KR101979989B1

KR101979989B1 - Composition for diagnosing lung cancer, assaying drug response and prognosis through analysis of extracellular vesicle isolated from blood

Info

Publication number: KR101979989B1
Application number: KR1020170032566A
Authority: KR
Inventors: 이계영; 허재영; 김희정
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단; 학교법인 건국대학교
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2019-08-28
Also published as: KR20180105462A

Abstract

본 발명은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 세포외소포체를 분석하는 폐암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 예후 예측용 키트, 상기 조성물을 이용한 폐암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 다른 혈액을 이용한 폐암 발현 유전자의 돌연변이 검출 방법은 조직검사를 통한 유전자 돌연변이 검출보다 비침습적이고, 용이하며 반복검사가 가능하면서 민감도가 높다는 점에서 EGFR-TKI와 같은 표적 항암제 치료 후 발생하는 항암제 내성 유발 돌연변이 검출에 용이하다.
또한, 폐암 환자의 혈액은 비교적 얻기 쉬운 시료로서, 상기 혈액 유래 세포외소포체를 이용하면 암세포에서 유래된 DNA, RNA, 단백질, 지질, 당의 생체 고분자의 다양한 정보를 분석할 수 있어 더욱 정확하고 효율적인 진단이 가능하므로, 폐암을 조기 검진하거나 예후를 측정하여 폐암 치료 효율 증대에 기여할 수 있다. The present invention provides a composition for diagnosing or predicting lung cancer for analyzing extracellular vesicles isolated from blood of a lung cancer patient, a kit for diagnosing or prognostic lung cancer comprising the composition, and providing information for diagnosing or predicting lung cancer using the composition. It is about a method.
Mutation detection method of lung cancer expression gene using blood according to the present invention is a non-invasive, easy, repeatable and high sensitivity than the detection of gene mutations through histology, which occurs after treatment with a target anticancer agent such as EGFR-TKI. Easy to detect anticancer drug-induced mutations.
In addition, the blood of a lung cancer patient is a relatively easy sample, and the blood-derived extracellular vesicles can analyze various information of biopolymers of DNA, RNA, proteins, lipids, and sugars derived from cancer cells for more accurate and efficient diagnosis. Since this is possible, early detection of lung cancer or measurement of prognosis may contribute to increased lung cancer treatment efficiency.

Description

Composition for diagnosing lung cancer, assaying drug response and prognosis through analysis of extracellular vesicle isolated from blood}

본 발명은 폐암 환자의 혈액에서 분리된 세포외소포체에 함유된 DNA 및 RNA와 같은 핵산, 단백질 등과 같은 생체활성분자(bioactive molecules)를 분석하는 제재를 포함하는 폐암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트, 상기 조성물을 이용한 폐암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. The present invention is a composition for diagnosing or predicting lung cancer, comprising the agent for analyzing bioactive molecules such as nucleic acids, proteins, such as DNA and RNA contained in extracellular vesicles isolated from the blood of lung cancer patients, the composition Lung cancer diagnostic kit, comprising a method for providing information for lung cancer diagnosis or prognosis prediction using the composition.

폐암은 세계적으로 하루 5천 명, 1년에 150만 명이 사망하고 있고 이번 세기에 모두 5억 명이 사망할 것으로 추정되며, 남녀 모두에서 가장 많이 사망하는 암으로 우리나라에서는 2013년 17,177명이 폐암으로 사망했으며 전체 암 사망자의 26.6%(남), 16.5%(여)를 차지하고 있다. 그러나 폐암은 진단방법 및 항암치료와 방사선 치료의 발전에도 불구하고 예후가 매우 좋지 않아 5년 생존율이 20.7%로 췌장암에 이어 두번째로 낮은 질환이다. Lung cancer is the world's 5,000 deaths per day, 1.5 million people a year, and 500 million people are expected to die this century. The most common cancer in both men and women is 17,177 in Korea. 26.6% of all cancer deaths are male and 16.5% are female. However, despite the advances in diagnostic methods, chemotherapy and radiation therapy, lung cancer has a very poor prognosis, with a 5 year survival rate of 20.7%, the second lowest after pancreatic cancer.

폐암의 조기 발견으로 사망률을 낮추기 위해 저선량 CT scan 등이 시도되고 있으나 선별검사로 확립되어 있지 못하며, 객담 세포학 검사의 민감도 도한 매우 낮아 조기 발견이 매우 어렵다. 따라서 폐암 생존율을 높이기 위한 조기 진단법 개발이 매우 중요하다. Low-dose CT scans have been attempted to reduce mortality due to early detection of lung cancer, but are not established by screening, and the sensitivity of sputum cytology is very low, making early detection very difficult. Therefore, it is very important to develop early diagnosis for improving lung cancer survival rate.

