KR20180085146A - miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20180085146A
KR20180085146A KR1020170008389A KR20170008389A KR20180085146A KR 20180085146 A KR20180085146 A KR 20180085146A KR 1020170008389 A KR1020170008389 A KR 1020170008389A KR 20170008389 A KR20170008389 A KR 20170008389A KR 20180085146 A KR20180085146 A KR 20180085146A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bart1
mir
cancer
inhibitor
ebv
Prior art date
Application number
KR1020170008389A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101985067B1 (ko
Inventor
이숙경
최호윤
김효지
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020170008389A priority Critical patent/KR101985067B1/ko
Publication of KR20180085146A publication Critical patent/KR20180085146A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101985067B1 publication Critical patent/KR101985067B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4739—Cyclin; Prad 1

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 miR-BART1-3p 억제제인 miR-BART1-3p에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 위암(gastric cancer), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma) 또는 비인두암(nasopharyngeal carcinoma)을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer comprising miR-BART1-3p inhibitor as active ingredient}
본 발명은 miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
miRNAs(microRNAs)는 22 bp 이하의 짧은 뉴클레오타이드로서, 단일가닥의 비-코딩 RNA 분자로서, 세포 내에서 만들어진 헤어핀 형태의 긴 전사체가 Drosha와 Dicer라는 효소에 의해 잘려져서 생성된다 (Nature. 2003 Sep 25;425(6956):415-9). 대부분의 miRNA들은 타겟 유전자 mRNA의 3' untranslated region (UTR)에 결합하여 번역을 억제하며, 세포 내에서 다양한 기능을 나타낸다. 예를 들어, 세포 성장, 세포 분화, 세포 사멸과 같은 세포 내 기능뿐만 아니라 암을 포함하는 다양한 질환과도 연관이 있다. 특히, 암과 연관해서 50% 이상의 miRNA가 암과 연관된 유전자 영역에 있는 것으로 나타났다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2;101(9):2999-3004). miRNA 조절 이상은 위암, 폐암, 유방암, 대장암 등과 연관이 있다.
EBV (Epstein Barr Virus)는 바이러스로는 최초로 miRNA를 발현한다는 것이 2004년에 보고되었다. 이후, EBV에서는 25개의 pre-miRNA와 44개의 mature miRNA가 발견되었다. EBV miRNA는 BHRF1 전사체에서 만들어지는 4개의 BHRF1 miRNA 및 BART 전사체에서 만들어지는 40개의 BART miRNA로 나뉘어지는 것으로 알려져 있다. 또한, BHRF1 miRNA는 latency III 에서만 발현되나 BART miRNA는 대다수의 EBV 연관 종양 및 세포주에서 발현되는 것으로 보고 된다.
우리는 EBV BART miRNA 중 miR-BART1-3p가 세포 생장에 중요한 역할을 하는 Cyclin D1을 조절하는 것을 발견하였다. EBV가 감염되어 miR-BART1-3를 발현하는 AGS-EBV에 miR-BART1-3p 저해제를 전달한 결과 AGS-EBV의 세포 생장이 감소되는 것을 확인하였다.
우리 결과는 EBV 연관 위암에 miR-BART1-3p 저해제를 전달하여 EBV 연관 위암의 치료나 생장 저해에 활용될 가능성을 제시한다.
1. 한국등록특허 제10-1308941호 2. 한국등록특허 제10-1465319호
본 발명의 목적은 miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 miR-BART1-3p 모방체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 miR-BART1-3p 억제제는 miR-BART1-3p에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 miR-BART1-3p 억제제는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 EBV(Epstein-Barr virus)에 의해 감염되어 형성된 암인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 EBV 관련 위암(gastric cancer), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma) 및 비인두암(nasopharyngeal carcinoma)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 miR-BART1-3p 모방체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 miR-BART1-3p는 서열번호 1인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 EBV(Epstein-Barr virus)에 의해 감염되어 형성된 암인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 EBV 관련 위암(gastric cancer), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma) 및 비인두암(nasopharyngeal carcinoma)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 miR-BART1-3p 억제제는 암의 치료, 구체적으로 EBV 관련된 암의 치료에 효과가 있으며, 더욱 구체적으로는 EBV 관련 위암의 치료에 효과가 있어 위암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 miR-BART1-3p의 과발현에 의한 Cyclin D1 발현량의 변화를 확인한 결과이다(scrambled control: 대조군; 및 miR-BART1-3p: miR-BART1-3p 모방체로 형질전환된 군). (A)는 Cyclin D1의 mRNA 발현량을 qRT-PCR로 확인한 결과이고, (B)는 Cyclin D1의 단백질 발현량을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이며, (C)는 (B)의 결과를 정량적으로 표시한 결과이다.
