KR20180069420A - 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제 치료 반응성 및 생존 예후 예측용 조성물 - Google Patents

골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제 치료 반응성 및 생존 예후 예측용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제 치료 반응성 및 생존 예후 예측용 유전자 마커의 돌연변이 여부를 확인하기 위한 조성물, 유전자 패널과 키트, 이를 이용한 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 저메틸화 제제 치료 반응성 및 생존 예후 예측용 조성물은 기존의 조성물보다 정확도 높게 예후를 예측할 수 있어, 골수형성이상 증후군 환자의 치료 방향을 결정하는데 있어 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Description

골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제 치료 반응성 및 생존 예후 예측용 조성물{Composition for Predicting Survival and the Response of a Patient with Myelodysplastic Syndromes to Hypomethylating Agent}
본 발명은 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제 치료 반응성 및 생존 예후 예측용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 조성물, 이를 위한 바이오마커를 포함하는 유전자 패널 및 키트, 이를 이용한 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
골수형성이상 증후군(Myelodysplastic syndromes, MDS)은 클론성 줄기세포 장애에 의한 골수성 종양으로, 비효율적인 조혈 작용을 일으키고 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML)의 진행 위험성을 증가시킨다. 이 증후군은 무기력증부터 AML의 진행 또는 심각한 혈구 감소증과 같이 생명을 위협하는 다양한 임상적 증상을 나타낸다. 아자시티딘(Azacitidine) 또는 데시타빈(Decitabine)과 같은 저메틸화 억제제(Hypomethylating agents, HMA)를 이용한 치료는 고위험 MDS 환자 또는 혈구 감소증 증상을 가지는 저위험 MDS 환자에게 첫번째 치료 방법이다. 그러나, 임상 시험자의 HMT에 따른 생존율 및 저메틸화 치료(Hypomethylating therapy, HMT)에 대한 응답을 예측하는 것은 여전히 해결해야 할 문제로 남아있다.
치료법 선택을 돕기 위하여 현재까지 다양한 예후 점수 시스템이 개발되어 왔다. 그 중에서도, 가장 최근 시스템인 개정된 국제 예후 점수 시스템(Revised International Prognostic Scoring System, IPSS-R)은 환자의 생존율을 예측하는데 유용하나, HMT에 대한 치료 반응성을 예측하기에는 효과적이지 않았다. 따라서, 신뢰할 수 있는 분자유전학적 마커를 확인한다면, 이를 통해 MDS에 대한 추가적 예후 정보를 제공할 수 있을 것이다.
한편, MDS 발병 기전을 이해하기 위하여, 최근 체세포 돌연변이 및 그와 MDS 병리생리학간의 상관관계에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 노력으로, 일부 돌연변이 정보가 기존의 예후 점수 시스템에 추가되어 개정되었다. 그럼에도 불구하고 기존의 시스템을 아시아인 또는 한국인 MDS 환자에게 적용하였을 때, 민감도, 특이도 및 정확도가 현저히 낮은 문제점이 있었다. 따라서, 아시아인 또는 한국인 MDS 환자에게 특이적으로 확인되는 분자유전자적 마커를 확인하고, 이를 도입한 새로운 예후 점수 시스템의 개발 필요성이 있어왔다.
미국특허 US2016/0083802 미국특허 US2014/0127690
Greenberg, Peter L., et al. "Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes." Blood 120.12 (2012): 2454-2465. Traina, F., et al. "Impact of molecular mutations on treatment response to DNMT inhibitors in myelodysplasia and related neoplasms." Leukemia 28.1 (2014): 78-87. Bejar, Rafael, et al. "TET2 mutations predict response to hypomethylating agents in myelodysplastic syndrome patients." Blood 124.17 (2014): 2705-2712. Bejar, Rafael, et al. "Somatic mutations predict poor outcome in patients with myelodysplastic syndrome after hematopoietic stem-cell transplantation." Journal of Clinical Oncology 32.25 (2014): 2691-2698. Haferlach, T., et al. "Landscape of genetic lesions in 944 patients with myelodysplastic syndromes." Leukemia 28.2 (2014): 241-247. Papaemmanuil, Elli, et al. "Clinical and biological implications of driver mutations in myelodysplastic syndromes." Blood 122.22 (2013): 3616-3627.
이에 본 발명자들은 골수형성이상 증후군 환자의 생존 및 저메틸화 치료에 대한 반응과 연관된 돌연변이를 발견하고자 하였고, 타겟 딥 시퀀싱(targeted deep sequencing) 방법을 통해, 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제 치료 반응성 및 생존 예후 예측할 수 있는 마커 유전자를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 해결하려는 과제는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후 예측용 유전자 패널을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오 마커에 대한 검출 시약을 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오 마커를 포함하는, 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후 예측용 유전자 패널을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물 또는 상기 유전자 패널을 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 환자로부터 얻은 유전자 시료에서, U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에서 돌연변이를 확인하는 단계를 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 골수형성이상 증후군(MDS) 환자의 저메틸화 제제 치료 반응성 및 생존 예후 예측용 조성물은 기존의 조성물보다 정확도 높게 예후를 예측할 수 있어, 골수형성이상 증후군 환자의 치료 방향을 결정하는데 있어 유용한 정보를 제공할 수 있다.
