KR20180115334A - 폴리말릭산 기반 나노면역컨주게이트 및 이의 용도 - Google Patents

폴리말릭산 기반 나노면역컨주게이트 및 이의 용도 Download PDF

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KR20180115334A
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nanoimmune
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tumor
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줄리아 와이. 루비모바
키스 엘. 블랙
에그하드 할라
알렉산더 루비모브
후이 딩
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세다르스-신나이 메디칼 센터
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Abstract

폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드, 표적 리간드, 항종양 면역 반응 자극제, 및 항암제를 포함하는 나노면역컨주게이트가 제공된다. 전신성 및 국소 면역 반응 그리고 상승적 항암 효과 모두를 제공하는 상기 나노면역컨주게이트를 투여함으로써 대상자에서 암을 치료하는 방법이 기재된다.

Description

폴리말릭산 기반 나노면역컨주게이트 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 4일자로 출원된 미국 가출원 제62/303,845호의 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 포함된다.
2017년 3월 3일에 생성되고 1,889 바이트의 크기를 갖는 "서열 목록(Sequence Listing)"이라는 명칭으로 본 출원과 함께 제출된 서열 목록은 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 부여된 허가번호 CA206220-01에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 전신성 및 국소 면역 반응 모두를 제공할 수 있고, 상승적 항암 효과를 제공할 수 있는 폴리말릭산 기반 나노면역컨주게이트로 세포 증식 질환을 갖는 환자를 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
유방암은 진단된 악성 종양이며 미국 여성의 암 사망 원인 중 두 번째이다. 미국에서 2015년에, 233,000이 넘는 새로운 유방암 사례가 진단될 것으로 보이며, 유방암으로 사망할 것으로 예상되는 여성의 수가 약 40,000명에 달한다. 조기 진단 및 새로운 치료법의 발전에도 불구하고, 유방암 환자의 재발은 여전히 주요 문제이며, 일단 그 질병이 전이되면 치료하기에 매우 힘들다. 유방암은 주로 국소 림프절, 뼈, 폐, 간 및 뇌에서 전이된다. 뇌 전이는 유방암 환자의 10-15%에서 관찰되며 치료가 특히 어렵다. 유감스럽게도, 상당 수의 유방암 환자가 이 치료법에 반응하지 않으며, 반응하는 사람은 저항력을 갖고 사망한다. 따라서, 유방암 환자를 위한 새로운 치료법이 여전히 시급히 요구된다.
국립 암 연구소는 미국에서 2015년에 22,850 건의 악성 뇌 및 척수 종양이 진단될 것으로 추정하고 있다. 신경교종(gliomas)은 가장 흔한 뇌 악성 종양이며, 매우 침습적인(aggressive) 종양인, 교아종 등급(glioblastoma grade) IV(교아종 다형성, 또는 GBM)가 가장 빈번하다. 신경교종 생물학에 대한 많은 노력과 새로운 데이터에도 불구하고, 지난 25년 동안 환자의 생존율은 크게 변하지 않았다. 따라서, 신경교종 분자 마커를 밝히고, 특히 뇌종양으로 표적화된 약물 전달을 통해 발현을 조절하는 효율적인 방법을 개발하는 데 있어 충족되지 않은 임상적 필요성이 존재한다.
원발성 암 치료의 진전으로 환자의 수명이 연장되었지만, 잔류 종양 세포가 특히 뇌에 전이될 확률이 증가하였다. 약리학적 뇌암 치료의 진전은 많은 약물이 뇌 혈관 내피에 의해 형성된 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통과할 수 없기 때문에 크게 진행되지 않는다. 예를 들어, 임상적으로 사용되는 치료용 모노클로날 항체(mAbs)는 원발성 종양 치료에는 효과적이지만 뇌종양에 도달하기 위해서는 BBB를 투과할 수 없다. 뇌종양 치료의 또 다른 장애는 효율적인 면역 요법을 방해하는 뇌 면역 회피(brain immune privilege)이다.
흑색종, 폐 및 전립선 암과 같은 종양의 면역 요법의 진전에도 불구하고, 놀랍게도 다른 암과 비교하여 인간의 유방암 및 뇌암 발달에 있어서 면역계의 역할에 대해서는 거의 알려지지 않았다.
일 견지로, 본 발명은 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드(polymalic acid-based molecular scaffold), 적어도 하나의 표적 리간드(targeting ligand), 적어도 하나의 항종양 면역 반응 자극제 및 적어도 하나의 항암제를 포함하는 나노면역컨주게이트(nanoimmunoconjugate)에 관한 것이다. 표적 리간드, 항종양 면역 반응 자극제 및 항암제는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드에 공유 결합된다.
일 견지로, 본 발명은 대상자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 나노면역컨주게이트 중 어느 하나를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 치료 유효량의 나노면역컨주게이트를 대상자에게 투여하는 것을 포함한다.
일 견지로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 나노면역컨주게이트 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 조성물에 관한 것이다.
일 견지로, 본 발명은 대상자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드 및 적어도 하나의 표적 리간드 및 상기 스캐폴드에 공유 결합된 적어도 하나의 항암제를 포함하는 나노컨주게이트를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 치료 유효량의 항종양 면역 반응 자극제 및 치료 유효량의 상기 나노컨주게이트를 대상자에 공동 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 구현의 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 관련하여 읽을 때 더욱 잘 이해될 것이다. 예시를 위해, 현재 바람직한 구현이 도면에 도시된다. 그러나, 본 발명은 도시된 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 도면에서:
도 1은 PMLA 백본(P), 안정성을 위한 mPEG 5000, 엔도솜 탈출 단위(endosomal escape unit)(LLL), BBB 및 유방 종양 표적화를 위한 항-TfR mAb, 및 종양 세폭 독성을 유도하기 위한 CK2에 대한 AON을 포함하는 예시적인 나노면역컨주게이트(NIC) 및 유방암의 상황에서 나노면역컨주게이트(NIC)의 작용 기전을 나타내는 개략도이다.
도 2는 인간 이종 이식 유방암(BT-474) 모델에서의 NIC(P/mPEG/LLL/mTfR/IL-2; x-마크)의 항종양 활성을, PBS(닫힌 다이아몬드) 및 P/IL-2(닫힌 사각형)를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나타낸 선 그래프 세트이다.
도 3은 s.c. D2F2 동질유전자적 유방 종양(s.c. D2F2 syngeneic mammary tumors)을 보유하는 BALB/c 마우스에서 나노면역컨주게이트 P/CTLA-4/IgG(닫힌 삼각형) 및 P/CTLA-4/MsTfR(x-마크)의 항종양 활성을, PBS(닫힌 다이아몬드) 및 CTLA-4mAb(닫힌 사각형)를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나타낸 선 그래프 세트이다.
도 4A-4B는 s.c. D2F2 동질유전자적 유방 종양을 갖는 BALB/c 마우스에서 항-CTLA-4에 의해 유도된 선호적인 IL-12(도 4A) 및 IL-10(도 4B) 활성을 나타낸 막대 그래프 세트이다. 도 4A는 P/IgG/CTLA-4, P/mTfR/CTLA-4, CTLA-4에 의해 유도된 IL-12 활성화를 혈청 및 PBS를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나타낸 것이다. 도 4B는 P/IgG/CTLA-4, P/mTfR/CTLA-4, CTLA-4에 의해 유도된 IL-10 활성화를 혈청 및 PBS를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나타낸 것이다.
도 5A-5B는 두개 내의(intracranial) D2F2 종양(뇌 전이 모델)을 갖는 동물에서의 면역자극을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 5A는 P/IgG/CTLA-4, P/mTfR/CTLA-4, CTLA- 4에 의해 유도된 IL-12 활성화를 혈청 및 PBS를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나타낸 것이다. 도 5B는 P/IgG/CTLA-4, P/mTfR/CTLA-4, CTLA- 4에 의해 유도된 IL-10 활성화를 혈청 및 PBS를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 P/mPEG/LLL/mTfR/CTLA-4, 항-CTLA-4 Ab 및 PBS를 이용한 치료 후 두개 내의(intracranial) 유방 D2F2 종양(뇌 전이 모델)을 보유한 BALB/c 마우스에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선의 세트이다.
도 7은 40% LLL, 2% mPEG, 0.2% mTfR Ab, 0.2% CTLA4 mAb, 0.4% IL-2 및 2% 모르폴리노 AON-HER2/ra>w를 함유하는 예시적인 PMLA NIC의 합성을 나타낸 것이다.
도 8은 인간 유방암 BT-474, 마우스 유방암 D2F2 및 정상적인 인간 유방 조직에서 CK2a 및 β-튜블린 발현을 나타내는 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 9는 이종 동물 모델에서 BBB를 가로지르며 CK2a를 차단하는 나노컨주게이트 P/Cetu/CK22a에 의한 인간 뇌 신경교종 LN229 성장 억제를, PBS를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나타낸 카플란-마이어 생존 곡선의 세트이다.
도 10은 P/트라스투주맙(trastuzumab)/MsTfR-mAb/HER2-AON 및 PBS를 이용하여 치료된 BT-474 HER2/neu 양성, 즉 종양(뇌 전이 모델)에서의 암 줄기 세포 마커 CD 133 및 c-Myc의 발현을 나타내는 사진 세트이다.
도 11은 PMLA 백본, LLL, TfR mAb, a- CTLA-4(PD-1), AON-CK2 및 AON-EGFR을 포함하는 나노면역컨주게이트가 뇌 종양에 미치는 영향을 나타내는 개략도이다.
도 12A-12B는 동질유전자적 마우스 모델을 위해 고안된 PMLA-기반 나노면역컨주게이트의 개략도이다. 도 12A는 AON을 이용하여 EGFR 및 CK2를 차단함으로써 종양 세포 성장의 억제를 위해 고안된, PMLA-백본, LLL, mPEG, CTLA-4(PD-1) mAB, msTfR mAb, AON-EGFR, AON-CK2, 및 선택적으로 Alexa Fluor 680 염료를 포함하는 나노면역컨주게이트를 나타낸다. 도 12B는 추가적인 면역 자극을 위해 부착된 활성 사이토카인(IL-2)을 갖는 PMLA-백본, LLL, mPEG, CTLA-4(PD-1) mAB, msTfR mAb 및 선택적으로 Alexa Fluor 680 염료를 함유하는 면역 자극 나노면역컨주게이트를 나타낸 것이다.
도 13A-13B는 GBMs에서의 EGFR 및 CK2a 발현 및 나노약물-컨주게이티드 AONs에 의한 이들의 억제를 나타내는 웨스턴 블롯의 사진이다. 도 13A는 EGFR 및 CK2a 모두가 세 개의 세포주 U87MG, LN229 및 GL26에서 발현되는 것을 나타낸다. 도 13B는, 세포 흡수를 위해 항-EGFR mAb cetuximab(Cetu)를 사용하는 P/Cetu/AON- EGFR (좌측 패널) 및 P/Cetu/AON-CK2a(우측 패널)를 이용한 세포 처리시 EGFR 및 CK2a의 발현이 PBS와 비교하여 현저히 감소되는 것을 나타낸다.
도 14는 PMLA 백본, 40% LLL, 2% mPEG, 0.2% TfR Ab, 0.2% CTLA-4/PD-1 Ab, 1% AON-EGFR 및 1% AON-CK2a를 함유하는 예시적인 나노면역컨주게이트의 합성을 나타낸다.
도 15A-15D는 PMLA 나노면역컨주게이트의 선택적 절단을 나타낸다. 도 15A는 암모니아에 의한 PMLA 나노컨주게이트의 선택적 절단의 개략도이다. 도 15B는 절단 전(상부 곡선) 및 절단 후(하부 곡선)의 PMLA 나노면역컨주게이트의 HPLC 프로파일이다. 도 15C는 280 nm의 최대 스펙트럼 파장을 갖는 mAb로서 첫 번째 피크를 확인하는 그래프이다. 도 15D는 260 nm에서 AON으로서 두 번째 피크를 확인하는 그래프이다.
도 16A-16B는 EGFR 및/또는 CK2a에 특이적인 AONs를 함유하는 나노면역컨주게이트가 LN229 GBM 성장을 억제하고 종양-보유 동물 생존을 연장시키는 것을 나타낸다. 도 16A(좌측)는 PBS(x-마크)를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나노면역컨주게이트 P/Cetu/AON-CK2a(닫힌 사각형), P/Cetu/AON- EGFR 및 P/Cetu/AON-CK2a/AON-EGFR를 이용한 치료시 현저히 증가된 생존률을 나타내는 카플란-마이어 곡선의 세트이며, 그리고 (우측) 중간 생존기간의 정량화를 나타내는 표이다. 도 16B는 나노면역컨주게이트 및 PBS를 이용한 치료 후에 종양 형태의 사진이다.
도 17A-17E는 PBS를 이용한 컨트롤 치료와 비교한, 두개 내의 LN229 이종 종양에서 프로-서바이벌(pro-survival) 및 증식 신호에 대한 나노면역컨주게이트 P/Cetu/AON-CK2a, P/Cetu/AON-EGFR, 및 P/Cetu/AON-EGFR/AON-CK2a의 효과를 나타낸다. 도 17A는 치료된 종양에서 EGFR, CK2a뿐만 아니라 인산화/활성화된 Akt(pAkt) 및 c-Myc의 감소를 나타내는 웨스턴 블롯의 사진 세트이다. 도 17B는 치료된 종양에서 EGFR의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 17C는 치료된 종양에서 CK2a의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 17D는 치료된 종양에서 pAkt/Akt의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 17E는 치료된 종양에서 cMyc의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 세트이다.
도 18은 P/AON-CK2a, P/AON-EGFR, P/AON-EGFR/AON-CK2a 및 PBS로 치료한 후 GL26 뇌 종양에서 암 줄기 세포 마커 CD 133, cMyc 및 Nestin의 발현을 나타내는 사진 세트이다.
도 19A-19B는 나노면역컨주게이트로 치료한 후의 동물의 생존률을 나타내는 카플란-마이어 곡선 세트이다. 도 19A는 CTLA-4 mAb, P/TfR/CTLA-4 mAb 및 P/TfR/CTLA-4 및 P/TfR/PD-1의 조합으로 치료한 후 동물의 생존률을 나타낸다. 도 19B는 PD-1 mAB, P/TfR/PD-1 mAb 및 P/TfR/CTLA-4 및 P/TfR/PD-1의 조합으로 치료한 후의 동물의 생존률을 나타낸다.
도 20은 나노면역컨주게이트 P/a-CTLA-4/PD-I/TfR의 I.V. 투여 후 BBB를 통한 동물 뇌로의 운반을 나타내는 사진이다.
도 21은 CTLA-4mAb, P/msTfR/CTLA-4 및 P/msTfR/CTLA-4 + P/msTfR/PD-1을 이용한 동물의 치료 후 IFNγ/CD8+ 세포의 분석을 나타내는 산점도(scatter plot)이다.
도 22는 CTLA-4mAb, P/msTfR/CTLA-4 및 P/msTfR/CTLA-4 + P/msTfR/PD-1으로 동물을 치료한 후 CD69+/CD8+ 세포의 분석을 나타내는 산점도이다.
도 23A-23C는 P/msTfR/CTLA-4, P/msTfR/PD-1 및 P/msTfRCTLA-4 + P/msTfR/PD-1으로 치료한 후 GL26 신경교종을 보유하는 C57/BI6 마우스로부터의 혈청에서 사이토카인 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 도 23A는 IL-12(p70) 수준을 나타낸다. 도 23B는 IFNγ 수준을 나타낸다. 도 23C는 TNFα 수준을 나타낸다.
특정 용어는 단지 편의를 위해서 하기의 설명에 사용되며 제한하는 것은 아니다. 다르게 명시되거나 문맥에 내재되어 있지 않는 한, 하기 용어 및 문구는 아래에 제공된 의미를 포함한다. 명시적으로 다르게 언급되거나 문맥으로부 명백하지 않은 한, 하기 용어 및 문구는 그 용어 또는 문구가 관련 기술 분야에서 획득되는 의미를 배제하지 않는다. 그 정의는 특정 구현을 설명하는 것을 돕기 위해 제공되며, 청구된 발명을 한정하고자 하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 범위가 청구범위에 의해서만 한정되기 때문이다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함한다.
단수의 용어 "하나(a 및 an)", 및 "상기(the)"는 문맥에 달리 명시되어 있지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 유사하게, "또는(or)" 이라는 단어는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 "및(and)"을 포함하는 것으로 의도된다. "A, B 또는 C"와 같이 둘 이상의 아이템의 리스트가 뒤 따르는 문구 "적어도 하나의(at least one)"는 A, B 또는 C 중 어느 개별적인 하나뿐만 아니라 이들의 어느 조합을 의미한다.
"우측(right)", "좌측(left)", "상부(top)" 및 "하부(bottom)"는 도면이 참조되는 방향을 지칭한다.
본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본원의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기술된다.
용어 "증식성 장애(proliferative disorder)" 및 "증식성 질환(proliferative disease)"은 암과 같은 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "종양(tumor)" 및 "신생물(neoplasm)""은 과도한 세포 성장 또는 증식, 전-암성 병변(pre-cancerous lesions)을 포함하는 양성(비암성) 또는 악성(암성) 중 어느 조직의 덩어리를 지칭한다.
"원발성 암(primary cancer)"이란 용어는 암이 발생한 원래의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 유방에서 유래된 암을 원발성 유방암 이라고 한다. 그것이 전이되면, 즉 뇌로 퍼지면, 암은 뇌에 전이하는 원발성 유방암으로 지칭된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전이(metastasis)"는 신체의 원래 자리에서 암이 유사한 암 병변의 발생을 갖는, 즉 새로운 위치에 동일하거나 실질적으로 동일한 생화학적 마커를 갖는 신체의 다르 부위로 퍼지거나 전이되는 과정을 지칭한다. "전이성(metastatic)" 또는 "전이(metastasizing)" 세포는 이웃 세포와의 접착 접촉에 대한 활성이 감소하고 혈류에 의해 또는 림프 내에서 질병의 원발 부위로부터 인접한 신체 구조 또는 말단(distal) 구조로 이동하는 것이다.
용어 "암세포(cancer cell)", "종양 세포(tumor cell)" 및 문법적 등가물은 비-종양 형성 세포 및 종양 형성 세포, 즉 암 줄기 세포를 포함하는 종양 또는 전-암성 병변으로부터 유래된 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "종양 형성(tumorigenic)"은 자가-재생성, 즉 부가적인 종양 형성 암 세포를 발생시키는 것 및 다른 종양 세포를 생성시키는 증식, 즉 분화되어 이에 다라 비-종양 형성 종양 세포를 발생시키는 것을 포함하는 고형 종양 줄기 세포의 기능성 특징을 지칭한다.
용어 "항체(antibody)"는 본 명세서에서 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질 또는 이들의 조합과 같은 표적을 면역 글로블린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 인식하고 특이적으로 바인딩하는 능력을 위해 조성물에 포함된 기능적 모듈인 면역글로블린 분자를 의미한다. 일 구현으로, 본 명세서에서 조성물의 기능적 모듈로서 포함되는 항체는 암 줄기 세포 마커 단백질에 특이적으로 바인딩하고, 예를 들어, hgand 바인딩, 리셉터 다이머화, 암 줄기 세포 마커 단백질의 발현, 및/또는 암 줄기 세포 마커 단백질의 다운스트림 신호전달을 방해하는 안타고니스트 항체로서 기술된 클래스를 포함할 수 있다. 택일적인 구현으로, 본 명세서에서 조성물 내 기능적 모듈로서의 항체는 암 줄기 세포 마커 단백질에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, 암 줄기 세포 마커 단백질에 의한 hgand 바인딩, 리셉터 다이머화 및/또는 신호전달을 촉진시키는 아고니스트 항체를 포함한다. 택일적인 구현으로, 암 줄기 세포 마커 단백질의 생물학적 활성을 방해하지 않거나 촉진하지 않는 항체는 대신에 예를 들어, 항체 내재화 및/또는 면역 시스템에 의한 인식에 의해 종양 성장을 억제하는 작용을 한다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체(antibody)"는 손상되지 않은(intact) 폴리클로날 항체, 손상되지 않은 모노클로날 항체, 항체 프래그먼트(Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 프래그먼트), 단일 쇄 Fv(scFv) 돌연변이, 적어도 2개의 손상되지 않은 항체로부터 생성된 2 특이적 항체와 같은 다중 특이적 항체, 키메릭 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원 인식 부위를 포함하는 어느 다른 변형된 면역글로블린 분자를 포함한다. 항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤(mu)로 각각 지칭되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 동일성(identity)에 기초하여 어느 5 주요 클래스의 면역글로블린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이들의 서브클래스(이소 타입)(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)를 포함한다. 항체는 벗겨진 상태이거나 또는 독소, 방사성 동위 원소 등과 같은 다른 분자에 접합될 수 있다. 다른 구현으로 항체는 융합 항체이다.
본 명세서에 사용된, 용어 "항체 프래그먼트(antibody fragment)"는 손상되지 않은 항체의 일부분을 지칭하며, 손상되지 않은 항체의 항원 결정성 가변 영역을 지칭한다. 항체 프래그먼트의 예는 이에 한정하는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab') 2 및 Fv 프래그먼트, 선형 항체, 단일 쇄 항체 및 항체 프래그먼트로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다.
"Fv 항체(Fv antibody)"는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 비-공유 다이머를 형성하는 2-사슬로서, 또는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 두 사슬이 유사한 다이머 구조로 결합되도록 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유 결합된 단일-쇄(scFv)로서 완전한 항원-인식 및 -바인딩 부위를 함유하는 최소 항체 프래그먼트를 지칭한다. 이 구성에서 각 가변 도메인의 상보성 결정 부위(CDRs)는 상호 작용하여 Fv 다이머의 항원-바인딩 특이성을 정의한다. 대안적으로, 단일 가변 도메인(또는 Fv의 절반)이 항원을 인식하고 바인딩하는 데 사용될 수 있지만, 일반적으로 보다 낮은 친화도를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 "모노클로날 항체(monoclonal antibody)"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 특이적 인식 및 바인딩에 관련된 균질한 항체 집단을 지칭한다. 폴리클로날 항체는 상이한 항원 결정기에 각각 지향되는 항체 종들의 집단을 포함한다. "모노클로날 항체(monoclonal antibody)"라는 용어는 두 가지 모두의 그리고 전장 모노클로날 항체 및 항체 프래그먼트(Fab, Fab', F(ab')2, Fv와 같은), 단일 쇄(scFv) 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 어느 다른 변형된 면역글로블린 분자를 포함한다. 또한, "모노클로날 항체(monoclonal antibody)"는 이에 한정하는 것은 아니나 하이브리도마 발현, 파지 선택, 재조합 발현 및 형질전환 동물을 포함하여, 이러한 방법으로 한정하지 않고 얻어진 것들을 지칭한다.
본 명세서에 사용된, 용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment 또는 treating)" 또는 "완화(amelioration)"은 대상자가 암과 같은 질병이나 질환과 관련된 컨디션의 진행 또는 중증도를 역전시키거나, 경감시키거나, 완화시키거나, 억제하거나, 감속시키거나 또는 정지시키는 치료학적 치료를 지칭한다. 용어 "치료(treating)"는 암과 관련된 컨디션, 질병 또는 장애의 적어도 하나의 부정적인 영향 또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상적 마커가 감소될 경우 "효과적" 이다. 택일적으로, 치료는 질병의 진행이 감소되거나 중단되는 경우 "효과적" 이다. 즉, "치료(treatment)"는 증상이나 마커의 개선뿐만 아니라, 치료 부재시 예상되는 것과 비교되는 증상의 진행 또는 악화의 중지 또는 적어도 감속을 포함한다. 유익하거나 바람직한 임상 결과에는 이에 한정하는 것은 아니나, 하나 이상의 증상(들)의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 완화 또는 경감, 차도(일부 또는 전체 여부에 관계없이), 및/또는 감소된 사망률이 포함된다. 질병의 "치료(treatment)"란 용어는 질병의 증상 또는 부작용(완화 치료 포함)으로 부터의 완화를 제공하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된, "관리(management 또는 managing)"는 대상자에서 질병 또는 질환이 발생하는 것을 예방하고, 질병 또는 질환으로 인한 사망 위험을 감소시키고, 질병 또는 질환의 발병을 지연시키며, 질병 또는 질환의 진행을 억제하고, 질병 또는 질환 및/또는 상기 질병 또는 질환으로 인한 부작용의 부분 치료 또는 완전 치료, 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과의 획득(효과는 질환 또는 질병 또는 컨디션, 도는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있으며, 그리고/또는 질병 또는 질환 및/또는 상기 질병 또는 질환으로 인한 부작용의 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적일 수 있음), 질병 또는 질환의 완화(즉, 질병 또는 질환의 퇴행을 일으킴)를 지칭한다. 또한, 본 개시는 본 개시물의 치료학적 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료하는 것이 예상된다.
"대상자(subject)" 및 "개체(individual)"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 인간 또는 동물을 의미한다. 보통, 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 애니멀과 같은 척추 동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰로거스 원숭이(cynomologous monkeys), 거미 원숭이 및 마카크(macaques), 예를 들면 레서스(Rhesus)를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 우드척(woodchucks), 페럿(ferrets), 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 게임 애니멀은 소, 말, 돼지, 사슴, 비슨(bison), 버팔로, 고양이 종, 예를 들어 가축 고양이, 개 종, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어, 닭, 에뮤(emu), 타조(ostrich), 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 환자 또는 대상자는 상기의 어느 서브 세트, 예를 들어 상기의 모든 것을 포함 하나, 인간, 영장류 또는 설치류와 같은 하나 이상의 그룹 또는 종을 제외한다. 일 구현으로, 대상자는 포유류, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간일 수 있다. "환자(patient)" 및 "대상자(subject)"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. "환자" 및 "대상자"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게, 대상자는 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예에 한정되지 않는다. 인간 이외의 포유류는 암의 동물 모델을 나타내는 대상자로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법은 가축화된 동물 및/또는 애완 동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 대상자는 남성 또는 여성일 수 있다. 대상자는 이전에 암으로 진단되었거나, 또는 암에 걸린 것으로 확인되었지만 치료를 이전에 받지 않았을 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "공동 투여(co- administering 또는 co-administration)"라는 용어는 적어도 2종의 상이한 화합물 및/또는 조성물의 투여를 지칭하며, 여기서 상기 화합물 및/또는 조성물은, 이들이 암을 치료하기 위해 부가적으로 또는 상승적으로 작용하는 한, 동시에, 또는 다른 시기에 투여될 수 있다. 제한 없이, 2개의 상이한 화합물 및/또는 조성물은 동일한 제형으로 또는 별도의 제형으로 투여될 수 있다. 별도의 제형으로 투여될 경우, 화합물 및/또는 조성물은 서로 어느 시간 내에 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물 및/또는 조성물은 24시간, 12시간, 6시간, 5시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 45분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 5분 이하 내에 서로 투여될 수 있다. 또한, 별도의 제형으로 투여될 경우, 화합물 및/또는 조성물은 어느 순서로 투여될 수 있다. 추가로, 공동 투여는 공동 투여된 화합물 및/또는 조성물을 동일한 경로로 투여할 것을 요구하지 않는다. 따라서, 각각은 독립적으로 또는 공통 투여 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 2가지 화합물은 서로에 대해 중량 또는 몰로 어느 비율로 투여될 수 있다. 예를 들어, 2가지 화합물을 약 50:1, 40:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1: 1.75, 1.5:1 또는 1.25:1 내지 1:1.25, 1:1.5, 1.75, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40 또는 1:50의 비율로 투여될 수 있다. 상기 비율은 어느 화합물의 유효량을 기준으로 할 수 있다.
일 구현은 동시적으로 특정 암세포를 사멸시키고, 항-종양 면역 반응을 자극할 수 있고, 항-종양 효능을 현저히 증가시킬 수 있는 나노면역컨주게이트를 제공한다. 나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드, 적어도 하나의 표적 리간드, 적어도 하나의 항-종양 면역 반응 자극제 및 적어도 하나의 항암제를 포함할 수 있다. 표적 리간드, 항-종양 면역 반응 자극제 및 항암제는 각각 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합되거나 또는 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리말릭산(polymalic acid)"은 주쇄 에스테르 결합을 함유하는 폴리머, 예를 들어 호모폴리머, 코폴리머 또는 블럭폴리머를 지칭한다. 폴리말릭산은 생분해성 및 고분자 가요성, 물(이온화될 경우) 및 유기 용매(이의 산 형태로)에 용해성, 비-독성 또는 비-면역원성 중 적어도 하나일 수 있다(Lee B et al., Water-soluble aliphatic polyesters: poly(malic acid)s, in: Biopolymers, vol. 3a (Doi Y, Steinbuchel A eds., pp 75-103, Wiley-VCH, New York 2002, 이 모든 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 일 구현으로, 폴리말릭산은 본 명세서에서 폴리-p-말릭산 또는 PMLA로 지칭되는 폴리(P-L-말릭산)일 수 있다.