최근 표적 항암제의 개발로 종양세포에서만 특이적으로 발현되는 유전자 돌연변이 검출에 대한 관심이 증가하고 있다. 폐암 진단에서 현재 사용되고 있는 가장 의미 있는 표적(biomarker)은 상피세포나 조직에서 나타나는 EGFR(Epidermal growth factor receptor) 변이이다. 상기 EGFR DNA의 활성 변이는 서양인 폐암 환자들에게서 10 내지 20% 정도인 반면, 비흡연 동양 여성 폐암 환자들 중에는 650%이상의 높은 빈도를 보인다. 가장 흔히 발견되는 활성 변이는 Exon 19에서 나타나는 염기 결실(deletion E746_A750)과 Exon 21에서 나타나는 염기치환(L858R) 돌연변이이다. 반면, EGFR-TKI (Tyrosine kinase inhibitor)에 대한 획득 내성을 유발하는 2차 돌연변이인 Exon 20의 염기치환(T790M) 돌연변이는 50-60%의 빈도로 발현되는데 제3세대 EGFR-TKI인 EMSI (EGFR mutant specific inhibitor)가 임상에 도입되면서 약제 처방에 대한 동반진단 (companion diagnostics)이 필수 사항으로 요구되면서 임상적 중요성이 부각되고 있다.Recently, with the development of target anticancer agents, interest in the detection of gene mutations specifically expressed in tumor cells is increasing. The most significant biomarkers currently used in lung cancer diagnosis are epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in epithelial cells or tissues. The activity variation of the EGFR DNA is about 10 to 20% in Western lung cancer patients, while the high frequency of more than 650% among non-smoking Asian female lung cancer patients. The most commonly found activity variants are base deletions (deletion E746_A750) in Exon 19 and base substitution (L858R) mutations in Exon 21. On the other hand, the nucleotide substitution (T790M) mutation of Exon 20, a secondary mutation that induces acquisition resistance to EGFR-TKI (Tyrosine kinase inhibitor), is expressed at a frequency of 50-60% .The third generation EGFR-TKI, EMSI (EGFR) As mutant specific inhibitors have been introduced into the clinic, clinical diagnostic importance has emerged as companion diagnostics are required.

현재 진행성 폐암에 대한 항암치료에 있어서 EGFR 유전자 돌연변이 검사는 의료보험 혜택이 적용될 정도로 필수적이며 보편화된 검사 방법으로서, EGFR 돌연변이 검사는 조직검사 병리 슬라이드에서 확인된 암세포에서 DNA를 분리하여 진행되고 있다. 즉 유전자 돌연변이 검사를 위해서는 생체조직을 얻고자 시행하는 조직검사가 현재로서는 표준 방법으로 되어있는데 정확하기는 하지만 침습적이고 관혈적인 검사 방법으로 출혈, 기흉, 공기 색전증 등 심각한 합병증을 초래할 수 있는 위험도가 있는 방법이며 때로는 병변의 위치나 위험성 때문에 검사를 시행할 수 없는 경우도 발생한다. 최근 Osimertinib등과 같은 제3세대 EGFR-TKI인 EMSI가 임상에 도입되면서 T790M 2차 돌연변이를 검출하고자 재조직검사(rebiopsy)를 시행해야 하는데 이 경우는 그 성공률이 더욱 낮아서 좋은 약제가 있음에도 불구하고 적절한 돌연변이 진단이 되지 않아서 환자가 혜택을 보지 못하는 경우가 증가하고 있다. Currently, EGFR mutation testing is an essential and universal test method for applying insurance benefits to advanced lung cancer treatment. The EGFR mutation testing is performed by separating DNA from cancer cells identified on a biopsy pathology slide. In other words, biopsies for genetic mutation testing are currently standard methods, but accurate, but invasive and invasive testing methods can lead to serious complications such as bleeding, pneumothorax, and air embolism. It is a method and sometimes a test cannot be performed because of the location or risk of the lesion. Recently, a third generation EGFR-TKI such as Osimertinib and EMSI has been introduced into the clinical trials to perform a rebiopsy to detect T790M secondary mutations. Increasingly, patients do not benefit from this.

이에 대한 해결책으로 최근 혈액을 이용하여 T790M 유전자 돌연변이 검사를 검출하려는 이른 바 체액 생검(liquid biopsy)에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있지만 기술적 한계로 60-70%의 환자만 찾아낼 수 있는 민감도 문제에 한계점을 보이고 있는 실정이다.As a solution for this, so-called liquid biopsy, which has recently been used to detect the T790M gene mutation test using blood, is being actively conducted worldwide, but due to technical limitations, the sensitivity can be detected only by 60-70% of patients. The situation is showing its limitations.

향후 생체액(biofluid) 분석을 통하여 암 유전자 검사를 시행하는, 이른 바 체액 생검(liquid biopsy)의 시대가 도래할 것으로 예상되고 있다. 그 대상으로 쉽게 얻을 수 있고, 비용도 적게 드는 혈액이나 소변과 같은 시료가 이상적이다.It is expected that the age of so-called liquid biopsy, which carries out cancer genetic testing through biofluid analysis, is coming. Samples such as blood or urine that are easily obtained and inexpensive to the subject are ideal.

