KR20180083869A - 케이. 뉴모니애 (K. pneumoniae)의 만난-기반 O-항원을 표적화 하는 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 O3b-항원 만노스 호모폴리머 반복 단위를 포함하고, 화학식 1의 구조를 포함하는 O3b- 항원에 혼입된 O3b- 에피토프인 클렙시엘라 뉴모니애의 리포폴리사카라이드 (LPS) O3b-항원 구조의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 화학식 1은:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n
이고, 상기 MeP는 메틸 포스페이트이다; 및
n은 0 내지 50이다.
본 발명은 추가로 상기 항체를 포함하는 약학적 또는 진단학적 제제, 및 상기 항체의 생산 방법을 제공한다.
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n
이고, 상기 MeP는 메틸 포스페이트이다; 및
n은 0 내지 50이다.
본 발명은 추가로 상기 항체를 포함하는 약학적 또는 진단학적 제제, 및 상기 항체의 생산 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 지금까지 확인되지 않은 구조를 포함하는 O3b-항원에 혼입된 O3b-에피토프인 클렙시엘라 뉴모니애의 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; LPS) O3b-항원 구조의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단리된 항체에 관한 것이다.
클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)는 심각한 이환율과 사망률을 유발하는 병원 감염에 원인이 되는 중요한 장내 세균성 병원체이다. 최근 MDR (Multi-drug resistant) 균주가 세계적으로 출현하여 치료 옵션이 제한되어 있다. 현재의 목표는 MDR 클렙시엘라 균주에 의한 감염의 예방 및 치료를 위한 치료용 단클론 항체를 개발하는 것이다. 의도된 단클론 항체의 분자 표적은 클렙시엘라의 표면에 있는 소수의 항원 (단독이 아닌 경우) 중 하나인 것으로 간주되는 LPS O-항원이다.
O 형 분포에 관해 발표된 역학 자료 (1,2)에 기초하여, 임상적으로 관련된 균주의 대다수는 4 개의 혈청형 (serotype), 즉 O1, O2, O3 및 O5에 속한다. O1 및 O2 항원은 갈락토스의 호모폴리머 (즉, 갈락탄)에 의해 형성되는 반면, O3 및 O5 혈청군 (serogroup)은 만노스 단일 중합체 (즉, 만난)로 구성된다 (3).
O3 혈청형은 "고전적" 펜타-만노스 구조를 특징으로 하며, 도 1 ((3)에 공개됨)에 나와 있다. 클렙시엘라 O3 항원의 펜타-만노스 구조가 밝혀졌다 (10). 이 O3 항원을 암호화하는 rfb 오페론은 Genbank에 등록번호 AB795941.1로 기탁되었다.
대장균 (E. coli)의 혈청형 O8과 O9는 각각 클렙시엘라 혈청형 O5와 O3와 구조적으로 동일한 O-특이성 만노스 호모 다당류를 가지고있다. 대장균 O9로부터 대장균 O9의 아형인 대장균 O9a를 혈청형으로 판별하는 단클론 항체가 기재되어있다 (Sugiyama et al. 1998, J. Bacteriol.180 (10): 2775-2778). 대장균 O9 및 O9a는 구조적 및 혈청학적으로 서로 유사하다.
대장균 O9의 구조 및 그의 유전적 결정인자는 클렙시엘라 O3 항원의 구조와 동일하다. 혈청군 O9의 아형, 즉 대장균 O9a는 WbdA 내의 점 돌연변이로부터 유래된 것으로 입증되었다 (7). O9a의 구조는 테트라-만노스 (tetra-mannose) 구조로 나타났다 (8).
표 1. O-특이적 만노스 호모다당류 (homopolysaccharide)의 반복 단위 구조 (Sugiyama 등에서 공개됨)
항-대장균 O9a 단클론 항체는 클렙시엘라 O3 다당류와 교차-반응한다고 기술되어 클렙시엘라 O3 균주에서 대장균 O9a 형 O 다당류의 존재를 시사한다 (Kido et al. 1997, Microbiol. Immunol., 41:519-525. 상기 항체는 대장균 O9a 다당체는 인식하였으나 대장균 O9는 인식하지 못했다. O9 및 O9a 다당류를 정의하는데 필요한 최소 만노스 잔기 수는 4개이고, 4-만노스 구조는 항체에 결합되는 에피토프에서 가장 짧은 후보로 기술되었다.
Van der Meer 등 (Infection and Immunity 1994, 62 (3): 1052-1057)은 살모넬라 미네소타(Salmonella Minnesota) R595에 대해 생성된 단클론 항체 (mAb) 및 내핵 (inner core) 구조에 특이적인 α-3-데옥시-D-만노-옥툴로손산 (α-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid)에 대해 기술한다. 항체는 클렙시엘라 뉴모니애의 거의 모든 O-혈청형과 반응하여 LPS의 핵심에 살모넬라 미네소타의 내핵의 것과 같은 에피토프를 제시한다.
WO2008/135446A2는 펩티드성 클렙시엘라 항원 및 항체를 개시한다.
Pollack 등 (Journal of Clinical Investigation 1987, 79 (5):1421-1430)은 LPS의 핵-지질 A 영역에서 에피토프를 인식하는 단클론 항체를 기술한다.
Yokochi 등 (Infection and Immunity 1992, 60 (11):4953-4956)은 클렙시엘라 뉴모니애로부터의 LPS의 보조제 활성을 기술한다. 클렙시엘라 O3 LPS의 보조제는 클렙시엘라 지질 A 잔기와 만노스 호모다당류 잔기의 조합을 요구할 수 있다고 제안되었다.
Curvall 등 (Acta Chemica Scandinavica 1973, 27:2645-2649)은 클렙시엘라 O3 LPS에서 O-특이적 측쇄의 구조를 개시한다. 클렙시엘라 O3:K58 LPS는 오당류 (pentasaccharide) 반복 단위로 구성되는 것으로 기술되어있다.
클렙시엘라 뉴모니애의 새로운 표적이 필요하다. 구체적으로, 면역 민감성이 있고 치료법 및 진단법 개발에 사용될 수 있는 표적을 동정할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 클렙시엘라 뉴모니애에 대한 항체를 제공하여 클렙시엘라 뉴모니애 감염의 예방 또는 치료에 사용될 병원체를 표적화하는 관련성이 향상된 항체를 제공하는 것이다. 클렙시엘라 뉴모니애 세균을 신속하고 신뢰성있는 방식으로 진단할 수 있는 수단 및 방법을 제공하는 것이 더 나아간 목적이다.
상기 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 O3b-항원 만노스 호모폴리머 (homopolymer) 반복 단위를 포함하고, 화학식 1의 구조를 포함하는 O3b-항원에 혼입된 O3b-에피토프인, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)의 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; LPS) O3b-항원 구조의 에피토프를 특이적으로 인식하며, 상기 화학식 1은:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n
이고, 상기 MeP는 메틸 포스페이트 (methyl phosphate)이며, n은 0 내지 50인 단리된 항체를 제공한다.
구체적으로, 상기 메틸 포스페이트기 (group)는 만노스 잔기 (residue)의 비-환원 말단에 위치한다.
O3b 에피토프는 구체적으로 화학식 1에 기재된 트리만노스 반복 단위를 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 항체는 O3b-항원 구조에 대해 생성되거나, 가공 (engineering) 및 선별 기술에 의해 수득되고, 그러한 구조 또는 그 안에 혼입된 O3b-에피토프에 결합함으로써 동정된다.
구체적으로, 상기 항체는 그러한 O3b-에피토프에 결합할 수 있다.
특정 양태에 따르면, 상기 항체는 O3a-에피토프 및/또는 O3-에피토프와 교차-반응하는 항체이며,
a) O3a-에피토프는 하나 이상의 O3a-항원 만노스 호모폴리머 반복 단위를 포함하고, 화학식 2의 구조를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3a-항원에 혼입되며, 상기 화학식 2는:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
이고, 상기 m은 0 내지 50이며;
및
b) O3-에피토프는 하나 이상의 O3-항원 만노스 호모폴리머 반복 단위를 포함하고, 화학식 3의 구조를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3-항원에 혼입되며, 상기 화학식 3은:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
이고, 상기 m은 0 내지 50이다.
O3a 에피토프는 구체적으로 화학식 2에 기재된 테트라만노스 반복 단위를 특징으로 한다.
O3 에피토프는 구체적으로 화학식 3에 기재된 펜타만노스 반복 단위를 특징으로 한다.
이러한 교차-반응 항체는 O3b-에피토프에 대한 O3-특이성 및 O3a- 및 O3 에피토프 중 하나 또는 둘 모두에 대한 추가의 교차-특이성을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 항체는 pan-O3 특이적 항체이며, O3b-에피토프를 특이 적으로 인식 또는 결합하고 O3a-에피토프 및 O3-에피토프와 교차-반응한다. 교차-반응성은 구체적으로 O3a 및 O3 LPS 항원 내의 O3b-에피토프의 존재에 기초한다.
예를 들어, 상기 항체는 실시예에 기재된 2F8-G6 또는 4D3-A4로 명명된 pan-O3 특이적 항체 또는 상기 항체의 기능적 변이체, 예를 들어 2F8-G6와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 기능적 변이체 또는 4D3-A4 항체에 결합하거나 또는 O3b 에피토프에 경쟁적으로 결합하는 항체이다. 2F8-G6은 본원에서 언급된 침착된 물질에 혼입된 6 개의 CDR 서열 및/또는 VH/VL 서열에 의해 특이적으로 특징화된다. 4D3-A4는 본 명세서에 기재된 HC 및 LC 서열에 편입된 6개의 CDR 서열 및/또는 VH/VL 서열을 특징으로 한다.
구체적으로, 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체 및 이의 기능적 변이체는 O3b 및 O3 구조에 또한 혼입되는 O3b 에피토프 및 구조에 대한 결합 특이성을 특징으로 하여, pan-O3 특이성으로서 언급된 교차-반응성을 유도한다.
변이체를 제공하기 위해, 이러한 항체는 본 명세서에서 모 (parent) 항체로 지칭되고, CDR 또는 프레임워크 서열은 본 명세서에서 모 CDR 또는 모 프레임워크 서열로 지칭된다.
특정 양태에 따르면, 변이체 항체는 모 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
또 다른 특정 양태에 따르면, 변이체 항체는 모 항체와 동일한 결합 부위를 포함한다.
기능적으로 활성인 변이체 항체는 임의의 VH 또는 VL 서열에서 상이하거나, 공통 VH 및 VL 서열을 공유할 수 있으며, 각각의 FR에 변형을 포함할 수 있다. 돌연변이 유발에 의한 모 항체로부터 유래된 변이체 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
항체의 기능적 변이체는 CDR 변이된 항체를 수득하기 위해, 예를 들어 항체의 친화성을 개선시키고 및/또는 모 항체에 의해 표적화되는 에피토프 근처의 동일한 에피토프 또는 에피토프를 표적화하도록 조작될 수 있다 (에피토프 쉬프트 (epitope shift)).
구체적으로, 기능적으로 활성인 변이체는 모 CDR 서열에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고, 친 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로부터 구성되는 기능적으로 활성인 CDR 변이체이다.
특정 기능적 변이체는 예를 들어, 피코몰 범위의 친화성을 갖는 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만, 바람직하게는 10-10M 미만, 바람직하게는 10-11M 미만의 Kd로 O3b-항원을 결합시키는 친화도를 갖는다.
특정 변이체는 예를 들어, 모 CDR 서열이 인간 또는 인간화된 프레임워크 서열에 혼입되어있는 모 항체의 인간화 변이체이고, 모 CDR 서열 각각의 임의의 1,2,3 또는 4 아미노산 잔기는 부모 또는 인간화 항체의 안정성, 특이성 및 친화성을 향상시키기 위해 점 돌연변이를 도입함으로써 추가로 변이된다.
특정 양태에 따르면, 항체는 적어도 하나의 인간, 인간화, 키메라, 쥐 또는 친화도 성숙 서열을 포함하는, 예를 들면 상이한 기원의 재조합 CDR 및 프레임워크 서열을 포함하며, 바람직하게는 상기 프레임워크 서열은 임의의 면역 글로불린 아이소타입 (isotype), 구체적으로 IgG 항체를 포함한다.
본 명세서에서 친화도-성숙 변이체로 지칭되는 친화도 성숙에 의해 생성된 모 항체의 변이체는 모 항체와 비교하여 적어도 1 로그 또는 2 로그 또는 3 로그의 Kd 차이로 증가된 결합 친화성을 가질 수 있다. 친화도 성숙 변이체는 전형적으로 10-8M 미만 또는 10-9M 미만의 Kd로 O3b-항원을 결합시키는 친화력을 갖는다. 모 항체가 10-8M 미만 또는 10-9M 미만의 Kd와의 친화성을 갖는 경우, 및 모 항체가 친화도 성숙을 받고있는 경우, 친화도 성숙 변이체는 각각 10-9M 미만 및 10-10M 미만의 Kd와 더 높은 친화도를 가질 수 있다.
특정 실시 양태에 따르면, 상기 항체는 2F8-G6 항체 또는 그의 특이적인 에피토프에 경쟁적으로 결합하는 항체이고, 상기 2F8-G6 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기탁된 물질에 혼입된 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 서열을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 2F8-G6 항체는
a) 기탁된 물질 DSM 32059에 혼입된 VH; 및
b) 기탁된 물질 DSM 32060에 혼입된 경량 VL을 특징으로 한다.
다른 특정 실시 양태에 따르면,
상기 항체는 4D3-A4 항체 또는 이의 특이적인 에피토프와 경쟁적으로 결합하는 항체이다.
구체적으로, 상기 4D3-A4 항체는
a) 도 10에서 식별되는 6 CDR 서열, 특히 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 의해 각각 식별되는 CDR1, 2, 3, 4, 5 및 6인 6개의 CDR 서열을 포함하고, 상기 넘버링 (numbering)은 카바트(Kabat)에 따르며; 또는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 의해 각각 식별되는 CDR1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하고, 상기 넘버링은 IMGT에 따르며; 및/또는
b) 도 10에서 식별되는 VH 및 VL 서열, 특히 서열번호 15로 식별되는 VH 서열 및 서열번호 16으로 식별되는 VL 서열 인 VH 및 VL 서열; 및/또는
c) 도 10에서 식별되는 HC 및 LC 서열, 특히 서열번호 13으로 식별되는 HC 서열 및 서열번호 14로 식별되는 LC 서열 인 HC 및 LC 서열;
중 어느 하나를 특징으로 한다.
구체적으로, 본 명세서에 언급된 카바트에 따른 CDR 서열은 카바트 명명법 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, US U.S. Department of Health and Human Services (1991) 참조)에 따라 결정된 항체의 아미노산 서열로서 이해된다.
구체적으로, 본 명세서에 언급된 IMGT에 따른 CDR 서열은 IMGT 시스템 (International ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res.27:209-212)에 따라 결정된 항체의 아미노산 서열로서 이해된다.
바람직하게는, 결합의 경쟁은 경쟁 ELISA 분석 또는 포르테바이오(ForteBio) 분석에 의해 결정된다.
항체 또는 임의의 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체에 경쟁적으로 결합하는 임의의 예시된 항체의 기능적 변이체는 경쟁 ELISA 분석 또는 포르테바이오 분석에 의해 측정된 바와 같이 그의 표적에 대한 결합의 상대적인 저해를 구체적인 특징으로 하며, 상대적 억제는 바람직하게는 30% 이상이다.
특정 양태에 따르면, 상기 항체는 O3a-에피토프와 관련하여 O3b-에피토프에 우선적으로 결합하거나, O3a-에피토프와 교차-반응하지 않고, 상기 O3a-에피토프는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3a-항원 구조의 O3a-항원 반복 단위에 혼입되며, 상기 O3a-항원 반복 단위는 화학식 2의 만노스 호모폴리머이다.
또 다른 특정 양태에 따르면, 상기 항체는 O3-에피토프와 관련하여 O3b-에피토프에 우선적으로 결합하거나, O3-에피토프와 교차-반응하지 않고, 상기 O3-에피토프는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3-항원 구조의 O3-항원 반복 단위에 혼입되며, 상기 O3-항원 반복 단위는 화학식 3의 만노스 호모폴리머이다.
구체적으로, 상기 우선적인 결합은 다른 O3-항원(들)보다 높은 친화성 및/또는 결합력으로 O3b-에피토프를 결합시킬 수 있는 항체의 특징이며, 특히 상기 항체는 O3a-에피토프 및/또는 O3-에피토프와 관련하여 O3b에 우선적으로 결합하며, 예를 들어 다른 O3-항원과 비교하여 O3b-에피토프 또는 O3b-항원에 결합하기에 더 높은 친화성을 갖는 항체이다. 특정 양태에 따르면, 상기 항체는 임의의 다른 O3-항원과 비교하여 O3b-에피토프 또는 O3b-항원과의 결합에 대해, 적어도 2배 이상의 친화성을 가지며, 구체적으로 적어도 2배 차이, 또는 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 심지어 적어도 10배의 차이, 예를 들어 친화성 및/또는 결합력의 차이를 의미한다. 예를 들어, O3a-항원 및/또는 O3-항원에 O3b-항원을 우선적으로 결합시키는 Kd 차이는, 면역분석법 (immunoassay), 바람직하게는 면역 블로팅법 (immunoblotting), ELISA 또는 다른 면역학적 방법으로 측정된 것과 같이, 적어도 0.5 또는 1 로그, 또는 적어도 2 로그 또는 적어도 3 로그 차이이다.
다른 특정 양태에 따르면, 상기 항체는 O3a-에피토프 및 O3-에피토프 중 어느 것과도 교차-반응하지 않는다. 구체적으로, 상기 항체는 낮은 친화성을 갖는 다른 O3-항원(들)의 임의의 것과 결합하고, 예를 들어, O3b-에피토프 또는 O3b-항원에 우선적으로 결합하는 Kd 차이가 적어도 2 로그, 바람직하게는 적어도 3 로그이다.
다른 특정 양태에 따르면, 상기 항체는 클렙시엘라 뉴모니애의 비-O3 LPS 분자의 에피토프와 교차-반응하지 않는다. 이러한 비-O3 LPS 분자는 예를 들어, O1, O2, O4, O12 LPS 분자이다. 구체적으로, 항체는 임의의 다른 클렙시엘라 뉴모니애 항원과 교차-반응하지 않으며, 및/또는 상기 항체는 보다 낮은 친화도를 갖는 임의의 다른 클렙시엘라 뉴모니애 항원에 결합하고, 예를 들어, (O3b-항원과 다른) 다른 클렙시엘라 뉴모니애 항원 보다 O3b-에피토프 또는 O3b-항원과 우선적으로 결합하는 Kd 차이가 적어도 2 로그, 바람직하게는 적어도 3 로그이다.
구체적으로, 비-교차-반응은 항체가 현저하게 결합하지 않는 O3b-항원 및 추가 항원을 사용하는 ELISA 분석 또는 면역 블롯에 의해 결정된다.
특정 실시 양태에 따르면, 예를 들어, 피코몰 범위의 친화성을 갖는 상기 항체는 10-7M 미만, 바람직하게는 10-8M 미만, 더욱 바람직하게는 10-9M 미만, 또는 바람직하게는 10-10M 미만, 또는 바람직하게는 10-11M 미만의 Kd로 O3b-에피토프를 결합시키는 친화도를 갖는다.
구체적으로, pan-O3 특이적 항체는 10-7M 미만, 바람직하게는 10-8M 미만, 더욱 바람직하게는 10-9M 미만의 Kd와 같은 높은 친화성으로 O3b-에피토프, O3a-에피토프 및 O3-에피토프 각각을 결합시킬 수 있다.
특정 양태에 따르면, 상기 항체는 중화 항체이다. 구체적으로, 상기 항체는 예를 들어 시험관 내 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo) 검출 방법에 의해 측정된 바와 같이, O3b 또는 O3a 또는 O3 LPS 분자 중 임의의 것을 발현하는 클렙시엘라 뉴모니애 균주의 내독소를 중화시킨다. 구체적으로, 항체는 시험관 내에서 특정 LPS 분자의 내독성 효과를 중화시킨다.
구체적으로, 상기 항체는 O3b-에피토프 또는 O3b-항원을 발현하는 클렙시엘라 뉴모니애 균주의 내독소를 중화하고, 여기서 중화능 (neutralization potency)은 적어도 기준 항체 (예를 들어, 4D3-A4로 명명된 본 명세서에 기재된 예시적인 항체)의 효능이다.
구체적으로, 싱기 항체는 클렙시엘라 뉴모니애 균주 혈청형 O3b, 및 O3a 및 O3 중 적어도 하나 또는 둘 모두의 내독소를 중화시키는 중화능을 가진 교차-중화 항체이며, 적어도 기준 항체 (예를 들어, 4D3-A4로 명명된 본 명세서에 기재된 예시적인 항체) 효능의 중화능을 갖는 항체이다.
