KR20180099271A - 푸코이단을 유효성분으로 포함하는 치주질환 염증억제 조성물 - Google Patents
푸코이단을 유효성분으로 포함하는 치주질환 염증억제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 푸코이단(fucoidan)를 유효성분으로 포함하는 치주질환 염증억제 조성물에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 포필로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)로부터 유발되는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유하는 푸코이단를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 포필로모나스 진지발리스에서 추출한 LPS를 1 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well)를 기준으로 할 때 푸코이단을 8~31 ug/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없으며, 포필로모나스 진지발리스에서 유래한 LPS로 인한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 있는데, 이는 NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하고, MAPKs의 발현을 저해하는 효능에 근거한다.
더욱 구체적으로는, 포필로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)로부터 유발되는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유하는 푸코이단를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 포필로모나스 진지발리스에서 추출한 LPS를 1 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well)를 기준으로 할 때 푸코이단을 8~31 ug/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없으며, 포필로모나스 진지발리스에서 유래한 LPS로 인한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 있는데, 이는 NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하고, MAPKs의 발현을 저해하는 효능에 근거한다.
Description
본 발명은 푸코이단(fucoidan)을 유효성분으로 포함하는 치주질환 염증억제 조성물에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 포필로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)로부터 유발되는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유하는 푸코이단를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 포필로모나스 진지발리스에서 추출한 LPS를 1 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well)를 기준으로 할 때 푸코이단을 8~31 ug/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없으며, 포필로모나스 진지발리스에서 유래한 LPS로 인한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 있는데, 이는 NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하고, MAPKs의 발현을 저해하는 효능에 근거한다.
LPS(Lipopolysaccharides)는 세균의 표면에 존재하는 항원 중 하나로서 인체 내에서 비특이적 내재면역반응 (Innate immunity)을 일으키는 물질이다. 세균마다 구조가 상이하나 기본적으로는 lipid A와 다당(Polysaccharide)의 구조로 되어 있다. 다당은 O항원과 Core다당으로 나누어지는데 균종을 혈청학적으로 분류할 때 O항원을 이용한다.
현재 실험실에서 가장 널리 사용되는 LPS로는 장내 세균인 대장균에서 추출한 LPS가 있다. 그러나 장내 세균인 대장균에서 추출한 LPS로는 다른 염증 원인 세균이 유발하는 염증까지 무조건적으로 효능이 있다고는 할 수 없다.
따라서 특정 세균의 염증 유발 물질인 LPS의 구조는 다른 세균의 LPS 구조와는 상이하므로 특정 염증의 원인 세균에 대한 항염증 효능은 그 세균의 LPS에 대한 효능 여부를 입증하는 것이 중요하다.
한편, 본 발명자는 치주염의 원인 세균인 포필로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)로부터 LPS를 추출하고, 이 LPS를 대식세포 RAW 264.7에 처리하여 유발된 염증을 푸코이단(fucoidan)이 예방, 개선 또는 치료할 수 있다는 것을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
특히, 천연 유래의 물질을 이용하여 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 안출한 이유를 살펴보면 다음과 같다.
구강질환의 개선 또는 치료를 위한 방법으로는, 클로르헥시딘(chlorhexidine)이라는 양치액을 사용하는 방법, 잇몸과 치아 사이에 특수 약제를 넣는 방법, 잇몸에 있는 특수한 세균을 박멸하기 위한 항생제를 사용하는 방법, 우식부위를 제거하고 다른 충전재로 채우는 방법 또는 잇몸 속의 세균성 치석 등을 제거하고 다시 봉합하는 방법 등이 있다.
그러나 위와 같은 방법들은 치료 방법이 복잡하며, 비용과 시간이 많이 소요된다. 또한, 항생제를 사용하여 구강 내 세균을 박멸하는 경우, 구강 내 세균 분포의 균형이 무너져 구강 내의 면역력이 감소하고 구강 건조증 등의 질환이 유발될 수 있으며, 항생제에 대한 구강 세균의 내성이 발생할 수도 있다.
이에 본 발명자는 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용이 동반되지 않으며 내성이 없고 결과적으로 구강 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 안출하였다.
한편, 푸코이단(fucoidan)은 끈적끈적한 점질 구조의 황산염화한 다당류로 고미역, 다시마 등 갈조류에 들어있는 성분이다.
