KR20180116312A - 핵산 서열 내로의 혼입을 위한 5-(n-보호된-트립타미노카복시아미드)-2'-데옥시유리딘 포스포아미데이트의 합성을 위한 화합물 및 방법 - Google Patents

핵산 서열 내로의 혼입을 위한 5-(n-보호된-트립타미노카복시아미드)-2'-데옥시유리딘 포스포아미데이트의 합성을 위한 화합물 및 방법 Download PDF

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Abstract

올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 변형된 트립타민, 트립타민-2'-데옥시-유리딘(TrpdU) 및 TrpdU-포스포아미다이트, 뿐만 아니라 개선된 합성 방법, 및 적어도 하나의 변형된 TrpdU 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 제공된다.

Description

핵산 서열 내로의 혼입을 위한 5-(N-보호된-트립타미노카복시아미드)-2'-데옥시유리딘 포스포아미데이트의 합성을 위한 화합물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 14일자, 미국 가출원번호 제62/308,132호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 임의의 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
분야
본 발명은 변형된 염기, 뉴클레오타이드, 및 포스포아미다이트를 비롯한, 개선된 합성 방법 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 분야에 관한 것이다.
3-(2-아미노에틸)-인돌 곁사슬을 가지는 화학적 변형된 뉴클레오타이드인 TrpdU (및 이의 2'-변형된 유사체)는, 단백질과 같은 분석물을 표적으로 하는 높은 친화성의 압타머의 개발에 유용하다. TrpdU의 인돌 고리는 전자가 풍푸하며 분극 가능하여, 표적 분석물과 2차 구조 및 상보적 소수성 계면을 형성하는 것을 촉진할 수 있다. 지금까지, TrpdU 뿐만 아니라 다른 변형된 뉴클레오타이드는 고상 올리고뉴클레오타이드 합성에서 포스포아미다이트 시약으로서 수행하지 못했고, 따라서 이의 사용이 제한되었다.
개선된 TrpU 포스포아미다이트, 및 TrpU 포스포아미다이트의 개선된 제조 방법에 대한 필요성이 기술 분야 내에 여전히 존재한다.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물
Figure pct00001
, 또는 이의 염이 제공된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X1 및 X2 는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X3 는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시로부터 선택된다.
일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-프로필이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 2-사이아노페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로펜틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로헥실이다. 일부 구체예에서, X1 및 X2는 메톡시이다. 일부 구체예에서, X3는 수소이다. 일부 구체예에서, X3는 메톡시이다. 일부 구체예에서, X3는 플루오로이다. 일부 구체예에서, X3는 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시이다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 제공되는 화합물은 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00002
;
Figure pct00003
;
Figure pct00004
;
Figure pct00005
;
Figure pct00006
;
Figure pct00007
;
Figure pct00008
;
및 이의 염.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물
Figure pct00009
, 또는 이의 염이 제공된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X1 및 X2 는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X3 는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시로부터 선택된다.
일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-프로필이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 2-사이아노페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로펜틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로헥실이다. 일부 구체예에서, X1 및 X2는 메톡시이다. 일부 구체예에서, X3는 수소이다. 일부 구체예에서, X3는 메톡시이다. 일부 구체예에서, X3는 플루오로이다. 일부 구체예에서, X3는 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00010
;
Figure pct00011
;
Figure pct00012
;
Figure pct00013
;
Figure pct00014
;
Figure pct00015
;
Figure pct00016
; 및 이의 염.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물:
Figure pct00017
, 또는 이의 염이 제공된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-프로필이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 2-사이아노페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로펜틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로헥실이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음으로부터 선택되는 구조를 가진다:
Figure pct00018
;
Figure pct00019
;
Figure pct00020
;
Figure pct00021
;
Figure pct00022
;
Figure pct00023
;
Figure pct00024
; 및 이의 염.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물:
Figure pct00025
이 제공된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-프로필이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 2-사이아노페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로펜틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로헥실이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음으로부터 선택되는 구조를 가진다:
Figure pct00026
;
Figure pct00027
;
Figure pct00028
;
Figure pct00029
;
Figure pct00030
;
Figure pct00031
; 및
Figure pct00032
.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물:
Figure pct00033
, 또는 이의 염의 제조 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-프로필이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 2-사이아노페닐이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로펜틸이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로헥실이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸이고, 산 클로라이드는 피바로일 클로라이드이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-프로필이고, 산 클로라이드는 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드이다. 일부 구체예에서, R1은 1,1-다이메틸-뷰틸이고, 산 클로라이드는 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드이다. 일부 구체예에서, R1은 2-클로로페닐이고, 산 클로라이드는 2-클로로벤조일 클로라이드이다. 일부 구체예에서, R1은 2-사이아노페닐이고, 산 클로라이드는 2-사이아노벤조일 클로라이드이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로펜틸이고, 산 클로라이드는 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드이다. 일부 구체예에서, R1은 1-메틸-사이클로헥실이고, 산 클로라이드는 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드이다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조한다:
Figure pct00034
;
Figure pct00035
;
Figure pct00036
;
Figure pct00037
;
Figure pct00038
;
Figure pct00039
;
Figure pct00040
; 및 이의 염.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물:
Figure pct00041
의 제조 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 다음의 화합물
Figure pct00042
과 트라이플루오로아세트산을 반응시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조한다:
Figure pct00043
;
Figure pct00044
;
Figure pct00045
;
Figure pct00046
;
Figure pct00047
;
Figure pct00048
; 및
Figure pct00049
.
일부 구체예에서, 상기 방법은 N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시켜, 다음의 화합물
Figure pct00050
