KR20180104122A - 면역요법을 향상시키기 위한 히스톤 데아세틸라제 저해제의 용도 - Google Patents

Abstract

항종양 활성도를 향상시키기 위한 클래스 I 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제의 예정된 세포사 단백질 1(PD-1) 저해제의 조합물을 포함하는 조성물이 개시된다. 신장 세포 암종에서 조절 T 세포를 억제시키기 위한 면역요법으로서 이들 조성물을 투여하는 방법이 추가로 개시된다.

Description

면역요법을 향상시키기 위한 히스톤 데아세틸라제 저해제의 용도

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 전문이 참고로 포함된, 2016년 1월 28일자로 출원된 미국 가출원 제62/288,121호에 대한 우선권을 주장한다.

서열 목록의 제출을 위한 지원의 진술

크기가 878바이트(MICROSOFT WINDOWS EXPLORER로 측정된 바와 같음)인, "IURTC_2016-086-02_ST25.txt"라는 명칭의 서열 목록을 함유하는 파일의 컴퓨터 판독 가능한 형태가 명세서에 제공되고, 참고로 본 명세서에 포함된다. 이 서열 목록은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진다.

본 개시내용은 일반적으로 클래스 I 히스톤 데아세틸라제(class I histone deacetylase)(HDAC) 저해제와 예정된 세포사 단백질 1(programmed cell death protein 1: PD-1) 저해제의 조합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가로, 신장 세포 암종에서 조절 T 세포를 억제시키고, 면역요법을 향상시키기 위한 이들 조성물의 용도가 개시된다.

지난 10년 동안, 면역요법은 고형 종양의 치료를 위해서 가장 매력적이고 광범위하게 연구된 접근법 중 하나가 되었다. 그러나, 암 면역요법의 현재 임상 연구는 여전히 매우 제한된 효능을 나타낸다. 암에 대한 면역 관용이 주요 장벽인 것으로 나타났다. 종양 성장 및 기질 확립은 국소 미세환경뿐만 아니라 면역계의 주변 구성성분을 조절하여 다양한 수준의 관용 기전: 면역억제 세포, 예컨대, 조절 T 세포(Treg), 골수 유래된 억제제 세포 및 종양-연관된 대식세포; 면역학적 관문제; 및 순환 사이토카인의 비정상 수준을 유도한다. 이들 면역억제 인자 중에서, Treg는 주요 작용인자 중 하나로서 식별된다. Treg의 수 또는 기능은 통상적으로 암 환자에서 촉진된다. 전임상 데이터는 또한 종양 연관된 항원에 대해서 관용을 유도하는 데 있어서의 Treg의 역할을 시사한다. 보다 중요하게는, 면역요법, 예컨대, 사이토카인 및 백신 자체가 환자에서 Trge 수 또는 기능의 촉진을 유도할 수 있다. 종합하면, Treg를 표적화하는 것이 면역요법의 효능을 개선시킬 수 있다는 강한 증거가 있다.

Treg를 표적화하는 대부분의 현재 전략은 세포-표면 수용체에 결합하는 단클론성 항체 또는 리간드-지향된 독소, CD25 또는 메트로놈(metronomic) 사이클로포스파마이드 치료를 사용한 Treg의 감소를 목표로 한다. 활성화된 T 효과기 세포(Teff) 및 Treg의 보충의 유도를 제거하기 위한 이들 감소 접근법은 아마도 이의 부작용으로 인해서 제한된 임상 이익을 갖는다. 다른 표면 마커를 표적화하는 전략 또한 특이성 문제를 갖는다. Treg 세포내 단백질 발현, 기능 또는 신호전달에 영향을 주기 위해서 더 많은 방법, 예컨대, siRNA 및 miRNA 접근법이 동물에서 시험되었는데, 이것은 통상적으로 가능한 임상 응용에 대한 제한 및 중요한 갭을 갖는다.

추가로, 신장 세포 암(RCC)을 갖는 환자의 치료에서의 최근 발전으로 면역 관문 저해제, 예컨대, 니볼루맙, PD-1 저해제의 사용이 가능해졌다. PD-1/PD-L1 축은 세포독성 T 세포의 항종양 활성도를 감소시키는 작용을 함으로써 종양의 면역 회피 능력에서 중심적인 역할을 한다. RCC에서 비정상적으로 발현되는 것으로 보고된 이러한 면역 관문을 차단하는 것은, 최근에 ccRCC 환자의 30 내지 40%에서 객관적인 반응을 나타내는 것처럼 보였다. III상 임상 시험 결과는, 진행 신장 세포 암종을 갖는 환자에서 항-PD-1 치료제로부터의 확실한 이익을 나타냄으로써 니볼루맙의 승인으로 이어졌다. 치료 기준인 에베로리무스와 비교할 때, 니볼루맙 환자는 제한된 치료 관련 이상 반응을 갖고 전체 생존율이 78% 증가되었다. 그러나, 인상적인 임상 발전에도 불구하고, RCC 및 다수의 다른 고형 종양을 위한 면역요법은 환자의 하위세트에서만 이익이다. 면역 감시로부터의 종양 도피는 RCC를 갖는 환자로부터 종양을 효과적으로 치료하는 데 있어서 주요 장애로 남아있다.

상기 내용을 기초로, 상기 제한이 극복될 수 있도록 Treg의 억제를 표적으로 할 수 있는 대안적인 면역요법을 개발하는 것이 관련 기술 분야에서 요구된다.

본 개시내용은 일반적으로 신장 세포 암종에서 조절 T 세포(Treg)의 억제 및 면역요법의 향상을 위한 클래스 I 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 및 예정된 세포사 단백질 1 (PD-1) 저해제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특별하게는, 일 실시형태에서, 클래스 I HDAC 저해제인 엔티노스타트는 PD-1 저해의 항종양 효과를 향상시킨다.