구체적으로, 종래 MDS에 대한 예후를 예측하는 방법은 정확도가 낮을 뿐 아니라 시간이 많이 소요되어 1명의 환자를 대상으로 예후 예측 인자의 검출에 대략 7~10일의 시간이 소요될 수 있다. 이에 따라 환자 시료의 수득, 예후 예측 인자의 검출, 정보 처리 및 진단 소견의 결정을 거쳐 환자의 치료 방법을 결정하기 위해 15~20일의 시간이 필요하다. 그러나, 본 발명에 따른 MDS 환자의 예후 예측 방법을 적용하면 기존의 조성물 및 이를 이용하는 종래 예후 예측방법보다 정확도가 높아질 뿐 아니라 시간 또한 절약될 수 있다. 컴퓨터의 정보 처리 속도에 의존하여 차이가 있을 수 있으나, 본 발명의 방법을 적용하였을 때 예후 예측 인자의 검출에 4~6일 만에 완료될 수 있어, 환자의 치료 방법을 결정하기 위해 총 7~10일이 요구될 수 있어, 종래 방법에 비해 예후 예측의 정확도가 개선되고 진단에 필요한 시간 역시 절약할 수 있다는 점에서 효과적이다.
도 1은 107개의 골수형성이상 증후군 환자의 게놈 중 26개 후보 유전자의 돌연변이를 나타낸 도면이다(각 행은 돌연변이 유전자를 나타내고, 각 열은 환자들을 나타냄).
도 2는 107개의 골수형성이상 증후군 환자의 게놈에서 반응군과 비반응군간 돌연변이 유전자의 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 3은 SETBP1 돌연변이의 다이어그램(A) 및 U2AF1 돌연변이의 다이어그램(B)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 DNMT3A, RAS, TP53 또는 DNMT1 돌연변이 상태에 따른 전체 생존율의 카플란-마이어(Kaplan-Meier)법으로 추정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 DNMT3A, RAS 또는 TP53 돌연변이 상태에 따른 무-AML생존율 카플란-마이어법으로 추정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 4가지 위험군의 전체 생존율(A) 및 무AML 생존율(B)을 카플란-마이어법으로 추정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 제시하는 예후 예측 모델과 기존 예후 예측 모델간 전체 생존율을 비교한 그래프이다.
도 8은 본 발명에서 제시하는 예후 예측 모델과 기존 예후 예측 모델간 급성골수성백혈병의 발병 없이 생존하는 비율을 비교한 그래프이다.
본 발명자들은 골수형성이상 증후군 환자의 생존 및 저메틸화 치료에 대한 반응과 연관된 돌연변이를 발굴하기 위해 예의 연구한 결과, 골수형성 이상 증후군 환자의 생존율을 예측할 수 있는 유전자 마커 및 저메틸화 치료에 대한 반응성을 예측할 수 있는 유전자 마커를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오 마커에 대한 검출 시약을 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 대상으로 하는 질병인 “골수형성이상 증후군(Myelodysplastic Syndromes)”은 골수의 증식과 구성 세포들의 이형성, 비효율적인 조혈을 특징으로 하는 비정상적인 조혈모세포로부터 유래된 혈액 질환을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “급성골수성 백혈병(Acute　myeloid　leukemia)”은 조혈모세포에 유전자 변이가 생겨 골수계 전구세포가 여러 가지 단계에서 분화를 정지해, 미성숙한 골수모구가 단세포군(Monoclonal)으로 증식하는 조혈기종양이다.　
본 발명에서 사용되는 용어 “저메틸화 치료”는 DNA를　저메틸화(hypomethylation)시키기 위한 치료를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 골수형성이상 증후군의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예후(prognosis)”란, 병세의 진행, 회복에 관한　예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서　예후는 골수형성이상 증후군의 재발, 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 “검출 시약”은 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인 것일 수 있다. 구체적으로, 핵산 수준의 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay),　in situ　교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약일 수 있다.
본 발명의 상기 “환자”는 바람직하게는 아시아인인 환자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 한국인 환자일 수 있다.
본 발명의 상기 “저메틸화 제제”는 바람직하게는 아자시티딘이나 데시타빈일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아자시티딘일 수 있다.
본 발명은 U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자를 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 예측 또는 생존 예후 예측을 위한 바이오 마커로 제공한다. 구체적으로, 상기 U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자에서 돌연변이를 가지는 양상을 통해 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 예측 또는 생존 예후 예측할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 바이오마커의 유전자 타입(야생형 또는 돌연변이형)을 확인하여 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성을 예측하거나, 생존 예후를 예측한다. 보다 구체적으로 예를들어, 골수형성이상 증후군 환자의 U2AF1 유전자가 야생형이라면, 저메틸화 치료 반응성이 긍정적일 것으로 예상할 수 있다. 반대로, U2AF1 유전자가 돌연변이형이라면, 저메틸화 치료 반응성이 부정적일 것으로 예상할 수 있다.
본 발명은 U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 또는 TP53 유전자의 타입(야생형 또는 돌연변이형)을 확인할 수 있는 검출 시약을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 검출 시약은 환자 유전자를 이용하여 PCR을 수행하기 위하여, 발명의 마커　유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오 마커의 돌연변이 여부를 확인하기 위한, 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 유전자 패널을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물 또는 상기의 유전자 패널을 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서 상기 키트는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, cDNA 등뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분　조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일 양태로서, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다. 다른 일 양태로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 골수형성이상 증후군 생존　예후　예측용 키트일 수 있으며, DNA 칩 키트는 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 환자로부터 얻은 유전자 시료에서, U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에서 돌연변이를 확인하는 단계를 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "골수형성이상 증후군　예후　예측을 위한 정보를 제공하는 방법"은 예후　예측을 위한 예비적 단계로써 골수형성이상 증후군　예후　예측을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명의 상기 “환자”는 바람직하게는 아시아인인 환자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 한국인 환자일 수 있다.
본 발명의 상기 “저메틸화 제제”는 바람직하게는 아자시티딘이나 데시타빈일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아자시티딘일 수 있다.
본 발명자들은 골수형성이상 증후군 환자 유래의 유전자 정보 및(또는) 병리학적 자료를 이용하여　U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자의 돌연변이 형태가 골수형성이상 증후군 환자의 병리학적 등급 및 환자의 생존율과 밀접한 연관성이 있음을 규명하였다.