최근 신체에서 얻어진 체액(biofluid)에는 나노 크기의 세포외소포체 (extracellular vesicles)라는 것이 존재한다고 밝혀져 주목 받고 있다. 세포외소포체는 이중 지질막으로 이루어진 50~1000nm의 크기를 갖는 나노 소포체로 DNA, RNA 및 단백질 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있으며, 세포막으로부터 분비되어 세포와 세포 사이의 communication에 매우 중요한 기능을 한다고 밝혀져 있다. 특히 암세포에서는 세포외소포체를 정상세포에 비해 훨씬 더 많이 분비하며, 암세포에서 분비된 세포외소포체를 암 유래 세포외소포체라고 하며, 최근 여러 연구들을 통해, 암 진행과정에서 암 유래 세포외소포체가 면역 억제, 전이, 혈관 형성 등 여러 가지 역할을 하고 있음이 확인되고 있다. 또한 세포외소포체는 이중 지질막으로 싸여 있어서 내부에 존재하는 DNA는 물론 RNA와 같은 핵산이나 단백질 등 주요 생체물질들이 대단히 안정적으로 보존되고 있어 암진단 및 생체표지자(biomarker) 개발에 혁신적인 기반을 제공할 것으로 주목받고 있다. 세포외소포체는 혈액, 소변, 타액, 모유, 흉수, 복수, 뇌척수액 등 대부분의 우리 몸에 정상적으로 혹은 질병 발생 시 발생하는 체액에 존재한다고 밝혀져 있어서 그 임상적 유용성이 대단히 높으며, 실제로 우리 몸의 체액에서 세포외소포제를 분리하여 분석함으로써 암은 물론 각종 질환을 진단하는 방법으로 개발하려는 노력들이 국제적으로 매우 활발히 진행되고 있는 실정이다.Recently, the body fluid (biofluid) obtained from the body has attracted attention because it is known that there are nano-sized extracellular vesicles (extracellular vesicles). Extracellular vesicles are nano-vesicles with a size of 50-1000 nm consisting of double lipid membranes, which are composed of substances with biological activities such as DNA, RNA, and proteins, and are secreted from the cell membranes to play a very important function in communication between cells. It turns out. In particular, in cancer cells, extracellular vesicles are secreted much more than normal cells, and the extracellular vesicles secreted from cancer cells are called cancer-derived extracellular vesicles. It has been confirmed that it plays various roles such as inhibition, metastasis, and blood vessel formation. In addition, the extracellular vesicles are encapsulated in double lipid membranes, which preserves highly stable biological materials such as nucleic acids and proteins such as RNA as well as DNA present in the interior, which will provide an innovative foundation for cancer diagnosis and biomarker development. It is attracting attention. Extracellular endoplasmic reticulum has been found to be present in the body fluids that normally occur in our bodies, such as blood, urine, saliva, breast milk, pleural fluid, ascites, and cerebrospinal fluid, and is highly clinically useful. By separating and analyzing the extracellular antifoaming agents, efforts are being made to develop cancers as well as various methods for diagnosing various diseases.

하지만 아직 폐암에 있어서 체액에 존재하는 세포외소포체를 분리하고 분석하여 진단 및 약제반응과 예후 예측에 적용할 수 있는 생체표지자로 이용할만한 연구적 성과는 보고되지 않는 실정이다. 특히, 소변이나 혈액과 같이 비교적 쉽게 얻을 수 있는 체액 내에 존재하는 세포외소포체를 분리하고 그 안에 존재하는 DNA를 분석하여 유전자 돌연변이 검사를 시행하는 것은, 합병증 빈도가 높은 침습적이고 위험성이 높으며 진단적 실패율의 문제점을 안고 있는 조직검사를 대체할 수 있는 매우 유망한 폐암 진단, 약제반응 및 예후 예측 방법으로 자리매김할 수 있을 것으로 기대된다.However, there are no research results that can be used as a biomarker that can be used to isolate and analyze extracellular vesicles present in body fluids in lung cancer and apply it to diagnosis, drug response, and prognosis. In particular, genetic mutation testing by separating extracellular vesicles present in relatively easily obtained body fluids such as urine or blood and analyzing DNA present therein is an invasive, high-risk and high diagnostic failure rate with a high complication rate. It is expected to be a very promising method of diagnosing lung cancer, drug response, and prognosis, which can be used as a substitute for biopsy.

이에 본 발명자는 폐암 진단 및 약제반응 예측용 조성물을 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 폐암 환자의 혈액에서 분리한 세포외소포체를 분석할 경우, 폐암세포에서 유래된 DNA, RNA, 단백질, 지질, 당의 생체 고분자의 다양한 정보를 분석할 수 있어 폐암 환자에서 비침습적이면서도 신속하고 민감도 높은 분자적 진단 결과를 얻음으로써 약제반응과 예후를 예측할 수 있다는 연구를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors continued the research to develop a composition for diagnosing lung cancer and predicting drug response, and when analyzing the extracellular vesicles isolated from the blood of lung cancer patients, DNA, RNA, protein, lipid, The present invention has been completed by confirming a study that can analyze various information of biopolymers of sugar and thus can predict drug response and prognosis by obtaining non-invasive, rapid and sensitive molecular diagnostic results in lung cancer patients.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 혈액으로부터 분리된 세포외소포체에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for detecting a lung cancer diagnostic gene marker in the extracellular vesicles isolated from the blood to solve the above problems.

또한 본 발명의 목적은 상기 폐암 진단용 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a lung cancer diagnostic kit comprising the lung cancer diagnostic composition.

또한 본 발명의 목적은 (a) 혈액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention (a) separating the extracellular vesicles from the blood; (b) extracting the isolated extracellular vesicle DNA; (c) analyzing the mutant gene of the extracellular vesicle DNA; And (d) judging lung cancer if the analyzed result includes the mutant gene; It provides a method for providing information for diagnosing lung cancer.

또한 본 발명의 목적은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA의 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a composition for predicting lung cancer prognosis comprising an agent for detecting a genetic mutation of extracellular vesicle DNA isolated from the blood of lung cancer patients.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem, another task that is not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

따라서, 본 발명은 혈액으로부터 분리된 세포외소포제에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for detecting a lung cancer diagnostic gene marker in an extracellular antifoaming agent isolated from blood.

