KR20180092942A - 약물 과민 반응의 원인 약물의 확인을 위한 방법 및 확인 키트 - Google Patents

약물 과민 반응의 원인 약물의 확인을 위한 방법 및 확인 키트 Download PDF

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Abstract

약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위한 방법 및 확인 키트로서, 먼저, 생물학적 샘플 림프구 및 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질을 시험관내 공동 배양하여 반응물을 형성한 다음, 반응물 중의 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준을 검출하고, 대조군 값과 비교한 다음, 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질이 림프구를 활성화시키는 정도를 확인할 수 있고, 따라서 약물 알레르기 반응을 나타내는 민감화 약물을 확인하는 것을 포함하는, 방법 및 확인 키트가 기재된다. 민감화 약물은 T-세포 활성화를 유발할 수 있는 양약, 전통 한약, 백신 및 항원 분자를 포함하고, 따라서, 본 발명은 빠르고 경제적이며, 높은 민감성 및 높은 특이성 등을 갖는 단일의, 실행이 용이한 기술과 같은 우수한 성질을 갖는다.

Description

약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위한 방법 및 확인 키트
본 발명은 약물 알레르기 반응의 민감화(sensitizing) 약물의 확인을 위한 방법 및 확인 키트로서, 약물 알레르기 반응의 민감화 약물을 확인하기 위하여, 생물학적 샘플로부터의 림프구를 의심스러운 민감화 약물 또는 이의 대사물질과 함께 시험관내 배양하여 반응물을 형성하는 단계, 및 반응물 중의 그라눌리신(granulysin) 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준을 정량하고 대조군의 것과 비교하는 단계를 포함하는, 방법 및 확인 키트에 관한 것이다. 본 발명은 빠르고 경제적이며, 높은 민감성 및 높은 특이성 등을 갖는 단일의, 실행이 용이한 기술과 같은 우수한 성질을 갖는다.
약물 알레르기 반응은 일종의 약물 유발성의, 사망을 초래할 수 있는 면역 질환이고, 호산구 증가증과 전신 증상이 있는 약물 발진(drug rash with eosinophilia and systemic symptom: DRESS), 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome: SJS), 및 독성 표피 괴사용해(toxic epidermal necrolysis: TEN)를 포함하여 가벼운 형태의 반구진 발진(maculopapular eruption: MPE), 대 다형성 홍반(erythema multiforme majus: EMM), 고정 약물 발진(fixed drug eruption: FDE)으부터 생명을 위협하는 심각한 피부 유해 반응(severe cutaneous adverse reaction: SCAR)까지의 범위를 갖는다.
SCAR은 약물-특이적 T 세포를 포함하는 것으로 생각된다. 통상적인 림프구 변형 시험(lymphocyte transformation test: LTT)은 T 세포-매개된 과민성의 민감화 약물을 시험하는데 가장 널리 사용된다. 이는 림프구를 환자로부터 수득하고, 림프구를 의심스러운 약물로 자극하고, DNA로의 3H-티미딘 혼입의 양을 측정하여 시험관내 배양의 1주 기간 동안 T 림프구 증식을 측정하는, 시험관내 T 세포 활성화 및 증식 배양 방법이다. 그러나, LTT의 민감성은 SCAR에 대하여 매우 낮고, SJS/TEN의 민감화 약물의 시험은 일반적으로 부정적인 결과를 수득한다. 추가로, 방사능 검정 기술의 작동은 숙련된 기술자 및 비싼 기구를 필요로 하고, 승인된 방사선-작업 환경하에 오직 면허를 받은 인원에 의해 실시되며, 방사선으로부터의 잠재적인 건강 위협은 이러한 검정의 한계이다.