푸코이단은 갈조류에 유연성을 부여하여 격렬한 조수의 흐름으로부터 해조류가 보호될 수 있도록 한다. 갈조류로부터 추출된 푸코이단은 평균 분자량 20kDa이며, 후코스(Fucose)라는 기본당과 황산기가 결합되어 있다. 황산화푸코이단에서 생기는 F-푸코이단과 20% 정도의 글루쿠론산를 포함한 U-푸코이단 두 종류가 있다.
푸코이단은 기능성 식품의 기초원료, 식이보조제, 첨가제 등으로 사용되고 있으며, 콜레스테롤의 배설을 도와 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추고 혈관 질환을 예방하며 비만이 성인병으로 발병되는 것을 예방시켜 준다.
또한, 최근 연구에서는 푸코이단이 혈액응고방지작용, 항종양작용, 위궤양 치료 촉진작용, 항균작용, 혈압상승억제작용, 간세포증식인자(HGF)생산유도, 혈당상승억제작용, 면역세포조절작용, 항알레르기작용, 항바이러스작용이 있다고 하였다.
특히 소화기계통 암 종류 치유에 뛰어난 효과가 있는 것으로 보고된 바 있으며, 대부분의 암 치유에도 매우 우수한 효과가 있는 것으로 나타났다. F-푸코이단은 임파종 세포줄기의 자살을 유도하며 토끼에서는 이상증식을 억제할 수 있다는 보고가 있었다.
한편, 본 발명과 관련된 선행특허를 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1144493호에 저분자의 알지네이트, 푸코이단 또는 은-알지네이트를 유효성분으로 함유하는 항균 화장료 조성물이 기재되어 있다.
위 선행특허에는 저분자 알지네이트 및 저분자 푸코이단이 대장균, 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 및 여드름 구균에 대해 항균활성을 보유함이 기재되어 있다.
그러나 선행특허는 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 기재만 있을 뿐, 포필로모나스 진지발리스가 유발하는 염증에 대한 항염증 효능이 있는지 여부는 알 수 없으며, 이에 대한 착안점이나 시사점도 기재된바 없다.
Wun ZY, Lin CF, Huang WC, Huang YL, Xu PY, Chang WT, Wu SJ, Liou CJ, Anti-inflammatory effect of fucoidane G isolated from Sophora flavescens in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages, Food and chemical toxicology, 2013, v.62, pp. 255-261
Kim DW, Chi YS, Son KH, Chang HW, Kim JS, Kang SS, Kim HP, Effects of fucoidane G, a prenylated flavonoid from Sophora flavescens, on cyclooxygenase-2 and in vivo inflammatory response, Archives of pharmacal research, 2002, v.25, no.3, pp.329-335
본 발명의 목적은 포필로모나스 진지발리스에 의한 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은, 푸코이단(fucoidan)을 유효성분으로 함유하는, 구강세균이 유발하는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 약학적 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
구체적으로는, 상기 구강세균은 포필로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 푸코이단은, 포필로모나스 진지발리스에서 추출한 LPS(Lipopolysaccharides)를 1 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well) 대상으로, 8~31 ug/mL로 포함되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 조성물은 세포 독성이 없으며, 포필로모나스 진지발리스에서 추출한 LPS가 유발하는 염증에 대하여, NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하고, MAPKs의 발현을 저해하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 푸코이단(fucoidan)을 유효성분으로 함유하는, 구강세균이 유발하는 치주질환 염증을 예방 또는 개선하는 건강기능식품 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 구강세균에 의한 NO의 생성을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 구강세균에 의한 PGE2의 생성을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 전구염증매개 효소인 iNOS와 COX-2의 발현을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 NF-κB의 발현을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 MAPKs의 발현을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
도 1은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 세포 독성을 비교한 결과이다.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 NO 생성량을 비교한 결과이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 PGE2 생성량을 비교한 결과이다.
도 4는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현을 비교한 결과이다.
도 6은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량을 나타낸 결과이다.
도 7은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 IL-1β 생성량을 나타낸 결과이다.
도 8은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 IL-6 생성량을 나타낸 결과이다.