상기 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자 마커는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the invention, the genetic marker may be one or more of the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K.

상기 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 유전자 마커는 EGFR 돌연변이인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the invention, the genetic marker may be an EGFR mutation.

상기 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 EGFR 돌연변이는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및 T790M 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the invention, the EGFR mutation may be any one or more selected from the group consisting of deletion of Exon 19, L858R substitution and T790M substitution.

또한, 본 발명은 혈액으로부터 분리된 세포외소포제에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing lung cancer comprising a composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for detecting a lung cancer diagnostic gene marker in an extracellular antifoaming agent isolated from blood.

또한, 본 발명은 (a) 혈액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (a) separating the extracellular vesicles from the blood; (b) extracting the isolated extracellular vesicle DNA; (c) analyzing the mutant gene of the extracellular vesicle DNA; And (d) judging lung cancer if the analyzed result includes the mutant gene; It provides a method of providing information for diagnosing lung cancer.

상기 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 (c) 및 (d)의 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the invention, the gene of the step (c) and (d) may be one or more of the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K.

상기 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단계 (c) 및 (d)의 유전자는 EGFR 유전자인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the genes of steps (c) and (d) may be EGFR gene.

상기 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 단계 (c)의 EGFR 돌연변이 유전자는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및T790M 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the invention, the EGFR mutant gene of step (c) may be any one or more selected from the group consisting of Exon 19 deletion, L858R substitution and T790M substitution.

또한, 본 발명은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA의 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for predicting lung cancer prognosis comprising an agent for detecting a gene mutation of extracellular vesicle DNA isolated from the blood of a lung cancer patient.

상기 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상 포함되는 것일 수 있다. According to a preferred embodiment of the invention, the gene may be one or more of the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 폐암 환자의 혈액에 존재하는 세포외소포체 DNA를 이용하여 폐암 관련 유전자의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하고자 한다. 이는 조직검사를 통한 유전자 돌연변이 검출보다 용이하고, 비침습적이며 반복검사가 가능하여 표적 항암제 치료 후 발생하는 항암제 내성유발 돌연변이 검출에 용이하다. 따라서 폐암의 조기 검진과 폐암 치료 효율 증대에 기여할 수 있다.The present invention has been made to solve the above problems, the present invention is to provide a method for detecting mutations in lung cancer-related genes using extracellular vesicle DNA present in the blood of lung cancer patients. This is easier than the detection of gene mutations through histology, non-invasive and repeatable test, it is easier to detect the anti-cancer drug-induced mutations that occur after the target anti-cancer drug treatment. Therefore, it can contribute to the early screening of lung cancer and the efficiency of lung cancer treatment.

도 1은 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 크기를 나타낸 결과이다.
도 2는 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA의 크기를 나타낸 결과이다.
도 3은 폐암 환자 혈액에 존재하는 유리 DNA의 크기를 나타낸 결과이다.
도 4는 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 혈액에 존재하는 유리 DNA의 크기를 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 혈액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이 증폭 곡선을 비교한 결과이다.
도 6은 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 혈액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이 검출 결과를 조직검사한 결과와 비교한 표이다.
도 7은 폐암 환자 혈액에서 분리한 세포외소포체 DNA와 혈액에 존재하는 유리 DNA의 EGFR 돌연변이를 조직검사 일치율과 비교한 표이다.Figure 1 shows the results of extracellular vesicle size isolated from the lung cancer patients blood.
Figure 2 is a result showing the size of the extracellular vesicles DNA isolated from the blood of lung cancer patients.
Figure 3 is a result showing the size of the free DNA present in the lung cancer patients blood.
Figure 4 shows the results of electrophoresis of the size of the extracellular vesicle DNA and the free DNA present in the blood from the lung cancer patients blood.
5 is a result of comparing the EGFR mutation amplification curves of extracellular vesicle DNA isolated from the lung cancer patients blood and free DNA present in the blood.
FIG. 6 is a table comparing EGFR mutation detection results of extracellular vesicle DNA isolated from lung cancer patients blood and free DNA present in blood with biopsy results.
FIG. 7 is a table comparing EGFR mutations of extracellular vesicle DNA isolated from lung cancer patients blood and free DNA present in blood with biopsy agreement.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

상술한 바와 같이, 종래 표준 방법으로 사용되는 조직검사를 통한 유전자 진단방법의 단점과 한계점을 보완하기 위한 비침습적이고도 반복적 검사가 가능하며 민감도가 높은 EGFR-TKI를 중심으로 하는 표적항암제 내성관련 돌연변이 검출에 용이한 진단방법 개발이 시급한 실정이다.As described above, detection of target anticancer drug resistance mutations centered on EGFR-TKI, which is highly sensitive and non-invasive, is capable of repeating the test to compensate for the shortcomings and limitations of the gene diagnosis method through the biopsy used as a conventional standard method. It is urgent to develop easy diagnostic methods.

본 발명은 폐암 환자 혈액에서 분리된 세포외소포체를 포함하는 폐암 진단용 마커 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다.The present invention sought to solve the above-mentioned problems by providing a marker composition for diagnosing lung cancer comprising extracellular vesicles isolated from the blood of lung cancer patients.

