KR20180105462A - Composition for diagnosing lung cancer, assaying drug response and prognosis through analysis of extracellular vesicle isolated from blood - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a composition for diagnosing lung cancer or predicting prognosis, which analyzes an extracellular endoplasmic reticulum isolated from blood of a lung cancer patient; a lung cancer diagnosing or prognosis predicting kit including the composition; and an information providing method for diagnosing lung cancer or predicting prognosis by using the composition. A method for detecting a mutation of a lung cancer expressing gene using other blood according to the present invention is more non-invasive than a gene mutation detection through a tissue inspection, is easy, may perform inspections repeatedly, and has high sensitivity, thereby being easy to detect an anticancer agent resistance induced mutation generated after the treatment of a target anticancer agent such as EGFR-TKI. In addition, the present invention can analyze various kinds of information of bio-polymers of DNA, RNA, protein, lipid, and sugar derived from cancer cells by using an extracellular endoplasmic reticulum derived from blood to enable more accurate and efficient diagnosis, and thus can contribute to improvement of lung cancer treatment efficiency by early diagnosing lung cancer or by early measuring prognosis.

Description

혈액에서 분리된 세포외소포체 분석을 통한 폐암 진단, 약제반응 및 예후 예측용 조성물{Composition for diagnosing lung cancer, assaying drug response and prognosis through analysis of extracellular vesicle isolated from blood}Technical Field [0001] The present invention relates to a composition for diagnosing lung cancer, analyzing a drug reaction, and prognosis by analyzing extracellular endoplasmic reticulum isolated from blood.

본 발명은 폐암 환자의 혈액에서 분리된 세포외소포체에 함유된 DNA 및 RNA와 같은 핵산, 단백질 등과 같은 생체활성분자(bioactive molecules)를 분석하는 제재를 포함하는 폐암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트, 상기 조성물을 이용한 폐암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for diagnosing lung cancer or for prognosing a disease, which comprises a material for analyzing bioactive molecules such as nucleic acids and proteins such as DNA and RNA contained in extracellular endoplasmic reticulum isolated from the blood of a patient suffering from lung cancer, And a method of providing information for lung cancer diagnosis or prognosis prediction using the composition.

폐암은 세계적으로 하루 5천 명, 1년에 150만 명이 사망하고 있고 이번 세기에 모두 5억 명이 사망할 것으로 추정되며, 남녀 모두에서 가장 많이 사망하는 암으로 우리나라에서는 2013년 17,177명이 폐암으로 사망했으며 전체 암 사망자의 26.6%(남), 16.5%(여)를 차지하고 있다. 그러나 폐암은 진단방법 및 항암치료와 방사선 치료의 발전에도 불구하고 예후가 매우 좋지 않아 5년 생존율이 20.7%로 췌장암에 이어 두번째로 낮은 질환이다. Lung cancer is estimated to be 5,000 deaths a day worldwide and 1.5 million deaths a year. It is estimated that 500 million people will die this century, and 17,177 people died of lung cancer in Korea in 2013 26.6% (male) and 16.5% (female) of the total cancer deaths. However, lung cancer has a poor prognosis despite the development of diagnostic methods, chemotherapy and radiotherapy, and the 5 - year survival rate is the second lowest disease after pancreatic cancer (20.7%).

폐암의 조기 발견으로 사망률을 낮추기 위해 저선량 CT scan 등이 시도되고 있으나 선별검사로 확립되어 있지 못하며, 객담 세포학 검사의 민감도 도한 매우 낮아 조기 발견이 매우 어렵다. 따라서 폐암 생존율을 높이기 위한 조기 진단법 개발이 매우 중요하다. Low-dose CT scans have been attempted to reduce mortality due to early detection of lung cancer, but they have not been established as screening tests, and the sensitivity of sputum cytology is very low and early detection is very difficult. Therefore, it is very important to develop an early diagnosis method to increase the survival rate of lung cancer.

최근 표적 항암제의 개발로 종양세포에서만 특이적으로 발현되는 유전자 돌연변이 검출에 대한 관심이 증가하고 있다. 폐암 진단에서 현재 사용되고 있는 가장 의미 있는 표적(biomarker)은 상피세포나 조직에서 나타나는 EGFR(Epidermal growth factor receptor) 변이이다. 상기 EGFR DNA의 활성 변이는 서양인 폐암 환자들에게서 10 내지 20% 정도인 반면, 비흡연 동양 여성 폐암 환자들 중에는 650%이상의 높은 빈도를 보인다. 가장 흔히 발견되는 활성 변이는 Exon 19에서 나타나는 염기 결실(deletion E746_A750)과 Exon 21에서 나타나는 염기치환(L858R) 돌연변이이다. 반면, EGFR-TKI (Tyrosine kinase inhibitor)에 대한 획득 내성을 유발하는 2차 돌연변이인 Exon 20의 염기치환(T790M) 돌연변이는 50-60%의 빈도로 발현되는데 제3세대 EGFR-TKI인 EMSI (EGFR mutant specific inhibitor)가 임상에 도입되면서 약제 처방에 대한 동반진단 (companion diagnostics)이 필수 사항으로 요구되면서 임상적 중요성이 부각되고 있다.Recently, the development of targeted anticancer agents has increased interest in the detection of gene mutations that are specifically expressed in tumor cells. The most significant biomarker currently used in the diagnosis of lung cancer is the epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation in epithelial cells and tissues. The active mutation of the EGFR DNA is about 10 to 20% in Western lung cancer patients while it is more than 650% in non-smoking oriental female lung cancer patients. The most common active mutations are the base deletion (deletion E746_A750) in Exon 19 and the base substitution (L858R) mutation in Exon 21. On the other hand, the mutation of the base substitution (T790M) of Exon 20, which is a second mutation inducing acquired resistance to EGFR-TKI (tyrosine kinase inhibitor), is expressed in a frequency of 50-60%. The third generation EGFR-TKI, EMSI mutant specific inhibitors have been introduced into clinical practice and clinical importance has emerged as mandatory companion diagnostics have been required for drug prescriptions.

