KR20180071651A - 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스 및 이를 이용하여 헌터증후군 치료제를 개선하는 방법 - Google Patents
비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스 및 이를 이용하여 헌터증후군 치료제를 개선하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스 및 이를 이용한 헌터증후군 치료제를 개선하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스에 헌터증후군 치료제인 이듀로네이트-2-설파타제 투여 시, 치료제 성분인 이듀로네이트-2-설파타제에 대한 면역반응이 일어나지 않으므로, 치료제의 단백성분에 대한 면역원성을 제외하고 그 외 면역원성 요인을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스 및 이를 이용한 헌터증후군 치료제를 개선하는 방법에 관한 것이다.
뮤코다당증은 유전성 대사질환의 일종으로 리소좀에 존재하는 효소의 결함으로 유발되는 질환이다. 리소좀은 전자전달, 산화적 인산화 및 피루브산, 지방산, 몇몇 아미노산 대사에 관여하는 효소, 그리고 다양한 가수분해 효소들을 포함하는 각종 분해 작용에 관여하는 세포 내 기관으로서, 특히 뮤코다당류, 뮤코지질 및 스핑고지질 등의 분해와 관련이 있다. 이외에도 뮤코다당증과 관련하여 이들의 대사 과정에 많은 효소 결함 및 유전자 이상이 보고되어 있다.
구체적으로, 뮤코다당증은 임상적으로 골격계, 순환계 및 정신 기능 등에 다양한 증상을 나타내고, 임상적, 유전학적 및 생화학적 기초에서 7가지 유형으로 나눌 수 있다. 상기 다당류 대사에 관여하는 효소의 이상으로 황산화된 다당류(sulfated polysaccharides)인 더마탄 설페이트, 헤파란 설페이트 또는 케라탄 설페이트 등이 조직 내에 축적됨으로서 뮤코다당증 증상을 나타낸다.
상기 뮤코다당증 중 타입 Ⅱ인 헌터증후군은 이듀로네이트-2-설파타제의 결함으로 유발되는 것으로, 헌터증후군은 어린 시절부터 심한 증상을 보이는 중증형과 정신지체 등은 보이지 않는 가벼운 증상의 경증형으로 구분된다. 구체적으로 중증형은 정신지체, 신체 이상의 증상이 나타나고 대부분 15세 이전에 사망하며, 경증형은 난쟁이, 못난 외모, 간비종(hepatosplenomegaly) 등을 나타내고 오래 생존한다. 헌터증후군은 우리나라에서 비교적 많이 발견되는 질환으로 X 염색체와 연관된 열성(X-linked recessive) 양식으로 유전되고 있다.
헌터증후군의 치료제로는 샤이어사의 엘라프라제(Elaprase®)와 녹십자사의 헌터라제(Hunterase®)가 이용되고 있다. 엘라프라제의 경우 비임상과 임상 시험에서 약물 투여 후 이듀로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulphatase, 이하 IDS) 단백질에 특이적인 항체(IgG type) 양성율은 약 50% 정도로 보고된 반면, 헌터라제의 경우는 비임상과 임상에서 유의한 항약물항체(anti-drug antibody, 이하 ADA) 양성율을 나타내지 않았다. 헌터라제와 엘라프라제가 서로 유사한 약물로 간주됨에도 불구하고 차별화된 면역원성을 보이는 이유를 밝히고, 향후 보다 최적화된 약물을 제공하기 위해서는 헌터라제 약물에 의한 ADA 생성원인에 대해 규명이 필요한 실정이다.
Chihwa Kim et al, Journal of Human Genetics, 8:1-8, 2016
이에, 본 발명자들은 헌터증후군 치료제 성분인 IDS의 단백질 자체의 면역원성을 제외하고, 그 외 응집, 순도 및 형태와 같은 면역원성 요인에 의한 ADA 생성에 대해 규명하기 위하여, 면역 관용 상태의 헌터증후군 환자와 유사한 면역학적 환경을 제공하기 위해 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 IDS 면역관용 형질전환 마우스를 제조하였다. 상기 IDS 면역관용 형질전환 마우스에서 IDS 투여 시 ADA가 형성되지 않음을 확인하여 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은, 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 염기 서열을 포함하는 타겟팅 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 타겟팅 벡터를 마우스의 수정란에 전달하여 수득한 형질전환된 수정란을 제공한다.