구체적으로, 상기 항체는 O3b-형 클렙시엘라 뉴모니애의 살균을 위해 제공된다.
특정 양태에 따르면, 본 발명의 항체를 사용하는 면역 요법은 예를 들어 다양한 동물 모델에서 결정된 바와 같이 살아있는 박테리아 챌린지 (live bacterial challenge)를 효과적으로 방지할 수 있다.
상기 항체는 치사 내독소 혈증을 특이적으로 중화시킬 수 있다. 이러한 기능적 활성은 적절한 생체 내 모델 (정제된 LPS를 이용한 시도)에서 결정될 수 있다.
상기 항체는 예를 들어, 시험관 내 혈청 살균 분석(serum bactericidal assay; SBA)에 의해 결정된 것처럼 예를 들어, 대조군 시료보다 적어도 20% 세균이 사멸된 보체 매개 사멸에 의해 O3b-형의 클렙시엘라 뉴모니애에 대해 특이적으로 효과가 있다 (항체 또는 무관한 대조군 mAb 미첨가).
상기 항체는 예를 들어, 시험관 내 옵소닌 식균성 사멸 분석 (opsonophagocytotic killing assay; OPK)에 의해 결정된 것처럼 예를 들어, 대조군 시료보다 적어도 20% 흡수의 투입 세균 또는 20% 더 낮은 최종 CFU 카운트를 가지는 항체 매개 식균 작용에 의해 O3b-형의 클렙시엘라 뉴모니애에 대해 특이적으로 효과적이다 (항체 또는 무관한 대조군 mAb 미첨가).
상기 항체는 예를 들어, 시험관 내 LAL 분석법이나 톨-유사 수용체 4 (toll-like receptor 4; TLR4)에 의해 결정된 것처럼 예를 들어, 대조군 시료와 비교하여 내독소 활성의 적어도 20%를 감소시켜 내독소 기능을 중화시킴으로써 O3b-형의 클렙시엘라 뉴모니애에 대해 특이적으로 효과적이다 (항체 또는 무관 한 대조군 mAb를 첨가하지 않음).
또 다른 특정 양태에 따르면, 상기 항체는 인간 및 비-인간 동물 모두를 포함하는 동물에서 표적화된 병원체를 중화시키고, 생체 내 발병, 바람직하게는 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염 중 임의의 모델의 발병을 억제한다.
구체적으로, 상기 항체는 전장 (full-length) 단클론 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편, 또는 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질이며, 구체적으로 상기 항체는 무작위화 또는 인공 아미노산 서열을 포함하는 비-천연 발생 항체이다. 구체적으로, 상기 항체는 전장 IgG1, 이중특이적 IgG1 또는 F(ab')2-절편 중 임의의 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 항체는 쥐, 라마, 토끼, 염소, 소, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 중쇄 항체, Fab, Fd, scFv 및 VH, VHH 또는 VL, 바람직하게는 인간 IgG 항체 또는 쥐 IgG 항체 단일 도메인 항체로 구성된 군에서 선택된 항체이다.
특정 실시 양태에 따르면, 상기 항체는 적어도 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체의 VH-CDR1 내지 VH-CDR3 서열 중 임의의 것이 특징인 항체 중쇄 가변 영역 또는 도메인 (VH)을 포함하고, 또는 그의 기능적으로 활성인 CDR 변이체를 포함한다. CDR 서열은 특히 카바트의 넘버링 시스템에 따라 지정된다.
특정 양태에 따르면, 상기 항체는 항원 결합 잔기로서의 VH 도메인만을 포함하며, 따라서, 예를 들어 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체, 또는 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체의 기능적 CDR 변이체의 VH-CDR1-3을 각각의 VL 도메인 없이 포함할 수 있다.
또 다른 특정 양태에 따르면, 상기 항체는 VH 도메인을 포함하고, 예를 들어 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체 또는 그의 기능적으로 활성인 CDR 변이체의 VL-CDR1 내지 VL-CDR3 서열 중 임의의 것을 특징으로 하는 항체 경쇄 가변 영역 또는 도메인 (VL)을 추가로 포함한다.
또 다른 특정 양태에 따르면, 상기 항체는 VH-CDR1-3 및 VL-CDR1-3 서열인 6개의 CDR 서열을 특징으로 하는 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체, 또는 그의 기능적으로 활성인 CDR 변이체 중 어느 하나의 결합 부위를 포함한다.
CDR 서열은 특히 카바트의 넘버링 시스템에 따라 지정된다.
특정 양태에 따르면, 본 발명은 그러한 모 항체의 항체 변이체를 생성하기 위한 모범적인 (모) 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체를 제공하고, VH 서열 단독 또는 서열 목록에 확인된 바와 같은 VH 및 VL 아미노산 서열 둘 모두에 의해 형성된 특이적 결합 부위를 특징으로 하는 모 항체와 같이, 특히 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 변이체를 포함하며, 또는 기탁된 물질로부터 얻을수 있고, 또는 각각의 CDR 서열에 의해 수득될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 모 항체의 각각의 CDR 또는 항체 서열을 변형시켜 수득한 기능적으로 활성인 변이체일 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 서열은 예를 들어 점 돌연변이에 의해 변형될 수 있는 "모 (parent)" 서열로 간주되는 것으로 잘 이해된다.
실시예에 기재된 2F8-G6 및 4D3-A4 항체는 인간의 서열로 키메라화 된 쥐 기원의 것이다. 인간화 및 선택적으로 친화성 성숙에 의해 수득된 변이체는 공지된 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 이들 변이체 항체는 표적 항원에 결합하고, 따라서 기능적으로 활성인 것으로 간주된다. 기능적으로 활성인, 예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 동일한 결합 부위를 포함하거나, 또는 모 항체와 같이 동일한 결합 특성을 갖는, 각각의 FR 또는 CDR 서열에서 변형된 VH 또는 VL 도메인이 또한 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체의 FR 또는 CDR 서열 중 일부는 다른 항체의 FR 또는 CDR 서열로 교환될 수 있음이 또한 가능하다.
구체적으로, 상기 항체는 2F8-G6 또는 4D3-A4 항체의 CDR 서열 중 임의의 CDR의 기능적으로 활성인 CDR 변이체를 포함하며, 여기서 기능적으로 활성인 CDR 변이체는
a) 모 CDR 서열에서 1, 2 또는 3 개의 점 돌연변이; 및/또는
b) 모 CDR 서열의 4 개의 C-말단 또는 4 개의 N-말단, 또는 4 개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 것에서 1 또는 2 개의 점 돌연변이; 및/또는
c) 모 CDR 서열과 60% 이상의 서열 동일성;
중 적어도 하나를 포함하며,
바람직하게는 상기 기능적으로 활성인 CDR 변이체는 4개 또는 5개 미만의 아미노산으로 구성된 임의의 CDR 서열에서 1 또는 2 개의 점 돌연변이를 포함한다.
구체적으로, 기능적으로 활성인 변이체는 아미노산 서열, 바람직하게는 CDR에서의 적어도 하나의 점 돌연변이에서 모 항체와 다르며, CDR 아미노산 서열 각각의 점 돌연변이의 수는 0, 1, 2 또는 3이다.
특정 양태에 따르면, 점 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입 중 임의의 것이다.
구체적으로, 항체는 인간, 인간화, 키메라 또는 쥐의 기원의 것이다.
특정 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 CDR 및 프레임워크 서열을 포함하며, CDR 및 프레임워크 서열 중 적어도 하나는 인간, 인간화, 키메라, 쥐 또는 친화도 성숙 서열을 포함하며, 바람직하게는 상기 프레임워크 서열은 IgG 항체의 서열이며, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형, 또는 IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 서열이다.
특정 항체는 프레임워크 돌연변이된 항체로서 제공되며, 예를 들어, 모 항체의 제조 가능성 또는 내성을 개선하기 위해, 예를 들어, 낮은 면역원성 잠재성을 갖는 개선된 (돌연변이된) 항체를 제공하기 위해, 모항체와 비교하여 임의의 CDR 서열 및/또는 프레임워크 서열에서 돌연변이를 갖는 이러한 인간화된 항체를 제공한다.
구체적으로, 상기 항체는 단클론 항체이다. 특히, 상기 항체는 인공 가변 및/또는 불변 도메인 서열, 예를 들어, 무작위 서열의 라이브러리로부터 수득된 서열 (Fc 서열의 CDR과 같은)을 포함하는 것과 같은, 비-천연 발생 항체이다.
특정 양태에 따르면, 상기 항체는 대상체의 감염을 제한하거나 상기 감염의 결과인 질병 상태를 개선시키기 위한 유효량의 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화의 위험이 있거나 그로 인해 고통 받고있는 대상체를 치료하는데 사용하기위한 용도이며, 바람직하게는 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염 중 어느 하나의 치료 또는 예방을 위한 용도이다.
바람직하게는, 치료 목적으로 사용되는 항체는 표적 병원체의 LPS를 중화시키는 중화 항체이다.
따라서, 본 발명은 또한 각각의 적응증에서 항체의 유효량을 투여함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 항체는 유효량의 항체를 대상체에 투여하여 대상체의 감염을 제한하거나 상기 감염의 결과인 질병 상태를 개선시키고, 바람직하게는 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염 중 어느 하나의 치료 또는 예방을 위하여 사용된다.
구체적으로, 상기 대상체는 인간이다. 구체적으로, 상기 대상체는 건강하거나 질병으로 고생하는 모든 인간이다. 구체적으로, 상기 인간은 면역저하되거나 (immunocompromised) 면역억제된 (immunosuppressed) 환자 또는 그의 접촉자 (contact)이다.
본 발명은 추가로 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 선택적으로 포함하는, 바람직하게는 비경구 (예를 들어, i.v. 또는 i.m.) 또는 점막 (예를들어, 경구) 제제를 포함하는, 본 명세서에 기재된 항체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 점막 제제는 예를 들어 유화되거나, 나노 입자화되거나, 또는 분무화된다.
이러한 제약 조성물은 단독 활성 물질로서, 또는 다른 활성 물질, 또는 적어도 2개 또는 3개의 상이한 항체의 조합물 또는 혼합물과 같은 활성 물질의 혼합물과 조합하여 항체를 함유할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 항체는 구체적으로 의학, 진단 또는 분석 용도로 제공된다.
본 발명은 또한 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화 (colonization) 또는 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염과 같은 연관된 질병의 진단을 위해 본 명세서에 기재된 항체의 용도를 추가로 제공한다.
구체적으로, 상기 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용하기 위해 제공되며, 상기 대상체의 O3b-형의 클렙시엘라 뉴모니애에 의한 전신 감염 또는 군집화는 상기 대상체의 생물학적 시료를 항체와 접촉시킴으로써 생체 외에서 결정되며, 상기 항체의 특이적 면역 반응은 감염 또는 군집화를 결정한다.
구체적으로, 상기 생물학적 시료는 체액 또는 조직 시료, 바람직하게는 혈액 시료, 대변 시료, 피부 시료, 소변 시료, 뇌척수액 및 내기관 흡입물 (endotracheal aspirates), 흉수 (pleural fluid), 폐 천자 (lung tap), 비강 면봉 또는 객담과 같은 호흡 기관 표본, 또는 상기 시료 중 어느 하나에서 유래한 클렙시엘라 뉴모니애 단리물이다. 구체적으로, 소변, 혈액, 혈액 단리물 또는 혈액 배양물, 흡입물, 가래, 삽관된 피험자의 세척액 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택된 체액 시료를 특이적 면역 반응에 대해 시험한다.
구체적으로, 상기 생물학적 시료를 처리하여 생물학적 시료로부터 기원하는 클렙시엘라 뉴모니애 단리물을 생성하고, 상기 단리물은 이의 O3b 유전자형 또는 표현형 및/또는 O3b 항원 발현 수준을 추가적인 특징으로 할 수 있다. 세균 단리물을 생산하기 위한 바람직한 시료 제조 방법은 세균 농축 및 배양 단계를 사용한다.
구체적으로, 상기 생물학적 시료를 처리하여 선택적으로 시료에서 직접 O3b 항원 수준을 결정하고, 경우에 따라 매트릭스 효과를 줄이고 시험의 특이성 및 민감도를 높이기 위한 농축 또는 정제의 예비 단계를 따른다. 예비 단계는 표준 배양 배지에서의 혈구 배양뿐만 아니라 일반적인 미생물학 실험실에서 수행되는 고형 한천 (표현형 검정(phenotyping) - 예를 들어, 안티바이오그램(antibiogram) 포함)에서의 표본 배양과 같은 표준 배양 절차에 따라 생물 표본 배양을 포함한다. 세균은 다른 성장 배지 (표준 배지 및/또는 화학적으로 정의된 배지, 높은 영양소, 낮은 양분, 제한된 배양 배지 조성)에서의 CFU의 확장을 위해 계대 배양되어 독성 인자의 발현을 향상시킬 수 있다. 세균 현탁액을 준비하고 표준 완충 용액으로 세척하여 잠재적인 기질 효과를 제거할 수 있다.
구체적으로, 상기 O3b-항원은 면역 분석법, 바람직하게는 ELISA, CIA, RIA, IRMA, 응집 분석, 면역 크로마토그래피, 딥스틱 분석 및 웨스턴블롯/면역블롯, 바이오센서, 어레이 기술 또는 질량-분광법, 핵 자기 공명 (NMR) 중 적어도 하나에 의해 결정된다.
구체적으로, 본 발명에 따른 진단적 용도는 시험 견본으로부터 회수된 순수한 클렙시엘라 뉴모니애 배양물로부터 시험관 내 클렙시엘라 뉴모니애의 혈청형을 결정하여 세균이 O3b-형인지 여부를 결정하는 것을 의미한다.
본 발명은 하기 성분을 포함하는 조성물 또는, 부분 (part)들의 키트 (kit) 속에 항체 및 추가의 진단 시약을 포함하는, 본 명세서에 기재된 항체의 진단 제제를 추가로 제공한다:
a) 본 명세서에 기재된 항체; 및
b) 추가의 진단 시약;
c) 및 선택적으로 항체 및 진단 시약 중 적어도 하나를 고정시키는 고체 상.
상기 진단 제제는 임의로 조성물 또는, 부분들의 키트에 본 발명의 항체 및 추가의 진단 시약을 포함한다.
상기 진단 키트는, 임의로 바람직하게는 물, 완충제 또는 부형제와 같은 통상적이거나 비특이적인 물질 또는 성분없이, 생물학적 시료에서 O3b-항원 발현을 결정하기 위한 모든 필수 성분을 포함한다. 상기 저장 안정성 키트는 바람직하게는 적어도 6개월, 보다 바람직하게는 적어도 1년 또는 2년 동안 저장 될 수 있다. 이는 건조 (예를 들어, 동결 건조)된 성분으로 이루어질 수 있고/있거나 방부제를 포함할 수 있다.
바람직한 진단 키트는 예를 들어 일상적 실험을 용이하게하는 오직 하나의 패키지에만 성분이 포함되는 포장된 또는 미리 포장된 단위로서 제공된다. 이러한 패키지는 예를 들어 일련의 생물학적 시료의 테스트를 수행하기에 적합한 하나 이상의 테스트에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 상기 키트는 표준 또는 참조 대조군으로서 O3b-항원 제제를 추가로 적절하게 포함할 수 있다.
상기 진단 조성물은 생물학적 시료와의 반응 혼합물 또는 그러한 시약의 보존된 형태, 예를 들어 동결 건조된 저장 안정성 형태와 같은 반응 혼합물에서 즉시 사용할 수 있는 시약일 수 있다; 급속-동결 (snap-frozen) (예를 들어, 액체 질소에서의), 극저온 저장 (-70℃ 및 -80℃), 저온 저장 (-20℃ 및 5℃) 및 조절된 실온 (15℃ 내지 27℃); 예를 들어, 글리세롤-스톡, 조직 파라핀-블록, (구강) 면봉 및 다른 표준 생물학적 시료 저장 방법과 같은 보존된 형태의 시약인 표준 시료 저장은 즉시 사용 가능한 시약을 얻기 위해 재구성되거나 제조될 수 있다. 이러한 즉시 사용 가능한 시약은 전형적으로 수용액, 구체적으로 (생리학적) 완충액 상태 (예를 들어, EDTA 완충액, 인산 완충액, HBSS, 구연산 완충액 등)의 형태이다.
구체적으로, 상기 추가의 진단 시약은 항원 및/또는 그의 항원에 결합하는 항체의 반응 생성물과 특이적으로 반응하는 시약이다. 적절한 진단 시약은 대상에서 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화를 진단 또는 모니터링하기 위한 면역 분석을 수행하는 데 적절하게 사용된다. 상기 적절한 진단 시약은 용매, 완충제, 염료, 항응고제, 본 발명의 항체 및/또는 항체-항원 면역 복합체에 특이적으로 결합하는 리간드일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 임의로 표지된 항체 및/또는 표지된 추가의 진단 시약, 예를 들어 상기 항체 또는 상기 항체의 면역 복합체를 특이적으로 인식하는 시약과 같은 본 발명의 항체의 진단 제제를 제공하고, 및/또는 항체 및 진단 시약 중 적어도 하나를 고정화시키는 고체 상을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 추가의 진단 시약은 진단 표지 또는 그의 항원에 결합하는 항체의 반응 산물 및/또는 항체와 특이적으로 반응하는 시약이다.
상기 항체 또는 진단 시약은 직접 표지되거나 간접적으로 표지될 수 있다. 간접 표지는 O3b-항원에 대한 항체 또는 진단 시약과 복합체를 형성하는 표지 결합제를 포함할 수 있다.
상기 표지는 전형적으로 분석에서 검출될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분이다. 예시적인 표지는 발색단, 형광색소 또는 방사성 분자이다. 일부 실시 양태에서, 상기 항체 또는 진단 시약은 그 자체가 검출 가능한 분자 (예를 들어, 형광 부분, 전기 화학적 표지, 금속 킬레이트 등)뿐만 아니라 검출 가능한 반응 산물 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제와 같은 효소)의 생산 또는 자신이 검출될 수 있는 특이적으로 결합하는 분자 (예를 들어, 비오틴, 디곡시게닌 (digoxigenin), 말토스, 올리고히스티딘, 2,4-딘트로벤젠 (2,4-dintrobenzene), 페닐아르세네이트 (phenylarsenate), ssDNA, dsDNA 등)에 의해 간접적으로 검출될 수 있는 분자를 포함할 수 있는 검출 가능한 표지에 접합된다.
바람직한 진단 제제 또는 검정은 예를 들어 라텍스 비드, 금 입자 등과 같이 고체 상에 고정화된 본 발명의 항체를 포함하여, 예를 들어 시험될 샘플로부터 수득된 O3b-형의 세균 항체에 의한 응집을 시험한다.
본 발명은 클렙시엘라 뉴모니애 균주에 의해 야기된 대상체에서 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화를 진단하는 방법으로서,
a) 본 명세서에 기재된 항체를 제공하는 단계; 및
b) 항체가 시험할 대상체의 생물학적 시료에서 O3b-에피토프와 특이적으로 면역반응 (immunoreact)하는지 여부를 검출함으로써, 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화를 진단하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 상기 생물학적 시료는 체액 또는 조직 시료, 바람직하게는 혈액 시료, 대변 시료, 피부 시료, 소변 시료, 뇌척수액 및 내기관 흡입물 (endotracheal aspirates), 흉수 (pleural fluid), 폐 천자 (lung tap), 비강 면봉 또는 객담과 같은 호흡 기관 표본, 또는 상기 시료 중 어느 하나에서 유래한 클렙시엘라 뉴모니애 단리물이다.
이러한 진단은 군집화의 MDR 클렙시엘라 뉴모니애 감염의 경우 특이적으로 나타나며, 특히 O3b-형 MDR 클렙시엘라 뉴모니애를 대상으로 한다. 선택적으로, 진단 분석은 O3b-항원 및/또는 임의의 추가의 O3a-항원 및 O3-항원에 결합하기 위한 상이한 특이성 및/또는 친화도를 갖는 2가지 상이한 항체를 포함할 수 있어, 다양한 O3-항원 사이의 구별이 가능하다.
특정 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 진단 또는 본 발명의 진단 방법에 의한 클렙시엘라 뉴모니애에 의한 대상체의 감염을 결정하기 위한 동반 진단을 제공하여, 예를 들어, 본 발명의 항체로 치료하는 것과 같은 면역 요법을 사용하여, 상기 감염에 대한 치료제를 포함하는 치료의 기초를 제공한다.