현재 진행성 폐암에 대한 항암치료에 있어서 EGFR 유전자 돌연변이 검사는 의료보험 혜택이 적용될 정도로 필수적이며 보편화된 검사 방법으로서, EGFR 돌연변이 검사는 조직검사 병리 슬라이드에서 확인된 암세포에서 DNA를 분리하여 진행되고 있다. 즉 유전자 돌연변이 검사를 위해서는 생체조직을 얻고자 시행하는 조직검사가 현재로서는 표준 방법으로 되어있는데 정확하기는 하지만 침습적이고 관혈적인 검사 방법으로 출혈, 기흉, 공기 색전증 등 심각한 합병증을 초래할 수 있는 위험도가 있는 방법이며 때로는 병변의 위치나 위험성 때문에 검사를 시행할 수 없는 경우도 발생한다. 최근 Osimertinib등과 같은 제3세대 EGFR-TKI인 EMSI가 임상에 도입되면서 T790M 2차 돌연변이를 검출하고자 재조직검사(rebiopsy)를 시행해야 하는데 이 경우는 그 성공률이 더욱 낮아서 좋은 약제가 있음에도 불구하고 적절한 돌연변이 진단이 되지 않아서 환자가 혜택을 보지 못하는 경우가 증가하고 있다. EGFR gene mutation testing is currently an essential and universal test for cancer treatment for progressive lung cancer. The EGFR mutation test is carried out by isolating DNA from cancer cells identified in histopathological pathology slides. In other words, a biopsy to obtain a biopsy is the standard method for genetic mutation testing. Although it is accurate, it is invasive and invasive, and there is a risk of causing serious complications such as hemorrhage, pneumothorax, air embolism And sometimes it is not possible to perform the test because of the location or risk of the lesion. Recently, EMSI, a third-generation EGFR-TKI such as Osimertinib, has been introduced into clinical practice to perform rebiopsy in order to detect T790M secondary mutation. In this case, although the success rate is lower, the appropriate mutation diagnosis The number of cases in which patients do not benefit is increasing.

이에 대한 해결책으로 최근 혈액을 이용하여 T790M 유전자 돌연변이 검사를 검출하려는 이른 바 체액 생검(liquid biopsy)에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있지만 기술적 한계로 60-70%의 환자만 찾아낼 수 있는 민감도 문제에 한계점을 보이고 있는 실정이다.Recently, there have been a lot of studies on liquid biopsy to detect T790M gene mutation using blood. However, due to technical limitations, only sensitivity of 60-70% It is a fact that it shows a limit to the problem.

향후 생체액(biofluid) 분석을 통하여 암 유전자 검사를 시행하는, 이른 바 체액 생검(liquid biopsy)의 시대가 도래할 것으로 예상되고 있다. 그 대상으로 쉽게 얻을 수 있고, 비용도 적게 드는 혈액이나 소변과 같은 시료가 이상적이다.In the future, it is expected that the era of liquid biopsy, which carries out cancer gene test through biofluid analysis, is expected to come. Samples such as blood or urine, which are easy to obtain and cost less, are ideal.

최근 신체에서 얻어진 체액(biofluid)에는 나노 크기의 세포외소포체 (extracellular vesicles)라는 것이 존재한다고 밝혀져 주목 받고 있다. 세포외소포체는 이중 지질막으로 이루어진 50~1000nm의 크기를 갖는 나노 소포체로 DNA, RNA 및 단백질 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있으며, 세포막으로부터 분비되어 세포와 세포 사이의 communication에 매우 중요한 기능을 한다고 밝혀져 있다. 특히 암세포에서는 세포외소포체를 정상세포에 비해 훨씬 더 많이 분비하며, 암세포에서 분비된 세포외소포체를 암 유래 세포외소포체라고 하며, 최근 여러 연구들을 통해, 암 진행과정에서 암 유래 세포외소포체가 면역 억제, 전이, 혈관 형성 등 여러 가지 역할을 하고 있음이 확인되고 있다. 또한 세포외소포체는 이중 지질막으로 싸여 있어서 내부에 존재하는 DNA는 물론 RNA와 같은 핵산이나 단백질 등 주요 생체물질들이 대단히 안정적으로 보존되고 있어 암진단 및 생체표지자(biomarker) 개발에 혁신적인 기반을 제공할 것으로 주목받고 있다. 세포외소포체는 혈액, 소변, 타액, 모유, 흉수, 복수, 뇌척수액 등 대부분의 우리 몸에 정상적으로 혹은 질병 발생 시 발생하는 체액에 존재한다고 밝혀져 있어서 그 임상적 유용성이 대단히 높으며, 실제로 우리 몸의 체액에서 세포외소포제를 분리하여 분석함으로써 암은 물론 각종 질환을 진단하는 방법으로 개발하려는 노력들이 국제적으로 매우 활발히 진행되고 있는 실정이다.Recently, biofluids from the body have been attracting attention due to the existence of nanoscale extracellular vesicles. The extracellular endoplasmic reticulum is composed of a bi-lipid membrane with a size of 50-1000 nm. It is composed of substances with biological activity such as DNA, RNA and protein. It is secreted from the cell membrane and plays a very important function for communication between cells and cells. . In particular, in cancer cells, the extracellular endoplasmic reticulum is secreted much more than normal cells, and the extracellular endoplasmic reticulum secreted from cancer cells is called extracellular endoplasmic reticulum derived from cancer. Recent studies have revealed that cancer- Inhibition, metastasis, and angiogenesis. In addition, the extracellular endoplasmic reticulum is surrounded by a double lipid membrane, and major biomaterials such as nucleic acid and protein such as RNA as well as DNA present in the inside are stored very stably to provide an innovative basis for the diagnosis of cancer and the development of biomarker It is attracting attention. The extracellular endoplasmic reticulum is known to be present in body fluids that occur in most of our bodies, such as blood, urine, saliva, breast milk, pleural fluid, ascites, cerebrospinal fluid, and the like. Therefore, its clinical usefulness is very high. Efforts to develop a method for diagnosing various diseases as well as cancer by separating and analyzing the extracellular defoaming agent are being actively carried out internationally.