도 2는 miR-BART1-3p의 발현 억제 또는 저해에 의한 Cyclin D1 발현량의 변화를 확인한 결과이다(control LNA: 대조군; 및 LNA-miR-BART1-3p(i): miR-BART1-3p 억제제로 형질전환된 군). (A)는 Cyclin D1의 mRNA 발현량을 qRT-PCR로 확인한 결과이고, (B)는 Cyclin D1의 단백질 발현량을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이며, (C)는 (B)의 결과를 정량적으로 표시한 결과이다.
도 3은 miR-BART1-3p의 발현 억제 또는 저해에 의한 EBV 감역 세포주의 세포 생장 곡선을 나타낸 결과이다(negative control: 대조군; 및 miR-BART1-3pi: miR-BART1-3p 억제제로 형질전환된 군).
본 발명에서 "miRNA 억제제"는 miRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 타겟으로 하는 miRNA, 특히, miRNA의 선도서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 "상보적 핵산-기반 억제제"로 기재될 수 있다.
본 발명의 용어, "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-BART1-3p 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 분자를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자이며, 보다 바람직하게는 RNA 분자이다. 선택적으로, 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드(RNA), 디옥시리보뉴클레오타이드(DNA), 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)이다. 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2'-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2'-O-C1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2'-O-C1-3 메틸 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명에서 miR-BART1-3p 의 억제는 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 달성될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 그 이상의 LNAs(Locked nucleic acids)를 포함할 수 있다. LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2' 내지 4' 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며, 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다. 택일적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 PNAs(peptide nucleic acids)를 포함할 수 있으며, 이는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 포함할 수 있는 다른 화학적 변형은, 2'-O-알킬(예컨대, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-플루오로 및 4'-티오 변형과 같은 당 변형; 포스포로티오에이트, 모포리노 또는 포스포노카복실레이트 결합과 같은 백본 변형(예컨대, 미국 특허 제6,693,187호 및 제7,067,641호)을 포함한다. 다른 구현예에서, 적합한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸 "갭머"이며 이는 5'-말단 및 3'-말단에 2'-O-메톡시에틸-변형 리보뉴클레오타이드를 포함하며 중앙에 적어도 10개의 디옥시리보뉴클레오타이드를 갖는다. 이 "갭머"는 RNA 타겟의 RNase I 의존성 파쇄 기전을 촉발시킬 수 있다. 안틴센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10-40 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 20-25 뉴클레오타이드이다.
miR-BART1-3p를 억제하는 다른 방식은 억제 RNA 분자를 투여하는 것이며, 상기 억제 RNA 분자는 miR-BART1-3p의 성숙 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 억제 RNA 분자는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 국소 주입, 뇌실내 주입, 척수강 주입, 피하 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예 에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재료 및 방법
1.1. miRNA 모방체 (mimic) 및 miRNA 억제제(inhibitor) 제작
miRNA 모방체의 합성은 Genolution Pharmaceuticals(Seoul, Korea)에서 의뢰하여 제작하였고 서열은 다음과 같다: miR-BART1-3p (5'-UAGCACCGCUAUCCACUAUGUC-3': 서열번호 1), mutated miR-BART1-3p (5'-UAGGTGCGCUAUCCACUAUGUC-3': 서열번호 2), scrambled control (5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3': 서열번호 3). miRNA 억제제 합성은 Exiqon (Vedbaek, Denmark)에 의뢰하여 제작하였고 서열은 다음과 같다: miR-BART1-3p inhibitor (5'-ACAUAGUGGAUAGCGGUGCU-3': 서열번호 4), control inhibitor (5'-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3': 서열번호 5).
1.2. 세포 배양 및 형질전환
위암 세포주인 AGS 세포주는 ATCC(Americal Type Culture Collection, US)에서 구입하였고, 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 RPMI1640(Gibco) 배지에서 배양하였다. AGS-EBV는 EBV(Epstein-Barr virus)로 감연된 AGS 세포주로서, AGS와 동일한 배양 조건에 400 μg/ml의 G418(geneticin)을 추가하여 배양하였다. miRNA 모방체 및 miRNA 억제제는 Lipofectamine®2000(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 프로토콜을 따라서 AGS 및 AGS-EBV 세포주에 전달하였다.
