KR20180106722A

KR20180106722A - 항-cd25 단일클론 항체-광감각제 복합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20180106722A
Application number: KR1020170035468A
Authority: KR
Inventors: 이흥규; 박지호; 오동선; 김희곤; 오지은; 정희은; 이윤수
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2017-03-21
Filing date: 2017-03-21
Publication date: 2018-10-01
Also published as: KR102061322B1

Abstract

본 발명은 항-CD25 단일클론 항체- 광감각제 복합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 광역학적 치료를 수행하는 경우, 암 치료를 위한 면역 요법 시 발생할 수 있는 자가면역질환과 같은 부작용을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 다른 광감각제와 비교하여 종양세포로의 침투율을 증가시켜 더욱 효과적으로 종양 세포의 사멸을 유도할 수 있다.

Description

항-CD25 단일클론 항체-광감각제 복합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI-CD25 MONOCLONAL ANTIBODY-PHOTOSENSITIZER COMPLEX FOR PREVENTING OR TREATING CANCER}

본 발명은 항-CD25 단일클론 항체- 광감각제 복합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

광역학적 치료(photodynamic therapy, PDT)는 빛과 광감각제(photosensitizer)의 조합을 이용한 의학적 치료로서, 작용기전은 크게 광감각제의 종양 선택적 축적에 대한 분자적 기전과 광감각제와 빛의 상호작용에 따른 종양 파괴기전으로 나눌 수 있다. 각 인자는 그 자체로 해롭지 않으나, 산소와 결합되는 경우, 종양 세포를 비활성화하는 치사의 세포독성 작용제를 생산할 수 있다(Sternberg ED et al. Tetrahedron, 1998, 54: 4151-4202; Kadish KM et al., The Porphyrin Handbook. 2000, Vol 6: 158-161).

상기 광감각제는 빛의 흡수 하에서 다른 화학종의 화학적 또는 물리적 변형을 유도하는 화학종으로서 정의될 수 있고, 거대 고리를 갖는 화합물이 대부분 사용된다. 이러한 특징은 가시광선 스펙트럼의 적색 영역에서의 강한 흡수를 가능하게 하기 때문에 더 두꺼운 층으로 되어 있는 종양의 치료를 가능하게 한다는 장점이 존재한다(Johnson CK et al., Tetrahedron Lett, 1998, 39: 4619-4622).

한편, 조절 T 세포(CD4+CD25+Foxp3⁺, Treg)는 흉선에서 분화되고 흉선으로부터 말초로 이동된다고 알려져 있다. 사카구치(Sakaguchi)에 의하여 조절 T 세포가 자기 항원에 대한 면역 관용(self-tolerance)의 주요 조절 인자라는 것이 확인된 이후, 조절 T 세포는 자기 항원에 대한 면역 관용을 유지하는 작용뿐만 아니라, 자기 항원, 병원체, 종양 항원 및 이식된 항원 등에 대한 면역 반응을 비롯한 전체 면역 반응 시스템에서 조절 작용을 하는 것으로 확인되고 있다. 상기 조절 T 세포는 여러 가지 억제 방식을 통하여 후천적 및 선천적 면역을 조절할 수 있다. 조절 T 세포 구획화 및 수송은 조직 및/또는 기관 특이적일 수 있고, 면역 조절을 필요로 하는 부위에서 조절 T 세포의 선택적 정체 및 수송을 위하여 상이한 케모카인(chemokine) 수용체 및 인테그린(integrin) 발현을 통할 수 있다.

