 14 and 28.

Figure 112018095472426-pct00006
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실시예 12: MenX 접합체에 대한 혈청 살균 분석법 (SBA)Example 12: Serum Sterilization Assay (SBA) for MenX Conjugates

마우스의 군에 속하는 각 혈청 샘플로부터의 동일한 부피를 함께 모아서 혈청 살균 분석법에 의한 시험을 위한 군 혈청 풀(group sera pool)을 만든다. 분석은 다음과 같이 수행된다:Equal volumes from each serum sample belonging to a group of mice are pooled together to form a group sera pool for testing by a serum sterilization assay. The analysis is performed as follows:

단일 콜로니 분리를 위해 엔. 메닌기티디스 혈청군 X 표적 균주를 스트리킹(Streaking)하고, 양 혈액 한천 플레이트(Sheep blood agar plate) 상에 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양한다. 이 균주는 다른 양 혈액 한천 플레이트의 전체 표면에 세포를 퍼뜨려(spreading) 계대 배양(subculture)한 다음 37 ℃, 5% CO2에서 신선한 성장을 위해 배양한다. 박테리아는 ~ 5 ml의 살균 분석 완충제에 재현탁시킨다. 현탁액 OD650는 약 1x105 cfu/ml의 등가 콜로니 수로 조정한다. 혈청을 연속으로 2 배 희석하고 분석 완충제를 대조군 웰(well)에 첨가한다. 10 ㎕의 박테리아 작용 용액 을 모든 웰에 첨가한다. 10 ㎕의 열 비활성화된(56 ℃에서 30 분 보관) 보체(complement)를 모든 비활성 보체 대조군 웰에 첨가하고, 10 ㎕의 상기 비활성화된 보체를 혈청 포함 웰 및 활성 보체 대조군 웰에 첨가한다. 플레이트를 흔들어 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.N for single colony isolation . The meningitidis serogroup X target strain is streaked and cultured overnight at 37° C., 5% CO 2 on a sheep blood agar plate. This strain was subcultured by spreading cells over the entire surface of different sheep blood agar plates, and then cultured for fresh growth at 37° C., 5% CO 2 . Bacteria are resuspended in ~5 ml of sterile assay buffer. Suspension OD 650 is adjusted to an equivalent number of colonies of about 1× 10 5 cfu/ml. Serum is serially diluted 2-fold and assay buffer is added to control wells. Add 10 μl of bacterial working solution to all wells. 10 μl of heat inactivated (stored 30 min at 56° C.) complement is added to all inactive complement control wells and 10 μl of the inactivated complement is added to serum containing wells and active complement control wells. Shake the plate and incubate for 1 h at 37 °C.

배양 후, 각 웰로부터의 10 ㎕를 기울어진 혈액 한천 플레이트에 스폿(spot)한다. 모든 한천 플레이트를 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양한다. 플레이트의 각 지점 에 있는 콜로니의 수를 센다. 보체 대조군과 비교하여 박테리아가 50 % 이상 죽는 것을 보이는 최고 혈청 희석은 그 혈청 샘플의 SBA 역가로 고려된다.After incubation, 10 μl from each well is spotted on a tilted blood agar plate. All agar plates are incubated overnight at 37° C., 5% CO 2 . Count the number of colonies at each point on the plate. The highest serum dilution that shows more than 50% killing of bacteria compared to the complement control is considered the SBA titer of that serum sample.

SBA 데이터는 3 회 투여 후 비히클 예방 접종으로부터의 무시할 수 있는 반응을 나타낸 반면, 시험 중인 Men X 접합체 모든 로트는 비히클 대조군과 비교하여 현저히 높은 SBA 역가를 나타냈는데, 이는 마우스 모델에서 생체 내에서 효과적인 백신임을 나타낸다 (표 7).The SBA data showed negligible responses from vehicle vaccination after 3 doses, whereas all lots of Men X conjugates under test showed significantly higher SBA titers compared to the vehicle control, indicating an effective vaccine in vivo in a mouse model. indicates that (Table 7).

표 7: 마우스 모델에서 MenX-TT 제제를 2 회- 및 3 회- 투여 후(3 회-투여 후에 대한 +,- 95% 신뢰 구간) SBA에 대한 기하 평균 역가, 0 일, 14 일 및 28 일에 l ㎍ 항원으로 예방 접종한 후. Table 7: Geometric mean titers for SBA, days 0, 14 and 28 after 2- and 3-dose (+,- 95% confidence intervals for post-dose) MenX-TT formulations in a mouse model After vaccination with l μg antigen.