1.3. CCK -8 어세이
세포생존율은 CCK-8 어세이(Dojindo Molecular Technologies, Inc.)로 측정되었다. EBV로 감염된 AGS-EBV 세포주는 96 well plate에 1x103 cells/well 분주하였고, miRNA 억제제는 Lipofectamine®2000(Invitrogen)을 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환 후 실험 목적에 따라 37℃ 세포 배양기에서 배양 후 CCK-8을 각 well당 10 ㎕씩 분주하고 37℃ 세포 배양기에서 2시간 반응시키고 ELISA 측정기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1.4. qRT -PCT(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction) 방법
AGS 세포(1x106 cells)는 100mm 디쉬에서 배양된 후, Lipofectamine®2000(Invitrogen)을 이용하여 각각 20 nM의 scrambled control과 miR-BART1-3p 모방체로 형질전환시켰고, 48 시간 뒤에 세포를 모았다.
또한, AGS-EBV 세포(1x106 cells)는 100mm 디쉬에서 배양된 후, Lipofectamine®2000(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 각각 50 nM의 control inhibitor와 miR-BART1-3p에 대한 안티센스 LNA™(locked nucleic acid)로 형질전환시켰고, 48시간 뒤에 세포를 모았다.
상기에 의해 모아진 각 세포로부터 총 RNA가 추출되었고, cDNA가 합성된 후 qRT-PCR 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 mRNA의 발현량을 관찰하였다. 유전자에 대한 프라이머 정보는 하기 표 1과 같다.
유전자 방향 서열정보
Cyclin D1 Forward 5'-CAA TGA CCC CGC ACG ATT TC-3' (서열번호 6)
Reverse 5'-CAT GGA GGG CGG ATT GGA A-3' (서열번호 7)
GAPDH Forward 5'-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3' (서열번호 8)
Reverse 5'-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3' (서열번호 9)
1.5. 웨스턴 블럿팅 방법
상기 1.4에서 세포를 수득한 후, 수득한 세포에서 단백질을 RIPA 버퍼를 사용해 획득하였다. 획득한 단백질은 폴리아크릴아마이드 젤을 통해 분리시킨 후, PVDF 멤브레인에 이동시켰다. anti-cyclin D1과 anti-beta-actin 항체 및 2차 항체를 이용하여 cyclin D1 및 beta-actin의 발현량을 확인하였다.
실시예 2. miR - BART1 -3p에 의한 세포증식 효과
miR-BART1-3p가 Cyclin D1에 미치는 영향을 관찰하기 위해, miR-BART1-3p 모방체를 AGS 세포에 전달하고 48시간 뒤에 Cyclin D1의 mRNA 및 단백질의 발현량을 각각 qRT-PCR과 웨스턴 블롯으로 조사하였다.
그 결과, miR-BART1-3p가 전달된 AGS 세포는 scrambled control이 전달된 세포에 비해 Cyclin D1의 mRNA 발현량 및 단백질 발현량이 증가됨을 확인하였다 (도 1).
실시예 3. miR - BART1 -3p 억제제에 의한 세포
내재적인 miR-BART1-3p의 영향을 알아보기 위해, miR-BART1-3p 저해제(LNA™: locked nucleic acid)를 AGS-EBV에 전달하여 Cyclin D1의 mRNA 발현량 및 단백질 발현량을 조사하였다.
그 결과, miR-BART1-3p 저해제가 전달된 AGS-EBV 세포는 control LNA가 전달된 세포에 비해 Cyclin D1의 mRNA 발현량 및 단백질 발현량이 감소됨을 확인하였다 (도 2).
또한, miR-BART1-3p를 발현하는 AGS-EBV 세포에 miR-BART1-3p 저해제를 전달하였을 때 control LNA가 전달된 AGS-EBV 세포에 비해 세포 생장이 감소됨을 확인하였다 (도 3).
본 발명자들은 miR-BART1-3p가 세포 생장에 중요한 역할을 하는 Cyclin D1의 발현을 증가시켰으며, EBV가 감염된 위암 세포주인 AGS-EBV 세포에서는 miR-BART1-3p의 발현을 저해하는 miR-BART1-3p 저해제가 전달될 경우 negative control 저해제가 전달된 AGS-EBV 세포에 비해 세포 생장이 저해된다는 것을 확인하였다.
따라서, miR-BART1-3p 저해제에 의한 miR-BART1-3p 특이적인 발현 저해는 EBV와 관련된 위암을 치료할 수 있음을 확인하였다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Composition for preventing or treating cancer comprising miR-BART1-3p inhibitor as active ingredient <130> PN1610-351 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-BART1-3p <400> 1 uagcaccgcu auccacuaug uc 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated miR-BART1-3p <400> 2 uaggtgcgcu auccacuaug uc 22 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled control <400> 3 acgugacacg uucggagaau u 21 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-BART1-3p inhibitor <400> 4 acauagugga uagcggugcu 20 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control inhibitor <400> 5 gtgtaacacg tctatacgcc ca 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclin D1 forward <400> 6 caatgacccc gcacgatttc 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclin D1 reverse <400> 7 catggagggc ggattggaa 19 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 8 catgagaagt atgacaacag cct 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse <400> 9 agtccttcca cgataccaaa gt 22