최근 항-CD25 단일클론 항체를 체내에 주입하여 조절 T 세포를 제거함으로써 종양에 대한 면역 치료의 효과를 높이고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 비특인 항-CD25 단일클론 항체의 주입으로 인한 조절 T 세포를 제거함으로써, 정상적인 조절 T 세포가 함께 제거되어 자가면역반응 등의 부작용이 유발되는 문제점이 있다. 따라서, 종양 내에 침윤된 조절 T 세포만을 특이적으로 제거함으로써 종양에 대한 면역반응을 증가시키고, 상기 자가면역반응과 같은 부작용을 최소화할 수 있는 방법의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명의 일 목적은 항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물의 복합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 조성물 및 광원을 포함하는 암 치료용 장치를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 발명자들은 광역학적 치료(photodynamic therapy, PDT)를 위하여, T 세포에 특이적으로 결합하는 CD25 항체에 클로린계 화합물을 결합시키는 경우, 상기 항체가 종양 조직 환경에만 특이적으로 결합할 수 있어, 면역치료 및 광역학적 치료로 발생하는 부작용을 최소화할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 실시예에서는 항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물의 복합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 “항-CD25 단일 클론 항체”란, T 세포상의 IL-2 수용체의 알파 체인(alpha chain)인 CD25의 하나의 항원 결정기에만 항체 반응을 하여, 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 상기 항체는 T 세포상에 있는 CD25에 특이적으로 결합하여 IL-2가 T 세포에 결합하는 것을 억제시킬 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 “클로린계 화합물”이란, 포르핀의 테트라피롤의 기본구조(포르핀)에 수소원자기 2개가 들어간 형태인 고리가 있는 구조의 화합물을 기본 골격 구조로 하고 있는 화합물을 총칭한다. 본 발명에서 상기 클로린계 화합물은 광감각제(photosensitizer)로 광 증감제의 역할을 할 수 있다. 상기 광 증감제는 일반적으로 일반적으로 전자기 방사선의 자외선 또는 가시 영역을 흡수하여 인접 분자로 전달하여 종양에 손상을 줄 수 있는 산소를 생성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 클로린계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 항체에 결합시켜 복합체를 제조하는 경우에는 우수한 스펙트럼 특성과 낮은 독성을 가질 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 복합체는 상기 항-CD25 단일 클론 항체와 클로린계 화합물을 혼합하여 제조할 수 있고, 보다 상세하게는 우선, 무수(anhydrous) DMSO(5mg/ml; Sigma-aldrich)에 클로린계 화합물을 용해시켜 카르복실기(carboxylic group)를 활성화한 뒤, N-하이드록시석신아마이드(N-hydroxysuccinimide) 및 1-에틸-3-(다이메틸아미노프로필)카르보디이마이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)가 포함된 DMSO와 혼합하여 반응시킨 뒤, 이를 CD25 단일 클론 항체와 혼합하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 상기 복합체의 제조 시 항-CD25 단일 클론 항체와 클로린계 화합물은 1: 10 내지 150: 의 중량비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1: 80 내지 120의 중량비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 복합체에서, 상기 CD25 단일 클론 항체에 상기 클로린계 화합물이 5 내지 15개가 결합(conjugation)되도록 조절할 수 있고, 바람직하게는 8 내지 12개가 결합될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10개가 결합될 수 있다. 클로린계 화합물이 5개 미만으로 결합되는 경우에는 광원의 조사 시 충분한 에너지를 흡수할 수 없고, 15개 초과로 결합되는 경우에는 항원-항체 특이적인 반응을 저해할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예 에서는 항-CD25 단일 클론 항체 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 복합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서 상기 복합체는 CD8+ 세포 독성 T 세포(CD8+ Cytotoxic T cell)의 활성을 유도할 수 있다.

단, 본 발명에서 상기 “CD8+ 세포 독성 T 세포(CD8+ Cytotoxic T cell)”란, 림프구의 한 종류로, 바이러스에 감염된 체세포나 종양 세포를 파괴하는 세포를 의미한다. 대부분의 세포독성 T 세포는 T 세포 수용체(TCR)을 가지고 있어, 모든 세포의 표면에 위치한 1형 MHC 분자에 붙어있는 특정한 항원의 펩타이드를 인식할 수 있으며, CD8이라는 당 단백질이 세포독성 T 세포의 표면에 위치하여 1형 MHC 분자의 불변 부위와 결합하여 세포 독성 활동을 수행할 수 있다.