Figure 112018095472426-pct00007
Figure 112018095472426-pct00007

Claims (26)

면역원성(immunogenicity)을 갖는 신규한 다당류-단백질 접합체(polysaccharide-protein conjugate)로서, 상기 다당류-단백질 접합체는
혈청군(serogroup) A, C, Y, W 또는 X의 네이세리아 메닌기티데스 캡슐형 다당류로부터 선택되는 하나 이상의 다당류; 및
담체 단백질(carrier protein)을 포함하며, 여기서
상기 다당류-단백질 접합체는 안정한 카바메이트 결합 -O-(C=O)-N- 을 갖고,
상기 담체 단백질은 TT(파상풍 톡소이드)이며,
상기 접합체의 화학식은 PS-L1-L2-CR이고, 여기서 PS는 다당류이며, L1은 카바메이트 결합이고, L2는 히드라지드(hydrazide) 결합이며, CR은 담체 단백질이고,
상기 다당류는 분해되어 있고, 상기 분해된 다당류의 최적 크기 범위는 분포 계수 0.38 + 0.06 Kd의 범위인, 신규한 다당류-단백질 접합체.
A novel polysaccharide-protein conjugate having immunogenicity, the polysaccharide-protein conjugate comprising:
one or more polysaccharides selected from Neisseria meningitides capsular polysaccharides of serogroups A, C, Y, W or X; and
a carrier protein, wherein
wherein the polysaccharide-protein conjugate has a stable carbamate bond -O-(C=O)-N-;
the carrier protein is TT (tetanus toxoid),
The formula of the conjugate is PS-L1-L2-CR, wherein PS is a polysaccharide, L1 is a carbamate bond, L2 is a hydrazide bond, and CR is a carrier protein,
wherein the polysaccharide is degraded, and the optimal size range of the degraded polysaccharide is in the range of a distribution coefficient of 0.38 + 0.06 Kd.
 제1항에 있어서, 상기 다당류는 혈청군 X의 네이세리아 메닌기티디스 캡슐형 다당류인, 신규한 다당류-단백질 접합체.
The novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 1, wherein the polysaccharide is a Neisseria meningitidis capsular polysaccharide of serogroup X.
 제1항에 있어서, 상기 접합체는 안정하고 백신 후보 물질로서 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체.
The novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 1, wherein the conjugate is stable and can be used alone or in combination as a vaccine candidate.
 제1항에 있어서, 상기 접합체는 실온에서 안정한 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체.
The novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 1, wherein the conjugate is stable at room temperature.
 제1항에 있어서, 상기 접합체는 37℃에서 28일 동안 저장될 때 10.5% 미만의 유리(free) 다당류 증분(increment)을 갖는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체.
The novel polysaccharide-protein conjugate of claim 1 , wherein the conjugate has less than 10.5% free polysaccharide increment when stored at 37° C. for 28 days.
 제1항에 있어서, 상기 접합체의 상기 면역원성은 음성 대조군과 비교하여 3회 투여 후 역가 값(titer value)이 100배 내지 150배 범위로 증가하는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체.
The novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 1, wherein the immunogenicity of the conjugate increases in a titer value in the range of 100-150-fold after three administrations compared to a negative control.
 제1항에 있어서, 상기 접합체는 비히클(vehicle) 대조군과 비교하여 2회 투여 후 32배 내지 128배, 3회 투여 후 118배 내지 198배 범위의 혈청 살균 분석 역가(Serum Bactericidal Assay Titres)를 나타내는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체.
The method according to claim 1, wherein the conjugate exhibits a Serum Bactericidal Assay Titres ranging from 32-fold to 128-fold and 118-fold to 198-fold after three administrations compared to the vehicle control group. A novel polysaccharide-protein conjugate.
 제1항의 면역원성을 갖는 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법으로서, 상기 방법은,
(a) 혈청군(serogroup) A, C, Y, W 또는 X의 네이세리아 메닌기티데스 캡슐형 다당류로부터 선택되는 하나 이상의 다당류를 최적 크기 범위로 분해하는 단계로서, 상기 분해된 다당류의 최적 크기 범위가 분포 계수 0.38 + 0.06 Kd의 범위인 단계,
(b) 단계 (a)의 상기 분해된 다당류를 강한 전해질 염(electrolytic salt)에 용해시키고, 수득되는 혼합물을 소정의 시간 동안 적절하게 혼합시키는 단계로서, 상기 소정의 시간은 30분 내지 90분의 범위인 단계,
(c) 동결 건조, 회전 증발 또는 진공 건조를 포함하는 공지된 기술에 의해 단계 (b)에서 수득된 결과적인 혼합물로부터 수분을 제거하여 건조된 다당류를 수득하는 단계,