Claims (10)

  1. miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 miR-BART1-3p 억제제는 miR-BART1-3p에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 miR-BART1-3p 억제제는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 EBV(Epstein-Barr virus)에 의해 감염되어 형성된 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 암은 EBV 관련 위암(gastric cancer), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma) 및 비인두암(nasopharyngeal carcinoma)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. miR-BART1-3p 모방체를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 miR-BART1-3p는 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 암은 EBV(Epstein-Barr virus)에 의해 감염되어 형성된 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 암은 EBV 관련 위암(gastric cancer), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma) 및 비인두암(nasopharyngeal carcinoma)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.

KR1020170008389A 2017-01-18 2017-01-18 miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 KR101985067B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170008389A KR101985067B1 (ko) 2017-01-18 2017-01-18 miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170008389A KR101985067B1 (ko) 2017-01-18 2017-01-18 miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180085146A true KR20180085146A (ko) 2018-07-26
KR101985067B1 KR101985067B1 (ko) 2019-05-31

Family

ID=63047942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170008389A KR101985067B1 (ko) 2017-01-18 2017-01-18 miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101985067B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101308941B1 (ko) 2011-05-25 2013-09-24 가톨릭대학교 산학협력단 엡스타인바 바이러스 마이크로 알엔에이를 포함하는 세포사멸 촉진 또는 세포성장억제를 위한 조성물
KR101465319B1 (ko) 2013-03-08 2014-11-28 서울대학교산학협력단 마이크로 rna 분해 엘리먼트 및 그 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101308941B1 (ko) 2011-05-25 2013-09-24 가톨릭대학교 산학협력단 엡스타인바 바이러스 마이크로 알엔에이를 포함하는 세포사멸 촉진 또는 세포성장억제를 위한 조성물
KR101465319B1 (ko) 2013-03-08 2014-11-28 서울대학교산학협력단 마이크로 rna 분해 엘리먼트 및 그 용도

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AYA Shinozaki-ushiku, et al. International journal of oncology, 2015; 46: 1421-1434. (2015년 공개)* *
Do Nyun Kim, et al. Journal of general virology, 2013; 94: 467-506. (2012년 공개)* *
Do Nyun Kim, et al. Journal of virology, Jan. 2007, p. 1033-1036. (2006.11.1. 공개)* *
Longmei Cai, et al. Nat Commun. 2015; 6: 7353. (2015.07.02. 공개)* *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101985067B1 (ko) 2019-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2756845T3 (en) Methods and compositions for specific inhibition of KRAS with asymmetric double stranded RNA
US10612023B2 (en) Methods and compositions for the specific inhibition of β-catenin by double-stranded RNA
US20170275618A1 (en) Methods and compositions for the specific inhibition of myc by double-stranded rna
EP1996022B1 (en) Modulation of innate immunity receptors&#39; signaling by microRNAs miR-146a and miR-146b
US10612020B2 (en) Artificial mimic miRNA for controlling gene expression, and use of same
US20110118337A1 (en) Method of Using Compositions Comprising MIR-192 and/or MIR-215 for the Treatment of Cancer
US20090136957A1 (en) Methods and compositions for regulating cell cycle progression via the miR-106B family
Paula Simões-Wüst et al. A functionally improved locked nucleic acid antisense oligonucleotide inhibits Bcl-2 and Bcl-xL expression and facilitates tumor cell apoptosis
US10221418B2 (en) Composition for treating cancer associated with HPV infection
KR101985067B1 (ko) miR-BART1-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
WO2014053014A1 (en) Modulation of rna activity and vascular permeability
KR20130014840A (ko) ｍｉＲ-636을 이용한 간암 치료 및 진단 방법
US7902167B2 (en) Compounds and methods for down-regulating Wrap53 protein by RNA interference
JPWO2007126150A1 (ja) 癌の新規治療用組成物
US20100113577A1 (en) Isolated nucleic acid molecules corresponding to micro rna 145 (mirna-145) and their use in treating colon cancer
WO2012087242A1 (en) Targeting glioma stem cells by sequence-specific functional inhibition of pro-survival oncomir-138
WO2012131673A2 (en) Ccat-1 silencing nucleic acid agents for treating cancer
KR20230170690A (ko) MicroRNA-134 억제제들
CN115998868A (zh) 核仁素在阻断猪繁殖与呼吸综合症病毒感染中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant