KR20180115751A

KR20180115751A - 살아있는 식물로부터 수득한 성분에 의한 태양광의 유해 효과의 완화

Info

Publication number: KR20180115751A
Application number: KR1020187027108A
Authority: KR
Inventors: 올가 듀바-코가노브; 아티옴 듀브; 리 장; 까린 뀌뀌멜; 질 오베르토
Original assignee: 아이에스피 인베스트먼츠 엘엘씨
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2017-02-27
Publication date: 2018-10-23
Also published as: US20220071892A1; EP4147751A1; EP3419721A1; US20190282491A1; US11154493B2; CN109152726B; US11766398B2; EP3419721A4; EP3419721B1; CN109152726A; WO2017147578A1; JP2019506436A

Abstract

피부 노화와 연관된 피부 외관을 개선시키는 방법이 본원에 개시된다. 방법은 적어도 하나의 노화 징후를 갖는 피부 표면에 항노화 생물활성 조성물을 도포하는 단계를 포함한다. 항노화 생물활성 조성물은 적어도 하나의 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포된다. 한 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 피부과용으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

Description

살아있는 식물로부터 수득한 성분에 의한 태양광의 유해 효과의 완화

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 2월 25일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/299,614의 우선권 이익을 주장하며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

개시내용의 분야

본 개시내용은 특히 화장품 분야에 관한 것이고, 보다 구체적으로 살아있는 식물로부터 수득한 성분에 의한 태양광의 유해 효과를 완화시키는 분야에 관한 것이다.

인간 피부에 대한 태양광의 손상 효과는 널리 공지되어 있다. 과도하게 높은 노출은 자극 및 염증을 수반하는 급성 유해 반응, 예컨대 UV 유발 일광화상으로 이어진다. 그러나, 전체 태양 방사선 스펙트럼의 90% 초과는 VIS - IR 범위이고, 피부 손상에 대한 그의 잠재적 기여가 점점 인식되고 있다. 급성 피부 반응을 유발하는데 활동상 불충분한 일광 노출도 여전히 염증-관련 과정을 촉발할 수 있고; 누적된 염증성 손상은 광노화로 공지된 과정으로, 피부 탄력성의 저하 및 바람직하지 않은 외관의 발생에 유의하게 기여한다.

본 발명은 관련 기술분야에서 이들 및 다른 부족함을 극복하는 것에 관한 것이다.

본원은 특히, 넬룸보 누시페라 가에르튼.(Nelumbo nucifera Gaertn.) (연꽃)의 신선한 (살아있는) 전체 식물 및 카모밀라 레쿠티타(Chamomilla recutita) (독일 카모마일)로부터 수집된 신선한 (살아있는) 꽃으로부터 수득된 본 발명의 생물학적 활성 성분을 신체 또는 얼굴 피부의 적어도 일부에 국소 도포하는 것을 포함하는, 살아있는 식물로부터 수득된 성분으로 태양광의 유해 효과를 완화시키기 위한 미용 관리 방법을 개시한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획을 사용하여 피부 노화와 연관된 피부 외관을 개선시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 적어도 하나의 노화 징후를 갖는 피부 표면에 항노화 생물활성 조성물을 도포하는 단계를 포함하며, 여기서 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획을 포함한다. 항노화 생물활성 조성물은 적어도 하나의 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포된다. 이러한 방법의 특정 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 피부과용으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 사용하여 피부 노화와 연관된 피부 외관을 개선시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 적어도 하나의 노화 징후를 갖는 피부 표면에 항노화 생물활성 조성물을 도포하는 단계를 포함하며, 여기서 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 포함한다. 항노화 생물활성 조성물은 적어도 하나의 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포된다. 이러한 방법의 특정 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 피부과용으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.

본 개시내용에 따르면, 본원에 기재된 세럼 분획이 각각 피부 노화의 유해 효과를 완화시키는 것과 연관된 다양한 유리한 특성의 조합을 갖는다는 것이 예상외로 발견되었다. 이러한 유리한 특성은, 제한 없이, 하기: (i) UVA-UVB 구역에서의 유익한 스펙트럼 흡광도 특징; (ii) 전체 스펙트럼 모의 일광 노출 후에 입증된 넓은 UVA 및 UVB 스펙트럼 흡수 광안정성과 함께 높은 UVA:UVB 흡광도 비 (UVA:UVB 흡광도 비의 계산은 0 (UVA 흡광도 부재와 동등함)에서 최대 1.0 (UVA 흡광도가 UVB와 동등함)의 값을 산출할 수 있음에 주목); (iii) 특별하고, 바람직하고, 예상되는 특성이 아닌, 방사선량이 증가됨에 따른 UVA1 구역에서의 증가된 감쇠 및 UVA/UVB 비에서의 동시 증가; (iv) 전체 스펙트럼 모의 일광 노출과 연관된 다양한 시험관내 세포 배양 기반 생물검정 및 관련 효소적 모델에서 입증된, 강력한 생물학적 활성 (특성); (v) 성능 관점에서 그의 광안정성을 확인시켜주는, 전체 스펙트럼 모의 태양광에 의해 전달된 4 MED 노출 후 초기 (조사-전) DPPH 켄칭 능력의 95% 초과의 유지; 및 (vi) 그의 조합을 포함한다. 본 개시내용의 세럼 분획은 또한, 피부 세포에 대한 전체 스펙트럼 태양광 노출의 다양한 유해 효과를 완화시키는데 함께 작용하는 다중기능적 활성을 제공한다는 것이 발견되었다.

기존 피부 노화 제품 및 방법을 뛰어넘는 본 개시내용의 세럼 분획 및 방법의 또 다른 이점은 세럼 분획이 자연에서 발견되지 않는 분획화 과정을 사용하여 살아있는 식물로부터 유래된다는 것이다. 추가로, 본원에 기재된 바와 같이, 살아있는 식물로부터 수득된 세럼 분획은 수용성/혼화성이고, 무기 미립자 물질, 예컨대 산화아연의 사용을 필요로 하지 않는다. 추가적으로, 본 개시내용의 세럼 분획은 그들이 산화아연과 같은 이러한 무기 미립자 물질이 거의 할 수 없는 일광 노출의 다양한 유해 효과의 완화를 가능하게 할 수 있다는 점에서 유리하다.

기존 피부 노화 제품 및 방법을 뛰어넘는 본 개시내용의 세럼 분획 및 방법의 또 다른 이점은 세럼 분획의 탁월한 안전성 및 독성 프로파일을 포함한다. 본원에 제시된 바와 같이, 유리한 안전성/독성 프로파일에 기초하여, 본 개시내용의 세럼 분획은, 필요한 경우에 또는 바람직한 경우에, 관련 기술분야의 피부 노화 제품보다 훨씬 더 높은 농도로 사용될 수 있는 것이 실현가능하다. 관련 기술분야에 공지된 일부 피부 노화 제품은 총 중량을 기준으로 약 15%의 활성 성분의 상한치를 가질 수 있는 반면에, 본 개시내용의 세럼 분획은 일부 적용의 경우에 "그 자체로" (즉, 공급된 바와 같은 100%로) 사용될 수 있다.

본 발명의 이들 및 다른 목적, 특색 및 이점은 첨부 도면과 함께 하기 본 발명의 다양한 측면의 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.

본 발명의 측면을 예시하기 위해, 본 발명의 특정 실시양태가 도면에 도시된다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다. 추가로, 제공되는 경우에, 도면에 포함된 비슷한 참조 번호는 유사하거나 동일한 요소를 식별하기 위한 것으로 의도된다.
도 1은 본 발명의 생물활성 항노화 성분을 제조하는 과정의 한 실시양태를 입증하는 개략적 도면이다.
도 2는 조사 전 및 후의 5% 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 정규화된 흡광도 스펙트럼을 보여준다.
도 3은 조사 전 및 후의 5% 카모밀라 레쿠티타 (마트리카리아) (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 정규화된 흡광도 스펙트럼을 보여준다.
도 4는 본 발명의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 한 실시양태에 관한 히알루론산 형광 염색의 정량화로부터의 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 한 실시양태에 관한 필라그린 형광 염색의 정량화로부터의 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 한 실시양태에 관한 AQP3 형광 염색의 정량화로부터의 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 한 실시양태에 관한 형광 염료 침투의 정량화로부터의 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 한 실시양태에 관한 콜라겐 I 형광 염색의 정량화로부터의 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 한 실시양태에 관한 분화된 3T3-L1에서의 글리세롤 방출의 정량화로부터의 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 한 실시양태에 관한 폰타나 마송 염색의 정량화로부터의 결과 그래프이다.

본 개시내용은, 특히, 피부에 대한 태양광의 유해 효과의 완화를 위한 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한, 넬룸보 누시페라 가에르튼. (연꽃)의 신선한 (살아있는) 전체 식물 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일)로부터 수집된 신선한 (살아있는) 꽃으로부터 수득된 본 발명의 생물학적 활성 성분을 신체 또는 얼굴 피부의 적어도 일부에 국소 도포하는 것을 포함하는, 미용 관리 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 이들 생물활성 식물성 화장품 조성물을 제조하는 방법, 및 이들 조성물의 다양한 제제로의 및 국소 피부 용도로서의 사용에 관한 것이다.

본원에 기재된 모든 수치 범위는 보다 좁은 범위를 포함하고; 서술된 상한치 및 하한치 범위는 명시적으로 서술되지 않은 추가의 범위 생성을 위해 상호교환가능하다.

본 개시내용에 기재되고 사용되는 조성물은 본원에 기재된 필수 구성요소 뿐만 아니라 임의적인 성분을 포함할 수 있거나, 그것으로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 "본질적으로 이루어진"은, 조성물 또는 구성요소가 추가의 성분을 포함할 수 있지만, 추가의 성분이 청구된 조성물 또는 방법의 기본적 및 신규 특징을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 그러하다는 것을 의미한다.

조성물과 관련하여 사용된 용어 "도포하다" 또는 "도포"는 본 발명의 조성물을 인간 피부 표면 예컨대 표피 위에 도포하거나 펴바르는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "피부과용으로 허용되는"은 기재된 조성물 또는 구성요소가 과도한 독성, 비상용성, 불안정성, 알레르기 반응 등이 없이 인간 피부 조직과 접촉시켜 사용하는데 적합하다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "유효량"은 유의하게 긍정적 외관을 유도하고/거나 이익을 느끼게 하는데 충분하지만, 심각한 부작용을 회피하는데 충분히 낮은 (즉, 통상의 기술자의 타당한 판단의 범주 내의 합리적인 이익 대 위험 비를 제공하는) 화합물 또는 조성물의 양을 의미한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 피부 노화와 연관된 피부 외관을 개선시키는 방법을 제공한다. 방법은 적어도 하나의 노화 징후를 갖는 피부 표면에 항노화 생물활성 조성물을 도포하는 단계를 포함한다. 항노화 생물활성 조성물은 적어도 하나의 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포된다.

특정한 측면에서, 본 개시내용은 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획을 사용하여 피부 노화와 연관된 피부 외관을 개선시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 적어도 하나의 노화 징후를 갖는 피부 표면에 항노화 생물활성 조성물을 도포하는 단계를 포함하며, 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획을 포함한다. 항노화 생물활성 조성물은 적어도 하나의 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포된다.

한 실시양태에서, 유효량의 상기 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획은 전체 조성물의 0.001 중량% 내지 100 중량% 범위로 존재한다.

한 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 피부과용으로 허용되는 담체를 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 상기 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획을 0.001% 내지 99% 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 사용하여 피부 노화와 연관된 피부 외관을 개선시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 적어도 하나의 노화 징후를 갖는 피부 표면에 항노화 생물활성 조성물을 도포하는 단계를 포함하며, 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 포함한다. 항노화 생물활성 조성물은 적어도 하나의 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포된다.

한 실시양태에서, 유효량의 상기 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획은 전체 조성물의 0.001 중량% 내지 100 중량% 범위로 존재한다.

한 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획 및 피부과용으로 허용되는 담체를 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 상기 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 0.001% 내지 99% 포함한다.

본 개시내용에 따르면, 항노화 생물활성 조성물은 태양광에의 피부 노출의 유해 효과를 완화시킨다.

본 개시내용에 따르면, 항노화 생물활성 조성물은 피부 세포에 대한 전체 스펙트럼 태양광 노출의 유해 효과를 완화시키는데 상승작용적으로 작용하는 다중기능적 활성을 갖는다.

본 개시내용에 따르면, 항노화 생물활성 조성물은 피부 수화, 피부 장벽 기능, 피부 처짐, 피부 주름 외관, 배액 및 신체 윤곽형성, 피부 색소침착, 및/또는 피부 색조를 개선시킴으로써 피부 노화와 연관된 피부 외관 속성을 개선시키는데 효과적이다.