제한없이, 폴리말릭산은 어느 길이 및 어느 분자량의 것일 수 있다. 폴리말릭산은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100 kDa 이상의 분자량을 가질 수 있다. 일 구현으로, 폴리말릭산은 하기 분자량 중 어느 둘 사이의 범위 내의 분자량을 가질 수 있다: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100 kDa.
본 명세서에 개시된 나노면역컨주게이트를 잘 받아들이는 예시적인 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드는, 예를 들어 2004 년 12월 3일 출원된 PCT 출원 PCT/US04/40660, 2009년 4월 10일 출원된 PCT/US09/40252 및 2010년 12월 10일 출원된 PCT/US10/59919, 2010년 12월 30일 출원된 PCT/US10/62515; 및 2007년 3월 12일 출원된 미국 특허출원 제10/580,999호, 및 2010년 9월 28일에 출원된 미국 특허출원 제12/935,110호에 기재되어 있으며, 이 모든 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항-종양 면역 반응 자극제(anti-tumor immune response stimulator)"는 항-종양 면역 반응을 유발할 수 있는 제제를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "항-종양 면역 반응"은 종양, 종양 세포, 암 세포 및/또는 종양/암 세포에 의해 발현되는 항원에 대한 면역 반응을 의미한다. 면역 반응은 T 세포 매개 및/또는 B 세포 매개 면역 반응일 수 있다. 예시적인 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들어 사이토카인 생산 및 세포성 세포독성을 포함한다. 또한, 면역 반응은 T 세포 활성화, 예를 들어, 항체 생산(체액성 반응) 및 사이토킨 반응성 세포, 예를 들어, 대식세포의 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응을 포함할 수 있다. 따라서, 면역 반응은 본래, 체액성, 세포성 또는 이들의 어느 조합일 수 있다.
일 구현으로, 항-종양 면역 반응 자극제는 하나 이상의 면역 관문 단백질의 활성 또는 합성을 전체적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해 또는 조절하는 제제일 수있다. 일 구현으로, 항-종양 면역 반응 자극제는 하나 이상의 면역 관문 단백질의 활성 또는 합성을 억제할 수 있다. 이러한 제제는 또한 본 명세서에서 "면역 관문 인히비터(immune checkpoint inhibitor)"로 지칭된다. 이론으로 한정되는 것은 아니며, 하나 이상의 면역 관문 단백질의 억제는 암을보다 효과적으로 치료하기 위해 억제 신호를 차단하거나 아니면 중화시켜 면역 반응을 상향 조절할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역 체크 포인트 단백질(immune checkpoint proteins)"은 항-종양 면역 반응을 하향-조절 또는 억제함으로써 면역 반응을 미세-조정하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 세포 표면 상의 분자 그룹을 의미한다. 면역 관문 단백질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이에 한정하는 것은 아니나 CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7- H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, 2B4, ICOS, HVEM, PD-L2, CD 160, gp49B, PIR-B, KIR과 리셉터, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, BTLA, SIRPct(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, 및 A2aR을 포함한다. 참조, 예, WO 2012/177624(이의 전체 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨)
면역 관문 단백질을 억제하는 데 유용한 예시적인 제제는 면역 관문 인히비터 단백질 또는 이의 프래그먼트를 바인딩 및/또는 불활성화시키거나 또는 억제할 수 있는 항체, 저 분자량 약물, 펩타이드, 펩타이드미메틱스, 천연 리간드 또는 천연 리간드의 유도체; 뿐만 아니라 면역 관문 단백질 인히비터 핵산, 또는 이의 프래그먼트의 발현 및/또는 활성을 하향 조절할 수 있는 간섭 RNA 간섭, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 핵산 앱타머 등일 수 있다. 면역 반응을 상향 조절하기 위한 예시적인 제제는 단백질과 이의 천연 리셉터(들) 사이의 상호 작용을 차단하는 하나 이상의 면역 관문 단백질에 대한 항체; 비-활성화 형태의 하나 이상의 면역 관문 단백질(예: 도미넌트 음성 폴리펩타이드); 하나 이상의 면역 관문 단백질과 이의 천연 리셉터(들) 사이의 상호작용을 차단하는 소 분자 또는 펩타이드; 천연 리셉터(들)에 바인딩하는 융합 단백질(예, 항체 또는 면역글로블린의 Fc 부분에 융합된 면역 관문 단백질의 세포외 부분); 면역 관문 단백질 코딩 핵산 전사 또는 번역을 차단하는 핵산 분자 등일 수 있다. 이러한 제제는 억제 시그널링을 방지하고 면역 반응을 상향 조절하기 위해 하나 이상의 면역 관문 단백질 및 이의 천연 리셉터(들)(예: 항체) 간의 상호작용을 직접 차단할 수 있다. 예를 들어, 안정화 된 세포 외 도메인과 같은 면역 관문 단백질 리간드는 이의 리셉터에 바인딩하여 적절한 리간드에 바인딩하는 리셉터의 유효 농도를 간접적으로 감소시킬 수 있다.
일 구현으로, 항-종양 면역 반응 자극제는 항-PD-1 항체 또는 항-CTLA-4 항체일 수 있다. 제한없이, 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한, 항체는 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 일 구현으로, 항-PD-1 및/또는 항-CTLA-4 항체는 IgGl일 수 있다.
일 구현으로, 항-종양 면역 반응 자극제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON) 또는 siRNA일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA는 면역 관문 단백질의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일 구현으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노(Morpholino) 안티센스 올리고 뉴클레오타이드일 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오타이드는 CTLA-4를 코딩하는 핵산의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 4 또는 5의 서열과 적어도 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오타이드는 PD-1을 코딩하는 핵산의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 6 또는 7의 서열과 적어도 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
일 구현으로, 항-종양 면역 반응 자극제는 면역자극성 사이토카인일 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 "면역자극성 사이토카인(immunostimulatory cytokine)"은 세포-매개 면역 반응, 체액성 면역 반응 및 보체 시스템에 일부를 형성하거나 이에 연루되는 성분들을 포함하는 면역 시스템의 어느 성분의 활성의 증가를 촉진시키는 어느 화합물을 지칭한다. 면역자극성 사이토카인은 이에 한정하는 것은 아니나 IL-2, IL-12, IL-20, IL-15, IL-18, IL-24, GM-CSF, TNFα, CD40 리간드, IFNa, IFNp, IFNγ 또는 기능적으로 동등한 이의 변이체일 수 있다. 일 구현으로, 면역자극성 사이토카인은 IL-2일 수 있다.
일 구현으로, 나노면역컨주게이트는 면역 관문 단백질의 인히비터 및 면역자극성 사이토카인 모두를 포함할 수 있으며, 각각은 폴리몰릭산 기반 분자 스캐폴드와 독립적으로 공유 결합된다.
본 명세서에 사용된 용어 "항암제(anti-cancer agent)"는 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 어느 화합물(이의 유사체, 유도체, 프로드럭 및 약학적 염을 포함 함) 또는 조성물을 지칭한다. 항암제는 이에 한정하는 것은 아니나 토포아이소머라아제 I 및 II의 인히비터, 알킬화제, 미세소관 인히비터 또는 혈관신생 인히비터일 수 있다.
일 구현으로, 항암제는 인간 표피 성장 인자 리셉터(EGFR/EGFRvIII 및 HER2) 또는 세포 증식을 위한 마스터 시그널링 레귤레이터인 세린-트레오닌 단백질 키나아제 CK2(CK2)의 합성 또는 활성을 저해하거나 감소시킬 수 있다. 제한없이, HER 단백질은 EGFR/EGFRvIII, HER1, HER2, HER3 또는 HER4로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질일 수 있다. HER 및/또는 CK2 단백질의 합성 또는 활성을 억제하는 항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고 뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 저 분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 구현으로, HER, EGFR 및/또는 CK2의 합성 또는 활성을 억제하는 항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA는 HER2/neu 또는 CK2 단백질의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일 구현으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노(Morpholino) 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 HER2/neu를 코딩하는 핵산의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 CK2를 코딩하는 핵산의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2의 서열과 적어도 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 서열 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 EGFR을 코딩하는 핵산의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함할 수있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 8의 서열과 적어도 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하는 것은 2개의 서열 내의 대응 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 정렬 및 비교하는 것을 포함할 수 있다. 두 서열의 모든 위치가 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우, 서열은 100% 동일하다. 퍼센트 동일성은 Smith Waterman 알고리즘(Smith TF, Waterman MS 1981 "Identification of Common Molecular Subsequences," J Mol Biol 147: 195 -197, 이의 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨)에 의해 측정된다.
일 구현은 본 명세서에서 열거된 핵산 또는 이의 상보체 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 서열의 일부를 갖는 합성 핵산, 합성 폴리뉴클레오타이드, 또는 합성 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 합성 핵산, 합성 폴리뉴클레오타이드 또는 합성 올리고뉴클레오타이드는 10 내지 전장, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 21, 10 내지 22, 10 내지 23, 10 내지 24, 10 내지 25, 또는 15, 20 또는 25 뉴클레오타이드의 범위 내 길이를 가질 수 있다. 상기 범위 중 하나 내에 길이를 갖는 합성 핵산, 합성 폴리뉴클레오타이드 또는 합성 올리고뉴클레오타이드는 상기 언급된 범위 내에서 어느 특정 길이를 가질 수 있으며, 종단점을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 언급된 길이는 언급된 길이를 수용하기에 충분한 뉴클레오타이드가 단일 위치를 따르는 기준 서열(즉, 본 명세서의 핵산 중 어느 하나) 내의 어느 단일 위치에서 시작할 수 있다. 언급된 길이는 기준 서열의 전장일 수 있다.
일 구현으로, HER의 합성 또는 활성을 억제하는 항암제는 항-HER2/neu 항체일 수 있다. 일 구현으로, 항-HER2/neu 항체는 Trastuzumab Herceptin®일 수 있다. 항-HER2/neu 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한, 항-HER2/neu 항체는 인간화 항체 또는 키메릭 항체일 수 있다.
본 발명에 따르는 추가적인 예시적인 항암제는 파클리탁셀(탁솔); 도세탁셀; 게르미시티빈(germicitibine); 알데스루킨(aldesleukin); 알렘투즈맙(alemtuzumab); 알리트레티노인(alitretinoin); 알로푸리놀; 알트레타민; 아미포스틴; 아나스트로졸; 아르세닉 트리옥사이드; 아스파라기나아제; BCG 라이브; 벡사로텐 캡슐; 벡사로텐 겔; 블레오마이신; 부술판 인트라베노스(busulfan intravenous); 부술파노랄(busulfanoral); 칼러스테론(calusterone); 카페시타빈; 플라티네이트; 카르무스틴; 폴리페프로산 임플란트가 있는 카르무스틴(carmustine with polifeprosan implant); 셀레콕시브; 클로람부실; 클라드리빈; 시클로포스파미드; 시타라빈; 시타라빈 리포조말(cytarabine liposomal); 다카바진; 닥티노마이신; 액티노마이신 D; 다베포에틴 알파; 다우노루비신 리포조말; 다우노루비신, 다우노마이신; 데닐루킨 디프티톡스(denileukin diftitox), 덱스라족산(dexrazoxane); 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 리포조말; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 엘리오트 B 솔루션(Elliott's B solution); 에피루비신; 에포에틴 알파 에스트라무스틴; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드(VP-16); 이그제메스탄(exemestane); 필그라스팀(filgrastim); 플록수리딘(floxuridine)(동맥 내); 플루다라빈; 플루오로우라실(5-FU); 풀베스트란트; 젬투주맙 오조가마이신; 고세렐린 아세테이트; 히드록시 우레아; 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan); 이다루비신; 이포스파마이드; 이마티닙 메실레이트; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 이리노테칸; 레트로졸; 류코보린; 레바미졸; 로뮤스틴(CCNU); 메클로레타민(니트로겐머스타드); 메게스트롤 아세테이트; 멜팔란(L-PAM); 메르캅토퓨린(6-MP); 메스나; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 미토마이신 C; 미토탄(mitotane); 미톡산트론; 난드롤론 펜프로피오네이트(nandrolone phenpropionate); 노페투모맙(nofetumomab); LOddC; 오프렐베킨(oprelvekin); 파미드로네이트; 페가데마세(pegademase); 페가스파그가세(pegaspargase); 페그필그라스팀(pegfilgrastim); 펜토스타틴; 피브로브로만; 플리카마이신; 미트라마이신; 포르피머 소듐; 프로카르바진; 퀴나크린; 라스부리카세(rasburicase); 리툭시맵; 사르그래모스팀(sargramostim); 스트렙토조신; 탈부비딘(LDT); 탤크; 타목시펜; 테모졸로미드; 테니포시드(teniposide)(VM-26); 테스토락톤; 티오구아닌(6-TG); 티오테파; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맵; 트라스트주맙; 트레티노인(ATRA); 우라실 머스타드; 발루비신; 발토르시타빈(monoval LDC); 빈블라스틴; 비노렐빈(vinorelbine); 졸레드로네이트; 또는 이들의 어느 혼합물일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "표적 리간드(targeting ligand)"는 선택된 표적, 예를 들어 세포, 세포 타입, 조직, 기관, 신체 부위, 또는 구획(compartment), 예를 들어 세포, 조직 또는 기관 구획에 대한 증강된 친화성을 제공하는 어느 분자를 지칭한다. 표적 리간드는 이에 한정하는 것은 아니나 항체, 항원, 폴레이트, 리셉터 리간드, 탄수화물, 앱타머, 인테그린 리셉터 리간드, 케모카인 리셉터 리간드, 트랜스페린, 바이오틴, 세로토닌 리셉터 리간드, PSMA, 엔도텔린, GCPII, 소마토스타틴, LDL 또는 HDL 리간드일 수 있다.
일 구현으로, 표적 리간드는 종양 세포 또는 암세포를 표적화할 수 있다. 본명세서에 사용된 문구 "종양 형성 세포 또는 암세포를 표적한다(target a tumorigenic cell or a cancer cell)"는 용어는 종양 내 종양 형성 세포 집단, 즉 종양 형성 세포에 나노면역컨주게이트를 전달하는 것을 지칭한다.
일 구현으로, 표적 리간드는 세포 내의 적어도 맥관구조(vasculature) 단백질에 특이적인 항체일 수 있다. 일 구현으로, 맥관구조 단백질은 트랜스페린 리셉터 단백질일 수 있다. 항체 표적 모듈(TfR-Ab)은 트랜스페린 리셉터 단백질에 바인딩하여 BBB와 관련된 내피를 통해 트랜스사이토시스를 달성할 수 있다. 제한없이, 맥관구조 단백질에 특이적인 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한, 항체는 인간화 항체 또는 키메릭 항체일 수 있다.
트랜스페린(Tf) 수용체(TfR/CD71)는 철 흡수 및 세포 성장 조절에 관여하는 트랜스멤브레인 호모다이머 단백질이다. 암세포는 TfR을 정상 세포보다 적어도 수배 더(최고 100배 더) 높은 수준으로 발현한다. TfR 과발현은 유방암을 포함하여 다양한 암의 단계 및 예후와 관련된다. 암세포 상의 높은 TfR 발현 수준, 이의 내재화하는 능력 및 암 병리학에서 이의 역할은 암 치료를 위해 매력적인 표적이 되도록 한다. 또한, TfR은 리셉터-매개 엔도시토시스에 의해 Tf 또는 항-TfR mAbs에 바인딩된 광범위하게 다양한 세포독성 분자를 유방을 포함하는 다른 암 세포로 전달하는 데 사용되어 왔다.
혈액-뇌 배리어는 뇌의 항상성을 유지하고, 암을 표적하는 치료 Abs를 포함하는 다수 분자의 뇌 접근을 제한하는 단단히 결합된 모세혈관 내피 세포막에 의해 형성된 높은 저항 배리어이다. 그러나, BBB는 이의 내피 세포 상에서 TfR을 발현하고, 항-TfR mAbs는 암을 표적하는 것을 포함하는 치료 약물의 뇌 전달에 사용되는 프로세스인 통과세포외배출(transcytosis)에 의해 효과적으로 BBB를 가로지를 수 있다. 이러한 시험관 내, 전임상 시험 및 임상 시험은 치료제를 암 세포로 전달하기 위한 TfR 표적화의 효능 및 안전성을 보여주며, 치명적인 유방암 뇌 전이를 치료하기 위해 BBB를 가로지르는 약물 전달과 특히 관련이 있다.
일 구현으로, 표적 리간드는 렉틴 또는 트랜스페린 수용체에 특이적인 다른 리간드일 수 있다. 일 구현으로, 표적 리간드는 임의의 수의 세포 표면 리셉터 또는 항원 중 하나에 대한 리간드일 수 있다.
상기 분자 스캐폴드 및 상기 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 성분들은 링커를 통해 서로 연결될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "링커(linker)"는 화합물의 두 부분을 연결하는 유기 모이어티(moiety)를 의미한다. 링커는 전형적으로 직접 결합 또는 산소나 황과 같은 원자, NR1, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH와 같은 유니트, 또는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴 알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로시크릴릴알킬, 알킬헤테로시클릴알케닐, 알킬헤테로시클릴알키닐, 알케닐헤테로시클릴알킬, 알케닐헤테로시클릴알케닐, 알케닐헤테로시클릴알키닐, 알키닐헤테로시클릴알킬, 알킬닐헤테로시클릴알케닐, 알키닐헤테로시클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴과 같은 원자들의 사슬을 포함하며, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R1)2, C(O), 절단가능한 연결기, 치환 또는 비치환 헤테로시클릭에 의해 중단되거나 종결될 수 있으며; 여기서 R1은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다.
일 구현으로, 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 제한없이, PEG는 어느 바람직한 분자량일 수 있다. 일 구현으로, PEG는 약 1,000 Da, 약 1,500 Da, 약 1,000 Da, 약 2,500 Da, 약 3,000 Da, 약 3,500 Da, 약 4,000 Da, 약 4,500 Da, 약 5,000 Da, 약 10,000 Da, 약 15,000 Da, 약 20,000 Da, 약 25,000 Da 또는 약 30,000 Da의 분자량을 가질 수 있다. 일 구현으로, PEG는 약 3,400 Da의 분자량을 가질 수 있다.
일 구현으로, 나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 PK 조절 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "PK 조절 리간드(PK modulating ligand)" 및 "PK 조절제(PK modulator)"는 나노면역컨주게이트의 약물동력학을 조절할 수 있는 분자를 지칭한다. 예를 들어, PK 조절제는 망상내피 시스템(RES) 및/또는 효소 분해에 의한 나노면역컨주게이트의 재흡수를 억제 또는 감소시킬 수 있다.
PEG화(PEGylation)는 일반적으로 접합된 단백질의 생체 내 반감기를 증가시키고, 순환 시간을 연장시키며, 표적화된 고형 종양으로 혈관 외 유출을 증진시키도록 약물 디자인에 사용된다(Arpicco et al., 2002 Bioconjugate Chem 13:757 and Maruyama et al, 1997 FEBS Letters 413:1771, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 따라서, 일 구현으로, PK 조절제는 PEG일 수 있다. 제한없이, PEG는 어느 바람직한 분자량일 수 있다. 일 구현으로, PEG는 약 1,000 Da, 약 1,500 Da, 약 1,000 Da, 약 2,500 Da, 약 3,000 Da, 약 3,500 Da, 약 4,000 Da, 약 4,500 Da, 약 5,000 Da, 약 10,000 Da, 약 15,000 Da, 약 20,000 Da, 약 25,000 Da 또는 약 30,000 Da의 분자량을 가질 수 있다. 일 구현으로, PK 조절제는 약 5,000 Da의 PEG일 수 있다. 반감기를 증가시키는 것으로 알려진 다른 분자도 PK 조절제로서 사용될 수 있다.
일 구현으로, 나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 엔도조몰리틱(endosomolytic) 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "엔도조몰리틱(endosomolytic) 리간드"는 엔도조몰리틱 특성을 갖는 분자를 지칭한다. 엔도조몰리틱 리간드는 세포 내의 엔도좀, 리소좀, 소포체(ER), 골지체(golgi apparatus), 미세소관, 퍼옥시좀 또는 다른 소포체와 같은 세포 구획으로부터 본 발명의 조성물 또는 이의 성분의 용해 및/또는 세포의 세포질로의 수송을 촉진한다. 엔도조몰리틱 리간드는 이에 한정하는 것은 아니나 이미다졸, 폴리 또는 올리고이미다졸, 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민(PEIs), 예를 들면, 스퍼민, 양이온성 선형 또는 분지형 폴리아민과 같은 선형 또는 분지형 폴리아민, 폴리카르복실레이트, 폴리양이온, 마스킹된 올리고 또는 폴리 양이온 또는 음이온, 아세탈, 폴리아세탈, 케탈/폴리케탈, 오르토에스테르, 마스킹 또는 마스킹되지 않은 양이온 또는 음이온 전하를 갖는 선형 또는 분지형 폴리머, 마스킹된 또는 마스킹되지 않은 양이온 또는 음이온 전하를 갖는 덴드리머, 폴리음이온성 펩타이드, 폴리음이온성 펩티도미메틱스, pH-민감성 펩타이드, 천연 또는 합성 융합성 리피드, 천연 또는 합성 양이온 리피드일 수 있다.
일 구현으로, 엔도조몰리틱 리간드는 다수의 류신 또는 발린 잔기를 포함할 수 있다. 엔도조몰리틱 리간드는 폴리류신일 수 있다. 일 구현으로, 엔도조몰리틱 리간드는 Leu-Leu-Leu(LLL)일 수 있다.
일 구현으로, 나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 영상화제를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "영상화제(imaging agent)"는 컨디션(들), 병리학적 질환(들), 및/또는 질병(들)의 존재 및/또는 진행의 검출, 영상, 및/또는 모니터링을 가능하게 하는 분자 내의 요소 또는 작용기를 지칭한다. 영상화제는 에코생성 물질(액체 또는 기체), 비금속 동위원소, 광학 리포터, 붕소 중성자 흡수제, 파라마그네틱 금속 이온, 페로마그네틱 금속, 감마-방출 방사성 동위원소, 양전자-방출 방사성 동위 원소, 또는 엑스레이 흡수제일 수 있다.
적합한 광학 리포터는 이에 한정하는 것은 아니나 형광 리포터 또는 화학발광성 그룹일 수 있다. 예를 들어, 플루오로포어와 같은 매우 다양한 형광 리포터 염료가 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 플루오로포어는 방향족 또는 헤테로 방향족 화합물이고, 피렌, 안트라센, 나프탈렌, 아크리딘, 스틸벤, 인돌, 벤즈인돌, 옥사졸, 티아졸, 벤조티아졸, 시아닌, 카보시아닌, 살리실레이트, 안트라닐레이트, 쿠마린, 플루오레세인, 로다민 또는 기타 화합물이다. 적합한 형광 리포터는 플루오로세인 또는 로다민 염료와 같은 크산텐 염료를 포함할 수 있다. 플루오로 포어는 이에 한정하는 것은 아니나 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론; 5-카르복시-2,7-디클로로플루오레세인; 5-카르복시 플루오레세인(5-FAM); 5-카르복시나프토플루오레세인(pH 10); 5-카르복시테트라메틸 로다민(5-TAMRA); 5-FAM(5-카르복시플루오레세인); 5-히드록시 트립타민(HAT); 5-ROX(카르복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카르복시테트라메틸 로다민); 6-카르복시로다민 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD); 7-히드록시-4-메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘; ABQ; 산성 푹신(Acid Fuchsin); ACMA(9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘); 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로우; 아크리플라빈(Acriflavin); 아크리플라빈 풀젠(Acriflavin Feulgen) SITSA; 에쿠오린(Aequorin)(광 단백질); Alexa Fluor 350™; Alexa Fluor 430™; Alexa Fluor 488™; Alexa Fluor 532™; Alexa Fluor 546™; Alexa Fluor 568™; Alexa Fluor 594™; Alexa Fluor 633™; Alexa Fluor 647™; Alexa Fluor 660™; Alexa Fluor 680™; 알리자린 콤플렉손; 알리자린 레드; 알로피코시아닌(Allophycocyanin)(APC); AMC, AMCA-S; AMCA(아미노메틸쿠마린); AMCA-X; 아미노락티노마이신 D; 아미노쿠마린; 아닐린 블루; 안트로실 스테아레이트(Anthrocyl stearate); APC-Cy7; APTS; 아스트라존 브릴런트 레드 4G(Astrazon Brilliant Red 4G); 아스트라존 오렌지 R(Astrazon Orange R); 아스트라존 레드 6B; 아스트라존 옐로우 7 GLL; 아타브린(Atabrine); ATTO-TAG™ CBQCA; ATTO-TAG™ FQ; 오우라민(Auramine); 오로포스핀 G; 오로포스핀; BAO 9(비스아미노페닐옥사다이아졸); BCECF(고 pH); BCECF(저 pH); 베르베린 설페이트(Berberine Sulphate); 베타 락타마아제; BFP 블루 쉬프티드 GFP(Y66H); BG-647; 비만(Bimane); 비스벤즈아미드; 블란코포르(Blancophor) FFG; 블란코포르 SV; BOBO™-1; BOBO™-3; 보디피 492/515; 보디피 493/503; 보디피 500/510; 보디피 505/515; 보디피 530/550; 보디피 542/563; 보디피 558/568; 보디피 564/570; 보디피 576/589; 보디피 581/591; 보디피 630/650-X; 보디피 650/665-X; 보디피 665/676; 보디피 Fl; 보디피 FL ATP; 보디피 Fl-세라마이드; 보디피 R6G SE; 보디피 TMR; 보디피 TMR-X 컨주게이트; 보디피 TMR-X, SE; 보디피 TR; 보디피 TR ATP; 보디피 TR-X SE; BO-PRO™-1; BO-PRO™-3; 브릴런트 설포플라빈 FF; 칼세인; 칼세인 블루; Calcium Crimson™; 칼슘 그린; ㅋ칼슘 그린-1 Ca2+ 염료; 칼슘 그린-2 Ca2+; 칼슘 그린-5N Ca2+; 칼슘 그린-C l8 Ca2+; 칼슘 오렌지; 칼코플루오르 화이트; 카르복시-X-로다민(5-ROX); Cascade Blue™; 케스케이드 옐로우; 카테콜라민; CFDA; CFP-시안 플루오레센트 단백질; 클로로필; 크로모마이신 A; 크로모마이신 A; CMFDA; 코엘렌터라진(Coelenterazine); 코엘렌터라진 cp; 코엘렌터라진 f; 코엘렌터라진 fcp; 코엘렌터라진 h; 코엘렌터라진 hep; 코엘렌터라진 ip; 코엘렌터라진 O; 쿠마린 팔로이딘(Coumarin Phalloidin); CPM 메틸쿠마린; CTC; Cy2™; Cy3.1 8; Cy3.5™; Cy3™; Cy5.1 8; Cy5.5™; Cy5™; Cy7™; 시안 GFP; 시클릭 AMP 플루오로센서(FiCRhR); d2; 다브실(Dabcyl); 단실(Dansyl); 단실 아민(Dansyl Amine); 단실 카다베린(Dansyl Cadaverine); 단실 클로라이드(Dansyl Chloride); 단실 DHPE; 단실 플루오라이드; DAPI; 다폭실(Dapoxyl); 다폭실 2; 다폭실 3; DCFDA; DCFH(Dichlorodihydrofluorescein Diacetate); DDAO; DHR(Dihydorhodamine 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS(무-비율); DiA(4-Di-16-ASP); DIDS; 디하이드로로다민(Dihydorhodamine) 123(DHR); DiO(DiOCl8(3)); DiR; DiR(DiICl8(7)); 도파민; DsRed; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; 에오신(Eosin); 에리트로신(Erythrosin); 에리트로신 ITC; 에티듐 호모다이머-1(Ethidium homodimer-1)(EthD-1); 유크리신(Euchrysin); 유로퓸(Europium)(III) 클로라이드; 유로퓸; EYFP; 패스트 블루(Fast Blue); FDA; 풀겐(Feulgen)(Pararosaniline); FITC; FL-645; 플라조 오렌지(Flazo Orange); 플루오-3(Fluo-3); 플루오-4; 플루오로세인 디아세테이트(Fluorescein Diacetate); 플루오로-에메랄드(Fluoro-Emerald); 플루오로-골드(Hydroxystilbamidine); 플루오르-루비(Fluor-Ruby); 플루오르X(FluorX); FM 1-43™; FM 4-46; Fura Red™(고 pH); Fura-2, 고칼슘; Fura-2, 저칼슘; 제나크릴 브릴리언트 레드(Genacryl Brilliant Red) B; 제나크릴 브릴리언트 옐로우 10GF; ㅈ제나크릴 핑크 3G; 제나크릴 옐로우 5GF; GFP (S65T); GFP 레드 시프티드(rsGFP); GFP 와일드 타입, 논-UV 여기(non-UV excitation)(wtGFP); GFP 와일드 타입, UV 여기(wtGFP); GFPuv; 글록살릭산(Gloxalic Acid); 그래뉼라 블루(Granular Blue); 헤마토포르피린(Haematoporphyrin); Hoechst 33258; Hoechst 33342; Hoechst 34580; HPTS; 히드록시쿠마린(Hydroxycoumarin); 히드록시스틸바미딘(Hydroxystilbamidine)(FluoroGold); 히드록시트립타민(Hydroxytryptamine); 인도디카르보시아닌(Indodicarbocyanine)(DiD); 인도트리카르보시아닌(Indotricarbocyanine)(DiR); 인트라화이트(Intrawhite) Cf; JC-1; JO-JO-1; JO-PRO-1; LaserPro; 라우로단(Laurodan); LDS 751; 루코포르(Leucophor) PAF; 루코포르 SF; 루코포르 WS; 리사민 로다민(Lissamine Rhodamine); 리사민 로다민 B; LOLO-1; LO-PRO-1; 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow); 마그 그린(Mag Green); 마그달라 레드(Magdala Red)(Phloxin B); 마그네슘 그린(Magnesium Green); 마그네슘 오렌지; 말라치트 그린(Malachite Green); 마리나 블루(Marina Blue); 막실론 브릴리언트 플라빈(Maxilon Brilliant Flavin) 10 GFF; 막실론 브릴리언트 플라빈 8 GFF; 메로시아닌; 메톡시쿠마린; 미토트래커 그린 FM(Mitotracker Green FM); 미토트래커 오렌지; 미토트래커 레드; 미트라마이신; 모노브로모비만(Monobromobimane); 모노브로모비만(mBBr-GSH); 모노클로로비만; MPS(Methyl Green Pyronine Stilbene); NBD; NBD 아민; 나일 레드; 니트로벤즈옥사디돌; 노르아드레날린; 뉴클리어 패스트 레드(Nuclear Fast Red); 뉴클리어 옐로우; 닐로산 브릴리언트 라빈(Nylosan Brilliant Iavin) E8G; Oregon Green™; Oregon Green 488-X; Oregon Green™ 488; Oregon Green™ 500; Oregon Green™ 514; 퍼시픽 블루(Pacific Blue); 파라로사닐린(Feulgen); PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-TexasRed(Red 613); 플록신 B(Magdala Red); 포르와이트(Phorwite) AR; 포르와이트 BKL; 포르와이트 Rev; 포르와이트 RPA; 포스핀 3R; PhotoResist; 피코에리트린 B[PE]; 피코에리트린 R[PE]; PKH26; PKH67; PMIA; 폰토크롬 블루 블랙(Pontochrome Blue Black); POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-PRO-3; 프리뮬린(Primuline); 프로시온 옐로우; 프로피듐 이오디드(Propidium lodid)(PI); PyMPO; 피렌; 피로닌; 피로닌 B; 피로잘 브릴리언트 플라빈(Pyrozal Brilliant Flavin) 7GF; QSY 7; 퀴나크린 머스타드; 레소루핀(Resorufin); RH 414; Rhod-2; 로다민; 로다민 110; 로다민 123; 로다민 5 GLD; 로다민 6G; 로다민 B 540; 로다민 B 200; 로다민 B 엑스트라; 로다민 BB; 로다민 BG; 로다민 그린; 로다민 팔리시딘(Rhodamine Phallicidine); 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidine); 로다민 레드; 로다민 WT; 로즈 벵갈; R-피코에리트린(PE); 레드 시프티드 GFP(rsGFP, S65T); S65A; S65C; S65L; S65T; 사파이어 GFP; 세로토닌; 세브론 브릴리언트 레드 2B; 세브론 브릴리언트 레드 4G; 세브론 브릴리언트 레드 B; 세브론 오렌지; 세브론 옐로우 L; sgBFP™; sgBFP™(수퍼 글로우 BFP); sgGFP™; sgGFP™(수퍼 글로우 GFP); SITS; SITS(Primuline); SITS(Stilbene Isothiosulphonic Acid); SPQ(6-메톡시-N-(3-설포프로필)-퀴노늄); 스틸벤; 설포로다민 B can C; 설포로다민 G 엑스트라; 테트라사이클린; 테트라메틸로다민; Texas Red™; Texas Red-X™ 컨주게이트; 티아디카르복시아닌(DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TCN; 티올라이트(Thiolyte); 티오졸 오렌지; 티노폴 CBS(Calcofluor White); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; TriColor(PE-Cy5); TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate); True Blue; TruRed; 울트라라이트(Ultralite); 우라닌(Uranine) B; 유비텍스(Uvitex) SFC; wt GFP; WW 781; XL665; X-로다민; XRITC; 크실렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; 옐로우 GFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; 또는 YOYO-3일 수 있다. 이들 형광 화합물의 많은 적합한 형태가 이용가능하며 사용될 수 있다.