특정 양태에 따르면, 본 발명은 예를 들어, 살아있는 세균의 양이 제한되는 임상 표본으로부터 유리 LPS를 결정함으로써 클렙시엘라 뉴모니애에 의한 대상체의 감염을 진단하기 위한 감수성 병상 진단 (bedside diagnostics)을 제공한다. 상기 분석의 민감도는 특히 100ng 미만, 바람직하게는 10ng 미만의 LPS이다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 추가로 제공한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 VH 및/또는 VL을 포함하는 단백질성 구조물, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 단백질 유도체를 포함하거나, 이를 포함하는 단백질성 구조물을 발현하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 플라스미드를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
본 발명은 숙주 세포가 상기 항체를 생산하는 조건하에 배양되거나 유지되는, 본 명세서에 기재된 항체를 생산하는 방법을 추가로 제공한다.
구체적으로, 숙주 세포 및 이 숙주 세포를 이용한 생산 방법이 바람직하며, 상기 숙주 세포는
- 항체 경쇄를 발현하는 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트; 및
- 항체 중쇄를 발현하는 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트를 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다:
a) 클렙시엘라 뉴모니애의 O3b-항원으로 비-인간 동물을 면역화시키고 항체를 생산하는 B-세포를 분리하는 단계;
b) 분리된 B-세포로부터 불멸화된 세포주를 형성하는 단계;
c) 상기 세포주를 스크리닝하여 O3b-항원 및 임의의 O3a-항원 및/또는 O3-항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 세포주를 동정하는 단계 (여기서, 예를 들어, 상기 O3b-항원에 우선적으로 결합시키는 단계는 임의의 다른 O3-항원(들)이 결정되는 것과 비교된다) 및
d) 단클론 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 단클론 항체 또는 인간화 또는 인간 형태의 항체 또는 그의 유도체를 생성하는 단계.
대안적으로, 상기 방법은 스크리닝 단계로서 말초 혈액으로부터 분리된 인간 공여자의 B-세포를 스크리닝하고, 표적 항원에 B-세포 결합의 단일 세포 분류 후에 면역 글로불린 유전자의 클로닝 및 시퀀싱 (sequencing)을 포함한다.
본 발명은 후보 항체를 동정하는 방법을 추가로 제공하며:
a) 항체 또는 항체-생산 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계; 및
b) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 O3b-에피토프와 함께 또는 그 시료에 의해 생성된 항체의 결합에 대해 평가하는 단계를 포함하며, 상기 항체와 에피토프 사이의 양성 반응으로 항체를 후보 항체로서 동정한다.
본 발명은 후보 항체를 동정하는 방법을 추가로 제공하며,
a) 항체 또는 항체-생산 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계; 및
b) 시료 속의 항체 또는 시료에 의해 생성된 항체의 본 명세서에 정의된 바와 같은 O3b-에피토프와의 결합에 대해 평가하는 단계를 포함하며, 본 명세서에 정의된 바와 같은 O3a-에피토프 및/또는 O3-에피토프와 관련하여, 또는 클렙시엘라 뉴모니애의 어떠한 비-O3 LPS 분자와 관련하여 항체와 O3b-에피토프 사이의 특이적 양성 반응으로 항체를 후보 항체로서 동정한다.
구체적으로, 상기 pan-O3 특이적 항체는 후보 항체가 O3b-에피토프, O3a-에피토프 및 O3-에피토프를 인식하는 경우, 동정된다.
구체적으로, 상기 pan-O3 특이적 항체는 10-7M 미만, 바람직하게는 10-8M 미만, 더욱 바람직하게는 10-9M 미만의 Kd와 같은 높은 친화성으로 O3b-에피토프, O3a-에피토프 및 O3-에피토프 각각을 결합시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 pan-O3 특이적 항체는 교차 반응하지 않거나 또는 O1, O2, O4 및 O12와 같은 비-O3 에피토프와 현저하게 교차 반응하지 않는다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체를 생산하는 방법을 추가로 제공하며;
a) 본 명세서에 기재된 바와 같이 동정된 후보 항체를 제공하는 단계; 및
b) 후보 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는, 단클론 항체 또는 인간화 또는 인간 형태의 후보 항체 또는 그의 유도체를 생산하는 단계를 포함한다.
도 1. 클렙시엘라 뉴모니애의 전형적인 O3 항원의 구조. N 및 Q에 의해 형성된 이당류 구조는 펜타-만노스 O-항원 서브 유닛을 캐리어-프라이머 (CP)에 가교시키는 소위 어댑터이다. 마지막 O-항원 반복은 종결자 분자 (T)에 의해 봉쇄되며, 이는 실제로 Kubler-Kielb 등 (4)이 밝힌 바와 같이 3-연결된 메틸 인산염이다.
도 2. O3 혈청군에 속하는 클렙시엘라 뉴모니애 균주의 LPS 패턴의 이질성. 레인 1: PCM-11, 2: Kp14, 3: Kp62, 4: Kp18, 5: Kp35.
도 3. 클렙시엘라 뉴모니애의 서로 다른 O3 (레인 4-9) 및 무관한 혈청형 (레인 1 내지 3) 균주에서 정제된 LPS 샘플의 ProQ 염색 (A) 및 면역 블롯 (B 및 C). 1μg/ml의 mAb 1G6-B8 (B) 또는 2F8-G6 (C)로 면역 블롯을 수행하였다. 레인 1: # 63 (O1:K2), 2: # 79 (O2:K27), 3: Kp108 (O5), 4: PCM-11, 5: Kp14, 6: Kp62, 7: Kp18, 8: Kp35, 9: Kp82.
도 4. 클렙시엘라 뉴모니애 Kp81 LPS의 O-PS 분획 1a, 1b, 1c의 1H NMR (왼쪽 패널) 및 MALDI-TOF MS (오른쪽 패널) 스펙트럼. 삽입 구조는 Kp81 O-PS를 나타낸다. *MeP- 메틸 포스페이트.
도 5. 클렙시엘라 뉴모니애 LPS 분획 1b의 음이온 모드 MALDI-TOF 질량 스펙트럼.
도 6. 다양한 특이성의 단클론 항체에 의해 상이한 O3 항원을 발현하는 살아있는 클렙시엘라 균주의 표면 염색.
도 7. 표 1. 클렙시엘라 뉴모니애 LPS, Kp81 균주에서 분리한 O-PS (1a)에서 관찰된 1H 및 13C NMR 화학적 이동 및 잔여물간 연결 (inter-residue connectivities). MeP: 3.61, 3.63/53.7, JP,H = 11.0Hz. 31P, 1H HMBC는 P (~ 2ppm) 및 MeP의 프로톤 (3.61과 3.63ppm)및 C'의 H-3 (4.26ppm) 사이의 상관 관계를 보여주었다. 31P, 1H HMQC-TOCSY는 P 및 C' 잔기의 H-1, H-2, H-3, H-4, H-5 사이의 상관 관계를 보여주었다. 당 잔기의 아노머 배열(anomeric configuration) (α)은 171-174 Hz의 JH1,C1에 근거하여 결정되었다. b, c, d, e, f, g-중첩된 신호.
도 8. 클렙시엘라 뉴모니애 O3 균주의 혈청 감수성. 표시된 O3 아형의 Mid-로그 배양액 (3Х103 CFU/ml)을 50% 정상 인간 혈청에서 배양하였다. 세균 수는 0, 90 및 180 분의 시점에서 반복하여 결정하였다.
도 9. O3a (A) 또는 O3b (B) 클렙시엘라 뉴모니애 균주에서 추출한 LPS의 TLR-4 신호 전달에 대한 시험관 내 중화. LPS를 혼합하고 상이한 농도의 항체 또는 폴리믹신 B를 함유하는 96웰 플레이트에서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 웰당 5Х104 hTLR4 HEK Blue 세포 (InvivoGen)를 반응물에 첨가하고 혼합물을 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. OD630에서의 흡광도를 측정하고, 중화 용량을 다음 식으로 알칼리성 포스파타아제 유도의 % 억제로서 표현하였다: 억제 % = 100 - [100 Х SEAP (mAb)/SEAP (LPS만 조절)], 상기 SEAP는 LPS가 없는 모의 무-처리 대조군의 신호에 대한 각 처리의 신호.
도 10. 4D3-A4 항체 서열
카바트 시스템에 따라 동정된 항체 4D3-A4의 CDR 서열, CDR1 (서열번호 1), CDR2 (서열번호 2), CDR3 (서열번호 3), CDR4 (서열번호 4), CDR5 (서열번호 5), CDR6 (서열번호 6), (A); 및 IMGT 시스템에 따라 CDR 영역을 지칭하는 동일한 항체를 기재함, CDR1 (서열번호 7), CDR2 (서열번호 8), CDR3 (서열번호 9), CDR4 (서열번호 10), CDR5 (서열번호 11), CDR6 (서열번호 12), (B).
약어:
CDR1 = VH-CDR1
CDR2 = VH-CDR2
CDR3 = VH-CDR3
CDR4 = VL-CDR4 또는 VL-CDR1
CDR5 = VL-CDR5 또는 VL-CDR2
CDR6 = VL-CDR6 또는 VL-CDR3
가변 및 불변 영역 VH (서열번호 15) 및 VL (서열번호 16), (C)를 확인하는 중쇄 (HC, 서열번호 13) 및 경쇄 (LC, 서열번호 14)의 전장 서열.
가변 영역 VH 또는 VL: 굵은 글씨와 밑줄이 있는 글자
불변 영역: 일반 대문자
도 2. O3 혈청군에 속하는 클렙시엘라 뉴모니애 균주의 LPS 패턴의 이질성. 레인 1: PCM-11, 2: Kp14, 3: Kp62, 4: Kp18, 5: Kp35.
도 3. 클렙시엘라 뉴모니애의 서로 다른 O3 (레인 4-9) 및 무관한 혈청형 (레인 1 내지 3) 균주에서 정제된 LPS 샘플의 ProQ 염색 (A) 및 면역 블롯 (B 및 C). 1μg/ml의 mAb 1G6-B8 (B) 또는 2F8-G6 (C)로 면역 블롯을 수행하였다. 레인 1: # 63 (O1:K2), 2: # 79 (O2:K27), 3: Kp108 (O5), 4: PCM-11, 5: Kp14, 6: Kp62, 7: Kp18, 8: Kp35, 9: Kp82.
도 4. 클렙시엘라 뉴모니애 Kp81 LPS의 O-PS 분획 1a, 1b, 1c의 1H NMR (왼쪽 패널) 및 MALDI-TOF MS (오른쪽 패널) 스펙트럼. 삽입 구조는 Kp81 O-PS를 나타낸다. *MeP- 메틸 포스페이트.
도 5. 클렙시엘라 뉴모니애 LPS 분획 1b의 음이온 모드 MALDI-TOF 질량 스펙트럼.
도 6. 다양한 특이성의 단클론 항체에 의해 상이한 O3 항원을 발현하는 살아있는 클렙시엘라 균주의 표면 염색.
도 7. 표 1. 클렙시엘라 뉴모니애 LPS, Kp81 균주에서 분리한 O-PS (1a)에서 관찰된 1H 및 13C NMR 화학적 이동 및 잔여물간 연결 (inter-residue connectivities). MeP: 3.61, 3.63/53.7, JP,H = 11.0Hz. 31P, 1H HMBC는 P (~ 2ppm) 및 MeP의 프로톤 (3.61과 3.63ppm)및 C'의 H-3 (4.26ppm) 사이의 상관 관계를 보여주었다. 31P, 1H HMQC-TOCSY는 P 및 C' 잔기의 H-1, H-2, H-3, H-4, H-5 사이의 상관 관계를 보여주었다. 당 잔기의 아노머 배열(anomeric configuration) (α)은 171-174 Hz의 JH1,C1에 근거하여 결정되었다. b, c, d, e, f, g-중첩된 신호.
도 8. 클렙시엘라 뉴모니애 O3 균주의 혈청 감수성. 표시된 O3 아형의 Mid-로그 배양액 (3Х103 CFU/ml)을 50% 정상 인간 혈청에서 배양하였다. 세균 수는 0, 90 및 180 분의 시점에서 반복하여 결정하였다.
도 9. O3a (A) 또는 O3b (B) 클렙시엘라 뉴모니애 균주에서 추출한 LPS의 TLR-4 신호 전달에 대한 시험관 내 중화. LPS를 혼합하고 상이한 농도의 항체 또는 폴리믹신 B를 함유하는 96웰 플레이트에서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 웰당 5Х104 hTLR4 HEK Blue 세포 (InvivoGen)를 반응물에 첨가하고 혼합물을 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. OD630에서의 흡광도를 측정하고, 중화 용량을 다음 식으로 알칼리성 포스파타아제 유도의 % 억제로서 표현하였다: 억제 % = 100 - [100 Х SEAP (mAb)/SEAP (LPS만 조절)], 상기 SEAP는 LPS가 없는 모의 무-처리 대조군의 신호에 대한 각 처리의 신호.
도 10. 4D3-A4 항체 서열
카바트 시스템에 따라 동정된 항체 4D3-A4의 CDR 서열, CDR1 (서열번호 1), CDR2 (서열번호 2), CDR3 (서열번호 3), CDR4 (서열번호 4), CDR5 (서열번호 5), CDR6 (서열번호 6), (A); 및 IMGT 시스템에 따라 CDR 영역을 지칭하는 동일한 항체를 기재함, CDR1 (서열번호 7), CDR2 (서열번호 8), CDR3 (서열번호 9), CDR4 (서열번호 10), CDR5 (서열번호 11), CDR6 (서열번호 12), (B).
약어:
CDR1 = VH-CDR1
CDR2 = VH-CDR2
CDR3 = VH-CDR3
CDR4 = VL-CDR4 또는 VL-CDR1
CDR5 = VL-CDR5 또는 VL-CDR2
CDR6 = VL-CDR6 또는 VL-CDR3
가변 및 불변 영역 VH (서열번호 15) 및 VL (서열번호 16), (C)를 확인하는 중쇄 (HC, 서열번호 13) 및 경쇄 (LC, 서열번호 14)의 전장 서열.
가변 영역 VH 또는 VL: 굵은 글씨와 밑줄이 있는 글자
불변 영역: 일반 대문자
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 링커 서열을 갖거나 갖지 않는 면역 글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로 이해되는 항체 도메인으로 구성되거나 이를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 폴리펩티드는 루프 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 2개 이상의 베타-가닥으로 이루어진 베타-배럴 구조를 포함한다면 항체 도메인으로 이해된다. 항체 도메인은 천연 구조일 수 있거나 예를 들어 Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fc 감마 수용체에 대한 결합과 같은 안정성 또는 기능적 특성과 같은 임의의 다른 특성을 항원 결합 특성 또는 변형시키기 위해 돌연변이 유발 또는 유도체 화에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 항체는 하나 이상의 항원 또는 이러한 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 특이적 결합 부위를 가지고, VH, VL 또는 VHH와 같은 단일 가변 항체 도메인의 CDR 결합 부위 또는 VL/VH 쌍과 같은 가변 항체 도메인 쌍의 결합 부위를 특이적으로 포함하며, 항체는 F(ab'), (Fab)2, scFv, Fv 또는 전장 항체와 같은 VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 특히 VH, VL 또는 VHH와 같은 단일 가변 항체 도메인, 또는 연결 서열 또는 힌지 영역을 갖거나 갖지 않는 가변 및/또는 항체 도메인의 조합을 포함하거나 구성하는 항체 형태를 지칭한다 VH/VL 쌍과 같은 가변 항체 도메인 쌍, VL/VH 도메인 쌍 및 상동성 항체 도메인을 포함하거나 이를 포함하는 항체, 예컨대 중쇄 항체, Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv, 또는 예를 들어 IgG 형 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 전장 항체를 포함할 수 있다. 용어 "전장 항체"는 적어도 대부분의 Fc 도메인 및 자연 발생 항체 단량체에서 통상적으로 발견되는 다른 도메인을 포함하는 임의의 항체 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 이 문구는 특정 항체 분자가 항체 단편이 아니라는 것을 강조하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
상기 용어 "항체"는 구체적으로 상이한 표적 항-게놈에 대해 지시되거나 또는 항체 도메인의 상이한 구조 배열을 포함하는 다른 항체가 실질적으로 없는 단리된 형태의 항체를 포함해야 한다. 또한, 단리된 항체는 단리된 항체, 예를 들어 단클론 항체 또는 상이한 특이성을 갖는 항체 단편과 같은 적어도 하나의 다른 항체와의 조합을 포함하는 조합 제제에 포함될 수 있다.
상기 용어 "항체"는 특히 재조합 항체를 포함하고, 인간, 쥐, 토끼, 염소, 라마, 암소 및 말 또는 암탉과 같은 조류를 포함하는 포유류와 같은 인간 종을 포함하는 동물 기원의 항체에 적용될 것이고, 이는 동물 기원의 서열, 예를 들어 인간 서열에 기초한다.
용어 "항체"는 쥐 및 인간 기원의 서열과 같은 상이한 종의 기원의 서열을 갖는 키메라 항체에 추가로 적용된다.
항체와 관련하여 사용되는 "키메라 (chimeric)"라는 용어는 나머지 사슬 세그먼트는 다른 종 또는 부류의 상응하는 서열과 상동성을 가지는 동안, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 종에서 유래된 항체의 상응하는 서열과 상동인 항체를 의미한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 포유 동물의 한 종에서 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 일정 부분은 다른 유래의 유도체 항체와 상동성이 있다. 예를 들어, 가변 영역은 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 조합하여 비-인간 숙주 유기체로부터의 용이하게 이용 가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 유래될 수 있다.
용어 "항체"는 인간화 항체에도 적용될 수 있다.
항체와 관련하여 사용되는 용어 "인간화된 (humanized)"은 비-인간 종 유래 면역 글로불린으로부터 실질적으로 유도된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 말하며, 분자의 나머지 면역 글로불린 구조는 구조 및/또는 인간 면역 글로불린의 서열을 포함한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역에 이식된 상보성 결정 영역 (CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나, 예를 들어 인간 면역 글로불린과 보다 유사하게 변형된 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 형태의 인간화 항체는 모든 CDR 서열 (예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개의 CDR을 모두 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태는 원래의 항체와 관련하여 변형된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
상기 용어 "항체"는 인간 항체에도 추가로 적용된다.
항체와 관련하여 사용되는 용어 "인간"은 인간 생식계 면역 글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 CDR에서, 인간 생식선 면역 글로불린 서열 (예를 들어, 시험관 내에서의 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 면역 글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역 글로불린에 대해 형질 전환된 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.
용어 "항체"는 특히 모든 등급 또는 하위 등급의 항체에 적용됩니다. 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 주요 부류에 할당될 수 있으며, 이들 중 몇 개는 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다.
상기 용어는 단클론 항체 또는 다클론 항체, 특히 재조합 항체에 관한 것으로, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체 및 항체 구조, 예를 들어 동물 유래 항체, 예컨대 인간, 뮤린, 키메라, 인간화 항체, 또는 하이브리도마 유래 항체와 같은 상이한 기원의 유전자 또는 서열을 포함한다. 추가적인 실시예는 항체를 발현하도록 형질 전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합, 조합 라이브러리, 또는 다른 DNA 서열에 대한 항체 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체로부터 단리된 항체를 의미한다.
상기 용어 "항체"는 또한 항체의 유도체, 특히 기능적으로 활성인 유도체를 의미하는 것으로 이해된다. 항체 유도체는 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 및/또는 항체의 임의의 도메인이 하나 이상의 다른 단백질, 예컨대 다른 항체의 임의의 위치에서 융합될 수 있는 융합 단백질의 임의의 조합으로 이해된다. CDR 루프, 수용체 폴리펩티드뿐만 아니라 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 독소 등을 포함하는 결합 구조를 포함한다. 항체의 유도체는 공유 결합, 정전기적 상호 작용, 디설파이드 결합 등의 다양한 화학적 기술에 의해 다른 부분에 결합되거나 결합됨으로써 수득될 수 있다. 항체에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, PEG, 전구 약물 또는 약물)일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 항체는 생물학적으로 허용 가능한 화합물과 특이적 상호 작용을 허용하는 추가의 태그를 포함하는 유도체이다. 항체가 그 표적에 결합하는데 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 본 발명에서 사용할 수 있는 태그는 특별히 제한되지 않는다. 적합한 태그의 예는 His-태그, Myc-태그, FLAG-태그, Strep-태그, Calmodulin-태그, GST-태그, MBP-태그 및 S-태그를 포함한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 항체는 표지를 포함하는 유도체이다. 본 명세서에 사용된 용어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성하기 위해 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 방사성 동위 원소 표지 또는 형광 표지와 같은 자체에 의해 검출될 수 있거나 효소 표지의 경우에 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바람직한 유도체는 바람직하게는 SBA, OPK 또는 LAL 분석에서 결정된 바와 같이 클렙시엘라 뉴모니애에 대항하는 효능을 갖는 항원 결합에 대해 기능적으로 활성이거나 세균 감염으로부터 보호하거나 내독소 혈증 (endotoxemia)을 중화시킨다.
구체적으로, 본 발명의 항체로부터 유래된 항체는 O3b-항원에 차별적으로 결합하여, 예를 들어, O3b-항원을 특이적으로 또는 선택적으로 결합시키는 기능적으로 활성인 적어도 하나 이상의 CDR 영역 또는 CDR 변이체를 포함할 수 있다.