본 개시내용에 따르면, 항노화 생물활성 조성물은 하기: (i) UVA-UVB 구역에서의 유익한 스펙트럼 흡광도 특징; (ii) 전체 스펙트럼 모의 일광 노출 후에 입증된 넓은 UVA 및 UVB 스펙트럼 흡수 광안정성과 함께 높은 UVA:UVB 흡광도 비; (iii) 방사선량이 증가됨에 따른 UVA1 구역에서의 증가된 감쇠 및 UVA/UVB 비에서의 동시 증가; (iv) 전체 스펙트럼 모의 일광 노출과 연관된 다양한 시험관내 세포 배양 기반 생물검정 및 관련 효소적 모델에서 입증된, 강력한 생물학적 활성 (특성); (v) 전체 스펙트럼 모의 태양광에 의해 전달된 4 MED 노출 후 초기 (조사-전) DPPH 켄칭 능력의 95% 초과의 유지; (vi) 피부 세포에 대한 전체 스펙트럼 태양광 노출의 다양한 유해 효과를 완화시키는데 함께 작용하는 다중기능적 활성; 및 (vii) 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 특성의 상승작용적 조합을 갖는다.

본 개시내용의 방법의 다양한 실시양태에 따르면, 피부 표면은 신체 피부 표면 및 얼굴 피부 표면으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 개시내용의 방법의 특정 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 선스크린 활성제, 항염증제, 및 피부 색조 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 성분을 추가로 포함한다.

본 개시내용의 방법의 다른 실시양태에서, 항노화 생물활성 조성물은 복수의 피부 노화 징후에, 복수의 피부 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포된다.

본 개시내용의 방법에 따르면, 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 또는 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획은 자연에서 발견되지 않는 분획화 과정을 사용하여 단리된다. 한 실시양태에서, 분획화 과정은 넬룸보 누시페라 (연꽃) 식물 또는 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃의 신선한 식물 바이오매스로부터 유래된 식물 세포 주스를 전자기장에 2.45 GHz 초과의 주파수로, 식물 세포 주스를 탈안정화시키기에 효과적인 시간 동안 적용하여 응고된 막 분획을 포함하는 응고된 세포 주스 혼합물을 수득하는 단계, 및 상기 응고된 막 분획을 상기 응고된 세포 주스 혼합물로부터 분리하여 상기 막 분획이 실질적으로-부재하는 세포질/시토졸 분획을 포함하는 생물활성 분획을 수득한 다음, 세포질 분획을 안정화된 시토졸 분획으로부터 분리할 수 있는 추가의 처리를 하여 세럼 분획을 수득하는 단계를 포함한다 (도 1).

상기 기재된 바와 같이, 식물 세포 주스가 막 분획 및 세포 주스 상청액, 즉 세포질/시토졸 분획(30)으로 분리되면, 이는 세포질 분획을 시토졸 분획으로부터 분리할 수 있는 추가의 처리에 적용된다.

세포질 분획의 완전한 분리를 평가하기 위한 정량적 기준은 시토졸 분획 내 검출가능한 수준의 고분자량 단백질의 부재 및/또는 리불로스 1,5-비포스페이트 카르복실라제 옥시게나제의 부재이다.

시토졸 분획은 세포내 물에 용해된 저분자량 수용성 구성요소를 함유한다. 시토졸 분획은 황색 및 약한 특징적 냄새를 갖는 투명한 액체이다. 수시간 내에, 불안정한 시토졸 분획은 무거운 침전물 및 강한 비-특징적 냄새를 함유하는 암갈색 현탁액으로 불가역적으로 변환된다. 그 결과, 시토졸 분획은 화장품 성분으로서 사용될 수 없다. 이어서 기재되는 절차는 안정하고 활성인 세럼 분획을 생성하도록 시토졸 분획의 정련을 가능하게 한다. 이는 원치않는 침전물의 생성 및 색 및 냄새의 악화로 이어지는 불가역적 변환의 원인이 되는 주요 구성요소를 시토졸 분획으로부터 제거함으로써 달성된다. 이러한 절차는 모두 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,442,391, 8,101,212, 8,277,852 및 8,318,220에 기재된 바와 같은 pH 조정, 열 처리, 냉각, 진공 여과, 및 안정화를 포함한다.

시토졸 분획이 생성된 후, 이는 이어서 세럼 분획의 생성을 위해 안정화 단계에 적용된다 (도 1). 본 발명의 안정화 단계에 사용하는데 적합한 작용제는 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 소듐 메틸 파라벤, 테트라소듐 EDTA, 펜틸렌 글리콜, 메타중아황산나트륨을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 개시내용에 따른 생물활성 성분은 넬룸보 누시페라 가에르튼. (연꽃)의 신선한 (살아있는) 전체 식물 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일)로부터 수집된 신선한 (살아있는) 꽃으로부터, 그의 개시내용이 모두 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,442,391; 7,473,435; 7,537,791; 8,043,635; 8,101,212; 8,277,852; 8,318,220; 미국 특허 출원 공개 번호 US-2015/0258012A1 및 US-2016/0000851A1; 및 PCT/EP2013/073565에 기재된 과정에 따라 수득될 수 있고, 태양광의 다양한 유해 효과를 완화시키는 그의 능력에 대해 평가될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 세럼 분획은 자연 발생된 것이 아니고, 대신 인공 제조 과정을 사용하여 생산된다. 한 실시양태에서, 이러한 제조 과정은 신선한 살아있는 식물 (또한 신선한 식물 바이오매스로 지칭됨)을 분쇄 및 가압하여 식물 세포 주스 (세포내 콜로이드성 분산액)를 수득하고, 이를 전자기파로, 세포 주스로부터 막 분획의 분리를 개시하기에 효과적인 주파수로 처리하여 막 분획이 실질적으로 부재하는 세포 세포질/시토졸 분획을 수득하는 것을 사용한다. 세포질/시토졸 분획은 세포질/시토졸 분획을 그의 구성요소 부분, 예를 들어 세포질 분획 및 시토졸 분획으로 분리하는데 효과적인 조건 하에 추가로 가공된다. 본 발명에 사용되는 신선한 식물 바이오매스로부터 식물성 분획의 제조를 위한 과정은 신선한 식물 바이오매스를 분쇄 (또는 온침) 및 가압하여 막 분획을 함유하는, 본원에서 식물 세포 주스로 지칭되는 세포내 식물 물질을 수득하고, 상기 세포 주스를 전자기파로, 상기 세포 주스 분획으로부터 상기 막 분획의 분리를 촉발하기에 효과적인 주파수로 처리하여 막 분획이 실질적으로-부재하는 세포 세포질/시토졸 분획을 수득하는 것을 포함한다. 상기 언급된 처리는 상기 처리 동안 상기 세포 주스의 온도가 40℃를 초과하지 않도록 유리하게 수행된다. 이어서 막 분획은 항단백질분해, 세포 성장 억제 활성, 및/또는 항단백질분해 및 세포 성장 억제 활성 둘 다를 나타내는 안정한 식물성 화장품 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 항단백질분해 활성은 적어도 1종의 프로테이나제의 억제로 인한 것이고, 세포 성장 억제 활성은 적어도 1종의 유형의 세포의 세포 성장의 억제로 인한 것이다. 세포질/시토졸 분획은 제약, 화장품, 영양, 치료 및/또는 개인 관리 제제 등의 구성요소로서 사용하기에 적합한 식물성 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 세포질/시토졸 분획은 세포질/시토졸 분획을 그의 구성요소 부분, 즉 세포질 분획 및 시토졸 분획으로 분리하기에 효과적인 조건 하에 추가로 가공된다. 세포질 분획은 단백질을 우세하게 포함한다.

예로서, 본 발명의 생물활성 식물성 화장품 조성물을 제조하기 위한 전체 과정이 도 1을 참조하여 하기에 기재된다. 도 1에 도시된 바와 같이, 신선한 살아있는 식물을 수확하고, 수집하고, 세척하여 신선한 식물 바이오매스를 수득한다(2). 이러한 신선한 식물 바이오매스를 분쇄, 온침, 및 가압(4)에 적용하여 세포내 식물 물질 (세포 주스)(6) 및 섬유-풍부화된 물질 (압축-케이크)(8)을 수득한다. 이어서 세포 주스(6)를 나일론 메쉬를 통해 여과하여(10) 여과된 식물 세포 주스(12)를 수득한다. 여과된 세포 주스(12)를 그의 탈안정화를 촉발하는 주파수의 전자기파 처리에 노출시킨다(14). 이어서 탈안정화된 세포 주스를 원심분리에 적용하여(16) 침전된 막 분획(20) 및 세포질/시토졸 분획(30)인 상청액을 수득한다. 막 분획(20)은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,442,391, 8,101,212, 8,277,852 및 8,318,220에 기재된 바와 같이, 화장품 제품에 첨가될 수 있는 생물활성 식물성 화장품 조성물이다. 식물 세포질/시토졸 분획(30)은 하기 기재된 바와 같이 추가의 과정에 사용된다.

세포질/시토졸 분획(30)은 하기 요약된 바와 같은 추가의 처리: i, ii, iii 또는 iv에 적용된다. 비제한적 예로서, 처리 (i)는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,442,391, 8,101,212, 및 8,277,852에 기재된 바와 같은, 등전 침전(32) 및 침전된 세포질 분획(36)을 시토졸 분획(38)을 함유하는 상청액으로부터 분리할 수 있는 후속 원심분리(34)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 시토졸/세포질 분획은 (ii) 원심분리 또는 여과 후 추가의 전자기 처리 (주파수 >7 GHz), 또는 (iii) 막 여과, 또는 (iv) 한외여과, 또는 그의 조합 (i, ii, iii, iv)의 결과로 추가로 분리될 수 있다. 세포질/ 시토졸 분획 구성요소는 "그 자체로" 사용될 수 있거나 또는 추가로 분리되어 사용될 수 있다. 이는 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 7,442,391; 7,473,435; 7,537,791; 8,043,635; 8,101,212; 8,277,852 및 8,318,220에 기재된 바와 같이, 보존제 및 항산화제에 의해 안정화될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 식물 세포 주스가 막 분획 및 세포 주스 상청액, 즉 세포질/시토졸 분획(30)으로 분리되면, 이는 세포질 분획을 시토졸 분획으로부터 분리할 수 있는 추가의 처리: i, ii, iii 또는 iv (도 1)에 적용된다.

시토졸 분획은 세포내 물에 용해된 저분자량 수용성 구성요소를 함유한다. 시토졸 분획은 황색 및 약한 특징적 냄새를 갖는 투명한 액체이다. 수시간 내에, 불안정한 시토졸 분획은 무거운 침전물 및 강한 비-특징적 냄새를 함유하는 암갈색 현탁액으로 불가역적으로 변환된다. 그 결과, 시토졸 분획은 화장품 성분으로서 사용될 수 없다. 이어서 기재되는 절차는 안정한 화장품 성분인, 안정하고 활성인 세럼 분획을 생성하도록 시토졸 분획의 정련을 가능하게 한다. 이는 원치않는 침전물의 생성 및 색 및 냄새의 악화로 이어지는 불가역적 변환의 원인이 되는 주요 구성요소를 시토졸 분획으로부터 제거함으로써 달성된다. 이러한 절차는 모두 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,442,391, 8,101,212, 8,277,852 및 8,318,220에 기재된 바와 같은 pH 조정, 열 처리, 냉각, 진공 여과, 및 안정화를 포함한다.

시토졸 분획이 생성된 후, 이는 이어서 세럼 분획 (세럼-유래 화장품 조성물)의 생성을 위해 안정화 단계에 적용된다. 본 발명의 안정화 단계에 사용하는데 적합한 작용제는 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 소듐 메틸 파라벤, 테트라소듐 EDTA, 펜틸렌 글리콜, 메타중아황산나트륨을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 사용하는데 적합한 보존제는 소르브산칼륨, 벤조산나트륨을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 사용하는데 적합한 항산화제의 예는 메타중아황산나트륨이다.

적합한 킬레이트화제의 예는 테트라소듐 EDTA이다.

보존제 부스터의 예는 펜틸렌 글리콜을 포함한다.

한 실시양태에서, 안정화 단계는 적어도 1종의 보존제, 적어도 1종의 킬레이트화제, 적어도 1종의 항산화제, 및 적어도 1종의 보존제 효능 부스터의 혼합물 중에서 세포 세럼 분획을 인큐베이션하여 안정화된 세포 세럼 분획을 수득하는 것을 수반한다.

또 다른 실시양태에서, 안정화 단계는 적어도 1종의 보존제 및 적어도 1종의 항산화제의 혼합물 중에서 세포 세럼 분획을 인큐베이션하여 안정화된 세포 세럼 분획을 수득하는 것을 수반한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 세럼-유래 화장품 조성물은 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 (또한 넬룸보 누시페라 추출물, 로투스 세럼 분획, 레센티아(Recentia)® NN 및 하르모니안스(Harmoniance)™로도 공지됨)이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 세럼-유래 화장품 조성물은 카모밀라 레쿠티타 (마트리카리아) (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획 (또한 카모마일 꽃 세럼 분획, 레센티아® CR-F, 레센티아 카모밀라 레쿠티타 제타 분획으로도 공지됨)이다.