영상화제로서 사용하기에 적합한 형광 단백질의 예로는 이에 한정하는 것은 아니나 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질(예: DsRed), 황색 형광 단백질, 시안 형광 단백질, 청색 형광 단백질 및 이들의 변이체가 포함된다(참조, 예, 미국 특허 제6,403,374호, 제6,800,733호 및 제7,157,566 호, 그 전체 내용이 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). GFP 변이체의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나 강화된 GFP(EGFP), 불안정화된 EGFP, 문헌 [Doan et al, Mol. Microbiol, 55: 1767-1781(2005)]에 기재된 GFP 변이체, 문헌 [Crameri et al, Nat. Biotechnol., 14:315319(1996)]에 기재된 GFP 변이체, 문헌 [Rizzo et al, Nat. Biotechnol, 22:445 (2004) and Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67:509(1998)]에 기재된 세룰린(cerulean) 형광 단백질, 및 문헌 [Nagal et al, Nat. Biotechnol., 20:87-90(2002)]에 기재된 황색 형광 단백질이 포함된다. DsRed 변이체는 예를 들어 문헌 [Shaner et al, Nat. Biotechnol., 22: 1567- 1572(2004)]에 기재되어 있으며, mStrawberry, mCherry, mOrange, niBanana, niHoneydew, 및 niTangerine을 포함한다. 추가적인 DsRed 변이체는 예를 들어 문헌 [Wang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101: 16745-16749(2004)]에 기재되어 있으며, mRaspberry 및 mPlum을 포함한다. DsRed 변이체의 추가 예는 문헌 [Fischer et al, FEBS Lett., 577:227-232(2004)]에 기재된 mRFPmars 및 문헌 [Fischer et al, FEBS Lett, 580:2495-2502(2006)]에 기재된 mRFPruby를 포함한다.
적절한 에코생성(echogenic) 가스는 이에 한정하는 것은 아니나 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄, 퍼플루오로시클로부탄, 퍼플루오로펜탄, 또는 퍼플루오로헥산과 같은 설퍼 헥사플루오라이드 또는 퍼플루오로카본 가스를 포함한다. 적합한 비금속 동위원소는 이에 한정하는 것은 아니나 11C, 14C, 13N, 18F, 123I, 124I, 125I, 및 131I를 포함한다. 적절한 방사성 동위원소는 이에 한정하는 것은 아니나 99mTc, 95Tc, 111In, 62Cu, 64Cu, Ga, 68Ga, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y; 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi 및 153Gd를 포함한다. 적합한 파라마그네틱 금속 이온은 이에 한정하는 것은 아니나 Gd(III), Dy(III), Fe(III) 및 Mn(II)을 포함한다. 적절한 X-선 흡수제는 이에 한정하는 것은 아니나 Re, Sm, Ho, Lu, Pm, Y, Bi, Pd, Gd, La, Au, Au, Yb, Dy, Cu, Rh, Ag, 및 Ir을 포함한다.
일 구현으로, 영상화제는 킬레이트화 분자를 포함할 수 있다. 적합한 킬레이트제는 이에 한정하는 것은 아니나 1,4,7,10-테트라아조시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA); 디벤조-DOTA, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA); 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라키스(2-프로피온산)(DOTMA); 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA); 1,4,7-트리카르복시메틸 1,4,7,10-테트라아자아시클로도데칸 트리아세트산(D03A); 1,4,7,10-테트라아자시클로-도데칸-1-(2-히드록시프로필)-4,7,10-트리아세트산(HP-D03A); 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA); 비스-2(히드록시벤질)-에틸렌-디아민디아세트산(HBED); 1,4,7-트리아자시클로-노난 1,4,7-트리아세트산(NOTA); BAD, EDTA, NTA, HDTA, 이들의 포스포네이트 유사체 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일 구현으로, 영상화제는 Alexa Fluor 680™일 수 있다.
제한없이, 나노면역컨주게이트는 어느 원하는 크기일 수 있다. 예를 들어, 나노면역컨주게이트는 나노면역컨주게이트가 통과세포외배출을 통해 혈액 뇌 배리어를 가로 지르게 하는 크기일 수 있다. 일 구현으로, 나노면역컨주게이트는 약 1 nm 내지 약 100 nm; 약 1 nm 내지 약 10 nm; 약 10 nm 내지 약 20 nm; 약 20 nm 내지 약 30 nm; 약 30 nm 내지 약 40 nm; 약 40 nm 내지 약 50 nm; 약 50 nm 내지 약 60 nm; 약 60 nm 내지 약 70 nm; 약 70 nm 내지 약 80 nm; 약 80 nm 내지 약 90 nm; 약 90 nm 내지 약 100 nm; 약 5 nm 내지 약 90 nm; 약 10 nm 내지 약 85 nm; 약 20 nm 내지 약 80 nm; 약 25 nm 내지 약 75 nm의 크기 범위일 수 있다. 일 구현으로, 나노면역컨주게이트는 약 50 nm 내지 약 70 nm의 크기일 수 있다. 일 구현으로, 나노면역컨주게이트는 50 nm 이하의 크기일 수 있다.
당업자는 나노면역컨주게이트가 표시된 "크기(size)" 주위의 크기 분포를 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 달리 언급하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 용어 "크기"는 나노면역컨주게이트의 크기 분포의 모드, 즉 크기 분포에서 가장 빈번하게 발생하는 값을 지칭한다. 크기를 측정하기 위한 방법은 예를 들어, 동적 광 산란(광 상관 분광법, 레이저 회절, 저각 레이저 광 산란(LALLS) 및 중각 레이저 광 산란(MALLS)), 광 차폐법(light obscuration methods)(쿨터 분석법(Coulter analysis method)과 같은), 또는 기타 방법(레올로지, 및 광 또는 전자 현미경과 같은)으로 당업자에게 알려져 있다.
일 구현은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 나노면역컨주게이트 중 어느 하나를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 이를 필요로하는 대상자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
일 구현으로, 암을 치료하는 방법은 본 명세서에 기재된 나노면역컨주게이트 중 어느 하나를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상자에게 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현으로, 암을 치료하는 방법은 본 명세서에 기재된 나노면역컨주게이트 중 어느 하나의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
일 구현으로, 암을 치료하는 방법은 치료 유효량의 항-종양 면역 반응 자극제 및 치료 유효량의 나노컨주게이트를 이를 필요로 하는 대상자에게 공동 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 나노컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드 및 적어도 하나의 표적 리간드 및 상기 스캐폴드에 공유 결합되거나 연결된 적어도 하나의 항암제를 포함한다.
일 구현으로, 상기 방법은 종양 성장의 억제를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 분석 단계는 대상자에서 약 60%, 70%, 80% 또는 약 90% 초과의 종양 성장 억제를 관찰하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현으로, 분석 단계는 Akt 인산화의 억제에 의한 HER2/neu 리셉터 신호전달의 억제를 관찰하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "치료 유효량(therapeutically-effective amount)"이라는 문구는 어느 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비율로 동물에서 세포의 적어도 하위 집단에서 소정의 원하는 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 화합물, 물질 또는 조성물의 양을 의미한다. 암을 치료하는 것과 관련하여, "치료 유효량"은 암 또는 변형된 성장의 추가 발달을 예방하고, 심지어 암 또는 고형 종양의 퇴행을 효과적으로 하는 양이다.
치료 유효량의 결정은 일반적으로 당업자의 능력 범위 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 대상자의 병력, 나이, 컨디션, 성별, 및 대상자의 의학적 컨디션의 중증도 및 타입에 따라 달라질 수 있고, 다른 제제의 투여는 치료될 질병 또는 질환을 완화시킨다.
독성 및 치료 효능은 예를 들어, LD50(집단의 50%에 대한 치사 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서의 치료 효과적인 투여량)과 같이 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 투여 비율은 치료 지수이며, LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지표를 나타내는 조성물이 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 용어 ED는 유효 투여량을 나타내며, 동물 모델과 관련하여 사용된다. EC라는 용어는 유효 농도를 의미하며, 시험관 내 모델과 관련하여 사용된다.
세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량의 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다.
치료 유효량은 초기에 세포 배양 어세이로부터 추정될 수 있다. 세포 배양 물에서 결정된 IC50(즉, 증상의 반-최대 억제를 달성하는 치료제의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위한 투여량을 동물 모델에 공식화할 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들어 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 어느 특정 투여량의 영향은 적합한 생물 검정에 의해 모니터링될 수 있다.
투여량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 필요에 따라 치료의 관찰된 효과에 적합하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 활성제가 1㎍/kg 내지 150mg/kg, 1㎍/kg 내지 100mg/kg, 1㎍/kg 내지 50mg/kg, 1㎍/kg 내지 20 mg/kg, 1 μg/kg 내지 10 mg/kg, 1㎍/kg 내지 lmg/kg, 100 μg/kg 내지 100 mg/kg, 100 μg/kg 내지 50 mg/kg, 100 μg/kg 내지 20 mg/kg, 100 μg/kg 내지 10 mg/kg, 100μg/kg 내지 lmg/kg, 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 10 mg/kg 내지 100 mg/kg, 10 mg/kg 내지 50 mg/kg, 또는 10 mg/kg 내지 20 mg/kg의 투여량으로 주어지도록 투여될 수 있다. 본 명세서에서 주어진 범위는 모든 중간 범위를 포함하며, 예를 들어 1 mg/kg 내지 10 mg/kg 범위는 1 mg/kg 내지 2 mg/kg, 1 mg/kg 내지 3 mg/kg, 1 mg/kg 내지 4 mg/kg, 1 mg/kg 내지 5 mg/kg, 1 mg/kg 내지 6 mg/kg, 1 mg/kg 내지 7 mg/kg, 1 mg/kg 내지 8 mg/kg, 1 mg/kg 내지 9 mg/kg, 2 mg/kg 내지 10 mg/kg, 3 mg/kg 내지 10 mg/kg, 4 mg/kg 내지 10 mg/kg, 5 mg/kg 내지 10 mg/kg, 6 mg/kg 내지 10 mg/kg, 7 mg/kg 내지 10mg/kg, 8 mg/kg 내지 10 mg/kg, 9 mg/kg 내지 10 mg/kg 등일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 상기 주어진 것의 중간 범위는 또한 본 발명의 범위 내에 있으며, 예를 들어, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위에서, 2 mg/kg 내지 8 mg/kg, 3 ㎎/㎏ 내지 7 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏ 내지 6 ㎎/㎏ 등과 같은 투여량 범위가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다.
일 구현으로, 조성물은 활성제가 15 분, 30 분, 1 시간, 1.5 시간, 2 시간, 2.5 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간 또는 그 이상의 시간의 투여 후, 500 nM 미만, 400 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 50 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 25 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 1 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.1 nM 미만, 0.05, 0.01 nM 미만, 0.005 nM 미만, 0.001 nM 미만의 생체 내 농도를 갖는 투여량으로 투여될 수 있다.
치료 기간 및 빈도와 관련하여, 숙련된 임상의가 치료가 치료 효과를 제공하는지 여부를 결정하고, 투여량을 증가 또는 감소시킬 것인지 결정하고, 투여 빈도를 증가 또는 감소시킬 것인지, 치료를 중단할 것인지, 치료를 재개할 것인지 또는 치료 요법에 대한 다른 변경을 할 것인지를 결정하기 위해 대상자를 모니터링하는 것이 전형적이다. 투여 일정은 폴리펩타이드에 대한 대상자의 민감성과 같은 임상 인자의 수에 따라 일주일에 1회부터 매일까지 다양할 수 있다. 원하는 투여량은 매일 또는 3, 4, 5 또는 6일마다 투여될 수 있다. 원하는 투여량은 한 번에 투여되거나 서브 투여량, 예를 들어 2-4 서브 투여량으로 나누어질 수 있고, 예를 들어 적절한 간격으로 하루 또는 다른 적절한 일정을 통해 일정 시간에 걸쳐 투여될 수 있다. 이러한 서브 투여량은 단위 투여형으로 투여될 수 있다. 일 구현으로, 투여는 만성적일 수 있으며, 예를 들어 1주일 또는 몇 개월의 기간 동안 매일 1회 이상의 투여량일 수 있다. 투여 일정의 예로는 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 이상의 기간 동안 매일, 하루 2회, 하루 3회 또는 4회 이상 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 용어 "투여(administer)"는 원하는 효과가 생성되도록 원하는 부위에서 조성물의 적어도 부분적인 국소화를 일으키는 방법 또는 경로에 의해 조성물의 대상자 내로의 배치를 의미한다. 본 명세서에 기술된 화합물 또는 조성물은 이에 한정하는 것은 아니나 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 폐, 비강, 직장 또는 국소(구강 및 설하 포함) 투여를 포함하는 경구 또는 비경구 경로를 포함하는 당업계에 공지된 어느 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
예시적인 투여 방식은 이에 한정하는 것은 아니나 주사, 주입, 점적, 흡입 또는 섭취를 포함한다. "주사(Injection)"는 이에 한정하는 것은 아니나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척추강 내(intrathecal), 심실 내, 피막 내, 안와 내, 심장 내, 피내, 복강 내, 기관 내, 피하(subcutaneous), 표피하(subcuticular), 관절 내, 피막 하(sub capsular), 지주막 하(subarachnoid), 척수 내(intraspinal), 대뇌 척수 내(intracerebro spinal), 및 인트라스테멀(intrastemal) 주사 및 주입을 포함한다. 일 구현으로, 조성물은 정맥 내 주입 또는 주사에 의해 투여될 수 있다.
대상자에게 투여하기 위해, 나노면역컨주게이트 및/또는 항-종양 면역 반응 자극제는 약학적으로 허용가능한 조성물로 제공될 수 있다. 따라서, 일 구현은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 나노면역컨주게이트를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이들 약학적으로 허용가능한 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형화된 하나 이상의 나노면역컨주게이트의 치료 유효량을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 하기에 대해 적응화된 것들을 포함하여 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별하게 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌취(drenches)(수성 또는 비수성 용액 또는 서스펜션), 로젠즈, 당제(dragees), 캡슐, 필스(pills), 정제(예, 협측, 설하 및 전신 흡수를 목표로 하는것), 볼러스(boluses), 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; (2) 비경구 투여, 예를 들어, 멸균 용액 또는 서스펜션 또는 서방형 제형과 같은 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 경막 외 주사에 의한 비경구 투여; (3) 국소 적용, 예를 들어, 크림, 연고 또는 피부에 적용되는 조절 방출 패치 또는 스프레이와 같은 국소 적용; (4) 질내 또는 직장 내, 예를 들어, 페서리, 크림 또는 발포체와 같은 질내 또는 직장 내; (5) 설하; (6) 안구; (7) 경피; (8) 점막; 또는 (9) 경비(nasally). 또한, 나노면역컨주게이트는 환자에게 이식되거나 약물 전달 시스템을 사용하여 주사될 수 있다.
다양한 공지된 조절- 또는 광범위한-방출 투여 형태, 제형 및 장치가 본 발명의 나노면역컨주게이트 및 조성물과 함께 사용되도록 개조될 수 있다. 그 예로는 이에 한정하는 것은 아니나 미국 특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제4,008,719호; 제5,674,533호; 제5,059,595호; 제5,591,767호; 제5,120,548호; 제5,073,543호; 제5,639,476호; 제5,354,556호; 제5,733,566호; 및 제6,365, 185 Bl호에 기재된 것들을 포함하며, 이들 모두 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 이러한 투여 형태는 다양한 비율로 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해 예를 들어, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 다른 폴리머 매트릭스, 겔, 투과성 멤브레인, 삼투 시스템(예를 들어, OROS®(Alza Corporation, Mountain View, 캘리포니아주, 미국)) 또는 이들의 조합을 사용하여 하나 이상의 활성 성분들의 느린 또는 조절된 방출을 제공하는 데 사용될 수 있다.
일 구현으로, 약학적으로 허용가능한 조성물은 투여의 용이함 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "투여 단위 형태(dosage unit form)"라는 표현은 치료될 대상자에게 적합한 활성제의 물리적으로 분리된 단위를 나타낸다.
본 명세서에 사용된, "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"이란 용어는 적절한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하는 데 사용하기에 적절한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본 명세서에 사용된, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically-acceptable carrier)"는 하나의 기관 또는 신체 일부로부터 다른 기관 또는 신체 일부로 대상 화합물을 운반 또는 수송하는 것과 관련된, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예: 윤활제, 탤크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테로릭산), 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비이클을 의미한다. 각 담체는 제형의 다른 성분과 양립할 수 있고, 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능(acceptable)"해야한다. 약학적으로 허용가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당류, 예컨대 락토오스, 글루코스 및 수크로오스; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미세 결정 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 그 유도체; (4) 분말형 트래거캔트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탤크; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 땅콩 오일, 면실유, 홍화유 오일, 참기름, 올리브유, 콤 오일(comm oil) 및 콩기름과 같은 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드와 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 피로겐-프리 워터; (17) 등장성 식염수; (IS) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리 카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; (22) 폴리펩타이드 및 아미노산과 같은 벌킹제; (23) 혈청 알부민, HDL 및 LDL과 같은 혈청 성분; (22) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (23) 약학 제형에 사용되는 기타 무-독성 상용 물질. 습윤제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향료(flavoring agents), 향제(perfuming agents), 보존제 및 항산화제가 또한 제형에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "약학적으로 허용되는 담체" 등과 같은 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된, 용어 "암(cancer)"은 신체 기관 및 시스템의 정상 기능을 방해할 수 있는 세포의 제어되지 않은 성장을 지칭한다. 암은 원발성 암 또는 전이성 암 또는 둘 다일 수 있다. 원래 위치에서 이동하고 생명 유지에 필수적인 장기에 시딩된 암은 그 영향을 받은 장기의 기능적 저하를 통해 결국 대상자의 죽음을 초래할 수 있다. 전이는 암세포 또는 암세포 그룹으로, 암세포가 원발성 종양에서 신체의 다른 부위로 전파되어 발생하는 원발성 종양과는 다르다. 원발성 종양 덩어리의 진단시에, 환자는 전이, 예를 들어 전파 과정에서 암세포의 존재에 대해 모니터링될 수 있다.
또한, 본 명세서에 사용된 용어 "암"은 이에 한정하는 것은 아니나 고형 종양 및 혈액 발생 종양을 포함한다. 암이라는 용어는 피부, 조직, 기관, 뼈, 연골, 혈액 및 혈관의 질병을 지칭한다. "암"이라는 용어는 원발성 및 전이성 암을 더 포함한다. 본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 암의 예는 이에 한정하는 것은 아니나 고형 종양; 신경교종, 교아 세포종(glioblastomas), 다형성 교아종(glioblastoma multiforme)(GBM), 핍지교종(oligodendrogliomas), 속질모세포종(primitive neuroectodermal tumors), 저, 중 및 고 등급 성상세포종(astrocytomas), 상의세포종(ependymomas)(예: 점액유두뇌실막종(myxopapillary ependymoma papillary ependymoma), 뇌실막밑세포종(subependymoma), 성형수술의 상의세포종(anaplastic ependymoma)), 핍지교종(oligodendrogliomas), 수모세포종(medulloblastomas), 수막종, 뇌하수체 선종, 신경아세포종 및 두개 인두종을 포함하는 뇌암; 이에 한정하는 것은 아니나 원 위치 도관 암종(ductal carcinoma in situ), 침습성(또는 침윤성) 도관 암종, 침습성(또는 침윤성) 소엽 상피암, 선낭(또는 선암) 암종, 저 등급 선편평 상피암, 수질암종, 점액성(또는 콜로이드성) 암종 유두상암종(mucinous (or colloid) carcinoma papillary carcinoma), 세관암종(tubular carcinoma), 염증성 유방암, 유두의 파겟(Paget) 병, 엽상종양(phyllodes tumor), 삼중 음성 유방암, 전이성 유방암을 포함하는 유방암; 방광, 유방, 결장, 신장, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 편평세포암종을 포함하는 피부의 암종을 포함하는 암종; 흑색종, 세미노마(seminoma), 기형암종(tetraatocarcinoma)을 포함하는 다른 종양; 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 이에 한정하는 것은 아니나 피부건조증(xenoderma), 색소성 건피증(pigmentosum), 각질극 세포종(keratoactanthoma), 소낭 갑상선암(thyroid follicular cancer), 및 기형암종(teratocarcinoma)을 포함하는 다른 종양을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법은 이전에 암 치료를 받은 환자뿐만 아니라 이전에 암 치료를 받지 않은 환자를 치료하는 데 유용하다. 실제로, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 제1 선 및 제2 선의 암 치료에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "전암 컨디션(precancerous condition)"이라는 용어는 일반적인 의미, 즉 전이가 없는 조절되지 않은 성장의 의미를 가지며, 다양한 형태의 과형성 및 양성 비대(hypertrophy)를 포함한다. 따라서 "전암 컨디션"은 치료하지 않고 방치하면 암으로 이어질 수 있는 질환, 증후군 또는 발견이다. 이것은 암 위험이 유의하게 증가하는 것과 관련된 일반화된 상태이다. 프리말리그넌트 병변(Premalignant lesion)은 형태학적으로 변형된 조직으로 암이 명백하게 정상적인 것보다 발생하기 쉽다. 프리말리그넌트 컨디션의 예는 이에 한정하는 것은 아니나 경구 백반증, 광선 각화증(일광 각화증), 바렛 식도, 위축성 위염, 전립선의 양성 과형성, 결장 또는 직장의 전암성 용종, 위 상피 형성 이상증, 선종성 이형성증(adenomatous dysplasia), 유전성 비폴립 결장암 증후군(HNPCC), 바렛 식도, 방광 이형성증, 전암성 자궁경부 컨디션 및 자궁경부 이형성증을 포함한다.
일 구현으로, 암은 유방암; 난소암; 뇌암; 위장암; 전립선암; 암종, 폐암종, 간세포암종, 고환암; 자궁경부암; 자궁내막암; 방광암; 두경부암; 폐암; 위식도암 및 부인과암으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 구현으로, 암은 이에 한정하는 것은 아니나 원 위치 도관 암종(ductal carcinoma in situ), 침습성(또는 침윤성) 도관 암종, 침습성(또는 침윤성) 소엽 상피암, 선낭(또는 선암) 암종, 저 등급 선편평 상피암, 수질암종, 점액성(또는 콜로이드성) 암종 유두상암종(mucinous (or colloid) carcinoma papillary carcinoma), 세관암종(tubular carcinoma), 염증성 유방암, 유두의 파겟(Paget) 병, 엽상종양(phyllodes tumor), 삼중 음성 유방암, 전이성 유방암을 포함하는 유방암일 수 있다.
일 구현으로, 암은 원발성 HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 이의 뇌 전이일 수 있다.
일 구현으로, 암은 이에 한정하는 것은 아니나 신경 교종; 교아 세포종(glioblastomas), 다형성 교아종(glioblastoma multiforme)(GBM), 핍지교종(oligodendrogliomas), 속질모세포종(primitive neuroectodermal tumors), 저, 중 및 고 등급 성상세포종(astrocytomas), 상의세포종(ependymomas)(예: 점액유두뇌실막종(myxopapillary ependymoma papillary ependymoma), 뇌실막밑세포종(subependymoma), 성형수술의 상의세포종(anaplastic ependymoma)), 핍지교종(oligodendrogliomas), 수모세포종(medulloblastomas), 수막종, 뇌하수체 선종, 신경아세포종 및 두개 인두종을 포함하는 뇌암일 수 있다. 일 구현으로, 뇌암은 신경 교종, 교아 세포종, 또는 다형성 교아종(GBM)일 수 있다.