을 형성하는 단계를 추가적으로 포함한다.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물:
Figure pct00051
, 또는 이의 염이 제공된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X1 및 X2 는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X3 는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 화합물과
Figure pct00052
5'-O-DMT-5-(2,2,2-트라이플루오로에톡시-카보닐)-2'-데옥시우리딘 (TFEdU)을 반응시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조한다:
Figure pct00053
;
Figure pct00054
;
Figure pct00055
;
Figure pct00056
;
Figure pct00057
;
Figure pct00058
;
Figure pct00059
; 및 이의 염.
일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 화합물과
Figure pct00060
트라이플루오로아세트산을 반응시켜, 다음의 화합물
Figure pct00061
을 형성하는 단계를 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시켜, 다음의 화합물
Figure pct00062
을 형성하는 단계를 추가적으로 포함한다.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물:
Figure pct00063
, 또는 이의 염이 제공된다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X1 및 X2 는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X3 는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 다음의 화합물
Figure pct00064
과 2-사이아노에틸-N,N,N',N'-테트라아이소프로필포스포-아미다이트를 반응시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 다음의 화합물
Figure pct00065
과 5'-O-DMT-5-(2,2,2-트라이플루오로에톡시-카보닐)-2'-데옥시우리딘 (TFEdU)을 반응시켜, 다음의 화합물
Figure pct00066
을 형성하는 단계를 추가적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 다음의 화합물
Figure pct00067
과 트라이플루오로아세트산을 반응시켜, 다음의 화합물
Figure pct00068
을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시켜, 다음의 화합물
Figure pct00069
을 형성하는 단계를 추가적으로 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조한다:
Figure pct00070
;
Figure pct00071
;
Figure pct00072
;
Figure pct00073
;
Figure pct00074
;
Figure pct00075
;
Figure pct00076
; 및 이의 염.
일부 구체예에서, 다음의 구조를 가지는 화합물:
Figure pct00077
, 또는 이의 염이 제공되며,
여기서,
R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고;
X1 및 X2는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택되고;
X3는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시으로부터 선택되고;
다음의 단계를 포함한다:
a) N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시켜, 다음의 화합물.
Figure pct00078
을 형성하는 단계;
b) 다음의 화합물
Figure pct00079
과 트라이플루오로아세트산을 반응시켜 화합물
Figure pct00080
을 형성하는 단계;
c) 다음의 화합물
Figure pct00081
과 5'-O-DMT-5-(2,2,2-트라이플루오로에톡시-카보닐)-2'-데옥시우리딘 (TFEdU)을 반응시켜, 다음의 화합물
Figure pct00082
을 형성하는 단계; 및
d) 다음의 화합물
Figure pct00083
과 2-사이아노에틸-N,N,N',N'-테트라아이소프로필포스포-아미다이트를 반응시키는 단계.
일부 구체예에서, 상기 방법은 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조한다:
Figure pct00084
;
Figure pct00085
;
Figure pct00086
;
Figure pct00087
;
Figure pct00088
;
Figure pct00089
;
Figure pct00090
; 및 이의 염.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 보호된 TrpU 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 제공되며, 이러한 올리고뉴클레오타이드 적어도 하나의 보호된 TrpU 뉴클레오타이드는 다음의 구조를 가진다:
Figure pct00091
. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X3 는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X4는 OH, -OR, -SR, 및 -Z-P(Z')(Z”)O-R으로부터 선택되며, 여기서 Z, Z', 및 Z”는 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되고, R은 올리고뉴클레오타이드 내에서 인접한 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, X5는 -O-ss, -OR, -SR, 및 -Z-P(Z')(Z”)O-R로부터 선택되며, 여기서 ss는 고체 지지체이고, Z, Z', 및 Z”는 각각 독립적으로 O 및 S으로부터 선택되고, R는 올리고뉴클레오타이드 내에서 인접한 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 제어된-공극 유리 (CPG, controlled-pore glass)이다. 일부 구체예에서, Z'는 S이고 Z”는 O이다. 일부 구체예에서, Z' 및 Z”는 O이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 TrpU 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 구조를 가지는 적어도 하나의 뉴클레오타이드:
Figure pct00092
를 고체 지지체 상의 뉴클레오타이드 서열 내로 혼입시키는 단계; 및 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입된 적어도 하나의 TrpU 뉴클레오타이드로부터
Figure pct00093
보호 그룹을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X3 는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시로부터 선택된다. 일부 구체예에서, X4는 OH, -OR, -SR, 및 -Z-P(Z')(Z”)O-R으로부터 선택되며, 여기서 Z, Z', 및 Z”는 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되고, R은 올리고뉴클레오타이드 내에서 인접한 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, X5는 -O-ss, -OR, -SR, 및 -Z-P(Z')(Z”)O-R로부터 선택되며, 여기서 ss는 고체 지지체이고, Z, Z', 및 Z”는 각각 독립적으로 O 및 S으로부터 선택되고, R는 올리고뉴클레오타이드 내에서 인접한 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 제어된-공극 유리 (CPG, controlled-pore glass)이다. 일부 구체예에서, Z'는 S이고 Z”는 O이다. 일부 구체예에서, Z' 및 Z”는 O이다.
도 1. TrpdU의 구조.
도 2. N-1-보호된 트립타민 화합물의 합성 반응식.
도 3. 보호된 트립타민 내 아실 그룹의 이동 이후 BOC의 제거.
도 4. piv-TrpdU 사이아노에틸-N,N-다이아이소프로필 포스포아미다이트 (CEP), 비보호된 TrpdU CEP, 및 NapdU CEP를 사용하여 합성된 압타머의 HPLC 프로파일.
도 5. N-1-piv-트립타민 트라이플루오로아세테이트의 합성 반응식.
도 6. Piv-TrpdU 사이아노에틸-N,N-다이아이소프로필 포스포아미다이트 (CEP)의 합성 반응식.
달리 언급되지 않는 한, 기술적 용어는 종래의 용도에 따라 사용된다. 분자 생물학의 일반적인 용어의 정의는 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 확인할 수 있다.
달리 설명되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 단수 용어(“a,” “an,” 및 “the”)는 문맥이 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. “A 또는 B를 포함함”은 A, 또는 B, 또는 A 및 B을 포함하는 것을 의미한다. 또한, 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공되는 것을 이해해야 한다.
또한, 본 명세서에 제공된 범위는 범위 내에 모든 값에 대해 단축된 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 (뿐만 아니라, 문맥이 명백하게 지시하지 않는 한 이의 분획)으로 구성된 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다. 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 적절한 경우, 이의 분획 (예컨대, 정수의 10 분의 1 및 100 분의 1)을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 중합체 하위 단위체, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징에 관련하여 본 명세서에 언급된 임의의 숫자 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용 시, “약” 또는 “본질적으로 구성된”은, 달리 지시되지 않는 한, 지시된 범위, 값, 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본 명세서에서 사용 시, 용어 “포함하다(“include” 및 “comprise”)는 넓은 의미로 해석되며 동의어로 사용된다.