본 발명에서 "세포외소포체"란 세포에서 생성되어 세포 밖으로 분비되는 소포체로써, 엑소좀(exosome), 마이크로베지클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, "extracellular endoplasmic reticulum" is a endoplasmic reticulum produced in the cells and secreted out of the cell, including, but not limited to, exosomes (microsome), microvesicles (microvesicle), microparticles (microparticles).

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 폐암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 폐암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 폐암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.The term "diagnosis" in the present invention means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, it is meant to determine whether the lung cancer, and the diagnosis in the present invention is also to determine whether the lung cancer diagnostic marker expression and the degree of expression to determine the onset, development and reduction of lung cancer, etc. Include.

상기 세포외소포체는 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 것일 수 있다. 폐암 환자로부터 혈장을 분리하는 방법은 항응고제가 포함된 진공채혈관을 이용해서 5cc정도 채혈 후 원심분리하여 상층액만 회수하는 것이 적합하나 이에 제한되는 것은 아니다.The extracellular vesicles may be isolated from the blood of lung cancer patients. Plasma separation from lung cancer patients using a vacuum blood vessel containing anticoagulant is about 5cc of blood collection and centrifugation to recover only the supernatant, but is not limited thereto.

본 발명은, 혈액으로부터 분리된 세포외소포체에서 폐암진단 유전자 마커를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for detecting a lung cancer diagnostic gene marker in an extracellular vesicle separated from blood.

상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 폐암의 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상세포에 비하여 폐암 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 폐암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 폐암 세포에서 차별발현되는 유전자 또는 단백질로서, EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상의 유전자 또는 단백질 일 수 있다. 바람직하게, 상기 EGFR 유전자는 Exon 19의 결실, L858R 치환 및 T790M 치환에 의해 폐암 세포에서 차별발현되는 것일 수 있다.The diagnostic marker refers to a substance capable of diagnosing lung cancer cells from normal cells, and means a polypeptide or nucleic acid (eg, mRNA, etc.) or lipid which shows an increase or decrease in lung cancer cells compared to normal cells. And organic biomolecules such as glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like. The lung cancer diagnostic marker provided by the present invention is a gene or protein differentially expressed in lung cancer cells compared to normal cells, and may be one or more genes or proteins in the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, and PI3K. . Preferably, the EGFR gene may be differentially expressed in lung cancer cells by deletion of Exon 19, L858R substitution, and T790M substitution.

본 발명의 KRAS 유전자 돌연변이는 K-Ras 단백질의 12 또는 13번째 아미노산인 글리신이 변형된 것이거나 61번째 아미노산인 글루타민이 변형된 것이다.The KRAS gene mutation of the present invention is a modification of glycine, which is the 12th or 13th amino acid of the K-Ras protein, or a glutamine, which is the 61st amino acid.

본 발명의 ALK 유전자는 tyrosine kinase receptor를 코딩하는 유전자로서, 비소세포폐암에서 돌연변이가 발견된다. 상기 유전자 돌연변이 중 염색체 전위가 가장 일반적이며, 이는 ALK (chromosome 2)/EML4 (chromosome 2), ALK/RANBP2 (chromosome 2), ALK/ATIC (chromosome 2), ALK/TFG (chromosome 3), ALK/NPM1 (chromosome 5), ALK/SQSTM1 (chromosome 5), ALK/KIF5B (chromosome 10), ALK/CLTC (chromosome 17), ALK/TPM4 (chromosome 19), 및 ALK/MSN (chromosome X)를 포함하여 여러 종양 유전자의 fusion을 초래한다.The ALK gene of the present invention is a gene encoding a tyrosine kinase receptor, and mutations are found in non-small cell lung cancer. Of these gene mutations, chromosomal translocations are most common, which include ALK (chromosome 2) / EML4 (chromosome 2), ALK / RANBP2 (chromosome 2), ALK / ATIC (chromosome 2), ALK / TFG (chromosome 3), ALK / Several including NPM1 (chromosome 5), ALK / SQSTM1 (chromosome 5), ALK / KIF5B (chromosome 10), ALK / CLTC (chromosome 17), ALK / TPM4 (chromosome 19), and ALK / MSN (chromosome X) Results in fusion of the tumor gene.

본 발명의 ROS1 유전자는 몇 가지 다른 종류의 ROS1 전위가 비소세포폐암에서 발견되었으며, SLC34A2-ROS1,　CD74-ROS1, EZR-ROS1, TPM3-ROS1,　and SDC4-ROS1을 포함한다.The ROS1 gene of the present invention has been found in several other types of ROS1 translocation in non-small cell lung cancer and includes SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, EZR-ROS1, TPM3-ROS1, and SDC4-ROS1.

한편, 질병을 진단하는 진단 마커는 유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용이 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는데 매우 중요한 인자로 작용하는데, 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다.On the other hand, the diagnostic marker for diagnosing a disease is a very important factor in selecting and applying a meaningful diagnostic marker to determine the reliability of the diagnostic result. It means a marker that has high reliability so as to have a high and consistent result even in repeated measurements.

본 발명의 폐암을 진단할 수 있는 상기 마커의 경우, 폐암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 결실, 치환 등이 되는 유전자들로서 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 돌연변이의 수준 차이가 대조군과 비교할 때 유의성 있는 차이를 보이므로 잘못된 결과를 보일 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.In the case of the marker for diagnosing lung cancer of the present invention, the same results are shown in repeated experiments with genes that are directly or indirectly deleted or substituted with the onset of lung cancer. It is a highly reliable marker that shows a significant difference and therefore has little chance of producing an incorrect result. Therefore, the result of diagnosis based on the result obtained by measuring the expression level of the significant diagnostic marker of the present invention can be reasonably reliable.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a lung cancer diagnostic kit comprising the composition.