모 CDR 또는 FR 서열과 같은 모 항체 또는 항체 서열로부터 유도된 항체는 본 명세서에서 가상실험 내에서 (in silico) 또는 재조합 공학에 의해 또는 화학적 유도체화 (chemical derivatization) 또는 합성에 의해 수득된 돌연변이체 또는 변이체로서 특히 이해된다.
용어 "항체"는 모 CDR 서열의 기능적으로 활성인 CDR 변이체를 갖는 항체 및 모 항체의 기능적으로 활성인 변이체 항체를 포함하는 항체의 변이체를 또한 의미하는 것으로 이해된다.
구체적으로, 본 발명의 항체로부터 유래된 항체는 적어도 하나 이상의 CDR 영역 또는 그의 CDR 변이체, 예를 들어 경쇄 가변 영역의 3개 이상의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역의 3개 이상의 CDR을 가지고, CDR 또는 FR 영역 중 적어도 하나에서, 또는 HC 또는 LC의 불변 영역에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 갖고, 예를 들어 O3b-항원에 특이적으로 결합하는 기능적으로 활성인 항체를 포함할 수 있다.
용어 "변이체"는 특히 예를 들어, 돌연변이 유발 방법에 의해 수득된 돌연변이 항체 또는 항체의 단편과 같은 항체를 의미하며, 특히 특정 항체 아미노산 서열 또는 영역으로의 삽입을 삭제, 교환, 도입하거나 또는 예를 들어 불변 도메인에서 항체의 안정성, 효과가 (effector) 기능 또는 반감기를 조작하기 위해 아미노산 서열을 화학적으로 유도체화하거나, 또는 예를 들어, 당해 기술 분야에서 이용가능한 친화성 성숙 기술에 의해 항원-결합 특성을 개선시키기 위한 가변 도메인에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 무작위화 기술에 의해 수득되는 원하는 위치에서 점 돌연변이를 포함하는 임의의 공지된 돌연변이 유발 방법이 사용될 수 있다. 일부의 경우, 위치는 예를 들어, 가능한 아미노산 또는 항체 서열을 무작위화하기 위한 바람직한 아미노산의 선택 중 임의의 것으로 무작위하게 선택된다. "돌연변이 유발"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 변경시키기 위한 당업계에서 인정된 기술을 의미한다. 바람직한 유형의 돌연변이 유발은 오류가 발생하기 쉬운 PCR 돌연변이 유발, 포화 돌연변이 유발 또는 다른 부위 돌연변이 유발을 포함한다.
상기 용어 "변이체"는 기능적으로 활성인 변이체를 구체적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용된 CDR 서열의 "기능적으로 활성인 변이체"라는 용어는 "기능적으로 활성인 CDR 변이체"로 이해되고, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 항체의 "기능적으로 활성인 변이체"는 "기능적으로 활성인 항체 변이체"로 이해된다. 기능적으로 활성인 변이체는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의한 이 서열 (모 항체 또는 모 서열)의 변형, 또는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 화학적 유도체화로 인한 서열, 또는 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드, 또는 서열의 원위 말단 (distal end) 중 어느 하나 또는 둘 모두, 예를 들어 CDR 서열에서 N-말단 및/또는 C-말단 1,2,3 또는 4개의 아미노산 및/또는 중심적인 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 (즉, CDR 서열의 중간)의 변형을 포함하고, 이 변형이 이 서열의 활성, 특히 손상에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 선택된 표적 항원에 대한 특이성을 갖는 결합 부위의 경우, 항체의 기능적으로 활성인 변이체는 미리 결정된 결합 특이성을 여전히 가지지만, 예를 들어, 특이적 에피토프에 대한 미세 특이성, 친화성, 결합력, Kon 또는 Koff 비율 등에 대해서는 변화될 수 있다. 예를 들어, 친화성 성숙 항체는 기능적으로 활성인 변이체 항체로서 구체적으로 이해된다. 따라서, 친화 성숙된 항체에서의 변형된 CDR 서열은 기능적으로 활성인 CDR 변이체로서 이해된다.
구체적으로, 본 발명의 항체의 기능적으로 활성인 변이체는 O3b-항원에 결합하는 효능, 또는 다른 O3-항원 또는 클렙시엘라 뉴모니애의 임의의 다른 항원과 관련하여 O3b-항원에 우선적으로 결합하는 특이성 또는 선택성, 예를 들어, O3b-항원에 결합하고 클렙시엘라 뉴모니애의 O3a 항원 또는 O3 항원에 결합하지 않거나 (또는 실질적으로 결합하지 않거나), 또는 O3a 항원 또는 O3 항원에 유의적으로 결합하지 않으며 및/또는 클렙시엘라 뉴모니애의 다른 항원에 결합하지 않는 잠재성을 가질 수 있다.
기능적으로 활성인 변이체는 예를 들어 모 항체, 예를 들어 2F8-G6 항체와 동일한 결합 부위를 포함하지만 결합 부위 외의 항체 영역 내에서의 변형을 갖는 항체의 서열을 변화시킴으로써 수득될 수 있거나 또는 이러한 모 항체 O3b 항원에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 능력을 포함하여, 모 항체와 실질적으로 동일한 생물학적 활성 또는 개선된 활성을 실질적으로 가질 수 있다.
선택적으로, 기능적으로 활성인 변이체는 중화 효능 및/또는 SBA 분석에서 보체 매개된 살상의 효능을 추가로 포함할 수 있으며, 및/또는 임의로 OPK 분석에서 항체 매개된 식균 작용의 효능을 추가로 포함할 수 있으며, 및/또는 선택적으로 내독소 중화 기능, 예를 들면, 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 LAL 분석에서 클렙시엘라 뉴모니애를 표적화하기 위한 특이적 결합 분석 또는 기능적 시험에 의해 결정된다.
본 명세서에서 사용된 표적 항원 또는 생물학적 활성에 결합하는 것과 관련하여 용어 "실질적으로 동일한"은 실질적으로 동일한 활성이 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는 예를 들어, 최대 200%, 또는 유사물 또는 모 항체에 대해 측정된 것보다 높은 활성을 나타내는 활성을 의미한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 바람직한 변이체 또는 유도체는 바람직하게는 O3b-항원에 특이적으로 결합하는 효능을 갖는 항원 결합 또는 다른 O3-항원에 비해 O3b-항원에 우선적으로 결합하는 특이성 또는 선택성을 갖는 기능적으로 활성이거나, 클렙시엘라 뉴모니애의 다른 항원, 예를 들어 O3b-항원에 결합하고 클렙시엘라 뉴모니애의 O3a-항원 또는 O3-항원에 결합하지 않거나 (또는 실질적으로 결합하지 않거나) O3a-항원 또는 O3-항원과 유의적으로 결합하지 않고, 및/또는 클렙시엘라 뉴모니애의 다른 항원에 결합하지 않는다. 바람직한 변이체는 적어도 2 로그, 바람직하게는 적어도 3 로그의 Kd값 차이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니애의 다른 항원에 결합하지 않고, 선택적으로 SBA 분석에서 예를 들어, 항체를 함유하지 않은 대조군 샘플과 관련하여 세균 수의 현저한 감소를 달성하는 것과 같이 보체 매개 사멸의 잠재성을 추가로 포함하며, 및/또는 항체를 함유하지 않은 대조군 샘플과 관련하여 세균 수의 현저한 감소를 달성하기 위해 OPK 분석에서 항체 매개된 식균 작용의 효능을 선택적으로 추가로 포함하고, 및/또는 클렙시엘라 뉴모니애를 표적으로 하는 특이적 결합 분석 또는 기능 시험에 의해 결정된 예를 들어, 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 항체를 함유하지 않은 대조군 시료에 비해 내독소 활성의 유의적인 감소를 달성하기 위한 것과 같은 LAL 또는 TLR4 시그널링 분석에서의 내독소 중화 기능을 선택적으로 추가로 포함한다. 다양한 분석에서 활성의 현저한 감소는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%에서 전형적으로 약 100% (+/- 1%)의 완전한 감소까지를 의미한다.
바람직한 실시 양태에서, 모 항체의 기능적으로 활성인 변이체는
a) 생물학적으로 활성인 항체의 단편이며, 상기 단편은 분자 서열의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%를 포함한다;
b) 적어도 하나의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 항체로부터 유도되고, 기능적으로 활성인 변이체는 분자 또는 그의 일부에 대한 서열 동일성을 가지며, 적어도 50% 서열 동일성의 항체와 같이, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다; 및/또는
c) 항체 또는 이의 기능적으로 활성인 변이체, 및 추가적으로 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대해 이종의 적어도 하나의 아미노산 또는 뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적으로 활성인 변이체는 본질적으로 상기 기재된 변이체와 동일하지만, 각각 다른 종의 상동성 서열로부터 유도된다는 점에서 그의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열과는 상이하다. 이들은 자연 발생 변이체 또는 유사체라고 한다.
"기능적으로 활성인 변이체"라는 용어는 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체뿐만 아니라 돌연변이체 또는 기타 자연 발생적 변이체를 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립 유전자 변이체는 본질적으로 폴리펩티드의 생물학적 기능을 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 것으로 특징되는 (폴리) 펩티드의 대체 형태이다.
기능적으로 활성인 변이체는 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 서열 변경에 의해, 예를 들어 하나 이상의 점 돌연변이에 의해 수득될 수 있으며, 여기서 서열 변경은 본 발명의 배합물로 사용되는 경우 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 기능을 유지하거나 향상시킨다. 이러한 서열 변경은 (보존적) 치환, 첨가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특이적 기능적으로 활성인 변이체는 CDR 변이체이다. CDR 변이체는 CDR 영역에서 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변형은 변이체가 변형되지 않은 서열의 생물학적 특성을 보유할 수 있도록 한다. CDR 아미노산 서열의 부분적인 변경은 1 내지 수 개의 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 결실 또는 치환에 의한 것일 수도 있고, 또는 1 내지 수 개의 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 첨가 또는 삽입에 의한 것일수도 있으며, 또는 1 내지 수 개의 아미노산, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산의 화학적 유도체화에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다. 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환, 예를 들어 대체 소수성 아미노산을 위한 하나의 소수성 아미노산의 치환일 수 있다.
보존적 치환은 측쇄 및 화학적 성질과 관련된 아미노산 군 내에서 일어난다. 그러한 군의 예로는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산, 산성 측쇄, 비극성 지방족 측쇄, 비극성 방향족 측쇄, 비하전 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등이 있다.
점 돌연변이는 특히 폴리뉴클레오티드의 조작으로 이해되며, 이는 하나 이상의 다른 아미노산에 대한 단일 (비-연속적) 또는 이중 아미노산의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 비-가공된 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열의 발현을 초래한다.
바람직한 점 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하의 아미노산의 교환을 지칭한다. 이와 관련하여, 아미노산은 64개의 삼중항 코돈에 의해 코딩된 20개의 자연 발생 아미노산을 나타낸다. 이들 20개의 아미노산은 중성 전하, 양전하 및 음성 전하를 갖는 아미노산으로 분리될 수 있다:
"중성"아미노산은 아래에 각각의 3자리 및 1자리 코드와 극성과 함께 표시된다:
알라닌: (Ala, A) 무극성, 중성;
아스파라긴: (Asn, N) 극성, 중성;
시스테인: (Cys, C) 무극성, 중성;
글루타민: (Gln, Q) 극성, 중성;
글리신: (Gly, G) 무극성, 중성;
이소류신: (Ile, I) 무극성, 중성;
류신: (Leu, L) 무극성, 중성;
메티오닌: (Met, M) 무극성, 중성;
페닐알라닌: (Phe, F) 무극성, 중성;
프롤린: (Pro, P) 무극성, 중성;
세린: (Ser, S) 극성, 중성;
트레오닌: (Thr, T) 극성, 중성;
트립토판: (Trp, W) 무극성, 중성;
티로신: (Tyr, Y) 극성, 중성;
발린: (Val, V) 무극성, 중성; 및
히스티딘: (His, H) 극성, 양성 (10%) 중성 (90%).
"양성" 대전된 아미노산은:
아르기닌: (Arg, R) 극성, 양성; 및
라이신: (Lys, K) 극성, 양성.
"음성" 대전된 아미노산은:
아스파르트산: (Asp, D) 극성, 음성; 및
글루탐산: (Glu, E) 극성, 음성.
본 명세서에 기술된 항체 서열 및 동족체에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 특정 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고, 필요하다면, 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
항체 변이체는 기능적이며 기능적 등가물, 예를 들어, 특정 표적에 대한 결합 및 기능적 특성으로 작용할 수 있는, 예를 들어 당류 공학에 의해 생성된 특이적 당화 패턴을 갖는 동족체, 유사체, 단편, 변형 또는 변이체를 포함하는 것으로 명확히 이해된다.
본 발명의 항체는 Fc 효과기 기능을 나타낼 수도 아닐 수도 있다. 행동 양식은 주로 Fc 효과기 기능이 없는 중화 항체에 의해 매개되지만, Fc는 면역 복합체 형성을 통한 순환으로부터 독소와 같은 표적 항원의 보체를 모집하고 지원을 제거할 수 있다.
특정 항체는 활성 Fc 부분이 없기 때문에, 항체의 Fc 부분을 함유하지 않거나 또는 Fc 감마 수용체 결합 부위를 함유하지 않는 항체 도메인으로 구성되거나 Fc 효과기 (effector) 기능이 결여된, 예를들어, Fc 효과기 기능을 감소시키기 위한, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 억제 또는 감소시키기 위한 변형에 의한 항체 도메인을 포함할 수 있다. 다른 항체는 Fc 효과기 기능을 증가시키기 위한, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 증가시키기위한 변형을 혼입시키도록 조작될 수 있다.
이러한 변형은 돌연변이 유발, 예를 들어, Fc 감마 수용체 결합 부위에서의 돌연변이 또는 항체 형태의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 방해하는 유도체 또는 제제에 의해 영향을 받아 Fc 효과기 기능의 감소 또는 증가를 달성할 수 있다.
Fc 효과기 기능의 현저한 감소는 전형적으로 ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정된 바와 같이 미변형 (야생형) 형태의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 Fc 효과기 기능을 지칭하는 것으로 이해된다. Fc 효과기 기능의 유의한 증가는 전형적으로 ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정되는 미변형 (야생형) 형태의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%의 Fc 효과기 기능의 증가를 지칭하는 것으로 이해된다.
항체 서열에 관한 용어 "글리코엔지니어드 (glycoengineered)" 변이체는 당 공학 조작의 결과로서 변형된 면역 조절성 (예를 들어, 항-염증성) 특성을 갖는 당화 변이체를 지칭한다. 모든 항체는 무거운 사슬 불변 영역의 보존된 위치에 탄수화물 구조를 포함하며, 각각의 이소 타입은 단백질 결합, 분비 또는 기능적 활성에 가변적으로 영향을 미치는 N 결합 탄수화물 구조의 별개의 배열을 보유한다. IgG1 형 항체는 각 CH2 도메인에서 N297에 보존된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당 단백질이다. N297에 부착된 두 개의 복합체 두 개의 가지를 갖는 (bi-antennary) 올리고당은 CH2 도메인 사이에 묻혀서 폴리펩티드 주쇄와의 광범위한 접촉을 형성하며, 이들의 존재는 Fc 수용체에 결합하고 작동 자 기능을 매개하는 항체에 필수적이다. N297에서의 N-글리칸의 제거, 예를 들어 돌연변이 N297을 통한 A 또는 T299의 제거는 전형적으로 ADCC가 감소된 아글리코실화된 (aglycosylated) 항체 형태를 초래한다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 글리코실화 또는 글리코엔지니어드되고 (glycoengineered), 또는 아글리코실화된 항체일 수 있다.
항체 글리코실화의 주요 차이점은 세포주 사이에 발생하거나 심지어 다른 배양 조건에서 성장한 동일한 세포주에서도 발생한다. 세균 세포에서의 발현은 전형적으로 아글리코실화된 항체를 제공한다. 인간 베타-1,4- 갈락토실트랜스퍼레이즈 1 및 베타-갈락토사이드 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1 효소를 코딩하는 유전자로 형질 감염된 CHO 세포는 갈락토실화 및 알파-2,6-시알릴화를 갖는 항체를 제공한다. 숙주 세포의 선택 이외에, 항체의 재조합 생산 동안 당화에 영향을 미치는 인자는 성장 모드, 배지 배양, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 계획 등을 포함한다.
"항원-결합 부위"또는 "결합 부위"라는 용어는 항원 결합에 관여하는 항체의 부분을 의미한다. 항원 결합 부위는 중량 ("H") 및/또는 경량 ("L") 사슬 또는 그 가변 도메인의 N 말단 가변 ("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역 (hypervariable regions)"으로 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 V 부위 내의 3개의 고도로 발산된 뻗기 (stretches)는 프레임워크 영역으로 알려진 보다 보존된 인접 뻗기 사이에 상호 위치한다. 항원 결합 부위는 결합된 에피토프 또는 항원의 3차원 표면 및 초가변 영역을 "상보성 결정 영역"또는 "CDR"이라 칭한다. CDR에 혼입된 결합 부위는 본 명세서에서 "CDR 결합 부위"라고도 불린다.
본 명세서에서 용어 "표적"또는 "표적 항원"과 상호 교환적으로 사용되는 용어 "항원"은 전체 표적 분자 또는 항체 결합 부위에 의해 인식되는 그러한 분자의 단편을 지칭한다. 구체적으로, 면역학적으로 관련이 있는 B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프와 같은 일반적으로 "에피토프"로 지칭되는 항원, 예컨대 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조의 하부 구조는 그러한 결합 부위에 의해 인식될 수 있다. 다양한 O3-항원과 같은 특정 항원은 탄수화물 (만난 (mannan)) 구조를 포함하고, 임의로 인공 담체, 또는 항원 또는 그의 세포 분획을 발현하는 클렙시엘라 뉴모니애 세포의 형태로 제공되는 단리된 항원으로서 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "에피토프"는 특히 특이적 결합 파트너를 완전히 구성하거나 항체의 결합 부위에 대한 특이적 결합 파트너의 일부일 수 있는 분자 구조를 지칭할 것이다. 에피토프는 탄수화물, 펩티드성 구조, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 이의 유도체 및 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 펩티드성 구조에 포함되는 경우, 이는 적어도 3개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 40개의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 10 내지 20개의 아미노산을 일반적으로 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 구조적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물 사슬의 일차 서열의 단일 세그먼트로 구성된다. 선형 에피토프는 인접하거나 중첩될 수 있다.
구조적 에피토프는 3차 구조를 형성하기 위해 폴리펩티드를 접음으로써 함께 모인 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며 아미노산은 반드시 선형 서열에서 서로 인접하지는 않는다. 구체적으로 및 폴리펩티드 항원과 관련하여, 구조적 또는 불연속적인 에피토프는 1차 서열에서 분리되지만, 폴리펩티드가 천연 단백질/항원으로 폴딩될 때 분자 표면에서 일정한 구조로 조립되는 2개 이상의 이산 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 한다.
본 명세서에서 용어 "에피토프"는 특히 항체에 의해 인식되는 단일 에피토프, 또는 적어도 2개의 상이한 항원에 의해 공유되고 선택적으로 교차-반응성 항체에 의해 인식되는 교차-반응성 에피토프를 지칭한다.
상기 용어 "발현"은 다음과 같은 방식으로 이해된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체와 같은 발현 산물의 원하는 코딩 서열을 함유하는 핵산 분자와, 예를 들어 작동 가능한 결합의 프로모터와 같은 조절 서열이 발현 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 서열로 형질 전환되거나 형질 감염된 숙주는 암호화된 단백질을 생성할 수 있다. 형질 전환을 수행하기 위해, 발현 시스템은 벡터에 포함될 수 있다; 그러나 관련 DNA는 숙주 염색체에 통합될 수도 있다. 구체적으로이 용어는 적합한 조건하에 숙주 세포 및 적합한 벡터, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 위한 상용성 벡터를 지칭한다.
코딩 DNA는 특정 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어, 항체에 대한 특정 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 코딩 DNA의 발현을 개시, 조절 또는 다른 의미로 매개하거나 또는 발현을 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA와 코딩 DNA는 동일한 유전자 또는 다른 유전자의 것일 수 있으며 동일하거나 다른 생물체의 것일 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서의 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어 항생제 내성 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 적합한 숙주 생물에서의 그의 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로 정의된다.
"발현 카세트"는 한정된 제한 효소 부위에서 벡터에 삽입될 수 있는 발현 산물을 암호화하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA 단편을 의미한다. 카세트 제한 부위는 올바른 판독 프레임에 카세트를 확실히 삽입하도록 설계되었다. 일반적으로, 외래 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 효소 부위에 삽입된 다음 벡터에 의해 전달 가능한 벡터 DNA와 함께 숙주 세포 내로 운반된다. 발현 벡터와 같이 DNA가 삽입 또는 첨가된 DNA의 단편 또는 서열은 또한 "DNA 구조물"이라 불릴 수 있다.