나아가, 본 발명은 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 마우스와 IDS 이형접합체 마우스를 교배하여 제조되고 마우스 IDS 단백부분까지 제거된, IDS 면역관용 형질전환 마우스를 제공한다.
나아가, 본 발명은 i) 상기 IDS 면역관용 형질전환 마우스에 두 가지 이상의 헌터증후군 치료제를 각각 주사하는 단계; ii) 상기 IDS 면역관용 형질전환 마우스에서 항약물항체(ADA)의 생성 유무를 확인하는 단계; 및 iii) 상기 두 가지 이상의 헌터증후군 치료제에 의한 ADA의 생성유무를 서로 비교하는 단계를 포함하는, 헌터증후군 치료제의 면역원성 요인에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.
아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고, 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된, 본 발명의 IDS 면역관용 형질전환 마우스는 헌터증후군 치료제인 이듀로네이트-2-설파타제 투여시 치료제 성분인 이듀로네이트-2-설파타제에 대한 면역반응이 일어나지 않으므로, 치료제의 단백 성분에 대한 면역원성을 제외하고 그 외 면역원성 요인을 규명하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 형질전환 마우스 제조용 타겟팅 벡터(pcDNA3.1(+)-IDSC84T)의 구조이다.
도 2는 타겟팅 벡터를 NheI과 XhoI으로 처리한 후 전기영동한 결과이다.
도 3은 타겟팅 벡터를 주입시킨 293FT 세포에서 배양액 및 세포 내에 존재하는 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 단백질의 발현양을 정량화한 도면이다.
도 4는 타겟팅 벡터를 주입시킨 293FT 세포에서 배양액 및 세포 내에 존재하는 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 단백질을 확인한 웨스턴 블랏을 보여주는 사진이다.
도 5a 내지 5e는 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환(IDSC84T) 마우스의 유전체(Genomic) DNA를 이용해 PCR을 실시하여 스크리닝한 결과이다(96마리 중 10마리 확보, NO: no template, N/C: normal mouse genomic, P/C: positive(plasmid DNA) control).
도 6은 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제만을 발현하고, 마우스의 IDS 단백이 제거된 IDS 면역관용 형질전환(IDS-/- C84T)마우스의 유전체 DNA를 이용해 PCR을 실시하여 스크리닝한 결과이다(수컷 마우스 중 형질전환 마우스이면서 IDS KO 마우스의 두 가지 성격을 모두 가진 #1,2,3,8 마우스 선별, KO: Knock-out, WT: Wild-type, Tg: Transgenic).
도 7은 6개월간 IDS 약물을 투여하는 시기와 시료채취 시기를 보여주는 도면이다.
도 8은 IDS 약물 투여 20주차의 IDS KO(IDS-/-) 마우스와 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된 IDS 면역관용 형질전환 마우스(IDS-/- C84T)에서 채취한 혈장 시료를 이용하여 효소면역측정법(ELISA)을 통해 ADA 생성에 따른 발색반응을 확인한 결과이다.
도 9는 IDS KO(IDS-/-) 마우스와 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된 IDS 면역관용 형질전환 마우스(IDS-/- C84T)에서 IDS 약물 투여 후 28주차까지 ADA 생성정도를 효소면역측정법을 통해 비교한 결과이다.
도 10은 54일간 아쥬번트(Adjuvant)가 포함된 IDS 약물을 투여하는 시기와 시료 채취 시기를 보여주는 도면이다.
도 11은 IDS KO(IDS-/-) 마우스와 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된 IDS 면역관용 형질전환 마우스(IDS-/- C84T)에서 아쥬번트가 포함된 2종의 IDS 약물 투여 후 48일차 샘플에 대해 효소면역측정법을 통해 ADA 생성에 따른 발색반응을 확인한 결과이다.
도 12는 IDS KO(IDS-/-) 마우스와 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된 IDS 면역관용 형질전환 마우스(IDS-/- C84T)에서 아쥬번트가 포함된 2종의 IDS 약물 투여 후 54일까지의 ADA 생성정도를 효소면역측정법을 통해 비교한 결과이다.