약물 알레르기 반응을 진단하는 또 다른 방식은 인터페론 감마(IFN-γ), 인터류킨(IL)-2,5,13와 같은 사이토킨의 합성 및 발현 수준을 검출하는 것이다. 이러한 방식은 T 세포의 활성화 및 배양 상청액 중의 사이토킨의 양, 또는 유세포 분석기를 통한 세포내 사이토킨의 양, 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 또는 역전사-PCR(RT-PCR)을 통한 세포내 사이토킨 유전자 발현의 평가를 포함한다. 이들 사이토킨이 약물 알레르기 반응이 있는 환자로부터의 민감화 약물을 확인하는데 사용될 수 있음에도 불구하고, 이들 사이토킨은 일반적으로 약물 알레르기에 특이적이지 않으며, 민감성은 또한 매우 낮고, 따라서 임상 용도로 적합하지 않다. 게다가, 이러한 방법은 더 많은 혈액 샘플을 필요로 하고, 민감성이 낮은 혈액 세포의 표면 위의 면역 분자를 검출하기 위한 비싼 유세포 분석기의 사용은 시약 구입을 위한 증가된 비용, 및 증가된 시간 및 노동 소모를 요구한다.
본 발명자들은 먼저 그라눌리신(GNLY)이 SJS/TEN의 파종성 각질세포 사멸에서 주요 매개체인 것을 발견하였다. 본 발명자들의 등록된 특허 제TW I333978호(제US 7718378 B2호)에는 SJS 및 TEN의 진단 또는 치료 방법에서 그라눌리신의 사용이 개시되어 있다. 그러나, 특허에는 그라눌리신에 의한 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인 방법이 개시되지 않았다.
상기 관점에서, 통상적인 LTT는 제한된 민감성을 갖는 비싼 방법이다. LTT의 실시는 방사성 물질을 작업하기 위한 면허를 갖는 숙련된 기술자를 필요로 하고, 또한 승인된 방사선-작업 환경에 의해 제한된다. 다시 말해서, 유세포 분석기에 의한 세포내 그라눌리신 검출은 낮은 민감성을 갖고, SCAR의 민감화 약물을 확인하는 다른 방법의 조합을 필요로 한다. 현재는, 약물 알레르기 반응의 민감화 약물을 확인하는, 높은 민감성, 높은 신뢰성을 갖지만 낮은 비용을 갖는 방법이 아직 없다. 따라서, 선행 기술의 개선의 여지가 여전히 존재한다.
본 발명은 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인 방법으로서, 단계 1: 생물학적 표본으로부터의 림프구를 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질(들)과 함께 시험관내 배양하여 반응물을 형성하는 단계; 단계 2: 반응물 중의 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준을 정량하고 대조군의 것과 비교하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준이 대조군의 것과 비교하여 1.2배 이상 높은 경우, 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질(들)은 림프구 활성화를 더 유발하고, 민감화 약물이며 아마도 약물 알레르기 반응을 유도한다.
용어 "대조군"은 민감화 약물을 위한 용매 존재 또는 부재하에 배양 배지에 배양되는 생물학적 표본으로부터의 림프구의 그라눌리신 발현 수준을 의미한다.
여기서, 단계 2에서 그라눌리신의 발현 수준은 반응물 중의 그라눌리신 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적인 포획 항체 및 검출 항체에 의해 정량된다.
여기서, 단계 2에서 그라눌리신의 발현 수준은 반응물 중의 그라눌리신 mRNA를 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브와 혼성화시킴으로써 정량된다.
여기서, 포획 항체 및 검출 항체에 의한 반응물 중의 그라눌리신의 발현 수준을 검출하는 방법은 효소 결합 면역흡착 검정법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 또는 효소 결합 면역점(enzyme-linked immunospot: ELISPOT)이다.
여기서, 림프구는 대상체로부터 단리된 말초 혈액 또는 생물학적 유체, 바람직하게는 말초 혈액으로부터의 세포를 포함한다.
여기서, 약물 알레르기 반응은 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사용해, 호산구 증가증과 전신 증상이 있는 약물 발진, 반구진 발진, 대 다형성 홍반, 및 고정 약물 발진을 포함한다.
여기서, 민감화 약물은 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 양약, 한약, 백신 또는 항원을 포함한다.
약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위한 확인 키트는 하기 시약을 포함한다; 시약 및 생물학적 표본으로부터의 림프구를 의심스러운 민감화 약물 또는 이의 대사물질(들)과 함께 시험관내 공동 재배하여(co-cultivate) 반응물을 형성하는, 시험 키트; 시험 키트에 의해 생성된 반응물과 상호작용하는, 검출 키트. 반응물 중의 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준은 정량되고, 대조군의 것과 비교된다. 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준이 대조군의 것과 비교하여 1.2배 이상 높은 경우, 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질(들)은 민감화 약물이다.