본 발명은 또한 생리학상 허용되는 매질을 함유하는 조성물 중의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 (이는 또한 로투스 세럼 분획, 하르모니안스™ 및 레센티아® NN으로도 공지됨)을 신체 또는 얼굴 피부의 적어도 일부에 국소 도포하여 피부에 대한 태양광의 유해 효과를 완화시키는 것을 포함하는, 미용 관리 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 생리학상 허용되는 매질을 함유하는 조성물 중의 카모밀라 레쿠티타 (마트리카리아) (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획 (또한 카모마일 꽃 세럼 분획, 레센티아® CR-F, 레센티아 카모밀라 레쿠티타 제타 분획으로도 공지됨)을 신체 또는 얼굴 피부의 적어도 일부에 국소 도포하여 피부에 대한 태양광의 유해 효과를 완화시키는 것을 포함하는, 미용 관리 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구현을 위한 조성물은 특히 수성, 히드로-알콜성 또는 유성 용액; 및 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼 또는 다중 에멀젼의 형태로 존재할 수 있고; 이는 또한 피부, 점막, 입술 및/또는 모발에의 도포에 적합한 현탁액 또는 분말의 형태로 존재할 수 있다.

이들 조성물은 다소 유동적일 수 있고, 크림, 로션, 밀크, 세럼, 포마드, 겔, 페이스트 또는 폼의 외관을 가질 수 있다. 이는 또한 고체 형태 예컨대 스틱일 수 있거나, 또는 에어로졸 형태로 피부에 도포될 수 있다.

이들 조성물은 또한, 고려되는 적용 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 첨가제, 뿐만 아니라 그의 제제화에 필요한 아주반트, 예컨대 용매, 증점제, 희석제, 항산화제, 착색제, 선스크린, 셀프-태닝제, 안료, 충전제, 보존제, 향료, 냄새 흡수제, 화장품 또는 제약 활성제, 에센셜 오일, 비타민, 필수 지방산, 계면활성제, 막-형성 중합체 등을 포함할 수 있다.

모든 경우에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 아주반트 (부형제) 뿐만 아니라 그의 비율이 본 발명의 조성물의 목적하는 유리한 특성을 방해하지 않게 선택되도록 보장할 것이다. 이들 아주반트는, 예를 들어, 조성물의 총 중량의 0.01 내지 20%에 상응할 수 있다. 본 발명의 조성물이 에멀젼인 경우에, 지방 상은 조성물의 총 중량에 관하여 5 내지 80 중량% 및 바람직하게는 5 내지 50 중량%를 나타낼 수 있다. 조성물에 사용되는 유화제 및 보조유화제는 고려되는 분야에 통상적으로 사용되는 것으로부터 선택될 것이다. 예를 들어, 이는 조성물의 총 중량에 관하여 0.3 내지 30 중량% 범위의 비율로 사용될 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 사용될 수 있는 조성물은, 본 발명에 따른 활성제에 더하여, 본 발명의 것과 유사하고/거나 보완적인 효과를 갖는 적어도 1종의 다른 활성제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이러한 활성제는 "추가의 활성제"로 규정될 것이다.

예를 들어, 추가의 활성제(들)는 선스크린 활성제, 항-UV, 항-VIS, 항-IR, 광안정화제, 항노화, 토닝, 라이트닝, 수화, 배액, 및 미세순환-촉진 작용제, 제약, 박리, 스크럽, 세포외 매트릭스-자극, 에너지 대사-활성화, 항박테리아, 항진균, 진정, 항-자유 라디칼, 및 항여드름 작용제, 항염증제, 마취제, 가온제, 냉각제 및 체중-감소제로부터 선택될 수 있다.

이러한 추가의 작용제는 비타민 A 및 특히 레티노산, 레티놀, 레티놀 프로피오네이트, 레티놀 팔미테이트, 비타민 B3 및 보다 구체적으로 니아신아미드, 토코페롤 니코티네이트, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 C, 특히 아스코르브산, 아스코르빌 글루코시드, 아스코르빌 테트라팔미테이트, 마그네슘 및 소듐 아스코르빌 포스페이트, 비타민 E, F, H, K, PP, 조효소 Q10, 메탈로프로테이나제 억제제, TIMP 활성화제, DHEA, 그의 전구체 및 유도체; 아미노산 예컨대 아르기닌, 오르니틴, 히드록시프롤린, 히드록시프롤린 디팔메이트, 팔미토일글리신, 히드록시리신, 메티오닌 및 그의 유도체, N-아실 아미노산 화합물, 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사펩티드를 포함한 천연 또는 합성 펩티드 및 그의 친지성 유도체, 이성질체, 및 다른 종 예컨대 금속 이온 (예를 들어 구리, 아연, 망가니즈, 마그네슘 등)과 복합체화된 것을 포함한 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 명칭 매트릭실(MATRIXYL)™, 아르기렐린(ARGIRELINE)™, 콜락실(COLLAXYL)™, 펩티드 빈시 02(PEPTIDE VINCI 02)™, 크로노겐(CHRONOGEN)™, 라미닉실 IS(LAMINIXYL IS)™, 펩티드 Q10™, AT펩티드(ATPeptide)™, 수르빅실 IS(SURVIXYL IS)™, 네오매트릭스(NEOMATRIX)™ 하에 상업적으로 공지된 펩티드, 식물-기반 펩티드 추출물 예컨대 대두, 나맥, 포도덩굴, 평지씨, 아마인, 벼, 옥수수, 완두의 추출물, 효모 추출물, 아르테미아 살리나 추출물, 데히드로아세트산 (DHA), 합성 또는 천연 기원의 피토스테롤, 살리실산 및 그의 유도체, 알파- 및 베타-히드록시산, 아미노 당, 글루코사민, D-글루코사민, N-아세틸-글루코사민, N-아세틸-D-글리코사민, 만노사민, N-아세틸 만노사민, 갈락토사민, 폴리페놀의 N-아세틸 갈락토사민 추출물, 이소플라본, 플라보노이드, 예컨대 포도 추출물, 소나무 추출물 및 올리브 추출물, 지질 예컨대 세라미드 또는 인지질, 동물 기원의 오일, 예컨대 스쿠알렌 또는 스쿠알란; 식물 오일, 예컨대 스위트 아몬드, 코프라, 리신, 호호바, 올리브, 평지씨, 땅콩, 해바라기, 밀 배아, 옥수수 배아, 대두, 목화씨, 알팔파, 양귀비, 겨울 스쿼시, 달맞이꽃, 기장, 보리, 호밀, 홍화, 패션 프루트, 헤이즐넛, 팜, 살구 종자, 아보카도, 및 칼렌둘라 오일; 에톡실화 식물 오일 및 시어 버터, 모든 UV 스크린 및 넓은 스펙트럼 선스크린.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 조성물은 임의의 적합한 경로에 의해, 특히 외부 국소 경로에 의해 도포될 수 있고, 조성물의 제제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적합화될 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 국소 적용에 적합한 형태로 존재한다. 이들 조성물은 따라서 생리학상 허용되는, 즉 피부 및 피부 부속물과 상용성인 매질을 함유해야 하고, 모든 화장품 형태를 포괄해야 한다.

본 발명은 일반적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간에 관한 것임이 명백하다.

이러한 화장품 처리 방법의 구체적 실시양태가 또한 상기 설명으로부터 유래한다. 본 발명의 다른 이점 및 특색은 예시 및 비제한적 목적을 위해 제공되는 예를 읽을 때 보다 분명해질 것이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 특정한 실시양태를 예시하기 위해 의도되지만, 어떠한 수단에 의해서도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1

넬룸보 누시페라 (연꽃) 및 카모밀라 레쿠티타 (마트리카리아) (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 시험

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 평가하기 위해 사용된 분석적, 세포 배양 기반 생물검정, 효소적 검정 및 시험관내 검정의 설명 및 관련 시험 결과가 하기 및 표 1-8 및 도 2-3에 기재된다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 조성을 결정하기 위해 사용된 분석 방법은 하기와 같다.

총 가용성 당: 이들 세럼 분획에서의 총 가용성 당 분석은 문헌 ["Estimation of Carbohydrates in Plant Extracts" by Anthrone by Yemm and Willis, Biochem J.; 57(3): 508-514 (1954)]에 기재된 비색 방법을 기초로 하였다. 샘플 분석은 하기 접근법을 사용하여 수행하였다: 각각 ~ 200 ppm의 프룩토스 및 글루코스, 총 414 ppm의 모노사카라이드의 조합으로부터 표준물 (2-당 혼합물)을 제조하였다. 물을 사용하여 이러한 스톡 표준물의 연속 희석물을 제조하고, 각각의 용액 1 mL를 5 mL의 빙냉 2000 ppm 안트론과 72% 황산 중에서 반응시켰다. 시약을 10분 동안 100℃로 가열하고, 680 nm에서의 이들 용액의 흡광도 값으로부터 4-점 보정 곡선을 생성하였다. 시험 샘플을 물 중에서 중량에 기초하여 0.5% 용액으로 희석하고, 동일한 반응을 수행하였다. 보정 곡선에 대비하여 비교된 680 nm에서의 이들 용액의 흡광도를 사용하여 그의 총 당 농도를 결정하였다. 샘플 및 표준물에 대해, 석영 1 cm 큐벳을 사용하였고, 순수한 물로 블랭크 흡광도 값을 수득하였다.

총 페놀계 화합물 함량: 이들 세럼 분획 중 총 페놀계 화합물 함량은 논문 ["Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent" by Ainsworth and Gillespie, Nature Protocols; 2: 875 - 877 (2007)]에 기재된 방법에 의해 결정하였다. 이 논문에 기재된 비색 총 페놀계 화합물 검정은 폴린-시오칼투 (F-C) 시약을 사용한다. F-C 검정은 알칼리성 매질 중에서 페놀계 화합물로부터 포스포몰르브데넘산/포스포텅스텐산 복합체로의 전자의 전송에 의존하며, 이는 765 nm에서 분광학적으로 결정된다. 샘플 분석은 단계 5로 시작되는 이러한 방법에 따라 수행하였다. 일회용 감소된 부피 큐벳에 충분한 부피를 생성하기 위해 단계 5, 6 및 7에서 부피를 배가하였다. 측정을 위한 각각의 샘플을 개별 큐벳에서 제조하였다. 단계 6, F-C 시약 첨가에서, 샘플 및 시약을 혼합하고, ~ 10분 동안 정치되게 한 다음, 카르보네이트를 첨가하였다. 2시간 말미에, 샘플 및 표준물 (클로로겐산) 용액을 공기에 대비하여 765 nm에서 측정하고; 샘플 중 총 페놀계 화합물 함량을 클로로겐산 (표준물) 보정 곡선을 사용하여 계산하였다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획*에 대한 분석 데이터 및 범위를 하기 표 1에 제시한다:

표 1

* 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획은 "그 자체로" 분석함.

카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획*에 대한 분석 데이터 및 범위를 하기 표 2에 제시한다:

표 2

* 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획은 "그 자체로" 분석함.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 안전성 및 독성학적 프로파일을 널리 기재된 방법을 사용하여 평가하였다. 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획을 최대 100% (비-희석) 농도에서 시험하였다. 이는 자극적이지 않음 (피부 자극 연구에서 입증됨: 재건된 인간 표피); 매우 잘 용인됨 (10명의 지원자에 대한 인간 48시간 패치 시험에서); 실제로 자극적이지 않음 (눈 자극 연구 Het-Cam 시험); 자극적이지 않음 (재구성된 인간 각막 상피 (RHCE) 장기 노출-시간 처리 시험)으로 확인되었고; 또한, 광독성 연구에서 어떠한 광독성 잠재력 없음 (3T3 세포에 대한 뉴트럴 레드 흡수 광독성 시험, 3T3 NRUPT 시험관내 방법); 비-민감제 (인간 반복 손상 패치, 10%, N > 200), 및 비-유전자독성 ("Ames" 박테리아 역돌연변이)을 입증하였다.

카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 안전성 및 독성학적 프로파일을 널리 기재된 방법을 사용하여 평가하였다. 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 최대 100% (비-희석) 농도에서 시험하였다. 이는 자극적이지 않음 (피부 자극 연구에서 입증됨: 재건된 인간 표피); 매우 잘 용인됨 (10명의 지원자에 대한 인간 48시간 패치 시험에서); 실제로 자극적이지 않음 (눈 자극 연구 Het-Cam 시험); 자극적이지 않음 (재구성된 인간 각막 상피 (RHCE) 장기 노출-시간 처리 시험)으로 확인되었고; 또한, 광독성 연구에서 어떠한 광독성 잠재력 없음 (3T3 세포에 대한 뉴트럴 레드 흡수 광독성 시험, 3T3 NRUPT 시험관내 방법)을 입증하였다.