도 2는 타겟팅 벡터를 NheI과 XhoI으로 처리한 후 전기영동한 결과이다.
도 3은 타겟팅 벡터를 주입시킨 293FT 세포에서 배양액 및 세포 내에 존재하는 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 단백질의 발현양을 정량화한 도면이다.
도 4는 타겟팅 벡터를 주입시킨 293FT 세포에서 배양액 및 세포 내에 존재하는 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 단백질을 확인한 웨스턴 블랏을 보여주는 사진이다.
도 5a 내지 5e는 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환(IDSC84T) 마우스의 유전체(Genomic) DNA를 이용해 PCR을 실시하여 스크리닝한 결과이다(96마리 중 10마리 확보, NO: no template, N/C: normal mouse genomic, P/C: positive(plasmid DNA) control).
도 6은 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제만을 발현하고, 마우스의 IDS 단백이 제거된 IDS 면역관용 형질전환(IDS-/- C84T)마우스의 유전체 DNA를 이용해 PCR을 실시하여 스크리닝한 결과이다(수컷 마우스 중 형질전환 마우스이면서 IDS KO 마우스의 두 가지 성격을 모두 가진 #1,2,3,8 마우스 선별, KO: Knock-out, WT: Wild-type, Tg: Transgenic).
도 7은 6개월간 IDS 약물을 투여하는 시기와 시료채취 시기를 보여주는 도면이다.
도 8은 IDS 약물 투여 20주차의 IDS KO(IDS-/-) 마우스와 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된 IDS 면역관용 형질전환 마우스(IDS-/- C84T)에서 채취한 혈장 시료를 이용하여 효소면역측정법(ELISA)을 통해 ADA 생성에 따른 발색반응을 확인한 결과이다.
도 9는 IDS KO(IDS-/-) 마우스와 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된 IDS 면역관용 형질전환 마우스(IDS-/- C84T)에서 IDS 약물 투여 후 28주차까지 ADA 생성정도를 효소면역측정법을 통해 비교한 결과이다.
도 10은 54일간 아쥬번트(Adjuvant)가 포함된 IDS 약물을 투여하는 시기와 시료 채취 시기를 보여주는 도면이다.
도 11은 IDS KO(IDS-/-) 마우스와 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된 IDS 면역관용 형질전환 마우스(IDS-/- C84T)에서 아쥬번트가 포함된 2종의 IDS 약물 투여 후 48일차 샘플에 대해 효소면역측정법을 통해 ADA 생성에 따른 발색반응을 확인한 결과이다.
도 12는 IDS KO(IDS-/-) 마우스와 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된 IDS 면역관용 형질전환 마우스(IDS-/- C84T)에서 아쥬번트가 포함된 2종의 IDS 약물 투여 후 54일까지의 ADA 생성정도를 효소면역측정법을 통해 비교한 결과이다.
본 발명은 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 염기 서열을 포함하는 타겟팅 벡터를 제공한다.
상기 인간 이듀로네이트-2-설파타제는 헤파란 설페이트 및 더마탄 설페이트의 분해에 관여하는 효소로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 예를들어, 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 구체적으로, 인간 이듀로네이트-2-설파타제 결핍시 헌터증후군 또는 제 2형 뮤코다당증을 유발할 수 있는 효소이며, 서열번호 3의 아미노산 서열과 같이 84번째 위치에 시스테인에서 트레오닌으로 점 돌연변이(point mutation)가 일어난 경우에는 당화(formylglycosylation)가 제대로 이루어지지 않아 인간 이듀로네이트-2-설파타제 활성을 나타내지 않는다.
또한, 상기 타겟팅 벡터에 포함되는 염기서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 염기 서열은 예를들어, 서열번호 4로 표시되는 것일 수 있다.
상기 타겟팅 벡터는 cDNA를 클로닝하기 위한 MCS(multiple cloning site)가 있고 숙주세포에서 복제가 가능하며 타겟팅 벡터를 선별하기 위한 리포터 유전자 또는 항생제 저항성 유전자를 가진 벡터라면 특정히 한정하지 않으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pcDNA3.1(+)벡터를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 타겟팅 벡터를 마우스의 수정란에 전달하여 수득한 형질전환 수정란을 제공한다.