본 발명에서, 상기 “광역학적 치료(photodynamic therapy, PDT)”란, 빛과 광감각제(photosensitizer)의 조합을 이용한 의학적 치료로서, 작용기전은 크게 광감각제의 종양 선택적 축적에 대한 분자적 기전과 광감각제와 빛의 상호작용에 따른 종양 파괴 기전을 포함하는 암의 치료 방법을 의미한다. 상기 광역학적 치료는 광감각제가 흥분 상태에 있을 때, 분자 삼중 산소와 상호작용을 통해 라디칼 및 활성 산소종을 생성하여 표적 세포에 충분한 산화적 손상을 가하는 과정을 통하여 세포 사멸을 유도할 수 있다(Metal-Based Drugs Volume 2008 (2008), Article ID 276109, 23 pages). 본 발명의 목적상, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 광역학적 치료용 조성물 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 암은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상에서 발생되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 폐암, 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 인체에 발생될 수 있는 세포의 비정상적인 증식 현상으로 인한 질환은 모두 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 암은 원발암뿐만 아니라, 전이암, 내성암 및 재발암을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "전이암"이란, 암세포가 원발 장기를 떠나 다른 장기로 이동하여 증식되어 발생된 암을 의미한다. 암이 신체 다른 부분으로 퍼지는 것은 크게 원발암에서 암 조직이 성장하여 직접적으로 주위 장기를 침습하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 원격 전이를 하는 것으로 구분할 수 있다. 바람직하게는 다른 원발암에서 암이 위의 장기로 전이된 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "내성암"이란, 방사선 치료법 등과 같은 암 치료요법 또는 암 치료용 약물, 특히 항암제 치료에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어, 상기 치료법에 의해 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료 증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 내성암은 특정한 치료법에 대하여 처음부터 내성을 가질 수도 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴 시간의 치료로 인하여 암세포 내의 유전자 변이 등에 의하여 동일한 치료에 대해 더 이상 감수성을 나타내지 않게 되어 발생할 수도 있다.

또한, 본 발명에서 상기 "재발암"이란, 최초 암의 발생 후 치료로 인해 완치 판정을 받은 후 암이 생긴 부위에 다시 암이 발생한 경우를 의미한다. 본 발명의 목적상 상피 중간엽 전이 과정을 통해 발생한 암의 재발일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물을 이용하여 암의 증상을 차단하거나, 그 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명에 따른 약학 조성물을 이용하여 암의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 추가로 다른 항암제와 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 일반적인 암세포 증식 및 암 전이 등을 효과적으로 억제하여 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈블라스틴, 이다루비신, 미토마이신, 블레로마이신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 5FU, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 형태로 제조되어 암이 발생된 부위에 직접적으로 주사 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에서는, 항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물 복합체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물; 및 파장이 550 nm 내지 750 nm 범위인 광선을 조사하기 위한 광원을 포함하는, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 장치를 제공한다.

본 발명의 암 치료용 장치에서 상기 항-CD25 단일 클론 항체, 클로린계 화합물, 암 및 광역학적 치료에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

본 발명에서 상기 "장치"란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 약학 조성물 내 포함되어 있는 광감각제를 흥분시키는 광원을 모아놓은 장치를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 장치는 클로린계 화합물을 흥분상태로 만들어 활성 산소 등을 생성할 수 있는 파장인 550nm 내지 750nm의 범위 내 광선을 조사할 수 있는 광원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 파장은 660nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 파장이 550nm 미만 및 750nm 초과인 경우에는 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되어 있는 광감각제를 흥분시킬 수 없다.

