KR20180093344A - 천잠 유래 신규 라카제-2 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천잠(Antheraea yamamai) 유래 신규 라카제-2(laccase-2) 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액을 이용하여 리그닌을 생물학적으로 분해하는 방법 및 염색폐수를 표백하는 방법, 상기 재조합 미생물을 배양하여 라카제-2 단백질을 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 라카제-2 단백질 및 상기 라카제-2 단백질을 유효성분으로 포함하는 옻 독 해독용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 신규 라카제-2 유전자는 생명공학 분야, 의약 산업 및 바이오에너지 분야 등에 다양하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

천잠 유래 신규 라카제-2 유전자 및 이의 용도{Novel laccase-2 gene from Antheraea yamamai and uses thereof}

본 발명은 천잠 유래 신규 라카제-2 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

주로 백색부후균(white-rot fungi)에서 발견된 효소인 라카제-2(laccase-2)는 구리(copper)를 함유한 폴리페놀 옥시다제(polyphenol oxydase)로서 페놀류 화합물을 비롯한 각종 유해 난분해 물질을 산화시켜 분해할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 라카제의 특성은 목재에서 리그닌 성분을 효율적으로 제거함으로써 펄프의 질을 향상시키는데 이용되기도 한다. 목재의 50-60%는 셀룰로스가 주성분으로 구성되어 있으며，리그닌은 전체의 20-30% 정도를 차지하고 있다. 리그닌은 초본과 목본을 구분하는 주요한 요소로서 현재까지 리그닌을 분해하기 위한 여러 연구들이 시도되었으나 아직까지 효율적으로 리그닌을 분해할 수 있는 방법은 개발되어 있지 않다.

바이오에탄올 생산 효율을 높일 수 있는 방법으로 백색부후균에서 리그닌 분해효소인 라카제-2 유전자를 분리하여 유전자 재조합 방식으로 또는 형질전환 버섯을 만들어 이를 활용한 연구 및 개발이 진행되고 있다. 또한 최근에 산림청，국립생물자원관，농촌진흥청 등 정부기관을 비롯하여 일반 기업에서도 리그닌 분해와 관련한 효율적인 유전자를 개발 및 발굴하고자 많은 노력을 기울이고 있다. 의약 분야에서도 라카제-2 유전자를 활용하여 옻나무의 독을 해독하기 위한 노력이 이루어지고 있으며, 축산 분야의 경우 가축의 사료 효율을 높이기 위해 새로운 리그닌 분해효소 발굴에 노력을 가하고 있다. 해외에서도 이와 동일한 내용에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있으나 아직까지 효과적인 리그닌 분해효소 유전자를 발굴하지 못해 산업적 활용에 어려움을 겪고 있는 것이 현실이다.

따라서, 기존에 알려진 라카제-2 유전자보다 리그닌 분해 활성이 더 우수한 새로운 유전자를 발굴할 필요가 있으며, 이러한 특이적 유전자 염기서열 발굴이 요구되고 있는 실정으로, 본 발명자들은 뽕나무 잎을 섭식하는 일반적인 누에와 달리 참나무 잎을 섭식하는 천잠으로부터 신규의 라카제-2 유전자를 발굴하였다.

한편, 한국공개특허 제2016-0123780호에는 '멧누에 유래 특이적 Dpp 유전자 및 그 유전자의 발현'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0797540호에는 '겨울우산버섯 라카아제 유전자, 라카아제 효소 및 그 생산방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 천잠 유래 신규 라카제-2 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 천잠에서 특이적으로 고발현되는 유전자를 신규로 발굴하였고 발굴된 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 일반 누에 및 백색부후균의 라카제-2 유전자와 유사성이 있는 것으로 확인되었으며, 특히 천잠의 견사선에서 상기 유전자가 고발현되고 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천잠(Antheraea yamamai) 유래 신규 라카제-2(laccase-2) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액을 리그닌을 포함하는 목질계 바이오매스에 처리하여, 리그닌을 생물학적으로 분해하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액을 산업용 염색폐수에 처리하여, 염색폐수를 표백하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 라카제-2 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 라카제-2 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 라카제-2 단백질을 유효성분으로 포함하는 옻 독 해독용 조성물을 제공한다.