구체적으로, 타겟팅 벡터의 DNA를 마우스의 수정란(zygote)에 미세주입법(microinjection)으로 주입한다. 암컷 마우스에 과배란을 유도하고 수컷 마우스와 교미시킨 후 교배 유무를 확인하여 질전(vaginal plug)이 있는 암컷 마우스 난관으로부터 수정란을 채취한다. 타겟 벡터 DNA 용액을 미세 주입 인젝션 파이펫(injection pipette)에 로딩(loading) 후 현미경 하에서 웅성 전핵에 주입한다.
또한, 본 발명은 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환(IDSC84T) 마우스를 제공한다.
상기 형질전환 마우스는 형질전환된 마우스 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 수득할 수 있다. 미세주입된 수정란을 대리모에 이식하고 19일 후 태어난 생쥐에 대해 꼬리에서 유전체(genomic) DNA를 추출하여 해당 유전자의 삽입 여부를 확인한다.
구체적으로, 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 PCR로 증폭된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 유전자를 확인하여 형질전환 마우스를 스크리닝할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환(IDSC84T) 마우스와 IDS 이형접합체(IDS-/+) 마우스를 교배하여 제조되고, 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고 마우스의 IDS 단백부분까지 제거된, IDS 면역관용 형질전환(IDS-/- C84T) 마우스를 제공한다.
상기 IDS 이형접합체(IDS-/+) 마우스는 이듀로네이트-2-설파타제 유전자를 결실시킨 타겟팅 벡터를 배아줄기세포에 도입하여, 형질전환된 배아줄기세포를 수정란의 배반포에 주입하여 얻은 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 수득할 수 있다.
또한, 상기 IDS 이형접합체(IDS-/+) 마우스는 대한민국 특허 제10-0884564호에 개시한 기술을 참고하여 제조할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 본 발명에서 사용하는 용어 "IDS 면역관용 형질전환 마우스"란, 인간 이듀로네이트-2-설파타제 유전자의 일부가 치환되고, 마우스의 이듀로네이트-2-설파타제 유전자의 일부가 결실되어, 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하고, 마우스의 이듀로네이트-2-설파타제는 발현하지 않는 형질전환 마우스를 의미한다.
또한, 본 발명은 i) 상기 IDS 면역관용 형질전환 마우스에 두 가지 이상의 헌터증후군 치료제를 각각 주사하는 단계; ii) 상기 IDS 면역관용 형질전환 마우스에서 항약물항체(ADA)의 생성 유무를 확인하는 단계; 및 iii) 상기 두 가지 이상의 헌터증후군 치료제에 의한 ADA의 생성유무를 서로 비교하는 단계를 포함하는, 헌터증후군 치료제의 면역원성 요인에 대한 정보제공방법을 제공한다.
상기 ADA는 IDS에 대한 항체일 수 있다.
상기 헌터증후군 치료제는 IDS를 포함할 수 있다.
상기 IDS는 헌터증후군의 치료제의 활성성분이며, 엘라프라제 또는 헌터라제일 수 있다. 구체적으로, 두 헌터증후군 치료제는 IDS단백에 대한 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 단백질의 중합체 비율(헌터라제 1.4%, 엘라프라제 3.2%)과 순도(헌터라제 98.9%, 엘라프라제 96.9%) 측면에서 차이를 보인다. 상기 엘라프라제 및 헌터라제는 헌터증후군 치료제로서 면역 유도 작용에서 보다 적합한 조건을 개선하는 방법의 시료로서 사용될 수 있다(Chihwa Kim et al, Journal of Human Genetics, 8:1-8, 2016).
상기 IDS는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 84번째에 N-glycosylation된 것일 수 있다.
또한, 상기 헌터증후군 치료제는 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있다.
I. IDS
-/-
C84T
형질전환 마우스 제조
실시예
1.
pcDNA3
.1(+)-
IDS
C84T
타겟팅
벡터 제조
서열번호 1의 인간 정상 IDS 아미노산 서열에서 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된(IDSC84T) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 타겟팅 벡터를 제조하기 위해, 서열번호 2의 인간 정상 IDS 염기서열에서 시스테인 코딩 DNA 서열인 tgc가 트레오닌을 코딩하는 DNA 서열 acc로 치환된 서열번호 4의 염기서열을 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝하였다.