세포 배양 기반 생물검정은 태양광에 반응하여 수많은 신호전달 물질 예컨대 시토카인 (IL-6), 케모카인 (IL-8) 및 프로스타글란딘 (PGE₂)을 방출하는 인간 피부로부터 배양된 표피 각질세포 (인간 표피 각질세포, HEK)를 사용한다. 이들 매개체의 양은 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 기술을 통해 측정된다. 이들 염증 매개체의 HEK 방출을 감소시킬 수 있는 생물활성 성분은 일광 노출로부터 발생하는 인간 피부에서의 자극 및 염증 징후를 제어하는데 도움이 될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 정상 인간 성인 표피 각질세포 (HEK) 및 모든 세포 배양 공급물은 라이프 테크놀로지 캄파니(Life Technologies Co.) (미국 캘리포니아주 칼스배드)로부터 입수하였다. 세포를 인간 각질세포 성장 보충제 (HKGS)가 첨가된 각질세포 기초 배지 154 (M154)에서 5% CO2 분위기 중 37℃에서 성장시킨 다음 유지시키고, 2 내지 4 계대에서 사용하였다. 실험을 위해, HEK 세포를 트립신처리하고, 96-웰 플레이트에 시딩하고, ~80% 전면생장률로 성장시켰다. 세포를 1회 세척하고, M154를 PBS로 대체하였다. 세척 및 대체 둘 다를 PBS로 수행하여, M154의 흡광 구성요소를 제거하였다. 이어서 HEK를 함유하는 96-웰 플레이트를 UV-투명 1 mm 석영 시트로 덮고, 실온으로 유지된 제어된 펠티에-냉각 표면 상부의 백색 깔개 위에 놓고, 동일한 석영 커버를 통한 일사계를 통해 측정되는 바와 같은, 20 J/cm²의 선량의 인공적으로 생성된 전체 스펙트럼 태양광으로 약 1100 W/m²의 선량률로 조사하였다. 이어서 PBS를 제거하고, M154로 대체하고, 세포를 시험 물품 및/또는 대조군과 함께 16시간 동안 인큐베이션하였다. 조사 장비는 펜실베니아주 글렌사이드 소재의 솔라 라이트 캄파니(Solar Light Company)로부터 입수하였고, 이는 평범한 거울을 사용하는 에어매스 1.5 구성의 태양 시뮬레이터 LS1000-6R-002; XPS1000 정밀 전류 공급원, 및 PMA2144 일사계를 포함하였다. 태양광의 존재를 제외하고, 비스트레스 대조군으로서의 역할을 하는 HEK를 사용하여 동일한 조작을 행하였다. 인큐베이션 후, HEK 세포 상청액을 수집하였다. 퀀티킨(Quantikine)® ELISA 키트 (알앤디 시스템즈 인크.(R&D Systems Inc.), 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 상청액 내 인터류킨을 정량화하였다. IL-8은 인간 CXCL/IL-8 면역검정 키트 (카탈로그 # D8000C)로 정량화하고, IL-6은 인간 IL-6 면역검정 키트 (카탈로그 # D6050)로 정량화하고; PGE₂는 파라미터(Parameter)™ 프로스타글란딘 E₂ 검정 (카탈로그 # KGE004B)을 사용하여 정량화하였다. IC₅₀ (인터류킨 또는 프로스타글란딘 수준을 50%로 감소시키는데 필요한 시험 물품의 농도, 비-조사된 세포가 0%로 간주되고 조사된 세포가 100%로 간주되는 샘플 사용) 값을 시그마플롯 10.0 (시스타트 소프트웨어)에 의한 S자형 곡선 피팅에 의해 계산하였다. 보다 낮은 IC₅₀ 값은 보다 높은 효력 및 효능의 정도를 나타낸다.

ORAC (산소 라디칼 흡수 능력)는 바이오텍 인스트루먼츠 인크.(BioTek Instruments Inc.) (버몬트주 위누스키)로부터의 시너지 2 마이크로플레이트 리더와 함께 사용하도록 변형된, 바이오텍으로부터의 문헌 ["Performing Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Assays with Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader" Application Note] [www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay_Application_Note.pdf]에 기재된 방법을 사용하여 ORAC 시험에 의해 결정하였다. 이러한 검정에서, AAPH (2, 2'-아조비스 2-아미노-프로판)는 형광 프로브 (소듐 플루오레세인)를 손상시키는 반응성 산소 종을 생성한다. 항산화제 예컨대 (R)-트롤록스 메틸 에테르는 이러한 손상을 방지하거나 늦추고, 그의 효과는 형광 측정에 의해 정량화될 수 있다. 형광 판독을 37℃에서 2시간 동안, 485 nm로 설정된 여기 파장 및 528 nm로 설정된 방출 파장으로, 반응 부피 200 μl, AAPH 농도 55 mM, 소듐 플루오레세인 농도 1.33 μM, 및 (R)-트롤록스 메틸 에테르 농도 범위 80 μM 내지 2 μM을 사용하여 연속해서 수득하였다. 소듐 플루오레세인 (플루카(Fluka) 46960), AAPH (시그마(Sigma) 440914) 및 (R)-트롤록스 메틸 에테르 (플루카 93509)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스)로부터 입수하였다. AUC (곡선하 면적) 값을 비율 (웰에 대한 제1 형광 판독으로 나눈 웰에 대한 현재 형광 판독)의 합으로서 계산하였다. 탈이온수가 담긴 웰의 AUC 값의 평균을 (R)-트롤록스 메틸 에테르가 담긴 웰 및 시험 물품이 담긴 웰의 AUC로부터 차감하여 항산화제에 의한 형광의 보존에 상응하는 AUC를 수득하였다. (R)-트롤록스 메틸 에테르 중량-당량 ORAC 활성을 나타내는 웰의 항산화제-관련 AUC의 함수로서 보정 곡선을 생성하였다. 이어서 시험 물품에 대한 ORAC 활성은, 1 g 시험 물품이 1 mg (R)-트롤록스 메틸 에테르에 의해 생성되는 것과 동등한 항산화제 효과를 달성하는데 필요한 것으로서 계산되었고, 보다 낮은 수는 보다 높은 ORAC 활성을 나타낸다.

DPPH (2,2-디페닐-1-피크릴히드라질) 검정. 자유 라디칼은 1개 이상의 쌍형성되지 않은 원자가 껍질 전자를 갖는 분자 또는 원자이다. 이러한 물질은 종종 불안정하고, 화학적으로 일시적이고, 고도로 반응성이지만, 항상 그러한 것은 아니다. 자유 라디칼은 연소, 태양광 조사, 및 정상 대사 - 특히 세포 호흡, 면역 반응 및 염증 과정을 수반하는 것을 포함한 많은 과정에 의해 생산될 수 있다. 생물계에서, 자유 라디칼은 가장 통상적으로 산소 대사 및 반응성 산소 종을 수반한다. 자유 라디칼의 높은 반응성은 그들이 생물학적 분자를 손상시키게 할 수 있다. 이러한 반응의 생성물이 자유 라디칼 그 자체인 경우, 이는 손상의 캐스케이드로 이어질 수 있다. 이러한 손상은 염증 반응을 촉발할 수 있고, 잠재적으로 유해한 자기-지속 루프로 이어진다. 이는 특히, 인간 피부가 자유 라디칼 생성 환경적 스트레스에 가장 많이 노출되므로, 그러한 기관과 관련이 있다. 따라서, 물질이 자유 라디칼을 켄칭 또는 스캐빈징하는 능력을 측정하는 방법은 어떠한 물질이 효과적인 항산화제이고 자유 라디칼과 관련된 피부 손상의 징후 및 그들이 촉발하는 과정을 완화 및 방지하는데 도움이 될 수 있는지 결정하는데 유용할 수 있다. 하나의 통상적인 접근법은 자유 라디칼 상태로 있는 동안 전자 비편재화로 인해 강렬하게 착색되고, 켄칭되는 경우 색을 상실하는 안정한 자유 라디칼의 사용을 수반한다. DPPH는 그의 라디칼 형태가 고체 형태에서 보라색-흑색이고 그의 메탄올 용액 중에서는 보라색인 한편, 켄칭된 형태는 용액 중 연황색이기 때문에, 비색 검정에 사용하기에 매우 적합한 안정한 유기 자유 라디칼이다. 이러한 변화는 515 nm 파장에서의 흡광도에서의 감소로서 측정될 수 있다. 이러한 감소의 동역학은 또한 시험 물품에 의한 자유 라디칼 스캐빈징의 속도에 대한 정성적 판단을 제공할 수 있다. DPPH (2,2-디페닐-1-피크릴히드라질) 자유 라디칼 스캐빈징 활성을 SUN-SRi (테네시주 락우드)로부터의 유리-코팅된 폴리프로필렌 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (카탈로그 번호 400 062) 및 바이오텍 인스트루먼츠 인크. (버몬트주 위누스키)로부터의 시너지 2 마이크로플레이트 판독기와의 사용에 대해 적합화된 동역학적 비색 검정에 의해 결정하였다. 흡광도는 515 nm 파장에서 측정하였다. 각각의 마이크로플레이트 웰 내의 반응 부피는 200 μl였고, DPPH의 초기 농도는 114 μM과 동등하였다. DPPH (시그마 D9132)는 시그마-알드리치 (미주리주 세인트 루이스)로부터 입수하였다. 반응물의 화학량론을 계산하였고, 1 g 시험 물품이 1 mg DPPH를 켄칭시키는데 필요한 것으로 표현되었고, 보다 낮은 수는 보다 높은 활성을 나타낸다. 이러한 방법은 문헌 ["Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity" by W. Brand-Williams et al., published in LWT - Food Science and Technology, Volume 28, Issue 1, 1995, pp 25-30]에 기재된 절차로부터 적합화되었다.

DPPH 검정에서의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 평가. 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 5% v/v 희석물을 시험 직전에 탈이온수 중에서 제조하였다. 이들 희석물, 뿐만 아니라 블랭크로서 탈이온수의 70 마이크로리터 분취물 (시험 설정에서 메니스커스를 형성하는데 충분한 양)을 석영 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 (투명 바닥, 흑색 측면, 헬르마 애널리틱스(Hellma Analytics)로부터 입수함)에 넣었다. 플레이트를 1 밀리미터 두께의 석영 시트로 덮었다. 덮은 플레이트를 펠티에-냉각 표면 상부의 백색 깔개 위에 놓았다 (마이크로플레이트 홀더가 부착된 토레이 파인스 사이언티픽(Torrey Pines Scientific) 가열/냉각 건조 조/진탕기). 펠티에 냉각은 15℃로 설정하였다. 에어매스 1.5에 상응하는 필터 및 거울 구성을 갖는 태양 시뮬레이터 (솔라라이트로부터의 LS-1000)를 사용하여 플레이트를 조사하였다. 샘플의 조사 전에, 홍반 검출기가 구비된 데이터-로깅 방사계 (각각 PMA2100 및 2101, 둘 다 솔라라이트로부터의 것)를 사용하여, 1 밀리미터 석영 시트를 통과하는 태양 시뮬레이터 광에 대한 1 최소 홍반 선량 (MED)에 상응하는 시간을 측정하였다. 샘플이 담긴 석영 플레이트를 4 MED에의 노출에 상응하는 시간 동안 조사하였다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 - 조사 전 및 후에 - DPPH 켄칭 검정에서 상기 기재된 바와 같이, 탈이온수를 희석제로서 사용하여 반응 부피 중 약 10% v/v 내지 약 0.2% v/v 범위의 농도로 시험하였다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획은 둘 다, 표 3 및 4에 제시된 바와 같이 - 전체 스펙트럼 모의 태양광에 의해 전달된 4 MED 노출 후 초기 DPPH 켄칭 능력을 95%를 초과하여 유지하였다.

표 3

조사 전 및 후의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 DPPH 활성

표 4

조사 전 및 후의 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 DPPH 활성

문헌 [FDA, Final Rule 2011]에 따라 임계 파장 (CW), nm를 결정하였다. 0.75 mg/제곱 cm 막의 흡광도를 조사-전 4 MED 후에 290 nm 내지 400 nm에서 측정하였다. CW를 스펙트럼 흡광도 곡선의 적분이 290으로부터 400 nm까지의 적분의 90%에 도달하는 파장으로서 정의하였다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 흡광도 스펙트럼 및 광안정성 평가: 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 5% v/v 희석물을 시험 직전에 탈이온수 중에서 제조하였다. 이들 희석물, 뿐만 아니라 블랭크로서 탈이온수 70 마이크로리터 분취물 (시험 설정에서 메니스커스를 형성하는데 충분한 양)을 석영 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 (투명 바닥, 흑색 측면, 헬르마 애널리틱스로부터 입수함)에 넣었다. 플레이트를 1 밀리미터 두께의 석영 시트로 덮었다. 덮은 플레이트를 펠티에-냉각 표면 상부의 백색 깔개 위에 놓았다 (마이크로플레이트 홀더가 부착된 토레이 파인스 사이언티픽 가열/냉각 건조 조/진탕기). 펠티에 냉각은 15℃로 설정하였다. 플레이트 홀더 온도는 18℃였다. 에어매스 1.5에 상응하는 필터 및 거울 구성을 갖는 태양 시뮬레이터 (솔라라이트로부터의 LS-1000)를 사용하여 플레이트를 조사하였다. 샘플의 조사 전에, 홍반 검출기가 구비된 데이터로깅 방사계 (각각 PMA2100 및 2101, 둘 다 솔라라이트로부터의 것)를 사용하여, 1 밀리미터 석영 시트를 통과하는 태양 시뮬레이터 광에 대한 1 최소 홍반 선량 (MED)에 상응하는 시간을 측정하였다. 샘플이 담긴 석영 플레이트를 1, 4, 및 8 MED에 상응하는 총 노출 동안 조사하였다. 본 시험에서 1 MED는 14분 25초였다. 플레이트 상부는 조사 동안 최대 약 36℃에 도달하였다. 280 나노미터 내지 500 나노미터 파장에서의 마이크로타이터 플레이트 내용물의 흡광도 스펙트럼을, 바이오텍 시너지 2 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 조사 전, 뿐만 아니라 1; 4, 및 8 MED 총 노출 후에 수득하였다.

탈이온수가 담긴 웰의 생성된 흡광도 곡선을 희석된 세럼 분획에 대한 흡광도 곡선으로부터 차감하였다. 이어서 이들 블랭크-차감된 곡선을 형상 및 비율의 보다 명확한 정성적 비교를 위해 정규화하였다. 정규화는 곡선의 최대 흡광도를 1로, 곡선의 최소 흡광도를 0으로 간주하여 재척도화한 것이었다. 정규화된 흡광도 곡선에 의해 이들 감소의 상이한 속성이 명확하게 제시된다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 UVA-UVB 비를 조사 전 및 후에 290 nm 및 400 nm 사이에서 측정된 정규화된 흡광도 곡선에 기초하여 결정하였다. 290 - 320 (UVB 영역) 사이의 곡선하 면적의 비를 320 nm 및 400 nm (UVA 영역) 사이의 곡선하 면적과 비교하였다. UVA/UVB 비는 다양한 성분, 선스크린 활성제 및 완제품의 보호 잠재력 및 광안정성을 결정하기 위해 산업에서 사용되는 선택 파라미터이다.

5% 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 정규화된 흡광도 스펙트럼 (도 2)은 모의 전체 스펙트럼 태양광에의 노출을 증가시키는 것이 약 310 nm에서 약 380 nm 파장까지 비례적으로 보다 높은 감쇠를 유발한다는 것을 보여주며, 가장 주목되는 차이는 약 350 나노미터에서의 피크였다. 조사 후 UVA/UVB 비에서의 유익한 변화는 (표 5에 제시됨) 주로 UVA1 (340 nm - 400 nm) 영역에서의 흡광도의 증가에 상응한다.

표 5

조사 전 및 후의 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 UVA/UVB 비

5% 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 정규화된 흡광도 스펙트럼 (도 3)은 1 MED에의 노출이 약 310 nm에서 약 340 nm까지 비례적으로 보다 낮은 흡광도를 유발한다는 것을 보여준다. 추가로 조사는 흡광도 스펙트럼의 주목할 만한 변화는 유발하지 않았다. 따라서, 조사 후 UVA/UVB 비에서의 경미한 감소 (표 6에 제시됨)는 주로 UVA2 영역 (320 nm - 340 nm) 및 부분적으로 UVB 영역 (290 nm -320 nm)에서의 흡광도의 저하에 상응한다.

표 6

조사 전 및 후의 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 UVA/UVB 비

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 및 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획 성분이 각각 전체 스펙트럼 일광 노출과 연관된 다양한 시험관내 세포 배양 기반 생물검정 및 관련 효소적 모델에서 입증된 강력한 생물학적 활성과 함께, UVA-UVB 구역에서의 유익한 스펙트럼 흡광도 특징의 상승작용적 조합을 갖는다는 것이 예상외로 발견되었다. 둘 다의 성분은 전체 스펙트럼 모의 태양광에 의해 전달된 4 MED 노출 후 초기 (조사-전) DPPH 켄칭 능력을 95% 초과하여 유지하였다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획은 특별한, 바람직하고 예상되지 않는 특성인, 방사선량이 증가됨에 따른 UVA1 구역에서의 증가된 감쇠를 입증하였다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 활성을 하기 표 7에 요약한다.

표 7

카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획의 활성을 하기 표 8에 요약한다.

표 8

실험 결과는 본 발명의 성분이 피부 세포에 대한 전체 스펙트럼 태양광 노출의 다양한 유해 효과를 완화시키는데 함께 작용하는 다중기능적 활성을 제공한다는 것을 시사한다.

실시예 2

제제 중 위약과 비교하여 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 주름 외관에 대한 효과

목적: 본 실험의 목적은 주름 외관에 대한 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 (또한 본원에서 하르모니안스™로 지칭됨)의 효과를 연구하기 위한 것이다.

방법론: 이는 위약에 대한 비교 이중-맹검 연구이고, 20명의 지원자의 얼굴에서 8-주 동안 수행되었다. 주요 평가 기준은 프린지 프로젝션 3D 영상화 (DermaTOP*)에 의한 피부 토포그래피 측정에 기초하였다.

실험 프로토콜: 얼굴의 모든 면에 피부 관리 제제 중 0.5%로 제제화된 생체기능적 생성물 또는 그의 위약을 제공하였다. 그 전에, 조건화 단계를 수행하였고; 본 연구에서는 위약 크림을 조건화 생성물로서 사용하여, D0 방문 8일 전에 대상체에게 분배하였다. 제1 도포는 D0의 측정 후 실험실에서 이루어졌다. 이후의 도포는 대상체가 1일 2회, 아침 및 저녁에, 시험의 종료시까지 행하였다. 지원자는 방문일 D56 전날 저녁에 크림 도포를 멈췄다.

결과: 도포 4주 후, 상이한 주름 파라미터 (부피 및 면적) 뿐만 아니라 피부 미세 지형 (Rz)이 위약 처리된 면과 비교하여 생체기능물 처리된 면에서 유의하게 감소되었고, 도포 8주 후 감소된 채로 유지되었다.

또한, 도포 8주 후, 본 발명자들은 0.5% 하르모니안스 함유-크림으로 처리된 면에서 위약 처리된 면과 비교하여 주름 개수의 유의한 감소를 관찰하였다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 주름 외관 처리 효율에 관한 데이터가 위약과 비교하여 하기 표 9-12에 제공된다.

주름 개수 측정

표 9는 0.5% 하르모니안스 처리된 면 및 위약 처리된 면에 대한 프린지 프로젝션에 의한 주름의 개수의 측정치, DX 및 D0 사이의 차이를 예시한다.

표 9

DX는 D28 또는 D56임. ns: 유의하지 않음; **: 매우 유의함, 데이터가 정상 분포를 따르는지 여부에 따른 스튜던트 t-검정 또는 윌콕슨 검정에 의함; 평균 +/- sem n=18. 변화의 %= 100 * [(D56_{하르모니안스} - D0_{하르모니안스}) - (D56_위약 - D0_위약)] / ((D0_{하르모니안스} + D0_위약)/2).

주름 부피 측정

표 10은 0.5% 하르모니안스 처리된 면 및 위약 처리된 면에 대한 프린지 프로젝션에 의한 주름 부피의 측정치 (mm³), DX 및 D0 사이의 차이를 예시한다.

표 10

DX는 D28 또는 D56임. *: 유의함, 데이터가 정상 분포를 따르는지 여부에 따른 스튜던트 t-검정 또는 윌콕슨 검정에 의함; 평균 +/- sem n=18. 변화의 %= 100 * [(DX_{하르모니안스} - D0_{하르모니안스}) - (DX_위약 - D0_위약)] / ((D0_{하르모니안스} + D0_위약)/2).

주름 면적 측정

표 11은 0.5% 하르모니안스 처리된 면 및 위약 처리된 면에 대한 프린지 프로젝션에 의한 주름 면적의 측정치 (mm²), DX 및 D0 사이의 차이를 예시한다.

표 11

Rz 측정

표 12는 0.5% 하르모니안스 처리된 면 및 위약 처리된 면에 대한 프린지 프로젝션에 의한 Rz 파라미터의 측정치 (mm), DX 및 D0 사이의 차이를 예시한다.

표 12

일반적 결론: 이중 맹검 연구의 목적은 주름 외관에 대한 하르모니안스-함유 크림 처리의 효과를 위약 크림과 비교하여 생체내 평가하기 위한 것이었다.

효과는 먼저, 주름의 개수 뿐만 아니라 그의 부피 및 면적의 유의한 감소에 의해 확인되었다.

또한, 피부 미세 지형 (Rz)은 0.5% 하르모니안스의 도포 4주 후에 유의하게 감소되었고, 이는 보다 매끄러운 피부를 시사한다.

피부의 매끄러움 및 주름의 감소는 눈가의 잔주름의 색 화상 및 피부 토폴로지 화상에서 관찰되었다.

본 발명의 조건 하에, 이들 결과는 주름 외관을 감소시키는 0.5% 하르모니안스의 효율을 확인시켜주었다.

실시예 3

제제 중 위약과 비교하여 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 피부 수화에 대한 효과

목적: 본 실험의 목적은 피부 수화에 대한 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 (또한 본원에서 하르모니안스™로 지칭됨)의 효과를 연구하기 위한 것이다.

방법론: 이는 위약에 대한 비교 이중-맹검 연구이고, 20명의 지원자의 전완에서 6-시간 동안 수행되었다. 주요 평가 기준은 피부 수화 측정에 기초하였다.

실험 프로토콜: 피부 관리 제제 중 0.5%로 제제화된 생체기능적 생성물 또는 그의 위약의 측정 및 도포를 위해, 전완에서 서로 마주하는 2개의 30 cm² 구역을 결정하였다. 세번째 구역은 비처리 조건을 위해 이들 구역 중 하나의 아래로 결정하였다. 오직 도포는 T0의 측정 후 실험실에서만 이루어졌다.

결과: 본 발명자들은 하르모니안스-함유 크림의 도포 3시간 및 6시간 후에 위약 크림과 비교하여 피부 수화의 고도로 유의한 개선을 인지하였다.

넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 피부 수화 처리 효율에 관한 데이터가 위약과 비교하여 하기 표 13-15에 제공된다.

피부 수화 측정

정전용량 방법을 사용하여 코르네오미터(Corneometer)* CM 825 (코리지 & 카자카(Courage & Khazaka)*)로 수화 측정을 수행하였다

표 13은 0.5% 하르모니안스 처리된 면 및 위약 처리된 면에 대한 수화 측정치 (정전용량, AU), TX 및 T0 사이의 차이를 예시한다.

표 13

TX는 T3h 또는 T6h임. ***: 고도로 유의함, 데이터가 정상 분포를 따르는지 여부에 따른 스튜던트 t-검정 또는 윌콕슨 검정에 의함; 평균 +/- sem, n=20. 변화의 %= 100 * [(TX_{하르모니안스} - T0_{하르모니안스}) - (TX_위약 - T0_위약)] / ((T0_{하르모니안스} + T0_위약)/2).

본 발명자들은 하르모니안스-함유 크림의 도포 3시간 및 6시간 후에 위약 크림과 비교하여 피부 수화의 고도로 유의한 개선을 인지하였다.

경표피 수분 손실

응축기-챔버 (밀폐된 챔버) 측정 방법인 아쿠아플럭스(AquaFlux)* AF200 (바이옥스(Biox)*)을 사용하여 경표피 수분 손실 (TEWL)을 측정하였다. 이러한 밀폐된 챔버 설계는 외부 공기 움직임에 의한 측정의 방해를 제거한다.

T6h에서의 측정 동안의 기술적 문제로 인해, 이 시간 동안의 16명의 지원자에 대한 결과를 제공하였다.

표 14는 0.5% 하르모니안스 처리된 면 및 위약 처리된 면에 대한 TEWL 측정치 (g/m²h), TX 및 T0 사이의 차이를 예시한다.

표 14

TX는 T3h 또는 T6h임. ***: 고도로 유의함, 데이터가 정상 분포를 따르는지 여부에 따른 스튜던트 t-검정 또는 윌콕슨 검정에 의함; 평균 +/- sem, T3h에 n=20 및 T6h에 n=16. 변화의 %= 100 * [(TX_{하르모니안스} - T0_{하르모니안스}) - (TX_위약 - T0_위약)] / ((T0_{하르모니안스} + T0_위약)/2).

도포 후 3시간 및 6시간째에 TEWL의 고도로 유의한 감소가 관찰되었다.

피부 부드러움 측정

프릭티오미터(Frictiometer)* FR 700 (코리지 & 카자카*)을 사용하여 부드러움 측정을 수행하였다.

표 15는 0.5% 하르모니안스 처리된 면 및 위약 처리된 면에 대한 부드러움 측정치 (AU), TX 및 T0 사이의 차이를 예시한다.

표 15

도포 후 3시간 및 6시간째에 피부 부드러움의 고도로 유의한 개선이 관찰되었다.