(d) 단계 (c)의 건조된 다당류를 무수 디메틸 설폭시드 (DMSO), 디메틸 포름아미드(DMF), N-메틸 피롤리돈(NMP: N-Methyl pyrrolidone) 및 디메틸 아세트아미드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비-수성 비양성자성(aprotic) 용매에 용해시키는 단계,
(e) 단계 (d)의 결과적인 용액을 N,N'-카르보닐 디이미다졸(CDI: N,N'-Carbonyl Diimidazole), N,N'-디숙신이미딜 카보네이트(DSC: N,N'-Disuccinimidyl carbonate) 및 N,N'-디숙신이미딜 옥살레이트(DSO: N,N'-Disuccinimidyl oxalate)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 무수분(moisture free) 활성제의 소정의 농도와 반응시키는 단계,
(f) 소정의 시간 동안 단계 (e)의 결과적인 혼합물을 유지시켜, 활성화된 다당류인 링커를 갖는 다당류를 수득하는 단계로서, 상기 소정의 시간은 2시간 내지 3시간 범위이고, 활성화된 다당류 상의 링커는 카바메이트인 단계,
(g) 황산 암모늄 침전(ammonium sulphate precipitation), 정용여과(diafiltration), 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 이들의 조합을 포함하는 공지된 방법에 의해 단계 (f)의 상기 활성화된 다당류를 정제하는 단계, 및
(h) 단계 (g)의 상기 정제된 활성화된 다당류를 넓은 pH 범위에서 소정의 시간 동안 내장된(in-built) 링커를 갖는 TT (파상풍 톡소이드)인 활성화된 담체 단백질과 반응시키는 단계로서, 상기 소정의 시간은 2시간 내지 20시간 범위이고, 상기 활성화돤 담체 단백질 상의 내장된 링커는 히드라지드인 단계를 포함하며,
상기 방법은 화학식이 PS-L1-L2-CR의 접합체를 생성하고, 여기서 PS는 다당류이며, L1은 카바메이트 결합이고, L2는 히드라지드(hydrazide) 결합이며, CR은 담체 단백질인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
A method for preparing a novel polysaccharide-protein conjugate having the immunogenicity of claim 1, the method comprising:
(a) decomposing one or more polysaccharides selected from Neisseria meningitides capsular polysaccharides of serogroup A, C, Y, W or X into an optimal size range, wherein the optimal size range of the degraded polysaccharide is distribution coefficient in the range of 0.38 + 0.06 Kd,
(b) dissolving the decomposed polysaccharide of step (a) in a strong electrolytic salt, and mixing the obtained mixture appropriately for a predetermined time, wherein the predetermined time is 30 to 90 minutes range step,
(c) removing moisture from the resulting mixture obtained in step (b) by known techniques including freeze drying, rotary evaporation or vacuum drying to obtain a dried polysaccharide;
(d) selecting the dried polysaccharide of step (c) from the group consisting of anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl formamide (DMF), N-methyl pyrrolidone (NMP: N-Methyl pyrrolidone) and dimethyl acetamide dissolving in one or more non-aqueous aprotic solvents,
(e) the resulting solution of step (d) is N,N'-carbonyl diimidazole (CDI: N,N'-Carbonyl Diimidazole), N,N'-disuccinimidyl carbonate (DSC: N,N) '-Disuccinimidyl carbonate) and N,N'-disuccinimidyl oxalate (DSO: N,N'-Disuccinimidyl oxalate) at least one moisture free (moisture free) selected from the group consisting of oxalate reacting with a predetermined concentration of the active agent step,
(f) maintaining the resulting mixture of step (e) for a predetermined time to obtain a polysaccharide having a linker that is an activated polysaccharide, wherein the predetermined time ranges from 2 hours to 3 hours, the phase of the activated polysaccharide phase wherein the linker is a carbamate;
(g) purifying the activated polysaccharide of step (f) by a known method including ammonium sulphate precipitation, diafiltration, size exclusion chromatography and/or a combination thereof, and
(h) reacting the purified activated polysaccharide of step (g) with an activated carrier protein that is TT (tetanus toxoid) having an in-built linker over a wide pH range for a predetermined time, wherein the predetermined time ranges from 2 hours to 20 hours, wherein the embedded linker on the activated carrier protein is hydrazide,
The method produces a conjugate of formula PS-L1-L2-CR, wherein PS is a polysaccharide, L1 is a carbamate bond, L2 is a hydrazide bond, and CR is a carrier protein. - Method for producing a protein conjugate.