본 명세서에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 이에 상응하는 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 하기에는 적절한 방법 및 재료가 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고 문헌은 그 전체가 참조로서 포함된다. 상충되는 경우, 용어의 설명을 비롯한 명세서가 우선된다. 또한, 재료, 방법, 및 예시는 단지 예시적인 것이며 제한하고자 의도되지 않는다.
본 명세서에서 사용 시, 용어 “뉴클레오타이드”는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이의 변형된 형태, 뿐만 아니라 이의 유사체를 지칭한다. 뉴클레오타이드는 퓨린 (예컨대, 아데닌, 하이포잔틴, 구아닌, 및 이의 유도체 및 유사체) 뿐만 아니라 피리미딘 (예컨대, 사이토신, 우라실, 타이민, 및 이의 유도체 및 유사체)을 포함하는 종을 포함한다.
본 명세서에서 사용 시, 용어 “TrpU”는 일반적으로 5-위치 N-(3-인돌-2-에틸)-카복스아마이드 작용성 그룹을 포함하는 우리딜릴(uridylyl) 뉴클레오타이드를 지칭하도록 사용된다. 용어 “TrpU”의 사용은 리보스의 2' 위치에 관하여 제한하도록 의도된 것이 아니며, 상기 용어는 특정의 2' 모이어티가 지시되지 않는 한, 2'-위치에 -H, -OH, -OMe, 또는 -F를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 용어 “TrpdU”는 일반적으로 2'-H를 포함하는 TrpU 뉴클레오타이드를 지칭한다
본 명세서에서 사용 시, “핵산,” “올리고뉴클레오타이드,” 및 “폴리뉴클레오타이드” 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하도록 상호교환적으로 사용되며, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드 및 이러한 종류의 핵산, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 변형체를 포함하며, 여기서 뉴클레오타이드 단위체에 대하여 임의의 위치에서의 다양한 개체 또는 모이어티의 부착이 포함된다. 용어 “폴리뉴클레오타이드,” “올리고뉴클레오타이드,” 및 “핵산”은 이중- 또는 단일-가닥 분자, 뿐만 아니라 삼중-나선형 분자를 포함한다. 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드는 용어 압타머보다 더욱 ?은 의미의 용어이며, 이에 따라, 용어 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드는 압타머인 뉴클레오타이드의 중합체를 포함하지만, 용어 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드는 압타머에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용 시, 용어 “적어도 하나의 뉴클레오타이드”는, 핵산의 변형체를 지칭하는 경우, 핵산 내 하나의, 복수의, 또는 모든뉴클레오타이드를 지칭하며, 임의의 또는 모든 경우에, 핵산 내 임의의 또는 모든 A, C, T, G 또는 U가 변형될 수 있거나, 변형되지 않을 수 있음을 나타낸다.
본 명세서에서 사용 시, “포스포아미다이트”는 리보스의 3' 탄소, 또는 또 다른 당 모이어티에 동일한 위치에 부착된
Figure pct00094
그룹을 포함하는 뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 포스포아미다이트는 리보스의 5'-OH 상의 보호 그룹, 트라이틸 보호 그룹, 예를 들어, 다이메톡시트라이틸 보호 그룹을 포함한다.
본 명세서에서 사용 시, “고상 합성(solid phase synthesis)”은 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 포스포아미다이트 화합물을 사용하는 고상 올리고뉴클레오타이드 합성을 지칭한다.
화합물
본 발명은 표 A에 나타난 화합물, 뿐만 아니라 이의 염, 및 상기 화합물의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
표 A: 본 발명의 화합물
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
일부 구체예에서, 표 A의 구조 중 X3은 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 표 A의 화합물 1 내지 7은 고상 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용되어, 하나 이상의 TrpU 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 또한 본 명세서에 화합물 8 내지 14로부터 선택되는 구조를 포함하는 화합물이 제공되며, 여기서 리보스의 3' 탄소는 링커 모이어티를 통해 제어된-공극 유리와 같은 고상에 연결된다. 일부 구체예에서, 리보스의 3' 탄소는 석시네이트, 다이글리콜레이트, 및 알킬아미노로부터 선택된 링커 모이어티를 통해 고상에 연결된다.
일부 구체예에서, 표 A의 화합물은 본 명세서의 실시예에서와 같이 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
염
화합물의 상응하는 염을 제조, 정제, 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다.
예를 들어, 화합물이 음이온이거나, 또는 음이온이 될 수 있는 작용성 그룹을 가지는 경우 (예컨대, -COOH는 -COO-이될 수 있음), 염은 적절한 양이온으로 형성될 수 있다. 적절한 무기 양이온의 예로는, Na+ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온, Ca2+ 및 Mg2+와 같은 알칼리성 토금속 양이온, 및 Al+3와 같은 다른 양이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적절한 유기 양이온의 예로는, 암모늄 이온 (즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온 (예컨대, NH3RX+, NH2RX 2 +, NHRX 3 +, NRX 4 +)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치환된 암모늄 이온의 일부 적절한 예로는 다음으로부터 유래된 이온이다: 에틸아민, 다이에틸아민, 다이사이클로헥실아민, 트라이에틸아민, 뷰틸아민, 에틸렌다이아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 피페리진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민, 및 트로메타민, 뿐만 아니라 아미노산, 예컨대 라이신 및 아르기닌. 일반적인 4차 암모늄 이온의 예로는 N(CH3)4 +이 있다.
화합물이 양이온이거나, 또는 양이온이 될 수 있는 작용성 그룹을 가지는 경우 (예컨대, -NH2는 -NH3 +이 될 수 있음), 염은 적절한 음이온으로 형성될 수 있다. 적절한 무기 음이온의 예로는 다음의 무기 산으로부터 유도된 음이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 염산, 브롬화 수소산, 요오드화 수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산, 및 아인산.
적절한 유기 음이온의 예로는 다음의 유기 산으로부터 유도된 음이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 2-아세트옥시벤조산, 아세트산, 아스코브르산, 아스파트르산, 벤조산, 캄포설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에테인다이설폰산, 에테인설폰산, 퓨마르산, 글루셉톤산(glucheptonic), 글루콘산, 클루탐산, 글리콜산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프탈렌 카복실산, 이세티온산, 젖산, 락토바이오닉산(lactobionic), 라우르산, 말레산, 말산, 메테인설폰산, 점액산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모인산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 설판일산, 타르타르산, 톨루엔설폰산 및 발레르산. 적절한 중합체성 유기 음이온의 예로는 다음의 중합체 산으로부터 유도된 음이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 타닌산, 카복시메틸 셀룰로스.
달리 명시되지 않는 한, 특정 화합물에 대한 언급은 이의 염 형태를 또한 포함한다.
변형된 올리고뉴클레오타이드
본 명세서에서 사용 시, 용어 “변형하다”, “변형된”, “변형체”, 및 이의 임의의 변형은, 올리고뉴클레오타이드에 대해 사용되는 경우, 올리고뉴클레오타이드의 4개의 구성 뉴클레오타이드 염기 (즉, A, G, T/U, 및 C) 중 적어도 하나는 자연적으로 발생한 뉴클레오타이드의 유사체 또는 에스터임을 의미한다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드에 뉴클레이스 내성을 부여한다. 추가적인 변형으로는 백본 변형, 메틸화, 특이한 염기쌍 조합, 예컨대 아이소염기 아이소시타딘 및 아이소구아니딘, 등을 포함할 수 있다. 변형은 또한 3' 및 5' 변형, 예컨대 캡핑을 포함할 수 있다. 다른 변형은 자연적으로 발생한 뉴클레오타이드 중 하나 이상과 유사체의 치환, 인터뉴클레오타이드 변형, 예를 들어, 비하전된 연결부를 가지는 변형 (예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트, 등) 및 하전된 연결부를 가지는 변형 (예컨대, 포스포로싸이오네이트, 포스포로다이싸이오네이트, 등), 인터칼레이터(intercalator) (예컨대, 아크리딘, 솔라렌(psoralen), 등)를 가지는 변형, 킬레이터(chelator) (예컨대, 금속, 방사선 금속, 보론, 산화 금속, 등)를 포함하는 변형, 알킬레이터를 포함하는 변형, 및 변형된 연결부를 가지는 변형 (예컨대, 알파 아노머 핵산, 등)을 포함할 수 있다. 또한, 뉴클레오타이드의 당에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실 그룹은 포스포네이트 그룹 또는 포스페이트 그룹에 의해 대체되거나; 표준 보호 그룹에 의해 보호되거나; 또는 활성화되어 추가적인 뉴클레오타이드 또는 고체 지지체에 추가적인 연결부를 제조할 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH 그룹은 인산화되거나 또는 아민, 약 1 내지 약 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 그룹 모이어티, 하나의 구체예에서 약 10 내지 약 80 kDa 범위의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체, 또 다른 구체예에서 약 20 내지 약 60 kDa 범위의 PEG 중합체, 또는 다른 친수성 또는 소수성 생물학적 또는 합성 중합체로 치환될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 또한 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-플루오로, 2'-NH2 또는 2'-아지도를 포함하는, 당해 분야에서 일반적으로 알려진 리보스 또는 데옥시리보스 당, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스, 비고리형 유사체 및 무염기성 뉴클레오사이드 유사체 예컨대 메틸 리보사이드의 유사한 형태를 포함할 수 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 하나 이상의 포스포다이에스터 연결부는 택일적인 연결 그룹에 의해 대체될 수 있다. 이러한 택일적인 연결 그룹은 포스페이트가 P(O)S (“싸이올레이트”), P(S)S (“다이싸이올레이트”), (O)NRX 2 (“아미다이트”), P(O) RX, P(O)ORX', CO 또는 CH2 (“폼아세탈”)에 의해 대체되는 구체예를 포함하며, 여기서 각각의 RX 또는 RX'은 독립적으로 H, 또는 선택적으로 에터 (-O-) 연결부, 아릴, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 아랄딜(araldyl)을 포함하는 치환된 또는 비치환된 알킬 (C1-C20)이다. 폴리뉴클레오타이드의 모든 연결부가 동일해야할 필요는 없다. 당, 퓨린, 및 피리미딘의 유사한 형태의 치환은 예를 들어 폴리아마이드 백본과 같은 대안의 백본 구조일 수 있음에 따라 최종 생성물의 설계에 유리할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 또한 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스, 비고리형 유사체 및 무염기성 뉴클레오사이드 유사체 예컨대 메틸 리보사이드의 유사체를 포함할 수 있다.
존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 라벨링 성분과 컨쥬게이션에 의해 중합 이후에 추가적으로 변형될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 제조
올리고데옥시뉴클레오사이드의 자동화 합성은 많은 실험실에서 일상적으로 수행된다 (예컨대, Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191를 참조하며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다). 올리고리보뉴클레오사이드의 합성은 또한 잘 알려져있다 (예컨대 Scaringe, S. A., et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441를 참조하며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다). 본 명세서에 언급된 바와 같이, 포스포아미다이트는 화학적 합성에 의해 변형된 뉴클레오사이드를 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입시키는데 있어 유용하며, 트라이포스페이트는 효소 합성에 의해 변형된 뉴클레오사이드를 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입시키는데 유용하다. (예컨대, Vaught, J. D. et al. (2004) J. Am. Chem. Soc., 126:11231-11237; Vaught, J. V., et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151; Gait, M. J. “Oligonucleotide Synthesis a practical approach” (1984) IRL Press (Oxford, UK); Herdewijn, P. “Oligonucleotide Synthesis” (2005) (Humana Press, Totowa, N.J.를 참조한다 (상기 문헌 각각은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다).
일부 구체예에서, 본 명세서에 제공되는 화합물, 및 특히, 표 A의 화합물 1 내지 7은, 상업적으로 입수 가능한 합성기를 사용하는 자동화 방법을 비롯한 표준 포스포아미다이트 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 사용될 수 있다. 합성 이후, TrpU 뉴클레오타이드의 보호 그룹은 예컨대 tBuNH2/MeOH/H2O 및 MeNH2 (기체)를 사용하는 표준 탈보호 방법을 통해 제거될 수 있다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 합성에 본 명세서에 제공되는 화합물, 예컨대 표 A의 화합물 1 내지 7을 사용하면 원하는 올리고뉴클레오타이드 생성물의 수율을 개선한다. 예를 들어, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 비보호된 TrpdU CEP를 대신하여 Piv-TrpdU CEP를 사용하면 13개의 TrpdU 뉴클레오타이드를 포함하는 51mer 올리고뉴클레오타이드의 수율을 약 1.7배 개선하였다. 표 10을 참조한다. 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드에 대해서, 수율은 2배 이상 증가될 수 있다. 표 11을 참조한다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 일부 구체예를 더욱 상세하게 설명하기 위해 제공된다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 다양한 화합물을 고안하기 위해 이러한 발견의 기본 원리를 쉽게 채택할 수 있다.
실시예 1: 트립타민에 대한 보호 그룹 조사
표준 올리고뉴클레오타이드 탈보호 조건 하에서 다양한 설폰일- 및 아실-보호 그룹을 반응성을 측정하기 위해 모델 시스템을 사용하였다. TrpdU에 대한 모델로서 화합물, N-α-tert-뷰톡시카보닐트립타민 (도 2, (1))을 사용하였다. 다양한 N-1 유도체는 (1)을 테트라하이드로퓨란 (THF)에서 포타슘 tert-뷰톡사이드 (1.1 당량)로 처리한 후, 적절한 설폰일 또는 아실 클로라이드 또는 무수물 (1.0 당량)을 첨가함으로써 용이하게 합성될 수 있다 (도 2). Cole, D. C., et al, J. Med. Chem., 50(23), 5535-5538, 2007를 참조한다. 얻어진 N-1 유도체 (표 1)는 결정화, 크로마토그래피에 의해 정제하거나, 또는 탈보호 시험에 직접 사용하였다.
표 1. a-BOC-Trytp아민의 N-1-보호된 유사체의 합성을 위한 시약.
Figure pct00101
* Chuit, C., et al, Tetrahedron, 36(16), 2305-10, 1980; Kudo, Noriaki, K., et al, Chem & Pharm Bull. 44(4), 699-702, 1996; Hoffamn, W. F., et al, J. Med. Chem., 29(5), 842-52, 1986.
** Takahashi, Y., et al, Synthetic Communications, 19(11-12), 1945-54, 1989; Fathi, B., et al, Helvetica Chimica Acta, 85(7), 2083-2088, 2002.
탈보호 시험 조건은 두 단계의 프로토콜에 근거하였다: tert-뷰틸아민 및 37 ℃에서의 암모늄 하이드록사이드. 소수성 모델 화합물을 용해시키기 위해, 메탄올을 탈보호 시약 (표 2)에 첨가하였다. 37 ℃에서의 각 탈보호 반응 샘플은 1, 4, 및 24 시간에 분석하였다. 일부 경우에, 기질에 70 ℃의 “스트레스” 탈보호 조건을 24 시간 동안 또한 적용하였다.
표 2. 올리고뉴클레오타이드 탈보호에 대한 모델 조건
Figure pct00102
모델 시스템 내 보호 그룹의 알칼리성 절단에 대한 표적 비율은 수학적 모델에 의해 정의된다. 탈보호는 과량의 염기의 존재하에 유사-1차 속도론을 따를 것으로 추정되었다. 최소 수용 가능한 비율은 24 시간에 99.9% 절단으로 정의하였다. 바람직한 반응 비율은 변동성에 더 큰 여유를 줄 것이며, 12 시간에 99.9% 절단으로 정의하였다. 이러한 기준에 근거하여, 바람직한 보호 그룹은 1 시간에 25-44%가 절단될 것이며 4 시간에 68-90%가 절단 및 24 시간에 >/= 99.9%가 절단될 것이다.
탈보호 반응은 실리카 겔 플레이트 상의 고전의 박막 크로마토그래피 (TLC)에 의해, 25% 에틸 아세테이트/75% 헥세인으로 용리시켜 모니터링하였다. 가장 정확한 TLC 가시화 기법은 알칼리성 과망간산 염 착색제인 것으로 밝혀졌다. 아이오딘 착색법은 비보호된 인돌의 과도한 표현을 초래하는 반면, UV 광 가시화는 보호된 N-1 아실 유도체의 과도한 표현을 초래할 수 있다.
먼저, 설폰일 보호 그룹을 연구하였다. 구조 및 반응성의 범위를 나타내기 위해 3개의 유도체를 합성하였다: 트라이플루오로메테인설폰일 (트라이플릴); 메테인설폰일 (메실); 및 벤젠설폰일 (베실) (표 1). 3가지 설폰일 유도체 모두 모델 올리고 탈보호 조건하에서 완전히 안정적 (0% 절단)인 것으로 발견되었다 (표 3). N-1-인돌 설폰일 보호 그룹을 절단하기 위해 문헌에 기재된 가혹한 알칼리성 조건 (NaOH + 가열)이 필요하며, 심지어 높은 반응성의 트라이플루오로메테인설폰일 (Tf) 그룹은 더욱 온화한 올리고 탈보호 조건에서 안정적인 것으로 결론지었다.
BOC-트립타민 및 적절한 산 클로라이드 시약으로부터 16개의 아실 유사체 (4개의 아릴 및 12개의 알킬) 세트를 합성하였다. 16개의 산 클로라이드는 상업적으로 획득하거나, 또는 상업적으로-수득 가능한 카복실 산으로부터 싸이오닐 클로라이드와의 반응에 의해 합성하거나, 또는 2-3 단계로 데 노보(de novo) 합성하였다 (표 1).
아실 보호 그룹은 알칼리성 탈보호 조건의 반응성 범위를 나타냈다. 4 개의 아릴 아실 유도체는 반응성의 스펙트럼을 나타냈다 (표 4). 비치환된 벤조일 그룹은 반응성이 너무 높아 1 시간 이내에 완전히 절단되는 반면, 2,4,6-삼중 치환된 유사체, Mes 및Tcb는 매우 안정하여 표준 조건 하에서는 검출 가능한 절단을 나타내지 않았다. 이러한 양 극단의 사이에서, 적당한 입체장애를 가지는 2-메틸벤조일 (Tol) 유사체가 원하는 표적 절단 비율 내에 들어맞았다. 추가적인 평가를 위해 Tol 그룹을 선택하였다.
표 3. 설폰일 그룹에 대한 탈보호 백분율 (“매우 느림”).
Figure pct00103
표 4. 아릴 아실 그룹에 대한 탈보호 백분율 (“적당함” = Tol).
Figure pct00104
12개의 알킬 아실 보호 그룹 중 어느 것도 원하는 표적 비율을 충족시키지 않는다. 유사체는 반응성이 너무 높거나 (표 5) 또는 너무 안정적인 (표 6) 것으로 밝혀졌다. 작은 구조 변화가 알칼리성 절단 속도를 극적으로 변화시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 다이메틸에틸아세틸 (Dmb)은 너무 빠른 반면, 다이에틸메틸아세틸 (Meb)은 너무 느리다.