일 양상에서, 본 개시내용은 클래스 I 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 및 예정된 세포사 단백질 1(PD-1) 저해제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양상에서, 본 개시내용은 조절 T 세포의 억제를 필요로 하는 개체에서 조절 T 세포를 억제시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 개체에게 클래스 I 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제와 예정된 세포사 단백질 1(PD-1) 저해제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시내용은 이의 하기 상세한 설명에 대해서 고려하는 경우 더 양호하게 이해될 것이고, 상기에 제시된 것이 아닌 특징, 양상 및 이점이 명확해질 것이다. 이러한 상세한 설명은 하기 도면을 참고로 한다.
도 1a 내지 1f는 엔티노스타트가 동계 신장 세포 암종 마우스 모델에서 면역요법을 개선시켰음을 나타낸 도면. (도 1a) 실험 시간 라인, 암컷 Balb/c 마우스에게 -8일에 1x10⁴ RENCA-Luc 세포를 정소이식방식으로(orthotopically) 주사하였다. 매주 생물발광 영상화를 이식 후 1주에 시작하였고, 실시예 2의 기간 동안 계속하였다. 치료를 실시예 2의 1일에 시작하였다. (도 1b) 상단: 기준선 생물발광 영상화. 하단: 종점 생물발광 영상화. 종합하면, 이들 영상은 생체내에서 종양 성장의 저해를 나타낸다. (도 1c) 실시예 2의 기간에 걸친 대조군, 엔티노스타트, 항-PD-1 및 엔티노스타트 + 항-PD-1 코호트에서 각각의 마우스의 평균 광휘(radiance)[p/s/㎠/sr]. (도 1D) 각각의 군에 대한 종점 종양의 영상. 실험 1 및 2를 순차적으로 수행하여 결과를 검증하였다. (도 1e) 엔티노스타트 + 항-PD-1 면역요법을 사용하여 종양 크기의 상당한 감소를 나타낸 그램 단위의 종점 종양 중량 (도 1F) 좌측: 10㎎/㎏의 항-PD-1을 사용한 생존율 연구는 대조군 및 항-PD-1 면역요법 단독에 비해서 엔티노스타트 + 항-PD-1로 치료된 마우스의 생존율 곡선이 상당히 이동된 것을 나타낸다. 우측: 20㎎/㎏의 항-PD-1을 사용한 생존율 연구는 대조군 및 엔티노스타트 코호트에 비해서 엔티노스타트 + 항-PD-1에서 추가로 상당히 이동된 것을 나타내고, 추가로 항-PD-1 면역요법의 증가된 투여량은 마우스 생존을 연장시켰다. 결과를 평균 ± SEM(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001)으로 나타내고, 종양 중량 통계치는 웰치스 보정(Welch's correction)과 함께 비대응 t 검정(unpaired t test)을 사용하여 계산하였고; 생존율 통계치는 로그-랭크(Log-rank)(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 검정을 사용하여 계산하였다.
도 2a 및 2b는 엔티노스타트가 동계 ccRCC 마우스 모델, RENCA에서 T 세포 및 종양 연관된 대식세포 반응을 조절하였음을 나타낸 도면. 혈액 및 종양 샘플을 실시예 2의 마지막에 마우스로부터 단리하고, 유세포 분석법 분석을 위해서 가공하였다. (도 2a) 좌측: 혈액의 FACS 분석은 CD4 및 FoxP3 수준에 대한 비히클 및 조합물 치료의 효과를 나타낸다. 우측: 대조군과 비교할 때, 조합물 코호트에서 T 조절 세포에 대한 기능성 전사 인자인 FoxP3의 감소와 함께, 조절 T 세포의 존재의 상당한 증가를 나타낸 평균 형광 강도(MFI)로서 나타낸 혈액 중의 T 조절 세포 존재 및 단백질 발현의 정량분석 (도 2b) 좌측: 대조군 또는 엔티노스타트 치료 이후의 RENCA 마우스로부터의 종양-세포 현탁물의 FACS 분석 우측: T 조절 세포에 대한 기능성 전사 인자인 FoxP3의 상당한 감소를 갖는 대조군에 비해서 조합물 코호트에서 조절 T 세포의 존재의 약간의 증가를 나타낸 평균 형광 강도(MFI)로서 나타낸 TME 중의 T 조절 세포 존재 및 단백질 발현의 정량분석.
도 2c는 TME 내의 CD8⁺ T 세포 침윤물의 정량적 FACS 분석을 도시한 도면. 결과는 CD8⁺ 침윤 및 CD8⁺:T 조절 세포비에서의 상당한 증가를 나타낸다.
도 2d는 대식세포 침윤의 상당한 감소를 나타내는 TME 내로의 종양 연관된 대식세포 침윤의 정량적 FACS 분석 결과를 도시하는데, 이는 HDACi가 선천적인 면역계에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다. n = 3 내지 5개 종양/패널당 코호트당 혈액 샘플. 결과를 평균 ± SEM(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001)으로 나타내고, 통계치는 웰치스 보정과 함께 비대응 t 검정을 사용하여 계산하였다.
도 3a 내지 도 3f는 엔티노스타트가 RENCA 종양으로부터 수집된 MDSC의 면역억제 능력을 저해하였음을 나타낸 도면. (도 3a) 우측: 엔티노스타트, 항-PD-1 면역요법 또는 조합물로의 치료 후 RENCA 종양으로부터의 종양-세포 현탁물의 FACS 분석. 좌측: 대조군과 비교할 때 조합물 코호트에서 M-MDSC 및 G-MDSC 둘 모두의 존재의 상당한 증가를 나타낸 CD45⁺CD11b⁺ 세포의 총 집단 중의 Ly6C⁺ 및 Ly6G⁺ 세포의 백분율로서 표현된 TME 내의 단핵구 및 과립구 MDSC 침윤물의 정량적 분석(n = 3 내지 5개 종양). (도 3b) G-MDSC의 대조군에 비해서 조합물에서 상당한 감소를 나타내고, 대조군에 비해서 조합물에서 M-MDSC의 상당한 증가를 나타낸 혈액 중의 G-MDSC 및 M-MDSC 존재의 정량적 FACS 분석(n = 3 내지 5개 혈액 샘플). (도 3c 및 3d) TME로부터 단리된 G-MDSC 및 M-MDSC 세포를 CFSE 태깅된 CD8⁺ T 세포와 함께 16 내지 18시간 동안 공배양하고, 그 시간에 이것을 수집하고, CD8 및 그랜자임 B 항체로 염색하고, T 세포 증식에 대해서 FACS 분석에 적용하였다. 결과는, 생체내에서 엔티노스타트로 치료되는 경우 M-MDSC 억제 능력의 상당한 손상을 나타낸다(n = 3 내지 5개 종양)(도 3c). 세포를 수거하고, 이미 기술된 바와 같이 공배양하였고, 결과는 생체내에서 엔티노스타트로 치료되는 경우 G-MDSC 억제 능력의 상당한 저해를 나타낸다(n = 3 내지 5개 종양)(도 3d). (도 3e) 대조군 치료된 코호트, 엔티노스타트 치료된 코호트, 또는 조합물 치료된 코호트로부터의 MDSC와 공배양된 T 세포로부터의 세포독성 CD8⁺ 활성 단백질 그랜자임 B의 FACS 분석 (도 3f) FACS 분석의 정량적 표현은 엔티노스타트 치료된 마우스 및 조합물 치료된 마우스로부터의 MDSC는 대조군보다 그랜자임 B를 통해서 더 약한 CD8⁺ T 세포 활성화의 저해 능력을 가졌다. 결과를 평균 ± SEM(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001)으로 나타내고, 통계치는 웰치스 보정과 함께 비대응 t 검정을 사용하여 계산하였다.
도 4a 내지 도 4e는 엔티노스타트가 MDSC-유사 세포주 J774M의 저해 능력을 감소시켰다는 것을 나타낸다. (도 4a) J774M 세포주의 특징적인 FACS 분석은 CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺ 세포 중에서, 세포 중 대략 90%가 Ly6G⁺ G-MDSC-유사 세포이고, 10%가 Ly6C⁺ M-MDSC-유사 세포임을 나타내었으며, 이들은 TME에서 전형적으로 인지되는 것을 대표한다. J774M 세포를 엔티노스타트로 시험관내에서 24시간 동안 처리하고, 그 다음 미리-활성화된 CD8⁺ T 세포와 68 내지 72시간 동안 공배양하였다. (도 4b) 공배양 68 내지 72시간에서 T 세포의 대표적인 영상(축적 막대: 400um). (도 4c) 1:1의 비에서 J77M 세포와 함께 인큐베이션된 게이팅형 CD8⁺ T 세포의 CFSE 형광 히스토그램. J774M 세포를 증가하는 농도 - 우측으로부터 좌측으로: 대조군(미처리), 0.01uM, 0.05uM, 0.25uM, 0.37uM, 0.5uM의 엔티노스타트로 처리하였다. (도 4d) 도 4b의 정량적 표현; 막대는 증식 중인 CD8⁺ T 세포의 평균 백분율을 나타낸다(n = 3개의 기술적인 반복물). 이 실험을 독립적으로 3회 반복하였다. (도 4e) 정량적 RT-PCR 분석은 J774M 세포를 엔티노스타트로 처리하는 경우 주요 MDSC 기능성 조절인자 아르기나제-1의 상당한 감소를 나타낸다. (도 4f) 엔티노스타트 치료 48시간 후 J774M 세포 증식 또는 생존력의 분석. (도 4g) J774M 세포를 엔티노스타트로 치료하는 경우 iNOS의 배수 변화를 도시한 정량적 분석. 결과를 평균 ± SEM(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001)으로 나타내고, 통계치는 웰치스 보정과 함께 비대응 t 검정을 사용하여 계산하였다.
도 5a 내지 도 5e는 엔티노스타트로의 치료가 RENCA 종양에서 발견되는 고도로 면역억제성인 환경을 상당히 변경시켰음을 도시한 도면. 실시예 2의 마지막에 마우스로부터 수집된 종양 및 혈액 샘플을 프로테옴 프로파일러(Proteome Profiler) 마우스 XL 사이토카인 어레이 키트(Ary028)를 사용하여 가공 및 조사하였다. (도 5a) 대조군 치료 코호트 및 엔티노스타트 치료 코호트(n = 2개 종양/코호트 및 종양당 3개의 데이터 지점)에서 종양 용해물로부터의 마우스 사이토카인/케모카인 어레이 결과. 종양 미세환경 분석은 종양 억제성 환경의 상당한 변경을 제공하였다. (도 5b) 엔티노스타트의 존재 하에서 상당히 하향조절된 MDSC 연관 또는 프로-종양(pro-tumor) 사이토카인/케모카인의 정량분석. (도 5c) 엔티노스타트 치료의 존재 하에서 상당히 상향조절된 항-종양 케모카인/사이토카인의 정량분석. (도 5d) 좌측: 대조군 치료 마우스 및 엔티노스타트 치료 마우스의 혈청 샘플로부터의 Ary028 어레이 결과(n = 2개 종양/코호트 및 종양당 3개의 데이터 지점). 엔티노스타트 치료 단독은 도 5d의 우측 패널에 나타낸 바와 같이 MDSC 연관 사이토카인 및 케모카인, 및 프로-종양 사이토카인 및 케모카인 중 다수를 저해하였다. (도 5e) 좌측: 대조군 코호트와 조합물 코호트(n = 2개 종양/코호트 및 종양당 3개의 데이터 지점)를 비교한 어레이 결과. 조합물 치료는 도 5E의 우측 패널에 도시된 바와 같이 다수의 항-종양 연관된 케모카인 및 사이토카인을 상당히 상향조절하였다. 결과를 평균 ± SEM(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001)으로 나타내고, 통계치는 웰치스 보정과 함께 다중 t 검정을 사용하여 계산하고, 벤자미니(Benjamini), 크리거(Krieger) 및 예쿠틸리(Yekutieli)의 2-단계 선형 설정 절차를 사용하여 Q는 1%인 것을 결정되었다.
도 6은 ccRCC에 대한 선천적 및 적응성 면역 반응인자의 엔티노스타트 변경의 개략적인 표현을 도시한 도면. 엔티노스타트가 T 조절 세포 활성도를 저해하는 방법의 모델이 포함된다. 추가로 엔티노스타트가 아르기나제1을 하향조절하고, 이에 따라서 L-아르기닌의 풀을 자유롭게 함으로써 MDSC 기능을 저해한다(이것이 세포독성 T 세포 활성화를 위해서 요구됨)는 공준된 기전이 제시된다.