발현 벡터는 발현 카세트를 포함하고 추가적으로 통상적으로 숙주 세포 또는 유전체 통합 사이트에서 자율 복제를 위한 기원, 하나 이상의 선택 가능한 마커 (예를 들어, 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 카나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 터미네이터를 포함하며, 이들 성분은 함께 작동 가능하게 연결된다. 본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열 및 유전체 통합 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 공통 유형의 벡터는 일반적으로 추가 (외래) DNA를 쉽게 받아 들일 수 있고 적당한 숙주 세포에 쉽게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자체 함유 분자인 "플라스미드"이다. 플라스미드 벡터는 종종 코딩 DNA 및 프로모터 DNA를 함유하고, 외래 DNA를 삽입하기에 적합한 하나 이상의 제한 효소를 갖는다. 구체적으로, 용어 "벡터"또는 "플라스미드"는 DNA 또는 RNA 서열 (예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포로 도입되어 숙주를 형질 전환시키고 도입된 서열의 발현 (예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진시키는 비히클을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 및 그의 임의의 자손과 같은 특정 재조합 단백질을 생산하기 위해 변형되는 1차 대상 세포를 지칭한다. 모든 자손이 부모 세포와 정확히 동일하지는 않지만 (신중하거나 부주의 한 돌연변이 또는 환경의 차이로 인하여), 자손이 원래 변형된 세포와 동일한 기능을 보유하고있는 한 그러한 변경된 자손이 이 용어에 포함된다는 것을 이해해야한다. 용어 "숙주 세포주"는 재조합 항체와 같은 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 재조합 유전자를 발현하는데 사용되는 숙주 세포의 세포주를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "세포주"는 장기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 나타낸다. 이러한 숙주 세포 또는 숙주 세포주는 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 세포 배양에서 유지되거나 배양될 수 있다.
핵산, 항체 또는 다른 화합물과 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 "단리된"또는 "단리"는 자연적으로 결합될 수 있는 환경으로부터 충분히 분리된 화합물을 지칭하므로, "실질적으로 순수한" 형태로 존재함을 의미한다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물의 배제, 또는 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 의미하지 않는다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 또한 자연 발생적이지 않은, 예를 들어, 코돈 최적화 핵산 또는 cDNA, 또는 화학적으로 합성된 핵산 분자를 포함하는 것을 의미한다.
유사하게, 본 발명의 단리된 항체는 다른 항체 또는 활성제와의 조합 제제에서 제공되는 것과 같이 자연적으로 발생하지 않으며, 자연적으로 발생하지 않는 조합이거나, 자연 발생 항체의 최적화된 또는 친화도-성숙 변이체이거나, 또는 항체의 제조 가능성을 개선하도록 조작된 프레임워크 영역을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 최적화 또는 공학에 의해 항체는 하나 이상의 합성 서열 또는 특성을 포함하는데, 이는 자연에서 항체의 문맥에서 발견되지 않을 것이다.
본 발명의 핵산과 관련하여, "단리된 핵산"이라는 용어가 때때로 사용된다. 이 용어는 DNA에 적용될 때 그것이 유래한 유기체의 자연적으로 발생하는 유전체에서 연속적으로 존재하는 서열로부터 단리된 DNA 분자를 의미한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 유전체 DNA에 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용될 때, "단리된 핵산"이라는 용어는 주로 상기 정의된 단리된 DNA 분자에 의해 암호화된 RNA 분자를 의미한다. 대안 적으로, 상기 용어는 자연 상태 (즉, 세포 또는 조직)에서 결합될 수 있는 다른 핵산으로부터 충분히 단리된 RNA 분자를 지칭할 수 있다. "단리된 핵산" (DNA 또는 RNA)은 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 생성되고 그 생산 동안 존재하는 다른 성분들로부터 단리된 분자를 추가로 나타낼 수 있다.
본 발명의 단리된 항체 또는 에피토프와 같은 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여, 용어 "단리된"은 구체적으로 자연적 환경에서 그들이 발견된 다른 화합물과 같이 자연적으로 연관된 물질이 없거나 실질적으로 없는 화합물을 지칭하거나, 또는 시험관 내 또는 생체 내에서 실시된 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 때, 이들이 준비된 환경 (예를 들어, 세포 배양물)을 의미한다. 분리 된 화합물은 희석제 또는 보조제로 제형화될 수 있고, 실용적인 목적을 위해 여전히 단리될 수 있다 - 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 진단 또는 치료에 사용될 때 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합될 수있다. 특히, 본 발명의 단리된 항체는 단리되고 정제된 형태로 제공되기 때문에, 바람직하게는 유일한 활성 물질로서 단리된 항체를 포함하는 제제에서 제공되기 때문에, 클렙시엘라 뉴모니애 균주에 대해 생성된 다클론성 혈청 제제와 상이하다. 그러나 이것은 단리된 항체가 제한된 수의 더 명확히 정의된 (단리된) 항체를 포함하는 조합 생성물에서 제공된다는 것을 배제하지 않는다. 단리된 항체는 비드 (bead)와 같은 고체, 반 액체 또는 액체 담체 상에 제공될 수 있다.
"중화하는" 또는 "중화"라는 용어는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 클렙시엘라 뉴모니애와 같은 병원체를 억제하여 개체를 감염시키거나 내독소를 생성시킴으로써 병원체가 감염을 촉진하는 것을 저해하는 모든 분자를 지칭한다. 중화가 달성되는 메커니즘에 관계없이 내독소가 생물학적 활성을 발휘하는 것을 억제한다. 중화는 예를 들어 점막 표면의 클렙시엘라 뉴모니애에 의한 콜로니 형성을 억제하는 항체, 멸균된 신체 부위에 대한 침입 및 숙주에서 부작용을 유발하는 생물학적 신호 (최악의 경우 패혈성 쇼크를 유발함)에 의해 달성될 수 있다.
엄격한 의미에서, 중화는 그의 동족 수용체 (예를 들어, Toll-유사 수용체-4 복합체)에 대한 특정 LPS의 결합을 억제하여 생물학적 활성을 유도하는 것을 의미한다. 이러한 중화 효능은 전형적으로 표준 시험, 예를 들어 시험관 내 또는 생체 내 중화 분석, 예를 들어 LAL 시험 또는 TLR-4에 기초한 분석에서 결정되며, 여기서 내독소의 생물학적 활성의 저해는 예를 들어 비색 측정에 의해 측정된다.
클렙시엘라 뉴모니애를 퇴치하거나 중화시키는 항체는 병원균 및 병원성 반응을 방해하여 감염을 제한하거나 방지하고/하거나 그러한 감염으로 인한 질병 상태를 개선하거나 클렙시엘라 뉴모니애 병인을 억제할 수 있고, 특히 보급 및 복제가 숙주의 멸균된 신체 구획/부위 내에 존재할 수 있다. 이와 관련하여, 중화 항체는 또한 항체가 활성 또는 수동 면역에서 관찰되는 감염 인자에 대한 면역을 담당하는 "방어 항체"로서 이해된다. 특히, 본 명세서에 기재된 중화 또는 보호 항체는 병원체에 의해 유도된 질병 증상, 부작용 또는 진행을 예방, 개선, 치료 또는 적어도 부분적으로 억제하기 위한 예방 목적 또는 치료법과 같은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 구체적으로, 보호 항체는 예를 들어, 혈청 살균 또는 옵소닌 식균 활성을 유도하거나, 살균된 신체 부위로부터 전체 세균 세포 또는 LPS 분자를 제거함으로써 살아있는 클렙시엘라 뉴모니애 세포의 복제를 죽이거나 방해할 수 있다 (즉, 확립된 감염에 주어지는 치료). 대안적으로 예방적으로 적용된 방어 항체는 상기 또는 다른 기작 중 하나에 의한 감염 (즉, 살균되지 않은 부위로부터 살균된 신체 구획으로의 클렙시엘라 뉴모니애의 확산)의 확립을 억제한다.
본 명세서에서 사용된 "생물학적 시료"란 용어는 클렙시엘라 뉴모니애를 포함할 수 있는 생물학적 물질을 함유하고 있거나 잠재적으로 포함하고 있는, 사람과 같은 대상체로부터 얻은 모든 물질을 의미한다. 생물학적 샘플은 조직, 액체 또는 세포 배양 시료일 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 시료의 예는 환자 시료, 예를 들어 조직 또는 체액, 특히 내기관 흡인물, 흉수, 폐 천자, 비강 면봉 또는 객담과 같은 호흡 기관 표본, 혈액 시료, 대변 시료, 피부 및 소변 시료 또는 뇌척수액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
생물학적 샘플은 전형적으로 여러 유형의 생물학적 및 소형 유기 분자, 예를 들어, 단백질 물질이 풍부한 점액 삼출물을 함유하는 복잡한 점성 생물학적 유체와 같은 복잡한 생물학적 매트릭스를 포함한다. 적합한 첨가제 또는 추출 절차는 시료 매트릭스의 점성 또는 고체 성분을 가용화 및/또는 분해함으로써 매트릭스 점도를 낮추고 및/또는 시료에서 매트릭스와 관련될 수 있는 비특이적 결합을 감소시키는데 사용될 수 있다. 생물체로부터 마커를 방출하고/하거나 생물학적 매트릭스를 분해 및/또는 액화시키는 샘플 준비 방법을 사용할 수 있다. 분석될 수 있는 생물학적 매트릭스는 비강 분비물, 객담, 가래, 인두 유출액, 요도 또는 질 분비물 및 이러한 막 표면의 세척액과 같은 점액 함유 시료를 포함한다.
적합한 시료 제조 방법은 분석에 대한 생물학적 매트릭스의 효과를 감소시키는 방법 단계를 포함한다. 이러한 방법 단계는 예를 들어 포획, 크로마토그래피, 회전-원심분리 및 투석을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
개체로부터 수득된 물질은 또한 세균 단리물, 예컨대 단리된 클렙시엘라 뉴모니애 또는 세포 배양 생성물을 배양하기 위한 세포 배양물의 형태일 수 있다. 배양 배지는 클렙시엘라 뉴모니애 집단만을 선택적으로 풍부하게하거나, 비-선택적일 수 있다.
세균 단리물 제조는 전형적으로 클렙시엘라 뉴모니애의 증식을 증진시키는 조건에서 시료를 유지시켜 인위적으로 클렙시엘라 뉴모니애 집단을 풍부하게하는 배양 단계를 포함한다.
일단 단리물이 수득되면, 세균은 예를 들어 O 형 및 발현된 O3b-항원의 수준을 결정하기 위한 생화학적 및/또는 혈청학적 검사에 의해 추가로 조사될 수 있다. 몇 가지 타이핑 방법이 클렙시엘라 뉴모니애 균주를 연구하는데 이용 가능하다. 이러한 방법에는 일반적으로 세로타이핑 (serotyping), 톡신-타이핑 (toxin-typing), MLST (Multi-locus sequence typing) 또는 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)를 포함한 유전 관계/계통 발생을 위한 표준 타이핑 (standard typing)이 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "O3b-항원"은 "O3b-유형"으로 언급되며, 특히 화학식 1에 나타낸 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O-항원의 (메틸 인산 함유) 탄수화물 구조를 지칭하며, 만난 중합체 및 화학식 1에 포함된 트리만노스 반복 단위 중 하나 이상을 포함하는 구조를 포함한다. 이러한 구조 및 트리만노스 반복 단위는 지금까지 확인되지 않았다. 구조는 유사하지만 O3a-항원 (화학식 2) 또는 O3-항원 (화학식 3)의 것과 구조가 다르다. 따라서, 놀랍게도, 새로 확인 된 O3b-구조는 별개의 에피토프를 포함한다. O3-항원의 펜타만노스 구조를 특이적으로 인식하는 항체는 이전에 O3a-항원 (테트라만노스즈 구조)을 인식하지 못하는 것으로 밝혀졌다. O3a 및 O3 다당류를 정의하는데 필요한 만노즈 잔기의 최소 수는 선행 기술에서 4로 기술되었고, 항체 에피토프에 대한 가장 짧은 후보는 테트라만난인 것으로 밝혀졌다 ((7) 참조). O3b는 다른 O3-항원의 존재 및 O3b (트리만노스) 구조의 부재에 의해 특징이 되는 O3a 또는 O3 혈청형과 유사하지만 구별되는 새로운 혈청형 결정인자로 이해된다.
O3b 구조를 포함하는 각각의 O-항원은 본 명세서의 O3b-특이적 항체에 의해 인식되는 "O3b-에피토프"를 포함하는 "O3b-항원"으로 언급된다. O3b-항원은 하나 이상의 특정 O3b-에피토프가 혼입된 표면 접근 가능한 항원성 탄수화물 구조인 O3b O-유형의 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS의 외부 부분으로 이해된다.
O3b 형의 클렙시엘라 뉴모니애의 유전자형은 O3 및 O3a 형 클렙시엘라 뉴모니애 균주의 rfb 오페론에서 상응하는 유전자와 비교하여 wbdD 및 wbdA 유전자의 서열에서 낮은 상동성을 특징으로 한다.
적어도 하나의 O3b 구조를 포함하는 LPS O-항원을 특징으로 하는 임의의 클렙시엘라 뉴모니애는 본 명세서에서 O3b 형의 클렙시엘라 뉴모니애로 지칭된다. O3b-형의 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS는 O3b 구조, 또는 O3b 및 O3a 및/또는 O3 구조를 모두 포함할 수 있다.
O3a-항원은 O3a-형의 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS의 바깥 부분으로 이해되며, 이는 그 안에 혼입된 하나 이상의 특이적 O3a-에피토프를 포함하는 표면 접근 가능한 항원성 탄수화물 구조이고, 임의의 O3b-구조를 포함하지 않는다.
O3-항원은 O3-형의 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS의 바깥 부분으로 이해되며, 이는 그 안에 혼입된 하나 이상의 특이적 O3-에피토프를 포함하는 표면 접근 가능한 항원성 탄수화물 구조이고, 임의의 O3b-구조 또는 O3a-구조를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "O3-항원"은 O3b, O3a 및 O3-항원 모두를 지칭한다. O3b-항원을 다른 O3-항원과 비교할 때, 다른 O3-항원은 O3a-항원 및/또는 O3-항원을 나타낼 것이다.
본 명세서에서 사용된 "pan-O3-항체"에 의해 인식되는 표적 항원에 대한 "pan-O3"이라는 용어는 모든 O3b-항원, O3a-항원 및 O3-항원 및 교차 반응성, O3-항원 및 O3-항원을 각각 인식하는 O3-특이적 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "특이적" 결합, 인식 또는 표적화는 결합제, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 표적 항원 또는 이종 분자 집단 내의 각각의 에피토프에 대한 상당한 친화력을 나타낸다는 것을 의미한다. 따라서, 지정된 조건들 (예를 들어, 면역 분석법) 하에서, 결합제는 표적 O3b-항원에 특이적으로 결합하고 샘플에 존재하는 다른 분자들에 상당한 양으로 결합하지 않는다. 상기 특이적 결합은 결합이 표적 동일성, 고, 중 또는 저 결합 친화도 또는 결합능의 관점에서 선택적으로 선택된다는 것을 의미한다. 선택적인 결합은 일반적으로 결합 상수 또는 결합 역학이 다른 표적과 비교하여 적어도 10 배 차이 (적어도 1 로그 차이로 이해됨), 바람직하게는 그 차이가 적어도 100 배 (적어도 2 로그 차이로 이해됨), 및 더욱 바람직하게는 적어도 1000 배 (적어도 3 로그 차이로 이해됨)이다.
용어 "특이성"은 또한 하나 이상의 분자, 예를 들면 교차-특이적 결합제에 결합하는 결합제에 적용되는 것으로 이해된다. 적어도 2개의 상이한 표적 또는 에피토프 또는 이러한 표적의 뉴클레오티드 서열을 표적으로하거나, 또는 적어도 2개의 상이한 표적상의 교차-반응성 에피토프 또는 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 바람직한 교차-특이적 (다특이성 (polyspecific) 또는 교차-반응성이라고도 함) 결합체는 특이적으로 실질적으로 유사한 결합 친화성, 예를 들어, 100배 미만 또는 10배 미만의 차이, 또는 실질적으로 상이한 결합 친화력, 예를 들어, 최소 10배 또는 100배 이상의 차이를 갖는다. 제 2 표적에 대해 제 1 표적을 우선적으로 결합시키는 제 1 표적 (예를 들어, O3b-항원) 및 제 2 표적 (예를 들어, O3a-항원 및 선택적으로 또한 O3 항원) 표적 모두를 인식하는 교차-특이적 결합제는 전형적으로 특징화된다 제 2 항원에 대해 제 1 항원에 우선적으로 결합하는 차별적인 결합 친화도가 구체적으로 적어도 동일하거나 동일 이상, 예를 들면, 적어도 1.5 배, 또는 적어도 2 배, 또는 적어도 3 배, 또는 적어도 4 배, 또는 적어도 5 배, 또는 적어도 6 배, 또는 적어도 7 배, 또는 적어도 8 배 또는 최소 9 배, 또는 적어도 10 배 이상 높다. 이러한 차별적 인 결합은 면역 분석, 바람직하게는 면역 블로팅, ELISA 또는 다른 면역학적 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체는 O3b-항원에 (O3b에만 결합하거나, 또는 O3a-항원 및/또는 O3-항원에 비해 O3b에 선택적으로 결합함) 높은 친화성, 특히, 높은 결합 및/또는 낮은 해리율, 또는 높은 결합력으로 결합한다. 항체의 결합 친화력은 일반적으로 해리 상수 (Kd 또는 KD)로 알려진 항원 결합 부위의 절반이 차지하는 항체의 농도를 특징으로 한다. 통상적으로 결합제는 Kd <10-7M의 결합 친화도를 가지며, 일부의 경우, 예를 들어, 높은 친화성을 갖는 치료 목적에서는 예를 들어, Kd <10-8M, 바람직하게는 Kd <10-9M, 더욱 바람직하게는 Kd <10-10M이다.
그러나, 특히 바람직한 실시 양태에서, 개별 항원 결합 친화도는 예를 들어, 적어도 2개의 항원에 결합할 때, 중간 친화도, 예를 들어, 10-6 미만 및 최대 10-8M의 Kd를 갖는다.
중간 친화성 결합제는 바람직하게는 필요하다면 친화성 성숙 공정과 함께 본 발명에 따라 제공될 수 있다.
친화도 성숙은 표적 항원에 대한 증가된 친화성을 갖는 항체가 생성되는 과정이다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 다양한 실시예에 따라 친화도 성숙된 항체를 생성하기 위해 당업계에서 이용 가능한 친화성 성숙 라이브러리를 제조 및/또는 사용하는 임의의 하나 이상의 방법을 이용할 수 있다. 무작위 돌연변이 유발, 세균 돌연변이 균주의 계대 배양, 위치 지정 돌연변이 유발, 돌연변이 핫스팟 표적화, 간략 돌연변이 유발, 항체 셔플링 (shuffling), 경쇄 셔플링, 중쇄 셔플링, CDR1 및/또는 CDR1 돌연변이 유발과 같은 예시적인 그러한 친화성 성숙 방법 및 용도 및 방법 본 명세서에 개시된 본 발명의 다양한 실시예에 따라 방법 및 용도를 수행할 수 있는 친화성 성숙 라이브러리를 제조하고 사용하는 방법은 예를 들어 Prassler et al.(2009); Immunotherapy, Vol.1 (4), pp.571-583; Sheedy et al.(2007), Biotechnol. Adv., Vol.25 (4), pp.333-352; WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; US2002/0177170; WO2003/074679 에 공개되어 있다.
아미노산 돌연변이 유발 또는 면역 글로불린 유전자 절편의 체세포 돌연변이의 결과를 포함하는 항체의 구조적 변화에 의해, 항원에 대한 결합 부위의 변이체가 생성되고 더 큰 친화도를 위해 선택된다. 친화성 성숙된 항체는 모 항체보다 몇 로그배 (logfold) 더 큰 친화력을 나타낼 수 있다. 단일 모 항체는 친화성 숙성의 대상이 될 수 있다. 대안적으로 표적 항원과 유사한 결합 친화력을 갖는 항체 풀 (pool)은 친화성 성숙 단일 항체 또는 이러한 항체의 친화성 숙성 풀을 얻기 위해 변하는 모 구조로 간주될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 바람직한 친화성 성숙된 (matured) 변이체는 결합 친화도가 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5, 바람직하게는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 50, 또는 바람직하게는 적어도 100 배 증가하는 것을 나타낸다. 친화도 성숙은 결합 친화도 Kd <10-8M의 특정 표적 결합 성질을 갖는 본 발명의 항체를 얻기위한 중간 결합 친화력을 갖는 항체와 함께 모 분자의 각각의 라이브러리를 사용하는 선별 캠페인 과정에서 사용될 수 있다 대안적으로 친화성은 10-9M 미만, 바람직하게는 10-10M 미만 또는 심지어 10-11M 미만, 가장 바람직하게는 피코몰 범위의 Kd에 상응하는 높은 값을 얻기 위한 본 발명에 따른 항체의 친화성 성숙에 의해 더욱 증가될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 결합 친화력은 친화성 ELISA 분석에 의해 결정된다. 특정 실시 양태에서, 결합 친화력은 BIAcore, ForteBio 또는 MSD 분석에 의해 결정된다. 특정 실시 양태에서, 결합 친화도는 동적 방법에 의해 결정된다. 특정 실시 양태에서, 결합 친화력은 평형/용액 방법에 의해 결정된다.