일반적으로 불완전한 탈보호는 올리고뉴클레오타이드 합성에서 허용되지 않기 때문에, 너무 안정한 유사체 중 어느 것도 (표 5) 추가적인 개발에 대해 고려하지 않았다.
매우 빠른 반응성을 가지는 5개의 유사체가 매우 빠름 그룹 (표 5)에 존재한다: Piv, Mcp, Mch, Dmv, 및 Dmb. 모든 유사체가 1 시간에 ~90% 절단 및 4 시간에 100% 절단을 나타내어, 원하는 표적 비율 보다 빨랐다. 그럼에도 불구하고, 추가적인 평가를 위해 Piv 및 Dmb를 선택하였다.
요약하여, 초기 N-α-BOC-트립타민 모델 시스템은 가능한 N-1 보호 그룹으로서 3 개의 리드를 식별하였다: Tol, Dmb, 및 Piv. 3 개의 리드는 알칼리성 SOS 탈보호 조건에 대해 반응성의 범위를 나타냈다: Piv > Dmb > Tol.
표 5. 알킬 아실 그룹에 대한 탈보호 백분율 (“매우 빠름”)
Figure pct00105
표 6. 알킬 아실 그룹에 대한 탈보호 백분율 (“매우 느림”)
Figure pct00106
실시예 2: TrpU에 선택된 보호 그룹의 사용
3 개의 N-1 보호 그룹의 상이한 반응성 (Piv > Dmb > Tol)은 N-α-BOC 그룹을 제거하고 유리 염기 형태로 전환시킨 후 관찰되었다. N-1 보호된 유리 염기는 N-1 아실 그룹 (방향족 아민)이 N-a (1차 알킬 아민)로 이동하여, 더욱 강한 아마이드 결합을 형성하기 때문에 불안정하다 (도 4). 이러한 자동-분해 재배열은 표준 알칼리성 탈보호와 유사하다.
3개 유사체, Piv > Dmb > Tol는 다이클로로메테인에서 트라이플루오로아세트산으로 처리하여 N-α-BOC 보호 그룹을 절단하였다. 5% 소듐 카보네이트로 반응을 ?칭하고, 아이소프로필 아세테이트를 사용하여 N-1-보호된 트립타민 유리 염기를 추출하였다. 유리 염기 추출물(~100 mM)을 밤새 70 ℃에서 가열하여 안정성 시험을 수행하였다. Piv 화합물은 완전히 분해되었고, Dmb 화합물은 ~50% 분해되었으며, Tol 화합물은 <5% 분해되었음을 발견하였다. 회전 증발기에서 추출물을 농축시켜 순수한 아민을 실온에서 밤새 유지할 때 유사한 분해 정도가 관찰되었다. 추출물을 냉동고에 저장하는 경우 안정한 것으로 밝혀졌다.
그 다음, 3개의 리드 (Tol, Dmb, Piv)는, BOC 그룹을 제거하고, N-1 보호된 트립타민과 5'-O-DMT-5-(2,2,2-트라이플루오로에톡시-카보닐)-2'-데옥시우리딘 (TFEdU)을 축합하여, 다음의 N-1 보호된 TrpdU 뉴클레오사이드를 수득함으로써, 상응하는 5'-DMT-2'-데옥시우리딘-5-카복스아마이드로 전환되었다: Tol-TrpdU, Dmb-TrpdU 및 Piv-TrpdU. 아민의 자동분해를 최소화하기 위해, 회전 증발기에서 농축하기 전 de-BOC 반응으로부터의 건조된 추출물에 TFEdU를 직접 첨가하였다. 이러한 방법을 사용함으로써, 원하는 반응 경로가 우세하여, 순수한 5'-DMT-2'-데옥시우리딘-5-카복스아마이드를 수득하는 것을 발견하였으며, 이를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
이러한 뉴클레오사이드를 이후 모델 알칼리성 탈보호 시험에서 평가하였다 (표 7). 아실 보호 그룹, Tol 및 Dmb의 절단은, 초기 BOC-트립타민 모델에서 보다 TrpdU 뉴클레오사이드 화합물에서 더욱 느린 것으로 밝혀졌다 (표 6).
표 7. N-1-보호된 TrpdU 뉴클레오사이드에 대한 탈보호 백분율.
Figure pct00107
실시예 3: Piv-TrpdU CEP의 합성
(안정한 트라이플루오로아세테이트 [TFA] 염으로서) N-1-piv-트립타민 곁사슬을 제조하기 위한 효과적인 3-단계 공정이 개발되었으며, 3개 결정질 중간체를 포함하며, 크로마토그래피를 필요로 하지 않는다. 다음으로 TFA 염은 TFEdU과 커플링된다. 전체 공정은 도 5 및 6에 나타난다.
N -α-BOC-트립타민. 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하지 않는 N-α-BOC-트립타민의 제조 방법이 개발되었다. 용매로서 아이소프로필 아세테이트를 사용하면, 반응 혼합물로부터 직접 생성물을 결정화할 수 있도록 한다. 도 5를 참조한다.
출발 물질인, 트립타민은 옅은 주황색 또는 밝은 황갈색의 과립 결정질 고체이며, 예컨대 Alfa Aesar로부터 현재 상업적으로-수득 가능하다 (제품 A11116). 갈색의, 배설물 냄새가 나는 트립타민은 사용하기 전에 재결정화되어야 한다. BOC 무수물 (다이-tert-뷰틸 다이카보네이트; 제품 205249), 및 다른 용매 및 시약 모두는 Sigma-Aldrich로부터 구매하였으며 수령한 대로 사용하였다.
기계식 교반의 1 L 둥근 바닥 플라스크를 트립타민 (49.32 g, 308 mmol), 및 아이소프로필 아세테이트 (200 mL)로 채웠다. 아르곤 발포기 하에서 혼합물을 신속하게 교반하고, 아이소프로필 아세테이트 (100 mL) 중의 다이-tert-뷰틸 다이카보네이트 (70.53 g, 323 mmol) 용액을 30 분에 걸쳐 적가하였다. ~40 mL를 첨가한 후 지속적으로 기체가 발생하였고, 모든 고체는 첨가가 거의 끝날 때 용해되어, 황색 용액을 수득하였다. 또 다른 30 분간 계속 교반하고, TLC로 출발 트립타민의 소비를 확인하였다 (SG60, 10% MeOH/90% 다이클로로메테인, Rf(SM) = 0.1, Rf(생성물) = 0.8).
용액을 여과시켜 일부 모래와 먼지를 제거하였다. 회전 증발기에서 여과물 (~395 g)을 ~250 g으로 농축시키고, 탁도가 나타날 때까지 헥세인 (~220 mL)으로 따뜻한 (40 ℃) 용액을 희석시켰다. 용액에 10 mg 기준 생성물을 시딩하여 즉시 결정화하였다. 슬러리를 실온에서 1 시간 동안 및 얼음 상에서 1 시간 동안 교반한 다음, 여과하고 25% iPrOAc/75% 헥세인 (75 mL)으로 세정하였다. 여과 케이크를 헥세인 (100 mL)으로 세척하고 진공하에 건조시켜, N-α-BOC-트립타민을백색 결정질 고체 (mp 86-88 ℃)로서, 61.75 g, 77% 수율로 수득하였다.
N -α-BOC-N-1-트라이메틸아세틸-트립타민. Cole, D. C., et al, J. Med. Chem., 50(23), 5535-5538, 2007의 연구에 기초하여, 염기 및 용매로서 초기에는 THF 중의 포타슘 tert-뷰톡사이드를 반응에 사용하였으나, 결정화에 의해 제거하기 어려운 ~5%의 극성 이합체 부산물 (정확한 구조는 결정되지 않음)이 생성되었다. 여러 용매 및 염기 조합을 시도한 결과, 이합체 부산물은 다이에틸 에터 중의 소듐 tert-뷰톡사이드를 사용함으로써 억제될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 과-아실화된 부산물을 생성하지 않으면서 N-1 음이온을 적정하기 위해, 마지막에 소량의 트라이메틸아세틸 클로라이드를 첨가하였다. 도 5를 참조한다.
큰 (1.5”) 자성 교반 막대를 가지며 건조되어, 아르곤으로 충전된 1 L 둥근 바닥 플라스크에 N-α-BOC-트립타민 (28.63 g, 110 mmol) 및 소듐 tert-뷰톡사이드 분말 (11.63 g, 121 mmol, 주의: 자극성 먼지)을 채웠다. 아르곤 하에 다이에틸 에터 (무수, 400 mL)를 캐뉼라에 의해 첨가하고 10 분간 교반하여, 부드러운, 백악질의 슬러리를 수득하였다. 보정된 첨가 깔대기를 장착하고, 전체 부피가 60 mL인, 다이에틸 에터 (~50 mL) 중의 트라이메틸아세틸 클로라이드 (14.6 g, 121 mmol, 이론상 110%)의 용액으로 충전하였다. 슬러리를 얼음에서 냉각시키고, 신속하게 교반하고, 대부분의 산 클로라이드 용액 (54.5 mL, 110 mmol, 이론상 100%)을 ~40 분에 걸쳐 적가하였다. 또 다른 20 분간 용액을 교반하고 TLC를 위해 샘플링하였다 [1 mL 다이클로로메테인 중의 0.2 mL 분취액] (SG60, 25% 에틸아세테이트/75% 헥세인; Rf(SM) = 0.2, Rf(생성물) = 0.4). 출발 물질이 검출되는 경우 (>1%), 산 클로라이드 용액에 상응하는 추가의 충전재를 첨가하고 (TLC 분석에 의해 나타난 바와 같이, 이론상 1-10%) 1 시간 동안 교반을 지속하였다.
반응을 5% 소듐 바이카보네이트 (200 mL) 및 아이소프로필 아세테이트 (100 mL)으로 ?칭하였다. 유기층을 NaCl 염수 (50 mL)로 세척하고, MgSO4으로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 증발 건조시켜 황갈색 고체 (~37 g)를 수득하였다. 이러한 미정제 생성물을 뜨거운 아이소프로필 아세테이트 (74 mL) 및 헥세인 (296 mL)의 용액으로부터 재결정화하였다. ~35℃로 냉각시키고, 교반된 용액에 기준 생성물 (50 mg)을 시딩하여 즉시 결정화하였다. 슬러리를 실온에서 1 시간 동안 및 얼음 상에서 1 시간 동안 신속하게 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 여과물 일부 (30 mL)를 세정한 다음, 케이크를 헥세인 (60 mL)으로 세척하고, 진공하에 건조하였다. N-α-BOC-N-1-트라이메틸아세틸-트립타민을 백색 내지 회백색 결정질 고체 (mp 95-97 ℃)로서, 30.7 g, 81% 수율로 수득하였다.
원하는 경우, 생성물은 아이소프로필 아세테이트 (2 mL/g) 및 헥세인 (8 mL/g)으로부터 추가적으로 재결정화되어 재가공될 수 있다.
N -1-트라이메틸아세틸-트립타민 트라이플루오로아세테이트. 여과하고 용이하게 세척한 이러한 염은 백색 결정질 고체이며, 안정하며 비흡습성이다. 염은 반응 혼합물로부터 직접 결정화한다. 도 5를 참조한다.
500 mL 둥근 바닥 플라스크에 헤드스페이스를 아르곤으로 천천시 스위핑하도록 구성된 Claisen 어댑터 및 오일 발포기를 장착하였다. 이는 반응 혼합물로부터 아이소뷰틸렌 기체의 제거를 촉진하며 부생성물을 감소시킨다.
큰 자성 교반 막대를 가지는 (상기와 같은 구성의) 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 무수 다이클로로메테인 (90 mL)에 용해된 N-α-BOC-N-1-트라이메틸아세틸-트립타민 (30.0 g, 87.1 mmol)을 채우고, 트라이플루오로아세트산 (53 mL, 693 mmol, 8 당량)을 첨가하였다. 용액을 신속하게 교반하여 아이소뷰틸렌 기체가 방출되었고, 오일 발포기를 통해 스위핑하였다. 1 시간 후, 혼합물에 결정이 형성되기 시작하였고, TLC 분석은 출발 물질이 완전히 소비되었음을 나타냈다 (SG60, 25% 에틸 아세테이트/75% 헥세인; Rf(SM) = 0.4; RF(생성물) = 0). 잘 교반된 혼합물에 다이에틸 에터 (~275 mL)를 적가하여, 혼합물을 농축시키고, 얻어진 슬러리를 실온에서 1 시간 동안 신속하게 교반하였다. 일부 부드러운 케이크는 교반 막대로 부서지며, 슬러리를 여과하고 다이에틸 에터 (100 mL)로 세정하였다. 케이크를 다이에틸 에터 (100 mL)로 조심스럽게세척하고 진공하에 건조하여 N-1-트라이메틸아세틸-트립타민 트라이플루오로아세테이트 염을, 백색의, 결정질 분말 (mp 150-152 ℃)로서, 30.0 g, 96% 수율로 수득하였다.