도 9는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 MAPKs의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 10은 6은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때 NF-κB의 구성요소인 p65의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 NO 생성량을 비교한 결과이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 PGE2 생성량을 비교한 결과이다.
도 4는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현을 비교한 결과이다.
도 6은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량을 나타낸 결과이다.
도 7은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 IL-1β 생성량을 나타낸 결과이다.
도 8은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 IL-6 생성량을 나타낸 결과이다.
도 9는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 MAPKs의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 10은 6은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때 NF-κB의 구성요소인 p65의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예
1.
푸코이단을
유효성분으로 함유하는 치주질환 염증억제 조성물
푸코이단을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제조한다.
푸코이단은 미역, 다시마 등과 같은 갈조류(brown seaweeds)의 줄기 또는 뿌리를 물, 에탄올 또는 메탄올 또는 기타 유기용매를 이용하여 추출 또는 분획추출한 후에 분리 동정한다. 추출용매의 종류에 따라 추출 온도, 추출 시간, 용매의 양 및 잔류성분 처리 방식 등을 달리하여 처리한다.
분리 동정된 푸코이단의 농도는 8~31 ug/ml에 해당하도록 농축하여 사용할 수 있다. 이는 하기 실험예들의 데이터에 근거한다.
푸코이단 이외의 약제학적으로 허용된 첨가제나 식품학적으로 허용된 첨가제를 이용하여 사용목적에 맞게 조성물을 제조한다.
실험예
1. 세포 독성 측정
1-1. 실험 준비
1) 세포 배양
실험은 마우스의 대식세포주(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포주를 사용하였다. 세포주는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/mL 페니실린, 100 ug/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 Dulbecco's modified eagles medium(Gibco, USA) 완전배지를 사용하여 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
이후 모든 실험예에서 사용한 세포주는 위와 동일한 과정으로 배양되었음을 밝혀둔다.
1-2. 실험 과정
푸코이단를 0~31 ug/mL 농도로 처리하고 MTT 검정법(methylthiazol tetrazolium bromide)을 통해 푸코이단의 세포 독성을 측정하였다.
MTT 검정법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 생성된 blue formazan 결정을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹여서 발색 시켜 그 흡광도를 측정하는 방법이다.
Well당 MTT 용액(2 mg/ml)을 50 ul씩 넣어 37℃, 5% CO2 항온기에서 2시간 반응시킨 후 배지는 제거하고 DMSO를 well당 100 ul씩 넣어 5분간 plate shaker에서 blue formazan 결정을 용해 시킨 다음 ELISA reader(Techan, Germany) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-3. 실험 결과
도 1은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 세포 독성을 비교한 결과이다.
실험 결과, 푸코이단를 4~31 ug/mL 농도별로 처리하였을 때의 세포 생존율은 모두 90% 이상으로 확인되었다.
통상적으로 특정 조성물을 처리하였을시 세포 생존율이 60% 이상이면 세포 독성이 없는 것으로 판단한다. 따라서 푸코이단는 세포 독성이 없다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
2. NO 생성 측정
2-1. 실험 과정
푸코이단의 포필로모나스 진지발리스에 의한 염증을 억제하는 효능을 알아보기 위해, NO(Nitric Oxide) 생성능을 RAW 264.7 대식세포를 이용하여 관찰하였다.
각 RAW 264.7 대식세포를 1×106 cell/well의 농도로 분취하고 37℃ CO2 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, 푸코이단(0~31 ug/mL)을 1시간 동안 처리한 후에 포필로모나스 진지발리스에서 추출한 LPS를 1 ug/mL 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
배양 종료 후 배양 상등액 중의 아질산염(nitrite, NO의 안정한 수화합물)의 농도를 Griess assay 방법(Griess. P., Chem. Ber. 12:426-428, 1897)으로 측정하였다. 즉 NaNO2를 표준물질로 하고 그리스 시약(Griess reagent, 0.5% sulfanilyamide, 0.05% N-(1-naphthyl) ethylene diamine dihydrochloride/2.5% H3PO4)을 이용하여 540 nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다.
2-2. 실험 결과
도 2는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 NO 생성량을 비교한 결과이다.
실험 결과, 푸코이단를 4~31 ug/mL 농도별로 처리하였을 때, NO 생성능은 감소하는 경향을 보였다.