본 발명의 일실시예에서는, U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 돌연변이일 경우, 저메틸화 제제에 대한 반응성이 낮거나, 생존 예후가 나쁘다는 것을 확인하였다.
본 발명의 상기 돌연변이를 확인하는 단계에서, U2AF1 유전자에 돌연변이가 존재할 경우, 저메틸화 제제에 대한 반응이 없을 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 반응성 환자의 12.3%, 비반응성 환자의 28%에서 U2AF1 유전자의 돌연변이를 확인하였으며 이 때 P-value는 0.052로 유의하다고 판단할 수 있었다. 따라서, U2AF1 유전자에 돌연변이가 존재할 경우, 저메틸화 제제에 대한 반응이 없을 것으로 예측할 수 있다. 보다 바람직하게는 U2AF1 유전자의 돌연변이 여부와 함께, 혈소판 수치와 헤모글로빈 수치를 함께 고려하여 저메틸화 제제에 대한 반응성을 예측할 수 있다. 구체적으로 U2AF1 유전자가 돌연변이일 경우, 혈소판 수치가 50,000/ul 이하일 경우, 헤모글로빈 수치가 10g/dl이하일 경우 저메틸화 제제에 대한 반응이 없을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 상기 돌연변이를 확인하는 단계에서, DNMT1, NDMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 돌연변이가 존재할 경우, 생존 예후가 나쁜 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, DNMT1, NDMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 돌연변이가 존재하면, 생존 예후가 나쁜 것으로 예측할 수 있다. 바람직하게는 DNMT1 , RAS 및 TP53 유전자로 이루어지는 군에서 하나 이상의 유전자 돌연변이가 존재하면, 생존 예후가 나쁜 것으로 예측할 수 있다. 보다 바람직하게는 DNMT1 , RAS 및 TP53 유전자에 돌연변이가 존재하면, 생존 예후가 나쁜 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 생존 예후를 예측하는 단계에서 비마커 임상 정보를 추가로 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 비마커 임상 정보는 헤모글로빈 수치, 혈소판 수치, 성별 정보 및 개정된 국제예후점수시스템(Revised international prognostic scoring system, IPSS-R) 정보로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 위험 그룹별로 분류하는 방법은 하기의 위험　점수를 합산하여 점수가 0이면 저위험군, 점수가 1이면 중저위험군, 점수가 2이면 중고위험군, 점수가 3 이상이면 고위험군으로 분류하여 예후를 예측하는 것일 수 있다; a) 남자일 경우 1, 여자일 경우 0; b) IPSS-R 수치가 높음 이상일 경우 1, 중간 이하일 경우 0; c) DNMT1 유전자가 돌연변이일 경우 1, 아닐 경우 0; d) DNMT3A 유전자가 돌연변이일 경우 1, 아닐 경우 0; e) RAS 유전자가 돌연변이일 경우 1, 아닐 경우 0; 및 f) TP53 유전자가 돌연변이일 경우 1, 아닐 경우 0.
이하, 실시예 및 비교예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 실시예 및 비교예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 비교예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[ 실험예 1]
연구대상의 선정 및 환자의 특성 확인
만성골수성백혈병을 포함한 골수형성이상 증후군(Myelodysplastic syndromes, MDS) 한국인 환자 107명이 이 연구에 참여하였다. 임상적 그리고 분자적 변수들은 저메틸화 제제 치료(Hypomethylating therapy, HMT) 이전에 동정되었다. 모든 환자에게 한 개나 두 개의 저메틸화 억제제(Hypomethylating agents, HMA)가 처방되었다: 아자시티딘(n=66) 혹은 데시타빈(n=41). 코호트의 평균 연령은 59세였다(범위: 23-76세). 모든 환자들은 서울아산병원(서울, 한국)과 서울성모병원(서울, 한국)에서 모집되었다. 치료 이후에 나타날 수 있는 분자적 수차에 의한 잠재적 편향을 피하기 위하여, HMT 이전의 골수 샘플을 얻었던 환자들만 포함시켰다. 기존의 기준치 특성 및 치료 효과는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
* 비반응 그룹에 속한 한 환자의 IPSS 및 IPSS-R 데이터는 수집되지 못함.. N, 번호; WHO, 세계보건기구; RCUD, 단일계열 형성이상 불응성 혈구 감소증; RCMD, 다계열 형성이상 불응성 혈구 감소증; RAEB, 모세포증가 불응성 빈혈; CMML, 만성 골수성 단구 백혈병; IPSS, 국제예후점수시스템; IPSS-R, 개정된 IPSS; ANC, 절대 호중구 개수; L, 낮은; VL, 매우 낮은; lnt, 중간; H, 높은; VH, 매우 높은; HMA, 저메틸화제; EPO, 에리스로포에틴(적혈구 생성소); CS, 사이클로스포린; OXM, 옥시메톨론; CR, 완전 관해; mCR, 골수 관해; HI, 혈액학적 개선; SD, 무변화.
반응성 환자들은 아자시티딘을 처방한 그룹에서 더 빈번하게 나타났다. 기준치 특성들과 비교를 하였을 때, 두 그룹 모두 유의한 차이를 보이진 않았지만, 환자들의 평균 연령은 아자시티딘이 처방된 환자들이 더 높았다(하기 표 2 참조).
Figure pat00002
* WHO, 세계보건기구; RCUD, 단일계열 형성이상 불응성 혈구 감소증; RCMD, 다계열 형성이상 불응성 혈구 감소증; RAEB, 모세포증가 불응성 빈혈; CMML, 만성 골수성 단구 백혈병; IPSS, 국제예후점수시스템; IPSS-R, 개정된 IPSS; ANC, 절대 호중구 개수; L, 낮은; VL, 매우 낮은; lnt, 중간; H, 높은; VH, 매우 높은; BM, 골수; EPO, 에리스로포에틴(적혈구 생성소); CS, 사이클로스포린; OXM, 옥시메톨론.