하지만 아직 폐암에 있어서 체액에 존재하는 세포외소포체를 분리하고 분석하여 진단 및 약제반응과 예후 예측에 적용할 수 있는 생체표지자로 이용할만한 연구적 성과는 보고되지 않는 실정이다. 특히, 소변이나 혈액과 같이 비교적 쉽게 얻을 수 있는 체액 내에 존재하는 세포외소포체를 분리하고 그 안에 존재하는 DNA를 분석하여 유전자 돌연변이 검사를 시행하는 것은, 합병증 빈도가 높은 침습적이고 위험성이 높으며 진단적 실패율의 문제점을 안고 있는 조직검사를 대체할 수 있는 매우 유망한 폐암 진단, 약제반응 및 예후 예측 방법으로 자리매김할 수 있을 것으로 기대된다.However, there is no report on the biochemical markers of lung cancer that can be applied to diagnosis, drug response and prognosis. In particular, isolating the extracellular endoplasmic reticulum (ER) present in relatively easily obtainable body fluids such as urine and blood, and analyzing the DNA present in the extracellular ER are highly invasive, high risk of complications, And it is expected to be a promising method for predicting lung cancer, drug response and prognosis, which can replace the biopsy that has the problem of lung cancer.

이에 본 발명자는 폐암 진단 및 약제반응 예측용 조성물을 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 폐암 환자의 혈액에서 분리한 세포외소포체를 분석할 경우, 폐암세포에서 유래된 DNA, RNA, 단백질, 지질, 당의 생체 고분자의 다양한 정보를 분석할 수 있어 폐암 환자에서 비침습적이면서도 신속하고 민감도 높은 분자적 진단 결과를 얻음으로써 약제반응과 예후를 예측할 수 있다는 연구를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors have continued to develop a composition for diagnosing lung cancer and for predicting drug response. As a result, when the extracellular endoplasmic reticulum isolated from the blood of a lung cancer patient is analyzed, DNA, RNA, protein, lipid, The present inventors have completed the present invention by confirming that the drug reaction and the prognosis can be predicted by analyzing various information of the biopolymer of the sugar chain, thereby obtaining non-invasive, rapid and sensitive molecular diagnosis results in lung cancer patients.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 혈액으로부터 분리된 세포외소포체에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for diagnosing lung cancer, which comprises a material for detecting a lung cancer diagnostic gene marker in an extracellular matrix separated from blood.

또한 본 발명의 목적은 상기 폐암 진단용 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a kit for the diagnosis of lung cancer comprising the composition for diagnosing lung cancer.

또한 본 발명의 목적은 (a) 혈액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a method for the treatment of cancer, comprising the steps of: (a) separating extracellular endoplasmic reticulum from blood; (b) extracting the isolated extracellular vesicle DNA; (c) analyzing the mutant gene of the extracellular vesicle DNA; And (d) judging the result as lung cancer if the analyzed result includes a mutant gene. The present invention provides a method for providing information for diagnosing lung cancer.

또한 본 발명의 목적은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA의 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a composition for predicting the prognosis of lung cancer, which comprises a agent for detecting gene mutation of extracellular vesicle DNA isolated from the blood of a lung cancer patient.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

따라서, 본 발명은 혈액으로부터 분리된 세포외소포제에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for diagnosing lung cancer, which comprises a agent for detecting a lung cancer diagnostic gene marker in an extracellular defoamer separated from blood.

상기 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자 마커는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the gene marker may include one or more members selected from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 and PI3K.

상기 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 유전자 마커는 EGFR 돌연변이인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the gene marker may be an EGFR mutation.

상기 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 EGFR 돌연변이는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및 T790M 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the EGFR mutation may be one or more selected from the group consisting of deletion of Exon 19, substitution of L858R and substitution of T790M.

또한, 본 발명은 혈액으로부터 분리된 세포외소포제에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for lung cancer diagnosis comprising a composition for diagnosing lung cancer, comprising a composition for detecting a lung cancer diagnostic gene marker in an extracellular defoamer separated from blood.