"동일한 특이성을 갖는", "동일한 결합 부위를 갖는" 또는 "동일한 에피토프에 결합"이라는 용어의 사용은 동등한 단클론 항체가 동일하거나 본질적으로 동일, 즉 유사한 면역 반응 (결합) 특성을 나타내고, 사전 선택된 표적 결합 서열에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것을 나타낸다. 특정 표적에 대한 항체 분자의 상대적 특이성은 예를 들어 Harlow, et al., ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)에 기재된 바와 같은 경쟁 분석에 의해 상대적으로 결정될 수 있다.
항체와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "경쟁한다"는 용어는 제 1 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 제 2 항체 또는 항원-결합 항원의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하는 것을 의미하며, 그의 동족 에피토프와의 제 1 항체의 결합 결과가 제 2 항체의 부재 하에서의 제 1 항체의 결합과 비교하여 제 2 항체의 존재 하에서 검출 가능하게 감소되는 것을 의미한다. 제 2 항체의 에피토프에 대한 결합이 또한 제 1 항체의 존재하에 검출 가능하게 감소되는 대안은 가능할 수 있으나, 그러한 경우는 필요하지 않다. 즉, 제 1 항체는 그것의 에피토프에 대한 제 1 항체의 결합을 저해하는 제 2 항체없이 그 항원 결정기에 대한 제 2 항체의 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 그의 동족 에피토프와 다른 항체의 결합을 검출 가능하게 저해하는 경우, 항체는 각각의 항원 결정기 (들)의 결합에 대해 서로 "경쟁"한다고 한다. O3b-항원에 결합하기 위해 임의의 예시된 항체와 경쟁하는 항체가 특히 본 발명에 포함된다.
"경쟁적으로 결합하는" 또는 경쟁은 경쟁 ELISA 분석 또는 ForteBio 분석에 의해 결정된 바와 같이 약 30%보다 큰 상대적 억제를 의미한다. 예를 들어, 경쟁 분석이 항원의 결합의 의도된 기능으로 설계된 새로운 항체를 선택하거나 스크리닝하는 데 사용되는 특정 상황에서 경쟁 수준이 적절한 지에 대한 기준으로 상대적 저해의 더 높은 기준을 설정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체가 충분히 경쟁적인 것으로 간주되기 전에 적어도 40%의 상대적인 저해가 검출되거나, 또는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 심지어 적어도 100%의 경쟁적 결합에 대한 기준을 설정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단 키트"는 질병 또는 질병 상태를 결정하거나, 질병 또는 질병 진행을 예측하기 위해 하나 이상의 분석물 또는 마커의 측정/검출을 수행하기 위해 조합 또는 혼합물로 사용될 수 있는 키트 또는 부품 세트를 지칭한다. 특히, 키트는 적어도 검출 분자 및/또는 결합제를 함유하며, 검출 분자 및/또는 결합제는 분석물 또는 마커, 또는 이러한 분석물 또는 마커의 반응 생성물을 특이적으로 인식한다. 또한 다양한 시약 또는 도구가 키트에 포함될 수 있다. 진단 키트는 마이크로 비드 또는 평면 어레이 또는 웰과 같은 기질, 바이오 마커 분리를 위한 시약, 특정 표적으로 향하는 검출 분자, 핵산 시퀀싱 또는 증폭을 위한 프라이머와 같은 시약, 핵산 하이브리드 화, 검출 가능한 표지, 용매 또는 완충액 등, 다양한 링커, 다양한 분석 성분, 차단제 등을 위한 어레이를 포함하는 본 방법을 수행하기위한 임의의 유용한 시약을 포함할 수 있다.
키트에는 또한 진단 방법에 사용하기 위한 지침이 포함될 수 있다. 그러한 지시는, 예를 들어, 마커를 결정하기 전에 세포 및/또는 단백질 함유 분획을 분리하는 것과 같은, 진단 목적을 위한 생물학적 시료를 제조하기 위한 도구 또는 장치와 같은 키트에 포함된 장치에 제공될 수 있다. 상기 키트는 저장 기간이 적어도 6개월인 시판용 키트와 같은 저장 안정 형태로 편리하게 제공될 수 있다.
특이적 진단 키트는 또한 검출 분자를 포함하거나, 바람직하게는 제 1 마커에 대해 유도된 제 1 결합 시약을 함유하는 제 1 영역 및 제 2 마커에 대해 유도된 제 2 결합 시약을 함유하는 제 2 영역을 포함하는, 관심 대상 마커에 대해 유도된 검출 분자의 고정화된 패턴화 어레이를 갖는 고체 지지체를 포함한다.
특히 샌드위치 형태를 사용할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 결합제는 생물학적 시료와의 접촉 전에 기판에 접합된다. 하나 이상의 결합제는 검출 분자로서 작용하는 검출 가능한 표지에 접합될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 하나 이상의 결합제는 검출 가능한 표지에 접합된다. 이러한 구성에서, 하나 이상의 결합제는 생물학적 시료와 접촉하기 전에 기질에 결합되어 포획제로 작용할 수 있다. 또한, 하나 이상의 결합제는 생물학적 샘플과의 접촉 전에 기질에 접합될 수 있고/있거나 하나 이상의 결합제는 검출 가능한 표지에 접합될 수 있다. 이러한 경우에, 하나 이상의 결합제는 포획제 및 검출제 중 하나 또는 둘 모두로서 작용할 수 있다.
진단 키트는 면역 반응에 의해 분석물 또는 마커에 결합하는 특정 결합제인 면역 검정법에 사용하기 위해 특별히 제공된다. 이러한 결합제는 표적 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편 또는 항체-유사 스캐폴드 (scaffold)일 수 있다.
적절한 면역 분석법은 ELISA, CIA, RIA, IRMA, 응집 분석, 면역 크로마토그래피, 계량 분석 및 웨스턴 블롯 중 임의의 것이다.
용어 "클렙시엘라 뉴모니애 감염" 및 "클렙시엘라 뉴모니애 군집화"는 다음과 같은 방식으로 이해된다: 클렙시엘라 뉴모니애는 그람 음성균인 장내세균과 (Enterobacteriaceae)의 일원인 세균이다. 그것은 장내 또는 상부기도에서 인간 숙주를 정착시킬 수 있는 유비쿼터스 세균 (ubiquitous bacterium) 이다. 이러한 부위에서 기회주의적 병원체가 되어 면역계에 의해 적절하게 조절되지 않는 경우, 멸균된 신체 부위를 침범할 수 있다. 이들 부위에서 제어되지 않은 박테리아 복제는 중요한 부분에서 클렙시엘라 뉴모니애로부터 방출된 내독소 (즉, LPS) 분자에 의해 매개되는 염증을 유도할 것이다. 균혈증의 경우 엔도톡신 분자가 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있다.
클렙시엘라 뉴모니애의 군집화는 대상체가 클렙시엘라 뉴모니애 세균이 검출될 수 있는 위치에 충분히 높은 농도를 가지고 있음에도 불구하고 세균이 징후나 증상을 일으키지 않는다는 것을 의미한다. 군집화는 장기간 지속될 수 있으며, 생물체에 대한 면역 반응, 다른 생물체와의 경쟁, 때로는 항생제 사용에 따른 영향을 받는다.
일반적으로, 클렙시엘라 뉴모니애에 의한 균혈증은 항생제, 스테로이드 및 비 스테로이드 성 염증 억제제 치료와 같은 기존의 항균 요법으로 성공적으로 치료할 수 있다. 본 발명은 선택적으로 항균 또는 항염증 요법과 병용되는 클렙시엘라 뉴모니애를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 새로운 면역 요법을 제공한다. 클렙시엘라 뉴모니애 감염 환자의 치료에 사용되는 항생제의 예로는 아미노글리코사이드, 세팔로스포린 (cephalosporine), 아미노페니실린, 카바페넴 (carbapenem), 플루오로퀴놀론 (fluoroquinolon), 타이제사이클린 (tygecycline), 콜리스틴 등이 있다.
다약제 내성 (Multi-drug resistant; MDR) 클렙시엘라 뉴모니애는 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴, 아미노글리코사이드, 테트라사이클린, 플루오로퀴놀론, 니트로퓨란토인 (nitrofurantoin), 트리메토프림 (trimethoprim) (및 이의 조합), 포스포마이신 (fosfomycin), 폴리믹신, 클로람페니콜, 아즈트레오남 (azthreonam) 또는 타이제사이클린과 같은 세 가지 이상의 항생제에 대한 내성을 입증하는 균주로 특히 이해된다.
최근 항생제 내성 균주가 출현함에 따라 이러한 성질의 균혈증을 치료하는 것은 상당히 어려워졌다. 클렙시엘라 뉴모니애 질병을 앓고있는 환자는 클렙시엘라 뉴모니애 질병이 없는 환자보다 병원 및 ICU 체류가 길고 사망률이 높으며 건강 관리 비용이 더 크다. 환자가 클렙시엘라 뉴모니애에 의해 심한 군집화가 되었을 때, 클렙시엘라 뉴모니애 질병을 치료하기 보다 예방하는 것이 환자의 치료가 개선되고 병원 감염이 감소될 수 있다.
클렙시엘라 뉴모니애 질병은 특히 클렙시엘라 뉴모니애 감염으로 인한 질병으로 이해된다. 그러한 질병은 국소 및 전신 질환을 포함한다. 심각한 질병의 경우는 예컨대 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염이다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합체"는 "유전자 조작에 의해 준비되거나 유전 공학의 결과"를 의미한다. 재조합 숙주는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 특이적으로 포함하거나, 재조합 핵산 서열을 포함하도록, 특히 숙주에 대해 다른 뉴클레오티드 서열을 사용하도록 유전적으로 조작된다. 재조합 단백질은 숙주에서 각각의 재조합 핵산을 발현시킴으로써 생산된다. 본 명세서에 사용된 용어 "재조합 항체"는 (a) 인간 면역 글로불린에 대해 트랜스제닉 (transgenic) 또는 트랜스크로모조말 (transchromosomal)인 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다 (b) 트랜스펙토마 (transfectoma)로부터 항체를 발현하도록 형질 전환 된 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 재조합체, 조합 인간 항체 라이브러리 또는 항체의 항원-결합 서열 라이브러리로부터 단리된 항체 (d) 인간 면역 글로불린 유전자 서열과 다른 DNA 서열의 스플라이싱을 포함하는 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체. 그러한 재조합 항체는 예를 들어 항체 성숙 동안 발생하는 재배열 및 돌연변이를 포함하도록 조작된 항체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 당업계의 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명되어있다. 예를 들어, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)"참조.
선택적 결합은 당업계에 공지된 재조합 항체 최적화 방법에 의해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역 글로불린 쇄의 가변 영역의 특정 영역은 경쇄 셔플링, 선별 돌연변이 유발, CDR 합병 및 선택된 CDR 및/또는 프레임워크 영역의 직접 돌연변이 유발을 포함하는 하나 이상의 최적화 전략을 겪을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "대상체"는 온혈 동물, 특히 인간 또는 비인간 동물을 지칭한다. 클렙시엘라 뉴모니애는 동물 병원에서 급성장하고있는 중요한 병원균이다. 그것은 광범위한 비 인간 동물 종에 존재한다. 따라서 "대상체"라는 용어는 특히 개, 고양이, 토끼, 말, 소, 돼지 및 가금류를 포함한 동물을 지칭 할 수도 있다. 특히, 본 발명의 의학적 용도 또는 각각의 치료 방법은 클렙시엘라 뉴모니애 감염과 관련된 질병 상태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 적용된다. 대상체는 클렙시엘라 뉴모니애 감염의 위험이 있거나 초기 단계 또는 후기 단계의 질병을 비롯한 질병으로 고통받는 환자 일 수 있다. "환자"란 용어는 예방적 또는 치료적 처리를 받는 사람 및 기타 포유류 개체를 포함한다. 따라서, "치료"라는 용어는 예방적 처리 및 치료적 처리를 모두 의미한다.
대상체는 예를 들어, 클렙시엘라 뉴모니애 질병 상태의 예방 또는 치료를 위해 처리된다. 특히, 감염의 위험이 있거나 그러한 질병 또는 질병 재발을 일으키는 대상체 또는 그러한 감염 및/또는 감염과 관련된 질병을 앓고있는 대상체인 대상체를 처리한다.
구체적으로, "예방 (prophylaxis)"이라는 용어는 발병 기전의 예방 또는 발병 위험을 줄이기위한 예방 조치를 포함하는 예방 조치를 의미합니다.
구체적으로, 치료는 병의 원인 인자인 클렙시엘라 뉴모니애의 병인을 방해함으로써 이루어질 수 있으며,
본 명세서에 사용된 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"은 화합물을 적어도 50% (w/w), 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의, 예를 들어 핵산 분자 또는 항체와 같은 화합물을 포함한다. 순도는 화합물에 적합한 방법 (예를 들어, 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다.
본 명세서에서 사용된 "치료학적 유효량"이란 용어는 본 발명의 항체 또는 화합물의 "유효량"또는 "충분한 양"이라는 용어의 어떠한 것과도 상호 교환 가능하게 사용되는 것으로, 환자에게 투여될 때 임상 결과를 포함하는 효과적이고 유익한 효과를 나타내며, 그로 인해 유효량 또는 동의어는 그것이 적용되는 상황에 의존한다.
유효량은 그러한 질병 또는 장애를 치료, 예방 또는 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. 질환과 관련하여, 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료학적 유효량의 항체는 클렙시엘라 뉴모니애 발병 기전의 억제, 예를 들어, 점액 표면의 부착 및 군집화, 살균된 신체 부위의 조절되지 않는 복제, 및 박테리아 생성물에 의한 숙주 세포의 독성 등으로부터 이익을 얻는 질환 또는 상태를 치료, 조절, 감쇠, 역전 또는 영향을 미치기 위해 구체적으로 사용된다.
상기 유효량에 상응하게 될 화합물의 양은 주어진 인자 또는 화합물, 약학 제제, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 대상의 신원 또는 투여 경로와 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.
치료를 필요로 하는 인간 환자에게 제공되는 것과 같은 본 명세서에 기재된 항체의 치료학적 유효량은 구체적으로는 0.5 내지 50 mg/kg, 바람직하게는 5 내지 40 mg/kg, 더욱 바람직하게는 최대 20 mg/kg, 최대 10 mg/kg, 최대 5 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있으나, 예를 들어 급성 질환 조건의 치료를 위해서는 더 많은 용량이 필요할 수 있다. 매우 강력한 항체가 사용된다면 투여 량은 훨씬 더 낮을 수 있다. 이 경우, 유효량은 0.005 내지 5 mg/kg, 바람직하게는 0.05 내지 1 mg/kg의 범위일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체의 치료적 유효량을 갖는 대상의 치료 또는 예방 체제는 단일 투여로 구성되거나, 또는 일련의 적용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 적어도 일년, 적어도 일 년 반 또는 적어도 한 달에 한번 투여될 수 있다. 그러나, 다른 실시 양태에서, 상기 항체는 주어진 치료를 위해 일주일에 약 1회 내지 약 1일 투여될 수 있다. 치료 기간의 길이는 질병의 중증도, 급성 또는 만성 질환, 환자의 연령, 항체 제형의 농도 및 활성과 같은 다양한 요인에 따라 달라집니다. 또한, 치료 또는 예방에 사용되는 유효 투여량은 특정 치료 또는 예방 체제의 과정에서 증가 또는 감소할 수 있음을 이해할 것이다. 투약량의 변화는 당업계에 공지된 표준 진단 분석에 의해 생길 수 있고 명백해질 수 있다. 어떤 경우에는 만성적인 관리가 필요할 수 있다.
O3b, 특히 pan-O3 항체에 매우 특이적인 단클론 항체 (mAb)는 클렙시엘라 뉴모니애의 동정을 위한 진단 시약으로서 큰 가능성을 가지고 있다. 또한, 특히 인간화 후에, 이들 mAb는 클렙시엘라 뉴모니애 감염의 예방 (예를 들어, 고위험군을 위한) 및 예방에 사용하기에 적합하다.
O3 혈청군은 하나의 균일한 구조로 간주되었지만 놀랍게도 반복 단위 내의 만노스 잔기의 수가 다른 세가지 아형을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 구조의 변화는 O3 혈청군에 특이적인 단클론 항체의 반응 패턴에 의해 증명된 항원 차이를 나타낸다. O3 혈청군 내 모든 세가지 다른 혈청형과 교차 반응하는 단클론 항체의 선택은 추정된 제품 개발과 관련이 있다.
만노스 중합을 코딩하는 상응하는 유전자의 유전 분석, 즉 O-항원 서브 유닛의 합성은 관찰된 구조적 변화를 정당화하는 차이를 나타냈다. 유전적 및 표현형의 차이에 기초하여 우리는 새롭게 기술된 혈청형을 O3 혈청형으로 알려진 "고전적" 펜타-만노스 구조와 구별하기 위해 O3a 및 O3b라고 명명할 것을 제안한다 (도 1 - (3)에 공개됨).
150개 이상의 임상 분리물의 수집물을 스크리닝하면, 새로 기술된 O3b 혈청형이 다른 만난형 (즉, O3, O3a 및 O5)보다 더 많은 단리물로 함께 발현된다는 것을 알 수 있다.
O-항원 반복 단위의 구조적 다양성은 본 명세서에서 LPS 분리 패턴에 기초한 O3 혈청군 클렙시엘라 뉴모니애 균주 중에서 제안된다. O3 측쇄를 암호화하는 rfb 오페론 내의 유전적 이질성은 제안된 구조적 차이를 확증했다. 이들 변이체 중 하나에 특이적이거나 O3 혈청군 내 3 가지 유형 모두와 교차-반응하는 mAb를 선택하였다.
생화학적 구조 분석의 예비 데이터는 펜타-만노스 반복 단위 구조가 테트라 및 트리-사카라이드 반복 단위로 대체됨으로써 뚜렷한 항원 구조를 나타냄을 암시한다. 여기서는 혈청형 O3a 및 O3b로 지칭된다.
클렙시엘라 O3a 서브유닛은 대장균 O9a와 동일하지만 O3b 항원은 새로운 구조를 나타내므로 O3b와 O3b, O3a 및 O3b 사이에 교차 반응하는 항체는 예를 들어, 면역 요법 및/또는 면역 진단법에 대한 가치있는 수단이다. O3 교차-반응 (pan-O3 반응성) 단클론 항체는 모든 클렙시엘라 균주의 거의 1/4 (23.2 %)에 특이적이므로 진단 및/또는 치료제 후보 물질과 같은 단클론 항체의 개발이 정당화될 수 있다.
일단 원하는 결합 특성을 갖는 항체가 확인되면, 항체 단편을 포함하는 그러한 항체는 예를 들어 하이브리도마 기술 또는 재조합 DNA 기술을 포함하여 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
재조합 단클론 항체는, 예를 들어, 공지된 재조합 발현 벡터, 예를 들어, 본 발명의 플라스미드 또는 항체 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 사용하여, 필요한 항체 사슬을 코딩하는 DNA를 단리하고 재조합 숙주 세포를 발현용 코딩 서열로 형질 감염시킴으로써 제조될 수 있다. 재조합 숙주 세포는 전술한 바와 같은 원핵 세포 및 진핵 세포일 수 있다.
특정 양태에 따르면, 뉴클레오티드 서열은 항체를 인간화하거나 항체의 친화도 또는 다른 특성을 개선시키기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체가 인간의 임상 시험 및 치료에 사용된다면, 불변 영역은 인간의 불변 영역과 유사하게 조작되어 면역 반응을 피할 수 있다. O3b 표적에 대한보다 큰 친화성 및 클렙시엘라 뉴모니애에 대한 보다 큰 효능을 얻기 위해 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항체에 만들어질 수 있고 여전히 표적 O3b 항원에 대한 그의 결합 능력을 유지한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
다양한 수단에 의한 항체 분자의 생산은 일반적으로 잘 알려져있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6331415 호 (Cabilly 등)는 중쇄 및 경쇄가 단일 세포 또는 단일 세포에서 두 개의 분리된 벡터로부터 동시에 발현되는 항체의 재조합 생산 방법을 기술한다. Wibbenmeyer 등 (1999, Biochim Biophys Acta 1430 (2): 191-202) 및 Lee와 Kwak (2003, J. Biotechnology 101: 189-198)은 별도로 생산된 중쇄 및 경쇄의 단클론 항체 생산을 기술하고 있으며, 숙주 세포의 분리된 배양물에서 발현된 플라스미드를 사용하였다. 항체 생산에 관련된 다양한 다른 기술은 예를 들어 Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)에 제공되어있다.