따라서 푸코이단는 농도 의존적으로 NO 생성량을 감소시킨다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
3.
PGE
2
생성 측정
3-1. 실험 과정
푸코이단의 포필로모나스 진지발리스에 의한 염증을 억제하는 효능을 알아보기 위해, PGE2(prostaglandin E2) 생성능을 RAW 264.7 대식세포를 이용하여 관찰하였다.
실험과정은 상기 NO 생성 측정 실험과정과 동일하다.
3-2. 실험 결과
도 3은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 PGE2 생성량을 비교한 결과이다.
실험 결과, 푸코이단를 8~31 ug/mL 농도별로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 PGE2 생성량을 감소시킨다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
4.
전구염증매개
효소 발현 정도 측정
4-1. 실험 과정
염증을 유발하는 전구염증매개 효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현 정도를 웨스턴 블롯 실험과 리얼타임 PCR 실험으로 측정함으로써, 푸코이단의 포필로모나스 진지발리스에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하였다.
푸코이단을 1시간 동안 전처리한 후에, LPS를 1 ug/mL 처리하여 염증이 유도된 Raw264.7 세포 1×106 개를 100 ㎜ 페트리디쉬에서 24시간 배양 후, 배지를 제거한 다음에 세포를 배양용기로부터 떼어내어 단백질 분해효소 저해제(Proteaseinhibitor cocktail, Roche, USA)를 함유한 단백질 용출용액(CelLyticTM-MT Tissue Lysis Reagent, Sigma, USA)을 사용하여 균질화하였다. 추출액은 20분 동안 14000 rpm에서 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다.
분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액을 5×SDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료에서 40 ug 단백질을 SDS 4-12% SDS-PAGE 겔에 로딩하였고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였다.
상기 분리된 단백질을 겔 한 장당 50 mA의 조건으로 1시간 동안 전기영동 하여 PVDF 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에서 단백질이 없는 부분을 탈지분유로 차단(blocking)시킨 다음, 1차 항체[항-iNOS 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-COX-2 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA),또는 항-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)] 및 2차 항체(항토끼-IgG HRP; Amersham Biosciences, UK)를 순차적으로 결합시킨 후, ECL 검출 키트(Amersham Biosciences, UK)로 발광반응을 유발하였고 X-ray 필름에 노출 시켜 감광하였다.
4-2. 실험 결과
도 4는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 5는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현을 비교한 결과이다.
실험 결과, 푸코이단를 8~31 ug/mL 처리하였을시 처리 농도를 증가시킴에 따라 iNOS 및 COX-2의 발현 정도가 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다.
실험예
5. 염증성 사이토카인 생성 측정
5-1. 실험 과정
염증반응의 지표가 되는 염증성 사이토카인의 생성량을 측정함으로써 푸코이단의 구강세균 독성에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하고자 하였다.
RAW 264.7 세포 1×106 cell/well을 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 푸코이단(2~31 ug/mL)를 1T시간 동안 전처리한 후, LPS(1 ug/mL) 처리하여 이전과 동일 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3분)하여 얻어진 상층액의 염증성 사이토카인의 생성함량을 측정하였다. 염증성 사이토카인은 mouse enzyme-linkedimmnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였다.
5-2. 실험 결과
도 6은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량을 나타낸 결과이다. 도 7은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 IL-1β 생성량을 나타낸 결과이다. 도 8은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 IL-6 생성량을 나타낸 결과이다.
실험 결과, 푸코이단를 4~31 ug/mL 처리하였을시 처리 농도가 높아질수록 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성량이 감소한 것을 알 수 있다.
따라서 푸코이단는 농도의존적으로 구강세균의 독성으로 인해 유발되는 염증을 억제 또는 완화하는 효능을 보유함을 알 수 있다.
실험예
6.
MAPKs의
발현 정도 측정
6-1. 실험 과정
MAPKs(mitogen-activated protein kinases)의 발현 정도를 웨스턴 블롯 실험으로 측정함으로써, 푸코이단의 구강세균의 독성에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하였다.
실험과정은 상기 전구염증매개 효소 발현 정도 측정 실험과정과 동일하게 수행되었으나, 배양은 24시간이 아니라 3시간을 하였다. 1차 항체로서 항-인산화 ERK 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-인산화 JNK 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 항-인산화 p38항체를 사용하였다.