또한, 본 발명은 (a) 혈액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for the treatment of cancer, comprising: (a) separating extracellular endoplasmic reticulum from blood; (b) extracting the isolated extracellular vesicle DNA; (c) analyzing the mutant gene of the extracellular vesicle DNA; And (d) judging the result as lung cancer if the analyzed result includes a mutant gene. A method for providing information for diagnosis of lung cancer.

상기 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 (c) 및 (d)의 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the genes of steps (c) and (d) may include one or more of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 and PI3K.

상기 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단계 (c) 및 (d)의 유전자는 EGFR 유전자인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the genes of steps (c) and (d) may be EGFR genes.

상기 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 단계 (c)의 EGFR 돌연변이 유전자는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및T790M 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the EGFR mutant gene of step (c) may be one or more selected from the group consisting of deletion of Exon 19, substitution of L858R and substitution of T790M.

또한, 본 발명은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA의 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for predicting the prognosis of lung cancer, which comprises a agent for detecting gene mutation of extracellular vesicle DNA isolated from the blood of a lung cancer patient.

상기 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함되는 것일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the gene may include at least one member selected from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 and PI3K.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 폐암 환자의 혈액에 존재하는 세포외소포체 DNA를 이용하여 폐암 관련 유전자의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하고자 한다. 이는 조직검사를 통한 유전자 돌연변이 검출보다 용이하고, 비침습적이며 반복검사가 가능하여 표적 항암제 치료 후 발생하는 항암제 내성유발 돌연변이 검출에 용이하다. 따라서 폐암의 조기 검진과 폐암 치료 효율 증대에 기여할 수 있다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made in order to solve the above problems, and it is an object of the present invention to provide a method for detecting a mutation of a lung cancer-associated gene using extracellular ER DNA present in blood of a lung cancer patient. This is easier, less invasive, and repeatable than gene mutation detection through tissue biopsy, and is useful for detecting cancer-causing mutations that occur after treatment with a target chemotherapeutic agent. Therefore, it can contribute to the early screening of lung cancer and the efficiency of treatment for lung cancer.

도 1은 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 크기를 나타낸 결과이다.
도 2는 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA의 크기를 나타낸 결과이다.
도 3은 폐암 환자 혈액에 존재하는 유리 DNA의 크기를 나타낸 결과이다.
도 4는 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 혈액에 존재하는 유리 DNA의 크기를 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 혈액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이 증폭 곡선을 비교한 결과이다.
도 6은 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 혈액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이 검출 결과를 조직검사한 결과와 비교한 표이다.
도 7은 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 혈액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이를 조직검사 일치율과 비교한 표이다.Figure 1 shows the extracellular endoplasmic reticulum size isolated from the blood of lung cancer patients.
Figure 2 shows the size of extracellular ER DNA isolated from the blood of lung cancer patients.
Figure 3 shows the size of free DNA present in the blood of patients with lung cancer.
FIG. 4 shows the results of electrophoresis of the extracellular ER DNA isolated from the blood of lung cancer patient and the size of free DNA present in the blood.
FIG. 5 shows a comparison of EGFR mutation amplification curves of extracellular ER DNA isolated from patients with lung cancer and free DNA in blood. FIG.
FIG. 6 is a chart comparing the results of biopsy of EGFR mutation detection results of extracellular ER DNA isolated from lung cancer patient's blood and free DNA present in blood. FIG.
FIG. 7 is a table comparing the EGFR mutation of the extracellular ER DNA isolated from the blood of lung cancer patients with the free DNA present in the blood with the histological examination concordance.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

상술한 바와 같이, 종래 표준 방법으로 사용되는 조직검사를 통한 유전자 진단방법의 단점과 한계점을 보완하기 위한 비침습적이고도 반복적 검사가 가능하며 민감도가 높은 EGFR-TKI를 중심으로 하는 표적항암제 내성관련 돌연변이 검출에 용이한 진단방법 개발이 시급한 실정이다.As described above, non-invasive and repetitive tests can be performed to overcome the disadvantages and limitations of the gene diagnosis method using the tissue test, which is used in the conventional standard method, and the mutation detection of the target anticancer drug resistance based on the highly sensitive EGFR-TKI It is urgent to develop an easy diagnostic method.

본 발명은 폐암 환자 혈액에서 분리된 세포외소포체를 포함하는 폐암 진단용 마커 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다.The present invention solves the above-mentioned problems by providing a marker composition for lung cancer diagnosis comprising an extracellular endoplasmic reticulum isolated from the blood of a lung cancer patient.

본 발명에서 "세포외소포체"란 세포에서 생성되어 세포 밖으로 분비되는 소포체로써, 엑소좀(exosome), 마이크로베지클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "extracellular < RTI ID = 0.0 > endoplasmic < / RTI > endoplasmic reticulum " is an endoplasmic reticulum produced in a cell and secreted out of the cell, including but not limited to exosome, microvesicle, microparticle and the like.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 폐암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 폐암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 폐암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.The term "diagnosing" as used herein means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purpose of the present invention, it is meant to confirm the onset of lung cancer. In the diagnosis of the present invention, the presence or absence and expression level of a marker for lung cancer diagnosis are checked to determine whether or not the lung cancer develops, .