본 발명의 천잠 유래 신규 라카제-2 유전자는 목본류의 리그닌 분해, 염색폐수의 표백, 고품질의 견사 생산 등의 목적으로 사용될 수 있는 천잠 유래 특이적 유전자로, 생명공학 분야, 의약 산업 및 바이오에너지 분야 등에 다양하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 누에와 천잠의 중장 조직으로부터 분리한 소화 내용물 사진이다.
도 2는 다양한 조직에서 라카제-2 유전자의 발현을 확인한 결과이다. 2R22, 음성 대조구; AY-actin, 천잠(Antheraea yamamai) 액틴 단백질; B.mori, 누에; AY(전중부), 천잠 전중부 견사선; AY(후부), 천잠 후부 견사선; AP(전중부), 작잠(Antheraea pernyi) 전중부 견사선; AP(후부), 작잠 후부 견사선; BM-#2, 누에 2번 개체; AY-#2, 천잠 2번 개체.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천잠(Antheraea yamamai) 유래 신규 라카제-2(laccase-2) 유전자를 제공한다.

용어 '라카제(laccase)'는 p-디페놀(히드로퀴논)을 산소와 결합하여 p-퀴논으로 만드는 페놀산화효소의 일종으로, p-디페놀산화효소라고도 한다. 옻나무의 수액 속에서 옻을 산화시키고 경화하는 효소로서 발견되었으며, 리그닌과 같은 난분해성 물질을 산화시켜 분해할 수 있는 능력이 있는 효소이다.

본 발명에 따른 상기 천잠 유래 라카제-2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다.

본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.

상기 발현벡터는 숙주세포에 따라, 사용가능한 발현벡터의 종류가 결정될 수 있는데, 대장균을 숙주로서 사용하는 경우는 발현벡터로 pET28a 벡터를 예로 들수 있으며, 효모를 숙주로서 사용하는 경우는, YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등을 예로 들 수 있다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL 프로모터, AOD 프로모터 등을 사용할 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현 억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "형질전환"이란 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 형질전환 방법은 본 발명의 발현벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등의 공지 방법으로 숙주세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 재조합 라카제-2 효소를 코딩하는 유전자의 도입효율이 우수하고, 도입된 유전자의 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액을 리그닌을 포함하는 목질계 바이오매스에 처리하여, 리그닌을 생물학적으로 분해하는 방법을 제공한다.

상기 목질계 바이오매스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 본 발명의 천잠 유래 라카제-2 단백질에 의해 리그닌이 분해될 수 있는, 목본, 초본 또는 볏짚과 왕겨 등 농업 부산물 등일 수 있다.

본 발명의 상기 리그닌을 생물학적으로 분해하는 방법은 리그닌을 분해하는 단계를 사용하는 바이오에탄올 분야 또는 사료첨가제 분야의 어떠한 곳에도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액을 산업용 염색폐수에 처리하여, 염색폐수를 표백하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 재조합 미생물은 천잠 유래 라카제-2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물로, 라카제 효소는 다중 이중결합의 염료 등을 분해할 수 있어, 상기 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액은 염색 폐수를 표백할 수 있는 것이다.

본 발명은 또한,

(a) 본 발명의 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 배양물 또는 배양상등액으로부터 라카제-2 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 라카제-2 단백질의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환체를 배양하기 위한 배지 및 배양조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 영양배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스, 및 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신) 등을 포함할 수 있다. 배양시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

상기 라카제-2 단백질을 회수하는 단계는 통상적인 생화학 분리 기술에 의하거나 단백질의 한 부분 또는 다른 부분에 대한 항체를 사용하는 면역친화적인 방법으로 엔도글루카나제를 분리, 정제할 수 있다. 또 다른 방법은 단백질 서열에 태그(tag)를 가하여, 항체 또는 이러한 태그에 대하여 적절하게 높은 친화성을 갖는 기타 물질을 이용하는 친화 방법에 의해 정제할 수도 있다. 통상적인 생화학 분리 기술로는 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등이 있고, 통상적으로 이들을 조합하여 사용하여 순도가 높은 단백질을 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 라카제-2 단백질을 제공한다.