일 구현으로, 본 명세서에 기술된 방법은 암을 가지거나 암을 갖는 것으로 진단된 대상자를 치료하는 것과 관련될 수 있다. 암을 가진 대상자는 현재의 암 진단 방법을 사용하여 의사에 의해 확인될 수 있다. 이러한 컨디션을 특성화하고 진단에 도움을 주는 암의 증상 및/또는 합병증은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이에 한정하는 것은 아니나 종양의 성장, 암세포를 보유하고 있는 기관 또는 조직의 기능 장애 등일 수 있다. 예를 들어, 암의 진단에 도움이 될 수 있는 시험에는 이에 한정하는 것은 아니나 조직 생검 및 조직 검사가 포함된다. 암의 가족력이나 암 위험 인자(예: 담배 제품, 방사선 등)에 대한 노출은 또한 대상자가 암을 가질 가능성이 있는지 또는 암을 진단할 수 있는지 판단하는 데 도움이 될 수 있다.
일 구현으로, 상기 방법은 추가의 치료제를 공동 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 추가의 치료제는 항체, 효소 인히비터, 항균제, 항바이러스제, 스테로이드성, 비스테로이드성 염증제, 항대사제, 사이토카인, 사이토카인 차단제, 부착 분자 차단제 및 가용성 사이토카인 리셉터로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 구현으로, 상기 방법은 하나 이상의 추가의 항암 요법을 대상자에게 공동 투여하는 단계를 더 포함할 수있다. 일 구현으로, 추가의 치료는 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 온열 요법, 면역 요법, 호르몬 요법, 레이저 요법, 항혈관신생 요법 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일 구현으로, 추가적인 치료는 항암제를 대상자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
일 구현으로, 상기 방법은 나노면역컨주게이트 및 항암제 또는 화학요법제를 대상자에게 공동 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현으로, 상기 방법은 항신생물제(antineoplastic agent)를 공동 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항신생물제는 트라스트주맙 내성을 극복하기 위한 제제를 포함할 수 있다. 모노클로날 항체, 재조합 단백질 및 약물을 포함하는 다양한 제제가 유방암 치료에 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 본 명세서에 기재된 조성물과 조합하여 유용한 제제인 것으로 예상된다.
일 구현으로, 상기 방법은 파클리탁셀(taxol, Bristol-Myers Squibb); 도세탁셀(taxotere, Sanofi-Aventis); 다사티닙(Sprycel®, Bristol-Myers Squibb), 소분자 티로신 키나아제 인히비터; 게피티닙(Iressa, Astra Zeneca and Teva), EGFR 인히비터; 트라스트주맙; 인산화된 HER2 및 인산화된 HEM의 수준을 감소시키는 제제; 아포토시스에 대한 카스파아제 인히비터의 영향의 결여에 의해 측정되는 카스파아제-독립적인 아포토시를 유도하는 약제; DNA 복구 기기에 영향을 미치고 이중 가닥 끊김(DSBs)의 축적을 유도하는 제제; 엘로티닙(erlotinib)(Tarceva, Roche), EGFR의 인히비터; H2AX의 Tyr142의 인산화를 통해 DNA 손상 반응을 조절하는 WICH 복합체(WSTF-ISWI ATP-의존성 크로마틴-리모델링 복합체)의 티로신 키나아제 성분 인 윌리엄스-뷰렌 증후군(WSTF, BAZ1B라고도 알려져 있음)과 연관된 전사 인자에 영향을 미치는 제제; 라파티닙(Tyverb®, GSK), 이중 EGFR/HER2 티로신 키나아제 인히비터; 퍼투주맙(2c4, omnitarg, Genentech), HER2 단백질의 세포외 도메인에 특이적인 모노클로날 항체; 트라스투주맙(trastuzumab) 및 DM1을 포함하여 구성된 트라스투주맙-DM1, 메이탄신(maytansine)으로부터 유도된 튜블린 중합의 인히비터인 제제; PI3K 경로 인히비터; HER2 세포외 도메인을 표적하는 HER2 백신 및 양자 면역 요법; 에르투막소맙(ertumaxomab)(Rexomum, Fresenius Biotech GmbH), T 세포 상의 HER2 및 CD3를 표적으로하는 이중 특이적 항체; 데퓨코실레이티드 트라스투주맙(defucosylated trastuzumab); 또는 이의 어느 조합을 공동 투여하는 것을 포함할 수 있다.
다음의 리스트는 본 발명의 특정 구현을 포함한다. 그러나, 이 리스트는 제한적이지 않으며, 대안적인 구현, 또는 본 명세서에서 달리 설명된 구현을 배제하지 않는다. 하기 구현 리스트에 기재된 퍼센트 동일성은 기준 서열의 전체 길이에 따른 인용 서열의 동일성을 나타낸다.
구현
1. 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드(polymalic acid-based molecular scaffold), 적어도 하나의 표적 리간드(targeting ligand), 적어도 하나의 항종양 면역 반응 자극제 및 적어도 하나의 항암제를 포함하며, 여기서 표적 리간드, 항종양 면역 반응 자극제 및 항암제는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드에 공유 결합된, 나노면역컨주게이트(nanoimmunoconjugate).
2. 제1 구현에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON), siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 나노면역컨주게이트.
3. 제1 구현 및 제2 구현 중 하나 또는 둘 모두에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 항체인, 나노면역컨주게이트.
4. 제1 구현 내지 제3 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 PD-1에 대한 항체, PD-L1에 대한 항체, PD-L2에 대한 항체, CTLA-4에 대한 항체, 또는 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 나노면역컨주게이트.
5. 제2 구현에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문 단백질의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 나노면역컨주게이트.
6. 제5 구현에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 나노면역컨주게이트.
7. 제6 구현에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NOS: 4 - 7로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 나노면역컨주게이트.
8. 제1 구현에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문 단백질의 인히비터인, 나노면역컨주게이트.
9. 제1 구현 및 제8 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 면역자극성 사이토카인인, 나노면역컨주게이트.
10. 제9 구현에 있어서,
사이토카인은 IL-2 또는 IL-12인, 나노면역컨주게이트.
11. 제1 구현 내지 제 10 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 나노면역컨주게이트.
12. 제1 구현 내지 제11 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 SEQ ID NO: 1, 2 및 8로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 나노면역컨주게이트.
13. 제1 구현 내지 제11 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 인간 표피 성장 인자 리셉터(HER), 또는 세린-트레오닌 단백질 키나아제(CK2)의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 나노면역컨주게이트.
14. 제1 구현 내지 제11 구현 및 제13 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 나노면역컨주게이트.
15. 제1 구현 내지 제11 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 항-HER2/neu 항체인, 나노면역컨주게이트.
16. 제1 구현 내지 제11 구현 및 제15 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항-HER2/neu 항체는 Herceptin®인, 나노면역컨주게이트.
17. 제1 구현 내지 제16 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드에 공유 결합된 적어도 2개의 다른 항암제를 포함하는, 나노면역컨주게이트.
18. 제1 구현 내지 제17 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
표적 리간드는 종양형성 세포 또는 암세포의 맥관구조(vasculature) 단백질에 특이적으로 바인딩하는, 나노면역컨주게이트.
19. 제1 구현 내지 제18 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
맥관구조 단백질은 트랜스페린 리셉터 단백질을 포함하는, 나노면역컨주게이트.
20. 제1 구현 내지 제19 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
표적 리간드는 항체인, 나노면역컨주게이트.
21. 제1 구현 내지 제20 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 PK 조절 리간드를 추가로 포함하는, 나노면역컨주게이트.
22. 제21 구현에 있어서,
PK 조절 리간드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 나노면역컨주게이트.
23. 제1 구현 내지 제22 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 엔도조몰리틱(endosomolytic) 리간드를 추가로 포함하는, 나노면역컨주게이트.
24. 제23 구현에 있어서,
엔도조몰리틱 리간드는 다수의 류신 또는 발린 잔기를 포함하는, 나노면역컨주게이트.
25. 제24 구현에 있어서,
엔도조몰리틱 리간드는 Leu-Leu-Leu(LLL)인, 나노면역컨주게이트.
26. 제1 구현 내지 제25 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 영상화제를 추가로 포함하는, 나노면역컨주게이트.
27. 제1 구현 내지 제26 구현 중 어느 하나 이상의 구현의 나노면역컨주게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물.
28. 제1 구현 내지 제26 구현 중 어느 하나 이상의 구현의 나노면역컨주게이트를 제공하는 단계 및 치료 유효량의 나노면역컨주게이트를 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서 암을 치료하는 방법.
29. 제28 구현에 있어서,
투여하는 단계는 대상자에서 암의 치료, 중증도의 감소 또는 진행의 둔화를 일으키는, 방법.
30. 제28 구현 및 제29 구현 중 하나 또는 둘 모두에 있어서,
암은 원발성 암, 전이성 암, 또는 둘 다인, 방법.
31. 제28 구현 내지 제30 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
암은 원발성 HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 이들의 뇌 전이인, 방법.
32. 제28 구현 내지 제30 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
암은 신경교종 또는 교아종인, 방법.
33. 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드 및 적어도 하나의 표적 리간드 및 상기 스캐폴드에 공유 결합된 적어도 하나의 항암제를 포함하는 나노면역컨주게이트를 제공하는 단계; 및
치료 유효량의 항종양 면역 반응 자극제 및 치료 유효량의 상기 나노면역컨주게이트를 대상자에게 공동 투여하는 단계
를 포함하는, 대상자에서 암을 치료하는 방법.
34. 제33 구현에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON), siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
35. 제33 구현 및 제34 구현 중 하나 또는 둘 모두에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 항체이고, 여기서 항체는 PD-1 항체에 대한 항체, PD-L1에 대한 항체, PD-L2에 대한 항체, CTLA-4에 대한 항체, 또는 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
36. 제33 구현 및 제34 구현 중 하나 또는 둘 모두에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문 단백질의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 방법.
37. 제33 구현 및 제34 구현 중 하나 또는 둘 모두에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, SEQ ID NOS: 4 - 7로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
38. 제33 구현 및 제34 구현 중 하나 또는 둘 모두에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문 단백질의 인히비터인, 방법.
39. 제33 구현, 제34 구현 및 제38 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항종양 면역 반응 자극제는 면역자극성 사이토카인이고, 상기 사이토카인은 IL-2 또는 IL-12로부터 선택되는, 방법.
40. 제33 구현 내지 제39 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
41. 제33 구현 내지 제40 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, SEQ ID NO: 1, 2 및 8으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
42. 제33 구현 내지 제40 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 인간 표피 성장 인자 리셉터(HER) 또는 세린-트레오닌 단백질 키나아제(CK2)의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 방법.
43. 제33 구현 내지 제40 구현 및 제42 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 방법.
44. 제33 구현 내지 제40 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 항-HER2/neu 항체인, 방법.
45. 제33 구현 내지 제40 구현 및 제44 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
항암제는 Herceptin®인, 방법.
46. 제33 구현 내지 제45 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
표적 리간드는 종양형성 세포 또는 암세포의 맥관구조 단백질에 특이적으로 바인딩하는, 방법.
47. 제33 구현 내지 제46 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
맥관구조 단백질은 트랜스페린 리셉터 단백질을 포함하는, 방법.
48. 제33 구현 내지 제47 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
표적 리간드는 항체인, 방법.
49. 제33 구현 내지 제48 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 PK 조절 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
50. 제49 구현에 있어서,
PK 조절 리간드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 방법.
51. 제33 구현 내지 제50 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 엔도조몰리틱(endosomolytic) 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
52. 제33 구현 내지 제51 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
엔도조몰리틱 리간드는 다수의 류신 또는 발린 잔기를 포함하는, 방법.
53. 제33 구현 내지 제51 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
엔도조몰리틱 리간드는 Leu-Leu-Leu(LLL)인, 방법.
54. 제33 구현 내지 제53 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 영상화제를 추가로 포함하는, 방법.
55. 제33 구현 내지 제54 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
암은 원발성 암, 전이성 암, 또는 둘 다인, 방법.
56. 제33 구현 내지 제55 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
암은 원발성 HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 이들의 뇌 전이인, 방법.
57. 제33 구현 내지 제55 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
암은 신경교종 또는 교아종인, 방법.
58. 제33 구현 내지 제57 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
상기 방법은 대상자에게 추가의 치료제를 공동 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
59. 제33 구현 내지 제58 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
상기 방법은 대상자에게 하나 이상의 추가의 항암 요법을 공동 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
60. 제59 구현에 있어서,
추가의 항암 요법은 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 온열 요법, 면역 요법, 호르몬 요법, 레이저 요법, 항혈관신생 요법 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
61. 제33 구현 내지 제60 구현 중 어느 하나 이상의 구현에 있어서,
대상자는 포유류인, 방법.
62. 제61 구현에 있어서,
포유류는 설치류, 실험용 인간 유방 종양 보유 누드 마우스 및 인간으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
본 발명의 구현에 대한 설명은 개시된 정확한 형태로 본 발명을 모두 망라하거나 한정하려는 것은 아니다. 본 발명의 특정 구현 및 실시예가 설명의 목적으로 여기에 기술되나, 관련 기술분야의 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 다양한 동등한 변형이 본 개시의 범위 내에서 가능하다. 예를 들어, 방법 단계들 또는 기능들이 주어진 순서로 제공되지만, 다른 구현들이 상이한 순서로 기능들을 수행할 수 있거나, 또는 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 개시의 교시는 적절한 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다양한 구현들은 결합되어 추가적인 구현들을 제공할 수 있다. 본 개시의 견지들은, 필요하다면, 상기 언급된 것들의 조성, 기능 및 개념 및 본 발명의 추가의 구현들 제공하는 적용을 채용하도록 변형될 수 있다. 이러한 변경 및 다른 변경은 상세한 설명의 개시 내용에 대하여 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서의 다른 구현들은 본 명세서의 임의의 하나 이상의 다른 구현들로부터의 하나 이상의 요소로 구현을 보충하고, 그리고/또는 하나의 구현으로부터의 하나 이상의 요소를 본 명세서의 하나 이상의 다른 구현으로부터의 하나 이상의 요소로 대체함으로써 형성될 수 있다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 특정 구현을 설명하기 위해 제공된다. 전체 구현들은 아래의 하나 이상의 실시예로부터 하나 이상의 세부 사항으로 보충될 수 있고, 그리고/또는 일 구현으로부터의 하나 이상의 요소는 아래의 하나 이상의 실시예로부터의 하나 이상의 세부 사항으로 대체될 수 있다.
실시예 1 - 유방암 치료 디자인
CTLA-4 및 PD-1 차단으로 여러 암을 치료하는 성공은, 유방암의 발달 및 진행에서 면역 시스템과 염증 시스템의 복잡성을 이해하는 것이 중요하다는 것을 강조한다. 유방암의 미세환경 면역 시스템은 실조된다. 정상 면역 시스템은 자극성 분과 억제성 성분 모두로 균형을 이룬다. 암세포는 말초 내성의 메커니즘을 이용하고, 세포독성 T 림프구(CTL)를 비활성화시킴으로써 면역 감시를 피할 수 있는 능력을 획득한다. 다음은 특별한 관심을 끄는 두 가지 접근 방식이다.
안타고니스틱 mAb 이필리무맵(ipilimumab)(Yervoy®)를 이용한 CTL-관련 항원 4(CTLA-4)의 차단은 2개의 3기 임상 시험에서 말기(IV기)에 대해 현저한 임상적 이익을 달성하는 첫 번째 전략이었으며, 이는 2013에 종양학에 대해 돌파 전략인 면역요법의 관념을 북돋았다. 면역 시스템 반응 조절제에 대한 인간화된 mAbs( CTLA-4 mAb 이필리무맵(ipilimumab), 및 PD-1 mAb 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(Keytruda®)과 같은 "관문 인히비터(checkpoint inhibitors)")가 흑색종 치료에 대한 FDA 승인을 받았다. CTL에 의한 면역 반응을 약화시키는 Treg(CD4+CD25+FoxP3+)의 억제와 관련이 있다. 전신 CTLA-4 또는 프로그램된 세포 사멸-1(PD-1) mAb는 일부 종양의 억제에 기여하지만, 이들은 뇌 및 유방 종양에 대한 효능이 낮고 방사선을 이용한 공동 치료가 효과를 나타내기 위해 필요하다.
현재, CD28 및 CTLA-4는 모두 면역 반응을 유도하거나 억제하는 제2 신호를 제공함으로써 T 세포 활성화를 조절하는 것으로 알려져 있다. CD28은 T 세포 리셉터/주요조직 적합성 복합체(TCR/MHC) 상호작용의 공동 자극제이며, 면역 반응의 유도를 이끈다. CTLA-4는 면역억제를 유발하는 공동 인히비터이다. CTLA-4와 이의 리간드의 상호작용은 CD28의 상호작용보다 더 높은 결합성을 가지므로, CTLA-4는 T 세포의 증식과 IL-2 생성의 감소를 초래하는 자극 신호를 능가하며, 궁극적으로는 암세포에 대한 CTL 활성을 포함하는 T-세포 면역 반응의 억제를 일으킨다. 따라서, 안타고니스틱 Abs의 사용을 통한 CTLA-4에 대한 리간드 바인딩의 차단은 면역 활성화를 유도하는 리간드와의 CD28의 상호작용을 선호한다.
PD-1(CD279)은 활성화된 T 세포에 의해 발현되는 면역글로블린 상과(superfamily)의 타입 I 막 관통 리셉터 멤버이며, 두 개의 리간드, PD-L1(B7-H1, CD274) 및 PD-L2(B7-DC, CD273)에 바인딩하며, 두 개 모두 B7 면역글로블린 상과의 일부이다. 암에 의해 전달되는 선택적인 면역 억제 신호가 주어지면, PD-1/PD-L1 경로의 차단은 CTLA-4 차단과 비교하여 더 큰 항종양 활성 및 더 적은 부작용을 가질 것으로 예측되었다. 항-CTLA-4/PD-1 mAbs는 CTL이 암세포를 제거하도록 하는 억제 메커니즘을 중지시키지만, 항-CTLA-4 mAbs의 항종양 활성의 정확한 메커니즘은 여전히 논쟁의 여지가 있으며, CTLA-4/PD-1 mAbs의 제2 메커니즘이 제안되었다.
그 후, 악성 종양에서 다양한 면역 관문 조절제를 시험한 많은 시도가 있었다. 특히 유방암에서, 증가된 수의 Treg와 감소된 CD8 T 세포/Treg의 비율은 나쁜 예후와 상관 관계가 있다. 유방 종양 환자의 모든 검체에서 단백질 및 mRNA 수준 모두에서 CTLA-4의 발현이 높은 것으로 발견되었고, 그리고 보다 높은 CTLA-4의 mRNA 수준은 분명한 액와 림프절 전이 및 더 높은 임상 단계와 상관 관계가 있다. 따라서 CTLA-4 차단은 유방암 치료에 의미있는 방법이다.
그러나, 자가 면역 효과 및 종양 특이적 면역력의 결여로 인해 Tregs의 억제 후 뒤이은 심각한 독성을 포함하여 암 치료를 위한 CTLA-4 Ab 단일 요법은 mAb 치료의 적용을 크게 제한하는 몇 가지 단점이 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 유방암 치료 면역조절제에 대해, 관문 인히비터 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 사이토카인 IL-2 및/또는 IL-12가 사용되었고, AONs를 사용한 단백질 키나아제 CK2 및 EGFR/E GFRvIII의 억제와 함께 사용되었다.
세포독성 AON과 관문 인히비터의 조합된 힘은 뇌 전이인 가장 파괴적인 단계를 포함하여 유방암을 표적할 수 있는 나노면역컨주게이트(NIC)의 일부로서 이용되었다. 이 접근법은 암세포를 직접 제거하고, 또한 국소적이고 전신성의 장기적인 광범위한 스펙트럼 면역 반응을 이끌어 내도록 고안되었다. 도 1은 유방암의 정황에서 나노면역컨주게이트(NIC)의 작용의 예시적인 구조 및 메커니즘을 나타낸다. 도 1을 참조하면, [1]은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 NIC의 일반적인 구조를 나타낸다. 이는 PMLA 백본, 안정성을 위한 mPEG 5000, 엔도조말 탈출 유니트(endosomal escape unit)(LLL), BBB와 유방 종양 표적화를위한 항-TfR mAb, 그리고 종양 세포독성을 유도하기 위한 CK2에 대한 AON을 갖는다. 후자는 HER2/neu에 대한 AON으로 대체되거나 조합될 수 있다. 또한, NIC는 종양 표적화 및 면역 자극을 위해 항-HER2/neu Ab 및 IL-2로 대체될 수 있는 관문 인히비터 mAb 항 PD-1 또는 -CTLA-4를 함유한다. 프리 사이토카인은 또한 NIC에 직접 컨주게이트될 수 있다. IL-12는 관문 인히비터에 의해 잘 유도되므로 IL-2가 선호된다. 단백질(mAbs 및 유도체)은 PEG3400 링커를 통해 PMLA에 바인딩된다. 도 1에서, [2-4]는 제안된 작용 메커니즘을 나타낸다. 전신 정맥 내(i.v.) 투여 후, [2] NIC는 TfR 또는 HER2/neu 종양 관련 항원(Ags)을 통해 종양에 도달하고, 리셉터 매개 엔도시토시스에 의해 세포 내로 전달된다. LLL은 엔도솜 탈출을 허용하고, AON(예: CK2에 대한)은 표적 mRNA를 차단하기 위해 세포질 글루타티온에 의해 절단된다. 관문 단백질에 부착된 mAbs는 종양 및 순환에서 Treg와 상호작용하여 CTL 반응을 유도한다. 유방암 뇌 전이의 경우에, 혈액-뇌 배리어(BBB)는 TfR-매개 통과세포외배출(transcytosis)에 의해 교차된다[3]. 일단 뇌에 도달하면, AbFP 상의 NIC 사이토카인은 NK 및 CTL 세포를 직접 활성화시킬 수 있으며, 선천성과 적응 면역성을 연결시킬 수 있으며, 한편으로는 NIC의 관문 인히비터가 CTL로부터 Treg "브레이크(brake)"를 제거하여 종양 사멸 잠재력을 최대화한다.
도 1을 참조하면, PMLA는 항종양 면역 반응 자극제, 항암 약물 및 종양 표적 Abs와의 컨주게이션을 위한 스캐폴드로서 사용된다. 강력한 면역자극제로서, (1) PD-1 또는 CTLA-4를 표적하는 안타고니스틱 Ab(관문 인히비터 mAbs)가 억제 메커니즘을 턴 오프하고, CTL이 암 세포를 제거하도록 하기 위해 사용되며; 그리고 (2) 강력한 면역자극 사이토카인인 IL-2 및/또는 IL-12에 유전적으로 융합된 HER2/neu에 특이적인 mAb를 포함하여 구성된 AbFP가 NK 및 CTL 세포 모두를 활성화시키고 관문 인히비터 mAbs의 활성을 증진시킨다. 세포독성 항암 약물로서, AON이 유방암 세포의 중요한 생존 이펙터인 HER2/neu 및/또는 마스터 시그널링 레귤레이터 CK2의 발현을 억제하는 데 사용된다. 이 세포독성 효과는 수지상 세포(DC)와 같은 Ag 프리젠팅 세포(APC)에 의해 이들의 식균작용을 촉진하는 종양 세포의 세포사멸을 증가시켜, 적응성 CTL 항종양 면역 반응을 증가시킨다. 이 효과는 종양 Ags에 대한 적응 면역 반응으로 항원 퍼짐을 유도하여, 종양 탈출 및 재발의 변화를 최소화하고, 장기적인 광범위 스펙트럼 면역성을 증가시킨다. 강력한 이펙터들의 조합은 항종양 활성을 최대화한다(시너지 효과).
이 방법의 이점은 다음과 같다. NIC는 뇌에서 유방암 전이를 치료하기 위해 내피 세포 시스템, 암세포 및 엔도솜 멤브레인뿐만 아니라 BBB를 포함하는 다수의 생물학적 멤브레인을 통해 유방암 종양에 나노 약물을 동시에 전달할 수 있게한다. NIC는 전신 및 국소 항종양 반응을 증가시키기 위해 CTL-활성화 mAbs(PD-1 또는 CTLA-4)를 보유한다. 항CTLA-4 및 PD-1 AON을 사용한 유전자 녹다운을 통해 관문 단백질 CTLA-4 및 PD-1을 차단하면, 치료 Abs의 알려진 독성을 감소시킬 수 있다. 사이토카인(IL-2 또는 IL-12)에 융합된 Ab를 관문 억제 전략과 함께 포함시킴으로써 강력한 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 조율하도록 고안된다. 단백질 키나아제 CK2 또는 HER2/neu를 억제함으로써 면역 시스템 활성화와 항암 세포 독성 약물을 조합하는 것은 유방 종양을 직접적으로 그리고 면역 세포독성 반응을 통해 근절하도록 고안된다. 여기에 설명된 프로세스는 두 가지 접근법의 조합이다: 가장 효과적인 치료법을 선택하기 위해 단일 약물로서 최대 로딩된 NIC의 사용과 일부 모이어티 플러스 프리 면역자극제가 부분적으로 로딩된 NIC의 공동 투여. 전반적으로, NIC는 동시 특이적인 암세포 사멸(내부 공격)과 항종양 면역 반응의 자극(외부 공격)을 제공하여 항종양 효능을 현저하게 증가시키도록 고안된다.
실시예 2 - 동물 모델에서 유방암을 효율적으로 치료하는 나노면역컨주게이트
동종 유방 종양 D2F2/E2 발현 인간 HER2/neu를 지닌 면역적격성 마우스에서의 항종양 연구는 단지 NIC만이 생존율을 유의하게 개선시켰으며 양호한 내성을 보였다. 이 효과는 단지 2개의 적은 투여량이 사용되었다는 사실에도 불구하고 관찰되었다. 중요하게도, NIC는 뮤린 항-HER2/neu IgG1과 IgG2a의 혈청 농도를 유의하게 증가시켰는데, 이는 마우스에서 체액성(TH2) 및 세포-매개성(THI) 면역 반응과 관련이 있으며, 관찰된 항종양 보호와 일치한다. 우수한 NIC 항종양 활성은 면역적격성 마우스(NK 및 CTL 세포)에서의 면역 이펙터 세포의 활성화 및 AON 세포독성에 의해 설명될 수 있다. 종양 표적화는 HER2/neu 바인딩을 통해, 그리고 부분적으로는 향상된 투과성 및 보유(EPR) 효과를 통해 일어났다. 그러나, 이 NIC는 마우스 종양 표적화 및 이에 따른 항종양 활성을 향상시키는 항-마우스 TfR mAb를 갖지 않았다.
LLL, mPEG, IL-2 및 항-마우스 TfR mAb를 함유하는 PMLA를 갖는 NIC가 개발되었다. 모든 컨주게이트된 성분은 완전히 생체활성적이었다.
도 2는 인간 이종 이식 유방암(BT-474) 모델에서의 NIC(P/mPEG/LLL/mTfR/IL-2; x-마크)의 항종양 활성을, PBS(닫힌 다이아몬드) 및 P/IL-2(닫힌 사각형)을 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나타낸 선 그래프의 세트이다. 도 2는 인간 이종 이식 유방암(BT-474) 모델에서 NIC의 항종양 활성을 나타낸 것이다. 도 2를 참조하면, 107 BT-474 세포를 암컷 누드 마우스에서 0일째에 피하 주사(s.c.)(우측)하였다. 치료는 종양이 평균 160mm3에 도달했을 때(20일), 시작되었다. 마우스를 3그룹(각각 n=6)으로 나누고, PBS, P/IL-2, 또는 NIC i.v.를 일주일에 두 번 제공하였다. P/IL-2에 대한 용량은 2mg/kg(~ 50 프리 또는 NIC에 바인딩된 것)이며 치료는 8회 수행되었다. 평균 종양 부피는 마우스를 안락사 시켰을 때 37일에서 PBS에 비해 NIC 그룹에서만 유의하게 낮았다(* p<0.01, 양방향 ANOVA, SD로 표시). 도 2를 참조하면, NIC는 BT-474 인간 유방암을 가진 누드 마우스에서 생존율이 현저히 개선되었고 잘 견디는 것으로 나타났다.
항-CTLA-4 mAb를 함유하는 나노면역 약물: LLL, mPEG, 항-마우스 TfR mAb 및 항-마우스 CTLA-4 mAb(BioXcell)를 함유하는 PMLA의 버전이 개발되었다. 항체는 또한 다른 회사에서 얻을 수 있다. 이 NIC의 활성을 s.c. 동종 뮤린 유방암 세포 D2F2를 보유하는 BALB/c 마우스에서 시험하였다. 이 세포주는 상기 인간 HER2/neu를 발현하지 않는 D2F2/E2의 모체이다.