여기서, 검출 키트는 반응물 중의 그라눌리신의 발현 수준을 정량하기 위하여 그라눌리신에 특이적인 특이적 포획 항체 및 검출 항체를 포함한다.
여기서, 검출 키트는 반응물 중의 그라눌리신의 mRNA 발현 수준을 정량하기 위하여 그라눌리신 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브를 포함한다.
여기서, 특이적 포획 항체 및 검출 항체에 의한 반응물 중의 그라눌리신의 발현 수준의 검출 방법은 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA) 또는 효소 결합 면역점(ELISPOT)이다.
여기서, 약물 알레르기 반응은 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사용해, 호산구 증가증과 전신 증상이 있는 약물 발진, 반구진 발진, 대 다형성 홍반, 및 고정 약물 발진을 포함한다.
여기서, 민감화 약물은 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 양약, 한약, 백신 또는 항원을 포함한다.
본 발명은 림프구를 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질(들)과 함께 시험관내 배양하여 반응물을 형성하는 것 및 활성화된 림프구에 의해 생성되는 그라눌리신에 대항하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 프로브, 및 포획 및 검출 항체의 사용에 관한 것이다. 여기서, 시험관내 배양 조건은 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질의 농도, 배양 배지의 조성, 및 배양 시간을 포함한다. 본 발명은 빠르고 경제적이며, 높은 민감성 및 높은 특이성 등을 갖는 단일의, 실행이 용이한 기술과 같은 우수한 성질을 갖는다.
본 발명의 기술, 수단 및 효과에 관하여, 본 발명의 상기 목적 및 특징은 첨부된 도면과 함께 볼 때 하기 상세한 설명으로부터 더 우수하게 이해될 수 있는 것으로 생각된다.
도 1은 본 발명의 검출 흐름도의 블록 다이어그램이다.
도 2는 SCAR 환자, 내성 대조군 또는 건강한 공여자로부터의 림프구를 의심스러운 약물/대사물질과 함께 1 내지 2주 동안 배양함으로써 수득된 그라눌리신의 발현 수준이다. 여기서, 그라눌리신의 발현은 ELISA에 의해 검출되었고, 그라눌리신의 배수 변화는 용매 대조군의 것에 의해 정규화되었다.
도 3은 SCAR 환자, 내성 대조군 또는 건강한 공여자로부터의 림프구를 의심스러운 약물/대사물질과 함께 1 내지 2주 동안 배양함으로써 수득된 IFN-γ의 발현 수준이다. 여기서, IFN-γ의 발현은 ELISA에 의해 검출되었고, IFN-γ의 배수 변화는 용매 대조군의 것에 의해 정규화되었다.
도 4는 알로퓨리놀-SCAR 환자로부터의 림프구를 치료학적 수준의 1배(1X) 또는 10배(10X) 농도의 약물과 함께 1주 동안 배양함으로써 수득된 그라눌리신 mRNA의 발현 수준이다. 여기서, 그라눌리신 mRNA의 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었고, 그라눌리신의 배수 변화는 용매 대조군의 것에 의해 정규화되었다.
도 1 내지 도 4에 관하여, 본 발명은 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인 방법으로서, 단계 1: 생물학적 표본으로부터의 림프구를 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질과 함께 시험관내 배양하여 반응물을 형성하는 단계; 단계 2: 반응물 중의 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준을 정량하고 대조군의 것과 비교하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준이 대조군의 것과 비교하여 1.2배 이상 높은 경우는 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질(들)이 림프구 활성화를 더 유발하고, 아마도 약물 알레르기 반응을 유도하는 민감화 약물임을 나타낸다.
용어 "대조군"은 약물을 위한 용매의 존재 또는 부재하에 배양 배지에 배양되는 생물학적 표본으로부터의 림프구의 그라눌리신 발현 수준을 의미한다.
여기서, 단계 2에서 그라눌리신의 발현 수준은 반응물 중의 그라눌리신 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적인 포획 항체 및 검출 항체에 의해 정량된다.