일반적 결론: 이중 맹검 연구의 목적은 피부 수화에 대한 하르모니안스-함유 크림 처리의 효과를 생체내 평가하기 위한 것이었다.

효과는 먼저, 1회 단일 도포 후 피부의 수화의 유의한 증가에 의해 확인되었다.

또한, 이러한 개선은 TEWL의 유의한 감소를 특징으로 하였고, 이는 0.5%의 하르모니안스가 피부 장벽 기능을 회복시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

프릭티오미터를 사용한 측정은 하르모니안스-함유 크림의 도포 후 피부 부드러움의 증진을 강조하였다.

본 발명의 조건 하에, 이들 결과는 피부 수화를 촉진시키는 0.5% 하르모니안스의 효율을 확인시켜주었다.

실시예 4

배양된 세포 및 정상 인간 피부 생검에 대한 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획의 효과

목적: 본 연구에서, 본 발명자들은 4종의 상이한 축: 피부 수화 및 장벽 기능, 피부 처짐, 배액 및 피부 색소침착에 연루된 파라미터에 대한 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획 (또한 본원에서 하르모니안스™로 지칭됨)의 효과를 시험관내 및 생체외 평가하였다.

A. 피부 생검에서의 히알루론산 형광 염색

피부 생검: 26-세 여성의 유방에서 성형 외과 조치로부터 정상 인간 피부를 입수하였다. 6 mm 직경 펀치 (의료용 pfm)를 사용하여 피부 생검을 수득하였다. 이를 FBS (론자(Lonza)) 10%, L-글루타민 (론자) 2 mM 및 프리모신(Primocin)* (인비보젠(InvivoGen)) 100 μg/mL로 보충된 DMEM 1 g/L 글루코스 (론자) 50% 및 Ham's-F12 (론자) 50%를 함유하는 배양 배지에서 배양하였다. 피부 생검을 5%의 CO₂를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서 유지시켰다.

53세 여성 공여자의 유방 피부 및 64세 여성 공여자의 팔 피부에서 추가의 실험을 수행하였다.

시약: 비오티닐화된 히알루론산 결합 단백질 (bHABP)은 코거(Coger)에서 구입하고, 스트렙타비딘-알렉사 플루오르* 488 접합체는 인비트로젠에서 구입하였다.

원리: 히알루론산 글리코사미노글리칸은 특이적 비오티닐화된, 결합 단백질: bHABP를 사용하여 검출하였다. 형광색소에 접합된 스트렙타비딘에 의한 비오틴의 인식은 형광 현미경 하에서의 검사를 가능하게 한다.

처리: 피부 생검은 위약 조건 하에 PBS (론자)를 사용하여, 또는 하르모니안스 0.5% 또는 1%를 사용하여, 1일 2회, 48시간 동안 이중으로 처리하였다. 용액 20 μL를 생검의 상부에 도포하였다.

생검 제조: 피부의 보존 및 절편화를 가능하게 하기 위해, 조직을 완충된 10% 포르말린 중에서 4시간 동안 고정시켰다. 샘플을, 물을 제거하기 위해 점진적으로 농축된 에탄올 조에 이어, 알콜을 제거하기 위해 2개의 크실렌 조로 옮기고, 마지막으로 용융된 파라핀 왁스에 포매하였다. 이어서 포매된 피부 생검을 마이크로톰 (산돈(Shandon))으로 4 μm 두께의 절편으로 자르고, 슈퍼프로스트 플러스* 슬라이드 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 상에 두었다.

프로토콜: 절편을 탈파라핀화하고, 수회 연속 크실렌, 알콜 및 수조를 사용하여 재수화시켰다. PBS 세척 후, 1/400으로 희석된 bHABP를 적용하고, 슬라이드를 습한 방에서 실온에서 교반 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 세정한 후, 1/1000으로 희석된 스트렙타비딘, 알렉사 플루오르* 488 접합체를 습한 방에서 실온에서 교반 하에 암실에서 1시간 동안 적용하였다. 마지막으로, 절편을 4',6'-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)*) 0.3 μM로 5분 동안 염색하고, 플루오로마운트-G(Fluoromount-G)* (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences))에 마운팅하였다. 검출은 20x 대물렌즈가 구비된 자이스 악시오베르트(Zeiss Axiovert) 200M 현미경을 사용하여 관리하고 검사하였다. 사진은 볼로시티* 획득 소프트웨어 (임프로비전(Improvision))에 커플링된 퀴매징(Qimaging)* EXI 블루 카메라로 찍었다.

영상 정량화: 조건당 3개의 사진을 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어 (임프로비전)로 분석하였고, 이는 형광 강도로 인해 관심 존의 선택을 가능하게 하였다. 수득된 결과는 선택된 존에서의 녹색 픽셀 강도의 합이었다. 마지막으로, 각각의 사진에 대해, 검사된 표피 및 진피 존의 면적을 고려하여 수득된 합을 조정하였다.

통계적 분석: JMP* 11 소프트웨어 (SAS) 및 스튜던트 t 검정을 사용하여 독립 샘플에 대해 단측 방향 기각으로 통계적 분석을 수행하였다. p≤0.05는 유의한 것으로 간주되고, p≤0.01은 매우 유의한 것으로 간주되고, p≤0.005는 고도로 유의한 것으로 간주된다.

결과: 히알루론산 형광 염색의 정량화를 도 4에 제시한다. 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 통계적 분석을 위약에 대비하여 표현하였다. (평균 ± sem; n=3; *: 유의함; **: 매우 유의함; ***: 고도로 유의함, 스튜던트 t-검정에 의함). 이러한 실험은 2명의 다른 공여자에서 확인되었다.

결론: 생체외 결과는 피부 생검을 하르모니안스 1%로 48시간 동안 처리한 경우에 증가된 히알루론산 형광 염색을 시사하였다.

B. 피부 생검에서의 필라그린 면역형광 염색

피부 생검: 53-세 여성의 유방에서 성형 외과 조치로부터 정상 인간 피부를 입수하였다. 6 mm 직경 펀치 (의료용 pfm)를 사용하여 피부 생검을 수득하였다. 이를 FBS (론자) 10%, L-글루타민 (론자) 2 mM 및 프리모신* (인비보젠) 100 μg/mL로 보충된 DMEM 1 g/L 글루코스 (론자) 50% 및 Ham's-F12 (론자) 50%를 함유하는 배양 배지에서 배양하였다. 피부 생검을 5%의 CO₂를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서 유지시켰다.

64-세 여성 공여자의 팔 피부에서 추가의 실험을 수행하였다.

항체: 1차 항체는: 항-필라그린 (산타크루즈(Santacruz)) 마우스 모노클로날로, 1/100으로 희석되어, 1시간 30분 동안 본 연구에 적용되었다. 2차 항체는 알렉사 플루오르* 488 당나귀 항-마우스 (인비트로젠(Invitrogen))로, 1/1000으로 희석되어, 1시간 동안 사용되었다.

원리: 면역형광은 특이적 1차 항체의 결합에 의해 조직 절편 내 특정 단백질의 시각화를 가능하게 하는 기술이다. 형광색소로 표지된 2차 항체는 1차 항체를 인식하는데 사용된다. 면역형광 염색된 샘플은 이어서 형광 현미경 하에 검사된다. DAPI에 의한 대조염색은 세포 핵의 시각화 및 표피의 국재화를 가능하게 한다.

처리: 피부 생검은 위약 조건 하에 PBS (론자)를 사용하여, 또는 하르모니안스 1%를 사용하여, 1일 2회, 48시간 동안 이중으로 처리하였다. 용액 20 μL를 생검의 상부에 도포하였다.

생검 제조: 피부의 보존 및 절편화를 가능하게 하기 위해, 조직을 완충된 10% 포르말린 중에서 4시간 동안 고정시켰다. 샘플을, 물을 제거하기 위해 점진적으로 농축된 에탄올 조에 이어, 알콜을 제거하기 위해 2개의 크실렌 조로 옮기고, 마지막으로 용융된 파라핀 왁스에 포매하였다. 이어서 포매된 피부 생검을 마이크로톰 (산돈)으로 4 μm 두께의 절편으로 자르고, 폴리신* 슬라이드 (써모 사이언티픽) 상에 두었다.

프로토콜: 절편을 탈파라핀화하고, 수회 연속 크실렌, 알콜 및 수조를 사용하여 재수화시켰다. 이어서, 0.25% 펩신 (지메드(Zymed), 인비트로젠) / 37℃에서 15분 동안 소화를 포함하는 차폐제거 프로토콜을 수행하였다. PBS 세척 및 30분 동안의 5% BSA (시그마) 용액에 의한 비특이적 부위의 포화 후, 1차 항체를 적용하고 슬라이드를 습한 방에서 실온에서 교반 하에 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 세정한 후, 2차 항체를 습한 방에서 실온에서 교반 하에 암실에서 적용하였다. 마지막으로, 세포 핵을 4',6'-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 몰레큘라 프로브스*) 0.3 μM로 5분 동안 염색하고, 절편을 플루오로마운트-G* (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스)에 마운팅하였다. 검출은 20x 대물렌즈가 구비된 자이스 악시오베르트 200M 현미경을 사용하여 관리하고 검사하였다. 사진은 볼로시티* 획득 소프트웨어 (임프로비전)에 커플링된 퀴매징* EXI 블루 카메라로 찍었다.

영상 정량화: 조건당 3개의 사진을 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어 (임프로비전)로 분석하였고, 이는 형광 강도로 인해 관심 존의 선택을 가능하게 하였다. 수득된 결과는 선택된 존에서의 녹색 픽셀 강도의 합이었다. 마지막으로, 각각의 사진에 대해, 검사된 표피 존의 길이를 고려하여 수득된 합을 조정하였다.

결과: 필라그린 형광 염색의 정량화를 도 5에 제시한다. 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 통계적 분석을 위약에 대비하여 표현하였다. (평균 ± sem; n=3; ***: 고도로 유의함, 스튜던트 t-검정에 의함). 이러한 실험은 또 다른 공여자에서 확인되었다.

결론: 본 발명자들은 48시간 동안 1% 하르모니안스로 처리된 피부 생검에서 위약-처리된 것과 비교하여 필라그린 형광 강도의 증진을 관찰하였다.

C. 피부 생검에서의 AQP3 면역형광 염색

항체: 1차 항체는: 항-AQP3 (산타크루즈(Santacruz)) 염소 폴리클로날로, 1/100으로 희석되어, 1시간 30분 동안 본 연구에 적용되었다. 2차 항체는 알렉사 플루오르* 488 당나귀 항-염소 (인비트로젠)로, 1/1000으로 희석되어, 1시간 동안 사용되었다.

원리: 면역형광은 특이적 1차 항체의 결합에 의해 조직 절편 내 특정 단백질의 시각화를 가능하게 하는 기술이다. 형광색소로 표지된 2차 항체는 1차 항체를 인식하는데 사용된다. 면역형광 염색된 샘플은 이어서 형광 현미경 하에 검사된다.

프로토콜: 절편을 탈파라핀화하고, 수회 연속 크실렌, 알콜 및 수조를 사용하여 재수화시켰다. 이어서, 시트레이트 완충제 0.01 M pH 6 (시그마) 중에서 비등할 때까지 600 W에의 마이크로웨이브 노출을 포함하여 차폐제거 프로토콜을 수행하였다. PBS 세척 및 30분 동안의 5% BSA (시그마) 용액에 의한 비특이적 부위의 포화 후, 1차 항체를 적용하고 슬라이드를 습한 방에서 실온에서 교반 하에 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 세정한 후, 2차 항체를 습한 방에서 실온에서 교반 하에 암실에서 적용하였다. 마지막으로, 절편을 플루오로마운트-G* (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스)에 마운팅하였다. 검출은 20x 대물렌즈가 구비된 자이스 악시오베르트 200M 현미경을 사용하여 관리하고 검사하였다. 사진은 볼로시티* 획득 소프트웨어 (임프로비전)에 커플링된 퀴매징* EXI 블루 카메라로 찍었다.

영상 정량화: 조건당 8개의 사진을 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어 (임프로비전)로 분석하였고, 이는 형광 강도로 인해 관심 존의 선택을 가능하게 하였다. 수득된 결과는 선택된 존에서의 녹색 픽셀 강도의 합이었다. 마지막으로, 각각의 사진에 대해, 검사된 표피 존의 면적을 고려하여 수득된 합을 조정하였다.

결과: AQP3 형광 염색의 정량화를 도 6에 제시한다. 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 통계적 분석을 위약에 대비하여 표현하였다. (평균 ± sem; n=8; ***: 고도로 유의함, 스튜던트 t-검정에 의함). 이러한 실험은 또 다른 공여자에서 확인되었다.

결론: 본 발명자들은 48시간 동안 1% 하르모니안스로 처리된 피부 생검에서 위약-처리된 것과 비교하여 AQP3 형광 강도의 증진을 관찰하였다.