상기 세포외소포체는 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 것일 수 있다. 폐암 환자로부터 혈장을 분리하는 방법은 항응고제가 포함된 진공채혈관을 이용해서 5cc정도 채혈 후 원심분리하여 상층액만 회수하는 것이 적합하나 이에 제한되는 것은 아니다.The extracellular endoplasmic reticulum may be isolated from the blood of a lung cancer patient. The method of separating plasma from lung cancer patients is preferably, but not limited to, collecting about 5 cc of blood using centrifugal blood vessels containing anticoagulants and then centrifuging the supernatant.

본 발명은, 혈액으로부터 분리된 세포외소포체에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for diagnosing lung cancer, which comprises a agent for detecting a lung cancer diagnostic gene marker in an extracellular endoplasmic reticulum isolated from blood.

상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 폐암의 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상세포에 비하여 폐암 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 폐암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 폐암 세포에서 차별발현되는 유전자 또는 단백질로서, EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상의 유전자 또는 단백질 일 수 있다. 바람직하게, 상기 EGFR 유전자는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및 T790M 치환에 의해 폐암 세포에서 차별발현되는 것일 수 있다.The diagnostic marker means a substance capable of distinguishing cells of lung cancer from normal cells and includes a polypeptide or nucleic acid (for example, mRNA or the like) which shows an increase or decrease in lung cancer cells as compared with normal cells, a lipid , Glycolipids, glycoproteins, sugar (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.), and the like. The marker for diagnosing lung cancer provided by the present invention may be one or more genes or proteins selected from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 and PI3K, which are differentially expressed in lung cancer cells compared to normal cells . Preferably, the EGFR gene may be differentially expressed in lung cancer cells by deletion of Exon 19, L858R substitution and T790M substitution.

본 발명의 KRAS 유전자 돌연변이는 K-Ras 단백질의 12 또는 13번째 아미노산인 글리신이 변형된 것이거나 61번째 아미노산인 글루타민이 변형된 것이다.The KRAS gene mutation of the present invention is a modification of glycine, which is the 12th or 13th amino acid of the K-Ras protein, or a modification of the 61st amino acid, glutamine.

본 발명의 ALK 유전자는 tyrosine kinase receptor를 코딩하는 유전자로서, 비소세포폐암에서 돌연변이가 발견된다. 상기 유전자 돌연변이 중 염색체 전위가 가장 일반적이며, 이는 ALK (chromosome 2)/EML4 (chromosome 2), ALK/RANBP2 (chromosome 2), ALK/ATIC (chromosome 2), ALK/TFG (chromosome 3), ALK/NPM1 (chromosome 5), ALK/SQSTM1 (chromosome 5), ALK/KIF5B (chromosome 10), ALK/CLTC (chromosome 17), ALK/TPM4 (chromosome 19), 및 ALK/MSN (chromosome X)를 포함하여 여러 종양 유전자의 fusion을 초래한다.The ALK gene of the present invention is a gene encoding a tyrosine kinase receptor, and mutation is found in non-small cell lung cancer. (Chromosome 2), ALK / RANBP2 (chromosome 2), ALK / ATIC (chromosome 2), ALK / TFG (chromosome 3) and ALK / (Including chromosome 5), ALK / SQSTM1 (chromosome 5), ALK / KIF5B (chromosome 10), ALK / CLTC (chromosome 17), ALK / TPM4 (chromosome 19), and ALK / MSN Resulting in the fusion of tumor genes.

본 발명의 ROS1 유전자는 몇 가지 다른 종류의 ROS1 전위가 비소세포폐암에서 발견되었으며, SLC34A2-ROS1,　CD74-ROS1, EZR-ROS1, TPM3-ROS1,　and SDC4-ROS1을 포함한다.The ROS1 gene of the present invention has several other types of ROS1 discovery found in non-small cell lung cancer and includes SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, EZR-ROS1, TPM3-ROS1, and SDC4-ROS1.

한편, 질병을 진단하는 진단 마커는 유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용이 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는데 매우 중요한 인자로 작용하는데, 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다.On the other hand, diagnostic markers that diagnose diseases are very important factors in determining the reliability of diagnostic results because selection and application of significant diagnostic markers are very important factors. Significant diagnostic markers are validity Means a marker with high reliability to produce consistent results even at high and repeated measurements.

본 발명의 폐암을 진단할 수 있는 상기 마커의 경우, 폐암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 결실, 치환 등이 되는 유전자들로서 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 돌연변이의 수준 차이가 대조군과 비교할 때 유의성 있는 차이를 보이므로 잘못된 결과를 보일 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.In the case of the above-mentioned marker capable of diagnosing lung cancer of the present invention, the same result is obtained in repeated experiments as deletion, substitution, or the like as a direct or indirect factor with the onset of lung cancer, and the level of mutation is different from that of the control It is a highly reliable marker that shows a significant difference and has little chance of showing false results. Therefore, the diagnosis result based on the result of measuring the expression level of the significant diagnostic marker of the present invention can be reasonably reliable.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for lung cancer diagnosis comprising the above composition.

본 키트는, 검사 대상에게서 돌연변이 유전자의 존재, mRNA 발현 또는 상기 유전자로부터 코딩된 돌연변이 단백질의 발현을 확인함으로써 폐암의 발병 가능성을 진단할 수 있다. 바람직하게, 상기 돌연변이 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상의 유전자일 수 있다.The kit can diagnose the likelihood of developing lung cancer by confirming the presence of a mutant gene, the expression of mRNA, or the expression of a mutant protein encoded from the gene in the test subject. Preferably, the mutant gene may be at least one gene selected from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 and PI3K.