N-1-트라이메틸아세틸-트립타민 트라이플루오로아세테이트 염은 흡습성을 현저히 가지지 않으며, 밀봉된 용기에 빛으로부터 보호하여, 주위 온도에서 운반될 수 있다. 비공식 안정성 시험에서, 이러한 염은 70 ℃의 밀봉된 바이알에서 10 일 동안 안정함을 나타냈다. 장기간 (>1 개월) 저장을 위해, 예방 조치로서 냉장 또는 냉동 저장 조건이 사용될 수 있다.
특정 트립타민 화합물의 1H-NMR 특성의 요약이 표 8에 나타난다.
Figure pct00108
5'- O -(4,4'-다이메톡시트라이틸)-5-[ N -((( N -1-트라이메틸아세틸)-3-인돌)-2-에틸)카복스아마이드]- -2'-데옥시우리딘 (Piv-TrpdU). 200 mL 둥근 바닥 플라스크를 5'-O-DMT-5-(2,2,2-트라이플루오로에톡시-카보닐)-2'-데옥시우리딘 (TFEdU, 공업용 등급 약 90%, 13.1 g, 20 mmol 비보정됨) 및 N-1-트라이메틸아세틸-트립타민 트라이플루오로아세테이트 염 (9.23 g, 26 mmol, 1.3 당량)으로 채웠다. 실린지로 무수 아세토나이트릴 (104 mL)을 첨가한 후, 트라이에틸아민 (5.6 mL, 40 mmol, 2.0 당량)을 첨가하였다. 얻어진 주황색 용액을 아르곤 하의 60 ℃에서 24 시간 동안 가열하였다. 0.1 mL 분취액을 취하여 다이클로로메테인 TLC 분석을 위해 희석시켰다 (SG60, 용리액: 1:1 아세톤:헥세인). 도 6을 참조한다. TFEdU 출발 물질이 검출 가능하도록 남아있는 경우 (>1%), 추가의 N-1-트라이메틸아세틸-트립타민 트라이플루오로아세테이트에 상응하는 충전재 (1-5%)를 첨가하고 가열을 지속한다. TFEdU가 소비된 경우 (<1%), 반응 혼합물을 회전 증발기 상에서 발포체로 증발시킨다. 크로마토그래피를 위해 발포체 (~33 g)를 다이클로로메테인 (30 mL)에 재용해시킨다.
4”D x 6”H 플래쉬 실리카 겔 컬럼을 2/2/96 TEA/MeOH/DCM (4 L)을 조건으로 한 다음, 2/98 MeOH/DCM (2 L)으로 플러싱하였다. 미정제 생성물을 도포하고 1/99 MeOH/DCM (2 L)에 이어, 2/98 MeOH/DCM으로 용리시켰다. 분획 (250 mL)을 수집하였고, 모아둔 분획 8-19으로 옅은 황색의 고체로서 piv-TrpdU 뉴클레오사이드, 14.8 g (66% 수율)을 수득하였다. 습윤 고체를 아르곤 하에서 취급하여 황변을 최소화한다.
Figure pct00109
1H-NMR (CD3CN, 300 MHz): δ 8.76 (1H, t, J = 6 Hz, CONHCH2), 8.54 (s, 1H, H-6), 8.41 (1H, bd, J = 8 Hz, I-7), 7.73 (1H, bs, I-2), 7.60 (1H, dt, J = 8,1 Hz, I-4), 6.81-7.43 (15H, m, 트라이틸 및 I-5 및 I-6, 중첩), 6.09 (1H, t, J = 6.5 Hz, H-1'), 4.24-4.28 (1H, m, H-3'), 3.98 (1H, q, J = 4 Hz, H-4'), 3.701 (3H, s, MeO), 3.700 (3H, s, MeO'), 3.62-3.69 (2H, m, CH2- α), 3.25-3.27 (2H, m, H-5' 및 H-5”), 2.95 (2H, t, J = 6.8 Hz, CH2-β), 2.18-2.34 (2H, m, H-2' 및 H-2”), 1.41 (9H, s, Piv).
13C-NMR (CD3CN, 100 MHz, 33xC): δ 177.0, 163.0, 161.8, 158.6, 149.5, 145.6, 145.1, 137.1, 135.8, 130.1, 129.5, 128.0, 127.9, 126.8, 125.0, 123.8, 123.2, 118.7, 118.6, 117.0, 113.1, 105.7, 86.3, 86.2, 71.0, 63.6, 54.8, 40.9, 40.2, 38.3, 27.8, 24.8.
질량 분석기 [M-H]-: C46H48N4O9에 대한 계산치: 800.91; 실험치: 799.3.
5'- O -(4,4'-다이메톡시트라이틸)-5- [ N -((( N -1-트라이메틸아세틸)-3-인돌)-2-에틸)카복스아마이드] -2'-데옥시우리딘-3'- O -( N,N -다이아이소프로필- O -2-사이아노에틸포스포아미다이트 (Piv-TrpdU CEP). 모든 크로마토 그래피 용매는 미세 기체 분산 튜브를 사용하여 아르곤으로 스파징 (sparging)하여 탈산소화하였다. 반응을 준비하기 위해, 6”D x 6”H 플래시 실리카 겔 컬럼을 2/30/68 Et3N/헥세인/EtOAc (8 L)을 조건으로 한 다음, 30/70 헥세인/EtOAc (4 L)으로 플러싱하였다. 추가의 30/70 용리액 (16 L)을 제조하고 탈기시켰다.
아르곤 하에서, 건조된 둥근 바닥 플라스크를 Piv-TrpdU (41.3 g, 51.5 mmol), 무수 다이클로로메테인 (83 mL), 2-사이아노에틸-N,N,N',N'-테트라아이소프로필포스포-아미다이트 (18.0 mL, 56.7 mmol, 1.1 당량), 및 마지막으로 , 피리딘 트라이플루오로아세테이트 분말 (10.95 g, 56.7 mmol, 1.1 당량)으로 채웠다. 혼합물을 신속하게 교반하여 황색 용액을 수득하였고, 30 분 후, TLC 분석 (SG60, 용리액: 1/1 EtOAc/헥세인)을 위해 분취액을 취하였으며, 이는 출발 물질이 소비되고 두 종류의 비극성 생성물이 형성되었음을 나타냈다. 도 6을 참조한다.
전체 반응 혼합물을 준비된 플래시 컬럼에 도포하고 30/70 헥세인/EtOAc으로 용리시켜, 아르곤으로 채워진, 캡핑된 세럼 병에 10 x 0.5 L, 10 x 1 L의 분획을 수집하였다. 모아둔 분획 8-17으로부터 생성물 (두 가지 부분입체 이성질체)을 수집하여, 아르곤 하에서 증발시키고, 연마 여과하고, 무수 ACN (2 x 500 mL)으로 추적하였다. 고진공에서 건조하여 회백색 발포체로서 Piv-TrpdU CEP (42.9 g, 83% 수율)를 수득하였다.
Figure pct00110
1H-NMR (CD3CN, 300 MHz) δ 9.61 (1H, bs, NH-3), 8.73/8.72 (1 H, 2bt, J = 5.6/5.6 Hz, CONHCH2), 8.58/8.56 (1H, 2s, H-6), 8.43/8.41 (1H, 2bd, J = 8 Hz, 인돌-7), 7.74 (1H, bs, 인돌-2), 7.60 (1H, bd, J = 8 Hz, 인돌-4), 6.83-7.45 (15 H, m, 13x 트라이틸 및 인돌-5 및 인돌-6, 중첩), 6.11/6.09 (1H, 2t, J = 6.6/6.6 Hz), 3.72 (3H, s, OMe), 4.38-4.47 (1H, m, H-3'), 4.12-4.15 (1H, m, H-4'), 3.71 (3H, s, OMe'), 3.51-3.76 (6H, m, CONHCH 2, 2 x Me2CH, CH 2CH2CN, 중첩), 3.29-3.35 (2H, m, H-5' 및 H-5”), 2.50/2.61 (2H, 2t, J = 6/6 Hz, CH 2CN), 2.27-2.54 (2H, m, H-2' 및 H-2”), 1.41 (9H, s, Piv), 1.01-1.16 (12H, m, 2 x [CH 3]2CH).
31P-NMR (CD3CN, 161 MHz) δ 148.12, 148.09.
3개의 N-1-보호된-TrpdU CEP 유사체에 대한 추가의 분석 데이터 요약 및 개발 배치 내역이 표 9에 제공된다.
표 9. N-1-보호된-TrpdU CEP 유사체에 대한 개발 배치 내역
Figure pct00111
실시예 4: TrpdU 포스포아미다이트에 선택된 보호 그룹의 사용
실질적으로 상기 논의된 바와 같이, 3개의 리드 N-1 보호된 유사체, Tol-TrpdU, Dmb-TrpdU 및 Piv-TrpdU를 사이아노에틸-N,N-다이아이소프로필 포스포아미다이트 (CEP)로 변환시키고, 이들의 사용을 고상 올리고뉴클레오타이드 합성에서 평가하였다.
3개의 보호된 TrpdU CEP 모두 고상 올리고뉴클레오타이드 합성에 잘 작용 하였지만, Tol-TrpdU는 일부 경우에 뉴클레오사이드 모델 시스템과 일치하는 불완전한 탈보호를 나타냈다 (표 7). Dmb-TrpdU 및 Piv-TrpdU 둘 모두는, 모든 표준 조건 (tBuNH2/MeOH/H2O; MeNH2 (기체)) 하에서 완전히 탈보호되었다.
동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지는 압타머를 Piv-TrpdU CEP, 원래의 비보호된 TrpdU CEP 또는 NapdU CEP (양성 대조군; 표 10)를 사용하여 합성하였고, 각각의 변형된 dU는 서열 내 U 염기 위치를 차지한다. 압타머는 13 dU 위치 잔기를 가지는 51-mer이다.
표 10: Piv-TrpdU, TrpdU, 및 NapdU를 사용하여 합성된 압타머
Figure pct00112
도 4는 혼입된 Piv-TrpdU, TrpdU, 및 NapdU를 가지는 3개의 압타머에 대한 결과를 나타낸다. 비보호된 TrpdU CEP는 초기 및 후기 용리 부산물과 함께 넓은 피크를 나타낸다. Piv-TrpdU CEP는 NapdU CEP를 가지는 대조군 압타머와 비교하여, 좁은 피크 폭을 가지며 눈에 띄게 깨끗한 프로파일을 나타낸다.
Piv-TrpdU CEP는 비보호된 TrpdU보다 새로운 포스포아미다이트를 사용하여 수율 개선을 입증하기 위해 6개의 상이한 압타머를 합성하도록 사용되었다. 먼저 표 11의 4개의 압타머 (압타머 1 내지 4)를 표준 조건을 사용하여 1 μmol 규모로 MerMade 합성기 (AME Bioscience) 상에서 합성하였고, 비보호된 TrpdU를 사용하여 이전의 낮은 수율을 나타냈다. 표 11의 5번째 압타머 (압타머 5)는 표준 워크플로우 및 탈보호 조건을 사용하여 ABI 합성기에서 합성하였고, 비보호된 TrpdU을 사용하여 허용 가능한 수율을 나타냈다. 6번째 압타머 (압타머 6)는 표준 워크플로우 및 탈보호 조건을 사용하여 ABI 합성기에서 합성하였고, 비보호된 TrpdU를 사용하여 이전의 낮은 수율을 나타냈다.
표 11은 이러한 실험의 결과를 나타낸다.
표 11: Piv-TrpdU 대 TrpdU를 사용한 합성 수율 (%전체 길이 SOMAmer)
Figure pct00113
압타머 1-4 및 6에 대한 올리고뉴클레오타이드 합성에 Piv-TrpdU CEP를 사용하면, 압타머의 합성 수율이 비보호된 TrpdU을 가지는 압타머의 합성 수율의 약 250-300%로 증가하였다. 압타머 5에 대한 올리고뉴클레오타이드 합성에 Piv-TrpdU CEP를 사용하면, 합성 수율이 비보호된 TrpdU를 가지는 압타머의 합성 수율에 비해 약 25% 증가하였다. 이에 따라, 상이한 합성기가 상이한 수율을 제공할 수 있지만, 일반적인 경향은 Piv-TrpdU CEP를 사용하면 비보호된 TrpdU의 사용과 비교하여 올리고뉴클레오타이드 합성 수율을 개선하는 것이다.

