KR20180061364A - 타우 영상화를 위한 아제티딘 유도체 - Google Patents

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샤마리 고쉬
캐리 호르힐러
후이 시옹
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 하기 화학식의 신규 화합물, 이 화합물의 제조 방법, 타우 영상화를 위한 이 화합물의 이용 방법, 및 타우 영상화 제제의 제조를 제공한다.

Description

타우 영상화를 위한 아제티딘 유도체
본 발명은 신규 화합물 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 및 18F 표지된 버전 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘, 및 이들 화합물의 제조를 위한 중간체, 및 타우 영상화를 위한 이들 화합물의 이용 방법, 및 진단 영상화를 위한 이들 화합물의 조성물 및 제제, 및 이들 화합물, 조성물 및 제제를 이용하는 영상화 방법에 관한 것이다.
치매의 주요 원인인 알츠하이머병 (AD)은 65세와 69세 사이의 인구의 1%에서 발병하며, 95세 이상에서는 40 내지 50%로 증가한다. AD 환자는 인지 장애 및 기억 기능에서의 결핍을 비롯한 숨길 수 없는 임상 증상을 나타낸다. 이들 환자에서, AD의 존재는 사후 조직병리학적 검사 시에 뇌 피질에서 발견되는 심한 노인성 플라크 부담 및 신경원섬유 엉킴 (NFT)에 의해 확인된다. 성숙 노인성 플라크는 과인산화 타우 단백질의 필라멘트로부터 유도된 세포내 신경원섬유 엉킴 (NFT) 및 아밀로이드 전구체 단백질의 효소적 프로세싱으로부터 유도된 세포외 β-아밀로이드 펩티드로 이루어진다. 과인산화 타우의 응집체, 예컨대 신경원섬유 엉킴은 알츠하이머병에서의 인지 장애의 정도와 관련된다. AD 및 다양한 다른 타우병증에서, 타우 응집체는 질환 위험, 발병 및/또는 진행과 관련된 특정 뇌 영역에서 및 특정 패턴으로 나타나며, 이러한 영역 및 패턴은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. AD 환자에서, 타우를 함유하는 엉킴은 먼저 기억에 밀접하게 관련된 뇌 영역에서 나타나고, 병리학적 연구는 플라크보다 엉킴들이 인지와 훨씬 더 강하게 상호관련될 수 있다는 것을 제시한다. 통상의 기술자는 이러한 영역 및 패턴에서 타우 영상화제로부터 발생하는 신호를 이용하여, 특정 질환 상태의 위험, 발병 및 진행을 보다 잘 모니터링하고 진단할 수 있다. (Correlation of Alzheimer disease neuropathologic changes with cognitive status: a review of the literature. Nelson PT, et al., J Neuropathol Exp Neurol . 2012 May; 71(5):362-81 참조). 따라서, 환자 내 타우 침착물을 검출 및/또는 정량화하기 위한 간단하고 비침습적인 방법이 열심히 모색되었다. (M . Maruyama et al., "Imaging of tau pathology in a tauopathy mouse model and in Alzheimer patients compared to normal controls", Neuron, 79: 1094 -1108, 2013, C. Mathis and W. Klunk , "Imaging Tau Deposits In Vivo : Progress in Viewing More of The Proteopathy Picture", Neuron, 79: 1035-10-37, 2013 참조).
타우의 PET 영상화를 위한 기존 작용제는 관련 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어 이러한 작용제는 WO2009/102498에 언급되어 있고, 최근 임상 평가 중인 화합물 [18F]T807 (또한 AV-1451로 알려짐)이 WO 2013/176698에 언급되어 있다. (또한, [( 18)F ]T807, a novel tau positron emission tomography imaging agent for Alzheimer's disease. Xia CF, et al., Alzheimer's Dement . 2013 Nov; 9(6):666-76 참조).
Figure pct00001
그러나, 기존의 타우 영상화 화합물은, 개선된 타우 시그널링 및 최소의 비-타우 시그널링을 갖는 향상된 타우 영상을 제공할 수 있는 혁신적인 작용제의 설계에 의해 개선될 수 있다는 기술적 특성을 갖는다. 따라서, 환자 내 타우를 검출 및/또는 정량화하기 위한 개선된 방법이 열심히 모색되었다.