도 3은 s.c. D2F2 동종 유방암 종양을 보유하는 BALB/c 마우스에서 NIC의 항종양 활성을 나타낸다. 도 3을 참조하면, 106 D2F2 세포에 0일에 s.c.(오른쪽 옆구리) 주사하였다. 치료는 종양이 ~ 160mm3 의 평균 크기에 도달했을 때(8일) 시작되었다. 마우스를 8, 11, 15, 18 및 22일에 PBS(n=5), 5mg/kg의 프리 항-CTLA-4 mAb (n=6), 항-CTLA-4 Ab와 컨주게이트된 NIC 및 IgG 음성 컨트롤 mAb(n=6) 또는 항-CTLA-4 및 항-TfR mAbs(n=1)에 컨주게이트된 NIC로 i.v. 치료하였다. 평균 종양 부피는 SD로 표시된다. *p<0.05, **p<0.001(양방향 ANOVA). 도 3을 참조하면, 항-CTLA-4 Ab를 함유하는 NIC로 치료한 동물에서 프리 항-CTLA-4 Ab에 비해 종양 성장이 유의하게 억제되었으며, 이는 EPR 효과 및 종양 침윤 T 세포의 표적화에 의한 우수한 종양 표적화에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 종양 성장은 항-CTLA-4 Ab 및 항-TfR Abs 모두를 함유하는 NIC로 치료된 마우스에서 보다 많은 정도로 억제되었다.
도 4A-4B는 s.c. D2F2 동종 유방 종양을 가진 BALB/c 마우스에서 항-CTLA-4 에 의해 유도된 선호적인 IL-12(도 4A) 및 IL-10(도 4B) 활성화를 나타낸 것이다. 이들 도면을 참조하면, 각 i.v. 치료 그룹에서 4마리의 무작위 선택된 동물로부터 수집된 혈청 샘플을 1:2로 희석하고, Magnetic Luminex Screening Assay에서 검사 하였다. 뮤린 IL-12 및 IL-10에 대한 데이터는 2중으로 2회의 독립적인 실험의 평균이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. *p <0.05 대 나이브 마우스 및 PBS로 치료된 마우스의 컨트롤 혈청(Student's t-test). 도 4A를 참조하면, 항-CTLA-4 mAb를 사용한 모든 치료는 IL-12의 유의한 증가를 유도하였다. 도 4B를 참조하면, IL-10 증가는 프리 항-CTLA-4 mAb를 이용한 경우에서만 관찰되었다. IL-12 반응은 IL-10보다 20배 더 높다. 도 4A를 참조하면, TH1 세포-매개 면역 반응의 선호적인 유도와 일치하는 양 NIC 그룹에서 증가된 수준의 혈청 뮤린 IL-12가 관찰되었다. 이러한 데이터는 PMLA에 바인딩된 항-CTLA-4 mAb가 활성적이고, 항암 활성이 CTL에 의해 매개됨을 제시한다. 항-CTLA-4 mAb 단독으로 치료한 동물에서 높은 혈청 IL-12 및 IL-10(IL-12보다 훨씬 적지만) 수준이 관찰되었다. IL-10은 TH2 클론에 의해 생산된다. 따라서, 이러한 데이터는 TH1 세포-매개성 및 TH2 체액 성 면역 반응의 유도와 일치한다. NIC 상에서 항-CTLA-4 mAb의 존재는 IL-12 및 IL-10 수준 모두에서 작지만 현저한 증가를 가져왔다. NIC와는 대조적으로, 항암 활성이 프리 항-CTLA-4 mAb로 치료된 마우스에서 관찰되지 않았다는 사실은, 종양 표적화의 결과로서 종양 미세환경에서 국소 CTL 반응의 NIC의 효과적인 유도에 의해 설명될 수 있다. 또한, NIC 및 프리 항-CTLA-4 Ab는 상이한 약물 동력학을 가지며, 혈청 샘플은 최종 처리 후 1일에 취하였다. 따라서, NIC 그룹의 초기 시점에서 보다 높은 수준의 IL-12 및 IL-10(조기 활성화 마커)이 검출되었을 수 있다. 실제로, D2F2 세포에 대한 뮤린 Abs(후기 활성화 마커)를 측정하면, IgGa 수준(TH2 반응과 관련됨)은 상이한 그룹에서 항종양 활성의 수준과 일치하는 것으로 나타났고, 이는 항-CTLA-4 및 항-mTfR mAbs와 컨주게이트된 NIC의 경우에 가장 높은 것이다.
상기의 전략을 사용하여, 유방암의 뇌 전이를 모방하기 위해 D2F2 세포를 두개 내(intracranially) 성장시키는 초기 연구가 수행되었다. 이 연구는 12일째에 끝나고, 5마리 대신 2마리의 마우스가 치료를 받았다. 12일에 마우스를 안락사시켜야했으며, 왜냐하면 뇌에 있는 이들 공격적인 세포를 초기에 많이 투여하여(105) 신경학적 증상이 나타났기 때문이다.
도 5A-5B는 두개 내의 D2F2 종양을 가진 동물(뇌 전이 모델)에서의 면역자극을 나타낸 것이다. 마우스(그룹당 n=4)에 105 D2F2 세포를 접종하고(0일), 5일 및 8일에 PBS 또는 5mg/kg의 프리 항-CTLA-4 Ab로 또는 컨즈롤 IgG Ab 또는 mTfR Ab와 컨주게이트된 동일한 Ab로 i.v. 치료하였다. 12일에 마우스를 안락사 시키고, 혈청을 수집하여 풀링하고, 뮤린 IL-12(도 5A) 및 IL-10(도 5B) 수준을 테스트하였다. 이들 도면을 참조하면, BBB를 통과하는 종양 표적화된 NIC만이 높은 사이토카인 반응을 유발한다는 것이 관찰되었다. IL-12 반응은 IL-10보다 20배 더 높았다. 이 초기에, 항-CTLA-4 및 항-mTfR mAb로 로딩된 NCI로 처리된 마우스에서 높은 IL-12 수준이 발견되었으며, 이는 우수한 종양 표적화 및 CTL 활성화와 일치하였다. 도 5B를 참조하면, 이 그룹은 또한 IL-12에 비해 훨씬 낮은 수준이지만 초기 IL-10 신호도 나타냈다(예: 도면의 Y축 스케일의 차이). 이 초기 경험을 바탕으로, 2차 예비 연구를 수행하였으며, 처음에는 보다 적은 종양 세포(105 대신 104)를 동물에 접종하여 더 많은 치료 투여 및 더 긴 생존을 가능하게 하였다.
도 6은 두개 내 유방 D2F2 종양을 보유하는 BALB/c 마우스(뇌 전이 모델)에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸 것이다. 104 D2F2 세포를 0일에 두개 내로 주입하였다. D2F2 세포가 뇌종양 생존에 대해 매우 공격적이기 때문에 전신 치료는 3일, 7일, 10일, 14일에 수행되었다. 마우스를 PBS(n=5), 5mg/kg 또는 프리 항-CTLA-4 Ab (n=6) 및 항-CTLA-4 Ab 및 항-TfR Ab에 컨주게이트된 NIC(n=1)로 치료하였다. PBS 및 프리 CTLA-4 Ab 그룹에서의 생존율은 비슷하였으나, 항-CTLA-4 및 항-TfR Ab를 보유하는 NIC로 처리된 생존율은 현저히 더 길었다(p<0.006, log-rank test). NIC의 일부로서 CTLA-4 Ab의 종양 국소 전달은 뇌종양에 대한 면역 시스템 반응에 중요하다.
도 6을 참조하면, 이러한 특별히 공격적인 종양을 가진 마우스의 유의한 생존율은 항-CTLA-4 Ab 및 항-TfR mAb에 컨주게이트된 NIC로 처리한 후에 관찰되었다.
여기에 설명된 모든 데이터는 부분적으로(단일 항암 성분) 로드되고 단독으로 사용된 NIC로 얻어진 것이었다. 완전하게 로딩된 NIC뿐만 아니라 부분적으로 로딩되고 프리 면역자극제와 공동 투여되는 NIC로 훨씬 더 강한 항종양 활성이 관찰된다.
실시예 3 - 유방암 치료용 나노면역컨주게이트의 합성 및 시험관 내 특성화
유방암을 표적하는 능력을 가진 다발성(multi-pronged) 항암 기능을 함유하는 NIC 버전이 개발되었다. 여러 개의 관능기를 함유한 NIC를 높은 재현성으로 제어된 방식으로 합성하였다. 설계된 NICs는 2가지의 다른 종류의 항암제를 제공하도록 설계되었다: 면역자극제(AbFP 및/또는 관문 인히비터 mAb)와 세포독성 AON. AON은 엔도솜 탈출 메커니즘을 통해 암세포의 세포질에 들어가 작용하는 것이 요구된다. 자세한 연구에서 pH 민감성 LLL을 사용할 때 PMLA 코폴리머에 의한 효과적인 엔도솜 멤브레인 분해가 확인되었다. P/LLL은 "배럴-스터브(barrel-stave)" 메커니즘을 통해 생물학적 멤브레인을 침투하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 세포질로의 보다 효과적인 엔도솜 방출을 가능하게 한다.
방법론
PMLA의 생산: NICs가 다수의 성분을 함유하기 때문에, 합성의 성공 및 이의 재현성을 모니터링하였다. 각 성분의 조절된 컨주게이션을 이용한 합성이 개발되었다. 접합의 각 단계를 SEC-HPLC로 확인하였다. NIC 합성을 위한 슬림 몰드 피사럼 폴리세팔럼(Physarum polycephalum)으로부터의 PMLA의 생산 및 정제를 기술된 바와 같이 수행하였다. PMLA는 고도로 정제되었으며 NIC의 재현가능한 합성에 대해 특성화하였다. PMLA 기반 나노 약물 합성은 잘 확립되어 있으며 재현성이 뛰어나다. NIC 변이체는 본 명세서에 기술된 것과 유사하게 합성될 수 있다. m.w.(중량-평균 분자량)의 PMLA = 50,000 Da(다분산도 P=1.1)를 Sephadex G25 fine 상에서 분획화하여 제조하였다.
도 7은 40% LLL, 2% mPEG, 0.2% mTfR Ab, 0.2% CTLA4 mAb, 0.4% IL-2 및 2% 모르폴리노 AON-HER2/neu를 함유하는 예시적인 PMLA NIC의 합성을 나타낸 것이다. 먼저, 40% LLL, 2% mPEG 및 10% MEA(상부 구조)를 함유하는 프리-컨주게이트를 합성하였다. 이 프리-컨주게이트는 (a) Mal-PEG3400-TfR Ab와 Mal-PEG3400-CTLA4 mAb의 혼합물, (b) Mal-PEG3400-[Ab-(IL-2)], (c) Morphohno AON-HER2/neu(또는 CK2) 및 (d) 잔류 프리 티올기를 차단하여 최종 생성물(하부 구조)을 얻는 PDP로 연속적으로 컨주게이트되었다.
도 7을 참조하면, 상부 구조, 프리-컨주게이트(P/mPEG/LLL/MEA)는 원-포트(one-pot) 반응으로 합성되었다. PMLA는 2시간 동안 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)의 존재하에 N-히드록시숙신이미드(NHS)로 완전히 활성화되었다. mPEG5000-NH2, H-Leu-Leu-Leu-OH(LLL) 및 MEA를 포함하는 작용기들을 각각의 이전 아미드화 완료 후에 순차적으로 첨가하였다. 반응의 완결은 박층 크로마토그래피(TLC; Ninhydrin test)로 확인하였다. 모든 반응 완결 후(TLC, Ninhydrin test), 미반응 폴리머-바인딩된 NHS 그룹은 물로 분해되었다. 그 다음, 프리-컨주게이트를 PD-10 컬럼 상에서 정제하여 작은 분자들을 제거하고, 동결 건조하여 -20℃에서 보관하였다.
NIC 합성
AON, Abs, 및 AbFP와의 컨주게이션. 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 모르폴리노 AON(PDP-Morph-AON)의 합성. 도 7을 참조하면, 모르폴리노-AON5'-CATGGTGCTCACTGCGGCTCCGGC-3'[SEQ ID NO: 1](GeneTools)는 인간 HER2/neu 의 억제를 위해 고안되었고, 5'-CGGACAAAGCTGGACTTGATGTTT-3'[SEQ ID NO: 2]는 인간 및 마우스 CK2의 억제를 위해 고안되었다. AON의 3'-모르폴리노-NH2 잔기는 용리액으로서 메탄올과 함께 LH-20 컬럼을 사용하여 숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP) 및 AON-PDP와 컨주게이트되었다. S-숙신이미딜-PEG3400-말레이미드 mAb 컨주게이트를 합성하였다. 인산 완충액 중 상기 mAbs(1mg/ml으로)의 민감한 디설파이드 결합을 5mM Tris(2-카르복시 에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)로 환원(reduce)시킨 후 PD-10 컬럼에서 정제하여 프리 TCEP를 제거하였다. 환원된 mAbs를 말레이미드-PEG34OO-말레이미드와 컨주게이트한 후 크기 배제 Sephadex G75 컬럼을 적용하였다. 정제된 mAb(S-숙신이미딜-PEG3400-말레이미드)를 프리컨주게이트에 컨주게이션 하기 전에 디아여과(diafiltration)(30 kDa 컷오프)로 농축시켰다. mAbs에 대한 말레이미드-PEG34OO-말레이미드의 성공적인 컨주게이션은 SEC-HPLC에 의해 확인되었다. 합성된 Ab-PEG3400-Mal은 같은 날에 사용된다. 나노면역컨주게이트 PMLA/mPEG/LLL/CTLA-4(PD-1) mAb/TfRmAb/AON을 하기와 같이 합성하였다. 인산염 완충제(pH 6.3, 100 mM)에 용해된 프리컨주게이트 P/mPEG/LLL/MEA를 인산염 완충액 중(pH 6.3) mAb-PEG3400-Mal(통상 1 PMLA 분자 당 각 종류의 mAb 1 또는 2 분자)의 혼합물에 상온에서 첨가하여 원하는 화학양론을 얻었다. 보통 PMLA 쇄 당 각 종류의 mAb 1 또는 2 분자가 생성된다. 컴플리트 mAb 컨주게이션은 SEC-HPLC에 의해 확인되었다. 마지막으로, 글루타티온에 의해 분해가능한 디설파이드 결합을 통해 AON-PDP(각각 동 몰비로) PMLA/mPEG/LLL/CTLA-4(PD-1) mAb/TfR mAb/MEA의 혼합물을 첨가하여 AON을 컨주게이트하였다. 미반응의 설프하이드릴기는 PDP로 차단되었다. 최종 생성물 PMLA/mPEG/LLL/CTLA-4(PD-1) mAb/TfR mAb/AON을 크기 배제 Sephadex G75 컬럼에서 정제하였다.
관문 인히비터 Abs, AbFP 및 AON 사이의 상승 효과를 이해하기 위해, 완전하고 부분적으로 로딩된 여러 NIC의 2가지 하위 세트가 고안되었다. Subset 1의 NIC 버전은 동종 마우스에서 뮤린 종양을 치료하고, 모든 NIC 버전에 반응할 수 있는 면역 세포의 완전한 레퍼토리를 목표로 사용되었다. 항-마우스 TfR(mTfR)은 BBB 통과세포외배출(전이) 및 종양 세포 및 종양 맥관구조(원발성 유방 종양) 모두를 표적화하기 위해 사용되었다. Subset 2의 NIC 버전은 누드 마우스의 인간 이종 이식 종양을 표적화하는 데 사용되었다. 이 모델에는 T 세포가 없기 때문에 관문 인히비터리 mAbs의 사용은 정당화되지 않았다. 그러나, 이 모델은 투여뿐만 아니라 IL-12의 NK 활성화 및 항-혈관신생 특성을 통해 IL-2 및 IL-12의 항-종양 활성을 테스트하는 데 유용하였다. 항-TfR Abs의 종 특이성을 고려할 때, 항-마우스 TfR(mTfR) 및 항-인간 TfR(hTfR) mAb를 조합하여 뮤린(BBB 및 종양 맥관구조) 및 인간(암 세포) TfR 모두를 표적으로 하였다. 뮤린 CTLA-4 및 TfR을 표적으로 하는 mAbs는 본 명세서에 기재된 것들이었다. 인간 TfR을 표적으로 하기 위해, chl28.1 마우스/인간 키메릭 IgG3 Ab가 개발되어 바이러스 입자를 비롯한 다양한 화합물을 암 세포로 전달하는 데 성공적으로 사용되었다. AON은 또한 HER2/neu 리셉터에 대해 기술된 바와 같이 mRNA 수준에서 이들의 합성을 억제함으로써 CTLA-4 및/또는 PD-1을 차단하는 데 사용되었다. HER2/neu 양성암의 성장을 예방하기 위한 약물의 리스트는 표 1과 2에 다음과 같이 제시되어 있다.
[표 1]
동종 마우스 치료를 위한 예시적인 약물
Figure pct00001
Figure pct00002
[표 2]
이종 마우스 치료를 위한 예시적인 약물
Figure pct00003
선택적으로 PMLA의 백본은 AlexaFluor 680 또는 생체 내 이미징 또는 형광 현미경 검사를 위한 다른 염료로 표지될 수 있다. 50 kDa PMLA, 2 mAb 분자, 18 AON 분자, 344 LLL 분자 및 18 PEG 분자(크기 약 20nm)로 구성된 나노 약물의 예상 평균 MW은 973 kDa였다.
NIC의 물리 화학적 특성.
합성 모니터링: 각각의 아미드화의 완료를 모니터링하기 위해 TLC에 의해 프리-컨주게이트(P/mPEG/LLL/MEA)의 제조를 확인하였다. 프리-컨주게이트의 각각의 배치(batch)는 리포좀 누출 분석(Ding et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA, 107: 18143-18148, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 편입됨)을 사용하여 pH 민감성에 대해 확인되었다. mAb 및 AON 컨주게이션에 이용가능한 티올 잔기를 Ellman 어세이로 분석하였다. mAb와 AON의 성공적인 컨주게이션을 SEC-HPLC로 모니터링하였다. 각 최종 NIC는 Zetasizer Nano-ZS90(Malvern)을 사용하여 크기 및 제타-포텐셜과 관련된 용액에서 특성화되었다. 나노면역컨주게이트 크기는 평균 20 nm였다.
용액 내 나노면역컨주게이트의 각 성분의 정량 분석: 말릭산의 총량은 16시간 동안 116℃에서 밀폐 앰플 내의 6N HCl에서 나노컨주게이트의 완전한 가수분해 후 말레이트 디하이드로게나아제 어세이(malate dehydrogenase assay)로 평가되었다(Mossman and Coffman, 1989, Adv Imunol 46: 11-147, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 편입됨). PEG의 총량은 특정 어세이(Ding et al., 2015, Int J Mol Sci, 16: 8607-8620, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 편입됨)에 의해 검출되었다. 총 mAb 및 AON 양은 BCA 방법보다 단백질에 대한 신뢰도가 높은 PMLA 백본의 선택적 절단에 의해 Ab 및 AON의 동시 측정 방법으로 분석하였다. NIC 합성 프로세스는 AON 및 mAb의 재현성있는 로딩을 위해 최적화되었다.
NIC의 시험관 내 생물학적 활성
바인딩 특이성: mAb 및 AbFP의 이들의 항원들과의 바인딩은 가용성 mTfR 또는 hTfR로 코팅된 플레이트뿐만 아니라 기재된 바와 같이(Helguera et al., 2006, Vaccine, 24: 304-316, Del Prete et al., 1993, J Immunol, 150: 353-360, 둘 모두 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 편입됨) HER2/neu(ECDHER2)의 세포외 도메인을 사용하여 ELISA에 의해 확인되었다. 재조합 마우스 CTLA-4-Fc(Biolegend) 또는 PD-1-Fc(R&D Systems)를 사용하여 항-CTLA-4/PD-1의 바인딩 활성을 측정하였다. 바인딩은 또한 항원을 발현하는 세포를 사용하여 유세포 분석법 또는 세포-기반 ELISA에 의해 확인되었다.
mAbs의 생체활성 어세이: 인간 IL-2의 생체활성은 보고된 바와 같이(Helguera et al., 2006, Vaccine, 24: 304-316, Ding et al, 2013, J Control Release, 322-339, 이들 모두 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 편입됨), 뮤린 CTLL-2 세포주를 이용한 증식 어세이에서 측정되었으며, 그리고 뮤린 IL-12의 생체활성은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용한 T 세포 증식 어세이에서 측정되었다. 이 후자는 인간 IL-12가 뮤린 T 세포에서 활성적이지 않지만, 뮤린 IL-12는 인간 T 세포에서 활성적이기 때문에 가능했다. 뮤린 NK 세포주 KY-1을 사용하여 인터페론 감마(IFN-γ) 분비를 유도하는 IL-12의 능력을 시험하였고, 그리고 IL-12가 기질로서 림포카인 활성화된 킬러(LAK) 세포 활성화 인간 PBMC를 또는 LAK 세포에 대한 바람직한 표적으로서 인간 K562 또는 Daudi 세포를 유도하는 능력을 시험하였다. 프리(논-컨주게이티드) AbFP를 컨트롤로서 사용하였다. 뮤린 T 세포에 대한 항-마우스 항-CTLA-4 Ab의 효과는 웨스턴 블롯 상에서 인산화된 STAT5 및 ERK1/2의 감소된 발현에 의해 확인되었다.
암세포에서의 표적 단백질 억제 및 세포독성: HER2/neu BT-474(인간) 및 D2F2/E2(뮤린)을 발현하는 세포주가 AON-HER2/neu(인간 HER2/neu 억제) 및 AON- CK2, AON-E GFR/E GFRvIII(인간 또는 뮤린 CK2 억제)에 대한 표적 세포로서 사용되었다.
도 8은 인간 유방암 BT-474, 마우스 유방암 D2F2 및 정상적인 인간 유방 조직에서의 CK2a 및 β-튜블린에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 인간 유방암 BT-474, 마우스 유방암 D2F2에서 강한 CK2a 발현이 관찰되었고, 정상 인간 유방 조직에서는 낮은 발현이 관찰되었다.
도 8을 참조하면, AON-CK2는 인간 및 마우스 CK2의 공통 서열인 5'-CGGACAAAGCTGGACTTGATGTTT-3'[SEQ ID NO: 3]을 표적하고, D2F2 세포(D2F2/E2와의 차이는 HER2/neu의 저발현뿐임)은 BT-474와 같은 인간 유방암 세포와 유사하게 높은 수준의 CK2를 발현한다. AON-HER2/neu 또는 AON-CK2로 로딩된 NIC의 상이한 버전의 능력을 상기 표적 세포에서 증식을 억제하고 아폽토시스를 유도하도록(Apopnexin kit, EMD Milhpore) 시험하였다. HER2/neu와 CK2의 세포 생존 역할을 감안할 때, 모든 세포주에서 세포독성이 관찰되었으며, D2F2/E2에서는 아마도 예외적이었으며, 여기서 인간 HER2/neu가 이전의 악성 세포(D2F2)에서 인위적으로 발현되었다.
통계: 모든 연구에서, 샘플은 3중 또는 4중(특정 테스트에 따라 다름)으로 시험되었으며 3회 반복 실험을 수행하였다. 통계 분석은 Prism5 소프트웨어(GraphPad Software)를 사용하여 Student's t-test 또는 ANOVA에 의해 수행되며, p<0.05는 유의한 것으로 간주된다.
실시예 4 - 동종 종양을 보유하는 면역적격 마우스 및 인간 종양 이종 이식편을 보유하는 누드 마우스에서 나노면역컨주게이트의 효능 측정
동종 종양을 보유하는 면역적격 마우스: 이 모델은 제안된 모든 면역자극제에 반응할 수 있는 면역 세포의 완전한 레퍼토리를 제공한다. 트라스트주맙(trastuzumab) 가변 영역을 가진 AbFPs의 종 특이성을 고려할 때, 이들은 뮤린 HER2/neu와 교차 반응하지 않는다. 이 제한을 극복하기 위해, 인간 HER2/neu(D2F2/E2)를 발현하는 BALB/c 또는 C57 동종 뮤린 유방암종 세포주 D2F2를 사용하였다. D2F2/E2는 백신 접종 및 수동 Ab 면역 요법을 포함한 다양한 면역 요법을 연구하는 데 사용된 모델인 HER2/neu(마우스 대응물과 고 상동성임)의 발현에도 불구하고 면역적격 BALB/c 마우스에서 성장한다. 실제로, AON이 있는 NIC는 D2F2/E2로 마우스를 보호하고, 항-마우스 CTLA-4 및 항-마우스 TfR Ab로 로딩된 NIC는 모 세포주인 D2F2에 대한 보호를 부여한다.
인간 종양 이종 이식편을 보유한 누드 마우스: 누드(무흉선의) 마우스에는 기능적 T 세포가 없기 때문에, 적응 면역 반응이 없지만, 이 모델은 인간 암세포를 사용하여 AON-HER2/neu 및 AON-CK2 전달에 대해 반응하는 HER2/neu를 발현하는 것을 가능하게 한다.
이종 마우스 모델을 사용하여, CK2 또는 HER-2 인히비터를 전달하는 나노 약물을 사용하여 뇌전이가 차단되는 것이 관찰되었다.
도 9는 이종 동물 모델에서 BBB를 가로지르고 CK2를 차단하는 나노컨주게이트에 의한 인간 뇌 신경교종 LN229 성장 억제를 나타낸 것이다. 카플란-마이어 생존 곡선은 AON 대 CK2a와의 나노컨주게이트 vs. PBS를 이용한 치료시 유의하게 증가된(p<0.009, log-rank test) 동물 생존을 보여준다. 종양 표적화는 EGFR 항체인 세툭시맵(cetuximab)(Cetu)에 의해 달성되었다. 중앙 생존 기간은 70일이었고, PBS 그룹에서는 37일이었다. 도 9를 참조하면, CK2가 차단되었을 때, 마우스의 수명이 현저히 연장되어 암 치료에 대한 놀라운 메커니즘을 보였다.
임상적으로 중요한 문제 중 하나는 종양 줄기 세포이다. 이들은 종양 성장에 기여할 뿐만 아니라, 차별화된 암세포보다 치료에 내성을 가지며, 이들의 생존은 종양 재발의 중요한 인자이다. 이러한 이유로, 성공적인 암 치료법은 암 줄기 세포의 효율적인 제거를 목표로 할 수 있다.
도 10은 BT-474 HER2/neu 양성, 즉 P/트라스투주맙/MsTfR-mAb/HER2-AON 및 PBS로 치료한 종양(뇌 전이 모델)에서의 암 줄기 세포 마커 CD 133 및 c-Myc의 발현을 나타내는 사진 세트이다.
CD 133 및 c-Myc의 높은 발현은 PBS-치료된 종양에서 관찰되었으며, CK2a를 억제하는 나노 약물 치료시 이의 유의성 있는 감소가 관찰되었다. 핵은 DAPI로 대조염색되었다. 조직 절편의 면역 형광 염색이 수행되었다. 여러 가지 암 줄기 세포 마커인 CD 133, c-Myc, 네스틴(nestin)을 이용하여 이종 이식 LN229 뇌종양에 대한 면역조직화학적 연구를 수행하였다. 세 가지 마커 모두 PBS-치료된 종양에서 잘 발현되었다. CK2a에 대한 AON을 보유하는 나노 약물 치료는 모든 마커의 발현을 극적으로 감소시키는 것으로 관찰되었다.
관문 인히비터 mAbs는 누드 마우스에서 활성적이지 않지만, IL-12의 내추럴 킬러(NK) 활성화 및 항혈관신생 특성을 통해 IL-2 및 IL-12의 항종양 활성을 테스트하는 데 유용하다. 누드 마우스에서 인간 종양 이종 이식은 인간 종양에 대한 Ab 효능을 해소할 것을 FDA에 의해 권장된다. 표적 세포로서, 인간 유방암 세포주: ATCC로부터 획득되는 BT-474(높은 수준의 HER2/neu), MDA-MB-231(낮은 HER2/neu) 및 MDA-MB-468(HER2/neu 없음, 음성 컨트롤, EGFR 양성)을 사용할 수 있다. HER2/neu 음성 세포주의 포함은 HER2/neu 음성 종양에서 암 줄기 세포에 대한 HER2/neu 과발현의 발견을 고려할 때 특히 매력적이다.
피하 종양: 면역적격성 및 누드 마우스에서 널리 사용되는 D2F2/E2 또는 BT-474를 사용하는 이 모델의 이점은, 캘리퍼 측정 및 영상화에 의해 종양 지연 및 성장을 쉽게 모니터링할 수 있다는 것이다. 이 모델은 또한 유방암의 s.c. 전이를 모방한다. 유방 지방 패드(mammary fat pad)에서 세포의 동소 이식(orthotopic implantation)시 발견되는 종양이 또한 연구되었다.