달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 및 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 하기에 기술된다.

일반적으로, 본 개시내용은 클래스 I HDAC 저해제와 PD-1 저해제의 조합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. HDAC는 세포 주기 진행, 증식 및 아폽토시스(apoptosis)에 관여되는 유전자의 전사 조절을 매개함으로써 종양원성 형질전환에 관여되는 것으로 밝혀져 있다. HDAC 저해제는 현재 암 치료를 위해서 개발되고 있고, 상이한 종양에서 항종양 활성을 나타내었다. HDAC는 상이한 표적 및 세포하위 위치를 갖는 4종의 상이한 클래스를 특징으로 하였다. 클래스 I HDAC 저해제는 STAT3 아세틸화를 유도하고, 그 결과 Treg에서 FOXP3 전사를 감소시킨다는 것이 최근 발견되었다. 이러한 주요 전사 인자의 저해는 더 약한 기능의 Treg로 이어지고, 항-종양 면역 반응을 촉발시킨다.

본 개시내용의 조성물에 사용하에 적합한 한 선택적인 클래스 I HDAC 저해제는 합성 벤즈아마이드, 엔티노스타트(피리딘-3-일메틸 N-[[4-[(2-아미노페닐)카바모일]페닐]메틸]카바메이트)를 포함한다. 합성 베나마이드인 엔티노스타트는 몇몇 종양 모델에서 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 항종양 활성도를 갖는다. 특히, 엔티노스타트는 종양 미세환경과 숙주 면역 감시 간의 동적 상호작용을 파괴하는 것으로 제시되어 있다. 종양 조직은 전통적으로 다수의 면역-억제 인자 및 화학유인물질 둘 모두를 방출함으로써 면역 감시를 회피하여 종양-촉진 염증을 가능하게 한다. 클래스 I HDAC 저해제로의 HDAC 치료는 종양의 면역원성을 증가시키는 것으로 나타났고, 이는 하나의 면역-억제 기전에 대응한다. 다른 적합한 클래스 I HDAC 저해제는, 예를 들어, 보리노스타트(N-하이드록시-N'-페닐옥탄다이아마이드) 및 트라이코스타틴 A(TSA) ((2E,4E,6R)-7-[4-(다이메틸아미노)페닐]-N-하이드록시-4,6-다이메틸-7-옥소-2,4-헵타다이엔아마이드), 다시노스타트(LAQ824라고도 공지됨) ((E)-3-(4-(((2-(1H-인돌-3-일)에틸)(2-하이드록시에틸)아미노)메틸)페닐)-N-하이드록시아크릴아마이드), 부티레이트, 발프로산(VPA), 벨리노스타트(PXD101이라고도 공지됨) ((2E)-N-하이드록시-3-[3-(페닐설파모일)페닐]프로프-2-엔아마이드), 파노비노스타트(LBH589라고도 공지됨) ((2E)-N-하이드록시-3-[4-({[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에틸]아미노}메틸)페닐]아크릴아마이드), 피록사마이드, SK-7041(4-(다이메틸아미노)-N-[[4-[(E)-3-(하이드록시아미노)-3-옥소프로프-1-엔일]페닐]메틸]벤즈아마이드), SK-7068(N-[[4-[3-(하이드록시아미노)-3-옥소프로프-1-엔일]페닐]메틸]-4-피롤리딘-1-일벤즈아마이드), 트라폭신 A(사이클로((S)-감마-옥소-L-알파-아미노옥시란옥탄오일-L-페닐알라닐-L-페닐알라닐-D-2-피페리딘카보닐)), 환식 테트라펩타이드 하이드록삼산 유사체(CHAP), 데푸데신(4,5:8,9-다이안하이드로-1,2,6,7,11-펜타데옥시-D-트레오-D-이도-운데카-1,6-다이에니톨), 모세티노스타트(MGCD-0103이라고도 공지됨), (N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸] 벤즈아마이드) 등 및 이들의 조합물을 포함한다.

클래스 I HDAC 저해제의 적합한 투여량은 예를 들어, 개체의 연령 및 체중, 치료를 필요로 하는 적어도 하나의 정확한 병태, 병태의 중증도, 조성물의 본성, 투여 경로 및 이들의 조합을 비롯한 다수의 인자에 좌우될 것이다. 궁극적으로, 적합한 투여량은 관련 기술 분야의 통상의 기술자, 예컨대, 예를 들어, 의사, 수의사, 과학자 및 다른 의학 및 연구 전문가에 의해서 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 낮은 투여량에서 시작하여, 이것을 목적하는 치료 결과 또는 결과물에 도달할 때까지 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 많은 투여량에서 시작하여, 이것을 목적하는 치료 결과 또는 결과물을 달성하는 데 필요한 최소 투여량까지 감소시킬 수 있다. 클래스 I HDAC 저해제의 예시적인 적합한 투여량은 약 0.5μM을 비롯하여 약 0.5μM 내지 약 2μM을 포함할 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 개체는 약 5㎎/㎏의 클래스 I HDAC 저해제의 투여량으로 PD-1 저해제와 조합하여 클래스 I HDAC 저해제가 투여될 수 있다.

조성물을 일반적으로 클래스 I HDAC 저해제와 조합하여 PD-1 저해제를 포함한다. PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하고, T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 수용체이다. PD-1은 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 면역 관문으로서 기능하는 PD-1은 T-세포의 활성화를 예방함으로써 면역계를 하향조절하는 데 중요한 역할을 하고, 이것은 결국 자가면역을 감소시키고, 자가-관용을 촉진시킨다. PD-1의 저해 효과는 Trge에서 아폽토시스를 동시에 감소시키면서, 림프절 내의 항원 특이적 T-세포에서 아폽토시스(예정된 세포사)를 촉진시키는 이중 기준을 통해서 성취된다. 본 개시내용의 조성물에서 사용하기에 적합한 PD-1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 등, PD-L1 저해제, 예컨대, 아테졸리주맙, 및 이들의 조합물을 포함한다.

PD-1 저해제의 적합한 투여량은 예를 들어, 개체의 연령 및 체중, 치료를 필요로 하는 적어도 하나의 정확한 병태, 병태의 중증도, 조성물의 본성, 투여 경로 및 이들의 조합을 비롯한 다수의 인자에 좌우될 것이다. 궁극적으로, 적합한 투여량은 관련 기술 분야의 통상의 기술자, 예컨대, 예를 들어, 의사, 수의사, 과학자 및 다른 의학 및 연구 전문가에 의해서 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 낮은 투여량에서 시작하여, 이것을 목적하는 치료 결과 또는 결과물에 도달할 때까지 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 많은 투여량에서 시작하여, 이것을 목적하는 치료 결과 또는 결과물을 달성하는 데 필요한 최소 투여량까지 감소시킬 수 있다. PD-1 저해제의 예시적인 하나의 적합한 투여량은 약 1.0μM을 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, 개체는 약 10㎎/㎏의 PD-1 저해제의 투여량으로 클래스 I HDAC 저해제와 조합하여 PD-1 저해제가 투여될 수 있다.