본 발명의 또 다른 구현 예에서는, 클로린계 화합물의 카르복실기(Carboxylic group)를 활성화 하는 단계; 및 항-CD25 단일 클론 항체와 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는 항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물 복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 카르복실기를 활성화하는 단계는 무수(anhydrous) DMSO에 용해시키는 단계를 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

또한, 본 발명에서 상기 카르복실기를 활성화 하는 단계에 후속적으로 -하이드록시석신아마이드(N-hydroxysuccinimide) 및 1-에틸-3-(다이메틸아미노프로필)카르보디이마이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)가 포함된 DMSO와 혼합한 뒤, 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 항-CD25 단일 클론 항체와 클로린계 화합물을 혼합하여 반응시키는 단계는 항-CD25 단일 클론 항체와 클로린계 화합물의 중량비가 1: 10 내지 120으로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1: 80 내지 120의 중량비로 혼합되는 단계일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

또한, 본 발명에서 상기 항-CD25 단일 클론 항체와 반응시키는 단계에 후속적으로 컬럼을 통과시켜, 복합체를 형성하지 않은 물질을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 컬럼은 PD-10 탈염 컬럼(desalting coulumns)일 수 있으나, 복합체를 형성하지 않은 물질을 정제할 수 있는 컬럼이라면 이에 제한되지 아니하고 모두 포함될 수 있다.

본 발명에서 상기 클로린계 화합물은 상기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물 복합체의 제조방법에서 상기 항-CD25 단일 클론 항체, 클로린계 화합물, 암 및 광역학적 치료에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

본 발명에 따른 약학 조성물을 통해 광역학적 치료를 수행하는 경우, 암 치료를 위한 면역 요법 시 발생할 수 있는 자가면역질환과 같은 부작용을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 다른 광감각제와 비교하여 종양세포로의 침투율을 증가시켜 더욱 효과적으로 종양 세포의 사멸을 유도할 수 있다.

도 1은 발명의 일 실시예에 따른 복합체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 발명의 일 실시예에 따른 복합체의 RFU의 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 발명의 일 실시예에 따른 광역학적 치료 시 쥐의 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 발명의 일 실시예에 따른 광역학적 치료 시 쥐의 종양 크기의 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[제조예 1 및 비교예 1] 항체 및 클로린 e6 복합체 제조

본 발명에 따른 조절 T 세포 특이적인 항체에 클로린계 화합물 복합체를 사용하는 경우, 광역학적 치료(PDT) 방법을 통한 암의 치료 효과가 증대되는 것을 확인하기 위하여 도 1과 같이, 항체 및 클로린 e6 복합체를 제조하였다.

쥐의 CD25 단일 클론 항체(Clone PC61, BioLegend) 및 쥐의 IgG1 λ 항체 (BioLegend)에 클로린 e6(Santa Cruz Biotechnology)를 하기 방법에 의해 접합(conjugation) 시켰다. 상기 클로린 e6을 무수(anhydrous) DMSO(5mg/ml; Sigma-aldrich)에 용해시켜 클로린 e6에 카르복실기(carboxylic group)를 활성화 한 뒤, N-하이드록시석신아마이드(N-hydroxysuccinimide) 및 1-에틸-3-(다이메틸아미노프로필)카르보디이마이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)가 포함된 DMSO와 혼합하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.

상기 반응이 완료된 혼합물은 쥐의 CD25 단일 클론 항체(제조예 1) 및 쥐의 IgG1 λ 항체(비교예 1)이 포함되어 있는 항체 용액(0.5mg/ml) 대 클로린 e6 의 중량 비율이 1:100이 되도록 혼합한 뒤, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.

상기 반응이 완료된 항체 및 클로린 e6 복합체 혼합물은 PD-10 탈염 컬럼(desalting coulumns)을 사용하여, 결합되지 않은 분자를 제거하여 제조예 1 및 비교예 1을 얻었다.

상기 제조예 1 및 비교예 1에서 접합된 클로린 e6의 수를 확인하기 위하여 흡광도를 측정한 뒤, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 비교예 1(Anti-CD25)는 흡광도가 측정되지 않은 반면, 클로린 e6이 접합된 지조예 1(Anti-CD25-Ce6)는 640nm 내지 700nm에서 형광을 나타내는 200 내지 800 RFU 값이 측정되었다.

상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 상기 쥐의 CD25 단일 클론 항체에 클로린 e6가 잘 접합되었음을 알 수 있다.