원한다면, 본 발명의 항체, 예를 들어, 2F8-G6 항체 또는 이의 기능적 변이체를 서열화할 수 있고, 이어서 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현 또는 증식용 벡터로 클로닝할 수 있다. 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포에서 벡터로 유지될 수 있으며, 숙주 세포는 이후의 사용을 위해 팽창 및 동결될 수 있다. 세포 배양에서의 재조합 단클론 항체의 생산은 당업계에 공지된 수단에 의해 B-세포로부터의 항체 유전자의 클로닝을 통해 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체의 생산을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
핵산을 코딩하는 항체는 임의의 적합한 특성을 가질 수 있고 임의의 적합한 특징 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 핵산을 코딩하는 항체는 DNA, RNA 또는 그의 하이브리드의 형태일 수 있고, 핵의 안정성을 증진시키는 변형된 골격, 예를 들어, 상기 핵산, 또는 둘 모두의 안전성을 촉진시키는 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 골격을 포함할 수 있다. 핵산은 유리하게는 표적 숙주 세포 (들)에서 원하는 발현, 복제 및/또는 선별을 촉진하는 특징을 포함하는 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 플라스미드에 혼입될 수 있다. 이러한 특징의 예로는 다수의 적합한 예가 공지되어있는 복제 기원 성분, 선택적 유전자 성분, 프로모터 성분, 인핸서 요소 성분, 폴리아데닐화 (polyadenylation) 서열 성분, 종결 성분 등 다수의 적합한 예가 알려져 있다.
본 명세서는 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 구조물을 제공한다. 이러한 재조합 구조물은 임의의 개시된 항체를 코딩하는 DNA 분자가 삽입된 플라스미드, 파지 미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터와 관련하여 사용된다.
단클론 항체는 재조합 진핵 세포 (포유류 또는 곤충) 또는 원핵 생물 (세균) 숙주 세포를 배양하는 것과 같은 배양에서 세포주에 의해 항체 분자를 생산하는 임의의 방법을 사용하여 생산된다. 단클론 항체를 예비-패킹하기위한 적합한 방법의 예는 Kohler 등의 하이브리도마 방법 (1975, Nature 256: 495-497) 및 인간 B- 세포 하이 브리 도마 방법 (Kozbor, 1984, J. Immunol.133: 3001 및 Brodeur 등, 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63)을 포함한다.
본 발명의 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 동정되거나 얻어질 수 있다. 이러한 방법에서, 마우스 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 면역화하여, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로 림프구를 생체 외에서 면역화할 수 있다. 그런 다음 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합 제제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 만든다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대한 단클론 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역 침강법 또는 방사 면역 측정법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)과 같은 시험관 내 결합 분석에 의해 결정된다.
이어서, O3b-항원의 특이적 결합 및 임의로 다른 O3- 또는 O-항원과 관련하여 O3b-항원에 우선적으로 결합하기 위한 이의 차별적인 결합 친화력에 대한 추가 시험 및 항체의 조작 등의 항체 하이브리도마 상등액으로부터 mAb를 정제할 수 있고, 다른 진단 또는 치료 목적을 위해 항체를 조작할 수 있다.
O3b-특이적 항체는 경우에 따라 단일 O3b-항원에 대한 스크리닝을 통해 출현한다. 차별적으로 결합하는 클론을 분리할 가능성을 높이려면 여러 항원에 대해 순차적으로 스크리닝하여 다중 선택 압력을 가할 수 있다. 특별한 mAb 선택 전략은 O3b 및 O3a 또는 O3 성분 또는 다른 클렙시엘라 뉴모니애 항원을 번갈아 사용한다.
원하는 선택적 결합 특성을 갖는 항체를 동정하기 위한 스크리닝 방법은 항체 서열 또는 이의 항원-결합 서열 (예를 들어, 파지, 박테리아, 효모 또는 포유 동물 세포를 사용; 또는 핵산 정보를 각 (폴리) 펩티드로 번역하는 시험관 내 디스플레이 시스템을 사용하는 디스플레이 기술). 반응성은 ELISA, 웨스턴 블롯팅 (Western blotting) 또는 유동 세포 계측법 (flow cytometry)에 의한 표면 염색법 (standard staining)을 이용하여 평가할 수 있다.
단리된 항원은 항체 라이브러리, 예컨대 효모-표시 항체 라이브러리로부터 항체를 선택하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 특이적으로 O3b-항원에 결합하는 항체를 동정하는 공정에 의해 수득되는 O3b 특이적 항체를 특이적으로 제공한다. 따라서, O3b 표적과의 반응성을 나타내는 항체를 포함하는 항체 라이브러리가 표적과의 반응성을 위해 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 약학 조성물은 본 발명에 따라 볼루스 주사 또는 주입 또는 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 이러한 투여 방법을 용이하게하기에 적합한 약학적 담체는 당업계에 잘 알려져있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 관련 조성물 또는 조합물과 생리적으로 상용성인 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 다른 예는 멸균수, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들 중 임의의 조합을 포함한다.
하나의 이러한 양태에서, 항체는 원하는 투여 경로에 적합한 하나 이상의 담체와 결합될 수 있고, 항체는 임의의 락토오스, 수크로스, 전분, 알칸산의 셀룰로오스 에스테르, 스테아린산, 탈크, 스테아르산 마그네슘, 산화 마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 아카시아, 젤라틴, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리딘, 폴리비닐 알콜 및 임의의 추가 투여 용으로 정제 또는 캡슐화될 수 있다. 선택적으로, 항체는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로스 콜로이드 용액, 에탄올, 옥수수 기름, 땅콩 기름, 면화유, 참기름, 트라가칸스 (tragacanth) 검 및/또는 다양한 완충액에 용해될 수 있다. 다른 담체, 보조제 및 투여 방식은 제약 분야에서 잘 알려져 있다. 담체는 단독으로 또는 왁스로 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 제어 방출 물질 또는 시간 지연 물질, 또는 당 업계에 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다.
추가의 약학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, REMINGTON 'S PHARMACEUTICAL SCIENCES에 기술되어있다. 액체 제제는 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있으며 현탁제, 용해제, 계면 활성제, 방부제 및 킬레이트 제와 같은 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 하나 이상의 치료학적 활성제가 제형화되는 약학 조성물이 고려된다. 본 발명의 항체의 안정한 제제는 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태로 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정 화제와 원하는 정도의 순도를 갖는 면역 글로불린을 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다. 생체 내 투여에 사용되는 제제는 구체적으로 멸균되어 있고, 바람직하게는 멸균 수용액의 형태이다. 이는 멸균 여과막 또는 다른 방법을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 본 명세서에 개시된 항체 및 기타 치료 활성제는 또한 면역 리포좀으로서 제제화될 수 있고 및/또는 마이크로 캡슐에 포획될 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 약학 조성물의 투여는 경구, 피하, 정맥 내, 비강 내, 국소, 경피, 점막, 국소 투여를 사용할 수 있으며, 예를 들어 겔, 고약, 로션, 크림 등 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 복강 내, 근육 내, 폐내 예를 들어, 흡입 기술 또는 폐 전달 시스템을 사용하여, 질내, 비경구적으로, 직장 내 또는 인공적으로 투여될 수있다.
비경구 투여에 사용되는 예시적인 제형은 예를 들어 멸균 용액, 에멀젼 또는 현탁액과 같은 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사에 적합한 것들을 포함한다.
한 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 질환을 변형 시키거나 예방하는 단일 요법으로서 환자에게 투여되는 유일한 치료 활성 약제이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 혼합물에서 추가 항체, 예를 들어, 혼합물 또는 키트의 부분으로 조합하여 클렙시엘라 뉴모니애를 표적으로 하여 병용 요법의 변형 또는 예방하는 질환으로서 혼합물이 환자에게 투여된 하나 이상의 치료 활성 약제를 함유하도록 한다.
또한, 본 발명의 항체는 항생제, 염증의 스테로이드 및 비 스테로이드 억제제 및/또는 다른 항체 기반 요법을 포함하는 하나 이상의 다른 치료제 또는 예방제와 조합하여 투여될 수 있다 예를 들어, 항균 또는 항염증제를 사용한다.
병용 요법은 특히 클렙시엘라 뉴모니애에 의한 감염 치료에 사용되는 표준 요법을 사용한다. 이것은 비-베타 락탐 억제제가 있거나 없는 항생제, 예를 들어 티그 시트린, 콜리스틴, 폴리믹신 B 및 베타 락탐을 포함할 수 있다.
병용 요법에서, 항체는 혼합물로서 또는 하나 이상의 다른 치료 요법과 병행하여, 예를 들어, 동시 요법 전, 동시 또는 동시 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 각각의 약학적 제제의 생물학적 특성은 세포, 조직 및 전체 유기체 실험에서 생체 외에서 특성화될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 질병 또는 질병 모델에 대한 치료를 위한 약물의 효능을 측정하기 위해, 또는 약물의 약동학 (pharmacokinetics), 약력학 (pharmacodynamics), 독성 및 기타 특성을 측정하기 위해, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 동물의 생체 내에서 약물을 종종 시험한다. 동물은 질병 모델이라고 할 수 있다. 치료법은 종종 누드 마우스, SCID 마우스, 이종 이식 마우스 및 트랜스 제닉 마우스 (knockins 및 knockouts 포함)를 포함하되 이에 제한되지 않는 마우스에서 테스트한다. 그러한 실험은 능동적 또는 수동적 면역 요법에서 적절한 반감기, 작동자 기능, (교차-) 중화 활성 및/또는 면역 반응을 갖는 치료제 또는 예방제로서 사용되는 항체의 잠재력을 결정하기위한 의미있는 데이터를 제공할 수 있다. 어떤 유기체, 포유 동물도 테스트에 사용할 수 있다. 예를 들어 인간과의 유전적 유사성 때문에 영장류, 원숭이는 적절한 치료 모델이 될 수 있으며 따라서 본 약제 또는 조성물의 효능, 독성, 약동학, 약력학, 반감기 또는 기타 특성을 시험하는데 사용될 수 있다. 인간에 대한 시험은 궁극적으로 의약품으로서의 승인을 위해 요구되며 따라서 당연히 이 실험들이 고려된다. 따라서, 본 발명의 항체 및 각각의 약학적 조성물은 인간의 치료 또는 예방 효능, 독성, 면역 원성, 약동학 및/또는 다른 임상적 특성을 결정하기 위해 시험될 수 있다.
2F8-G6로 명명된 항체, 구체적으로 항체 경쇄 및/또는 중쇄는 본 명세서에 기재된 수탁번호 하에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b / Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE)에 기탁된 생물학적 물질에 의해 특징지어진다.
DSM 32059는 2F8-G6 VH의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드로 형질 전환된 대장균 숙주 세포이다: 대장균 2F8-G6 VH = DSM 32059, 기탁일: 2015년 6월 4일; 기탁자: Arsanis Biosciences GmbH, 오스트리아 비엔나.
DSM 32060은 2F8-G6 VL: 대장균 2F8-G6 VL = DSM 32060의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드로 형질 전환된 대장균 숙주 세포이다; 기탁일 : 2015 년 6월 4일; 기탁자 : Arsanis Biosciences GmbH, 오스트리아 비엔나.
하기 정의의 주제는 본 발명의 실시 양태로 고려된다 :
1. 하나 이상의 O3b-항원 만노스 호모폴리머 반복 단위를 포함하고, 화학식 1의 구조를 포함하는 O3b-항원에 혼입된 O3b-에피토프인, 클렙시엘라 뉴모니애의 리포폴리사카라이드 (LPS) O3b-항원 구조의 에피토프를 특이적으로 인식하며, 상기 화학식 1은:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n
이고, 상기 MeP는 메틸 포스페이트 (methyl phosphate)이며, n은 0 내지 50인 것인, 단리된 항체.
2. 정의 1에 있어서, O3a-에피토프 및/또는 O3-에피토프와 교차-반응하는 항체이며,
a) O3a-에피토프는 하나 이상의 O3a-항원 만노스 호모폴리머 반복 단위를 포함하고, 화학식 2의 구조를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3a-항원에 혼입되며, 상기 화학식 2는:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
이고, 상기 m은 0 내지 50이며;
및
b) O3-에피토프는 하나 이상의 O3-항원 만노스 호모폴리머 반복 단위를 포함하고, 화학식 3의 구조를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3-항원에 혼입되며, 상기 화학식 3은:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
이고, 상기 m은 0 내지 50인 것인, 항체.
3. 정의 2에 있어서, pan-O3 특이적 항체로서, O3b-에피토프에 특이적으로 결합하고 O3a-에피토프 및 O3-에피토프와 교차-반응하는 것인, 항체.
4. 정의 3에 있어서, 2F8-G6 항체 또는 이의 특이적인 에피토프와 경쟁적으로 결합하는 항체이며, 상기 2F8-G6 항체는
a) 기탁된 물질 DSM 32059에 혼입된 VH; 및
b) 기탁된 물질 DSM 32060에 혼입된 경량 VL인 것인, 항체.
5. 정의 3에 있어서, 4D3-A4 항체 또는 이의 특이적인 에피토프와 경쟁적으로 결합하는 항체이며, 상기 4D3-A4 항체는
a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 의해 각각 식별되는 CDR1, 2, 3, 4, 5 및 6인 6개의 CDR 서열을 포함하고, 상기 넘버링 (numbering)은 Kabat에 따르며; 또는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 의해 각각 식별되는 CDR1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하고, 상기 넘버링은 IMGT에 따르며; 및/또는
b) 서열번호 15로 식별되는 VH 서열 및 서열번호 16으로 식별되는 VL 서열 인 VH 및 VL 서열; 및/또는
c) 서열번호 13으로 식별되는 HC 서열 및 서열번호 14로 식별되는 LC 서열 인 HC 및 LC 서열;
중 어느 하나를 특징으로 하는 것인, 항체.
6. 정의 1에 있어서, O3a-에피토프와 관련하여 O3b-에피토프에 우선적으로 결합하거나, O3a-에피토프와 교차-반응하지 않고, 상기 O3a-에피토프는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3a-항원 구조의 O3a-항원 반복 단위에 혼입되며, 상기 O3a-항원 반복 단위는 화학식 2의 만노스 호모폴리머인 것인, 항체.
7. 정의 1에 있어서, O3-에피토프와 관련하여 O3b-에피토프에 우선적으로 결합하거나, O3-에피토프와 교차-반응하지 않고, 상기 O3-에피토프는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3-항원 구조의 O3-항원 반복 단위에 혼입되며, 상기 O3-항원 반복 단위는 화학식 3의 만노스 호모폴리머인 것인, 항체.
8. 정의 6 또는 7에 있어서, O3a-에피토프 및 O3-에피토프 중 어느 것과도 교차-반응하지 않는 것인, 항체.
9. 정의 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 클렙시엘라 뉴모니애의 비-O3 LPS 분자의 에피토프와 교차-반응하지 않는 것인, 항체.
10. 정의 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 10-7M 미만, 바람직하게는 10-8M 미만, 더욱 더 바람직하게는 10-9M 미만의 Kd로 O3b-에피토프에 결합하는 친화도를 갖는 것인, 항체.
11. 정의 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, O3b LPS 분자를 발현하는 클렙시엘라 뉴모니애 균주의 내독소를 중화하는 것인, 항체.
12. 정의 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 전장 단클론 항체, 상기 결합 부위를 혼입하는 적어도 하나의 항체 도메인 (domain)을 혼입하는 이의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 혼입하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질이며, 구체적으로 상기 항체는 무작위화 또는 인공 아미노산 서열을 포함하는 비-천연 발생 항체인 것인, 항체.
13. 정의 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 인간, 인간화, 키메라 또는 마우스 기원인 것인, 항체.
14. 정의 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 단클론 항체인 것인, 항체.
15. 정의 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 감염을 제한하거나 상기 감염의 결과인 질병 상태를 개선시키기 위한 유효량의 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화의 위험이 있거나 그로 인해 고통 받고있는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 용도이며, 바람직하게는 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염 중 어느 하나의 치료 또는 예방을 위한 용도인 것인, 항체.
16. 정의 1 내지 14 중 어느 하나의 항체를 포함하고, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 선택적으로 포함하는 비경구 또는 점막 제제를 포함하는 것인, 약학적 제제.
17. 대상체에서의 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화의 진단, 또는 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염과 같은 관련된 질병의 진단을 위한, 정의 1 내지 14 중 어느 하나의 항체의 용도.
18. 정의 17에 있어서, 상기 대상체는 면역 저하된 (immunocompromised) 또는 면역 억제된 (immunosuppressed) 환자 또는 이의 접촉자 (contact)인 것인, 용도.
19. 하기 성분을 포함하는 조성물 또는 부분들의 키트속에 항체 및 추가의 진단 시약을 포함하는 것인, 정의 1 내지 14 중 어느 하나의 항체의 진단 제제:
a) 정의 1 내지 14 중 어느 하나의 항체; 및
b) 추가의 진단 시약;
c) 및 선택적으로 항체 및 진단 시약 중 적어도 하나를 고정시키는 고체 상.
20. 정의 19 있어서, 상기 추가의 진단 시약은 진단 표지 또는 그의 항원에 결합하는 항체의 반응 산물 및/또는 항체와 특이적으로 반응하는 시약인 것인, 진단 제제.
21. 클렙시엘라 뉴모니애 균주에 의해 야기된 대상체에서 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화를 진단하는 방법으로서,
a) 정의 1 내지 14 중 어느 하나의 항체를 제공하는 단계; 및
b) 항체가 시험할 대상체의 생물학적 시료에서 O3b-에피토프와 특이적으로 면역반응하는지 여부를 검출함으로써, 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화를 진단하는 단계를 포함하는, 방법.
22. 정의 21에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체액 또는 조직 시료, 바람직하게는 혈액 시료, 대변 시료, 피부 시료, 소변 시료, 뇌척수액 및 내기관 흡입물 (endotracheal aspirates), 흉수 (pleural fluid), 폐 천자 (lung tap), 비강 면봉 또는 객담과 같은 호흡 기관 표본, 또는 상기 시료 중 어느 하나에서 유래한 클렙시엘라 뉴모니애 단리물인 것인, 방법.
23. 정의 1 내지 14 중 어느 하나의 항체를 코딩하는 것인, 단리된 핵산.
25. 정의 1 내지 14 중 어느 하나의 항체의 VH 및/또는 VL을 포함하는 단백질성 작제물 (construct)을 발현하는 코딩 서열을 포함하는 것인, 발현 카세트 또는 플라스미드.
25. 정의 24의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 것인, 숙주 세포.
26. 제25항의 숙주 세포가 항체를 생산하는 조건하에 배양 또는 유지되는 것인, 정의 1 내지 14 중 어느 하나의 항체의 생산 방법.
27. 후보 항체를 동정하는 방법으로서,
a) 항체 또는 항체-생산 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계; 및
b) 정의 1에 정의된 바와 같은 O3b-에피토프와 함께 또는 그 시료에 의해 생성된 항체의 결합에 대해 평가하는 단계를 포함하며, 상기 항체와 에피토프 사이의 양성 반응으로 항체를 후보 항체로서 동정하는 것인, 방법.
28. 후보 항체를 동정하는 방법으로서,
a) 항체 또는 항체-생산 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계; 및
b) 정의 1에 정의된 바와 같은 O3b-에피토프와 함께 또는 그 시료에 의해 생성된 항체의 결합에 대해 평가하는 단계를 포함하며, 정의 2에 정의된 바와 같은 O3a-에피토프 및/또는 O3-에피토프와 관련하여, 또는 클렙시엘라 뉴모니애의 어떠한 비-O3 LPS 분자와 관련하여 항체와 O3b-에피토프 사이의 특이적 양성 반응으로 항체를 후보 항체로서 동정하는 것인, 방법.
29. 정의 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 항체의 제조 방법으로서,
a) 정의 27 또는 28에 따라 확인된 후보 항체를 제공하는 단계; 및
b) 후보 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 단클론 항체, 또는 인간화 또는 인간 형태의 후보 항체, 또는 그의 유도체를 생산하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않고 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1. O3 혈청군의 클렙시엘라 뉴모니애 균주 중 다른 O-항원 반복 단위 크기의 동정
LPS는 상이한 O3 균주 (IITD PAN Wroclaw, Polish Collection of Microorganisms의 PCM-11 O3: K11, Kp14, Kp62, Kp18 및 Kp35는 관련없는 혈청 형뿐만 아니라 임상 수집물에서 추출한 것이다)로부터 상업용 LPS 정제 키트 (Intron)로 정제 하였다. ~1μg LPS를 SDS-PAGE로 분리하고 ProQ® Emerald 300 리포폴리사카라이드 염색 키트 (LifeTechnologies)로 염색하였다.