여기서, 단계 2에서 그라눌리신의 발현 수준은 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브를 반응물 중의 그라눌리신 mRNA에 혼성화시킴으로써 정량된다.
여기서, 민감화 약물은 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 양약, 한약, 백신 또는 항원을 포함한다.
여기서, 약물 알레르기 반응은 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 독성 표피 괴사용해(TEN), 호산구 증가증과 전신 증상이 있는 약물 발진(DRESS), 반구진 발진(MPE), 대 다형성 홍반(EMM), 또는 고정 약물 발진(FDE)을 포함한다.
림프구 배양 배지 중의 그라눌리신 단백질 또는 핵산의 발현 수준은 대상체로부터 림프구를 수득하고, 림프구를 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질 또는 내성 약물과 함께 배양함으로써 평가될 수 있다. 용어 "림프구"는 대상체로부터 단리된 말초 혈액 또는 생물학적 유체, 바람직하게는 말초 혈액으로부터의 세포를 포함한다. 그라눌리신 발현 수준은 그라눌리신 유전자에 의해 인코딩된 mRNA를 측정하는 방식; 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 양을 측정하는 방식; 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 측정하는 방식을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 방식으로 측정될 수 있다.
반응물 중의 배양된 백혈구로부터 단리된 mRNA의 수준은 노던 블롯 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 프로브 어레이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 혼성화 또는 증폭 검정에 의해 측정될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위한 바람직한 진단 방법 중 하나는 그라눌리신 mRNA에 혼성화될 수 있는 핵산 분자(프로브)의 사용을 포함한다. 핵산 프로브는, 예를 들면, 전장 그라눌리신 핵산 또는 이의 부분, 예를 들면, 길이가 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 250개의 뉴클레오타이드이고, 엄격한 조건하에 그라눌리신 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화되는데 충분한 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
반응물 중의 그라눌리신 mRNA 수준은 또한 핵산 증폭, 예를 들면, RT-PCR, 리가아제 연쇄 반응, 자가 유지 서열 복제, 전사 증폭 시스템, Q-베타 레플리카제(Q-Beta Replicase), 회전 환형 복제, 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법 후, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하는 증폭된 프라이머의 검출에 의해 평가될 수 있다. 본 발명에서, 증폭 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 영역(각각 플러스 및 마이너스, 또는 그 반대)으로 어닐링될 수 있는 한 쌍의 핵산 분자로서 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 길이가 약 10 내지 30개의 뉴클레오타이드이고, 길이가 약 50 내지 200개의 뉴클레오타이드인 영역을 플랭킹(flanking)한다. 적절한 조건하에 적절한 시약과 함께, 이러한 프라이머는 프라이머에 의해 플랭킹된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 허용한다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 방법은 대조군 샘플을 증폭 프라이머와 혼성화시켜 그라눌리신 mRNA 또는 게놈 DNA를 검출하는 단계, 및 대조군 샘플 및 시험 샘플 중의 그라눌리신 mRNA 또는 게놈 DNA의 발현을 비교하는 단계를 포함한다.
반응물(배양된 림프구의 상청액) 중의 그라눌리신 단백질의 수준을 측정하는데 다양한 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 단백질 또는 이의 항원 또는 면역원 절편, 예를 들면, 항체에 선택적으로 결합하는 제제를 샘플과 접촉시키는 단계, 및 샘플 중의 단백질의 수준을 평가하는 단계를 포함한다. 기술은 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA), 효소 결합 면역점(ELISPOT) 검정, 면역침강법, 면역형광법, 효소 면역검정법(EIA), 방사면역검정법(RIA), 및 웨스턴 블롯 분석을 포함한다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 방법은 대조군 샘플과 시험 샘플 사이의 그라눌리신의 발현을 비교하는 단계를 더 포함한다. 이러한 방법은 실험 값과 참조 값(예를 들면, 샘플을 배지/용매 대조군과 함께 배양)의 비교를 더 포함한다.
본 발명은 또한 하기 시약을 포함하는, 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위한 확인 키트를 포함한다: 시약을 생물학적 표본으로부터의 림프구 및 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질과 함께 시험관내 배양하여 반응물을 형성하는, 시험 키트; 시험 키트의 반응물과 상호작용하고, 반응물 중의 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준을 정량하는, 검출 키트. 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준이 대조군의 것과 비교하여 1.2배 이상 높은 경우, 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질(들)은 민감화 약물로 결정될 수 있다.