치료에 대한 반응성은 수정된 국제워킹그룹(International Working Group, IWG 2006)의 기준에 따라 평가되었다. 완전한 반응, 부분적 반응, 골수 반응 또는 혈액학적 개선 효과를 동반한 안정 상태(Stable disease)의 경우, 반응성 환자(n=57, 53.3%)로 판명하였고, 그 외 나머지(n=50, 46.7%)는 비반응성 환자로 판단하였다. 이 연구는 각 기관의 심사위원들에 의해 승인되었다. 환자 동의서는 각 환자들로부터 얻었다.
[ 실험예 2]
통계 분석
범주형 변수들은 피셔 정확검정 혹은 카이자승 검정법을 사용하여 비교하였고, 연속 변수는 스튜던트 T 검정(student’s t test)을 이용하여 비교하였다. 생존율 분석을 위해서, 시간-대-이벤트 분석에 사용된 지속기간은 HMT 시작일부터 어떤 원인에 의한 사망(Overall survival, OS, 전체 생존율) 또는 급성골수성백혈병의 발병일(free-AML survival, 무AML 생존율)까지로 정의되었다. 단변량 생존 분석에서 생존자들은 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 방법에 따라서 산출되었다. 생존 곡선에서의 차이는 로그순위법을 이용하여 평가되었다. 다변량 분석을 위해서는 단계적 다중 로지스틱 회귀분석법과 콕스 비례 위험 분석 모델이 사용되었다. 모든 통계분석에서 0.05 보다 작은 P 값만을 유의한 것으로 보았다.
[ 실험예 3]
타겟 딥 시퀀싱의 수행 및 결과 분석
실험예 3-1. 타겟 딥 시퀀싱의 수행
타겟 딥 시퀀싱을 이용하여, MDS와 관련된 총 26개의 유전자(DNMT3A, TET2, EZH2, RUNX1 , ASXL1 , STAG2 , CBL , TP53, SRSF2 , SF3B1 , U2AF1 , LAMB4 , DNMT1 , ETV6, KRAS , NF1, NPM1 , NRAS , PRPF8 , IDH1 , IDH2 , JAK2 , FLT3 , SETBP1 , ATRX 및 ZRSR2)가 107 MDS 게놈(57명 반응성 환자 그리고 50명 비반응성 환자)에서 분석되었다. 간단히 설명하자면, 시퀀싱 라이브러리(sequencing library)들은 맞춤형 표적 패널이 담긴 AmpliSeq Library Kit 2.0(Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용해서 제조사의 지침에 따라 만들어졌다. 이 맞춤형 표적은 26개 타겟 유전자의 암호부위유전자의 98.4%을 포함하는 1,088개의 앰플리콘(amplicon)을 담고 있다. 지침대로 Ion Torrent Proton (Life Technologies)의 P1 칩을 사용하여 시퀀싱이 진행되었다. Torrent Suite 4.2를 이용해서 유전자변수들과 GRCh37/hg19로 시퀀싱 리드(reads)들이 나열되었다.
유의한 돌연변이를 찾기 위해서, 엄격한 후-필터링(stringent post-filtering) 방법이 진행되었다. 처음에는 암호 부위 유전자에서의 기능적 변수들을 선정하였다. 일반 데이터 베이스(dbSNP138, ESP6500, 그리고 1000 게놈 프로젝트)를 통해 알려진 다형성 부위(소수유전형질 빈도의 >1%)들은 다형으로 판단하고 필터하여 제거했다. 기관 내부 자료(한국인의 38개의 전체 게놈과 2,283개의 전체 진유전체(exome) 염기서열 데이터)에서 >1%의 소수유전형질의 빈도를 갖는 변수들 또한 필터되어 제거하였다. 남는 변수들은 후보 체세포 돌연변이로 판단하였다.
실험예 3-2. 타겟 딥 시퀀싱 결과
MDS 게놈의 대부분 (94/107, 87.9%)은 적어도 하나의 타겟 유전자에서 돌연변이를 나타냈다(도 1 참조). 평균적으로, 게놈 당 1.9 단일 뉴클레오티드 변형체 (SNVs) 및 인델(indels)이 확인되었다(SD 1.4, 범위 0-7). 반응 그룹 (평균 1.7 돌연변이; 0-5)과 비반응 그룹(평균 2.2 돌연변이; 0-7) 사이의 돌연변이 수와 패턴에 유의적인 차이는 없었다(도 2 참조). 돌연변이된 유전자들 중 6개의 유전자는 107명의 MDS 환자 중 10% 이상의 환자에서 검출되었다; U2AF1 (19.6%), ASXL1 (18.7%), TET2 (15.9%), TP53 (12.1%), RUNX1 (11.2%) 및 SF3B1 (10.3%).
본 발명에서 확인된 돌연변이 빈도는 DNMT3A, DNMT1 , SRSF2 , IDH2 , 및 NPM1 (표 3 참조)와 같은 일부 예외를 제외하고는 다른 MDS 연구에서 동정된 것과 대체로 유사했다.
Figure pat00003
실험예 3-3. 저메틸화 제제 치료( HMT ) 반응성과 연관 있는 요인
상기 실험예 3-2.를 통해 검출된 유전자 돌연변이는 다른 MDS 연구에서 동정된 것과 대체로 유사하였지만, 이들 연구에서는 저메틸화 제제 치료(HMT) 반응성에 대하여는 언급한 바 없으며, 예후 예측을 위해 사용된다고 하더라도 일부 예후에 대하여만 보고되었다. 본 발명에서는 MDS 환자의 HMT 치료 반응성과 연관 있는 요인을 보다 구체적으로 선별하기 위해, 상기 검출된 유전자 돌연변이 중 HMT에 대한 반응성 여부에 따라 예후인자를 다시한번 선별하였다.
단일변량분석을 통해서는, SETBP1 돌연변이만이 HMT에 대한 비반응성과 유의하게 연관이 있는 것으로 나타났다(돌연변이 빈도: 반응성 환자 0% (0/57) vs. 비반응성 환자 8% (4/50), P=0.045) (표 4 및 5 참조). p.G870S(n=3)과 p.A1193T (n=1)을 포함하는 모든 SETBP 돌연변이는 COSMIC 데이터베이스에 제공된 4번 암호부위유전자에 나타나는 과오돌연변이로 나타났다(도 3A).
Figure pat00004
* 변수 분석을 위하여, P값이 0.1 미만인 변수(헤모글로빈, 혈소판, 저메틸화제, TP53, SETBP1 및 U2AF1 유전자의 돌연변이)를 다중 로지스틱 회귀 분석하였다. OR, 저메틸화제의 반응 비율.
Figure pat00005
Figure pat00006
* HMT, 저메틸화 치료; AML, 급성 골수성 백혈병; ANC, 절대 호중구 수; Hb, 헤모글로빈; PLT, 혈소판; IPSS-R, 개정된 국제예후점수시스템; VG, 매우 좋음; G, 좋음; INT, 중간; P, 나쁨; VP, 매우 나쁨; LR, 저위험; HR, 고위험; HMA, 저메틸화제; AZA, 아자시티딘; DAC, 데시타빈; 굵게 표시된 것은 P<0.05를 나타냄.
U2AF1 돌연변이는 비반응성 환자들에게서 더 빈번하게 나타났지만, 유의성은 경계에 머물렀다(반응성 환자 12.3% vs. 비반응성 환자 28%, P=0.052) (표 5 참조). p.S34F(n=12), p.S34Y(n=7) 그리고 p.Q157R(n=2)을 포함한 모든 U2AF1 돌연변이는 COSMIC 데이터베이스에 제공되어있는 과오돌연변이들이다 (그림 3B). 임상적 변수들 가운에, 낮은 헤모글로빈 수준(<10 g/dL) 및 낮은 혈소판 수(<50,000/μL)가 낮은 반응성과 유의하게 관련이 있는 것으로 나타났다(낮은 헤모글로빈 수준: 반응성 환자들의 수치 46.8% vs. 비반응성 환자들의 수치 71.4%, P=0.029; 낮은 혈소판 수치: 39.0% vs. 62.1%, P=0.028). 카이자승 검정법을 통해 얻은 P < 0.1의 값들만 사용한 다변량 분석을 통해서는 헤모글로빈 수준 10g/dL(OR 3.56, 95% CI 1.22-10.33, P=0.020)와 혈소판 수 <50,000/μL(OR 2.49, 95% CI 1.05-5.93, P=0.039)만이 MDS에서 HMT에 대한 양성 반응과 연관이 있는 것으로 나타났다(표 4 참조). 비록, TET2 돌연변이의 빈도는 다양한 인구로 진행된 이전 보고와 동일하게 나타났지만(표 3 참조), 이 돌연변이는 우리 연구에서는 HMT의 반응성과는 유의미하지 않은 것으로 나타났다. HMT에 대한 반응성과 연관이 있는 임상적 그리고 유전적 변수들은 표 5에 나타나있다.
다음, 우리는 HMA 타입(아자시티딘 처리 환자 66명과 데시타빈 처리 환자 41명)을 이용하여 서브그룹 분석을 진행하였다. U2AF1 돌연변이는 아자시티딘 복용 그룹의 비반응성과 유의하게 연관이 있었지만(돌연변이빈도: 감수성 환자 2.5% (1/40) vs 비감수성 환자 30.8% (8/26), P=0.002) 데시타빈 복용 그룹에서는 그렇지 못했다(P=0.507). 중요하게도, 여덟 명의 아자시티딘 복용 반응성 환자들은 MDS에 중요한 것으로 알려진 p.S34F/Y 돌연변이를 갖고 있었다(그림 3B). TET2, ASXL1, 그리고 RUNX1를 포함한 빈번하게 나타나는 돌연변이들은 아자시티딘이나 데시타빈을 처리한 그룹 모두에서 유의한 결과를 나타내지 못했다. 위와 동일하게 다변량 분석을 진행하였을 때, U2AF1 돌연변이만이(OR 14.96, 95% CI 1.67-134.18, P=0.016) MDS에서의 아자시티딘에 대한 반응성의 독립적인 예후 인자로 나타났다.
실험예 3-4. 급성 골수성 백혈병의 발병없이 생존하는 비율( 무AML )과 연관 있는 요인
예후와 관련된 요소를 확인하기 위해, 생존분석을 진행하였다. 치료의 중간기간은 HMT 시작 이후 2.28년(범위: 0.07~6.24년)이었다; 45명의 환자가 사망하였고, 28명의 환자는 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML)으로 발전하였다. 전체 환자의 2년 생존율과 무AML 생존율은 각각 62.4%와 71.3%였다. 단변량 분석법에서는 여섯 가지 돌연변이(DNMT1, P=0.012; DNMT3A, P=0.001; TP53, P=0.003; NPM1, P=0.029; NRAS, P<0.001; KRAS, P=0.001)가 저하된 전체생존율(Overall Survival, OS)과 유의하게 관련이 있는 것으로 나타났다(표 5 참조).
KRAS와 NRAS 돌연변이를 RAS 돌연변이로 병합하였을 때, RAS 돌연변이를 가진 환자들의 OS가 돌연변이가 없는 환자들에 비해 유의하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다(P<0.001) (표 5 참조). 이 돌연변이들에 더불어, 다섯 가지 임상적 변수(남성 성별, P=0.006; 연령 ≥60, P=0.004; BM 블라스트 ≥5%, P=0.029; IPSS-R 유전세포학적 위험성 낮음 (P) 혹은 매우 낮음 (VP), P=0.007; IPSS-R 높음 (H) 혹은 매우 높음 (VH), P=0.039)들이 단변량 분석에서의 낮은 OS와 연관이 있는 것으로 나타났다(표 5 참조). 후보 돌연변이와 단변량 분석에서 유의했던 임상적 변수들을 이용하여 다변량 분석을 진행했을 때, OS의 독립 예후 인자들은 DNMT1 (Hazard ratio [HR]=4.08, 95% CI 1.14-14.62, P=0.031), DNMT3A (HR=4.12, 95% CI 1.51-11.22, P=0.006), RAS (HR=2.76, 95% CI 1.03-7.37, P=0.043), 그리고 TP53 (HR=3.17, 95% CI 1.35-7.43, P=0.008) 돌연변이와 두 가지의 임상변수(남성-성별, HR=3.70, 95% CI 1.63-8.36, P=0.002 그리고 IPSS-R H/VH, HR=2.36, 95% CI 1.11-5.02, P=0.026)가 있었다(표 6). 네 가지 유전자의 돌연변이 유무와는 HMA의 종류나 치료 횟수와는 연관성이 없었다. OS와 유의하게 연관이 있었던 돌연변이들은 도 4에 나타나있다.
Figure pat00007
* 변량 생존율 분석은 카플란 마이어법으로 수행되었다.
a 콕스 비례위험 모델은 단변량 분석에서 P값이 0.1 미만인 변수들로 수립되었다.
IPSS-R, 개정된 국제예후점수시스템; VL, 매우 낮은; L, 낮은; INT, 중간; H, 높은; VH, 매우 높은; WT, 야생형; MT, 돌연변이형.
다변량 분석을 통해 DNMT3A (P<0.001), STAG2 (P<0.001), NPM1 (P=0.042) 그리고 NRAS (P<0.001) 돌연변이를 갖고 있는 환자들은 낮은 무AML 생존율을 보였다 (표 5). RAS 돌연변이는 낮은 AFS(P<0.001)과도 연관이 있었다. 두 임상변수(BM 블라스트 ≥5%, P=0.015 그리고 IPSS-R H/VH, P=0.044)는 다변량 분석을 통해 낮은 AFS와 연관이 있는 것으로 나타났다 (표 5). 다변량 분석을 통해, DNMT3A (HR=12.81, 95% CI 4.04-40.63, P<0.001), TP53 (HR=2.80, 95% CI 1.01-7.75, P=0.047), 그리고 RAS (HR=7.04, 95% CI 2.24-22.12, P=0.001) 돌연변이들과, 두 개의 임상적 변수 (남성-성별, HR=2.85, 95% CI 1.15-7.09, P=0.024 그리고 IPSS-R H/VH, HR=6.30, 95% CI 1.77-22.52, P=0.005)들이 낮은 AFS에 대한 독립적 예후 요소들인 것으로 확인되었다 (표 6). AFS와 관련된 유의한 돌연변이들은 도 5에 나타나있다.
치료 반응성을 예측하기 위한 위험성 평가 시스템
아자시티딘에 의한 반응성을 예측하기 위해, 우리는 치료 반응성과 연관이 있는 것으로 밝혀진 임상적 그리고 유전적 요소들(U2AF1 돌연변이, 헤모글로빈 수치 그리고 혈소판 수치)을 이용한 수치적 평점법을 수행하였다. 다변량 분석을 통해 구해진 OR의 경우에는, 환자를 네 가지 그룹으로 나누었다; 그룹 1(헤모글로빈 ≥10g/dL, 혈소판 수치 ≥50,000/μL, 그리고 U2AF1 야생형), 그룹 2(헤모글로빈 <10g/dL 또는 혈소판 수치 <50,000/μL, 그리고 U2AF1 야생형), 그룹 3(헤모글로빈 <10g/dL, 혈소판 수치 <50,000/μL, 그리고 U2AF1 야생형), 그리고 그룹 4(임상적 요소들을 배제한 U2AF1 돌연변이). 구체적인 분류 기준은 하기 표 7에 기재하였다.
Figure pat00008
도 6A에 보이는 바와 같이, HMT 반응성 환자에 대한 비율은 그룹에 따라 유의하게 다르게 나타났다: 그룹 1에서 85.7% (12/14), 그룹 2에서 70.0% (21/30), 그룹 3에서 46.2% (6/13), 그리고 그룹 4에서는 11.1% (1/9)(P=0.002).
생존율을 예측하기 위한 위험성 평가 시스템
생존율을 측정하기 위해 유사한 평점법을 도입하였다. 남성 성별과, IPSS-R H/VH 그리고 각 네 가지 유전자(DNMT1, DNMT3A, RAS, 그리고 TP53)에 대한 돌연변이에 대해서는 각각 1 점씩 주어졌고, 여성 성별, IPSS-R VL/L/Int 그리고 야생형 네 가지 유전자에 0점이 주어졌다. 점수의 전체 합을 바탕으로, 환자들을 네 그룹으로 나누었다; 위험이 낮음 (전체 합=0), 중간-1 (전체 합=1), 중간-2 (전체 합=2) 그리고 높음 (전체 합≥3). 구체적인 분류 기준은 하기 표 8에 기재하였다.
Figure pat00009
도 6B에 보이는 바와 같이, 전체 점수의 합이 증가할수록, OS(P<0.001)와 AFS(P<0.001)가 점수에 비례해서 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
[ 비교예 1]
비특허문헌 002에 제시된 저메틸화 치료 반응성 예측 점수 시스템
비특허문헌 002(F. Traina, Impact of molecular mutations on treatment response to DNMT inhibitors in myelodysplasia and related neoplasms, Leukemia(2015) 28, 78-87)에 기재된 저메틸화 치료 반응성 예측 점수 시스템은 하기 표 9에 기재한 바와 같다.
Figure pat00010
[ 비교예 2]
비특허문헌 001에 제시된 저메틸화 치료 반응성 예측 점수 시스템
비특허문헌 001에 기재된 예후 예측 점수 시스템은 하기 표 10에 기재한 바와 같다.
Figure pat00011
[ 비교예 3]
비특허문헌 002(F. Traina, Impact of molecular mutations on treatment response to DNMT inhibitors in myelodysplasia and related neoplasms, Leukemia(2015) 28, 78-87)에 기재된 예후 예측 점수 시스템은 하기 표 11에 기재한 바와 같다.
Figure pat00012
[ 실험예 4]
실시예 1과 비교예 1의 예측 정확도 비교
본 발명자는 본 발명의 실시예 1에 제시한 저메틸화 치료 반응성 점수 시스템이 비교예 1로 나타나는 기존 예측법에 비해 얼마나 더 정확하게 예측 가능한지를 알아보고자 하였다.
골수형성이상 증후군의 치료 반응성 점수 시스템 모델로는 비특허문헌 002(F. Traina, Impact of molecular mutations on treatment response to DNMT inhibitors in myelodysplasia and related neoplasms, Leukemia(2015) 28, 78-87)의 예후예측 모델이 알려져 있으며, 이 모델은 혈소판수, 백혈구수 및 TET2, DNMT3A 돌연변이 유무를 기반으로 치료 반응을 예측한다. 이 모델에서는 위험 점수를 기준으로 3개 그룹으로 위험도를 분류한다(표 9 참조).
본 발명에서 제시하는 실시예 1의 치료 반응성 점수 시스템에서는 헤모글로빈과 혈소판구 및 U2AF1 돌연변이를 기반으로 치료 반응을 예측하며, 위험 점수별로 4개의 그룹으로 분류한다(표 7 참조).
두 모델간 비교는 한국인 골형성이상증후군 전체 환자(107례)를 대상으로 분석되었으며, 비교예 1을 한국인 샘플셋에 적용한 결과 선형 연관(linear-by-linear association) 값이 0.891로 유의한 결과를 얻을 수 없었다(표 12). 이와 같은 결과는 비교예 1의 예측 모델로는 한국인에는 적합하지 않다는 것을 의미한다. 본 발명에서 새롭게 제시한 치료 반응 예측 scoring system을 동일한 샘플셋에 적용한 결과 선형 연관 값이 0.001미만으로 유의한 결과를 나타내었다(표 13).
한국인 골형성이상증후군에 비교예 1 시스템을 적용한 결과
총점 위험군 인원수( % ) 반응 인원수( % ) P 3
0 또는 1 Favorable 33(30.8%) 19(57.6%)
2 Intermediate 53(49.5%) 26(49.1%)
3 Unfavorable 21(19.6%) 12(57.1%) 0.891
한국인 골형성이상증후군에 실시예 1 시스템을 적용한 결과
총점 위험군 인원수( % ) 반응 인원수( % ) P 3
0 Favorable 16(15.0%) 14(87.5%)
1 Intermediate-1 48(44.9%) 28(58.3%)
2 Intermediate-2 22(20.6%) 8(36.4%)
≥5 Unfavorable 21(19.6%) 7(33.3%) <0.001
두 모델간 민감도, 특이도, 정확도 비교를 위해 각 모델을 2개의 군(반응군, 비반응군)으로 나누었다. 이를 위해 비교예 1의 점수 시스템에서 'favorable' 그룹을 반응군, 'unfaborable' 그룹을 비반응군으로 하였으며 'intermediate' 그룹은 분석에 넣지 않았다. 본 발명의 실시예 1의 점수 시스템에서는 'favorable'과 'intermediate-1' 그룹을 반응군, 'intermediate-2'와 'unfavorable' 그룹을 비반응군으로 하였다.
분석 결과, 하기 표 14에 보이는 바와 같이, 실시예 1이 비교예 1에 비해 민감도 특이도 정확도가 모두 높았을 뿐 아니라 'intermediate' 그룹까지 모두 사용함으로써 적용 범위를 넓힐 수 있었다. 따라서 본 발명에서 새롭게 제시한 치료 반응 예측 점수 시스템은 기존 예측 모델에 비해 더욱 정확한 예측을 세분화되게 할 수 있어 효과적이다.
한국인 골수형성이상 증후군에서 두 시스템간 민감도, 특이도 및 정확도 비교
민감도 특이도 정확도
비교예 1
(Favorable 33례 vs. Unfavorable 21례)		 61.3% 39.1% 51.9%
실시예 1
(Favorable 16례, Int-1 48례 vs. Int-2 22례, Unfavorable 21례)		 73.7% 56.0% 65.4%
정리하면, 본 발명의 실시예 1에 제시된 유전자 U2AF1은 아자시티딘(azacitidine)에 대한 비반응과 유의적으로 연관되어있었다. 따라서 이 유전자를 포함하는 본 발명의 시스템은 아자시티딘에 대한 치료 반응성을 더욱 정확히 예측할 수 있다. 실제로 아자시티딘을 투여받은 환자들로(66례) 점수 시스템을 적용한 결과 민감도와 특이도 정확도가 월등히 높았다(표 15, 16, 17 참조).
아자시티딘 투여군에 비교예 1 시스템을 적용한 결과
총점 위험군 인원수( % ) 반응 인원수( % ) P 3
0 or 1 Favorable 22(33.3%) 14(63.6%)
2 Intermediate 33(50.0%) 20(60.6%)
3 Unfavorable 11(16.7%) 6(54.5%) 0.717
아자시티딘 투여군에 실시예 1 시스템을 적용한 결과
총점 위험군 인원수( % ) 반응 인원수( % ) P 3
0 Favorable 14(21.2%) 12(85.7%)
1 Intermediate-1 30(45.5%) 21(70.0%)
2 Intermediate-2 13(19.7%) 6(46.2%)
3 Unfavorable 9(13.6%) 1(11.1%) <0.001
아자시티딘 투여군에서 두 시스템간 민감도, 특이도 및 정확도 비교
민감도 특이도 정확도
비교예 1
(Favorable 22례 vs. Unfavorable 11례)		 70.0% 38.5% 57.6%
실시예 1
(Favorable 14례, Int-1 30례 vs.