본 발명의 키트에는 상기 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브와, 상기 유전자로부터 코딩된 돌연변이 단백질을 선택적으로 인지하는 항체가 포함되고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 상기 키트는 프라이머 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. The kit of the present invention includes a primer or a probe capable of detecting the mutant gene and an antibody selectively recognizing the mutant protein encoded from the gene and further comprises one or more other component compositions suitable for analysis, Or device. The kit may be a primer kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit, but is not limited thereto.

구체적인 일예로서, 본 발명에서 EGRF 돌연변이 유전자를 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 EGFR 돌연변이 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소, DNase, 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.As a specific example, in the present invention, the kit for measuring the EGRF mutation gene may be a kit containing the essential elements required for conducting RT-PCR. RT-PCR kits may include test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase, DNase, inhibitors, sterile water, etc., in addition to the respective primer pairs specific for the EGFR mutant gene .

또한, 본 발명의 키트는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자를 포함하는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자의 염기서열에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함한다. 본 발명의 마이크로어레이는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자의 존재 여부를 검출하여 폐암의 발병 가능성을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.In addition, the kit of the present invention may be in the form of a microarray comprising the EGFR mutant gene according to the present invention. The microarray may comprise DNA or RNA polynucleotide probes. The microarray comprises a conventional microarray configuration except that it comprises a probe specific for the base sequence of the EGFR mutant gene according to the present invention. The microarray of the present invention can detect the presence or absence of the EGFR mutation gene according to the present invention and thus provide useful information for diagnosing the possibility of lung cancer.

또한 본 발명은, (a) 혈액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for the production of a pharmaceutical composition comprising: (a) separating an extracellular endoplasmic reticulum from blood; (b) extracting the isolated extracellular vesicle DNA; (c) analyzing the mutant gene of the extracellular vesicle DNA; And (d) judging the result as lung cancer if the analyzed result includes a mutant gene. A method for providing information for diagnosis of lung cancer.

상기 (a) 단계의 폐암 진단에 사용되는 세포외소포체는 폐암 환자의 혈액의 혈구세포의 연속적인 원심분리(centrifugation) 및 초고속 원심분리(ultracentrifugation)를 통해 분리할 수 있으며, 기존에 혈액에서 세포외소포체를 분리하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.The extracellular endoplasmic reticulum used in the diagnosis of lung cancer in step (a) can be separated by continuous centrifugation and ultrafast centrifugation of blood cells of lung cancer patients, Depending on the method of separating the endoplasmic reticulum, it is not limited thereto.

상기 (b) 단계의 세포외소포체는 세포외소포체 용해 버퍼와 단백질분해효소 K를 이용해 추출할 수 있으며, 기존에 혈액에서 세포외소포체 DNA를 추출하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.The extracellular endoplasmic reticulum of step (b) can be extracted using an extracellular ER lysis buffer and a protease K, but the present invention is not limited to the method of extracting extracellular ER DNA from blood.

상기 (c) 단계의 DNA는 농도 측정용 Nanodrop 기계를 이용하고, 크기 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The DNA of step (c) is measured using a Nanodrop machine for concentration measurement and a Bioanalyzer machine for size analysis, but is not limited thereto.

상기 (d) 단계의 돌연변이 유전자 분석은 세포외소포체 DNA, 야생형 유전자 증폭 억제용 PNA 프로브, 형광물질이 들어있는 PCR믹스를 섞어서 PCR 반응 용액을 만든 후 실시간 분석용 PCR 기계인 CFX96에서 40 사이클 동안 반응하여 매 사이클마다 형광 값을 측정, 측정된 형광 값으로 증폭 곡선을 그리고 증폭이 시작되는 사이클 값(Cycle threshold, Ct)을 분석하여 돌연변이 유전자 유무를 분석하는 방법으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다. In step (d), the PCR reaction solution was prepared by mixing extracellular ER DNA, wild-type gene amplification-inhibiting PNA probe, and fluorescent substance-containing PCR mix, and then subjected to reaction for 40 cycles in CFX96 And measuring the fluorescence value every cycle, analyzing the amplification curve with the measured fluorescence value, and analyzing the cycle threshold (Ct) at which the amplification starts, but the present invention is not limited thereto.

또한, 본 발명은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for predicting the prognosis of lung cancer, which comprises a material for detecting mutation of extracellular ER DNA gene isolated from the blood of a lung cancer patient.

본 발명에서 용어 "예후"란 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등의 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게는 개체의 시료로부터 본 발명의 세포외소포체 DNA의 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K 등 유전자 돌연변이 유무를 확인함으로써 해당 개체의 폐암 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋은지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다.The term "prognosis" in the present invention means judging whether the individual has recurrence, metastasis, drug reactivity, resistance or the like after treatment of cancer. Preferably, the presence or absence of a mutation in EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K, etc. of the extracellular ER DNA of the present invention from the individual sample indicates not only the incidence of lung cancer in the individual but also the survival prognosis It is possible to predict whether or not it is good.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, these examples are intended to further illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

[[ 실시예Example ]]

실시예Example 1. 폐암 환자의 혈액에 존재하는  1. Present in the blood of patients with lung cancer 세포외소포체Extracellular vesicle 분리 및  Separation and 세포외소포체Extracellular vesicle DNA 추출 DNA extraction