임상 시료 및 상업 수집물로부터 유래된 균주로부터 수득한 LPS를 분리하고 염색하였다. 흥미롭게도 도 2에서 보듯이 LPS 패턴은 상당한 변동성을 보였다. O-항원의 모달 길이 (즉, O-항원 서브 유닛의 평균 개수)뿐만 아니라 "래더-단계"의 분리에서도 다른 세 가지 유형이 구별될 수 있다. 이 전형적인 래더 형 구조에서 개별 "래더 단계"가 하나의 단일 O-항원 반복 단위 차이를 나타내는 것을 감안할 때 래더 단계 사이의 거리는 반복 단위의 크기에 특징적이다. 명백하게, O3 혈청군 내의 3 개의 별개의 LPS 분자는 그들의 반복 단위의 상이한 크기를 나타낸다: 레인 2 및 3 > 레인 1 > 레인 4 및 5. 이를 바탕으로 우리는 O-항원 반복 단위 내의 만노스 분자의 수가 다른 O3 혈청군의 3가지 변이가 존재한다고 제안했다.
실시예 2. 모든 O3 혈청형과 교차-반응하는 단클론 항체의 동정
Balb/c 마우스를 2주 간격으로 3회 107 CFU 살아있는 클렙시엘라 뉴모니애 원형 균주 PCM-11 (O3:K11, IITD PAN Wroclaw, Polish Collection of Microorganisms)로 정맥 내 면역화시켰다. 마우스 하이브리도마를 표준 절차에 의해 생성하고, 면역화 균주 유래의 정제된 O-다당류에 특이적인 쥐 mAb를 분비하는 클론을 선택하였다.
상기한 바와 같이 분리된 LPS 샘플을 면역 블롯팅을 위해 PVDF 막으로 옮겼다. 멤브레인을 1μg/ml의 마우스 mAb 및 2차 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG와 반응시켰다. 블롯은 ECL 시약으로 개발되었다.
PCM-11 (도 3에서 레인 4)로 면역화된 마우스로부터 선택된 O3 특이적 단클론 항체는 상이한 반응성 패턴을 나타내었다. 1G6-B8이 나타내는 일부 mAb (도 3B)는 대부분 면역형 균주와 반응하지만, 다른 염색 패턴을 보이는 다른 O3 균주에서는 훨씬 적다 (도 2 및 3A). 대조적으로, 2F8-G6으로 대표되는 다른 mAb는 모든 O3 변이체와 동등하게 반응하였다 (도 3C). 이들 단클론 항체는 O1, O2 및 O5와 같은 비-O3LPS 분자를 전혀 염색하지 않았다 (각각 레인 1, 2 및 3).
이러한 결과는 혐오 분리 패턴에 의해 암시된 다른 유형이 정말로 항원 상으로 다른 구조를 나타냄을 확인한다. 반면에, 다른 유형은 pan-O3 교차 반응성 단클론 항체의 선택에 의해 뒷받침되는 일반적인 에피토프를 공유한다.
실시예 3. 새로운 클렙시엘라 뉴모니애 O 항원의 구조적 특성
클렙시엘라 뉴모니애 O3b 균주 Kp81 (임상 분리물)을 10L 발효조 (37℃, 12시간, 200rpm의 교반, 5L/분의 가스 흐름)에서 LB 배지에서 배양하고 1% 페놀로 2시간 동안 60℃에서 처리하고, 원심 분리하고, 세척하고, 물에 재현 탁시키고 동결-건조시켰다. 클렙시엘라 뉴모니애 Kp81의 LPS를 뜨거운 페놀/물 방법으로 분리하고 투석 및 초원심분리로 정제하였다 (9). 글래스 울 필터 (glass wool filter)를 통한 여과가 투석과 초원심분리 사이의 추가 단계로 추가되었다. O-특이적 다당류 (O-PS)와 다른 올리고당 성분은 온화한 산성 가수 분해 (1.5% CH3COOH, 20분, 100℃)에 의해 방출되었다. 수용성 폴리- 및 올리고당을 초원심분리 (6시간, 105000×g, 4℃)하여 캡슐 항원 (K 항원, CPS) 잔류물을 제거하였다. Bio-Gel P-10 (-400 메쉬) (Biorad, USA) 또는 HW-40F (Tosoh Bioscience LLC, USA)에서 겔 여과하고 분획화하여 분획 1a, 1b, 1c, 2, 3 및 4를 수득하였다. 모든 분획을 NMR 분광법 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광법 (MS)으로 분석하여 분획 1a-c에서 O-PS의 존재를 나타내었다 (도 4). 이들 분획은 프라이머 어댑터 서열에 연결된 상이한 수의 O-PS 반복 단위 (RU) 및 하기 일반 구조를 갖는 외부 코어 올리고당의 공통 부분을 함유하였다: Kdo-GlcNAc-Man-[RU]n.
분획 1a에 대하여 당 및 메틸화 분석, 1H 및 13C NMR 분광법 및 MALDI-TOF MS를 사용하여 LPS O-PS의 반복 단위 (RU)의 구조를 결정하였다. 당 및 메틸화 분석 결과를 종합해 볼 때, 3개 치환 잔류물인 2- 및 3- 치환된 만노피라노스 (Manp)의 존재가 확인되었다. O-PS Kp81 1H와 13C 공명 (도 7)의 완전한 할당은 HSQC-DEPT, HMBC 및 HSQC-TOCSY 실험뿐만 아니라 COSY, TOCSY 및 NOESY의 해석에 의해 달성되었다. 1H, 13C HSQC-DEPT 스펙트럼은 3개의 주요 아노머성 양성자 및 탄소 (잔기 A, B, C) 및 부회전 시스템 (잔기 A', B', C')에 대한 시그널을 포함하고 있다 (도 7, 표 1). 또한 인산기 (P)로의 치환을 나타내는 11.0 Hz의 JP,H를 갖는 이중항 (doublet)으로서 메틸기 (δH 3.61, 3.63, δC 53.7 ppm)의 두 개의 날카로운 양성자 신호의 존재를 토대로 메틸렌 포스페이트 (methyl Phosphate)가 확인되었다. 인접한 당 잔류물들 사이의 잔류물 연결성은 NOESY 및 HMBC 실험에 의해 관찰되었다 (도 7). 신호의 주요 세트는 Kp81 O-PS 생물학적 RU의 삼당 구조에 기인한다: [→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n ([→3)-C-(1→2)-A-(1→3)-B-(1→]n) (도 4, 삽입 구조). 1H, 31P HMBC 스펙트럼은 잔기 C'(α-D-Manp3PMe)의 H-3에 대한 MeP 인산염 그룹의 상관 관계를 보여주었다. 추가로 31P, 1H HMQC-TOCSY는 MeP에 의한 C'의 치환을 지지하는 잔기 C'의 H-2, H-3, H-4, H-5에 대한 MeP 인산기의 상관 관계를 보여주었다. 또한, 잔기 A' (→2)-α-D-Manp) 및 B' (→3)-α-D-Manp)가 동정되었고 C'와 함께 Kp81 O-PS의 비환원 말단의 구성 요소인 것으로 밝혀졌다. 비환원 말단을 포함하는 Kp81 O-PS의 완전한 구조는 도 1에 제시되어 있으며 다음의 도식 서열을 갖는다: C'-(1→2)-A'-(1→3)-B'-(1[→3)-C-(1→2)-A-(1→3)-B-(1→]n.
MALDI-TOF MS를 이용하여 O-PS Kp81 반복 단위 (Manp의 삼당화물)의 분자량을 확인하였다. 분획 1a, 1b, 1c의 질량 스펙트럼은 상이한 형태의 Kdo-GlcNAc-Man-[RU]n에 기인하는 이온의 클러스터를 보였다. ([M-H]-, 헵토스 및 MeP 치환을 포함하는 탈수된 형태). 이들 이온들 사이의 평균 단일 동위 원소 질량 차이는 486.49 Da 였고, NMR 결과에 기초하여 계산된 질량 - 486.42 Da와 일치하였다. 또한 분획 1b (도 5)의 질량 스펙트럼은 MeP-[Man]n으로 제조된 O-PS 단편에 기인하는 [M-H2O-H]- 이온 (예를 들어 m/z 1227.39, 1389.45, 1551.52, 1713.58, 1875.66, 2037.73, 2199.79, 2361.85, 2523.90)을 함유하였다. 162 Da의 이온 간의 질량 차이는 사람 잔류물에 기인한 것이다. 예를 들어, m/z 1713.58에서의 이온은 MeP-[Man]10 중합체에 기인한 것이다. 이러한 단편은 천연 O-PS의 MALDI in-source 단편화로 인한 결과이며 O-PS 당 하나의 MeP 그룹의 존재를 나타낸다.
실시예 4. LPS-O3 교차 반응성 단클론 항체에 의한 표면 결합
살아있는 클렙시엘라 균주에서 상이한 만난 특이성 (그림 6)의 단클론 항체에 의한 표면 염색을 유세포 분석으로 조사하였다. 세척된 세균 (106 CFU)를 O3 특이적 mAb (40 μg / ml)로 반응시킨 후, 2μg/ml Alexa Fluor® 488-결합 염소 항-인간 IgG 2차 항체 (Life Technologies) 및 5μM SYTO-62 핵산 염색 (Life Technologies)으로 염색하였다. 시료를 BD AccuriTM C6 유동 세포 계측기 (BD Biosciences)에서 정량하고 데이터를 FCS Express 소프트웨어 버전 4 (De Novo Software)를 사용하여 분석하였다.
교차-반응성 단클론 항체 2F8-G6는 표현된 O-항원의 만난 구조에 관계없이 조사한 모든 O3 클렙시엘라 균주의 표면에 강하게 결합했다. 대조적으로, 비교 가능한 단클론 항체 1G6-B8은 O3a 면역화 균주 (PCM-11)만을 강력하게 염색하였다. 그것은 O3를 발현하는 균주 Kp14의 표면에 약하게 결합하고, O3b 항원를 발현하는 Kp82 균주는 전혀 응집시키지 않는다.
따라서, 유동 세포 계측법 분석은 만난 특이적 mAb에 의한 상응하는 살아있는 클렙시엘라 균주의 표면 염색이 항원 특이성에 의해 독점적으로 결정되며 다양한 평활 LPS 분자에 의해 제한되지 않는다는 것을 확인했다. 결과적으로, 넓은 특이성을 갖는 항체는 잠재적인 항균제로서 추가 개발을 위한 유망한 후보자이다.
실시예 5. O3 형 LPS 분자의 내독소 활성의 교차-중화
클렙시엘라 뉴모니애 O3 균주는 정상적인 사람 혈청의 살균 효과에 민감하기 때문에 (도 8), 치료용 mAb에 대한 임상적으로 적절한 작용 기전은 그러한 단클론 항체의 항 염증 가능성이다. 용해된 세균으로부터 방출된 내독소 (즉, LPS 분자의 지질 A 부분)는 그의 고유 수용체 복합체 TLR-4/CD14/MD2를 통한 신호 전달을 통해 강한 염증 반응을 유발한다. 상이한 클렙시엘라 뉴모니애 O3 형 LPS 분자에 의해 유도된 신호 전달에 대한 단클론 항체 4D3-A4의 영향을 세포 기반 시험관 시스템 (HEK Blue, InvivoGen)에서 조사하였다. 세포에 의해 표현되는 인간 TLR-4 복합체를 통한 시그널링은 비색 신호로 변환된다. 도 9는 단클론 항체 4D3-A4가 시그널링을 억제할 수 있음을 나타내며, 즉 추출되고 정제된 LPS 분자의 내독성 효과를 중화시킬 수 있음을 나타낸다. 중요한 것은, 용량 의존성 중화가 상이한 O3 아형 (subtype)에서 관찰되었으며, 즉 O3 교차-반응성 단클론 항체는 O3a (IITD PAN Wroclaw로부터의 균주 PCM-11, Polish Collection of Microorganisms 도 9A) 또는 O3b (임상 수집물 유래 균주 Kp81 임상 단리물; 도 9B)에서 추출한 LPS에 대해 상대적으로 강력했다.
참조
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Claims (28)
- 하나 이상의 O3b-항원 만노스 호모폴리머 (homopolymer) 반복 단위를 포함하고, 화학식 1의 구조를 포함하는 O3b-항원에 혼입된 O3b-에피토프인, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)의 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; LPS) O3b-항원 구조의 에피토프를 특이적으로 인식하며, 상기 화학식 1은:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n
이고, 상기 MeP는 메틸 포스페이트 (methyl phosphate)이며, n은 0 내지 50인 것인, 단리된 항체.
- 제1항에 있어서, O3a-에피토프 및/또는 O3-에피토프와 교차-반응하는 항체이며,
a) O3a-에피토프는 하나 이상의 O3a-항원 만노즈 호모폴리머 반복 단위를 포함하고, 화학식 2의 구조를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3a-항원에 혼입되며, 상기 화학식 2는:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
이고, 상기 m은 0 내지 50이며;
및
b) O3-에피토프는 하나 이상의 O3-항원 만노즈 호모폴리머 반복 단위를 포함하고, 화학식 3의 구조를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3-항원에 혼입되며, 상기 화학식 3은:
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
이고, 상기 m은 0 내지 50인 것인, 항체.
- 제2항에 있어서, pan-O3 특이적 항체로서, O3b-에피토프에 특이적으로 결합하고 O3a-에피토프 및 O3-에피토프와 교차-반응하는 것인, 항체.
- 제3항에 있어서, 2F8-G6 항체 또는 이의 특이적인 에피토프와 경쟁적으로 결합하는 항체이며, 상기 2F8-G6 항체는
a) 기탁된 물질 DSM 32059에 혼입된 VH; 및
b) 기탁된 물질 DSM 32060에 혼입된 경량 VL이며,
상기 기탁된 물질은 2015년 6월 4일 DSMZ에 기탁되는 것을 특징으로 하고;
바람직하게는, 상기 결합의 경쟁은 경쟁 ELISA 분석 또는 포르테 바이오 (ForteBio) 분석에 의해 결정되는 것인, 항체.
- 제3항에 있어서, 4D3-A4 항체 또는 이의 특이적인 에피토프와 경쟁적으로 결합하는 항체이며, 상기 4D3-A4 항체는
a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 의해 각각 식별되는 CDR1, 2, 3, 4, 5 및 6인 6개의 CDR 서열을 포함하고, 상기 넘버링 (numbering)은 Kabat에 따르며; 또는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12에 의해 각각 식별되는 CDR1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하고, 상기 넘버링은 IMGT에 따르며; 및/또는
b) 서열번호 15로 식별되는 VH 서열 및 서열번호 16으로 식별되는 VL 서열 인 VH 및 VL 서열; 및/또는
c) 서열번호 13으로 식별되는 HC 서열 및 서열번호 14로 식별되는 LC 서열 인 HC 및 LC 서열 중 어느 하나를 특징으로 하는 것인, 항체.
- 제1항에 있어서, O3a-에피토프에 비해 O3b-에피토프에 우선적으로 결합하거나, O3a-에피토프와 교차 반응하지 않고, 상기 O3a-에피토프는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3a-항원 구조의 O3a-항원 반복 단위를 혼입하며, 상기 O3a-항원 반복 단위는 화학식 2의 만노스 호모폴리머인 것인, 항체.
- 제1항에 있어서, O3-에피토프와 관련하여 O3b-에피토프에 우선적으로 결합하거나, O3-에피토프와 교차 반응하지 않고, 상기 O3-에피토프는 클렙시엘라 뉴모니애의 LPS O3-항원 구조의 O3-항원 반복 단위를 혼입하며, 상기 O3-항원 반복 단위는 화학식 3의 만노스 호모폴리머인 것인, 항체.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, O3a-에피토프 및 O3-에피토프 중 어느 것과도 교차-반응하지 않는 것인, 항체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 클렙시엘라 뉴모니애의 비-O3 LPS 분자의 에피토프와 교차-반응하지 않는 것인, 항체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 10-7M 미만, 바람직하게는 10-8M 미만, 더욱 더 바람직하게는 10-9M 미만의 Kd로 O3b-에피토프에 결합하는 친화도를 갖는 것인, 항체.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, O3b LPS 분자를 발현하는 클렙시엘라 뉴모니애 균주의 내독소를 중화하는 것인, 항체.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 단클론 항체, 상기 결합 부위를 혼입하는 적어도 하나의 항체 도메인 (domain)을 혼입하는 이의 항체 단편, 또는 상기 결합 부위를 혼입하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질이며, 특히 상기 항체는 무작위화 또는 인공 아미노산 서열을 포함하는 비-천연 발생 항체인 것인, 항체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체이며, 바람직하게는 인간, 인간화, 키메라 또는 마우스 기원인 것인, 항체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 감염을 제한하거나 상기 감염의 결과인 질병 상태를 개선시키기 위한 유효량의 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화의 위험이 있거나 그로 인해 고통 받고있는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 용도이며, 바람직하게는 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염 중 어느 하나의 치료 또는 예방을 위한 용도인 것인, 항체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 선택적으로 포함하는 비경구 또는 점막 제제를 포함하는 것인, 약학적 제제.
- 대상체에서의 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화의 진단, 또는 1차 및 2차 균혈증, 폐렴, 요로 감염, 간 농양, 복막염 또는 수막염과 같은 관련된 질병의 진단을 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
- 제16항에 있어서, 상기 대상체는 면역 저하된 (immunocompromised) 또는 면역 억제된 (immunosuppressed) 환자 또는 이의 접촉자 (contact)인 것인, 용도.
- 하기 성분을 포함하는 조성물 또는, 부분들의 키트 속에 항체 및 추가의 진단 시약을 포함하는 것인, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 진단 제제:
a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체; 및
b) 추가의 진단 시약;
c) 및 선택적으로 항체 및 진단 시약 중 적어도 하나를 고정시키는 고체 상.
- 제18항에 있어서, 상기 추가의 진단 시약은 진단 라벨 또는 그의 항원에 결합하는 항체의 반응 산물 및/또는 항체와 특이적으로 반응하는 시약인 것인, 진단 제제.
- 클렙시엘라 뉴모니애 균주에 의해 야기된 대상체에서 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화를 진단하는 방법으로서,
a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 제공하는 단계; 및
b) 항체가 시험할 대상체의 생물학적 시료에서 O3b-에피토프와 특이적으로 면역반응하는지 여부를 검출함으로써, 클렙시엘라 뉴모니애 감염 또는 군집화를 진단하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체액 또는 조직 시료, 바람직하게는 혈액 시료, 대변 시료, 피부 시료, 소변 시료, 뇌척수액 및 내기관 흡입물 (endotracheal aspirates), 흉수 (pleural fluid), 폐 천자 (lung tap), 비강 면봉 또는 객담과 같은 호흡 기관 표본, 또는 상기 시료 중 어느 하나에서 유래한 클렙시엘라 뉴모니애 단리물인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 것인, 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 VH 및/또는 VL을 포함하는 단백질성 작제물을 발현하는 코딩 서열을 포함하는 것인, 발현 카세트 또는 플라스미드.
- 제23항의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 것인, 숙주 세포.
- 제24항의 숙주 세포가 항체를 생산하는 조건하에 배양 또는 유지되는 것인, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체의 생산 방법.
- 후보 항체를 확인하는 방법으로서,
a) 항체 또는 항체-생산 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계; 및
b) 제1항에 정의된 바와 같은 O3b-에피토프와 함께 또는 그 시료에 의해 생성된 항체의 결합에 대해 평가하는 단계를 포함하며, 상기 항체와 에피토프 사이의 양성 반응으로 항체를 후보 항체로서 확인하는 것인, 방법.
- 후보 항체를 확인하는 방법으로서,
a) 항체 또는 항체-생산 세포를 함유하는 시료를 제공하는 단계; 및
b) 제1항에 정의된 바와 같은 O3b-에피토프와 함께 또는 그 시료에 의해 생성된 항체의 결합에 대해 평가하는 단계를 포함하며, 제2항에 정의된 바와 같은 O3a-에피토프 및/또는 O3-에피토프와 관련하여, 또는 클렙시엘라 뉴모니애의 어떠한 비-O3 LPS 분자와 관련하여 항체와 O3b-에피토프 사이의 특이적 양성 반응으로 항체를 후보 항체로서 확인하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체의 제조 방법으로서,
a) 제26항 또는 제27항에 따라 확인된 후보 항체를 제공하는 단계; 및
b) 후보 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 단클론 항체, 또는 인간화 또는 인간 형태의 후보 항체, 또는 그의 유도체를 생산하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
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