본 키트는, 검사 대상에게서 돌연변이 유전자의 존재, mRNA 발현 또는 상기 유전자로부터 코딩된 돌연변이 단백질의 발현을 확인함으로써 폐암의 발병 가능성을 진단할 수 있다. 바람직하게, 상기 돌연변이 유전자는 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K로 이루어진 군 중 1종 이상의 유전자일 수 있다.The kit can diagnose the likelihood of developing lung cancer by confirming the presence of a mutant gene, mRNA expression or expression of a mutant protein encoded from the gene in the test subject. Preferably, the mutant gene may be one or more genes from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K.

본 발명의 키트에는 상기 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브와, 상기 유전자로부터 코딩된 돌연변이 단백질을 선택적으로 인지하는 항체가 포함되고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 상기 키트는 프라이머 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. Kits of the present invention include primers or probes capable of detecting the mutant genes, and antibodies that selectively recognize the mutant proteins encoded from the genes, further comprising one or more other component compositions, solutions, suitable for analysis. Or a device may be included. The kit may be a primer kit, a DNA chip kit, a protein chip kit, but is not limited thereto.

구체적인 일예로서, 본 발명에서 EGRF 돌연변이 유전자를 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 EGFR 돌연변이 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소, DNase, 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.As a specific example, the kit for measuring the EGRF mutant gene in the present invention may be a kit containing the essential elements required to perform RT-PCR. RT-PCR kits may include test tubes or other suitable containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases, DNases, inhibitors, sterile water, etc., in addition to each primer pair specific for the EGFR mutant gene. .

또한, 본 발명의 키트는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자를 포함하는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자의 염기서열에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함한다. 본 발명의 마이크로어레이는 본 발명에 따른 EGFR 돌연변이 유전자의 존재 여부를 검출하여 폐암의 발병 가능성을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.In addition, the kit of the present invention may be in the form of a microarray comprising the EGFR mutant gene according to the present invention. The microarray may comprise a DNA or RNA polynucleotide probe. The microarray includes a conventional microarray configuration except that it includes a probe specific for the nucleotide sequence of the EGFR mutant gene according to the present invention. The microarray of the present invention can provide useful information for detecting the presence of EGFR mutant gene according to the present invention to diagnose the possibility of lung cancer.

또한 본 발명은, (a) 혈액으로부터 세포외소포체를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 세포외소포체 DNA를 추출하는 단계; (c) 상기 세포외소포체 DNA의 돌연변이 유전자를 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석한 결과가 돌연변이 유전자를 포함하면 폐암으로 판단하는 단계; 를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention, (a) separating the extracellular vesicles from the blood; (b) extracting the isolated extracellular vesicle DNA; (c) analyzing the mutant gene of the extracellular vesicle DNA; And (d) judging lung cancer if the analyzed result includes the mutant gene; It provides a method of providing information for diagnosing lung cancer.

상기 (a) 단계의 폐암 진단에 사용되는 세포외소포체는 폐암 환자의 혈액의 혈구세포의 연속적인 원심분리(centrifugation) 및 초고속 원심분리(ultracentrifugation)를 통해 분리할 수 있으며, 기존에 혈액에서 세포외소포체를 분리하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.The extracellular vesicles used for the diagnosis of lung cancer in step (a) can be separated by continuous centrifugation and ultra-centrifugation of blood cells in the blood of lung cancer patients, and can be separated from the extracellular blood According to the method for separating the endoplasmic reticulum, but is not limited thereto.

상기 (b) 단계의 세포외소포체는 세포외소포체 용해 버퍼와 단백질분해효소 K를 이용해 추출할 수 있으며, 기존에 혈액에서 세포외소포체 DNA를 추출하는 방법에 따르나, 이에 제한되는 것은 아니다.The extracellular vesicles of step (b) can be extracted using an extracellular vesicle lysis buffer and protease K, and according to the conventional method of extracting extracellular vesicle DNA from blood, but is not limited thereto.

상기 (c) 단계의 DNA는 농도 측정용 Nanodrop 기계를 이용하고, 크기 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The DNA of step (c) is measured using a nanodrop machine for concentration measurement and a bioanalyzer machine for size analysis, but is not limited thereto.

상기 (d) 단계의 돌연변이 유전자 분석은 세포외소포체 DNA, 야생형 유전자 증폭 억제용 PNA 프로브, 형광물질이 들어있는 PCR믹스를 섞어서 PCR 반응 용액을 만든 후 실시간 분석용 PCR 기계인 CFX96에서 40 사이클 동안 반응하여 매 사이클마다 형광 값을 측정, 측정된 형광 값으로 증폭 곡선을 그리고 증폭이 시작되는 사이클 값(Cycle threshold, Ct)을 분석하여 돌연변이 유전자 유무를 분석하는 방법으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다. Mutation gene analysis of the step (d) is a mixture of extracellular vesicle DNA, PNA probe for suppressing wild-type gene amplification, PCR mixture containing a fluorescent material to make a PCR reaction solution and then reacted for 40 cycles in CFX96, a real-time analysis PCR machine By measuring the fluorescence value every cycle, the amplification curve with the measured fluorescence value and the cycle value (Cycle threshold, Ct) to start amplification by analyzing the presence or absence of a mutant gene, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리된 세포외소포체 DNA 유전자 돌연변이를 검출하는 제재를 포함하는 폐암 예후 예측용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for predicting lung cancer prognosis comprising an agent for detecting an extracellular vesicle DNA gene mutation isolated from the blood of a lung cancer patient.