클로닝된 IDSC84T cDNA를 포유류 세포 293FT에서 안정적으로 발현시키기 위하여, 이를 포유류 CMV 프로모터가 있는 pcDNA3.1(+)벡터(Invitrogen)의 Nhel과 Xhol 제한효소 사이트 사이에 서브클로닝하여 pcDNA3.1(+)-IDSC84T 벡터를 제조하였다(도 1 및 2).
실시예
2.
pcDNA3
.1(+)-
IDS
C84T
타겟팅
벡터 발현 확인
상기 pcDNA3.1(+)-IDSC84T 벡터에서 씨퀀싱(sequencing)을 통해 84번째 코돈이 시스테인 코돈에서 트레오닌 코돈으로 점 돌연변이가 일어나 있음을 확인한 후, 상기 벡터를 293FT 세포에 형질도입한 후, 얻어진 세포 및 이의 배양액에서 효소면역측정법(ELISA) 및 단백질 흡입법(Western blotting)을 통해 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제가 정상적으로 발현됨을 확인하였다(도 3 및 4).
실시예
3. 형질전환된 수정란 세포 제조
상기 pcDNA3.1(+)-IDSC84T 타겟팅 벡터를 적당한 제한효소로 잘라 linearized DNA 조각을 만들고 agarose 젤에 전기영동하여 DNA를 정제한다. 정제된 DNA는 정량을 통해 약 4 ng/uL가 되도록 준비하였다.
과배란 유도를 위하여 암컷 마우스에 PMSG와 hCG 호르몬 주사를 48 시간 간격으로 주사하였고, 수컷 마우스와 교미를 유도한 후 다음날 아침 질전을 체크하여 교배 유무를 확인하였고, 질전이 있는 암컷 마우스의 난관으로부터 수정란을 채란하였다. 그 후 DNA 용액을 미세 주입 인젝션 파이펫(injection pipette)에 로딩(loading) 후 현미경 하에서 웅성 전핵에 주입한다.
실시예
4. 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된
비활성 인간
이듀로네이트
-2-
설파타제를
발현하는 형질전환(
IDS
C84T
) 마우스 제조
타겟팅 DNA가 주입된 수정란은 생존한 것을 선별하여, 대리모 난관에 이식하여 착상시켰다. 이식 후 19일째 형질전환 마우스를 분만하였다.
그 후 4~5주령 마우스의 유전체 DNA를 꼬리에서 추출하여 유전자의 삽입 여부를 확인하였다. 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR을 실시해 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환(IDSC84T) 마우스를 스크리닝하여 10마리를 수득하였다(도 5a 내지 5e). 상기 형질전환(IDSC84T) 마우스의 정자를 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 실험동물자원센터에 2016년 11월 28일자로 기탁하였다(기탁번호: AZ00001310).
실시예
5. IDS 면역관용 형질전환(IDS
-/-
C84T
) 마우스 스크리닝
상기 형질전환 (IDSC84T) 마우스 수컷과 IDS 이형접합체(IDS-/+) 마우스 암컷을 교배시켜 자손을 얻었다. 태어난 후 4-5주령 마우스의 꼬리 유전체 DNA를 이용하여 PCR을 통해 마우스의 IDS 결실 유전자와 비활성 인간 IDS 유전자를 모두 갖는 IDS-/-C84T 면역관용 마우스를 스크리닝하였다(도 6).
II.
면역원성 측정 실험
실시예
6. IDS에 따른 ADA 생성확인
실시예
6-1. IDS 처리 후 시료 채취
야생형(Wild type, WT), IDS 넉아웃(Knock-out, KO), IDS 면역관용 형질전환(IDS-/- C84T) 세 종류의 마우스를 이용하여 총 5군으로 나누어 6개월 동안 1주일에 한 번씩 1 mg/kg로 약물 투여가 진행되었다(표 1, 도 7). 투여 전 3일째와 투여 후 4주 단위로 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28주차에 혈장 시료를 채취하였다. 모든 샘플은 한 배치(batch)에서 분석하기 위해 분석 전까지 -70 ℃에서 보관하였다.