D. 재건된 표피에서의 피부 장벽 기능의 평가

재건된 인간 표피 (RHE): 본 연구에 사용된 각질세포는 3-세 공여자의 포피로부터 혈청 분획하였다. 이를 무혈청 배지 및 프리모신* (인비보젠) 100 μg/ml에서 성장시켰다. 세포를 5%의 CO₂를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서 유지시켰다. 이어서, 세포를 불활성 폴리카르보네이트 막 (0.5 cm² 삽입물, 눈크(Nunc))에 시딩하고, 5%의 CO₂를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서 화학적으로 한정된 배지 (Rosdy M. and Clauss L.C., 1990; Rosdy M. et al., 1993)에서 12일 동안 공기-부양시켰다.

3-세 공여자의 포피 및 24-세 공여자의 복부 피부로부터 혈청 분획한 각질세포를 사용하여 추가의 데이터를 수득하였다.

시약: 본 연구에 사용된 형광 염료는 루시퍼 옐로우 (산타크루즈)이다.

원리: 루시퍼 옐로우 염료는 피부 장벽 완전성의 평가를 가능하게 하고, 표피 층에서의 염료의 침투는 피부 장벽의 투과성과 상관된다.

처리: 재건-후 17일 후에, 0.15% SDS (시그마)를 사용하여 3시간 동안 RHE에 국소로 스트레스를 가하거나 가하지 않고, 이어서 위약 조건 하에 PBS (론자)를 사용하여, 또는 하르모니안스 0.5% 또는 1%를 사용하여, 1일 2회, 48시간 동안 처리하였다. PBS-세정 후, 루시퍼 옐로우 형광 염료 1 mM을 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. RHE를 다시 PBS로 세척하여 그의 삽입물로부터 제거하였다.

RHE 제조: RHE의 보존을 가능하게 하기 위해, 이를 완충된 10% 포르말린 중에서 4시간 동안 고정시켰다. 샘플을, 물을 제거하기 위해 점진적으로 농축된 에탄올 조에 이어, 알콜을 제거하기 위해 2개의 크실렌 조로 옮기고, 마지막으로 용융된 파라핀 왁스에 포매하였다. 이어서 포매된 RHE를 마이크로톰 (산돈)으로 4 μm 두께의 절편으로 자르고, 슬라이드 (써모 사이언티픽) 상에 두었다.

프로토콜: 절편을 탈파라핀화하고, 수회 연속 크실렌, 알콜 및 수조를 사용하여 재수화시켰다. 마지막으로, 세포 핵을 4',6'-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 몰레큘라 프로브스*) 0.3 μM로 5분 동안 염색하고, 영상화를 위해 슬라이드를 플루오로마운트-G* (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스)에 마운팅하였다. 검출은 20x 대물렌즈가 구비된 자이스 악시오베르트 200M 현미경을 사용하여 관리하고 검사하였다. 사진은 볼로시티* 획득 소프트웨어 (임프로비전)에 커플링된 퀴매징* EXI 블루 카메라로 찍었다.

영상 정량화: 조건당 3개의 사진을 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어 (임프로비전)로 분석하였고, 이는 형광 강도로 인해 관심 존의 선택을 가능하게 하였다. 수득된 결과는 형광의 면적이었다. 마지막으로, 각각의 사진에 대해, 전체 표피 존의 면적을 고려하여 수득된 결과를 조정하였다.

결과: 형광 염료 침투의 정량화를 도 7에 제시한다. 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 통계적 분석을 0.15% SDS에 대비하여 표현하였다. (평균 ± sem; n=3; ***: 고도로 유의함, 스튜던트 t-검정에 의함). 이러한 실험은 2명의 다른 공여자에서 확인되었다.

결론: 본 발명자들은 재건된 표피에 대한 SDS 스트레스 후, 1% 하르모니안스 처리에 의해 피부 장벽 회복의 개선을 관찰했다.

F. 섬유모세포에 대한 콜라겐 I 면역형광 염색

섬유모세포: 본 연구에 사용된 섬유모세포는 53-세 여성 공여자의 정상 인간 피부로부터 추출된 것이다. 이를 FBS (론자) 10%, L-글루타민 (론자) 2 mM 및 프리모신* (인비보젠) 100 μg/mL로 보충된 DMEM 1 g/L 글루코스 (론자)에서 성장시켰다. 세포를 5%의 CO₂를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서 유지시켰다.

항체: 1차 항체는 항-콜라겐 I (록랜드(Rockland)) 토끼 폴리클로날로, 1/100으로 희석되어, 1시간 30분 동안 본 연구에 적용되었다. 2차 항체는 알렉사 플루오르* 488 당나귀 항-토끼 (인비트로젠)로, 1/1000으로 희석되어, 1시간 동안 사용되었다.

원리: 면역형광은 특이적 1차 항체의 결합에 의해 세포 내 특정 단백질의 시각화를 가능하게 하는 기술이다. 형광색소로 표지된 2차 항체는 1차 항체를 인식하는데 사용된다. 면역형광 염색된 샘플은 이어서 형광 현미경 하에 검사된다. DAPI에 의한 대조염색은 세포 핵의 시각화를 가능하게 한다.

세포 제조: 세포를 8개의 웰 유리 챔버 슬라이드 (팔콘(Falcon))에 시딩하였다. 조건당 2개의 웰을 분석하였다.

처리: 세포를 배양 배지에서 직접 희석된 하르모니안스 0.01%를 사용하여, 1일 2회, 48시간 동안 이중으로 처리하거나, 또는 처리하지 않았다.

프로토콜: 처리 후, 세포를 PBS로 세정하고 냉 메탄올로 4℃에서 4분 동안 고정시켰다. 이어서 세포를 실온에서 교반 하에 1차 항체와 인큐베이션하였다. 3회의 PBS-세척 후, 형광 2차 항체를 실온에서 교반 하에 암실에서 적용하였다. 다시 PBS로 3회 세척 후, 세포 핵을 4',6'-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 몰레큘라 프로브스*) 0.3 μM로 5분 동안 염색하고, 슬라이드를 플루오로마운트-G* (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스)에 마운팅하였다. 검출은 20x 대물렌즈가 구비된 자이스 악시오베르트 200M 현미경을 사용하여 관리하고 검사하였다. 사진은 볼로시티* 획득 소프트웨어 (임프로비전)에 커플링된 퀴매징* EXI 블루 카메라로 찍었다.

영상 정량화: 조건당 3개의 사진을 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어 (임프로비전)로 분석하였고, 이는 콜라겐 I 형광 강도로 인해 세포의 선택을 가능하게 하였다. 수득된 결과는 선택된 존에서의 녹색 픽셀 강도의 합이었다. 마지막으로, 각각의 사진에 대해, 세포의 면적을 고려하여 수득된 합을 조정하였다.

결과: 콜라겐 I 형광 염색의 정량화를 도 8에 제시한다. 볼로시티* 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 통계적 분석을 비처리에 대비하여 표현하였다. (평균 ± sem; n=3; ***: 고도로 유의함, 스튜던트 t-검정에 의함).

결론: 본 발명자들은 48시간 동안 0.01% 하르모니안스로 처리된 섬유모세포에 대해 콜라겐 I 형광 강도에서 통계적으로 유의한 시험관내 증진을 관찰하였다.

G. 피부 생검에서의 UV 스트레스 후 탄성 섬유

피부 생검: 30-세 여성의 유방에서 성형 외과 조치로부터 정상 인간 피부를 입수하였다. 6 mm 직경 펀치 (의료용 pfm)를 사용하여 피부 생검을 수득하였다. 이를 FBS (론자) 10%, L-글루타민 (론자) 2 mM 및 프리모신* (인비보젠) 100 μg/mL로 보충된 DMEM 1 g/L 글루코스 (론자) 50% 및 Ham's-F12 (론자) 50%를 함유하는 배양 배지에서 배양하였다. 피부 생검을 5%의 CO₂를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서 유지시켰다.

시약: 엘라스티카 반 기슨(Elastica Van Gieson) 염색 키트 (머크(Merck))를 사용하여 탄성 섬유를 염색하였다.

원리: 반 기슨 피크로푸크신 용액과 조합된 바이게르트에 따른 레조르시놀-푸크신 용액은 탄성 섬유 (흑색-자주색) 및 콜라겐 (적색-분홍색)의 시각화를 가능하게 한다.

처리: 피부 생검을 하르모니안스 1%를 사용하여, 1일 2회, 48시간 동안 이중으로 처리하거나, 또는 처리하지 않았다. 용액 20 μl를 생검의 상부에 도포하였다. 이어서 피부 생검에 단일 선량의 5 J/cm² UVA 및 200 mJ/cm² UVB로 스트레스를 가하고, 10시간 동안 재-인큐베이션한 후 염색하였다. UVA 오븐 유형 BLX-E365 및 UVB 오븐 유형 BLX-E312 (피셔 바이오블록 사이언티픽(Fisher Bioblock Scientific))를 사용하였다.

프로토콜: 절편을 탈파라핀화하고, 수회 연속 크실렌, 알콜 및 수조를 사용하여 재수화시켰다. PBS 세척 후, 절편을 바이게르트에 따른 레조르시놀-푸크신 용액 중에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 절편을 물 중에서 5분 동안 세척하였다. 반 기슨에 따른 피크로푸크신 용액을 절편에 2분 동안 도포하였다. 수회 연속 물, 알콜 및 크실렌 조 이후, 슬라이드를 유키트(Eukitt)* (오. 킨들러)에 마운팅하고 40x 대물렌즈가 구비된 이클립스 E600 현미경 (니콘(Nikon))을 사용하여 검사하였다. 사진을 퀴매징* EXI 블루 카메라로 찍어 큐-캡쳐 프로 7(Q-Capture Pro 7) 소프트웨어 (퀴매징*)를 사용하여 가공하였다.

결론: 피부를 하르모니안스 1%로 사전처리한 경우에 보다 우수한 탄성 섬유의 조직화가 관찰되었다.

H. 3T3-L1 지방세포에서의 글리세롤 방출 검정

3T3-L1 지방세포: 3T3-L1 전-지방세포 (ATCC) (PX+8)를 FBS (론자) 10%, L-글루타민 (론자) 2 mM 및 프리모신* (인비보젠) 100 μg/mL로 보충된 DMEM 4.5 g/L 글루코스 (론자)에서 배양하였다.

세포의 전면생장 2일 후, 배양 배지에서 3일 동안 0.5 mM IBMX, 1 μM 덱사메타손 및 10 μg/ml 인슐린 (시그마)을 첨가하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 그 후, IBMX 및 덱사메타손을 제거하고, 오직 인슐린만을 3 내지 4일 동안 유지시킨 다음; 또한 인슐린을 제거하고, 세포를 배양 배지에서 다시 3일 동안 유지시켰다.

시약: 지방분해 검정 키트 (케이만 케미칼(Cayman Chemical))를 사용하여 글리세롤 방출을 측정하였다.

원리: 지질분해는 트리글리세리드의 글리세롤 및 지방산으로의 가수분해이다. 글리세롤 방출의 양은 저장된 트리글리세리드의 양 및 지질분해의 정도 둘 다에 비례할 것이다.

세포 제조: 세포를 24 웰 플레이트 (써모 피셔 사이언티픽)에 시딩하였다.

처리: 분화 세포를 배양 배지에서 직접 희석된 하르모니안스 0.01%를 사용하여, 또는 카페인 2 mM을 사용하여, 1일 1회, 48시간 동안 이중으로 처리하거나, 또는 처리하지 않았다.

프로토콜 : 검정은 공급업체 권고를 사용하여 수행하였다.

결과: 분화된 3T3-L1에서의 글리세롤 방출의 정량화를 도 9에 제시한다. 통계적 분석을 비처리에 대비하여 표현하였다. (평균 ± sem; n=2; ~: 거의 유의함; *: 유의함, 스튜던트 t-검정에 의함). 본 실험은 2명의 다른 공여자에 대해 확인되었다.

결론: 본 발명자들은 48시간 동안 0.01% 하르모니안스로 처리된 3T3-L1의 글리세롤 방출에서 통계적으로 유의한 시험관내 증진을 관찰하였다.

I. 피부 생검에서의 멜라닌 염색

피부 생검: 52-세 여성의 유방에서 성형 외과 조치로부터 정상 인간 피부를 입수하였다. 6 mm 직경 펀치 (의료용 pfm)를 사용하여 피부 생검을 수득하였다. 이를 FBS (론자) 10%, L-글루타민 (론자) 2 mM 및 프리모신* (인비보젠) 100 μg/mL로 보충된 DMEM 1 g/L 글루코스 (론자) 50% 및 Ham's-F12 (론자) 50%를 함유하는 배양 배지에서 배양하였다. 피부 생검을 5%의 CO₂를 함유하는 가습 분위기 하에 37℃에서 유지시켰다.

60-세 여성 공여자의 복부 피부에서 추가의 실험을 수행하였다.