클래스 I HDAC 저해제와 PD-1 저해제의 조합물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 구 "약제학적으로 허용 가능한"은 적절한 의학적 판단의 범주 내에서, 타당한 유익/유해비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제점 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜서 사용하기에 적합한 리간드, 물질, 제형 및/또는 투여형을 지칭한다. 구 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 활성 화합물을 신체의 하나의 기관 또는 부분으로부터 신체의 또 다른 기관 또는 부분으로 운반 또는 이송시키는 데 관여하는 약제학적으로 허용 가능한 물질, 제형 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 각각의 담체는 조성물의 다른 구성성분(예를 들어, 클래스 I HDAC 저해제, PD-1 저해제)과 상용성이고, 개체에 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 재구성 및 투여될 수 있는 동결건조된 조성물이 또한 본 개시내용의 범주에 속한다.

약제학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어, 부형제, 비히클, 희석제 및 이들의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 조성물이 경구로 투여되려는 경우, 이것은 정제, 캡슐, 과립, 분말 또는 시럽으로 제형화될 수 있거나; 또는 비경구 투여를 위해서는, 이것은 주사제(근육내, 피하, 척수내, 척추강내, 심실내, 정맥내, 유리체내, 망막하, 결막하), 점적 주입 제제 또는 좌제로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 종래의 수단에 의해서 의해서 제조될 수 있고, 바람직한 경우, 활성 화합물(즉, 클래스 I HDAC 저해제, PD-1 저해제)은 임의의 종래의 첨가제, 예컨대, 부형제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 교정제, 가용화제, 현탁 보조제, 유화제, 코팅제 또는 이들의 조합물과 함께 혼합될 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 질환, 장애 및 병태를 개선, 중재, 예방 및 치료하기 위한 추가적인 공지된 치료제, 약물, 합성 화합물의 전구약물로의 변형물 등을 추가로 포함할 수 있다고 이해되어야 한다.

또 다른 양상에서, 본 개시내용은 일반적으로 Treg를 억제하고, 항종양 효과를 향상시키기 위한 조성물의 투여에 관한 것이다. 따라서, 본 개시 내용의 방법에 사용되는 클래스 I HDAC 저해제와 PD-1 저해제의 조합물을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 개체의 하위세트에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이를 필요로 하는 개체"는 암, 특히 신장 세포 암종, 유방암, 난소암, 흑색종 등의 위험이 있거나 또는 이를 갖는 개체를 지칭한다. 추가로, "이를 필요로 하는 개체"는 또한 본 명세서에서 암을 갖는 것으로서 의학 전문가에 의해서 진단되거나 또는 이러한 위험이 있는 개체를 지칭하도록 본 명세서에서 사용된다. 이와 같이, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 이들 실시형태에서 일반적인 집단 중 모두가 이 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 것은 아니도록 일반적인 집단의 하위세트에 관한 것이다. 상기를 기초로, 본 개시내용의 방법 실시형태 중 일부는 식별된 개체의 특정 하위세트 또는 하위부류(즉, 본 명세서에 언급된 하나 이상의 특정 병태를 다루는 데 있어서 도움을 "필요로 하는" 개체의 하위세트 또는 하위부류)에 관한 것이며, 개체 모두가 본 명세서에 기술된 바와 같은 개체의 하위세트 또는 하위부류 내에 포함될 것은 아니다. 특히, 필요로 하는 개체는 인간이다. 필요로 하는 개체는 또한 예를 들어, 동물, 예컨대, 예를 들어, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 소, 돼지 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 연구 및/또는 애완 동물의 다른 유형일 수 있다.

관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 조성물이 시간 기간에 걸쳐서 단일 투여량 또는 다회의 투여량으로 투여될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 조성물은 3일, 5일, 7일 또는 그 초과의 기간에 걸쳐서 매일, 격일로, 3일마다, 매주 등으로 투여될 수 있다. 추가로, 조성물은 1일 1회 또는 1일 2회, 1일 3회 또는 그 초과의 횟수를 비롯한 1일 1회 초과로 투여될 수 있다.

본 개시내용의 이들 및 다른 실시형태의 다양한 기능 및 이점은 하기에 제시된 실시예로부터 보다 완전히 이해될 것이다. 실시예는 본 개시내용의 이익을 예시하도록 의도되지만, 본 개시내용의 완전한 범주를 예시하지 않는다.

실시예

실시예 1

본 실시예에서, 항-PD-1 항체 치료와 조합된 엔티노스타트 치료의 면역조절 능력을 분석하였다.

물질 및 방법

세포주: 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(국립 암 연구소(National Cancer Institute))로부터 구입한 RENCA-Luc 뮤린 신장 세포 암종 세포주에 필리 실험실(Pili laboratory)에서 루시퍼라제 리포터를 안정하게 형질주입시켰다. 세포를 10% 우태아 혈청(코닝(Corning)) 및 1% Pen/Strep(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 갖는 RPMI 1640(코닝)을 사용하여 배양하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 유지되는 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 75 내지 80% 컨플루언트 세포를 Balb/c 마우스의 신장 내로의 정소이식 주사를 위해서 0.25% 트립신(코닝)을 사용하여 수거하고, 1:1비의 마트리겔(MATRIGEL)(등록상표)(코닝) 및 DPBS(깁코(Gibco)) 중에 현탁하였다.

J774M 세포주 - 조지아 암 센터(Georgia Cancer Center)에 의한 기부/배양 방법

J774M 세포주를 10% 우태아 혈청(코닝) 및 1% Pen/Strep(라이프 테크놀로지스)을 갖는 DMEM(코닝) 배지를 사용하여 배양하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션시켰다. 70 내지 80% 컨플루언트 세포를 세포 스크래퍼를 사용하여 수거하고, ATCC 가이드라인을 통해서 모 세포주에 대해서 제안된 바와 같이 계대시켰다.

종양 현탁물 및 비장세포 준비: 살아있는 종양 단편을 종양으로부터 단리하고, 작은 조각으로 절단하고, 마우스 종양 해리 키트(밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec) - 130-096-730)로부터의 효소 칵테일 용액으로 소화시켰다. 종양을 효소 칵테일과 함께 30분 동안 37℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 효소 반응을 PBS를 사용하여 정지시키고, 세포를 300g에서, 4℃에서 7분 동안 회전시키고, PBS 중에서 재현탁하고, 70um 세포 여과기를 통해서 으깼다. 이들 종양으로부터의 세포를 유세포 분석법 분석을 위해서 사용하거나 또는 기능 분석을 위해서 추가로 가공 및 사용하였다.

T 세포 단리 및 활성화: 전체 비장을 미경험 마우스로부터 수거하고, 70㎛ 여과기를 통해서 으깨면서 통과시켰다. 이어서, 세포를 세척하고, RBC 용해 완충제(어피메트릭스(Affymetrix) 00-4333-57)로 용해시키고, 10% FBS, Pen(100단위/㎖)-Strep(100㎎/㎖), 1mM 소듐 피루베이트, 100mM 비필수 아미노산, 2mM L-글루타민, 55μM BME를 갖는 RPMI 배지 중에서, 항-CD3(이바이오사이언시스(eBioscience) 16-0031-85) 및 항-CD28(이바이오사이언시스 5012503)과 함께 대략 24시간 동안 배양하였다. 이어서, CD8⁺ T 세포를 밀테니이 바이오테크로부터의 CD8a⁺ T 세포 단리 키트(130-104-075)를 사용하여 단리하고, 제조사의 프로토콜에 따라서 CFSE(NC9759757)로 염색하고, 하기에 기술된 바와 같이 MDSC와 함께 공배양하였다.

MDSC 단리: MDSC를 밀테니이 바이오테크의 골수 유래된 억제제 세포 단리 키트(130-094-538)를 사용하여 각각의 군의 RENCA 종양으로부터 단리하고, 연속 희석된 농축물 중에서 단리된 CD8⁺ T 세포와 함께 공배양하였다.

T 세포 억제 검정: T 세포(1x10⁵; CD8a⁺ T 세포 단리 키트로 단리됨; 밀테니이 바이오테크)를 16 내지 18시간 동안 RENCA 종양으로부터 단리된 다양한 수의 G-MDSC 또는 M-MDSC를 갖는 플레이트에서 배양하였다. 열거된 방법으로 단리된 T 세포를 엔티노스타트 처리된 J774M 세포와 함께 68 내지 72시간 동안 공배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고, 염색하고, FACS 분석을 통해서 분석하였다.

생체내 종양 성장(RENCA): 모든 절차는 로즈웰 파크 캔서 인스티튜트(Roswell Park Cancer Institute), 인디안 유니버시티 스쿨 오브 메디슨(Indiana University School of Medicine)에서 실험 동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에 따라서 그리고 실험 동물의 케어 및 사용 가이드라인(Care and Use of Laboratory Animal guidelines)을 위한 NIH 가이드에 따라서 엄격하게 수행 및 승인되었다.