본 발명의 라카제-2 단백질은 천잠(Antheraea yamamai) 유래의 효소로, 리그닌 분해 활성 및 표백 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명은 상기 라카제-2 단백질을 유효성분으로 포함하는 옻 독 해독용 조성물을 제공한다. 본 발명의 옻 독 해독용 조성물은 유효성분으로 라카제 효소를 포함하고 있는데, 라카제 효소는 우루시올을 변형시켜 옻의 알러지 유발물질을 제거하는 기능이 있으므로, 라카제 단백질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 옻 독을 해독할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 천잠 유래의 라카제-2 유전자 확보를 위한 유전자 클로닝

천잠(Antheraea yamamai)의 중장(midgut) 조직과 누에(Bombyx mori)의 중장 조직을 적출하여 중장 조직 내 소화 내용물을 비교하였다. 그 결과 도 1과 같이 천잠과 누에의 중장 조직 내 소화 내용물이 큰 차이를 보임을 확인하였고, 이는 각각의 식식성(phytophagy)의 차이로부터 기인한 것으로 판단되었다. 또한, 이러한 식식성 차이에 따른 천잠의 중장 조직 특이적 효소의 확인을 위하여, 천잠의 중장 조직에서 총 RNA를 분리하고 이를 주형으로 하여 차세대염기서열분석법(NGS)을 통하여 새롭게 천잠의 라카제(laccase)-2 유전자 염기서열 일부를 확인하였다. 다음으로 그 결과를 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 Blast 검색을 수행한 결과, 일반누에(B. mori) 및 작잠(Antheraea pernyi) 고유의 라카제-2 유전자 염기서열(각각 Genbank accession no. EU093074 및 KU878363)과 유사함을 확인하였다.

천잠 유충으로부터 총 RNA 분리하고 이를 주형으로 하여 cDNA 합성을 수행하였으며，작잠의 라카제-2 유전정보를 통하여 라카제-2 유전자 특이적 프라이머를 제작하였고, cDNA와 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭하였다. 상기 PCR 반응을 통하여 증폭된 유전자는 pGEM-T Easy 벡터 내에 TA 클로닝 방법으로 삽입하여 클론 벡터를 제작하고, 시퀀싱을 수행하여 증폭된 천잠 유래의 라카제-2 유전자의 염기서열 정보를 확인하였다. 본 발명에서 확인한 천잠 라카제-2 유전자의 염기서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열(서열번호 2)은 기존에 알려진 라카제-2 유전자와 다소 차이가 있음을 확인하였다.