여기서, 검출 키트는 반응물 중의 그라눌리신의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위하여 그라눌리신 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브를 포함한다.
여기서, 검출 키트는 반응물 중의 그라눌리신의 발현 수준을 검출하기 위하여 그라눌리신에 특이적인 특이적 포획 항체 및 검출 항체를 포함한다.
여기서, 포획 항체 및 검출 항체에 의하여 반응물 중의 그라눌리신의 발현 수준을 검출하는 방법은 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA) 또는 효소 결합 면역점(ELISPOT)이다.
여기서, 민감화 약물은 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 양약, 한약, 백신 또는 항원을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법은 약물 알레르기 반응을 갖거나 이의 발병 위험이 있는 대상체의 민감화 약물을 확인할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약물 알레르기 반응"은 반구진 발진(MPE), 고정 약물 발진(FDE), 대 다형성 홍반(EMM), 심각한 피부 유해 반응(SCAR), 호산구 증가증과 전신 증상이 있는 약물 발진(DRESS), 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 또는 독성 표피 괴사용해(TEN)를 포함한다.
방법은 시험 샘플의 값을 대조군 샘플(예를 들면, 샘플을 배지/용매 대조군과 함께 배양)의 값과 비교하는 것을 더 포함한다. 샘플의 그라눌리신 발현 값은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 샘플로부터의 핵산을 제공하고, 핵산을 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브에 접촉시키거나 상청액 또는 세포를 항-그라눌리신 항체에 접촉시킴으로써 수득된다.
본 발명은 의심스러운 약물 및 대사물질과 함께 림프구의 시험관내 배양을 포함하고, ELISA 또는 ELISPOT에 의해 그라눌리신 단백질의 발현, 또는 정성 실시간 PCR에 의해 그라눌리신 mRNA의 발현을 검출한다. 단계는 환자로부터의 전혈로부터 림프구를 단리하는 것 및 림프구를 37℃에서 5% CO2와 함께 RPMI-1640 배지 중에 96-웰 마이크로플레이트에서 배양하는 것을 포함한다. 림프구와 공동 배양(co-culture)되는 의심스러운 약물, 약물 대사물질 또는 내성 약물을 배양 배지를 사용하여 희석하여 생리학상 치료학적 수준(1배, 1X), 0.1배(0.1X), 및 10배(10X)의 농도를 수득하고, 1 내지 2주 동안 공동 배양하였다.
의심스러운 약물 또는 대사물질과 함께 림프구의 배양: 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜-파크(Ficoll-Paque)(Pharmacia Fine Chemicals, 미국 소재) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 전혈 샘플로부터 단리하였다. PBMC(1.0x106/웰)를 10% 자가조직 혈청 및 IL7(1 ng/㎖)로 보충된 RPMI-1640 배지(GIBCO Invitrogen, Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 중에 96-웰 마이크로플레이트에서 37℃에서 5% CO2 중에서 1 내지 2주 동안 배양하였다. 시험을 위한 의심스러운 약물, 대사물질 또는 내성 약물을 배지 중에 희석하여 생리학상 치료학적 수준(1배로 기재됨), 0.1배 또는 10배를 반영하는 농도를 수득하였다. 예를 들면, 세포를 옥시퓨리놀(10 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖) 또는 환자에 의해 3개월 이상 임의의 유해 반응 없이 사용되었던 내성 약물을 함유하는 배지 중에 배양하였다. 추가로, 용매를 음성 대조군으로서 배지에 가하고, 10 ㎍/㎖ 농도의 식물성응집소(phytohemagglutinin: PHA)를 양성 대조군으로 사용하였다.