Int-2 13례, Unfavorable 9례)		 82.5% 57.7% 72.7%
[ 실험예 5]
실시예 2와 비교예 2, 3의 예측 정확도 비교
본 발명자들은 본 발명의 실시예 2가 기존 예측 방법에 비해 더욱 정확한 예측이 가능한지를 알아보고자 하였다. 골수형성이상 증후군의 예후예측 모델로는 비교예 2에 기재한 비특허문헌 001의 IPSS-R(Revised International Prognostic Scoring System)과 비교예 3에 기재한 비특허문헌 002(F. Traina, Impact of molecular mutations on treatment response to DNMT inhibitors in myelodysplasia and related neoplasms, Leukemia(2015) 28, 78-87)의 예후 예측 모델이 알려져 있다.
본 발명의 실시예 2와 종래의 예측 모델(비교예 2 및 3)간 비교는 한국인 골수형성이상 증후군 전체 환자(107례)를 대상으로 하였으며 전체 생존율 및/또는 급성골수성 백혈병의 발병 없이 생존하는 비율(AML-free survival)을 분석하였다.
비교예 2 모델에서는 세포유전학적 요인, BM 블라스트, 헤모글로빈, 혈소판 및 ANC를 기반으로 예후를 예측하며, 위험 점수 별로 5개의 그룹으로 분류하였다(표 10 참조). 비교예 3 모델에서는 세포 유전학적 위험, 나이, 헤모글로빈, SF3B1 및 ASXL1 돌연변이 유무를 기반으로 예후를 예측하며, 위험 점수 12점을 기준으로 두 그룹으로 분류한다(표 11 참조).
본 발명의 실시예 2 모델에서는 성별, IPSS-R, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 돌연변이 유무를 기반으로 예후를 예측하며 위험 점수 별로 4개의 그룹으로 분류한다(표 8 참조).
각 모델간 전체 생존율 비교 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 2 모델이 가장 유의한 결과를 나타낸 반면(P=1.8x10 -12 ), 실시예 비교예 3의 모델은 통계적 유의성을 나타나지 않았다(P=0.078). 비교예 2의 모델은 전체 생존율 예측에 통계적 유의성을 나타냈으나(P=0.032), 실시예 2 모델에 비해서는 유의성이 현저히 낮았다. 이와 같은 결과는 한국인 골수형성이상 증후군의 예후 예측에 본 발명에서 제시하는 실시예 2의 모델이 가장 우수하다는 것을 의미한다.
다음으로 급성골수성백혈병의 발병 없이 생존할 가능성(AML-free survival)을 분석하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 2 모델에서 급성골수성백혈병의 발병 없이 생존할 가능성을 유의하게 예측하였다(P=4.0x10 -12 ). 비교예 3 모델(P=0.941)과 비교예 2 모델(P=0.194)은 급성골수성백혈병의 발병 없이 생존할 가능성 분석에서 통계적 유의성을 확인할 수 없었다. 이것은 본 발명에서 제시하는 실시예 2의 예후 예측 모델이 전체 생존율뿐만 아니라 급성골수성백혈병의 발병 없이 생존할 가능성도 정확하게 예측할 수 있음을 의미한다.

Claims (13)

  1. U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오 마커에 대한 검출 시약을 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 검출 시약은 바이오 마커의 돌연변이 여부를 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인 것을 특징으로 하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 바이오 마커의 핵산 수준 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay),　in situ　교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인 것을 특징으로 하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 조성물.
  4. U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오 마커를 포함하는, 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후 예측용 유전자 패널.
  5. 제1항의 조성물 또는 제 4항의 유전자 패널을 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후의 예측용 키트.
  6. 환자로부터 얻은 유전자 시료에서,
    U2AF1, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군 중 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에서 돌연변이를 확인하는 단계를 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 환자는 아시아인 환자인 것을 특징으로 하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 저메틸화 제제는 아자시티딘(Azacitidine) 또는 데시타빈(Decitabine)인 것을 특징으로 하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 돌연변이를 확인하는 단계에서, U2AF1 유전자에 돌연변이가 존재할 경우, 저메틸화 제제에 대한 반응이 없을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 돌연변이를 확인하는 단계에서, DNMT1, DNMT3A, RAS 및 TP53 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 돌연변이가 존재할 경우, 생존 예후가 나쁜 것으로 예측하는 단계를 포함하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 예측하는 단계에 비마커 임상 정보를 추가로 사용하는 것을 특징으로 하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 비마커 임상 정보는 헤모글로빈 수치, 혈소판 수치, 성별 정보 및 개정된 국제예후점수시스템(Revised international prognostic scoring system, IPSS-R) 정보로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 생존예후를 예측하는 방법은 하기의 위험　점수를 합산하여 점수가 0이면 저위험군, 점수가 1이면 중저위험군, 점수가 2이면 중고위험군, 점수가 3 이상이면 고위험군으로 분류하여 예후를 예측하는 것을 특징으로 하는 골수형성이상 증후군 환자의 저메틸화 제제에 대한 반응성 및 생존 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법:
    a) 남자일 경우 1, 여자일 경우 0;
    b) IPSS-R 수치가 높음 이상일 경우 1, 중간 이하일 경우 0;
    c) DNMT1 유전자가 돌연변이일 경우 1, 아닐 경우 0;
    d) DNMT3A 유전자가 돌연변이일 경우 1, 아닐 경우 0;
    e) RAS 유전자가 돌연변이일 경우 1, 아닐 경우 0; 및
    f) TP53 유전자가 돌연변이일 경우 1, 아닐 경우 0.
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