[실시예 1] 항체 및 클로린 e6 복합체 검증

상기 제조예 1, 비교예 1 및 클로린 e6의 세포의 결합 및 비특이적(non-specific) 결합 여부를 확인하기 위하여, 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다.

상기 유세포 분석을 위하여 쥐의 비장을 분리하였다. 분리된 비장을 스트레이너를 이용하여 단일 세포로 분리하고, 적혈구 용해 버퍼(lysis buffer)를 통해 적혈구를 제거한 뒤, 미세 비드로 CD4+ T 세포를 얻었다. 상기 CD4+ T 세포에 상기 제조예 1, 비교예 1 및 클로린 e6을 30분 동안 4℃에서 반응시켜 충분히 결합될 수 있도록 하였다. PBS로 2회 세척 후 스트렙타비딘-형광 색소가 포함되어 있는 용액과 15분 동안 4℃에서 반응시킨 뒤, PBS로 2회 세철 후 유세포 분석기를 이용하여 Foxp3의 발현 정도를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, CD25 단일 클론 항체의 Foxp3의 발현은 49.5인 것과 비교하여, 클로린 e6 이 결합된 제조예 1 은 40.9로 측정되었다. 반면, 비교예 1 은 0.939로 측정되었다.

상기 결과를 통하여, 상기 제조예 1의 CD25 단일 클론 항체의 CD4+ T 세포에 대한 결합력은 클로린 e6이 결합된다고 하여 감소되는 것이 아니며, 동일한 결합력이 있음을 알 수 있다.

[실시예 2] 세포 내(in vitro) CD4+ Foxp3+ 조절T세포 특이적 사멸(apoptosis) 유도 효과

본 발명에 따른 상기 복합체의 세포 내 CD4+ Foxp3+ 조절T세포 특이적인 사멸 유도를 확인하였다.

상기 제조예 1 및 비교예 1을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 결합시킨 뒤, 660nm의 광선을 조사하고 유세포 분석으로 세포 사멸의 표지자인 아넥신 V(Annexin V)의 발현을 측정하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 제조예 1에 광선을 조사하지 않은 경우(Anti CD25-Ce6)에는 30분에 아넥신 V의 발현이 13.4이고, 15시간 후에는 6.87의 발현을 나타냈다. 반면, 광선을 조사한 경우(Anti CD25-Ce6 + Irradiation)에는 30분에 22.7의 발현 수준에서, 15시간 후에는 62.5의 발현 수준으로 현저하게 증가하였다.

또한, 비교예 1은 광선을 조사한 경우, 30분에서 17.6의 발현을 나타내고, 15시간에서는 9.03의 발현 수준으로 아넥신 V의 발현이 증가 되지않았다.

상기 결과를 통하여, 본 발명의 CD25 단일 클론 항체 및 클로린 e6의 복합체는 CD4+ Foxp3+ 조절T 세포와 결합한 뒤, 광선에 의하여 특이적으로 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 3] 세포 외(in vivo) CD4+ Foxp3+ 조절T세포 특이적 사멸(apoptosis) 유도 효과

본 발명에 따른 CD25 단일 클론 항체 및 클로린 e6의 복합체의 세포 외 CD4+ Foxp3+ 조절T세포 특이적인 사멸 유도를 확인하였다.

B16-F10 쥐의 흑색종(melanoma) 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1%의 항생제를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하여, 상기 세포의 포화도가 80 내지 90%에 해당하면 세포를 트립신/EDTA을 이용하여 수득한 뒤, 쥐의 옆구리에 5 X 10⁵ 개의 세포를 피하 주사하고 10일동안 배양하였다.

상기 흑색종 세포가 배양된 쥐에, 하기 표 1과 같이 2일 간격으로 총 4번 조성물을 투여한 뒤, 광원을 660 nm, 약 100 mW /cm², 30 분의 조건으로 조사하고, 상기 광원을 쥐에 조사하는 제조예 1의 형광 사진을 도 5에 나타내었다.