그라눌리신 발현의 ELISA 정량: 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA)을 사용하여 그라눌리신의 수준을 측정하기 위하여, 배양 상청액을 제7일 및 제14일에 수집하였다. 간략하게, 플레이트(Nunc, 덴마크 로스킬레 소재)를 항-그라눌리신 단일클론 항체 G011 50 ㎍/㎖로 코팅한 다음, 세척 버퍼(0.1% Tween-20을 함유한 PBS) 중의 10% FBS로 차단하고, 실온에서 2시간 동안 차단 버퍼; 1시간 동안 차단 버퍼 중의 비오틸화 항-그라눌리신 단일클론 항체 G052 1 ㎍/㎖; 및 세척 버퍼 중의 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘 2㎍/㎖와 순차적으로 배양하고 반응시켰다. 두 배양 사이에, 플레이트를 세척 버퍼를 사용하여 세척하였다. 최종적으로, 플레이트를 H2O2 및 테트라메틸벤지딘을 함유한 기질 용액과 함께 배양하였고, 각각의 반응 사이에 세척 단계가 있었다. 샘플을 3중으로 분석하였다. 그라눌리신에 대한 검정 민감성은 1.56 ng/㎖이었다. 추가로, 샘플 중의 IFN-γ의 수준은 민감성이 1.56 pg/㎖인 IFN-γ ELISA 키트(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)로 측정하였다.
정량 실시간 RT-PCR: 전체 RNA를 배양된 백혈구로부터 단리하였다. 그라눌리신 mRNA 수준을 마스터 SYBR 그린 1 키트를 사용하는 라이트사이클러(LightCycler)(Roche molecular Biochemicals) 기반의 실시간 정량 RT-PCR을 사용하여 정량하였다. 절대 카피 수를 이전에 기재된 방법을 사용하여 측정하였다(Matsushita et al. Br J Haematol. 2001 March; 112(4):916-26). 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다:
그라눌리신:
5'-TCTCTCGTCTGAGCCC-3'
5'-GCAGCATTGGAAACACT-3'
β-액틴:
5'-ACATCCGCAAAGACCT-3'
5'-AGGG TGTAACGCAACTA-3'
통계적 분석: 데이터를 용매 대조군으로 나누어 의심스러운 약물/대사물질 또는 내성 약물에 의해 자극된 림프구의 배양 상청액 중의 그라눌리신의 배수 변화를 계산하였다. 그룹 간의 유의미한 차이를 하나의 샘플 t 시험 또는 스튜던트 t 시험으로 분석하였다. 민감성 및 특이성은 표준 정의에 따라 계산하였다. 모든 P 값은 양측성이었고, 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 통계적 분석은 SPSS 소프트웨어 버젼 18.0(SPSS Inc, 미국 일리노이주 시카고 소재)을 사용하여 수행하였다.
약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인에 유용할 수 있다는 것을 입증하기 위하여, 이 실시예는 SJS, TEN, FDE, 및 EMM을 포함한 심각한 피부 유해 약물 반응(SCAR)이 있는 환자 22명을 등록하였다. 이들 환자로부터의 PBMC를 단리하고, 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질과 함께 1 내지 2주 동안 시험관내 배양하였다. 민감성을 비교하기 위하여 배양의 상청액 중의 그라눌리신 및 IFN-γ의 수준을 ELISA로 측정하였다. 데이터는 그라눌리신의 민감성이 77.3-81.8%인 것을 보여준다. 그러나, IFN-γ의 민감성은 20%보다 낮다(표 1). 따라서, 본 실험은 그라눌리신-기반의 약물 림프구 자극 시험에서 ELISA에 의한 그라눌리신의 검출이 높은 민감성을 갖고, 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위하여 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
SCAR 환자 22명으로부터의 림프구를 의심스러운 약물로 1 내지 2주 동안 자극하였다. 방출된 그라눌리신 및 IFN-γ의 수준을 ELISA로 측정하여 민감성을 비교하였다.