Claims (50)

  1. 다음을 포함하는 화합물:
    Figure pct00114
    , 또는 이의 염으로서;
    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고;
    X1 및 X2는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택되고;
    X3는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시으로부터 선택되는 화합물.
  2. 제1항에 있어서, R1은 tert-뷰틸인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X1 및 X2는 메톡시인 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 수소인 화합물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 메톡시인 화합물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 플루오로인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00115
    ;
    Figure pct00116
    ;
    Figure pct00117
    ;
    Figure pct00118
    ;
    Figure pct00119
    ;
    Figure pct00120
    ;
    Figure pct00121
    ;
    및 이의 염.
  8. 다음을 포함하는 화합물:
    Figure pct00122
    , 또는 이의 염으로서;
    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고;
    X1 및 X2는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택되고;
    X3는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시로부터 선택되는 화합물.
  9. 제8항에 있어서, R1은 tert-뷰틸인 화합물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, X1 및 X2는 메톡시인 화합물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 수소인 화합물.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 메톡시인 화합물.
  13. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 플루오로인 화합물.
  14. 제8항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00123
    ;
    Figure pct00124
    ;
    Figure pct00125
    ;
    Figure pct00126
    ;
    Figure pct00127
    ;
    Figure pct00128
    ;
    Figure pct00129
    ;
    및 이의 염.
  15. 다음을 포함하는 화합물:
    Figure pct00130
    , 또는 이의 염으로서;
    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되는 화합물.
  16. 제15항에 있어서, R1은 tert-뷰틸인 화합물.
  17. 제15항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00131
    ;
    Figure pct00132
    ;
    Figure pct00133
    ;
    Figure pct00134
    ;
    Figure pct00135
    ;
    Figure pct00136
    ;
    Figure pct00137
    ;
    및 이의 염.
  18. 다음을 포함하는 화합물로서:
    Figure pct00138