혈액에서 혈구세포와 세포 찌꺼기를 제거하기 위해서 1000g에서 10분 동안 원심분리 하여 침전시켰다. 세포와 세포 찌꺼기가 제거된 상층액을 200,000g에서 1시간 동안 초고속 원심분리 하여 세포외소포체를 침전시킨 후 상층액을 제거하고 PBS 버퍼 200ul에 침전물을 풀어주었다. 분리된 세포외소포체의 크기를 나노물질 크기 측정용 zetasizer 기계로 측정하였다. 분리된 세포외소포체 200ul에 세포외소포체 용해 버퍼 200ul와 20mg/ml의 단백질분해효소 K 40ul를 넣고 내용물이 균일해지도록 천천히 섞어주고 70에 10분간 방치하였다. 상기 용해된 세포외소포체를 유리 섬유 컬럼에 옮긴 후 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 세척 버퍼 500ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸으며 이 과정을 2회 반복하였다. 세척버퍼를 완전히 제거하기 위해 상기 컬럼을 12,500g에서 30초간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 증류수 50ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리 하였다. 상기 추출된 세포외소포체 DNA의 농도를 농도 측정용 NanoDrop 기계를 이용하여 측정 하였다. 상기 추출된 세포외소포체 DNA의 크기를 DNA 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정 하였다. (도 2, 4) 세포외소포체 DNA 농도는 1950pg/ul이고, DNA의 크기는 도2,3,4를 비교했을 때 세포외소포체 DNA에서 600bp이상의 큰 DNA가 유리 DNA보다 많이 존재하였다.In order to remove blood cells and cellular debris from blood, they were precipitated by centrifugation at 1000g for 10 minutes. Cells and cell debris were removed from the supernatant by ultrafast centrifugation at 200,000 g for 1 hour to precipitate the extracellular endoplasmic reticulum. The supernatant was removed and the precipitate was dissolved in 200 μl of PBS buffer. The size of the isolated extracellular endoplasmic reticulum was measured with a zetasizer machine for nanomaterial size measurement. 200 μl of extracellular vesicle lysis buffer and 40 μl of 20 mg / ml protease K were added to the separated extracellular vesicle, and the mixture was slowly mixed to make the contents homogeneous and allowed to stand for 10 minutes at 70 ° C. The dissolved extracellular endoplasmic reticulum was transferred to a glass fiber column, centrifuged at 8000 g for 1 minute, and the solution was discarded. The column was charged with 500 ul of wash buffer, centrifuged at 8000 g for 1 minute, discarded and the procedure was repeated twice. The column was centrifuged at 12,500 g for 30 seconds to completely remove the wash buffer and the solution discarded. 50 ul of distilled water was added to the column, followed by centrifugation at 8000 g for 1 minute. The concentration of the extracellular ER DNA was measured using a NanoDrop machine for concentration measurement. The size of the extracellular ER DNA was measured using a Bioanalyzer machine for DNA analysis. (Figs. 2 and 4). The extracellular ER DNA concentration was 1950 pg / ul and the size of the DNA was larger than that of the free DNA in the extracellular ER DNA of 600 bp or more when comparing Figs.

실시예Example 2. 폐암 환자의 혈액에 존재하는 유리 DNA 추출 2. Extraction of free DNA in the blood of patients with lung cancer

폐암 환자 혈액에 존재하는 세포외소포체 DNA와의 비교를 위해 하기의 실험을 실시하였다. The following experiments were performed for comparison with extracellular vesicle DNA present in the blood of lung cancer patients.

혈액에 유리 DNA 추출 버퍼 200ul와 20mg/ml의 단백질분해효소 K 40ul를 넣고 내용물이 균일해지도록 천천히 섞어주고 70에 10분간 방치하였다. 상기 용해된 세포외소포체를 유리 섬유 컬럼에 옮긴 후 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 세척 버퍼 500ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸으며 이 과정을 2회 반복하였다. 세척버퍼를 완전히 제거하기 위해 상기 컬럼을 12,500g에서 30초간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 증류수 50ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리 하였다. 상기 추출된 유리DNA의 농도를 농도 측정용 NanoDrop 기계를 이용하여 측정 하였다. 상기 추출된 유리DNA의 크기를 DNA 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정 하였다(도 3, 4). 유리 DNA 농도는 850pg/ul이었다.200 μl of free DNA extraction buffer and 40 μl of 20 mg / ml protease K were added to the blood, and the mixture was slowly mixed so that the contents became uniform, and the mixture was left at 70 ° C for 10 minutes. The dissolved extracellular endoplasmic reticulum was transferred to a glass fiber column, centrifuged at 8000 g for 1 minute, and the solution was discarded. The column was charged with 500 ul of wash buffer, centrifuged at 8000 g for 1 minute, discarded and the procedure was repeated twice. The column was centrifuged at 12,500 g for 30 seconds to completely remove the wash buffer and the solution discarded. 50 ul of distilled water was added to the column, followed by centrifugation at 8000 g for 1 minute. The concentration of the extracted free DNA was measured using a NanoDrop machine for concentration measurement. The size of the extracted free DNA was measured using a Bioanalyzer machine for DNA analysis (FIGS. 3 and 4). The free DNA concentration was 850 pg / ul.