암컷 5- 내지 6주령의 Balb/c 마우스(챨스 리버(Charles Rivers))를 12/12시간 낮/밤 스케줄을 갖는 온도 제어 공간에 넣고, 자유식으로 음식을 공급하였다. 70 내지 80% 컨플루언트 RENCA-Luc 세포를 0.25% 트립신(코닝)을 사용하여 수거하고, 1:1비의 마트리겔(코닝) 및 HBSS(깁코) 중에 현탁하고, 1x10⁴ 세포를 함유하는 10㎕를 신피막 하에 주사하였다. 주사 1주 후 예비 생물발광 영상화 이후에, 마우스를 4개의 군: 대조군, 엔티노스타트, 항-PD-1 또는 조합물로 무작위화하였다. 마우스 종양을 생물발광 IVIS 영상화 기계를 사용하여 순차적으로 영상화하였다.

엔티노스타트 및 항-PD-1 치료: 치료군에서의 마우스를 엔티노스타트 5㎎/㎏ 5일/주로 경구로, 바이오엑스셀(BioXCell)로부터 I.P. 10㎎/㎏ 또는 20㎎/㎏(제2 생존율 연구) 또는 조합물 치료 요법으로 치료하였다.

세포 염색 및 유세포 분석법: 비장세포, 종양 세포 현탁물, 및 말초 혈액 세포를 세척하고, Fc 블록(Block)(항-마우스 CD16/32 mAb; 비디 바이오사이언시스)으로 4℃에서 15분 동안 차단하고, 표면 마커: 바이오레전드(Biolegend), 이바이오사이언시스 또는 비디 바이오사이언시스로부터의 구입된 CD45(클론 30-F11), CD11b(클론 M1/70), Gr1(클론 RB6-8C5), Ly6C(클론 AL-21), Ly6G(클론 1A8), F480(클론 BM8), CD8a(클론 53-6.7), CD4(클론 RM4-5) 항체에 대한 형광 접합된 항체로 염색하였다. 이어서, 세포를 고정/관통 완충제(이바이오사이언시스) 중에서 고정시키고, FoxP3(NRRF-30) 및 그랜자임 B(클론 GB11)를 비롯한 세포내 단백질에 대한 항체로 염색하였다. 항체를 비디 바이오사이언시스, 바이오레전드 및 알앤디 시스템즈로부터 구입하고, 염색에 사용하였다. 염색된 세포 및 아이소타입-대조군-염색된 세포를 LSR4 또는 포테사(Fortessa) 유세포 분석기(비디 바이오사이언시스) 상에서 분석하였다. 플로우조(FlowJo)(플로우조 엘엘씨(FlowJo LLC)) 및/또는 모드핏(ModFit) LT 4.1 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

프로테옴 프로파일: 종양 조직을 프로테아제 저해제를 함유하는 PBS 중에서 균질화시켰다. 균질화 후, 트라이톤(Triton) X-100을 1%의 최종 농도로 첨가하고, -80℃에서 동결시키고, 해동시키고, 10,000g로서 5분 동안 원심분리하고, 제조사의 프로토콜에 따라서 정량분석 및 검정하였다. 혈액 샘플을 각각의 코호트의 마우스로부터 수집하고, 2시간 동안 실온에서 응고시키고, 2000g에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈청 샘플을 제조사의 프로토콜에 따라서 실시되는 분석 시까지 -80℃에서 동결시켰다. 모든 샘플을 알앤디 시스템즈 마우스 XL 사이토카인 어레이 키트(Ary028) 상에서 가공 및 처리하였다.

정량분석 실시간 PCR: mRNA를 표준 트라이졸(Trizol) 프로토콜을 사용하여 ± 엔티노스타트로 처리된 J774M 세포로부터 추출하였다. RNA 농도 및 순도는 시너지 하이 멀티-모드 리더(Synergy Hi Multi-Mode reader)를 사용하여 A260/280비를 측정함으로써 결정하였다. 아이스크립트 키트(iScript kit)(바이오-라드(Bio-Rad))를 사용하여 cDNA를 준비하고, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 7900HT 신속 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qPCR을 수행하였다. 서열 검출 시스템 소프트웨어(Sequence Detection Systems software) v2.3을 사용하여 주기 역치(cycle threshold: Ct) 값을 식별하고, 유전자 발현 곡선을 생성시켰다. 데이터를 Gapdh 발현에 정규화시키고, 배수 변화를 계산하였다. 표적 유전자를 위해서 사용된 프라이머는 다음과 같았다: Gapdh_정방향 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3', Gapdh_역방향 5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3'(서열번호 1), 아르기나제 1_정방향 5'-GTGAAGAACCCACGGTCTGT-3'(서열번호 2), 및 아르기나제 1_역방향 5'-CTGGTTGTCAGGGGAGTGTT-3'(서열번호 3).

결과:

엔티노스타트는 뮤린 신장 세포 암종 모델에서 PD-1 저해의 항종양 효과를 향상시켰다. 이전 연구는, 엔티노스타트 치료가 T 조절 세포를 비롯하여, 종양 미세 환경에 대한 직접적인 영향을 통해서 면역요법 치료를 향상시킬 가능성을 갖는다는 것을 나타내었다. 추가로, 엔티노스타트는 RENCA 모델에서 STAT3 아세틸화에 의해서 T 조절 세포 기능을 조절함으로써 IL-2 면역요법을 향상시켰다는 것을 이미 보여주었다. 선천적인 면역계에 대한 엔티노스타트의 면역조절 가능성을 조사하기 위해서, 엔티노스타트를 RENCA 모델에서 마우스 관문 저해제 항-PD-1 항체와 조합하여 사용하였다. 항-PD-1 면역 관문 저해제의 사용은 종양 미세환경(TME) 전체에 영향을 미치며, PD-L1 발현은 종양 및 선천적인 면역 세포 둘 모두 상에 제시된다. RENCA 모델은 항-종양 T 세포 활성도의 억제에서 주요 인자인 면역억제성 MDSC를 상당히 유인하는 것으로 나타났다. Balb/c 마우스에 정소이식방식으로 루시퍼린 태깅된 RENCA 세포를 접종하였다.

종양 보유 마우스를 생물발광 판독치를 기반으로 무작위화하고, 4개의 군: 대조군, 엔티노스타트(5㎎/㎏), 항-PD-1(10㎎/㎏), 또는 엔티노스타트와 항-PD-1의 조합물로 분리하였다. 엔티노스타트 단독으로의 치료는 종양 성장의 상당한 저해(52.6% 성장 저해; 엔티노스타트 대 대조군: p = 0.0015)를 초래한 반면, 항-PD-1 단독은 종양 성장을 단지 적당하게 감소시켰다(35.05% 성장 저해; 항-PD-1 대 대조군: p = 0.0768)(도 1a 내지 도 1e). 추가로, 엔티노스타트와 항-PD-1 치료제의 조합물은 대조군 및 단일 치료군 각각에 비해서 종양 성장 저해를 향상시켰다(83.3% 감소; 조합물 대 비히클: p < 0.0001; 조합물 대 엔티노스타트: p = 0.0115; 조합물 대 항-PD-1: p = 0.0076)(도 1a 내지 도 1e).

임상적으로, 항-PD-1 면역요법은 RCC를 갖는 환자의 최대 41%에서 질환의 연장된 안정화를 나타내었다. 이전 연구에 따라서, 엔티노스타트와 항-PD-1 항체 조합물의 생존율 향상 효과를 분석하였다. 상기에 기술된 치료 농도를 사용하여, 마우스의 생존율의 상당한 증가가 관찰되었다. 조합물 치료는 생존율의 상당한 증가를 초래하였다(조합물 대 항-PD-1: p = 0.0012; 조합물 대 대조군: p = 0.0009)(도 1f). 다음으로 항-PD-1 항체 치료제의 용량이 RENCA 종양 모델의 반응을 추가로 향상시킬 것인지의 여부를 조사하였다. 결과는 대조군 및 엔티노스타트 군과 비교할 때 항-PD-1 군에서의 연장된 생존율 및 조합물 치료된 코호트에서의 향상된 효과를 나타내었다(조합물 대 대조군: p = 0.0471; 조합물 대 엔티노스타트: p = 0.0372) (도 1f). 이들 연구 결과는, 엔티노스타트와 항-PD-1 항체 면역요법의 조합물이 뮤린 ccRCC 모델 RENCA에서 생존율을 촉진시킬 수 있다는 것을 시사한다.