 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 무수분 활성제의 소정의 농도는 5 내지 50몰 초과의 범위인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
9. The method of claim 8, wherein the predetermined concentration of the at least one anhydrous active agent ranges from 5 to greater than 50 moles.
 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 무수분 활성제의 소정의 농도는 30몰 초과의 범위인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
9. The method of claim 8, wherein the predetermined concentration of the at least one anhydrous active agent is in the range of greater than 30 moles.
 제8항에 있어서, 상기 넓은 pH 범위는 pH 6 내지 pH 10인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The method according to claim 8, wherein the wide pH range is between pH 6 and pH 10.
 제8항에 있어서, 상기 분해되고 활성화된 다당류 및 상기 활성화된 담체 단백질은 pH 7.0-10.0의 완충제(buffer)에서 0.5:1 내지 1:0.5 w/w의 범위의 비율로 혼합되는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The novel method according to claim 8, wherein the degraded activated polysaccharide and the activated carrier protein are mixed in a ratio ranging from 0.5:1 to 1:0.5 w/w in a buffer of pH 7.0-10.0. A method for preparing a polysaccharide-protein conjugate.
 제12항에 있어서, 상기 분해되고 활성화된 다당류 및 상기 활성화된 담체 단백질은 pH 9.0의 완충제(buffer)에서 0.5:1 내지 1:0.5 w/w의 범위의 비율로 혼합되는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The novel polysaccharide according to claim 12, wherein the degraded and activated polysaccharide and the activated carrier protein are mixed in a ratio ranging from 0.5:1 to 1:0.5 w/w in a buffer of pH 9.0. - Method for producing a protein conjugate.
 제12항에 있어서, 상기 분해되고 활성화된 다당류 및 상기 활성화된 담체 단백질은 pH 7.0-10.0의 완충제(buffer)에서 1:1 w/w의 범위의 비율로 혼합되는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The novel polysaccharide-protein according to claim 12, wherein the degraded and activated polysaccharide and the activated carrier protein are mixed in a buffer of pH 7.0-10.0 in a ratio ranging from 1:1 w/w. A method for manufacturing a conjugate.
 제12항에 있어서, 상기 분해되고 활성화된 다당류 및 상기 활성화된 담체 단백질은 pH 9.0의 완충제(buffer)에서 1:1 w/w의 범위의 비율로 혼합되는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 12, wherein the degraded and activated polysaccharide and the activated carrier protein are mixed in a buffer of pH 9.0 in a ratio ranging from 1:1 w/w. manufacturing method.
 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 카보네이트 완충제 및 보레이트(borate) 완충제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The method according to any one of claims 12 to 15, wherein the buffer is selected from the group consisting of a carbonate buffer and a borate buffer.
 제8항에 있어서, 상기 접합체 중의 다당류/단백질 비는 0.3 내지 1.0 (w/w)의 범위인 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The method according to claim 8, wherein the polysaccharide/protein ratio in the conjugate is in the range of 0.3 to 1.0 (w/w).
 제8항에 있어서, 상기 접합체는 정제된 접합체에서 10% 미만의 유리 다당류를 갖는 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The method of claim 8 , wherein the conjugate has less than 10% free polysaccharide in the purified conjugate.
 제8항에 있어서, 접합 공정에 의해 수득된 접합체의 수율은 60% 이하인 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법.
The method for producing a novel polysaccharide-protein conjugate according to claim 8, wherein the yield of the conjugate obtained by the conjugation process is 60% or less.
 제8항에 있어서, 접합 공정에 의해 수득된 접합체의 평균 수율은 30±5%인 것인, 신규한 다당류-단백질 접합체의 제조방법. The method according to claim 8, wherein the average yield of the conjugate obtained by the conjugation process is 30±5%. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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