| 그룹 | 약물 | 마우스 | 투여기간 | 분석 |
| G1 | saline | WT | 6개월간 매주 | 1개월에 한 번씩 Blood sampling - 효소면역측정법(ELISA)를 하여 Anti-Drug-Antibody 형성 유무 확인 |
| G2 | saline | IDS KO | ||
| G3 | IDS 1mg/kg | |||
| G4 | saline | IDS-/- C84T | ||
| G5 | IDS 1mg/kg |
실시예
6-2. IDS 처리 후 ADA 형성 유무 확인
상기 혈장 시료를 PBS로 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10,000으로 희석하여 효소면역측정법(ELISA)를 실시하였다(도 8). 구체적으로, PBS에 희석된 IDS 단백질 10 ug/ml을 96-well-plate에 100 ㎕씩 넣고, 2~8 ℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. plate에 담겨있던 용액을 버리고, 1 부피% BSA/PBS 300 ㎕를 넣은 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 희석된 혈장시료를 한 농도당 2개 well에 100 ㎕씩 주입하였다. plate sealer로 덮고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 각 well에 세척액(0.1 부피% PBST) 300 ㎕씩 넣고 3회 세척하였다. 마지막에 남아있는 세척액은 여러 겹의 종이 타올에 강하게 쳐서 완전히 제거하였다.
모든 well에 HRP-conjugated anti-mouse-IgG를 PBS로 1:2000 희석한 후 100 ㎕씩 넣었다. plate sealer로 덮고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 well에 세척액(0.1 부피% PBST) 300 ㎕씩을 넣고 3회 세척하였다. 마지막에 남아있는 세척액은 여러 겹의 종이 타올에 강하게 쳐서 완전히 제거하였다.
TMB 페록시다아제 기질 용액 100 ㎕를 모든 well에 넣고, 15분간 실온에서 반응시켰다. 모든 well 에 1N 황산 100 ㎕를 가하여 반응을 정지시킨 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 상기 20주차에 모은 혈장시료를 1:100 희석하여 ADA 형성 유무를 효소면역측정법(ELISA)를 수행하여 비교하였다. 그 결과, IDS KO 마우스에서는 높은 항체반응을 보이지만, 면역관용 형질전환(IDS-/- C84T) 마우스에서는 나타나지 않아 IDS 단백에 대해서 면역 내성을 가짐을 확인하였다(도 8).
IDS KO 마우스에서는 IDS 약물 투여에 의해 약 8주차부터 ADA 형성을 보였다. 반면에 면역관용 형질전환(IDS-/- C84T) 마우스에서는 IDS 약물 투여에 의해 생성되는 ADA가 없었다(도 9).
실시예
7. IDS의 종류 및
아쥬번트에
따른 ADA 생성확인
실시예
7-1.
아쥬번트가
포함된 IDS 처리 후 시료 채취
야생형(Wild type, WT), IDS 넉아웃(Knock-out, KO), IDS 면역관용 형질전환(IDS-/- C84T) 세 종류의 마우스를 이용하여 총 7군으로 나누어 3주 간격으로 아쥬번트(adjuvant)가 포함된 헌터라제와 엘라프라제 2종을 복강 내 투여하여 3차례 실시하였다.
투여 전 3일째와 1차 투여(0일째) 후 일주일(7일째)과 이주일(14일째), 2차 투여(21일째) 후 일주일(28일째)과 이주일(35일째), 3차 투여(42일째) 후 일주일(48일째)과 이주일(54일째)에 혈장 시료 채취를 실시하였다(표 2 및 도 10). 모든 샘플은 한 배치(batch)에서 분석하기 위해 분석 전까지 -70 ℃에서 보관하였다.
| 그룹 | 약물 | 마우스 | 투여기간 | 분석 |
| G1 | PBS | WT | 54일간 | plasma sampling - 3,7, 14, 28, 35, 48, 54일 |
| G2 | PBS | IDS KO | ||
| G3 | IDS-1 50ug Quil A 5ug MPL 5ug |
|||
| G4 | IDS-2 50ug Quil A 5ug MPL 5ug |
|||
| G5 | PBS | IDS-/- C84T | ||
| G6 | IDS-1 50ug Quil A 5ug MPL 5ug |
|||
| G7 | IDS-2 50ug Quil A 5ug MPL 5ug |
실시예
7-2.