민감성(%)
그라눌리신 IFN-γ
1주 77.3 18.2 p=2.03X10-4
2주 81.8 13.6 p=1.16X10-5
본 발명은 추가로 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위하여 그라눌리신의 특이성을 시험하였다. 내성 대조군 및 건강한 개체로부터의 림프구는 아닌 약물 알레르기 환자로부터의 림프구만이 민감화 약물/이의 대사물질과 함께 배양한 경우 그라눌리신 발현을 유도할 것임을 증명하기 위하여, 이 실시예는 내성 대조군 11명 및 건강한 공여자 10명을 등록하였다. 이들의 PBMC를 단리하고, 민감화 약물 또는 대사물질과 함께 1 내지 2주 동안 시험관내 배양하였다. 특이성 비교를 위하여 배양의 상청액 중의 그라눌리신 및 IFN-γ의 수준을 ELISA로 측정하였다. 데이터는 그라눌리신 및 IFN-γ의 특이성이 내성 대조군에서 1주 배양 후 각각 95.7% 및 76.2%임을 보여준다. 2주 배양 후, 그라눌리신 및 IFN-γ의 특이성은 내성 대조군에서 각각 92.9% 및 77.8%이다(표 2). 건강한 공여자에서, 그라눌리신 및 IFN-γ의 특이성은 2주 배양 후 각각 86.7% 및 75.6%이다(표 2). 따라서, 이 실험은 그라눌리신-기반의 약물 림프구 자극 시험에서 ELISA에 의한 그라눌리신의 검출이 높은 특이성을 갖고, 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위하여 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
내성 대조군 11명 및 건강한 공여자 10명으로부터의 림프구를 약물로 1 내지 2주 동안 자극하였다. 민감성의 비교를 위하여 방출된 그라눌리신 및 IFN-γ의 수준을 ELISA로 측정하였다.
특이성(%)
내성 대조군 건강한 대조군
1주 2주 1주 2주
그라눌리신 95.7 92.9 - 86.7
IFN-γ 76.2 77.8 - 75.6
SCAR 환자, 내성 대조군 및 건강한 공여자로부터의 림프구를 민감화 약물/대사물질 또는 내성 약물과 함께 1 내지 2주 동안 시험관내 배양하고, ELISA에 의해 측정된 그라눌리신 및 IFN-γ의 발현을 도 2 및 도 3에 도시하였다. 결과는 민감화 약물/대사물질을 SCAR 환자 22명으로부터의 림프구와 함께 배양함으로써 그라눌리신의 강력한 발현이 배양 중에 유도되었다는 것을 보여준다. 그러나, 내성 대조군 및 건강한 공여자 10명에서 통계학적 차이는 없었다(도 2 및 도 3). 일부 SCAR 환자에서 림프구 자극 후 IFN-γ의 발현이 증가되었지만(도 3A 및 도 3B), 이는 오직 몇 가지 경우로 제한되었으며 특이적인 바이오마커로서 충분하지 않았다. 따라서, 결과는 그라눌리신 기반의 약물 림프구 자극 시험에서 ELISA에 의한 그라눌리신의 검출이 약물 알레르기 반응의 민감화 약물을 확인하는 가장 우수한 방법임을 제안한다.
도 4는 그라눌리신 mRNA 수준에 관한 것이다. 본 실시예는 알로퓨리놀-유도된 SCAR 환자 3명을 등록하였다. 이들의 림프구를 1배(1X) 또는 10배(10X)의 민감화 약물/대사물질 또는 다른 내성 약물과 함께 1주 동안 시험관내 배양하였다. 그라눌리신 mRNA의 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 결과는 또한 1배(1X) 또는 10배(10X) 민감화 약물/대사물질에 의해 자극되었는지 여부와 관계없이 그라눌리신이 더 민감하고(66.7%) 더 특이적임(100%)을 보여준다.
상기에 따라, 본 발명은 그라눌리신-기반의 T-세포 활성화 검정이 높은 특이성 및 민감성을 갖는 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위한 유용한 방법이 될 수 있다는 것을 증명한다. 본 발명은 시험관내 그라눌리신-기반의 약물 림프구 자극 시험에서 그라눌리신 mRNA 및 단백질 발현을 측정하는 방법을 제공한다. 또한 그라눌리신 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 그라눌리신 단백질을 인식할 수 있는 항체를 포함하는, 시험관내 그라눌리신-기반의 약물 림프구 자극 시험에서 그라눌리신 mRNA 및 단백질 발현을 측정하는 키트가 제공된다.