뇌에서의 종양: 비록 뇌가 BBB로 인해 많은 전신 면역 세포에 대한 접근이 제한된 면역 특권이 있는 부위이지만, 여전히 면역 반응이 발생할 수 있다. 뇌-상주 APC(brain-resident APC)는 말초 림프절로 이동하여 T 세포를 자극하여 뇌로 다시 이동할 수 있다. 소교 세포(Microglial cells)는 뇌에 상주하는 면역 조절 세포이며, 자극시 IL-2 리셉터를 발현하는 APC로서 작용하며, 따라서 T 세포와 함께 AbFP 자극에 잠재적으로 반응할 수 있다. IL-2, IL-12 및 AON은 누드 마우스에서 항종양 활성을 갖도록 설계되었다. 따라서, 전이 모델로서의 뇌 종양은 두 동물 모델 모두에 관련되었다. 종양 세포를 두개 내로 접종하였다. 뇌 전이(BM) 치료를 위한 몇 가지 마우스 모델이 있다. 1. 형질전환된 돌연변이 마우스를 포함하여 환경적으로 유도된, 유전자 조작된 마우스. 2. 크고 작은(마이크로) 전이 모두를 일으키는 심장 내/경동맥 내 종양 세포 주사. 3. 가장 흔한 두개 내 암 세포 접종. BM 치료와 영상화제 및 치료제의 BBB 전달을 위해, 암세포 접종 후 2~3주 동안 100% 전이를 갖는 HER2/neu 양성 유방암에 대한 신뢰할 수 있는 BM 모델이 개발되었다. 이를 달성하기 위한 모델은, 다른 모델이 BM 형성의 빈도가 낮아(3-15%), 두개 내 주입을 통해 이루어졌다.
모든 연구에서, 두 가지 동물 모델의 서로 다른 생리학 및 이펙터 및 표적 세포 집단이 약물 동태학, 독성 및 치료 효능에 영향을 미치기 때문에, 두 가지 동물 모델 모두가 사용되었다. 두 모델은 서로를 보완적이다. 종양의 측면에서, 모든 연구시 s.c. 및 두개 내 종양 모두 사용되었다.
방법론
BALB/c 또는 C57 마우스의 경우, 완전 로딩된 NIC[항-CTLA-4(PD-1) mAb, AON-HER2/neu 또는 AON-CK2, 항-HER2/neu Ab-(IL-2) 또는 -(IL-12), 및 항-TfR mAb] 및 부분적으로 로딩된 NIC[항-CTLA-4(PD-1) mAb, AON-HER2/neu 또는 AON-CK2, 및 항-TfR Ab]가 사용되었다. 일부 실험에서는 프리 항-HER2/neu Ab-(IL-2) 또는 -(IL-12)를 공동 투여하였다. 누드 마우스의 경우, [AON-HER2/neu 또는 AON-CK2, 항-HER2/neu Ab(IL-2) 또는 Ab-(IL-12) 및 항-TfR mAb] 단독을 갖는 또는 AON 및 항-TfR mAb를 갖는 NIC를 프리 항-HER2/neu Ab-(IL-2) 또는 Ab-(IL-12)와 함께 가능한 동시 투여로 사용하였다. 실험용 NIC 및 시험관 내 및 생체 내에서 사용되는 컨트롤의 구성에 대한 세부 사항은 본 명세서에 기재되어 있다(AON, mAbs 및 AbFP의 컨주게이션; NIC 서브세트 1 및 2 참조).
약물 동력학, 종양 표적화 및 독성에 관한 연구는 새로운 NIC 버전에서만 수행되었는데, 그 이유는 이 정보가 이전 버전 및 프리 AbFP에 이용가능하였기 때문이다. 프리 AbFP의 사용은 s.c. 및 뇌 종양에 대해 관련되었다. BBB가 뇌암의 Ab 치료를 위한 장애물이지만, 뇌종양은 BBB 타이트 접합(tight junction)에서 약간의 변화를 보여서 투과성을 증가시킨다. 따라서, 프리 AbFP는 또한 뇌 전이성 유방암을 표적으로 삼아 항종양 면역 반응을 일으키고 공동 투여된 NIC의 효과를 향상시키는 데 사용되었다. 중요하게도, 활성화된 T 세포가 BBB를 가로지를 수 있기 때문에, 관문 인히비터 mAbs의 전신 투여에 의해 말초에서 활성화된 T 세포는 또한 두개 내 종양을 표적할 수 있다.
새로운 NICs의 작용 메커니즘을 조사하기 위해, 다운스트림 신호전달 경로와 세포 사멸의 면역조직화학 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 초점은 프로-생존 신호전달(AON 작용에 대한 인산화된 Akt 대 총 Akt), 활성화된 STAT5 및 ERK(관문 인히비터 효과에 대한) 및 종양 세포 사멸(Apopnexin 키트 염색 및/또는 절단 PARP 웨스턴 블롯 분석)에 있었다. 줄기 세포 마커 염색은 도 10에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 치료는 줄기 세포를 포함한 종양 세포의 신호전달 및 사멸 증가를 억제한다는 결과가 관찰되었다.
항종양 효능 및 약물 작용의 메커니즘은 두 동물 모델 모두에서 8마리의 마우스/그룹을 사용하여 연구하였다.
동종 종양을 보유하는 면역적격 마우스: 마우스에게 0.15 ml 행크스(Hank's) 발란스 염 용액에 담긴 5x105 D2F2/E2 s.c. 또는 다른 유방암 세포주(TNBC)를 우측 옆구리(0일)에 접종하였다. 1일, 2일 및 3일 중 어느 날에(미세 전이성 s.c. 컨디션을 모방하기 위해), 또는 6일, 7일 및 8일 중 어느 날에(잘 확립된 종양을 모방하기 위해), 마우스를 NIC 또는 컨트롤 단독 또는 프리 AbFP와의 공동 투여로 i.v.로 치료하였다. 그러나, 다른 투여량 및/또는 스케쥴이 고려될 수 있다. 종양 성장(s.c.)은 2차원 캘리퍼(caliper)로 모니터링하였고, 부피는 다음 식에 따라 계산하였다: 종양 부피 = (길이 x 폭2)/2. 생존은 마우스를 안락사 시켰을 때 종양 챌린지로부터 종양 직경이 1.5cm에 도달할 때까지의 기간으로 간주되었다. 평행 연구는 104 종양 세포를 두개 내로 주입하여 뇌 전이를 모방한 것을 제외하고 동일한 조건 하에서 수행되었다.
NK, CD4 T 및 CD8 T 세포와 같은 종양 침윤 세포의 종양 절편을 더 염색하였다. 종양 샘플을 또한 웨스턴 블롯에 의해 표적화된 단백질 AON 억제(HER2/neu 및 CK2)에 대해 시험하였다. 또한, 비장 세포를 분리하고, ELISPOT에서 그리고 D2F2/E2 및 D2F2 종양에 대해 칼세인(Calcein) AM 방출 어세이를 사용하여 Ag 특이적 CTL에 대해 시험하였다. 혈액 샘플은 ELISA에 의해 뮤린 항-HER2/neu 이소타입(IgG1/IgG2a) 프로파일링에 대해서 뿐만 아니라 TH1 및 TH2 면역 반응의 존재를 측정하기 위해 루미넥스(Luminex) 기술을 사용하여 뮤린 사이토킨 프로파일링에 대해 분석되었다(예비 데이터에서 설명됨). 항CTLA-4/PD1 항체는 없지만, CTLA-4, PD-1 AON 모폴리노(Morpholino) 안티센스를 이용한 CTLA-4/PD-1을 억제하는 접근법이 동종 마우스 모델에 사용되었다. 각 관문 인히비터에 대한 두 AON 세트가 GeneTools에 의해 생성되었다:
CTLA-4, 5'에서 3':
1. GTCCTCAGGGAGCAGAGTAAAACCC [SEQ ID NO: 4]; 및
2. TCCAGAAGCCTTGAGATGTGTTTGA [SEQ ID NO: 5].
PD-1, 5'에서 3':
1. TACCTGCCGGACCCACATGCCCAGA [SEQ ID NO: 6]; 및
2. CCTGGCAGTGTCGCCTTCAGTAGCA [SEQ ID NO: 7].
인간 종양 이종 이식을 보유한 누드 마우스: CK2와 HER2/neu AON의 효과를 연구하기 위해 BT-474를 선택하였다. 마우스가 면역억제되었기 때문에, 적응 면역의 유도는 연구하기가 불가능하였다. 그러나, 종양에서의 조직학적 및 면역조직화학적 연구를 수행하여 아폽토시스/괴사성 종양 세포 및 NK와 같은 종양 침윤 세포를 모니터링하였다. AON HER2/neu 및 CK2 억제는 종양에서 웨스턴 블롯에 의해 평가된다. 원발성 및 전이성 유방암으로 알려진 줄기 세포를 처리 후에 도 11에 나타낸 바와 같이 CK2 AON을 갖는 원발성 뇌암에 대해 나타낸 바와 같이 치료 효과의 거울로서 평가하였다. PD-1 발현 수준은 유방암의 간엽성 특징과 연과되었다. 간엽 세포는 CD44high/CD24low, vimentin+ 및 E-cadherin- 표현형을 가지고 있는 반면, 상피 세포는 정상적으로 CD24high, himentin- 및 E-cadherin+ 표현형을 갖는다. NIC 작용의 기전을 이해하기 위해, HER2/neu 및 CK2에 대한 관문 인히비터 및 세포독성 인히비터로 처리한 후, 시험관 내 및 생체 외에서 CD44, CD24, CD 133, C-myc, 노치 1과 3, 그리고 네스틴(nestin)의 발현을 종양 절편의 면역조직화학검사와 새로운 종양 세포를 이용한 FACS 분석으로 측정하였다.
통계: 혈액 검사 및 종양 부피에서 차이의 유의성은 투-테일드 스튜던츠 t-test 또는 3개 이상의 그룹에 대한 ANOVA를 사용하여 결정하였으며, 생존율 (Kaplan-Meier plot)은 비-파라메트릭 로그 순위 테스트로 분석하였다.
생체 내 형광 영상 분석의 대안은 마우스에서 종양 세포를 표적으로 하는 124I-표지된 Abs의 생체 분포를 연구하기 위해 사용되는 매우 민감하고 정량적인 방법인 PET 스캔이다. 소형 동물용 MRI 및 마이크로-PET/CT 스캐너 장비를 사용할 수 있다.
D2F2/E2 외에도, BALB/c와 동등한 암종인 인간 HER2/neu CT26(CT26-HER2/neu)을 발현하는 뮤린 세포주를 사용할 수 있었다. 이 모델을 사용하여 Abs 만 단독으로 또는 트라스트주맙(trastuzumab)을 포함하여 HER2/neu를 표적하는 사이토카인 및 AbFP와 조합하여 효능을 테스트하였다. 유사하게, C57BL/6 마우스와 동종인 뮤린 암종 세포 MC38-HER2/neu가 사용되었다.
IL-2를 보유하는 AbFP, IL-2 및 IL-12를 갖는 항-HER2/neu가 나노 의약에 사용되었다. IgG3-(GM-CSF) 및 이관능성 AbFP(IL-12)-IgG3-(IL-2) 및 (IL-12)-IgG3-(GM-CSF)와 같은 다른 항-HER2/neu가 또한 치료에 사용되었다. AbFP는 scFv C6MH3-B1에 기초하여 생성되었다. scFv C6MH3-B1 가변 영역을 갖는 항-HER2/neu IgE Ab가 개발되었다. 강력한 면역자극 활성을 가진 이 IgE Ab가 추가되었다.
NIC의 약물 동태학 및 독성학 연구
방법론
약물 동태학 및 종양 표적화를 두 동물 모델 모두에서 8마리의 마우스/그룹을 사용하여 연구하였다.
혈장 약물 농도, 반감기 측정: 각 NIC 변이체에 대해 종양이 없는 마우스 그룹에 125I-표지된 나노면역 약물로 i.v. 주사하고, 지정된 시간에 혈액 샘플을 채취하여 125I-표지된 NIC를 검출하는 섬광 계수를 사용하여 관련 방사능을 측정하였다. 반감기는 클리어런스(CL)와 분포량(Vd)에 의해 결정되었으며, 관계식은 다음 식에 의해 기술된다: t1/2 = loge0.5Vd/CL. 조직 및 체액에서의 약물 제거/반감기 및 분포를 평가하기 위한 임상 생화학 시험을 표준 절차에 따라 수행하였다. 생체 내 형광 영상 분석: Xenogen IVIS 200 Imaging System을 사용하여 생체 내에서 Alexa Fluor 680-컨주게이트된 약물 분포 및 종양 표적을 연구하였다.
독성 연구는 두 동물 모델 모두에서 8마리의 마우스/그룹을 사용하여 수행되었다. 마우스에 NIC로 꼬리 정맥에 160 μL로 i.v. 주사하였다. 로딩된 Abs에 상응하는 2-5 mg/kg 체중 범위의 투여량을 시험하였다. 5 내지 25 mg/kg 체중 범위의 NIC를 시험하였다. 이 투여량은 임상에서 대부분의 Abs 및 이들의 유도체에 일반적으로 사용되는 범위를 포함한다. 목표는 강력하고 효과적인 NCI 치료 투여량이나, 두 가지 마우스 모델 모두에서 종양 효능 연구에 사용할 수 있는 무독성인 것을 찾는 것이었다. 동물들은 정기적으로 다음을 포함하는 독성 영향의 임상적 징후에 대해 체크되었다: 활동(과대 또는 과소); 느린 움직임; 관심 상실; 영양; 신경학상 점수: (1등급: 꼬리 약화 또는 꼬리 마비, 2등급: 뒷다리/사지 마비 또는 반신부전마비; 3등급: 뒷다리/사지 반신부전마비; 4등급: 완전 마비(사지 마비), 병적 단계 또는 사망. 혈액 생화학적 분석은 다음과 같이 통상적으로 수행되었다: (AST, ALT) - 간 기능; 빌리루빈(직접, 간접); 크레아티닌; 혈액 요소 질소; 혈액: 백혈구; 적혈구; 혈소판; 헤모글로빈; 및 염증: C-반응성 펩타이드. 실험이 끝나면 동물을 안락사시키고 장기를 마크로- 및 현미경 검사를 수행하였다.
CTLA-4 및 PD-1 Ab 농도가 5 mg/kg인 치료 데이터를 개발하여 3, 5 및 10 mg/kg의 투여량을 증가시켰다. 그러나, 상대적으로 높은 독성으로 인하여, 1 mg/kg에서 항-PD-1과 3 mg/kg에서 CTLA-4의 농도가 또한 사용되었다. NIC의 일부로서 감소된 Treg mAbs의 농도는 또한 모든 적절한 평가로 탐구되었다. 보다 낮은 농도는 항암 효과를 손상시키지 않으면서 임상적으로 알려진 독성을 감소시킬 수 있었다.
실시예 5 - 뇌암 치료 디자인
실시예 1에 기재된 유방암 치료를 위한 이들 표적에 대한 항체의 사용을 포함하는 CTLA-4 및 PD-1 차단을 위한 전략은 뇌암 치료에도 적용가능하다.
더욱이, 이들 항체의 조합으로 신경 교종을 치료하는 것은 다른 항체들이 BBB를 가로지르지 않기 때문에 성공적이지 못하였다. 이 치료에서 전신 면역 반응 만 활성화되었다.
본 발명은, 부분적으로, 내피 시스템 및 BBB를 통과할 수 있으며, 약물 및 면역자극 항체를 이의 미세환경 내의 종양 및 면역 세포에 직접 전달하여, 뇌종양 국소 면역 반응과 함께 일반적인 면역 반응을 활성화시키는 나노면역 요법을 제공한다.
(1) 항종양 면역 반응의 이중(전신 및 국소) 자극 및 (2) 일반 GBM 표적 CK2 및 EGFR의 합성을 차단하여 종양 세포 증식의 억제를 위한 나노면역컨주게이트를 사용하여 뇌암 치료를 위한 효율적인 접근법이 개발되었다. 국소적 면역 자극은 뇌 면역 특권과 이들이 BBB를 통과할 수 없어 뇌암에 대하여 CTL-활성화 mAbs의 효능이 부족하기 때문에, GBM에서 중요하다(Muldoon et al., 2013, J Cereb Blood Flow Metab, 33: 13-21 and Oh et al., 2014, J Transl Med, 12: 107, 이들 모두 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 이 전략은 CTLA-4 및/또는 PD-1에 대한 mAbs를 사용하여 Treg에 의해 CTLs에 부과된 기능적 제약을 제거함으로써 항종양 반응을 향상시키는 BBB-교차형 나노면역컨주게이트의 이점을 취한다. 표적화된 암 치료는 하나의 나노면역컨주게이트에 다중 요법 치료제를 결합한다. 주요 이점은 다음과 같다. 암 치료는 면역 특권을 지닌 뇌종양에서 국소 및 전신선 항암 면역을 강화시키는 나노면역컨주게이트의 능력에 의해 달성되었다. BBB-교차형 나노면역컨주게이트는 종양을 표적화하기 위한 폴리머 선형 플랫폼에 의해 설계된다. 나노면역컨주게이트는 CTLA-4 또는 PD-1에 대해 CTL-활성화하는 mAbs를 보유하여, CK2 억제에 의한 GBM 증식을 억제하는 약물, 및 야생형 EGFR과 돌연변이된 EGFRvIII, 신경교종의 두 주요 암 마커와 함께 국소 및 전신성 항종양 반응을 증강시킨다. 그 결과, 뇌종양을 직접적으로 그리고 면역 세포독성 반응을 통해 박멸할 수 있다. 하나의 나노면역컨주게이트에 국소 CTL 항종양 반응을 자극하는 활성 사이토킨(예컨대, IL-2) 및 전신 및 국소 항종양 면역을 자극하는 mAb를 조합하는 것이 GBM 요법에 유리하다.
도 11은 PMLA 백본, LLL, TfR mAb, a-CTLA-4(PD1), AON-CK2 및 AON-EGFR을 포함하는 나노면역컨주게이트의 뇌종양에 대한 효과(종양 특이적 분자 마커, EGFR 및 CK2의 억제와 함께 항종양 면역 반응이 활성화될 때 병용 요법의 작용 메커니즘)를 나타내는 개략도이다. 도 11을 참조하면, 단계 (1)에서, 나노면역컨주게이트는 종양 세포 및 내피 세포가 풍부한 마우스 트랜스페린 리셉터(TfR)에 바인딩하고, BBB를 통해 종양 간질로 통과세포외배출(transcytosed)된다. 단계 (2)에서, 나노면역컨주게이트는 마우스 GBM 상의 TfR에 바인딩하고 내재화된다. 이것은 엔도좀(endosome)으로 진행되고, 이의 멤브레인을 파괴하며, 약물은 세포질에서 방출되고 AON은 세포질 글루타티온에 의해 분해된다. 단계 (3)에서, 프리 AON은 표적(EGFR 및/또는 CK2) 번역을 억제하고, 암 세포 사멸을 유발한다. 단계 (4)에서, 암세포에 진입할 수 없는 나노면역컨주게이트는 CTLA-4(PD-1) 항체를 통해 Treg에 바인딩하고 및 불활성화하여 CTL에서 이들의 블록을 제거함으로써 CTL이 암세포를 공격 및 사멸할 수 있게 한다.
나노면역컨주게이트는 활성 표적화에 의해 BBB를 통과하고, 특이적 뇌암 세포 사멸(내부 공격) 및 항종양 면역 반응(외부 공격)의 자극을 동시에 제공하여 항종양 효능을 현저하게 증가시키는 것으로 관찰되었다.
실시예 6 - 뇌암 치료를 위한 나노면역컨주게이트의 합성 및 시험관 내 특성화
두개 내 종양 보유 마우스를 뇌 종양 치료를 위한 PMLA-기반 나노면역컨주게이트의 효능을 시험하기 위한 모델로 사용하였다. 도 12A-12B는 동종 마우스 모델을 위해 고안된 PMLA-기반 나노면역컨주게이트의 개략도이다. 도 12A는 AON으로 EGFR 및 CK2를 차단함으로써 종양 세포 성장의 억제를 위해 디자인된, PMLA-백본, LLL, mPEG, CTLA-4(PD-1) mAB, msTfR mAb, AON-EGFR, AON-CK2 및 선택적으로 Alexa Fluor 680 염료를 함유하는 나노면역컨주게이트를 나타낸다. 종양 표적화는 항-msTfR mAb에 의해 달성되었다. Treg 표적화는 항-CTLA4 또는 PD-1 mAb에 의해 달성되었다. 선택적 형광 염료는 실시간 영상을 포함하여 세포 및 조직에서 컨주게이트 검출을 가능하게 하였다. 도 12B는 추가적인 면역 자극을 위한 활성 사이토카인(IL-2)이 부착된 PMLA-백본, LLL, mPEG, CTLA-4(PD-1) mAB, msTfR mAb 및 선택적으로 Alexa Fluor 680 염료를 함유하는 면역자극 나노면역컨주게이트를 나타낸다. 이종 마우스 모델의 경우, 항-림프구 mAb를 항-인간 TfR로 대체하여 종양 세포를 표적화시켰다.
라미닌-411에 대한 AON을 가진 폴리세핀(Polycefin)의 제형이 종양 혈관신생을 억제한다는 것이 관찰되었다. 흔한 GBM 마커인 EGFR과 CK2를 표적화하는 PMLA-기반 약물 전달 시스템이 나노면역컨주게이트에 이용되었다. 이 화합물들은 뇌종양 세포에 이중 공격을 가한다. 즉 AON에 의한 성장을 차단하고 항종양 면역 반응을 강화시킨다. 또 다른 진보는 항암 효과를 증가시키기 위해 나노플랫폼 상의 활성 항종양 사이토카인(예: IL-2)과 AON을 조합시키는 것이었다. 폴리말릭산 기반의 약물 전달 시스템은 (1) BBB를 통과할 수 있고, (2) AONs 및 mAbs를 포함한 추가 약물 모이어티를 부착하는 변형이 가능하며, (3) 뇌종양을 특이적으로 표적화할 수 있기 때문에 스캐폴드로서 유리하다. 상기 PMLA-기반 나노면역컨주게이트는 AONs을 다른 종양 표적(CK2 및 EGFR) 및 기능성 항체에 동시에 운반할 수 있으므로, 종양 억제 효능을 증가시킨다. 신경 교종에 대한 CTL 반응, 및 EGFR 및 CK2를 표적화하여 종양 세포를 사멸시키는 것을 동시에 증가시킴으로써, 전신 독성이 있는 경우에 이는 낮으면서 뇌암에 놀랄만큼 효과적인 나노치료법을 개발하는 것이 가능하였다. 나노면역컨주게이트 변이체를 합성하고, 물리 화학적 특성 규명 및 합성 최적화를 제공하였다. 상기 변이체는 시험관 내에서 종양 세포에서 시험되었다.
나노면역컨주게이트는 순도(내독소 또는 다른 물질 오염이 없음), 및 HPLC, 분광 광도법, ELISA 및 새로운 상세한 정량 화학 및 영상 분석으로 특성화되었다(Ljubimov et al., 2004, Invest Ophtalmol Vis Sci, 45: 4583-4591, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 시험관 내 세포 생존력이 독성 나노컨주게이트를 선택하기 위해 시험되었다. 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학법, ELISA, FACS, 아폽토시스 어세이를 통해 표적 단백질(CK2, EGFR)의 저해 및 항-CTLA-4, 및 PD-1 항체와 사이토카인의 기능적 분석을 수행하였다.
GBM 세포는 CK2 및 EGFR을 발현하며, 이는 나노약물에 의해 하향 조절되었다. 도 13A-13B는 GBMs에서의 EGFR 및 CK2α 발현 및 나노약물-컨주게이트된 AONs에 의한 이의 억제를 나타내는 웨스턴 블롯의 사진이다. 도 13A는 EGFR 및 CK2α가 세 개의 세포주 U87MG, LN229 및 GL26에서 발현되었음을 보여준다. 도 13B는 PBS와 비교하여, EGFR 및 CK2α의 발현이 세포 흡수를 위해 항-EGFR mAb 세툭시맙(Cetu)을 사용한 P/Cetu/EGFR-AON(좌측 패널) 및 P/Cetu/CK2α-AON(우측 패널)으로 세포를 치료한 경우에 두드러지게 감소되었음을 나타낸다. GAPDH는 웨스턴 블롯을 위해 겔 로딩을 정상화하기 위해 하우스키퍼로 사용되었다. 도 13A를 참조하면, 두 단백질 모두 인간(U87MG 및 LN229) 및 마우스(GL26) GBMs에서 발현되는 것으로 관찰되었다. 도 13B를 참조하면, 암세포를 표적으로 하는 항-EGFR 세툭시맵 mAb를 갖는 PMLA-기반 나노약물은 SEQ ID NO: 2 및 8의 서열을 갖는 각각의 AON으로 CK2 및 EGFR 발현을 효과적으로 저해한다는 것이 관찰되었다.
실험 디자인 나노면역컨주게이트를 본 명세서에 기술된 바와 같이 합성하였다. 인간 및 마우스와 교차 반응하는 미리 선택된 AON의 시험관 내 기능을, 인간 U87MG, LN229 및 마우스 GL26/G1261 GBM 배양물에서 시험하고, 정상 HAST 40 성상세포와 비교하였다. CK2 및 EGFR 억제는 웨스턴 분석에 의해 확인되었다. ELISA, 바인딩/FACS 및 증식 어세이는 기술된 바와 같이(Peggs et al., 2009, J Exp Med, 206: 1717-1725, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨) IL2 및/또는 IL-12뿐만 아니라 CTLA-4 및 PD-1에 대한 기능-블로킹 mAbs의 활성을 시험하였다. 치료 후 세포 사멸은 Apopnexin assay(EMD Millipore)에 의해 평가되었다. 화학적 및 기능적 복잡성을 특정 정량 분석(Ljubimova et al., 2014, J Vis Exp, 88, and Ding et al, 2015, Int J Mol Sci, 16: 8607-8620, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨)에 의해 시험하였다. 데이터는 Cancer Center Biostatistics core에서 통계적으로 분석되었다. 시험관 내 실험은 관련 특이성 컨트롤과 함께 3중으로 통상적으로 수행되었다.
실험 디자인 나노면역컨주게이트를 본 명세서에 기술된 바와 같이 합성하였다. 인간 및 마우스와 교차 반응하는 미리 선택된 AON의 시험관 내 기능을 인간 U87MG, LN229 및 마우스 GL26/G1261 GBM 배양물에서 시험하고, 정상 HAST 40 성상세포와 비교하였다. CK2 및 EGFR 억제는 웨스턴 분석에 의해 확인되었다. ELISA, 바인딩/FACS 및 증식 어세이는 기술된 바와 같이(Peggs et al., 2009, J Exp Med, 206: 1717-1725, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨) IL2 및/또는 IL-12뿐만 아니라 CTLA-4 및 PD-1에 대한 기능-차단 mAbs의 활성을 시험하였다. 치료 후 세포 사멸은 아폽넥신 어세이(Apopnexin assay)(EMD Millipore)에 의해 평가되었다. 화학적 및 기능적 복잡성을 특정 정량 분석(Ljubimova et al., 2014, J Vis Exp, 88, and Ding et al, 2015, Int J Mol Sci, 16: 8607-8620, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨)에 의해 시험하였다. 데이터는 Cancer Center Biostatistics core에서 통계적으로 분석되었다. 시험관 내 실험은 관련 특이성 컨트롤과 함께 3중으로 통상적으로 수행되었다.
프리-컨주게이트의 제조 나노면역컨주게이트는 여러 가지 성분을 함유하고 있기 때문에, 합성의 성공과 재현성을 모니터링하였다. 각 성분의 조절된 컨주게이션으로 순차적 합성 과정을 개발하고, SEC-HPLC에 의한 각 단계의 검증을 수행하였다(Lee et al., 2006, Bioconjug Chem, 17: 317-326, and Fujita et al, 2007, J Control Release, 122: 356-363, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 약물 합성을 위한 PMLA는 점균 황색망사점균(myxomycete Physarum polycephalum)으로부터 생성되고 정제되었다. 정제된 PMLA는 나노면역컨주게이트 합성 이전에 특성화되었다. m.w.의 PMLA(중량 평균 분자량) = 100 KDa(다분산도 P = 1.1)를 Sephadex G25 fine에서 분획화하여 제조하였다.