아쥬번트가
포함된 IDS 처리 후 ADA 형성 유무 확인
상기 혈장시료를 PBS로 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000으로 희석하여 효소면역측정법(ELISA)를 실시하였다. PBS에 희석된 IDS 단백질 10ug/ml을 96-well-plate에 100 ㎕씩 넣고, 2~8 ℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. plate에 담겨있던 용액을 버리고, 1 부피% BSA/PBS 300 ㎕를 넣은 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 희석된 혈장시료를 한 농도당 2개 well에 100 ㎕씩 주입하였다. plate sealer로 덮고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 각 well에 세척액(0.1 부피% PBST) 300 ㎕씩을 넣고 3회 세척하였다. 마지막에 남아있는 세척액은 여러 겹의 종이 타올에 강하게 쳐서 완전히 제거하였다.
모든 well에 HRP-conjugated anti-mouse-IgG를 PBS로 1:2000 희석한 후 100 ㎕씩 넣었다. plate sealer로 덮고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 well에 세척액(0.1 부피% PBST) 300 ㎕씩을 넣고 3회 세척하였다. 마지막에 남아있는 세척액은 여러 겹의 종이 타올에 강하게 쳐서 완전히 제거하였다. TMB 페록시다아제 기질 용액 100 ㎕를 모든 well에 넣고, 15분간 실온에서 반응시켰다. 모든 well 에 1N 황산 100 ㎕를 가하여 반응을 정지시킨 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 면역관용 형질전환 (IDS-/- C84T) 마우스에서 아쥬번트(Adjuvant)가 포함된 두 종류의 IDS 약물 투여에 의해 생성되는 ADA가 없었다 (도 11).
상기 7차례 모아진 모든 혈장시료를 1:100 희석하여 ADA 형성 유무를 효소면역측정법(ELISA)를 수행하여 비교하였다. 면역관용 형질전환(IDS-/- C84T) 마우스에서는 아쥬번트가 포함된 IDS 두 종류의 약물에 대해서 면역 내성을 가짐을 확인하였다(도 12).
[설치류 및 수정란 기탁확인서]
<110> Mogam Institute for Biomedical Research
<120> TRANSGENIC MOUSE EXPRESSING INACTIVATED HUMAN
IDURONATE-2-SULPHATASE AND METHOD FOR IMPROVING A HUNTER SYNDROME
TREATING AGENT USING SAME
<130> FPD/201611-0017
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 550
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser
20 25 30
Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg
35 40 45
Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile
50 55 60
Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln
65 70 75 80
Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His
100 105 110
Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr
115 120 125
Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn
130 135 140
His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro
145 150 155 160
Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly
165 170 175
Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro
180 185 190
Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu
195 200 205
Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly
210 215 220
Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys
225 230 235 240
Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro
245 250 255
Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln
260 265 270
Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile
275 280 285
Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val
290 295 300
Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp
305 310 315 320
Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly
325 330 335
Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp
340 345 350
Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala
355 360 365
Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe
370 375 380
Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu
385 390 395 400
Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu
405 410 415
Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys
420 425 430
Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu
435 440 445
Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser
450 455 460
Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro
465 470 475 480
Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp
485 490 495
Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala
500 505 510
Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp
515 520 525
Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu
530 535 540
Phe Gln Leu Leu Met Pro
545 550
<210> 2
<211> 1653
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60
tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120
ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180
tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240
caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300
cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360
cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420
atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480
tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540
aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600
agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660
ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720
ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780
cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840
atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900
tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960
cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020
gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080
ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140
ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200
gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260
cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320
cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380
attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440
agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500
gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560
gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620
ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1653
<210> 3
<211> 550
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of Human iduronate 2-sulfatase (C84T)
<400> 3
Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser
20 25 30
Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg
35 40 45
Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile
50 55 60
Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln
65 70 75 80
Gln Ala Val Thr Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His
100 105 110
Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr
115 120 125
Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn
130 135 140
His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro
145 150 155 160
Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly
165 170 175
Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro
180 185 190
Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu
195 200 205
Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly
210 215 220
Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys
225 230 235 240
Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro
245 250 255
Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln
260 265 270
Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile
275 280 285
Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val
290 295 300
Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp
305 310 315 320
Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly
325 330 335
Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp
340 345 350
Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala
355 360 365
Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe
370 375 380
Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu
385 390 395 400
Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu
405 410 415
Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys
420 425 430
Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu
435 440 445
Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser
450 455 460
Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro
465 470 475 480
Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp
485 490 495
Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala
500 505 510
Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp
515 520 525
Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu
530 535 540
Phe Gln Leu Leu Met Pro
545 550
<210> 4
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of Human iduronate 2-sulfatase (C84T)
<400> 4
atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60
tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120
ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180
tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240
caagcagtga ccgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300
cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360
cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420
atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480
tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540
aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600
agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660
ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720
ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780
cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840
atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900
tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960
cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020
gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080
ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140
ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200
gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260
cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320
cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380
attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440
agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500
gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560
gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620
ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1653
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for iduronate 2-sulfatase (C84T)
<400> 5
cgtgtacggt gggaggtcta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for iduronate 2-sulfatase (C84T)
<400> 6
gtgggaagga ccagctgtag 20
Claims (11)
- 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제 염기 서열을 포함하는, 타겟팅 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 염기 서열이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 것인, 타겟팅 벡터.