실시예 2. 천잠 유래의 라카제-2 유전자의 조직별 발현 확인

천잠(A. yamamai), 작잠(A. pernyi) 및 누에(B. moril)의 다양한 조직으로부터 총 RNA를 분리하고 이를 주형으로 하여 cDNA 합성을 수행하였으며，라카제-2 특이적 프라이머를 사용하여 조직별 라카제-2 유전자의 발현 수준을 분석하였다. 그 결과，도 2와 같이 라카제-2 유전자는 조직간 발현의 차이가 있음을 확인할 수 있었고, 특히, 작잠의 전중부 견사선(AP 전중부)와 천잠의 전중부 견사선(AY 전중부)에서 라카제-2 유전자가 고발현되고 있음을 확인할 수 있었다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY OF DAEGU INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel laccase-2 gene from Antheraea yamamai and uses thereof <130> PN16515 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2286 <212> DNA <213> Antheraea yamamai <400> 1 atggggtgca gtggaagatt ctgtttactg actctgttca tgtgcctagt gactgaactt 60 gctatcggtg tgagaattgt gcccaagaga aagaaagaag ccataaactc tgcggacgat 120 caatcaacat cggcatcatg gtggcaatcc ggcacaactt ctacattccg ggacactgcg 180 agtaacccat tttcctcgac tcacggactt atacaaactc acccaaccgc tgatgatccc 240 tttggatctt cattaggaac cattggtagc acaattggac cttcgtcaaa ccctttcgta 300 catagtggca gcggtccact tagtggagga gtaaggaata atccgttacc aagtctttcg 360 agaaatgtca acggaaaact atccttgaaa catttagatt tcacgagcag tgcaacagct 420 gaactaagga ggaatccagc tctgtcagcc cctgatgagt gtgctagagc ttgccgagaa 480 aatgaacctc caaggatttg ctattatcac tttactttgg aattgtacac agttttggga 540 gcggcgtgtc aagtgtgcac tcccaacgca actaacgtag tctggtctca ttgtcaatgc 600 gtgttagctg atggcgtcga gcgcggtatc ctctcagcaa atcgaatgat 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Val Gln Pro Val Gln Val Asn Thr Ile Ile Ser 420 425 430 Phe Ser Gly Glu Arg Tyr Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Asn Ile Pro 435 440 445 Gly Ala Tyr Trp Ile Gln Val Arg Gly Leu Gly Glu Cys Gly Ile Lys 450 455 460 Arg Thr Gln Gln Leu Gly Ile Leu Arg Tyr Ala Arg Gly Pro Tyr Gln 465 470 475 480 Pro Ser Ser Ala Ser Pro Thr Tyr Asp Val Gly Ile Pro Gln Gly Val 485 490 495 Val Met Asn Pro Leu Asp Ala Met Cys Asn Thr Ser Arg Asn Asp Ala 500 505 510 Ile Cys Val Ser Gln Leu Lys Asn Ala Arg His Ile Asp Pro Ala Ile 515 520 525 Leu Gln Glu Arg Pro Asp Val Lys Ile Phe Leu Pro Phe Arg Phe Phe 530 535 540 Val Tyr Thr Pro Glu Met Leu Phe Gln Pro Asn Thr Tyr Asn Arg Tyr 545 550 555 560 Leu Val Ala Pro Gly Gly Thr His Val Ile Ser Leu Ile Asp Glu Ile 565 570 575 Ser Tyr Met Ala Pro Pro Ala Pro Leu Ile Ser Gln Tyr Asp Asp Ile 580 585 590 Asn Pro Asp Gln Phe Cys Asn Gly Asp Asn Arg Pro Ala Asn Cys Gly 595 600 605 Gln Asn Cys Met Cys Thr His Lys Val Asp Ile Pro Leu Asn Ala Val 610 615 620 Val Glu Ile Val Leu Val Asp Glu Val Gln Ile Thr Asn Leu Ser His 625 630 635 640 Pro Phe His Leu His Gly Tyr Ala Tyr Asn Val Ile Gly Ile Gly Arg 645 650 655 Ser Pro Asp Gln Asn Val Lys Lys Ile Asn Leu Lys His Ala Leu Asp 660 665 670 Leu Asp Arg Arg Gly Leu Leu Glu Arg His Leu Lys Gln Gly Asp Leu 675 680 685 Pro Pro Ala Lys Asp Thr Ile Ala Val Pro Asn Asn Gly Tyr Val Ile 690 695 700 Leu Arg Phe Arg Ala Asn Asn Pro Gly Phe Trp Leu Leu His Cys His 705 710 715 720 Phe Leu Phe His Ile Val Ile Gly Met Asn Val Val Leu Gln Val Gly 725 730 735 Thr Gln Thr Asp Leu Pro Pro Ile Pro Pro Asn Phe Pro Thr Cys Gly 740 745 750 Asp His Leu Pro Pro Ile Gly Leu Asn 755 760

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 천잠(Antheraea yamamai) 유래 신규 라카제-2(laccase-2) 유전자.
2. 제1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
3. 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
4. 제3항의 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액을 리그닌을 포함하는 목질계 바이오매스에 처리하여, 리그닌을 생물학적으로 분해하는 방법.
5. 제3항의 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액을 산업용 염색폐수에 처리하는 단계를 포함하는, 염색폐수를 표백하는 방법.
6. (a) 제3항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 배양물 또는 배양상등액으로부터 라카제-2 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 라카제-2 단백질의 생산 방법.
7. 제6항의 방법에 의해 생산된 라카제-2 단백질.
8. 제7항의 라카제-2 단백질을 유효성분으로 포함하는 옻 독 해독용 조성물.

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