도 14는 PMLA 백본, 40% LLL, 2% mPEG, 0.2% TfR Ab, 0.2% CTLA-4/PD-1 Ab, 1% AON-EGFR 및 1% AON-CK2a를 함유하는 예시적인 나노면역컨주게이트의 합성을 나타낸 것이다. 먼저, 40% LLL, 2% mPEG 및 10% MEA(상부 구조)로 프리-컨주게이트를 합성하였다. 이는 순차적으로, (a) Mal-PEG3400-항-TfR mAb 및 Mal-PEG3400-항-CTLA-4 또는 항-PD-1 mAb의 혼합물, (b) PDP-AON-CK2, PDP-AON -EGFR의 혼합물 및 (c) 잔류 프리 티올기를 차단하여 최종 생성물(하부 구조)을 얻는 PDP와 컨주게이트되었다. 도 14를 참조하면, 상부 구조체로서, 먼저, 프리-컨주게이트(P/mPEG/LLL/MEA)가 단일-포트 반응으로 합성되었다. PMLA는 2시간 동안 DCC의 존재 하에서 NHS로 완전히 활성화되었다. mPEG5000-NH2, H-Leu-Leu-Leu-OH 및 MEA(2-메르캅토-1-에틸아민)를 포함하는 작용기를 각각 이전의 아미드화 완료 후 박층 크로마토그래피(TLC; Ninhydrin 시험)에 의해 순차적으로 첨가하였다. 미반응 폴리머-바인딩된 NHS 그룹은 물로 분해되었다. 프리-컨주게이트를 PD-10 컬럼에서 정제하여 작은 분자를 제거하고 동결 건조하여 -20℃에서 보관하였다.
나노면역컨주게이트의 합성(P/mPEG/LLL/항-msTfR mAb/항-MTLA-4 mAb 또는 항-PD-1 mAb/AON(CK2, EGFR)) 3-(2-피리딜디티오) 프로피오닐 모르폴리노 AON(PDP-Morph-AON)은 본 명세서에 실시예로 기재된다. 모르폴리노-EGFR-AON: 5'- TCGCTCCGGCTCTCCCGATCAATAC-3'[SEQ ID NO: 8] 및 CK2a-AON: 5'-CGGACAAAGCTGGACTTGATGTTT-3'[SEQ ID NO: 3]은 Gene Tools의 것이었으며, 도 13B에 나타낸 바와 같이 나노면역컨주게이트를 이용하여 효능에 대해 기능적으로 확인되었다. 3'-NH2 AON 말단은 용리액으로서 메탄올을 이용하여 LH-20 컬럼에서 정제된 숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP) 및 PDP-AON과 컨주게이트되었다. PDP-AON은 -20℃에 보관되었다. IL-2를 AON과 유사한 SPDP와 컨주게이트한 후 PD-10 컬럼에서 정제하여 IL-2-PDP를 얻었다.
S-숙신이미딜-PEG3400-말레이미드 mSb 컨주게이트의 합성. 민감한 mAb S-S 결합은 실온(RT)에서 5mM Tris(2-카르복시 에틸) 포스핀 하이드로 클로라이드(TCEP)로 인산염 완충액에서 30분 동안 환원시키고, 프리 TCEP는 PD-10 컬럼에서 제거하였다. mAb를 RT에서 30분 동안 말레이미드-PEG3400-말레이미드(mPEGm)와 컨주게이트한 후, Sephadex G75 컬럼에서 크기-배제로 미반응 mPEGm을 제거하였다. 정제된 mAb(S-숙신이미딜-PEG3400-말레이미드)를 프리컨주게이트에 컨주게이션하기 전에 디아여과(diafiltration)(30 kDa 컷오프)에 의해 농축시켰다. mAbs에 대한 mPEGm의 컨주게이션은 SEC-HPLC에 의해 확인되었다. 합성된 mAb-PEG3400-Mal는 같은 날에 사용되었다.
완전 나노컨주게이트 P/mPEG/LLL/항-msTfR mAb/항-CTLA-4 mAb 또는 항-PD-1 mAb/AON(CK2, EGFR/EGFRvIII)의 합성. 인산 완충액(pH 6.3, 100 mM) 중의 프리컨주게이트 P/mPEG/LLL/MEA를 실온에서 인산염 완충액 pH 6.3에서 PMLA 분자 당 각 mAb의 2분자의 당량을 함유하는 mAb-PEG3400-Mal의 혼합물에 첨가하였다. mAbs의 컨주게이션은 SEC-HPLC에 의해 확인되었다. 그 다음, S-S 결합을 형성함으로써 PDP-AONs의 등몰 혼합물에 PMLA/mPEG/LLL/항-msTfR mAb/항-CTLA-4 mAb 또는 항-PD-1 mAb/MEA를 첨가하였다. 유사하게, IL-2-PDP는 나노컨주게이트에 부착되었다. 미반응된 설프하이드릴 그룹은 PDP로 차단되었다. 최종 약물 P/mPEG/LLL/항-msTfR mAb/항-CTLA-4 mAb 또는 항-PD-1 mAb/AON(CK2,EGFR)을 Sephadex G75 컬럼에서 정제하였다.
IgG 및 스크램블된 AON은 표준 음성 컨트롤이었다. 항마우스 TfR mAb를 BBB 통과세포외배출(transcytosis) 및 종양 세포 표적화에 사용하였다. 표 3 및 4에 나타낸 누드 마우스에서 인간 이종 이식 종양 치료용 나노면역컨주게이트는, 이 모델이 T-세포를 갖지 않아서 항-CTLA-4 mAb 또는 항-PD-1 mAbs를 갖지 않는다. 그러나, 이 모델은 IL-12의 NK 및 항혈관형성 특성의 활성화를 통해 IL-2 또는 IL-12 항종양 활성을 시험하는 데 사용되었다. 종 특이성을 고려할 때, 뮤린 BBB를 표적으로 하는 항-msTfR은 인간 암세포를 표적으로 하기 위해 항-huTfR과 조합되었다. CTLA-4, PD-1 및 TfR mAbs가 여기에 기술되었다. 영상화를 위해, PMLA는 Alexa Fluor 680 염료(Inoue et al., 2012, PLoS One, 7: e31070, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨)로 표지되었다. 예상 평균 MW는 100 kDa PMLA, 2 mAb 분자, 18 AON 분자, 344 LLL 분자 및 18 PEG 분자로 구성된 나노 약물의 경우 973 kDa이다.
[표 3]
동종 마우스 치료를 위한 나노면역컨주게이트
Figure pct00004
**항마우스 AON-EGFR/EGFRvIII 또는 AON-CK2; LLL, 삼중루신; IgG 및 AON-스크램블드(scrambled)는 음성 컨트롤이다.
[표 4]
투여 및 독성 연구를 위한 이종 마우스 치료용 나노면역컨주게이트
Figure pct00005
***항인간 AON-CK-2 및 AON- EGFR/EGFRvIII; LLL, 삼중루신; IgG 및 AON-스크램블드(scrambled)는 음성 컨트롤이다.
나노면역컨주게이트의 물리 화학적 특성화
합성 모니터링 프리-컨주게이트(P/mPEG/LLL/MEA)의 제조는 TLC에 의해 확인되어 각 아미드화의 완료를 모니터링한다. 프리컨주게이트의 각 배치(batch)는 리포좀 누출 어세이를 사용하여 pH 민감성에 대해 확인되었다. 성공적인 mAb 및 AON 컨주게이션은 SEC-HPLC로 모니터링하였다. 각각의 나노면역컨주게이트의 크기와 제타 전위는 Zetasizer Nano-ZS90(Malvern)을 사용하여 용액에서 특성화되었다. 도 12A-12B에 나타낸 바와 같이 나노면역컨주게이트의 크기는 평균 20 nm였다.
용액 중의 각각의 나노면역컨주게이트 성분의 정량 분석 밀봉된 앰플 중의 6N HCl에서 116℃에서 16시간 동안 완전한 나노 약물 가수분해 후, 말레이트 디하이드로게나아제 어세이로 총 말릭산을 평가하였다. PEG의 양은 특정 암모늄 페로티오시아네이트(ferrothiocyanate) 어세이에 의해 측정되었다. mAb 및 AON 함량은 PMLA 백본을 암모늄 히드록시드로 선택적으로 절단한 후 mAb 및 AON을 동시에 측정하는 방법으로 분석하였다.
이 방법은 SEC-HPLC를 사용하여 나노컨주게이트에서 mAb 및 AON을 함께 정량화하는 것을 가능하게 한다. 또한, 도 15A-15D는 PMLA 나노면역컨주게이트의 선택적 절단을 나타낸 것이다. 도 15A는 암모니아에 의한 PMLA 나노컨주게이트의 선택적 절단의 개략도이다. 도 15B는 절단 전(상부 곡선) 및 절단 후(하부 곡선)의 PMLA 나노면역컨주게이트의 HPLC 프로파일이다. 이 도면을 참조하면, PMLA 나노면역컨주게이트는 먼저 단일 브로드 피크로 나타낸 SEC-HPLC를 이용한 절단 전(상부 곡선) 및 2개의 분리된 피크로 나타낸 절단 후(하부 곡선)에 분석되었다. 도 15C는 280 nm의 최대 스펙트럼 파장을 갖는 mAb로서 확인된 제1 피크의 프로파일이다. 도 15D는 260 nm에서 AON으로 확인된 제2 피크의 프로파일이다. 절단은 mAb 및 AON 완전성 및 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 보고되었다(Ding et al., 2015, Int J Mol Sci, 16: 8607-8620, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 항체 양을 평가하기 위한 비신코닉산(bicinchoninic acid)(BCA) 방법과 대조적으로, 본 명세서에 기술된 방법은 일관되게 신뢰성 있는 결과를 산출하였다. ELISA 데이터는 mAb 기능이 PMLA 플랫폼에 컨주게이션하는 동안 상당한 영향을 받지 않음을 입증하였다. 나노면역 약물의 멤브레인 파괴 활성을 평가하기 위해 리포좀/칼세인 형광 어세이를 실시하였다. 이 어세이는 나노면역컨주게이트와 적혈구 단백질의 상호작용에 의해 그 결과가 불분명하지 않았기 때문에, 이전에 수행된 용혈 시험보다 더 신뢰성이 있는 것으로 관찰되었다.
나노면역컨주게이트의 AON 방출 모듈 시험 품질 관리에서, AON 방출 모듈의 활성 및 나노면역 약물에 대한 AON 바인딩의 양을 평가하였다. 나노면역컨주게이트(0.25mM 바인딩된 AON)를 37℃에서 50mM 인산 완충액(pH 7.4) 중의 5mM GSH(γ-L-글루타밀-L-시스테이닐글리신)와 함께 배양하고, 완료까지 여러 번 반응을 20mM N-에틸말레이미드로 정지시켰다. 유리되고 환원된 AONs은 SEC-HPLC, A260에 의해 N-에틸말레이미딜 유도체로서 검출되었다. 완전한 방출은 50 mM 디티오트레이톨(DTT)의 존재하에 얻어졌으며, 37℃에서 60분까지 100% 완료되었다.
기능 분석 및 나노면역컨주게이트 변이체에 대한 mAbs의 컨주게이션 반응 혼합물을 SEC-HPLC로 조심스럽게 정제하고, 항체 부착을 SDS-PAGE로 확인했다. IgGs 비율의 정량 시험은 이용가능한 항체로 ELISA에 의해 수행되었다. 항체 활성 및 나노면역 약물에 대한 2개의 mAbs의 존재는 하나의 mAb를 갖는 나노면역 약물의 고정화를 이용한 풀다운 ELISA 및 다른 mAb 또는 IL 단백질(들)에 대한 특이적 항체를 이용한 시험에 의해 측정되었다. 세포 내에서의 약물 축적의 시간 경과는 공초점 현미경에 의해 그리고 웨스턴 블롯팅에 의해 표적 억제가 모니터링되었다. IL-2의 생체 활성은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용한 T 세포 증식 어세이에서 뮤린 CTLL-2 세포주 및 뮤린 IL-12 세포주를 이용한 증식 어세이로 측정되었다. 이것은 뮤린 IL-12가 인간 T 세포에서 활성적이기 때문에 가능하였다. 뮤린 NK 세포주 KY-1에서 인터페론 감마(IFN-γ) 분비를 유도하는 IL-12의 능력뿐만 아니라 기질로서 인간 PBMC에서 그리고 LAK 세포에 대한 표적으로서 인간 K562 또는 Daudi 세포에서 IL-12가 림포카인 활성 킬러(LAK) 세포 활성화를 유도하는 능력을 시험하였다. 뮤린 PBMC에 대한 항마우스 항-CTLA-4 및 항-PD-1 mAbs의 효과는 기술된 바와 같이(Harvill and Morrison, 1995, Immunotechnology, 1: 95-105; Comin-Anduix et al., 2010, PLoS One, 5: el2711; Liston and Kim, 2009, Immunol Cell Biol, 87: 443-444; and Kramerov et al., 2011. Mol Cell Biochem, 349: 125- 137, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨), 증식 어세이 및 웨스턴 블롯에서의 STAT5 및 ERK1/2의 감소된 인산화에 의해 확인되었다. 혈청 IL-2 및 IL-12 수준은 Luminex 어세이로 측정하였다. GL26 뇌종양을 가진 마우스를 네이키드 mAbs, 나노면역컨주게이트 또는 나노면역컨주게이트들의 조합 상의 mAbs로 I.V. 5회 치료하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, (1) 나노면역 약물은 BBB를 통과할 수 있었고, (2) 나노면역 약물은 종양 국소 면역 반응을 활성화하고, 이에 의해 항-CTLA-4/PD-l mAbs는 CTL이 종양 내부의 뇌암 세포들을 공격하는 것을 막는 것으로부터 Treg를 차단하기 때문에, 폴리머-부착된 mAbs만이 동물의 생존을 연장시키는 것으로 관찰되었다.
분석 방법 N-히드록시숙시이미딜(hydroxysuccinimidyl)(NHS) 잔기의 치환은 반응 혼합물의 RP-HPLC 분석에 이어진다. 디아여고(5 kDa 컷오프)에 의해 프리 2-MEA를 제거한 후, 엘만 방법으로 티올 잔기를 분석하였다. 말레이미도 그룹의 양은 2-MEA와의 반응 및 엘만 방법을 이용한 역 적정에 의해 정량화되었다. 아미노산은 표준 프로토콜에 따라 100℃에서 6M HCl에서 컨쥬게이트를 가수분해한 후 RP-HPLC로 정량하고 트리니트로플루오로벤젠(TNBS)을 이용한 비색법으로 정량하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔에서의 SDS-PAGE의 환원 및 웨스턴 분석은 기술된 바와 같이(Ljubimova et al., 2013, J Drug Target, 21: 956 - 967, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨) 수행하였다.
신경교종 세포의 배양 인간 GBM 세포주 U87MG 및 LN229(ATCC), 및 마우스 GL26 및 GL261 계통을 사용하였다. 세포들은 기재된 바와 같이(Ding et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA, 107: 18143-18148, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨) 성장시켰다. 나노면역 약물 변이체를 이용한 치료가 수행되었다. AON-스크램블드 변이체 및 PBS(약물 용매)가 컨트롤로서 제공되었다. 실험을 3중으로 수행하고, 적어도 3회 반복하고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 적절한 통계 분석을 하였다.
시험관 내 세포 생존도 시험 생존 세포를 CellTiter 96 AQueous MTS Assay(Promega)로 정량화하였다. 세포 사멸은 Apopnexin 키트(EMD Millipore)에 의해 제조사의 추천에 따라 분석하였다.
통계 적절할 때마다, Prism5 프로그램(GraphPad Software)을 사용하여 통계적으로 서로 다른 그룹의 정량적 데이터를 비교하였다. 두 그룹의 경우, Student's t test가 사용되었고, 세 그룹 이상에 대해서는 적절한 post-hoc 테스트가 있는 2-웨이 ANOVA가 사용되었다.
실시예 7 - 뇌종양 성장에 대한 나노면역컨주게이트의 억제 효과의 조사
전임상 생체 내 효능을 평가하여 리드(lead) 나노면역컨주게이트 및 치료 요법을 선택하였다. GL26 및 GL261 두개 내 신경교종의 동종 마우스 모델, 및 누드 마우스에서 인간 두개 내 U87MG 및 LN229 GBMs의 이종 모델을 사용하였다. 데이터는 나노 약물의 치료 효능을 평가하기 위한 이들 모델의 타당성을 보여주었다. 이러한 두개 내 모델에서, BBB는 강하게 작용하여 프리 항체 및 다른 약물이 뇌종양에 도달하는 것을 방지하였다(Agarwal et al., 2013, Drug Metab Dispos, 41: 33-39, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 이 시스템의 중요한 이점은 종양 세포에서의 AON 약물과 나노 의약에서 이전에는 사용되지 않았던 올인원 나노 면역 약물에 의해 제공되는 면역 시스템 자극의 동시 작용이다. 이 시스템의 또 다른 이점은 국소 면역 자극이 뇌 종양 치료에 중요하다고 여겨지므로, BBB를 통과하는 이의 능력이다. 데이터는 뇌 신경교종을 치료하기 위해 CK2와 EGFR을 차단하는 표적화된 나노 약물의 가능성을 보여주었다. 종양 세포에서 EGFR 및 CK2를 차단하는 나노면역컨주게이트는 뇌 종양 성장을 유의하게 억제하고 동물 생존을 증가시키는 것으로 관찰되었으며, 이 효과는 CTLA-4 및 PD-1에 대한 mAbs, 및/또는 부가적인 종양 면역 조절을 위한 나노면역 약물-부착된 활성 사이토카인 IL2에 의한 국소 및 전신 항-종양 면역 반응의 동시 자극에 의해 현저하게 향상되었다.
EGFR 및/또는 CK2를 표적으로 하는 나노 약물에 의한 GBM 억제. 도 13A-13B를 참조하면, 인간 두개 내 GBMs인 LN229 및 U87MG를 갖는 누드 마우스를 시험관 내에서 효과적인 나노 약물로 I.V.로 6회 치료하였다. 치료는 PBS 주사에 비해 동물 생존을 거의 두 배 증가시키는 것으로 관찰되었다.
도 16A-16B는 EGFR 및/또는 CK2a에 특이적인 AONs을 함유하는 나노면역컨주게이트가 LN229 GBM 성장을 억제하고 종양 보유 동물 생존을 연장시키는 것을 나타낸다. 16A(좌측)는 PBS(x-마크)를 이용한 컨트롤 치료와 비교하여 나노면역컨주게이트 P/Cetu/AON-CK2a(닫힌 사각형), P/Cetu/AON-EGFR 및 P/Cetu/AON-CK2a/AON-EGFR로 치료한 동물의 생존을 보여주는 카플란-마이어 곡선의 세트이며, 그리고 (우측) 중간 생존률의 정량화를 나타내는 표이다. 도 16B는 나노면역컨주게이트 및 PBS를 이용한 치료 후에 종양 형태의 사진이다. PBS-치료된 종양이 잘 발달되고; 나노 약물 치료된 것들은 큰 괴사 부위를 가지고 있는 것이 관찰되었다. 도 16A을 참조하면, CK2 또는 EGFR의 억제가 유사하게 효과적이었음이 관찰되었다. 하나의 나노 약물에 대한 이들의 조합은 LN229에 대해 나타낸 생존율을 약간 증가시켰다. U87MG GBM에서도 비슷한 결과가 나타났다. 조직학적인 H&E 분석은 PBS로 처리한 동물에서 밝은 적색의(florid) 종양의 성장을 나타내지만, 나노 약물로 치료한 종양은 큰 괴사 부위를 가지고 있는 것으로 나타났다. BBB를 가로지르는 능력을 증명하는 종양 세포 내에서 표지된 나노 약물이 검출되었다.
도 17A-17E는 PBS를 이용한 컨트롤 치료와 비교한, 두개 내의 LN229 이종 종양에서 프로-서바이벌(pro-survival) 및 증식 신호에 대한 나노면역컨주게이트 P/Cetu/AON-CK2a, P/Cetu/AON-EGFR, 및 P/Cetu/AON-EGFR/AON-CK2a의 효과를 나타낸다. 도 17A는 치료된 종양에서 EGFR, CK2a뿐만 아니라 인산화/활성화된 Akt(pAkt) 및 c-Myc의 감소를 나타내는 웨스턴 블롯의 사진 세트이다. 도 17B는 치료된 종양에서 EGFR의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 17C는 치료된 종양에서 CK2a의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 17D는 치료된 종양에서 pAkt/Akt의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 17E는 치료된 종양에서 cMyc의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 17A-17E를 참조하면, PBS와 비교하여 NICs로 치료한 후, EGFR, CK2a, pAkt/Akt 및 cMyc의 상대적인 발현 수준에서 유의한 변화가 관찰되었다. 가장 강력한 효과는 AON 조합에서 관찰되었다. 도 17A를 참조하면, 뇌종양 세포에 작용하는 나노 약물의 메커니즘은 Akt 인산화 및 c-Myc 발현을 억제하는 것과 연루된 것으로 보인다. 경구 소 분자 CK2 인히비터에 대해 59%인 것이 비해 나노면역컨주게이트를 이용한 경우에 보다 높은 마우스 생존 증가를 생성하여(CK2a AON에 대해 89% 및 CK2a+EGFR에 대해 103%), 종양 표적 나노면역컨주게이트에 의한 CK2 저해는 경구 인히비터 치료에 비해 더 우수한 것으로 보인다.
임상적으로 중요한 문제 중 하나는 종양 줄기 세포이다. 이들은 종양 성장에 기여할뿐만 아니라 분화된 암세포보다 치료에 더 저항적이고, 이들의 생존은 종양 재발의 중요한 인자이다. 이러한 이유로, 성공적인 암 치료는 암 줄기 세포의 효율적인 제거를 목표로 해야한다. 여러 가지 암 줄기 세포 마커인 CD 133, c-Myc 및 네스틴(nestin)을 사용하여 치료된 이종 이식 LN229 종양의 면역조직화학적 연구를 수행하였다. 세 가지 마커 모두 PBS로 치료한 종양에서 잘 발현되었다. 도 18은 P/AON-CK2a, P/AON-EGFR, P/AON-EGFR/AON-CK2a 및 PBS로 처리한 후 GL26 뇌종양에서 암 줄기 세포 마커인 CD 133, cMyc 및 네스틴(Nestin)의 발현을 나타내는 사진 세트이다. 이 도면을 참조하면, CD 133, c-Myc 및 네스틴의 높은 발현이 PBS-처리된 종양에서 관찰되었고, CK2a 및 EGFR을 억제하는 나노 약물 처리시의 유의적인 감소가 관찰되었다. 두 표적의 복합 억제는 염색을 없앴다. 핵은 DAPI로 대조염색되었다. 조직 절편의 면역형광 염색 후, CK2a 또는 EGFR에 대한 AON을 갖는 나노 약물들, 특히 이의 조합을 이용한 치료가 모든 마커 발현을 극적으로 감소시키는 것으로 관찰되었다.
데이터는 EGFR 및/또는 CK2의 합성을 억제하는 나노 약물에 의한 GBM 성장 및 암 줄기 세포 차단 방법의 능력을 분명히 증명한다.
나노면역컨주게이트에 의한 GBM 억제
BBB를 통과하는 나노면역컨주게이트는 CTLA-4 또는 PD-1에 대한 mAbs로 조작되었으며, 두개 내 신경교종 GL26을 갖는 마우스를 치료하는 데 사용되었다. 뇌종양과 싸우는 데 있어 전신과 국소 면역의 각 역할을 조사하였다. 마우스를 TfR mAb를 표적으로 하는 종양을 갖는 네이키드 mAbs 또는 나노컨주게이트-부착된 mAbs로 5회 전신적으로 처리하였다. 네이키드 mAbs는 PBS보다 동물의 생존을 연장시키지 못했다. 그러나, 나노 플랫폼 상의 뇌종양-표적화된 mAbs 모두 동물의 생존을 현저하게 증가시켰다. 이 데이터는 Treg-조절 mAbs에 의한 국소 면역의 자극이 전신 면역 자극과 비교하여 항-뇌 종양 반응을 일으키는 데 더 중요하며, 이 접근법의 타당성을 입증한다는 가정을 뒷받침한다. 동일한 실험에서, 마우스 Magnetic Luminex Screening Assay(R&D Systems)를 사용하여 처리 동물의 혈청에서 관련 사이토카인의 농도를 측정하였다. 나노폴리머-부착되고 종양 전달된 면역조절 mAbs만이 극적으로 IL-12 발현을 증가시킬 수 있었으나(항종양 반응과 일치함), 한편으로 네이키드 mAbs는 그렇지 않은 것으로 관찰되었다. 놀랍게도, IL-2 수준은 유의하게 증가하지 않았다. 이러한 이유로, 도 12B에 나타낸 바와 같이 CTL-자극 mAbs와 함께 부착된 IL-2를 갖는 나노면역 약물이 사용되었는데, 이는 IL-12가 이미 치료에 의해 매우 증가되기 때문이다.
뇌종양 치료시 종양 내 CD8+ 세포가 증가했는지에 대해 다음 측정이 이루어졌으며, 이는 CTL 활성화와 일치하는 것이었다. 이 세포들은 치료되지 않은 종양에서는 매우 드물었으며, 항 CTLA-4 또는 항 PD-1로 전신 치료한 후에는 현저한 변화가 없었다. 그러나, 나노면역 약물을 이용하여 이들 면역조절 mAbs를 종양으로 전달하는 것은 CD8+ 세포 수가 증가하는 것으로 관찰되었다. CTLA-4 mAb는 일반적으로 PD-1 mAb보다 더 확연한 효과를 일으키는 것에 주목해야한다.
본 명세서에 기재된 데이터는 신경교종 성장을 억제하는 데 있어서 CK2 및 EGFR AON을 이용한 나노면역컨주게이트의 효능을 나타내며, 국소 및 전신 면역을 증진시키는 나노면역 약물의 효능을 나타낸다. 두 가지 치료법 모두 종양 보유 동물의 생존을 연장시켜, 더 많은 전임상 발달을 위한 매력적인 후보로 만들었다.
실험 디자인 두개 내 종양이 확립되었다. 1일에, 마우스에 이전에 최적화된 투여량으로 신경교종 세포를 정맥 내로 정위적으로(stereotactically) 주사하였다. U87MG는 최적 성장을 위해 25x103 cells/마우스가 필요로 하였으며, LN229는 1x105 세포, 그리고 GL26 및 GL261는 25x103 세포를 필요로 하였다. GL26 및 GL261 세포의 사용은 클래스 I 및 II MHC 항원의 상이한 발현에 의해 유도되었다: GL26은 비-면역원성이며 클래스 II MHC를 발현하지 않았으나, GL261은 부분적으로 면역원성이고 MHC I의 높은 수준을 발현하였고, 또한 T 세포 활성화에 필요한 분자의 공동 자극제인 MHC II, B7-1 및 -2의 높은 수준을 발현하였다.
종양은 3일 동안 성장되었다. 3일, 7일, 10일, 14일, 17일 및 21일(이전 연구에서 효과적이었던 6가지 치료)에, 동물에게 표 1-4에 제시된 나노면역컨주게이트 및 컨트롤 제제를 정맥 내 주사하였다. 나노면역컨주게이트 투여량의 표준 투여량은 AON에 의해 5.0 mg/kg, CTLA-4 및 PD-1에 3 -10 mg/kg이었다. 각 그룹은 Cancer Center Biostatistics core에 의해 승인된 대로 8마리의 마우스로 구성되었다. 동물들은 신경학적 이상이 발생한 경우에 희생되었다. 일반적인 조절은 다음과 같았다: 1) 정상 컨트롤 조직을 얻기 위해 치료없이 30일에 8마리의 마우스를 안락사시키고; 2) 치료 그룹 당 8마리의 마우스에게 네이키드 PMLA 또는 PBS, 또는 스크램블드 AONs을 갖는 나노컨주게이트를 주사하고; 면역자극 항체를 이용한 실험에 나노면역 약물 상의 이소타입 IgG를 사용하였으며; 전신 대 국소 면역 자극에 대한 컨트롤은 BBB 통과 나노면역 약물과의 효능을 비교하기 위해 케어 네이키드 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 항체의 스탠다드를을 포함하였다. 네이키드 AONs는 생체 내에서 세포 멤브레인을 통과하지 못하고 컨트롤로서 사용되지 않았다. 결과 측정 절제된 종양은 H&E 염색법, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학법에 의한 표적 및 림프구 마커(CD8 및 CD4)의 크기 및 발현 측정에 의해 분석하였다. 약물 작용과 면역 자극의 메커니즘을 조사하기 위해, Akt, STAT5, ERK1/2의 인산화와 절단된 PARP에 의한 세포 사멸 정도를 기재된 바와 같이(Inoue et al., 2012, PLoS One, 7: e31070, 이 모든 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨), 평가하였다. 사이토카인 수준(IL-2 및 IL-12)을 동물 혈청에서 측정하였다.
암 줄기 세포는 나노면역컨주게이트 치료 후 면역염색 및 FACS 분석(Cedars-Sinai core에서)에 의해 검출되었으며, 이들의 마커 발현은 종양의 크기 및 아니 마(animas)를 갖는 신경교종의 생존과 상관관계가 있었다. 암 줄기 세포는 프로그램 세포 사멸 리간드-1(PD-L1) 및 TGF-61을 발현시킴으로써 T 세포 증식을 억제하고, T 세포 아포토시스를 유도하며 Treg 기능을 증진시킴으로써 면역 억제를 유도 하였다.