본 발명에서 바람직한 실시형태의 수단이 본 명세서에 기재되었지만, 청구항에 기재된 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않고 많은 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가에 의해 만들어질 수 있다. 변형 및 변화는 본 발명의 명세서에 의해 제한된 범위에 속하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CHANG GUNG MEMORIAL HOSPITAL, LINKOU <120> METHOD AND IDENTIFICATION KIT FOR IDENTIFYING SENSITIZING DRUG FOR DRUG ALLERGIC REACTION <130> WO/2017/070916 <140> PCT/CN2015/093319 <141> 2015-10-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Granulysin primer <400> 1 tctctcgtct gagccc 16 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Granulysin primer <400> 2 gcagcattgg aaacact 17 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Actin Primer <400> 3 acatccgcaa agacct 16 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Actin Primer <400> 4 agggtgtaac gcaacta 17

Claims (13)

  1. 약물 알레르기 반응의 민감화(sensitizing) 약물의 확인 방법으로서,
    단계 1: 생물학적 표본으로부터의 상기 림프구를 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질과 함께 시험관내 배양하여 반응물을 형성하는 단계;
    단계 2: 상기 반응물 중의 그라눌리신(granulysin) 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준을 정량하고 대조군의 것과 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준이 대조군의 것과 비교하여 1.2배 이상 높은 경우에는 상기 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질이 상기 민감화 약물임을 나타내는, 확인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 2에서 그라눌리신의 발현 수준을 특이적 포획 항체 및 검출 항체에 의해 정량하여 상기 반응물 중의 상기 그라눌리신 단백질 또는 폴리펩타이드를 검출하는, 확인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 2에서 그라눌리신의 발현 수준을 상기 반응물 중의 그라눌리신 mRNA를 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브와 혼성화시킴으로써 정량하는, 확인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 림프구가 대상체로부터 단리된 말초 혈액 또는 생물학적 유체, 바람직하게는 말초 혈액으로부터의 세포인, 확인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 포획 항체 및 검출 항체에 의한 상기 반응물 중의 그라눌리신의 발현 수준의 검출 방법이 효소 결합 면역흡착 검정법(enzyme-linked immunosorbent assay ) 또는 효소 결합 면역점(enzyme-linked immunospot)인, 확인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약물 알레르기 반응이 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 독성 표피 괴사용해(TEN), 호산구 증가증과 전신 증상이 있는 약물 반응(DRESS), 반구진 발진(MPE), 대 다형성 홍반(EMM), 및 고정 약물 발진(FDE)을 포함하는, 확인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 민감화 약물이 T 세포 활성화를 유도하는 양약, 한약, 백신 또는 항원을 포함하는, 확인 방법.
  8. 약물 알레르기 반응의 민감화 약물의 확인을 위한 확인 키트로서,
    시약을 생물학적 표본으로부터의 림프구 및 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질과 함께 시험관내 배양하여 반응물을 형성하는 시험 키트;
    상기 시험 키트에서 상기 반응물과 상호작용하고, 상기 반응물 중의 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준을 정량하는 검출 키트를 포함하되,
    상기 그라눌리신 단백질, 폴리펩타이드 또는 mRNA의 발현 수준이 대조군의 것과 비교하여 1.2배 이상 높은 경우에는 상기 의심스러운 약물 또는 이의 대사물질이 상기 민감화 약물임을 나타내는, 확인 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출 키트가 상기 반응물 중의 그라눌리신의 발현 수준을 정량하기 위하여 그라눌리신에 특이적인 특이적 포획 항체 및 검출 항체를 포함하는, 확인 키트.
  10. 제8항에 있어서, 상기 검출 키트가 상기 반응물 중의 그라눌리신의 mRNA 발현 수준을 검출하기 위하여 그라눌리신에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 확인 키트.
  11. 제9항에 있어서, 상기 특이적 포획 항체 및 상기 검출 항체에 의한 상기 반응물 중의 그라눌리신의 발현 수준의 검출 방법이 효소 결합 면역흡착 검정법 또는 효소 결합 면역점인, 확인 키트.
  12. 제8항에 있어서, 상기 약물 알레르기 반응이 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 독성 표피 괴사용해(TEN), 호산구 증가증과 전신 증상이 있는 약물 반응(DRESS), 반구진 발진(MPE), 대 다형성 홍반(EMM), 및 고정 약물 발진(FDE)을 포함하는, 확인 키트.
  13. 제8항에 있어서, 상기 민감화 약물이 T 세포 활성화를 유도하는 양약, 한약, 백신 및 항원을 포함하는, 확인 키트.
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