    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되는 화합물.
  19. 제18항에 있어서, R1은 tert-뷰틸인 화합물.
  20. 제18항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00139
    ;
    Figure pct00140
    ;
    Figure pct00141
    ;
    Figure pct00142
    ;
    Figure pct00143
    ;
    Figure pct00144
    ;
    Figure pct00145
    .
  21. 다음을 포함하는 화합물:
    Figure pct00146
    , 또는 이의 염의 제조 방법으로서;
    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고 ;
    상기 방법은 N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, R1은 tert-뷰틸이고, 산 클로라이드는 피바로일 클로라이드인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 화합물은 다음으로부터 선택되는 방법:
    Figure pct00147
    ;
    Figure pct00148
    ;
    Figure pct00149
    ;
    Figure pct00150
    ;
    Figure pct00151
    ;
    Figure pct00152
    ; 및
    Figure pct00153
    .
  24. 다음을 포함하는 화합물:
    Figure pct00154

    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고 ;
    상기 방법은 다음의 화합물
    Figure pct00155

    과 트라이플루오로아세트산을 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, R1은 tert-뷰틸인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 방법은 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조하는 방법:
    Figure pct00156
    ;
    Figure pct00157
    ;
    Figure pct00158
    ;
    Figure pct00159
    ;
    Figure pct00160
    ;
    Figure pct00161
    ;
    Figure pct00162
    .
  27. 제21항에 있어서, 상기 방법은 N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시켜, 다음의 화합물
    Figure pct00163
    을 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  28. 다음을 포함하는 화합물:
    Figure pct00164
    , 또는 이의 염의 제조 방법으로서;
    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고;
    X1 및 X2는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택되고;
    X3는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시으로부터 선택되고;
    상기 방법은 다음의 화합물
    Figure pct00165

    과 5'-O-DMT-5-(2,2,2-트라이플루오로에톡시-카보닐)-2'-데옥시우리딘 (TFEdU)을 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 방법은 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조하는 방법:
    Figure pct00166
    ;
    Figure pct00167
    ;
    Figure pct00168
    ;
    Figure pct00169
    ;
    Figure pct00170
    ;
    Figure pct00171
    ;
    Figure pct00172
    ; 및 이의 염.
  30. 제28항 내지 제29항에 있어서, 상기 방법은 다음의 화합물
    Figure pct00173

    과 트라이플루오로아세트산을 반응시켜, 다음의 화합물
    Figure pct00174
    을 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 방법은 N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시켜, 다음의 화합물
    Figure pct00175
    을 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  32. 다음을 포함하는 화합물:
    Figure pct00176
    , 또는 이의 염의 제조 방법으로서;
    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고;
    X1 및 X2는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택되고;
    X3는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시으로부터 선택되고;
    상기 방법은 다음의 화합물
    Figure pct00177

    과 2-사이아노에틸-N,N,N',N'-테트라아이소프로필포스포-아미다이트를 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, R1은 tert-뷰틸인 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, X1 및 X2는 메톡시인 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 수소인 방법.
  36. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 메톡시인 방법.
  37. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 플루오로인 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음의 화합물
    Figure pct00178

    과 5'-O-DMT-5-(2,2,2-트라이플루오로에톡시-카보닐)-2'-데옥시우리딘 (TFEdU)을 반응시켜, 다음의 화합물
    Figure pct00179
    을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법은 다음의 화합물
    Figure pct00180

    과 트라이플루오로아세트산을 반응시켜, 다음의 화합물
    Figure pct00181
    을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 방법은 N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시켜, 다음의 화합물
    Figure pct00182
    을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조하는 방법:
    Figure pct00183
    ;
    Figure pct00184
    ;
    Figure pct00185
    ;
    Figure pct00186
    ;
    Figure pct00187
    ;
    Figure pct00188
    ;
    Figure pct00189
    ;
    및 이의 염.
  42. 다음을 포함하는 화합물:
    Figure pct00190
    , 또는 이의 염의 제조 방법으로서;
    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고;
    X1 및 X2는 각각 독립적으로 메톡시 및 수소로부터 선택되고;
    X3는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시으로부터 선택되고;
    다음의 단계를 포함하는 방법:
    e) N-α-BOC-트립타민과, 피바로일 클로라이드, 2,2-다이메틸뷰틸로일 클로라이드, 2,2-다이메틸발레로일 클로라이드, 1-메틸사이클로펜테인-1-카보닐 클로라이드, 1-메틸사이클로헥세인-1-카보닐 클로라이드, 2-클로로벤조일 클로라이드, 및 2-사이아노벤조일 클로라이드로부터 선택되는 산 클로라이드를 반응시켜, 다음의 화합물
    Figure pct00191
    을 형성하는 단계;
    f) 다음의 화합물
    Figure pct00192
    과 트라이플루오로아세트산을 반응시켜, 화합물
    Figure pct00193
    을 형성하는 단계;
    g) 다음의 화합물
    Figure pct00194
    과 5'-O-DMT-5-(2,2,2-트라이플루오로에톡시-카보닐)-2'-데옥시우리딘 (TFEdU)을 반응시켜, 다음의 화합물
    Figure pct00195
    을 형성하는 단계; 및
    h) 다음의 화합물
    Figure pct00196
    과 2-사이아노에틸-N,N,N',N'-테트라아이소프로필포스포-아미다이트를 반응시키는 단계.
  43. 제42항에 있어서, R1은 tert-뷰틸인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, X1 및 X2는 메톡시인 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 수소인 방법.
  46. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 메톡시인 방법.
  47. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 플루오로인 방법.
  48. 제42항에 있어서, 상기 방법은 다음으로부터 선택되는 화합물을 제조하는 방법:
    Figure pct00197
    ;
    Figure pct00198
    ;
    Figure pct00199
    ;
    Figure pct00200
    ;
    Figure pct00201
    ;
    Figure pct00202
    ;
    Figure pct00203
    ;
    및 이의 염.
  49. 적어도 하나의 보호된 TrpU 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드로서, 이러한 올리고뉴클레오타이드 적어도 하나의 보호된 TrpU 뉴클레오타이드는 다음의 구조를 가지며:
    Figure pct00204
    ;
    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고;
    X3는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시으로부터 선택되고;
    X4는 OH, -OR, -SR, 및 -Z-P(Z')(Z”)O-R으로부터 선택되며, 여기서 Z, Z', 및 Z”는 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되고, R은 올리고뉴클레오타이드 내에서 인접한 뉴클레오타이드이고;
    X5는 -O-ss, -OR, -SR, 및 -Z-P(Z')(Z”)O-R로부터 선택되며, 여기서 ss는 고체 지지체이고, Z, Z', 및 Z”는 각각 독립적으로 O 및 S으로부터 선택되고, R는 올리고뉴클레오타이드 내에서 인접한 뉴클레오타이드인, 올리고뉴클레오타이드.
  50. 적어도 하나의 TrpU 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법으로서, 상기 방법은 다음의 구조를 가지는 적어도 하나의 뉴클레오타이드:
    Figure pct00205

    여기서,
    R1은 tert-뷰틸, 1,1-다이메틸-프로필; 1,1-다이메틸-뷰틸; 2-클로로페닐; 2-사이아노페닐; 1-메틸-사이클로펜틸; 및 1-메틸-사이클로헥실으로부터 선택되고;
    X3는 메톡시, 플루오로, 수소, 및 tert-뷰틸다이메틸실릴옥시으로부터 선택되고;
    X4는 OH, -OR, -SR, 및 -Z-P(Z')(Z”)O-R으로부터 선택되며, 여기서 Z, Z', 및 Z”는 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되고, R은 올리고뉴클레오타이드 내에서 인접한 뉴클레오타이드이고;
    X5는 -O-ss, -OR, -SR, 및 -Z-P(Z')(Z”)O-R로부터 선택되며, 여기서 ss는 고체 지지체이고, Z, Z', 및 Z”는 각각 독립적으로 O 및 S으로부터 선택되고, R는 올리고뉴클레오타이드 내에서 인접한 뉴클레오타이드이고;
    를 고체 지지체 상의 뉴클레오타이드 서열 내로 혼입시키는 단계; 및 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입된 적어도 하나의 TrpU 뉴클레오타이드로부터
    Figure pct00206
    보호 그룹을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
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