면역자극 항체 또는 항종양 사이토카인을 갖는 AON 대 EGFR 및 CK2의 조합 은 상승 효과를 생성하였다.
종양 크기의 평가 H&E 염색을 수행하고 종양의 표면 및 종양의 중심에서 종양 직경을 측정하였다. 종양 부피(V)는 V = π/6×a2×b의 식에 의해 평가되었으며, 여기서 a는 단축이고 b는 장축이다.
분자 표적의 발현 스크램블드 AON-나노 약물 또는 PBS를 받는 컨트롤 동물과 비교하여 치료 후 종양에서 CK2, EGFR, CTLA-4, PD-1, CD8 및 CD4의 발현을 검출하기 위해 특정 항체를 사용하였다. 절단 후, 종양 조직의 나머지 부분과 2~8 mm의 거리에 있는 인접한 조직을 단백질 추출을 위한 OCT 블록에서 뽑았다. 이후의 웨스턴 분석은 Akt, STAT5, ERK1/2의 인산화 상태 및 아포토시스에 대해 절단된 PARP를 반-정량적으로 측정하였다.
사이토카인 측정 도 20에서 기술되고 예시된 바와 같이 Luminex 어세이를 사용하여 동물 혈청에서 사이토카인 수준(예: IL-2 및 IL-12)을 측정하였다.
통계 분석은 다수의 그룹에 대해 ANOVA에 의해 수행되었다.
나노컨주게이트의 약물 동력학 및 독성 연구
면역원성 시험을 위해, 인간 항원과 반응하는 승인된 CTLA-4 및 PD-1 항체를 사용하여, 이들의 작용으로 인해 동물에서 면역 반응이 증강될 가능성을 제거하였다.
실험 디자인 약물 반감기 및 조직 분포를 평가하기 위해, 방사능으로 표지 된 나노면역컨주게이트를 사용하였다. 다양한 시간에 혈액 샘플과 조직 균질액을 제조하여 나노면역 약물 분해를 나타내는 sec-HPLC 및 신틸레이션 카운팅에 의한 분자량에 대한 방사능 분포를 측정하였다. 소변 샘플도 분석했다. 가능한 독성 지표로서의 임상 생화학뿐만 아니라 PBS 및 인간 혈장에서의 퀄러티 및 안정성이 측정되었다. 리드 화합물의 마우스에서의 급성 독성, 특정 약물 동력학 및 ADME(흡수, 분포, 대사 및 배설)뿐만 아니라 최대 내약 투여량(MTD)이 실험실에서 수행되었다.
약물 반감기 및 조직 분포 연구 이것은 폴리머-컨주게이트된 방사성 추적자를 사용하여 수행되었다. 실험 및 컨트롤 종양-보유 그룹(n=5/그룹)에게 CK2와 EGFR에 대한 AONs을 갖는 125I-표지된 나노면역 약물과 상기에서 결정된 투여량으로 150μL 부피의 적절한 mAbs를 정맥 내 주사하였다. 반감기는 클리어런스(CL)와 분포의 부피(Vd)에 의해 측정되었으며, 관계식은 다음 식에 의해 기술된다: t1/2 = loge0.5Vd / CL. 혈액 및 소변 샘플 및 조직 균질화 시간을 나노면역 약물 분해를 나타내는 sec-HPLC에 의한 분자량에 걸친 관련 라벨 분포에 대해 10분, 3, 12, 24, 48 및 72시간에서 평가하였다. 표지된 나노면역컨주게이트는 신틸레이션 카운팅을 사용하여 기관에서 검출되었다. 현미경 영상화는 Alexa Fluor 680으로 표지된 나노 면역 약물을 검출하기 위해 수행되었다. 연구는 3회 반복되었다.
나노면역 약물 품질 및 안정성의 조절 (1) 품질 조절: 인간 혈장에서, ELISA 어세이를 사용하여 37℃에서 24시간 배양한 후 다양한 mAbs의 활성을 검출하였다. (2) 안정성 조절: PMLA의 에스테르 결합은 보관 중에 대부분 파괴되었다. 나노면역컨주게이트의 용액은 -20℃에 보관되었다. 3개월, 6개월, 12개월, 15개월의 보관 기간 후에도 활동적이었다. 동결건조된 나노면역 약물은 -20℃에서 2년간 안정적이었다.
면역학적 특성화 분석 표준 어세이 검사가 개발되어 나노면역컨주게이트의 특성을 규명하는 데 사용되었다. 내독소 제거는 GLP 인증 실험실에서 토끼 발열성 시험으로 분석하였다. 임상 생화학 시험은 실험 동물 및 컨트롤 동물의 생화학적 임상 시험을 위한 스탠다드 절차에 따라 수행되었다: 임상적 증상: 느린 움직임; 관심 상실; 활동(과대 또는 과소); 영양; 신경학상 점수: (1등급: 꼬리 약화 또는 꼬리 마비, 2등급: 뒷다리/사지 마비 또는 반신부전마비; 3등급: 뒷다리/사지 반신부전마비; 4등급: 완전 마비(사지 마비), 병적 단계 또는 사망. 혈액 생화학적 분석: 트랜스아미나아제(AST, ALT) - 간 기능; 빌리루빈(직접, 간접); 크레아티닌; 혈액 요소 질소; 혈액: 백혈구; 적혈구; 혈소판; 헤모글로빈; 및 염증: C-반응성 펩타이드.
급성 독성 연구 및 마우스에서 반복된 I.V. 투여량 독성 연구 총 30마리에 대해 3가지 투여량 수준(고, 중 및 저)으로 5마리 동물/성/투여량으로 투여하였다. 모든 동물에게 단일 정맥 내 투여가 주어졌다. 체중은 매주 한 번씩 재었고; 임상 징후는 투여 당일 2회, 그 후 매일 1회, 최소 6시간 간격으로 매일 2회 사망률 검사를 실시했다. 15일에, 부검을 시행하였다. 어떠한 중대한 병변이 발견되면, 이들 조직을 포르말린에 수집하고 조직 병리학을 수행하였다. 원숭이의 경우, 2개의 투여량 수준과 컨트롤 그룹이 있었다. 총 6마리의 동물(FDA- 허용)에 대해 1마리의 동물/성/투여량이 있었고, 이는 1일, 4일, 8일 및 11일에 I.V. 투여를 받았다. 체중은 1주의 후반부에서 시작하여 종료시에 1주에 2회 재었다. 음식 섭취는 반-정량적으로 측정되었다. 사망 확인은 적어도 6시간 간격으로 매일 2회 실시되었다. 임상 증상은 매일 투여 후 ~1 내지 2시간에 확인되었다. 임상 관찰(신체 검사)은 1주에서 시작하여 매주 실시하였다. 만성 병리학 검사는 모든 동물에 대해 예비검사 중에 그리고 15일에 종료시 1회 수행하였다. PK 샘플을 1일 및 11일(4번째 투여 후)에 수집하였다. 모든 생존자와 모든 발견된 죽은 동물에 대해 15일에 부검을 실시했다. 주요 장기에 대한 장기 무게를 재고; 골수 도말을 리브로부터 준비하고 평가하였다. 임상 병리학 및 조직병리학 시험이 실시되었다.
통계 분석 독물학 연구를 위해, 체중 변화, 음식 섭취, 혈액학, 임상 병리학, 심장학 측정 및 장기 체중 데이터에 대해 ANOVA 테스트를 수행하였다. 유의적인 F 비율을 얻은 경우(p<0.05), Dunnett의 t 검정을 컨트롤과의 페어-와이즈 비교에 사용하였다. 페어-와이즈 비교를 위해 Duncan의 다중 범위 검정이 대안적으로 사용되었다. 임상 화학 및 혈액학적 파라미터가 연령의 함수로 변하기 때문에, 미국 임상 화학 협회의 공동 태스크 포스(Joint Task Force of the American Association for Chnical Chemistry)에서 권장한 바와 같이 측정값을 디스크리트 포인트(discreet points)에서 통계적으로 분석하였다. 사망률, 육안 부검(gross necropsy) 및 조직 형태 관찰과 같은 빈도 데이터를 Fisher의 정확 검정(exact test) 또는 카이-스퀘어(Chi-square) 분석을 통해 비교하였다. SAS, SPSS 및 BMPD 통계 분석 프로그램도 이용가능하였다.
GL261 세포가 접종된 마우스의 치료
20,000 마리의 마우스에 신경 교종 세포 GL261을 두개 내로 접종하였다. 신경 교종 세포 접종 5일 후, 한 그룹의 마우스에 프리 항체 CTLA-4(10 ㎎/㎏), P-CTLA-4/msTfR, P-PD-1/mTfR 및 P-CTLA-4/msTfR + P-PD-1/msTfR의 조합을 총 5회 I.V. 주사로 일주일에 2회 투여하여 치료하였다.
20,000 마리의 마우스에 신경 교종 세포 GL261을 두개 내로 접종하였다. 신경 교종 세포 접종 5일 후, 한 그룹의 마우스에 프리 항체 CTLA-4(10 ㎎/㎏), P-CTLA-4/msTfR, P-PD-1/mTfR 및 P-CTLA-4/msTfR + P-PD-1/msTfR의 조합을 총 5회 I.V. 주사로 일주일에 2회 투여하여 치료하였다. 도 19A-19B는 나노면역컨주게이트로 치료한 후의 동물의 생존률을 나타내는 카플란-마이어 곡선 세트이다. 도 19A는 CTLA-4 mAb, P/TfR/CTLA-4 mAb 및 P/TfR/CTLA-4 및 P/TfR/PD-1의 조합으로 치료한 후 동물의 생존률을 나타낸다. 도 19B는 PD-1 mAB, P/TfR/PD-1 mAb 및 P/TfR/CTLA-4 및 P/TfR/PD-1의 조합으로 치료한 후의 동물의 생존률을 나타낸다. P는 폴리머(Polymer)를 의미한다. 이 도면은 프리 mAbs와 비교하여 나노면역컨주게이트로 치료한 후 일반 및 종양 국소 면역 시스템의 활성화 후 동물의 생존을 나타낸다. 뇌 종양 GL.261을 보유한 마우스는 나노면역컨주게이트의 일부로서 뇌 종양에 전달된 관문 인히비터 CTLA-4 mAb 및 PD-1 mAb에 대한 Abs로, 또는 IgG1 항체로서 프리 CTLA-4 및 PD-1으로 치료받았다. IgG1 항체로서 프리 CTLA-4 및 PD-1은 BBB를 가로지르지 않는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, 나노면역컨주게이트는 BBB를 가로지르고 뇌종양 면역 시스템을 활성화시켰다. 도 19A를 참조하면, 단지 하나의 나노면역컨주게이트 P/TfR/CTLA-4 mAb, 또는 CTLA-4 mAb만을 사용한 치료와 비교하여, P/TfR/CTLA-4 mAb + P/TfR/PD-1 mAB의 조합으로 치료한 후에 동물 생존율이 더 높은 것이 관찰되었다(P<0.02). 도 19B를 참조하면, P/TfR/PD-1 또는 PD-1 mAB만을 사용한 치료와 비교하여, P/TfR/CTLA-4 mAb + P/TfR/PD-1 mAB의 조합으로 치료한 후에 동물 생존율이 더 높은 것이 관찰되었다(P<0.02). 도 20은 BBB를 가로지르는 나노면역컨주게이트 P/a-CTLA-4/PD-1/TfR(백색 화살표)를 나타내는 사진이다. 이 도면을 참조하면, 혈관 윤곽이 그려져 있다. 화살표로 표시된 흰색 점들은 BBB 횡단의 증거를 제공하는 나노면역컨주게이트 축적이다. 적외선 염료인 로다민(Rhodamine)을 사용하여 나노면역컨주게이트를 합성하였다.
유세포 분석기 마커를 연구하였다:
마우스가 인도적인 종점에 이르렀을 때, 이들을 안락사시키고 종양을 수거하여 유세포 분석에 의해 T 세포 집단을 분석하는 데 사용하였다. CD3은 T 세포를 확인하는 데 사용되었으며: CD4, CD8 및 FOXP3은 T 세포 집단 내에서 T-이펙터 및 T-조절자 세포를 확인하는 데 사용되었으며; CD69 및 IFNγ를 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포 활성화를 측정하였으며; PD1 및 CTLA4를 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 치료 표적의 발현을 측정하였다.
종양 조직에서 유세포 분석 결과
프리 항체 항-PD1에 비해 폴리머/항-PD1 및 조합 치료로 치료된 동물에서 CD4+ T 세포의 총수가 감소되었다. 통계적 유의성은 없었지만 Tregs(CD4+ FOXP3+)의 분획도 프리 항체 치료와 비교하여 모든 폴리머 컨주게이트된 치료로 감소되었다. 유사하게, CD8+ T 세포는 프리 항체와 비교하여 폴리머 컨주게이트된 항체로 치료된 마우스에서 증가하였으나, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.
도 21은 CTLA-4mAb, P/msTfR/CTLA-4 및 P/msTfR/CTLA-4 + P/msTfR/PD-1을 이용한 동물의 치료 후 IFNγ/CD8+ 세포의 분석을 나타내는 산점도이다. 이 도면을 참조하면, 나노면역컨주게이트 P/msTfR/CTLA-4 및 P/msTfR/CTLA-4 + P/msTfR/PD-1으로 치료한 후 종양 국소 면역 시스템의 활성화가 관찰되었다. 도 22는 CTLA-4mAb, P/msTfR/CTLA-4 및 P/msTfR/CTLA-4 + P/msTfR/PD-1으로 동물을 치료한 후 CD69+/CD8+ 세포의 분석을 나타내는 산점도이다. 폴리머 컨주게이트된 항체는 CD4+ T 세포에서 CD69 및 IFNγ 발현에서 유의한 증가를 생성시키지 않은 것으로 관찰되었다. 대신, 프리 CTLA 항체 치료에 비해, 폴리머 컨주게이트된 항-CTLA4 및 조합 치료(두 컨주게이트의 공동 주사: P/TfR/CTLA-4 + P/TfR/PD-1)에 의해 CD8+ T 세포의 활성화가 유의하게 증가하였다.
폴리머 컨주게이트된 항-PD1 항체 및 조합 치료는 통계적으로 유의하지는 않지만 프리 항-PD1 항체와 비교하여 CD4+ T 세포에서 PD1 발현의 감소를 생성하였다. 또한, 폴리머 컨주게이트된 항-PD1 항체 및 조합 치료로 치료된 동물은 항-PD1 항체 및 항-CTLA4 항체 치료 모두와 비교하여 CD8+ 세포에 의한 PD1 발현의 유의한 감소를 나타낸다. CD4 + 및 CD8+ T 세포 모두에서의 CTLA4 발현은 프리 항체 치료에 비해 폴리머 컨주게이트된 치료에 의해 영향을 받지 않은 것으로 보인다.
다중 사이토카인 어세이
뇌에서 GL261 교아종을 보유한 C57/B16 마우스의 혈청을 사용하여 BioRad Bioplex 어세이로 사이토카인 수준을 측정하였다. 마우스에 3개의 I.V. 주사, PBS, 폴리머 컨주게이트된 항-PD1 항체, 폴리머 컨주게이트된 항-CTLA4 항체, 또는 마지막 2가지의 조합으로 교대로 주사하였다. 세 번째 치료 후 24시간 후에 혈청을 수거하였다. 도 23A-23C는 P/msTfR/CTLA-4, P/msTfR/PD-1 및 P/msTfRCTLA-4 + P/msTfR/PD-1으로 치료한 후 GL26 신경교종을 보유하는 C57/BI6 마우스로부터의 혈청에서 사이토카인 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 도 23A는 IL-12(p70) 수준을 나타낸다. 도 23B는 IFNγ 수준을 나타낸다. 도 23C는 TNFα 수준을 나타낸다.
치료시 명확한 경향을 알아볼 수 있었으며, 여기서 사이토카인 발현은 폴리머 컨주게이트된 항체로 치료한 동물에서, 특히 PBS 치료 마우스와 비교하여 조합 치료를 받은 동물에서 증가했다. 특히, 조합 치료는 다른 치료와 비교하여 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12(p70), IFNγ 및 TNFα의 발현을 통계적으로 유의하게 증가시켰다. 사이토카인 수준의 증가는 면역 시스템 및 특히 T 세포 집단의 활성화를 나타낸다.
그 결과는 폴리머 컨주게이트된 항체인 항-PD1 및 항-CTLA4로 치료한 후 뇌에서 종양 수준에서 국소적으로 T 세포 집단의 활성화를 나타냈다. 동일한 활성화는 PMLA 폴리머에 컨주게이트되지 않은 경우 동일한 항체에 의해 유발되지 않았다. 또한, 데이터는 혈청 내 전신 수준 및 뇌 내부의 종양 내 국부적인 사이토카인 수준 모두의 증가 형태로 면역 시스템의 활성화를 나타낸다.
나노면역컨주게이트의 이점
실험적이며 임상에 이미 사용되고 있는 현존하는 나노의약(Doxil, Abraxane 등)과 비교하여, 본 명세서에 개시된 나노면역컨주게이트는 여러 현저한 이점, 특히 유방암 및 뇌 종양 치료에 대해 여러 현저한 이점을 갖는다. 이들은 느리고 비효율적인 EPR 효과에 의해서가 아니라 이들의 적재량을 잃지 않고 종양 혈관계를 통한 능동적인 통과세포외배출(transcytosis)에 의해 혈액 뇌 배리어(BBB) 및 혈액 조직 배리어(BTB)를 통과할 수 있다. 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드에 모든 모이어티의 공유 결합은 나노입자와 리포좀에 공통적인 누출없이 종양 부위로의 전달을 보장한다. 종양 맥관구조 및 암세포의 이중 표적화는 인접한 정상 조직에 대한 상당한 영향없이 의도된 표적에 특정 약물 전달을 보장한다. 이들은 완전히 생분해성이며 동물에 무독성이다. 이들은 국소 종양 면역을 자극할 수 있는 나노 약물이다. 이러한 중요한 이점은 본 명세서에 개시된 나노면역컨주게이트를 뇌암 및 유방암을 치료하기 위한 매우 매력적인 약물로 만든다.
가설은 이러한 항체 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1을 컨주게이트의 일부로서 전달함으로써 국소 종양 면역 시스템과 함께 일반적인 면역 시스템을 활성화시키는 것이었다. 나노면역컨주게이트는 뇌와 유방의 종양 내피 시스템을 통과할 수 있었다. 실험 데이터에 의하면, 뇌 및 유방암의 주요 치료와 유방암의 뇌로의 전이는 프리 항-CTLA-4 및 항-PD-1 치료보다 유의하게 우수하다는 것이 확인되었다. 뇌종양의 경우, 치료는 이들 항체들이 혈액-뇌 배리어를 가로지르지 않기 때문에 임상에서 효과적이지 않다. 따라서, 일반적인 면역 반응의 활성화는 뇌종양 치료에 충분하지 않다. 유방암은 전신적으로 투여되는 나노면역컨주게이트로 훨씬 잘 치료되며, 이는 생체 내 치료 데이터에 의해 나타난다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 참고문헌은 본 명세서에서 명백한 모든 목적을 위해 및 각각의 참고문헌이 완전히 개시된 것과 같이 편입된다. 프레젠테이션을 위해, 이들 참조문헌 중 특정 참조문헌을 본 명세서에서 특정 위치에 인용한다. 특정 위치에서의 참고문헌의 인용은 참고문헌의 가르침이 편입되는 방식을 나타낸다. 그러나, 특정 위치에서의 참거문헌의 인용은 인용된 참고문헌의 모든 가르침이 모든 목적을 위해 편입되는 방식을 제한하지 않는다.
따라서, 본 발명은 개시된 특정 구현에 한정되지 않으며, 첨부된 청구항; 위의 설명; 및/또는 첨부 도면에 나타낸 본 발명의 사상 및 범위 내에 있는 모든 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Cedars Sinai Medical Center <120> POLYMALIC ACID BASED IMMUNO-NANOCONJUGATES <130> CSM-PT001WO <150> 62/303,845 <151> 2016-03-04 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct, AON: HER2/neu <400> 1 catggtgctc actgcggctc cggc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct, AON:human&mouse CK2 <400> 2 cggacaaagc tggacttgat gttt 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct, CK2 consensus seq <400> 3 cggacaaagc tggacttgat gttt 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct, AON: CTLA-4_1 <400> 4 gtcctcaggg agcagagtaa aaccc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct, AON: CTLA-4_2 <400> 5 tccagaagcc ttgagatgtg tttga 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct, AON: PD-1_1 <400> 6 tacctgccgg acccacatgc ccaga 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct, AON: PD-1_2 <400> 7 cctggcagtg tcgccttcag tagca 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct: AON: EGFR <400> 8 tcgctccggc tctcccgatc aatac 25

Claims (69)

  1. 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드(polymalic acid-based molecular scaffold),
    적어도 하나의 표적 리간드(targeting ligand),
    적어도 하나의 항종양 면역 반응 자극제, 및
    적어도 하나의 항암제
    를 포함하며, 여기서 표적 리간드, 항종양 면역 반응 자극제 및 항암제는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드에 공유 결합된, 나노면역컨주게이트(nanoimmunoconjugate).
  2. 제1항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON), siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 나노면역컨주게이트.
  3. 제2항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 항체인, 나노면역컨주게이트.
  4. 제3항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 PD-1에 대한 항체, PD-L1에 대한 항체, PD-L2에 대한 항체, CTLA-4에 대한 항체, 또는 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 나노면역컨주게이트.
  5. 제2항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문(checkpoint) 단백질의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 나노면역컨주게이트.
  6. 제5항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오타이드는 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 나노면역컨주게이트.
  7. 제5항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NOS: 4 - 7로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 나노면역컨주게이트.
  8. 제1항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문 단백질의 인히비터인, 나노면역컨주게이트.
  9. 제1항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 면역자극성 사이토카인인, 나노면역컨주게이트.
  10. 제9항에 있어서,
    사이토카인은 IL-2 또는 IL-12인, 나노면역컨주게이트.
  11. 제1항에 있어서,
    항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 나노면역컨주게이트.
  12. 제11항에 있어서,
    항암제는 SEQ ID NO: 1, 2 및 8로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 나노면역컨주게이트.
  13. 제11항에 있어서,
    항암제는 인간 표피 성장 인자 리셉터(HER), 또는 세린-트레오닌 단백질 키나아제(CK2)의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 나노면역컨주게이트.
  14. 제11항에 있어서,
    항암제는 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 나노면역컨주게이트.
  15. 제11항에 있어서,
    항암제는 항-HER2/neu 항체인, 나노면역컨주게이트.
  16. 제15항에 있어서,
    항-HER2/neu 항체는 Herceptin®인, 나노면역컨주게이트.
  17. 제1항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드에 공유 결합된 적어도 2개의 다른 항암제를 포함하는, 나노면역컨주게이트.
  18. 제1항에 있어서,
    표적 리간드는 종양형성 세포 또는 암세포의 맥관구조(vasculature) 단백질에 특이적으로 바인딩하는, 나노면역컨주게이트.
  19. 제18항에 있어서,
    맥관구조 단백질은 트랜스페린 리셉터 단백질을 포함하는, 나노면역컨주게이트.
  20. 제1항에 있어서,
    표적 리간드는 항체인, 나노면역컨주게이트.
  21. 제1항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 PK 조절 리간드를 추가로 포함하는, 나노면역컨주게이트.
  22. 제21항에 있어서,
    PK 조절 리간드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 나노면역컨주게이트.
  23. 제1항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 엔도조몰리틱(endosomolytic) 리간드를 추가로 포함하는, 나노면역컨주게이트.
  24. 제23항에 있어서,
    엔도조몰리틱 리간드는 다수의 류신 또는 발린 잔기를 포함하는, 나노면역컨주게이트.
  25. 제24항에 있어서,
    엔도조몰리틱 리간드는 Leu-Leu-Leu(LLL)인, 나노면역컨주게이트.
  26. 제1항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 영상화제를 추가로 포함하는, 나노면역컨주게이트.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 나노면역컨주게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물.
  28. 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드(polymalic acid-based molecular scaffold),
    적어도 하나의 표적 리간드(targeting ligand),
    적어도 하나의 항종양 면역 반응 자극제, 및
    적어도 하나의 항암제
    를 포함하며, 여기서 표적 리간드, 항종양 면역 반응 자극제 및 항암제는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드에 공유 결합된, 나노면역컨주게이트(nanoimmunoconjugate)를 제공하는 단계, 및
    치료 유효량의 나노면역컨주게이트를 대상자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상자에서 암을 치료하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON), siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 PD-1 항체에 대한 항체, PD-L1에 대한 항체, PD-L2에 대한 항체, CTLA-4에 대한 항체, 또는 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항체인, 방법.
  31. 제29항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문(checkpoint) 단백질의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NOS: 4 - 7로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
  33. 제28항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문 단백질의 인히비터인, 방법.
  34. 제28항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 IL-2 및 IL-12로 구성되는 그룹으로부터 선택된 면역자극성 사이토카인인, 방법.
  35. 제28항에 있어서,
    항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    항암제는 SEQ ID NO: 1, 2 및 8로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    항암제는 인간 표피 성장 인자 리셉터(HER), 또는 세린-트레오닌 단백질 키나아제(CK2)의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 방법.
  38. 제35항에 있어서,
    항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, 그리고 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 방법.
  39. 제35항에 있어서,
    항암제는 항체이며, 그리고 여기서 항체는 HER2/neu에 대한 항체인, 방법.
  40. 제28항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드에 공유 결합된 적어도 2개의 다른 항암제를 포함하는, 방법.
  41. 제28항에 있어서,
    표적 리간드는 종양형성 세포 또는 암세포의 맥관구조(vasculature) 단백질에 특이적으로 바인딩하는, 방법.
  42. 제28항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 PK 조절 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제28항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 엔도조몰리틱(endosomolytic) 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제28항에 있어서,
    투여하는 단계는 대상자에서 암의 치료, 중증도의 감소 또는 진행의 둔화를 일으키는, 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    암은 원발성 암, 전이성 암, 또는 둘 다인, 방법.
  46. 제44항에 있어서,
    암은 원발성 HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 이들의 뇌 전이인, 방법.
  47. 제44항에 있어서,
    암은 신경교종 또는 교아종인, 방법.
  48. 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드 및 적어도 하나의 표적 리간드 및 상기 스캐폴드에 공유 결합된 적어도 하나의 항암제를 포함하는 나노면역컨주게이트를 제공하는 단계; 및
    치료 유효량의 항종양 면역 반응 자극제 및 치료 유효량의 상기 나노면역컨주게이트를 대상자에게 공동 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상자에서 암을 치료하는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON), siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 항체이고, 여기서 항체는 PD-1 항체에 대한 항체, PD-L1에 대한 항체, PD-L2에 대한 항체, CTLA-4에 대한 항체, 또는 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  51. 제49항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문 단백질의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, SEQ ID NOS: 4 - 7로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
  53. 제48항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 면역 관문 단백질의 인히비터인, 방법.
  54. 제48항에 있어서,
    항종양 면역 반응 자극제는 면역자극성 사이토카인이고, 상기 면역자극성 사이토카인은 IL-2 또는 IL-12로부터 선택되는, 방법.
  55. 제48항에 있어서,
    항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 저분자량 약물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, SEQ ID NO: 1, 2 및 8으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
  57. 제55항에 있어서,
    항암제는 인간 표피 성장 인자 리셉터(HER), 또는 세린-트레오닌 단백질 키나아제(CK2)의 mRNA 전사체에 함유된 서열에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인, 방법.
  58. 제55항에 있어서,
    항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 방법.
  59. 제55항에 있어서,
    항암제는 항-HER2/neu 항체인, 방법.
  60. 제48항에 있어서,
    표적 리간드는 종양형성 세포 또는 암세포의 맥관구조 단백질에 특이적으로 바인딩하는, 방법.
  61. 제48항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 PK 조절 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  62. 제48항에 있어서,
    나노면역컨주게이트는 폴리말릭산 기반 분자 스캐폴드와 공유 결합된 엔도조몰리틱(endosomolytic) 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제48항에 있어서,
    암은 원발성 암, 전이성 암, 또는 둘 다인, 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    암은 원발성 HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암(TNBC) 또는 이들의 뇌 전이인, 방법.
  65. 제48항에 있어서,
    상기 방법은 대상자에게 추가의 치료제를 공동 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  66. 제48항에 있어서,
    상기 방법은 대상자에게 하나 이상의 추가의 항암 요법을 공동 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    추가의 항암 요법은 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 온열 요법, 면역 요법, 호르몬 요법, 레이저 요법, 항혈관신생 요법 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  68. 제48항에 있어서,
    대상자는 포유류인, 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    포유류는 설치류, 실험용 인간 유방 종양 보유 누드 마우스 및 인간으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
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