향상된 항-PD-1 면역요법은 증가된 항종양 면역 반응 및 감소된 면역억제 세포 집단의 존재와 연관된다. PD/L-1 축은 활성화된 T 세포 아폽토시스의 촉진을 통해서 면역 감시의 종양 회피를 돕는 데 중요한 역할을 한다. 추가로, HDAC 저해(HDACi) 치료제는 Treg 세포 활성도를 감소시키고, CD8 T 세포 침윤을 향상시킴으로써 종양 미세환경을 변경시키는 것으로 나타났다. 조합물 치료로부터 생성된 종양 성장의 저해가 면역 반응 향상과 연관되었는지의 여부를 이해하기 위해서, 순환 및 종양 침윤 면역 집단을 조사하였다. 종점 혈액 샘플 및 종양 샘플을 본 실시예의 각각의 팔에서 마우스로부터 수집하고, 면역형광 염색 및 FACS 분석에 적용하였다. 증가된 Treg, CD4⁺FoxP3⁺, 혈액 중에서의 존재 및 TME에서의 유의한 차이 없음이 관찰되었다. 그러나, 이미 나타난 바와 같이, HDAC 저해 치료제는 MFI(평균 형광 강도)가 나타낸 바와 같이, 순환 CD4⁺FoxP3⁺ 세포 하위유형에서 FoxP3의 단백질 수준을 상당히 감소시켰다. 조합물 군은 FoxP3 단백질 수준의 감소를 또한 나타내면서, 혈액 샘플에서 대조군 또는 항-PD-1 군 단독과 비교할 때 상당히 감소된 것은 아니었다(도 2a). TME에서, CD4⁺FoxP3⁺ 세포의 MFI에서의 상당한 감소가 관찰되었는데, 이는 항-PD-1 및 엔티노스타트 조합물 치료에 반응한 Treg 기능의 저해를 시사한다(도 2b).

CD8 T 세포는 PD/L-1 축의 주요 구성성분이고, 종양 감시에 필수적이다. PD/L-1 관문 축이 차단되는 경우, 종종 T 세포 기능 및 종양 침윤이 증가한다. 엔티노스타트와 항-PD-1 면역요법의 조합 효과는 종양 침윤 CD8⁺ T 세포의 상당한 증가를 초래하는 것을 발견하였다(대조군 대 조합물: p = 0.0352)(도 2c, 좌측). 유사하게, CD8⁺ T 세포:T 조절 세포비의 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었는데, 이는 덜 종양 억제성인 환경의 생성을 시사한다(대조군 대 조합물: p = 0.0218)(도 2c, 우측).

종양 연관된 대식세포(TAM)는 면역억제성 TME를 지지한다. 미숙 골수 세포의 종양으로의 이동 시, 이들 세포는 종종 종양 세포로부터의 케모카인 및 사이토카인 방출에 반응하여 TAM이 되도록 프라이밍(priming)될 수 있다. 이들 세포는 CD45⁺CD11b⁺ 마커와 조합되어 판(pan)-대식세포 마커 F4/80에 의해서 마킹된다. 따라서, 엔티노스타트 및 항-PD-1 면역요법의 반응에 대한 TAM의 존재를 조사하였고, 대조군 및 엔티노스타트 단독과 비교할 때 조합물 군에서 TAM 존재의 상당한 감소가 관찰되었다(조합물 대 대조군: p = 0.0272; 조합물 대 엔티노스타트: p = 0.009)(도 2d). 종합하면, 이들 결과는, 항-PD-1 면역요법과 HDAC 저해 조합물이 종양 미세환경의 억제 본성을 상당히 변경하고, RENCA 모델에서 증가된 면역 반응을 가능하게 한다는 것을 시사한다.

골수 유래된 억제제 세포 기능은 엔티노스타트와 항-PD-1 면역요법의 조합물에 의해서 손상된다. 골수 유래된 억제제 세포(MDSC)는 미숙 골수 세포로부터 유래되는데, 이것은 항-종양 T 세포 면역 반응을 저해함으로써 면역 억제성 TME에 기여한다. MDSC는 2종의 널리 규정된 면역억제성 하위-집단, 과립구 Ly6G⁺Ly6C⁺(G-MDSC) 및 단핵구 Ly6C⁺Ly6G^-(M-MDSC) MDSC으로 제시된다. 종양은 화학유인물질, 예컨대, CCL2, CCL5, CCL7 및 CXCL12의 방출을 통해서 MDSC, 단핵구, 및 미숙 골수 세포를 유인한다. MDSC는 표면 PD-L1의 상향조절, 면역억제 사이토카인(IL-10, TGF-β) 및 T reg 유인 사이토카인(CCL4, CCL5)의 생산, 아르기나제 1(Arg1) 및 iNOS의 증가, 및 세포독성 T 세포에 대한 내성을 비롯한 다수의 기전을 통해서 종양의 면역 도피를 보호 및 향상시키는 것으로 나타났다.

엔티노스타트 단일 치료를 사용하는 경우 종양 침윤 G-MDSC 및 M-MDSC 집단에서 약간의 증가가 관찰된 반면(엔티노스타트 대 대조군: G-MDSC p = 0.2025, M-MDSC p = 0.1903), 항-PD-1 단일 작용제 치료는 G-MDSC 집단의 감소로 이어졌다(항-PD-1 대 대조군: G-MDSC p = 0.0.0402)(도 3a). 엔티노스타트 군에서 먼저 관찰된 MDSC 집단의 약간의 증가는 조합물 군에서 증폭되었는데, 여기서 두 집단 모두에 걸쳐서 증가된 존재의 경향성(조합물 대 대조군: G-MDSC p = 0.0199, M-MDSC p = 0.0222; 조합물 대 엔티노스타트: G-MDSC p = 0.0102, M-MDSC p = 0.5613; 조합물 대 항-PD-1: G-MDSC p = 0.0001, M-MDSC p = 0.0198)이 관찰되었다(도 3a). 추가로, 엔티노스타트 또는 조합물 치료 이후에 순환 G-MDSC의 약간의 감소 및 순환 M-MDSC의 상당한 증가를 갖는 순환 MDSC의 변경(엔티노스타트 대 대조군: G-MDSC p = 0.0421, M-MDSC p = 0.0188; 엔티노스타트 대 조합물: G-MDSC p = 0.0608, M-MDSC p = 0.0500; 항-PD-1 대 조합물: G-MDSC p = 0.0424, M-MDSC p = 0.0229; 조합물 대 대조군: G-MDSC p = 0.0080, M-MDSC p = 0.0049)이 관찰되었다(도 3b). 따라서, 엔티노스타트는 주변 면역 상태 및 종양 미세환경의 것 둘 모두를 변경하면서 RENCA 모델에서 항-PD-1 면역요법 치료의 효과를 향상시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 효과의 기전을 추가로 조사하기 위해서, 면역계의 MDSC 컴파트먼트에서 인지된 흥미로운 변경을 추가로 분석하였다.

MDSC 침윤물에서의 치료 특이적 증가가 MDSC 억제 능력과 연관되는지를 결정하기 위해서, 종양 미경험 마우스로부터의 미리-활성화된 CD8⁺ T 세포를 억제시키는 종양 연관된 MDSC의 능력을 생체외에서 시험하였다. RENCA 종양이 이식된 마우스의 향상된 생존율 및 종양 저해를 나타내는 생체내 데이터와 일치하게, 엔티노스타트 또는 조합물 치료 이후에, MDSC(G-MDSC 또는 M-MDSC)는 CD8⁺ T 세포 증식을 저해하는 이의 능력에서 상당한 감소를 나타내었다는 것이 관찰되었다. MDSC 대 T 세포비, 1:1, 0.5:1, 및 0.25:1 각각에서, 미리-자극된(항-CD3/CD28 자극된) 세포를 TME로부터 단리된 MDSC와 함께 16 내지 18시간 동안 공배양하는 경우 CD8⁺ T 세포 증식의 MDSC 저해에서 통계학적으로 유의한 감소(G-MDSC 및 M-MDSC 조건 각각에 대해서 p-값 = 0.01)가 존재하였다(도 3c 및 3d). 생체내 TME로부터의 이들 세포의 면역억제성 상태를 잠재적으로 변경하는 것을 회피하기 위해서 여기서 더 짧은 공배양 시간 지점을 선택하였다. 치료된 마우스의 종양으로부터 단리된 이들 세포는, 이들이 대조군 자극된 CD8⁺ T 세포 단독과 유사하게 증식(약 90% 증식)하도록 CD8⁺ T 세포의 증식을 저해할 수 없었다. 이들 공배양 실험으로부터의 CD8⁺ T 세포의 추가 조사는 대조군에 비해서 대략 40% 만큼 증가된 그랜자임 B 생산을 보여주었는데, 여기서 미처리 종양-보유 마우스로부터의 MDSC는 미리 자극된 CD8⁺ T 세포와 공배양되었다(각각의 조건 및 MDSC:T 세포비에 대해서 p-값 = 0.01)(도 3e 및 도 3f). 함께, 이들 데이터는 엔티노스타트 치료 단독 및 항-PD-1 면역요법과의 조합에 대한 반응으로 종양 침윤 MDSC의 기능에서 상당한 변경을 나타낸다. 엔티노스타트는 FoxP3 기능을 저해함으로써 종양 미세환경을 변경할 수 있다는 것을 나타내었고, 이들 데이터는 ccRCC의 동계 마우스 모델에서 MDSC의 기능 저해를 통한 TME의 추가적인 변형을 나타낸다.