6-2. 실험 결과
도 9는 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때의 MAPKs의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
실험결과, 푸코이단를 4~31 ug/mL 처리하였을시 pERK, pJNK 및 pp38의 발현 정도가 감소하는 경향을 보였다.
따라서 푸코이단은 MAPKs의 발현을 저해한다는 결론을 도출할 수 있으며, 상세하게는 푸코이단이 MAPKs의 인산화 과정을 저해함으로써 항염증 효능을 나타낸다고 할 수 있다.
실험예
7.
NF
-
κB
발현 정도 측정
7-1. 실험과정
염증을 유발하는 NF-κB(nuclear factor-κB)의 발현 정도를 웨스턴 블롯 실험으로 측정함으로써, 푸코이단의 구강세균의 독성에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하였다.
실험과정은 상기 전구염증매개 효소 발현 정도 측정 실험과정과 동일하게 수행되었으나, 배양은 24시간이 아니라 3시간을 하였다. 1차 항체로서 항-HO-1 항체, 항-IκB-α 항체 및 항-NF-κB p65 항체를 사용하였다.
7-2. 실험결과
도 10은 RAW 264.7 세포에서 푸코이단를 농도별로 처리하였을 때 NF-κB의 구성요소인 p65의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
실험 결과, 푸코이단를 8~31 ug/mL 처리하였을시 p65의 발현 정도가 감소하는 경향을 보였다.
따라서 푸코이단은 NF-κB의 발현을 저해한다는 결론을 도출할 수 있으며, 상세하게는 푸코이단이 NF-κB의 활성화를 저해함으로써 항염증 효능을 나타낸다고 할 수 있다.
Claims (5)
- 푸코이단(fucoidan)을 유효성분으로 함유하는, 구강세균이 유발하는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 구강세균은 포필로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)인 것을 특징으로 하는, 구강세균이 유발하는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 푸코이단은,
포필로모나스 진지발리스에서 추출한 LPS(Lipopolysaccharides)를 1 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well) 대상으로,
8~31 ug/mL로 포함되는 것을 특징으로 하는, 구강세균이 유발하는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 세포 독성이 없으며, 포필로모나스 진지발리스에서 추출한 LPS가 유발하는 염증에 대하여, NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하고, MAPKs의 발현을 저해하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는, 구강세균이 유발하는 치주질환 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 약학적 조성물.
- 푸코이단(fucoidan)을 유효성분으로 함유하는, 구강세균이 유발하는 치주질환 염증을 예방 또는 개선하는 건강기능식품 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170026496A KR20180099271A (ko) | 2017-02-28 | 2017-02-28 | 푸코이단을 유효성분으로 포함하는 치주질환 염증억제 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180099271A true KR20180099271A (ko) | 2018-09-05 |
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ID=63594453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020170026496A KR20180099271A (ko) | 2017-02-28 | 2017-02-28 | 푸코이단을 유효성분으로 포함하는 치주질환 염증억제 조성물 |
Country Status (1)
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| KR (1) | KR20180099271A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101144493B1 (ko) | 2009-11-27 | 2012-05-11 | 조선대학교산학협력단 | 저분자의 알지네이트, 후코이단 또는 은-알지네이트를 유효성분으로 함유하는 항균 화장료 조성물 |
-
2017
- 2017-02-28 KR KR1020170026496A patent/KR20180099271A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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| KR101144493B1 (ko) | 2009-11-27 | 2012-05-11 | 조선대학교산학협력단 | 저분자의 알지네이트, 후코이단 또는 은-알지네이트를 유효성분으로 함유하는 항균 화장료 조성물 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Kim DW, Chi YS, Son KH, Chang HW, Kim JS, Kang SS, Kim HP, Effects of fucoidane G, a prenylated flavonoid from Sophora flavescens, on cyclooxygenase-2 and in vivo inflammatory response, Archives of pharmacal research, 2002, v.25, no.3, pp.329-335 |
| Wun ZY, Lin CF, Huang WC, Huang YL, Xu PY, Chang WT, Wu SJ, Liou CJ, Anti-inflammatory effect of fucoidane G isolated from Sophora flavescens in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages, Food and chemical toxicology, 2013, v.62, pp. 255-261 |
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