개선된 영상화제를 이용하여 뇌 내 타우를 영상화하는 것에는 여러 잠재적 이익이 존재한다. 향상된 타우 영상화는 AD 발병 확률이 증가할 가능성이 있는 잠재적 환자, 즉 뇌에 높은 수준의 타우를 가진 환자를 확인함으로써 진단을 개선시킬 것이다. 개선된 PET 작용제를 이용한 영상화는 또한 타우 축적 및 국재화, 및/또는 AD 및/또는 다른 타우병증의 진행을 모니터링하는 데 유용할 것이며, 항-타우 약물 치료가 이용가능해질 경우, 타우 영상화는 치료를 모니터링하기 위한 필수 도구를 제공할 수 있다.
본 발명은 타우 영상화를 위한 신규 화합물, 조성물, 제제 및 방법을 제공한다. 그러므로, 환자 내 타우를 영상화하는 능력을 향상시키는 개선된 기술이 또한 진단용 타우 영상화제의 임상 이익 및 영향을 확장시키는 데 필요하다. 개선된 영상화제는 강한 타우 신호 및 감소된 비-타우 신호로 인해 보다 우수한 선명도를 갖는 영상을 생성하며, 공지된 작용제에 비해 향상된 타우 영상을 제공할 것이다.
본 발명은, 본원에서 "화합물 8"로도 지칭되는, 화학식 I의 화합물로 구조적으로 나타내어질 수 있는 화합물 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 제공한다.
Figure pct00002
본 발명은 또한 본원에서 "화합물 4"로도 지칭되는, 화학식 II의 화합물로 구조적으로 나타내어질 수 있는 화합물 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 제공한다.
Figure pct00003
본 발명은 타우 영상화제의 제조 및 타우 PET 영상화를 위한 화학식 I의 화합물 및/또는 화학식 II의 화합물, 및/또는 그의 혼합물의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물의 제조를 위한 중간체를 추가로 제공한다. 본 발명은 화학식 7의 화합물로부터 제조된 화학식 II의 화합물 (이하 화합물 8로 나타냄)을 제공한다.
Figure pct00004
본 발명은 화학식 Ia 또는 화학식 Ib의 화합물로부터 제조된 화학식 I의 화합물을 추가로 제공한다. 본 발명의 바람직한 종은 화학식 Ia의 화합물이다.
Figure pct00005
본 발명의 또 다른 바람직한 종은 화학식 Ib의 화합물이다.
Figure pct00006
본 발명은 인간 내 타우의 영상화를 위한 방사성제약 작용제의 제조를 위한 화학식 I, Ia, Ib 또는 II의 화합물의 용도를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 I, Ia, Ib 또는 II의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물로부터 화합물 8을 제조하는 방법을 제공한다. 특히 바람직하게는, 화학식 Ia의 화합물로부터 화합물 8 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 화합물 8 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서 본 발명은 화합물 8 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 화합물 4 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 0.9% 염화나트륨 중 0.45% (w/v) 아스코르브산나트륨, 10% EtOH (v/v)에서 제제화된, 화합물 8 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 바람직하게는 인간에게 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 0.9% 염화나트륨 중 0.45% (w/v) 아스코르브산나트륨, 10% EtOH (v/v)에서 제제화된, 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물로부터 제조된 화합물 8 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 바람직하게는 인간에게 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 바람직하게는 화학식 Ia 또는 Ib의 화합물로부터 제조된 화합물 8 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 그의 조성물의 검출가능한 양을 환자에게 도입하는 것을 포함하는 타우를 영상화하는 방법을 제공한다.
본 발명은 화학식 I의 화합물의 제조 방법으로서,
Figure pct00007
하기 화학식에 의해 나타내어지는 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-일 4-메틸벤젠술포네이트:
Figure pct00008
를 [18F]플루오라이드의 공급원과 반응시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 화학식 I의 화합물의 제조 방법으로서,
Figure pct00009
하기 화학식 Ib의 화합물:
Figure pct00010
을 [18F]플루오라이드의 공급원과 반응시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 타우의 영상화 방법으로서,
하기 화합물의 검출가능한 양을 포유동물에게 투여하고,
Figure pct00011
상기 화합물이 타우와 회합되기에 충분한 시간이 경과되도록 두고,
상기 화합물을 검출하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
하기 반응식, 제조예 및 실시예는 본 발명의 실시를 보다 잘 설명하기 위해 제공된다. 이들 반응식, 제조예 및 실시예의 단계에 적합한 반응 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 통상의 기술자는 용매 및 공-시약의 대체를 비롯한 반응 조건을 적절히 변형시킬 능력이 있다.