본 발명에서 용어 "예후"란 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등의 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게는 개체의 시료로부터 본 발명의 세포외소포체 DNA의 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K 등 유전자 돌연변이 유무를 확인함으로써 해당 개체의 폐암 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋은지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다.As used herein, the term "prognosis" refers to determining whether a subject relapses, metastases, drug reactivity, resistance, etc. after treatment of cancer. Preferably, by examining the presence or absence of genetic mutations, such as EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2, PI3K, etc. of the extracellular vesicle DNA of the present invention from the sample of the individual, the survival prognosis of the individual in the future It is possible to predict whether or not is good.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the embodiment of the present invention will be described in detail. However, these examples are intended to illustrate the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

[[ 실시예Example ]]

실시예Example 1. 폐암 환자의 혈액에 존재하는 1. present in the blood of lung cancer patients 세포외소포체Extracellular vesicles 분리 및 Separation and 세포외소포체Extracellular vesicles DNA 추출 DNA extraction

혈액에서 혈구세포와 세포 찌꺼기를 제거하기 위해서 1000g에서 10분 동안 원심분리 하여 침전시켰다. 세포와 세포 찌꺼기가 제거된 상층액을 200,000g에서 1시간 동안 초고속 원심분리 하여 세포외소포체를 침전시킨 후 상층액을 제거하고 PBS 버퍼 200ul에 침전물을 풀어주었다. 분리된 세포외소포체의 크기를 나노물질 크기 측정용 zetasizer 기계로 측정하였다. 분리된 세포외소포체 200ul에 세포외소포체 용해 버퍼 200ul와 20mg/ml의 단백질분해효소 K 40ul를 넣고 내용물이 균일해지도록 천천히 섞어주고 70에 10분간 방치하였다. 상기 용해된 세포외소포체를 유리 섬유 컬럼에 옮긴 후 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 세척 버퍼 500ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸으며 이 과정을 2회 반복하였다. 세척버퍼를 완전히 제거하기 위해 상기 컬럼을 12,500g에서 30초간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 증류수 50ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리 하였다. 상기 추출된 세포외소포체 DNA의 농도를 농도 측정용 NanoDrop 기계를 이용하여 측정 하였다. 상기 추출된 세포외소포체 DNA의 크기를 DNA 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정 하였다. (도 2, 4) 세포외소포체 DNA 농도는 1950pg/ul이고, DNA의 크기는 도2,3,4를 비교했을 때 세포외소포체 DNA에서 600bp이상의 큰 DNA가 유리 DNA보다 많이 존재하였다.In order to remove blood cells and cell debris from the blood was precipitated by centrifugation for 10 minutes at 1000g. The supernatant from which the cells and cell debris were removed was precipitated at 200,000 g for 1 hour by ultrafast centrifugation to precipitate extracellular vesicles, and the supernatant was removed and the precipitate was released in 200ul of PBS buffer. The size of the isolated extracellular vesicles was measured by a zetasizer machine for measuring the size of nanomaterials. 200 ul of extracellular vesicles were separated and 200 ul of extracellular vesicle lysis buffer and 20 mg / ml protease K 40ul were mixed slowly to make the contents uniform and left at 70 for 10 minutes. The lysed extracellular vesicles were transferred to a glass fiber column and then centrifuged at 8000 g for 1 minute and the solution discarded. 500 ul of washing buffer was added to the column, and centrifuged at 8000 g for 1 minute, and the solution was discarded. This process was repeated twice. The column was centrifuged at 12,500 g for 30 seconds to completely remove the wash buffer and the solution was discarded. 50ul of distilled water was added to the column and centrifuged for 1 minute at 8000g. The concentration of the extracted extracellular vesicles DNA was measured using a concentration measurement NanoDrop machine. The size of the extracted extracellular vesicle DNA was measured using a Bioanalyzer machine for DNA analysis. (FIGS. 2 and 4) The extracellular vesicle DNA concentration was 1950 pg / ul, and the size of the DNA was greater than 600 bp in the extracellular vesicle DNA than the free DNA.

실시예Example 2. 폐암 환자의 혈액에 존재하는 유리 DNA 추출 2. Extraction of Free DNA in the Blood of Lung Cancer Patients

폐암 환자 혈액에 존재하는 세포외소포체 DNA와의 비교를 위해 하기의 실험을 실시하였다. The following experiment was conducted for comparison with extracellular vesicle DNA present in the blood of lung cancer patients.