조성물	개체 수
PBS	6
제조예 1(CD25 단일클론 항체 및 클로린 e6 복합체)	6
비교예 1(IgG1 및 클로린 e6 복합체)	6
CD25 단일클론 항체	6

또한, 상기 쥐의 종양의 체적은 하기 식 1을 이용하여 연구자가 3일 간격으로 총 24일 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.

[식 1]

종양 부피=((종양 조직 긴 부분의 길이) X (종양 조직의 짧은 부분의 길이)²)/2

도 5에서 보는 바와 같이, 제조예 1을 상기 흑색종이 배양된 쥐에 투여한 경우, 종양 조직이 발생한 부위에 특이적으로 형광이 관찰되었다.

또한, 도 6에서 보는 바와 같이, PBS, CD25 단일클론 항체 단독 및 비교예 1의 경우에는 광원을 조사한 경우에도 종양 조직의 크기가 감소되지 않은 반면, 제조예 1을 투여한 뒤 광원을 조사한 경우에는 종양 조직이 2000mm³ 정도 감소되었다.

상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 CD25 단일 클론 항체 및 클로린 e6의 복합체는 종양 조직에 특이적으로 결합하며, 광원 조사에 의하여 효과적으로 조직의 크기를 감소시키는 암 치료 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

[실시예 4] 종양 내 침윤한 CD8+ 독성 T 세포 활성 유도 효과

본 발명에 따른 상기 복합체가 종양으로 침투(infiltration)를 증가시키는 CD8+ 독성 T 세포(CD8+ cytotoxic T cells)의 활성을 유도하는지 확인하였다.

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 흑색종 배양 쥐에 상기 표 1의 조성물을 투여한 뒤, 광원을 660 nm, 약 100 mW /cm², 20분의 조건으로 2일 간격으로 2회 조사하였다. 상기 광원이 조사된 종양 조직은 상기 실시예 1에서와 같이 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 분리한 뒤, 유세포분석기를 통하여 종양 세포로 침투된 세포의 수를 측정하여, 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.

또한, CD8+ T 세포가 만들어 내는 사이토카인의 양을 유세포 분석을 통해 확인하여, 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다.

도 7 및 도 8에서 보는 바와 같이, CD4+ T 세포의 경우 제조예 1, 비교예 1 및 CD25 단일클론 항체 모두에서 세포의 수가 유사하였다. 반면, CD8+ T 세포의 경우 CD25 단일클론 항체는 23.9, 비교예 1은 27.2이었지만, 제조예 1에서는 32.1로 높은 수준의 세포 수가 확인되었다.

또한, 도 9 및 도 10 에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 상기 복합체가 다른 약물에 비하여 CD8+ 세포독성 T세포의 다기능성 (poly functionality)이 IFN-β+CD107a+ 에 대하여 현저히 증가하였음을 확인하였다.

상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 CD25 단일 클론 항체 및 클로린 e6의 복합체는 CD8+ T 세포가 종양 조직으로 침투되는 것을 현저하게 유도하고, 뿐만 아니라, CD8+ T 세포의 활성 역시 현저하게 증가시켜, 암의 치료 효과를 높이는 것을 알 수 있다.

[실시예 5] 전신 면역 반응 변화 확인

본 발명에 따른 상기 복합체가 단일 클론 항체의 전신 투여로 인하여 발생하는 자가 면역 반응(autoimmune response) 또는 병원균 감염에 대한 과민 반응과 같은 부작용 여부에 대해 확인하였다.

상기 실시예 3에서 제작한 흑색종이 배양된 쥐에게 상기 흑색종 세포 접종 5일 후, PR8 바이러스(25 PFU/mouse)를 감염시켰다. 감염 6일 후 상기 실시예 4에서와 동일한 조건으로 광원을 조사하였다.

상기 쥐는 이산화탄소를 이용하여 사망을 유도한 뒤, 폐를 분리하여 면도날로 잘게 썰어 37 에서 30 분 동안 2 mg/ml 콜라게나제 IV 및 30 ㎍/ml DNase I이 포함된 DMEM로 1차 용해시켰다. 상기 용해된 폐 조직을 세포 여과기로 통과시킨 뒤, PBS로 세척하고 적혈구를 ACK 용해 버퍼를 이용하여 2차 용해시켰다.