- 제1항의 타겟팅 벡터를 마우스의 수정란에 전달하여 수득한, 형질전환된 수정란.
- 아미노산 84번 위치의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스.
- 제4항에 있어서,
상기 형질전환 마우스가 제3항의 형질전환된 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 수득된 것인, 형질전환 마우스.
- 제4항의 형질전환 마우스와 IDS 이형접합체 마우스를 교배하여 제조되고 마우스 IDS 단백부분까지 제거된, IDS 면역관용 형질전환 마우스.
- i) 제6항의 IDS 면역관용 형질전환 마우스에 두 가지 이상의 헌터증후군 치료제를 각각 주사하는 단계;
ii) 상기 IDS 면역관용 형질전환 마우스에서 항약물항체(ADA)의 생성 유무를 확인하는 단계; 및
iii) 상기 두 가지 이상의 헌터증후군 치료제에 의한 ADA의 생성유무를 서로 비교하는 단계를 포함하는, 헌터증후군 치료제의 면역원성 요인에 대한 정보 제공 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 ADA가 IDS에 대한 항체인, 헌터증후군 치료제의 면역원성 요인에 대한 정보 제공 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 헌터증후군 치료제가 IDS를 포함하는 것인, 헌터증후군 치료제의 면역원성 요인에 대한 정보 제공 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 IDS가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 IDS 단백질인, 헌터증후군 치료제의 면역원성 요인에 대한 정보 제공 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 헌터증후군 치료제가 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 것인, 헌터증후군 치료제의 면역원성 요인에 대한 정보 제공 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160174514A KR20180071651A (ko) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스 및 이를 이용하여 헌터증후군 치료제를 개선하는 방법 |
| US15/848,149 US20180168134A1 (en) | 2016-12-20 | 2017-12-20 | Transgenic mouse expressing inactivated human iduronate-2-sulphatase and method for improving a hunter syndrome treating agent using same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160174514A KR20180071651A (ko) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스 및 이를 이용하여 헌터증후군 치료제를 개선하는 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180071651A true KR20180071651A (ko) | 2018-06-28 |
Family
ID=62556149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160174514A KR20180071651A (ko) | 2016-12-20 | 2016-12-20 | 비활성 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 발현하는 형질전환 마우스 및 이를 이용하여 헌터증후군 치료제를 개선하는 방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20180168134A1 (ko) |
| KR (1) | KR20180071651A (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120180148A1 (en) * | 2011-01-07 | 2012-07-12 | Jin Thong-Gyu | Transgenic mouse model for developing enzyme replacement therapy for iduronate-2-sulfatase deficiency syndrome |
-
2016
- 2016-12-20 KR KR1020160174514A patent/KR20180071651A/ko not_active Application Discontinuation
-
2017
- 2017-12-20 US US15/848,149 patent/US20180168134A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Chihwa Kim et al, Journal of Human Genetics, 8:1-8, 2016 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20180168134A1 (en) | 2018-06-21 |
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|---|---|---|---|
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