또한, 통상의 기술자는 일부 상황에서 모이어티가 도입되는 순서가 결정적인 것은 아님을 인식할 것이다. 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물의 제조에 요구되는 단계들의 특정한 순서는, 통상의 화학자에 의해 잘 인식되는 바와 같이, 합성될 특정한 화합물, 출발 화합물, 및 치환 모이어티의 상대적 불안정성에 따라 달라진다. 통상의 기술자는 모든 치환기가 모든 반응 조건에 상용적이지는 않다는 것을 인식할 것이다. 이들 화합물은 합성 시 알맞은 시점에 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 보호 또는 변형될 수 있다. 본 발명의 중간체 및 최종 생성물은 바람직한 경우에 통상의 기술, 예컨대 재결정화, 또는 실리카 겔 또는 알루미나 등의 고체 지지체 상에서의 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 다양한 경로에 의해 투여되는 방사성제약 조성물로서 제제화된다. 바람직하게는, 이러한 조성물은, 바람직하게는 인간에서의 정맥내 사용을 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (P.P. Gerbino, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2006)를 참조할 수 있다. 타우의 PET 영상화를 위해 타우 영상화제를 이용하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, [( 18)F ]T807, a novel tau positron emission tomography imaging agent for Alzheimer's disease. Xia CF, et al., Alzheimer's Dement. 2013 Nov; 9(6):666-76을 참조할 수 있다. [(18)F]T807은 [18F]AV-1451로도 알려져 있다.
본 발명의 바람직한 제제는 화학식 Ia의 화합물로부터 제조된 화합물 8의 제조물이다. 특히 바람직하게는 반응식 2에 기재된 절차에 따라 화학식 Ia의 화합물로부터 제조된 화합물 8이다. 특히 바람직하게는 실시예 2에 따른 본원에 기재된 절차에 따라 화학식 Ia의 화합물로부터 제조된 화합물 8이다. 화합물 8의 바람직한 제제는 0.9% 염화나트륨 중 0.45% (w/v) 아스코르브산나트륨, 10% EtOH (v/v) 중에서, 바람직하게는 인간에게 사용하기 위해 제제화된다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 화학식 Ia의 화합물로부터 제조되고 0.9% 염화나트륨 중 0.45% (w/v) 아스코르브산나트륨, 10% EtOH (v/v) 중에서 제제화된 화합물 8의 제제이다. 특히 바람직하게는 반응식 1에 따른 본원에 기재된 절차에 따라 제조된 화합물 4이다. 특히 바람직하게는 실시예 2에 따른 본원에 기재된 절차에 따라 화학식 Ia의 화합물로부터 제조되고 0.9% 염화나트륨 중 0.45% (w/v) 아스코르브산나트륨, 10% EtOH (v/v) 중에서 제제화된 화합물 8이다. 본 발명은 본원의 실시양태에 따라 기재된 바와 같은 진단 조성물의 검출가능한 양을 포유 동물에게 도입하고, 상기 진단 조성물이 타우와 회합되기에 충분한 시간이 경과되도록 두고, 진단 조성물을 검출하는 것을 포함하는 타우의 영상화 방법을 제공한다. 특히 바람직하게는 실시예 2에 따른 본원에 기재된 절차에 따라 화학식 Ia의 화합물로부터 제조되고 0.9% 염화나트륨 중 0.45% (w/v) 아스코르브산나트륨, 10% EtOH (v/v) 중에서 제제화된 화합물 8의 조성물의 검출가능한 양을 포유 동물에게 도입하는 것을 포함하는 타우의 영상화 방법이다.