상기 용해를 통해 얻어진 세포를 CD8α, CD11b, CD45.2, CD44, 및 PR8 NP366-374 펜타머를 이용하여 염색한 뒤, 유세포분석기를 통해 상기 세포를 분석하여 그 결과를 도 11 및 12에 나타내었다.

도 11 및 12에서 보는 바와 같이, 제조예 1을 투여한 쥐의 폐에서 발현되는 바이러스 특이적인 항원의 CD8+ T 세포의 빈도수 및 절대량은 PBS, CD25 단일 클론 항체 단독 및 비교예 1과 대조하여 유사한 수준의 양이 측정되었다. 또한, 체액성 면역반응에 해당하는 항체 IgG1 과 IgM 에 대해서도 유사한 수준의 양이 측정되었다.

도 12에서 보는 바와 같이,

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 상기 복합체가 바이러스 감염에 대한 적응 면역 반응(adaptive immune response)에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.

[실시예 6] 타 광감각제와의 효과 비교

본 발명에 따른 클로린계 화합물 중 클로린 e6을 광감각제로 사용하는 경우 광역학적 치료에 있어서 시너지 효과가 존재하는지 확인하기 위하여, 다른 광감각제와 암세포 사멸 유도 효과를 비교하였다.

그 결과, 암세포 사멸 유도 효과 확인 시 기타 광감각제에 비하여 클로린 e6가 결합된 복합체가 현저하게 암세포 사멸을 유도하였다.

이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물의 복합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 클로린계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 약학 조성물:

[화학식 1]
제 1항에 있어서,
상기 복합체는 상기 항-CD25 단일 클론 항체에, 8 내지 12개의 상기 클로린계 화합물이 결합(Conjugation)되어 있는 것인, 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 복합체는 CD8+ 세포 독성 T 세포(CD8+ Cytotoxic T cell)의 활성을 유도하는 것인, 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약학 조성물은 광역학적 치료(photodynamic therapy, PDT)용인 것인, 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 암은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것인, 약학 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 암은 폐암, 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 약학 조성물.
항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물의 복합체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물; 및
파장이 550 nm 내지 750 nm 범위인 광선을 조사하기 위한 광원을 포함하는, 광역학적 치료에 사용하기 위한 암 치료용 장치.
제 8항에 있어서,
상기 클로린계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 암 치료용 장치:

[화학식 1]
제 8항에 있어서,
상기 약학 조성물은 광역학적 치료(photodynamic therapy, PDT)용인 것인, 암 치료용 장치.
제 8항에 있어서,
상기 암은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것인, 암 치료용 장치.
제 8항에 있어서,
상기 암은 폐암, 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 암 치료용 장치.
클로린계 화합물의 카르복실기(Carboxylic group)를 활성화 하는 단계; 및
항-CD25 단일 클론 항체와 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는 항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물 복합체의 제조방법.
제 13항에 있어서,
상기 카르복실기를 활성화하는 단계에 후속적으로 N-하이드록시석신아마이드(N-hydroxysuccinimide) 및 1-에틸-3-(다이메틸아미노프로필)카르보디이마이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)가 포함된 DMSO와 혼합한 뒤, 반응시키는 단계를 더 포함하는, 복합체의 제조방법.
제 13항에 있어서,
상기 클로린계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 복합체의 제조방법:

[화학식 1]
제 13항에 있어서,
상기 혼합 반응 시, 항-CD25 단일 클론 항체 및 클로린계 화합물의 중량비는 1:10 내지 150의 중량비로 혼합하는 것인, 복합체의 제조방법.
제 13항에 있어서,
상기 항-CD25 단일 클론 항체와 반응시키는 단계에 후속적으로 컬럼을 통과시켜, 복합체를 형성하지 않은 물질을 정제하는 단계를 더 포함하는, 복합체의 제조방법.