시약: 폰타나-마송 염색은 질산은 (시그마)의 용액에 수산화암모늄 (아크로스 오가닉스(Acros Organics))을 첨가하는 것에 의해 형성되는 원액 제조를 필요로 한다. 이 용액을 사용 전 24시간 동안 침강되도록 두었다.

원리: 멜라닌은 단백질에 결합된 갈색-흑색 색소군이다. 멜라닌은 멜라노솜에서 멜라닌세포에 의해 합성되고, 이어서 기저 표피의 각질세포로 전송되어 여기서 핵 위에 캡을 형성한다.

폰타나-마송 염색은 외부 환원제를 사용하지 않고 암모니아성 질산은 용액을 금속성 은 (갈색)으로 환원시키는 멜라닌 능력을 기초로 한다.

처리: 피부 생검을 하르모니안스 0.5%-1%-3%를 사용하여, 또는 20 mM 코지산을 사용하여, 1일 2회, 48시간 동안 이중으로 처리하거나, 또는 처리하지 않았다. 용액 20 μl를 생검의 상부에 도포하였다.

프로토콜: 절편을 탈파라핀화하고, 수회 연속 크실렌, 알콜 및 수조를 사용하여 재수화시켰다. 이어서, 원액 100 μl를 각각의 절편에 첨가하고, 슬라이드를 60℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 3분 동안 증류수 세척한 후, 생검을 5% 티오황산나트륨 (시그마) 100 μl와 2분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 증류수조에서 3분 동안 세척하고, 마지막으로 수회 알코올 및 크실렌 조에서 탈수하였다. 이를 유키트* (오. 킨들러)에 마운팅하고, 20x 대물렌즈가 구비된 이클립스 E600 현미경 (니콘)을 사용하여 검사하였다. 사진을 퀴매징* EXI 블루 카메라로 찍어 큐-캡쳐 프로 7 소프트웨어 (퀴매징*)를 사용하여 가공하였다.

영상 정량화: 조건당 3개의 사진을 분석하였다. 이미지J 소프트웨어는 관심 존의 선택을 가능하게 하고, 이러한 존에서 강도당 픽셀 수를 나타내는 히스토그램을 생성한다. 따라서, 모든 흑색 픽셀의 합 (0 내지 175의 강도를 가짐)을 계산하고, 수득된 합을 검사한 표피 존의 길이로 조정하였다. (McMullen R.L. et al., 2010)

결과: 폰타나 마송 염색의 정량화를 도 10에 제시한다. 이미지J 분석 소프트웨어를 사용하여, 통계적 분석을 위약에 대비하여 표현하였다. (평균 ± sem; n=3; ns: 유의하지 않음; ***: 고도로 유의함, 스튜던트 t-검정에 의함). 이러한 실험은 또 다른 공여자에서 확인되었다.

결론: 하르모니안스 1% 및 3%는 멜라님 함량을 감소시키는데 유의하게 도움이 된다.

J. 일반적 결론

본 실시예는 재건된 인간 표피에 대한 시험관내 (배양된 섬유모세포 및 3T3-L1 지방세포에 대함), 생체외 (정상 인간 피부에 대함) 하르모니안스의 효능 시험을 요약한다. 수화 및 장벽 기능, 피부 처짐, 배액 및 색소침착의 마커를 조사하였다.

제1 파트에서는, 생체외 피부에서의 히알루론산, 필라그린 및 AQP3 단백질의 발현에 대한 하르모니안스 1%의 효과를 관찰하였다. 하르모니안스 도포 48시간 후, 이들 피부 수화 마커의 발현이 증가되었다.

이어서, SDS 스트레스 후 1% 하르모니안스로 처리된 재건된 표피에서 피부 장벽 기능을 평가하였다. 하르모니안스에 의한 48-시간 처리는 SDS 스트레스 효과를 상쇄시키게 하였다.

다음으로, 피부 처짐의 마커인 콜라겐 및 엘라스틴에 대한 하르모니안스의 효과를 연구하였다.

본 발명자들은 0.01% 하르모니안스에 의한 48-시간 처리 후 섬유모세포에서 콜라겐 I 발현의 증가를 관찰하였다. 또한, 생체외 피부에 대한 조합 UVA 및 UVB 스트레스 후에, 피부를 하르모니안스 1%로 48시간 동안 사전-처리한 경우, 보다 우수한 탄성 섬유의 조직화가 관찰되었다.

제3 파트에서, 배액 능력의 지표인 글리세롤 방출에 대한 하르모니안스 효과를 조사하였다. 이를 위해, 3T3-L1 전-지방세포에서 글리세롤 방출을 검사하였다. 분화된 세포에 대한 48시간 동안의 0.01% 하르모니안스 처리 후, 글리세롤 방출의 증진이 검출되었다.

마지막 파트에서, 48시간 동안의 하르모니안스 처리 후 피부 색소침착을 평가하였다. 멜라닌 함량에서의 감소가 용량-의존성 방식으로 관찰되었다.

하르모니안스는 수화 및 장벽 기능, 피부 처짐 및 주름 외관, 배액 및 신체 윤곽형성, 피부 색소침착 및 색조를 포함한, 피부 노화와 연관된 피부 외관의 가장 중요한 속성을 표적으로 한다.

상기 예는 본 발명의 생물활성 제제의 특정 실시양태의 비제한적 예이다. 예는 단지 예시의 목적으로 주어지고, 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 그의 많은 변경이 가능하므로 본 발명의 제한으로서 해석되지 않으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 예에서, 달리 명시되지 않는 한 모든 농도는 중량 퍼센트로서 열거되고, 부차적 물질, 예컨대 희석제, 충전제 등은 배제할 수 있다. 따라서, 열거된 제제는 열거된 구성요소 및 이러한 구성요소와 연관된 임의의 부차적 물질을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 이들 부차적 물질의 선택은 본 발명을 상기 기재된 바와 같이 제조하기 위해 선택된 특정한 성분의 물리적 및 화학적 특징에 따라 달라질 것이다.

본 발명이 그의 구체적 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 진정한 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 등가물이 치환될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 특정한 상황, 물질, 물질의 조성물, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적 취지 및 범주에 채택하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.

본원에서 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 발명의 선행 기술임을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 본원에 인용되는 모든 참고문헌은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

Claims

적어도 하나의 노화 징후를 갖는 피부 표면에 항노화 생물활성 조성물을 도포하는 단계를 포함하는, 피부 노화와 연관된 피부 외관을 개선시키는 방법이며,
여기서 상기 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 넬룸보 누시페라(Nelumbo nucifera) (연꽃) 세럼 분획을 포함하고,
여기서 상기 항노화 생물활성 조성물은 적어도 하나의 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 유효량의 상기 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획이 전체 조성물의 0.001 중량% 내지 100 중량% 범위로 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 항노화 생물활성 조성물이 피부과용으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 상기 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획을 0.001% 내지 99% 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 태양광에의 피부 노출의 유해 효과를 완화시키는 것인 방법.
제5항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 피부 세포에 대한 전체 스펙트럼 태양광 노출의 유해 효과를 완화시키는데 상승작용적으로 작용하는 다중기능적 활성을 갖는 것인 방법.
제6항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 피부 수화, 피부 장벽 기능, 피부 처짐, 피부 주름 외관, 배액 및 신체 윤곽형성, 피부 색소침착, 및/또는 피부 색조를 개선시킴으로써 피부 노화와 연관된 피부 외관 속성을 개선시키는데 효과적인 것인 방법.
제1항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 하기: (i) UVA-UVB 구역에서의 유익한 스펙트럼 흡광도 특징; (ii) 전체 스펙트럼 모의 일광 노출 후에 입증된 넓은 UVA 및 UVB 스펙트럼 흡수 광안정성과 함께 높은 UVA:UVB 흡광도 비; (iii) 방사선량이 증가됨에 따른 UVA1 구역에서의 증가된 감쇠 및 UVA/UVB 비에서의 동시 증가; (iv) 전체 스펙트럼 모의 일광 노출과 연관된 다양한 시험관내 세포 배양 기반 생물검정 및 관련 효소적 모델에서 입증된, 강력한 생물학적 활성 (특성); (v) 전체 스펙트럼 모의 태양광에 의해 전달된 4 MED 노출 후 초기 (조사-전) DPPH 켄칭 능력의 95% 초과의 유지; (vi) 피부 세포에 대한 전체 스펙트럼 태양광 노출의 다양한 유해 효과를 완화시키는데 함께 작용하는 다중기능적 활성; 및 (vii) 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 특성의 상승작용적 조합을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 피부 표면이 신체 피부 표면 및 얼굴 피부 표면으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 선스크린 활성제, 항염증제, 및 피부 색조 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 성분을 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 복수의 피부 노화 징후에, 복수의 피부 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 넬룸보 누시페라 (연꽃) 세럼 분획이 자연에서 발견되지 않는 분획화 과정을 사용하여 단리되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 분획화 과정이 넬룸보 누시페라 (연꽃) 식물의 신선한 식물 바이오매스로부터 유래된 식물 세포 주스를 전자기장에 2.45 GHz 초과의 주파수로, 식물 세포 주스를 탈안정화시키기에 효과적인 시간 동안 적용하여 응고된 막 분획을 포함하는 응고된 세포 주스 혼합물을 수득하는 단계, 및 상기 응고된 막 분획을 상기 응고된 세포 주스 혼합물로부터 분리하여 상기 막 분획이 실질적으로-부재하는 세포질/시토졸 분획을 포함하는 생물활성 분획을 수득한 다음, 세포질 분획을 안정화된 시토졸 분획으로부터 분리할 수 있는 추가의 처리를 하여 세럼 분획을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
적어도 하나의 노화 징후를 갖는 피부 표면에 항노화 생물활성 조성물을 도포하는 단계를 포함하는, 피부 노화와 연관된 피부 외관을 개선시키는 방법이며,
여기서 상기 항노화 생물활성 조성물은 유효량의 카모밀라 레쿠티타(Chamomilla recutita) (독일 카모마일) 세럼 분획을 포함하고,
여기서 상기 항노화 생물활성 조성물은 적어도 하나의 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 유효량의 상기 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획이 전체 조성물의 0.001 중량% 내지 100 중량% 범위로 존재하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 항노화 생물활성 조성물이 피부과용으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 상기 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획을 0.001% 내지 99% 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 태양광에의 피부 노출의 유해 효과를 완화시키는 것인 방법.
제18항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 피부 세포에 대한 전체 스펙트럼 태양광 노출의 유해 효과를 완화시키는데 상승작용적으로 작용하는 다중기능적 활성을 갖는 것인 방법.
제19항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 피부 수화, 피부 장벽 기능, 피부 처짐, 피부 주름 외관, 배액 및 신체 윤곽형성, 피부 색소침착, 및/또는 피부 색조를 개선시킴으로써 피부 노화와 연관된 피부 외관 속성을 개선시키는데 효과적인 것인 방법.
제14항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 하기: (i) UVA-UVB 구역에서의 유익한 스펙트럼 흡광도 특징; (ii) 전체 스펙트럼 모의 일광 노출 후에 입증된 넓은 UVA 및 UVB 스펙트럼 흡수 광안정성과 함께 높은 UVA:UVB 흡광도 비; (iii) 전체 스펙트럼 모의 일광 노출과 연관된 다양한 시험관내 세포 배양 기반 생물검정 및 관련 효소적 모델에서 입증된, 강력한 생물학적 활성 (특성); (iv) 전체 스펙트럼 모의 태양광에 의해 전달된 4 MED 노출 후 초기 (조사-전) DPPH 켄칭 능력의 95% 초과의 유지; (v) 피부 세포에 대한 전체 스펙트럼 태양광 노출의 다양한 유해 효과를 완화시키는데 함께 작용하는 다중기능적 활성; 및 (vi) 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 특성의 상승작용적 조합을 갖는 것인 방법.
제14항에 있어서, 피부 표면이 신체 피부 표면 및 얼굴 피부 표면으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제14항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 선스크린 활성제, 항염증제, 및 피부 색조 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 성분을 추가로 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 항노화 생물활성 조성물이 복수의 피부 노화 징후에, 복수의 피부 노화 징후의 외관을 개선시키는데 충분한 기간 동안 도포되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃 세럼 분획이 자연에서 발견되지 않는 분획화 과정을 사용하여 단리되는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 분획화 과정이 카모밀라 레쿠티타 (독일 카모마일) 꽃의 신선한 식물 바이오매스로부터 유래된 식물 세포 주스를 전자기장에 2.45 GHz 초과의 주파수로, 식물 세포 주스를 탈안정화시키기에 효과적인 시간 동안 적용하여 응고된 막 분획을 포함하는 응고된 세포 주스 혼합물을 수득하는 단계, 및 상기 응고된 막 분획을 상기 응고된 세포 주스 혼합물로부터 분리하여 상기 막 분획이 실질적으로-부재하는 세포질/시토졸 분획을 포함하는 생물활성 분획을 수득한 다음, 세포질 분획을 안정화된 시토졸 분획으로부터 분리할 수 있는 추가의 처리를 하여 세럼 분획을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.