실시예Example 3.  3. EGFREGFR 돌연변이 유전자 분석 Mutant gene analysis

상기 추출된 세포외소포체 DNA 70ng또는 유리 DNA70ng을 프라이머, 야생형 유전자 증폭 억제용 PNA 프로브, 형광물질이 들어있는 PCR 믹스 (mix)를 섞어서 20ul의 PCR 반응 용액을 만들었다. 실시간 분석용 PCR 기계인 CFX96에서 94 5분 반응 후 94 30 초, 70 20초, 63 30초 조건으로 40 사이클 (cycles) 동안 반응하며 매 사이클마다 형광 값을 측정하여 그래프를 작성하였다. (도 5) 이 때, 94의 열을 가하면 한 개의 DNA가 두 가닥으로 분리되는 denaturation, 이 후 온도를 70정도로 내리면 프라이머와 중합효소가 외가닥 DNA의 특정부위에 결합하고, 합성되는 단계를 거쳐 두 개의 DNA가 된다. 증폭시키려는 상기 추출된 세포외소포체 DNA 또는 유리 DNA의 적은 양을 이용해 엄청난 양으로 늘릴 수 있으며, 측정된 형광 값으로 증폭 곡선을 그리고 증폭이 시작되는 사이클 값 (Cycle threshold, Ct)을 분석하여 돌연변이 유전자 유무를 파악하였다. EGFR 돌연변이 유전자 검사 결과 세포외소포체 DNA는 20 검체중 11 검체가 조직검사 결과와 일치하여 55%의 일치율을 보였고, 유리 DNA는 20개 검체중 6개 검체가 일치하여 30%의 일치율을 보여 혈액에서 세포외소포체 DNA를 이용한 EGFR 돌연변이 유전자 검사가 효율성이 높다는 것이 입증 되었다(도 6, 7).    70 ng of the extracted extracellular ER DNA or 70 ng of free DNA was mixed with a primer, a PNA probe for suppressing wild-type gene amplification, and a PCR mix containing a fluorescent material to prepare 20 uL of PCR reaction solution. The reaction was carried out in CFX96, a real-time analysis PCR machine, for 94 cycles of 94, 30, 70, 20, and 63 for 30 cycles, and fluorescence values were measured for each cycle. (FIG. 5). At this time, when denaturation in which one DNA is separated into two strands by applying heat of 94, and then the temperature is lowered to about 70, a primer and a polymerase are bound to a specific site of the DNA and synthesized, DNA. The amount of the extracted extracellular ER DNA or free DNA to be amplified can be increased to an enormous amount. The amplification curve is measured with the measured fluorescence value and the cycle threshold (Ct) Respectively. The EGFR mutant gene showed that the extracellular ER DNA was identical in 11 out of 20 specimens to 55% in concordance with biopsy specimens, and the free DNA in 30 out of 20 specimens showed a concordance rate of 30% EGFR mutant gene testing using extracellular ER DNA was proven to be highly efficient (Figures 6 and 7).

Claims (11)

혈액으로부터 분리된 세포외소포제에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는
폐암 진단용 조성물.
Including agents that detect lung cancer diagnostic genetic markers in extracellular defoamers isolated from blood
Compositions for diagnosing lung cancer.
제1항에 있어서,
상기 유전자 마커는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 하는
폐암 진단용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the gene marker comprises at least one member selected from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 and PI3K
Compositions for diagnosing lung cancer.
제1항에 있어서,
상기 유전자 마커는 EGFR 돌연변이인 것을 특징으로 하는
폐암 진단용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the gene marker is an EGFR mutation
Compositions for diagnosing lung cancer.
제3항에 있어서,
상기 EGFR 돌연변이는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및 T790M 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는
폐암 진단용 조성물.
The method of claim 3,
Wherein said EGFR mutation is any one or more selected from the group consisting of deletion of Exon 19, substitution of L858R and substitution of T790M
Compositions for diagnosing lung cancer.
제1항의 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트.
A kit for the diagnosis of lung cancer comprising the composition of claim 1.
(a) 혈액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계;
(c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및
(d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는
폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
(a) separating the extracellular endoplasmic reticulum from the blood;
(b) extracting the isolated extracellular vesicle DNA;
(c) analyzing the mutant gene of the extracellular vesicle DNA; And
(d) judging lung cancer if the result of the analysis includes a mutation gene; Containing
Providing information for lung cancer diagnosis.
제6항에 있어서,
상기 단계 (c) 및 (d)의 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 하는
폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
The method according to claim 6,
Wherein the gene of steps (c) and (d) comprises at least one member selected from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K
Providing information for lung cancer diagnosis.
제6항에 있어서,
상기 단계 (c) 및 (d)의 유전자는 EGFR 유전자인 것을 특징으로 하는
폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
The method according to claim 6,
Wherein the gene of steps (c) and (d) is an EGFR gene
Providing information for lung cancer diagnosis.
제8항에 있어서,
상기 단계 (c)의 EGFR 돌연변이 유전자는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및T790M 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는
폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
9. The method of claim 8,
Wherein the EGFR mutant gene of step (c) is any one or more selected from the group consisting of deletion of Exon 19, substitution of L858R and substitution of T790M
Providing information for lung cancer diagnosis.
폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA의 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는
폐암 예후 예측용 조성물.
Comprising a means of detecting a gene mutation in extracellular vesicle DNA isolated from the blood of a lung cancer patient
Composition for predicting lung cancer prognosis.
제10항에 있어서, 상기 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함되는 것을 특징으로 하는
폐암 예후 예측용 조성물.

[Claim 11] The method according to claim 10, wherein the gene comprises at least one member selected from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 and PI3K
Composition for predicting lung cancer prognosis.

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