MDSC-유사 세포주, J774M의 엔티노스타트 치료는 잠재적인 기전적 표적으로서 아르기나제 1을 보여주었다. 감사하게도 오거스타 대학교(Augusta University)의 조지아 암 센터의 케빈 리우(Kebin Liu) 실험실에서 공급된 J774M 세포주는 안정한 MDSC-유사 세포주로서 최근에 특징규명되었다. 본 실시예의 목적을 위한 이러한 발견을 검증하기 위해서, 이들 세포를 Ly6C 및 Ly6G에 대해서 염색하여 세포의 MDSC-유사 상태를 추가로 설명하였다. 이것을 도 4a에 나타내는데, 이것은 이들 세포의 하위집단비가 RENCA TME에서 발견된 것과 유사하다. CD45⁺CD11b⁺Gr1⁺ 집단 중에서, 세포 중 약 90%가 G-MDSC(Ly6G⁺)이고, 세포 중 약 10%가 M-MDSC(Ly6C⁺) 양성 세포이다. 세포 표현형의 검증 이후에, 시험관내에서 엔티노스타트의 치료로 기능적으로 변경되는 이들 MDSC-유사 세포의 능력을 연구하였다. 세포를 최대 48시간 동안 0.01 내지 5uM 범위 농도의 엔티노스타트로 처리하였고, J774M 세포 증식 또는 생존력에서 어떠한 유의한 변경도 없었다(도 4f). 엔티노스타트 처리된 J774M 세포와 미리-활성화된 CD8⁺ T 세포의 68 내지 72시간 동안의 공배양은 CD8⁺ T 세포 단독의 것에 근사한 CD8⁺ T 세포 증식의 상당한 증가를 보여주었고, 본 실시예는 3회의 독립적인 반복을 대표한다(도 4b 내지 도 4c). 추가로 이들 시험관내 실험으로부터의 J774M 세포의 조사는 대조군 - 미처리 세포와 비교할 때 엔티노스타트 처리된 MDSC-유사 세포에서 아르기나제-1(Arg1) 발현의 상당한 저해를 보여주었다(대조군 대 0.5uM 엔티노스타트: p = 0.003; 대조군 대 1uM 엔티노스타트: p = 0.0041; 대조군 대 2uM 엔티노스타트: p = 0.0043)(도 4d). MDSC는 특징적으로 아르기나제 1 및 iNOS의 높아진 수준을 갖는다. iNOS의 평가는 결론에 도달하지 못한 결과를 산출하였지만(도 4g), Arg1의 높아진 활성도는 순환 L-아르기닌 풀의 우레아 및 L-오르니틴으로의 arg 1 전환을 통해서 세포독성 T 세포 집단에서 세포 주기 정지를 유도하고, 따라서 세포독성 T 세포 생존에 필수적인 세포외 L-아르기닌의 존재를 감소시키는 것을 가능하게 한다. 이들 데이터는, 엔티노스타트가 잠재적인 특이적 표적으로서 아르기나제 1과 함께, MDSC의 활성도를 저해하는 종양-촉진 T 세포를 손상시킨다는 것을 나타낸다.

엔티노스타트 치료는 면역요법에 대한 향상된 반응을 위해서 종양 미세환경(TME)을 프라이밍시킨다. 종양 미세환경은 면역 세포를 모집하고, 면역 세포의 기능을 변경함으로써 숙주 면역계를 이용한다. 종양 또는 종양 침윤 세포에 의해서 방출된 케모카인 및 사이토카인은 종양 미세환경으로의 면역 세포 수송을 촉진시킨다. 향상된 MDSC 침윤으로 이어지는 것 중에는 CCL2(JE/MCP-1), CCL5, CCL12(MCP-5), CXCL12(SDF-1) 및 VCAM-1이 있다. 일단 이들 세포가 TME 내에 모집되면, 이들은 M-CSF, G-CSF, GM-CSF, C5a, IL1-β, IL-10 및 IL-6을 비롯한, 종양 유래 인자에 반응하여 확장 및 활성화된다. 이어서, MDSC는 아르기나제-1 및 iNOS의 상향조절, 뿐만 아니라 관련 사이토카인(즉, Treg 촉진 IL-10, CCL4, CCL5)의 생산을 통해서 세포의 성장, 증식, 혈관형성 및 면역 감시의 도피를 도울 수 있다. TME는 종양 세포 및 연관된 면역 침윤물 둘 모두에 의해서 방출 및 통역될 사이토카인의 연속적인 스톰을 갖는 복잡한 시스템이다. 이러한 복잡한 균형 및 이것이 HDAC 저해 및 면역요법으로 어떻게 변경되는지를 이해하는 것은 매우 흥미롭다.

TME 면역 상태에 대한 엔티노스타트의 역할을 조사하기 위해서, 대조군 및 엔티노스타트 처리된 코호트의 종양 샘플을 프로테옴 프로파일러 분석(Ary028)에 제공하였는데, 이것은 대조군 및 엔티노스타트 처리된 코호트의 상이한 프로파일을 비롯하여 111종의 케모카인 및 사이토카인의 판독치를 제공하였다. 이러한 풀 내에서, TME 내의 MDSC 연관된 수송/축적(CCL2: p = 0.0001, VCAM-1/CD106: p ≤ 0.0001 / 앤지오포이에틴-2: p = 0.001), 확장/활성화 사이토카인(G-CSF: p ≤ 0.001, GM-CSF: p ≤0.01, IL-1β: p ≤ 0.001, 및 IL-10: p = 0.0001)의 상당한 감소가 관찰되었다. 항-종양 케모카인 및 사이토카인의 상당한 상향조절이 또한 주목되었는데, 이것은 항-종양 면역 기억(CXCL10/IP-10: p< 0.01), T 세포 유인(E-셀렉틴: p<0.0001), 프로-MDSC 저해(IL-1ra: p<0.01) 및 선천적인 항-종양 반응(IL-4: p<0.001 및 IL-12p40: p<0.01)에 기여한다(도 5a). 이러한 결과는, 엔티노스타트 치료가 TME의 면역 상태를 항-종양 상태로 변경시키기에 충분하다는 것을 시사하는데, 이것은 TME를 면역요법적 개입, 예컨대, 항-PD-1 치료제에 더 양호하게 반응하도록 프라이밍시킬 수 있다. 면역요법 치료에 대한 반응을 위해서 숙주 면역계를 병원에서 번역 가능하게 프라이밍시키는 엔티노스타트에 대한 이들 데이터를 위해서, 대조군 및 엔티노스타트 처리된 마우스로부터의 혈청 샘플을 동일한 Ary028 프로테옴 프로파일러에 적용하였다. 다수의 순환 프로-종양 연관된 케모카인 및 사이토카인의 상당한 감소가 대조군 처리된 코호트와 엔티노스타트 처리된 코호트 사이에서 관찰되었다. 이들 중에는 MDSC 확장 조절인자, 아디포넥틴(p<0.01); 프로-종양 화학유인물질, 앤지오포이에틴-2(p<0.001); 염증 촉진 키티나제 3-유사 1(p<0.001), CCL12(p<0.01), 보체 구성성분 C5(p<0.001), c-반응성 단백질(p<0.001), IL-6(p = 0.0001), 펜트락신스 2/3(p = 0.01) 및 페리오스틴(p = 0.001); T 조절 세포 케모카인, CCL17(p = 0.001), MDSC 화학유인물질 M-CSF(p = 0.01) 및 GM-CSF(p = 0.01); EMT/침입 매트릭스-메탈로프로테이나제, MMP-2(p = 0.001) 및 MMP-9(p = 0.0001); CCL2(p ≤ 0.01) - MDSC 유인-유도 오스테오프로테게린(p = 0.001); 및 백혈구 유인제 VCAM(p = 0.001)가 있다.