혈액에 유리 DNA 추출 버퍼 200ul와 20mg/ml의 단백질분해효소 K 40ul를 넣고 내용물이 균일해지도록 천천히 섞어주고 70에 10분간 방치하였다. 상기 용해된 세포외소포체를 유리 섬유 컬럼에 옮긴 후 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 세척 버퍼 500ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리하고 용액은 버렸으며 이 과정을 2회 반복하였다. 세척버퍼를 완전히 제거하기 위해 상기 컬럼을 12,500g에서 30초간 원심분리하고 용액은 버렸다. 상기 컬럼에 증류수 50ul를 넣고 8000g에서 1분간 원심분리 하였다. 상기 추출된 유리DNA의 농도를 농도 측정용 NanoDrop 기계를 이용하여 측정 하였다. 상기 추출된 유리DNA의 크기를 DNA 분석용 Bioanalyzer 기계를 이용하여 측정 하였다(도 3, 4). 유리 DNA 농도는 850pg/ul이었다.200ul of free DNA extraction buffer and 20mg / ml of protease K 40ul were added to the blood, mixed slowly until the contents were uniform, and left at 70 for 10 minutes. The lysed extracellular vesicles were transferred to a glass fiber column and then centrifuged at 8000 g for 1 minute and the solution discarded. 500 ul of washing buffer was added to the column, and centrifuged at 8000 g for 1 minute, and the solution was discarded. This process was repeated twice. The column was centrifuged at 12,500 g for 30 seconds to completely remove the wash buffer and the solution was discarded. 50ul of distilled water was added to the column and centrifuged for 1 minute at 8000g. The concentration of the extracted free DNA was measured using a concentration measurement NanoDrop machine. The size of the extracted free DNA was measured using a Bioanalyzer machine for DNA analysis (Fig. 3, 4). The free DNA concentration was 850 pg / ul.

실시예Example 3. 3. EGFREGFR 돌연변이 유전자 분석 Mutant Gene Analysis

상기 추출된 세포외소포체 DNA 70ng또는 유리 DNA70ng을 프라이머, 야생형 유전자 증폭 억제용 PNA 프로브, 형광물질이 들어있는 PCR 믹스 (mix)를 섞어서 20ul의 PCR 반응 용액을 만들었다. 실시간 분석용 PCR 기계인 CFX96에서 94 5분 반응 후 94 30 초, 70 20초, 63 30초 조건으로 40 사이클 (cycles) 동안 반응하며 매 사이클마다 형광 값을 측정하여 그래프를 작성하였다. (도 5) 이 때, 94의 열을 가하면 한 개의 DNA가 두 가닥으로 분리되는 denaturation, 이 후 온도를 70정도로 내리면 프라이머와 중합효소가 외가닥 DNA의 특정부위에 결합하고, 합성되는 단계를 거쳐 두 개의 DNA가 된다. 증폭시키려는 상기 추출된 세포외소포체 DNA 또는 유리 DNA의 적은 양을 이용해 엄청난 양으로 늘릴 수 있으며, 측정된 형광 값으로 증폭 곡선을 그리고 증폭이 시작되는 사이클 값 (Cycle threshold, Ct)을 분석하여 돌연변이 유전자 유무를 파악하였다. EGFR 돌연변이 유전자 검사 결과 세포외소포체 DNA는 20 검체중 11 검체가 조직검사 결과와 일치하여 55%의 일치율을 보였고, 유리 DNA는 20개 검체중 6개 검체가 일치하여 30%의 일치율을 보여 혈액에서 세포외소포체 DNA를 이용한 EGFR 돌연변이 유전자 검사가 효율성이 높다는 것이 입증 되었다(도 6, 7). 70 ul of the extracted extracellular vesicle DNA or 70 ng of free DNA was mixed with a primer, a PNA probe for suppressing wild-type gene amplification, and a PCR mix containing a fluorescent material to prepare a 20 ul PCR reaction solution. The CFX96, a real-time analysis PCR machine, reacted for 40 cycles under the conditions of 94 30 seconds, 70 20 seconds, and 63 30 seconds after 94 5 minutes reaction, and a graph was prepared by measuring the fluorescence value every cycle. (Fig. 5) At this time, if 94 DNA is applied, one DNA is separated into two strands, and after the temperature is lowered to about 70, primers and polymerases bind to specific regions of the outer strand DNA, and the two are synthesized. DNA of the dog. The small amount of the extracted extracellular vesicle DNA or free DNA to be amplified can be increased to enormous amounts, and the mutant gene can be analyzed by amplifying curves with the measured fluorescence values and analyzing the cycle threshold (Ct) at which amplification begins. I checked the presence or absence. The EGFR mutant gene test showed that the extracellular vesicle DNA showed 55% agreement with 11 samples out of 20 samples, and the free DNA showed 30% agreement with 6 samples out of 20 samples. Genetic testing of EGFR mutants using extracellular vesicle DNA has proven to be highly efficient (FIGS. 6 and 7).

Claims

delete

(a) centrifuging blood to remove blood cells and debris and separating supernatant;
(b) ultra-centrifuging the supernatant to separate extracellular vesicles having an average size of 5 nm to 11 nm;
(c) extracting the isolated extracellular vesicle DNA;
(d) analyzing the mutant gene of the extracellular vesicle DNA; And
(e) judging lung cancer if the analysis results include a mutant gene; As an information providing method for diagnosing lung cancer,
Gene of step (d) and (e) is one or more genes selected from the group consisting of EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET, HER2 and PI3K providing information for diagnosing lung cancer.

delete

The method of claim 6,
The mutant gene of the step (d) and (e) is characterized in that the EGFR mutant gene
How to provide information for diagnosing lung cancer.

The method of claim 8,
The EGFR mutant gene is any one or more selected from the group consisting of base deletion of exon 19, base substitution of L858R of exon 21 and base substitution of T790M of exon 20
How to provide information for diagnosing lung cancer.

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