항-종양 사이토카인/케모카인의 상향조절이 엔티노스타트 치료군에서 관찰되었지만, 다수의 사이토카인/케모카인의 상당한 상향조절이 조합물 코호트에서 인지되었는데, 이는 항-PD-1 면역요법 및 엔티노스타트가 개선된 면역치료 반응을 위해서 숙주 면역계를 향상시키도록 함께 작용하는 것을 시사한다. 또한 하기 항-종양 관련된 사이토카인/케모카인의 증가가 관찰되었다: T 세포 유인제 및 항-내피 마커(CXCL9(p = 0.001), CXCL10(p ≤ 0.0001)), 종양 증식 저해 사이토카인(IL-4(p = 0.0001) 및 IL-13(p = 0.0001)), T 세포 화학유인물질(E-셀렉틴(p = 0.0001)) 및 항-종양 마커(IL-12p40(p = 0.0001)). 종합하면, 이러한 결과는, 엔티노스타트 치료가 숙주 환경 및 TME를 항-PD-1 면역요법 치료의 향상을 가능하게 하는 방식으로 변경한다는 것을 시사한다.

상기 결과는 엔티노스타트로의 치료가 골수 유래된 억제제 세포의 기능을 조절하고, 따라서 TME를 조절한다는 것을 나타낸다. 조절은 면역요법 치료에 대한 증폭된 면역 반응 및 증가된 항-종양 반응으로 이어진다. 더욱이, 투명 세포 신장 세포 암종의 마우스 모델에서 엔티노스타트와 항-PD-1 면역요법을 조합하는 경우 상승작용적 항-종양 효과가 관찰되었다. 지연된 종양 성장에 더하여, 엔티노스타트 및 항-PD-1 면역요법이 ccRCC 모델에서 생존을 연장시키도록 상승작용적으로 기능한다는 것을 나타낸다.

이전 결과에 따라서, 엔티노스타트 치료는 T 조절 세포의 존재 및 기능적 상태에 대한 직접적인 효과를 나타내었다. 조합물 치료는 종양 연관된 FoxP3⁺ 세포(이것은 항-PD-1 치료제를 사용하면 약간 증가되었음)를 감소시켰고, 세포에서 FoxP3 단백질의 존재를 상당히 감소시켰으며, 이는 상승작용적 항-종양 활성을 시사한다. 엔티노스타트 치료로 인한 T 조절 저해가 TME 내로의 증가된 CD8⁺ 침윤 및 CD8⁺ 대 TReg비의 후속 증가를 동반하였다. 이러한 발견은 면역요법 치료와 조합된 엔티노스타트가 종양에 대한 직접적인 세포독성이 아니라 상당한 면역조절 활성을 갖는다는 개념을 지지한다.

유방암 환자에서의 II상 임상의 최근 분석은 종양 미세환경에서의 단핵구 및 과립구 MDSC 둘 모두의 감소를 나타내었다. 실험 조건에서, MDSC 집단의 단핵구 및 과립구 하위세트 둘 모두에서의 상당한 증가가 인지되었다. 이들 데이터는 종합하면 특이적 종양 미세환경이 종양 유형에 걸쳐서 인지되는 상이한 관찰에서 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> Indiana University Research and Technology Corporation <120> USE OF HISTONE DEACETYLASE INHIBITORS FOR ENHANCING IMMUNOTHERAPIES <130> WO/2017/132536 <140> PCT/US2017/015389 <141> 2017-01-27 <150> US 62/288,121 <151> 2016-01-28 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 gtgaagaacc cacggtctgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 ctggttgtca ggggagtgtt 20

Claims (19)

1. 클래스 I 히스톤 데아세틸라제(class I histone deacetylase)(HDAC) 저해제 및 예정된 세포사 단백질 1(programmed cell death protein 1: PD-1) 저해제를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 클래스 I HDAC 저해제는 엔티노스타트(피리딘-3-일메틸 N-[[4-[(2-아미노페닐)카바모일]페닐]메틸]카바메이트), 보리노스타트(N-하이드록시-N'-페닐옥탄다이아마이드) 및 트라이코스타틴 A(TSA)((2E,4E,6R)-7-[4-(다이메틸아미노)페닐]-N-하이드록시-4,6-다이메틸-7-옥소-2,4-헵타다이엔아마이드), 다시노스타트((E)-3-(4-(((2-(1H-인돌-3-일)에틸)(2-하이드록시에틸)아미노)메틸)페닐)-N-하이드록시아크릴아마이드), 부티레이트, 발프로산(VPA), 벨리노스타트((2E)-N-하이드록시-3-[3-(페닐설파모일)페닐]프로프-2-엔아마이드), 파노비노스타트((2E)-N-하이드록시-3-[4-({[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에틸]아미노}메틸)페닐]아크릴아마이드), 피록사마이드, SK-7041(4-(다이메틸아미노)-N-[[4-[(E)-3-(하이드록시아미노)-3-옥소프로프-1-엔일]페닐]메틸]벤즈아마이드), SK-7068(N-[[4-[3-(하이드록시아미노)-3-옥소프로프-1-엔일]페닐]메틸]-4-피롤리딘-1-일벤즈아마이드), 트라폭신 A(사이클로((S)-감마-옥소-L-알파-아미노옥시란옥탄오일-L-페닐알라닐-L-페닐알라닐-D-2-피페리딘카보닐)), 환식 테트라펩타이드 하이드록삼산 유사체(CHAP), 데푸데신(4,5:8,9-다이안하이드로-1,2,6,7,11-펜타데옥시-D-트레오-D-이도-운데카-1,6-다이에니톨), 모세티노스타트(N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸] 벤즈아마이드) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 약 0.5μM 내지 약 2μM의 상기 클래스 I HDAC 저해제를 포함하는, 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 클래스 I HDAC 저해제는 엔티노스타트인, 조성물.
5. 제4항에 있어서, 약 0.5μM의 엔티노스타트를 포함하는, 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 PD-1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 PD-1 저해제는 니볼루맙인, 조성물.
8. 제5항에 있어서, 약 1.0μM의 니볼루맙을 포함하는, 조성물.
9. 제1항에 있어서, 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 조성물.
10. 조절 T 세포의 억제를 필요로 하는 개체에서 조절 T 세포를 억제시키는 방법으로서, 클래스 I 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 및 예정된 세포사 단백질 1(PD-1) 저해제를 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 클래스 I HDAC 저해제는 엔티노스타트(피리딘-3-일메틸 N-[[4-[(2-아미노페닐)카바모일]페닐]메틸]카바메이트), 보리노스타트(N-하이드록시-N'-페닐옥탄다이아마이드) 및 트라이코스타틴 A(TSA)((2E,4E,6R)-7-[4-(다이메틸아미노)페닐]-N-하이드록시-4,6-다이메틸-7-옥소-2,4-헵타다이엔아마이드), 다시노스타트((E)-3-(4-(((2-(1H-인돌-3-일)에틸)(2-하이드록시에틸)아미노)메틸)페닐)-N-하이드록시아크릴아마이드), 부티레이트, 발프로산(VPA), 벨리노스타트((2E)-N-하이드록시-3-[3-(페닐설파모일)페닐]프로프-2-엔아마이드), 파노비노스타트((2E)-N-하이드록시-3-[4-({[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에틸]아미노}메틸)페닐]아크릴아마이드), 피록사마이드, SK-7041 (4-(다이메틸아미노)-N-[[4-[(E)-3-(하이드록시아미노)-3-옥소프로프-1-엔일]페닐]메틸]벤즈아마이드), SK-7068(N-[[4-[3-(하이드록시아미노)-3-옥소프로프-1-엔일]페닐]메틸]-4-피롤리딘-1-일벤즈아마이드), 트라폭신 A(사이클로((S)-감마-옥소-L-알파-아미노옥시란옥탄오일-L-페닐알라닐-L-페닐알라닐-D-2-피페리딘카보닐)), 환식 테트라펩타이드 하이드록삼산 유사체(CHAP), 데푸데신 (4,5:8,9-다이안하이드로-1,2,6,7,11-펜타데옥시-D-트레오-D-이도-운데카-1,6-다이에니톨), 모세티노스타트(N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸] 벤즈아마이드) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5μM 내지 약 2μM의 상기 클래스 I HDAC 저해제를 포함하는, 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 클래스 I HDAC 저해제는 엔티노스타트인, 방법.
14. 제13항에 있어서, 엔티노스타트는 약 5㎎/㎏의 양으로 투여되는, 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 PD-1 저해제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
16. 제10항에 있어서, 상기 PD-1 저해제는 니볼루맙인, 방법.
17. 제14항에 있어서, 니볼루맙은 약 10㎎/㎏의 양으로 투여되는, 방법.
18. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 방법.
19. 제10항에 있어서, 상기 개체는 신장 세포 암종을 갖는, 방법.

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