화학식 I 및 II의 신규 화합물이, 바람직하게는 인간 임상 영상화를 비롯한, 타우 영상화에서 놀랍게도 예기치 않게 유리하다는 것을 발견하였다. 본원에서 화합물 8로도 지칭되는, 바람직한 화합물인 화학식 I의 화합물은 높은 타우 친화도, 선택성, 흡수, 소실 및 대사 프로파일을 포함한, 타우 영상화에 특히 유리한 특성들의 조합을 갖는다. 생체내에서 화합물 8은 유리한 조직 분포, 약동학 및 대사 안정성을 나타낸다. 생체외 및/또는 시험관내에서, 화합물 8은 타우에 높은 친화도로 결합했으며, AD 뇌로부터의 타우 함유 조직 샘플을 Aβ 및/또는 비-타우 결합에 비해 높은 선택성으로 표지한다. 화합물 8은 타우에 대해 높은 친화도 및 선택성을 나타내며, 질환 상태, 조직 및 세포 위치 특이적인 방사선촬영 신호를 나타낸다. 화합물 8에 의해 생성되는 방사선촬영 신호는 바람직하지 않은 비-타우 신호에 비해 개선된 타우 검출, 및 임상 방사성제약 영상화제에 유용한 생체내 조직 분포 및 대사 프로파일을 반영한다. 특히 유용한 특성의 이러한 조합을 갖는 화합물 8은 강한 타우 신호 및 감소된 비-타우 신호로 인해 개선된 선명도를 갖는 영상을 생성하며, 공지된 작용제에 비해 향상된 타우 영상을 제공한다. 이러한 놀랍게도 유리한 특성의 조합은, 타우에 대한 환자의 영상화를 용이하게 하는 효과적인 임상 타우 영상화제를 제공한다. 임상 타우 PET 영상화에서 화합물 8을 이용하는 것은 AD의 평가 및 또는 진단에 중요한 긍정적 영향을 미칠 것이며, 타우의 검출, 치료, 모니터링 및 평가, 및 타우와 관련된 질환의 진단을 발전시킬 것이다.
도 1: 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8) 방사성합성의 대표적 반정제용 HPLC 크로마토그램. 상부 패널은 감마 검출을 이용한 HPLC 크로마토그래프를 도시한다. 하부 패널은 UV 검출을 이용한 HPLC 크로마토그래프를 도시한다. "컷 피크"로 표시한 구간은 생성물 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)을 수득한 상응하는 수집 분획을 나타낸다.
도 2: 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 대표적 분석용 HPLC (QC) 크로마토그램. (HPLC 감마 검출기)로 표지된 상부 패널은 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 라디오-크로마토그램을 도시한다. (HPLC UV 검출기)로 표지된 하부 패널은 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 자외선 크로마토그램을 도시한다. 상부 패널의 주요 피크에 6.589분의 피크 체류 시간이 표시되었고, 하부 패널의 주요 피크에 6.607분의 피크 체류 시간이 표시되었다.
도 3: Kd 결정을 위한 AD 뇌 절편 상에서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8) 자가방사선촬영. 실험 설정 및 분석에 대한 설명은 검정 실시예 4를 참조.
도 4: 선택성 결정을 위한 AD 뇌 절편 상에서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 자가방사선촬영. 실험 설정 및 분석에 대한 설명은 검정 실시예 5를 참조.
도 5: 선택성 결정을 위한 AD 뇌 절편 상에서의 3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 자가방사선촬영. 실험 설정 및 분석에 대한 설명은 검정 실시예 5를 참조.
도 6: 선택성 결정을 위한 AD 뇌 절편 상에서의 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 자가방사선촬영. 실험 설정 및 분석에 대한 설명은 검정 실시예 5를 참조.
도 7: 정상 뇌 절편 대 AD 뇌 절편 상에서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘, 화합물 8 자가방사선촬영. 실험 설정 및 분석에 대한 설명은 검정 실시예 6을 참조.
도 8: 정상 뇌 절편 대 AD 뇌 절편 (무알콜 세척 사용) 상에서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8) 및 [18F]AV-1451 (또한 [18F]T807로도 알려짐), 자가방사선촬영. 실험 설정 및 분석에 대한 설명은 검정 실시예 6을 참조.
도 9: 3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (일명 T821) 대 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 마우스 PET/CT 시간 방사능 곡선.
도 10: 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (일명 T798) 대 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 마우스 PET/CT 시간 방사능 곡선.
실시예 및 제조예
일반적 방법
모든 반응은 달리 나타내지 않는 한 질소 분위기 하에 수행되었다. 생성물은 자동화 텔레다인 이스코 플래쉬(Teledyne Isco Flash)® 크로마토그래피 시스템을 사용하여 정제하였다. 1H, 19F 및 13C NMR 스펙트럼은, CDCl3 (캠브리지 이소토프 래보러토리즈(Cambridge Isotope Laboratories), 카탈로그 번호 DLM-7-100) 또는 DMSO-d6 (캠브리지 이소토프 래보러토리즈, 카탈로그 번호 DLM-10-25) 중에서, 브루커(Bruker)® HD 아반스(Avance) III 400 분광계에서 기록하였다. HRMS 데이터는 워터스(Waters)® QTof 질량 분광계에서 전기분무 이온화 양성 스캔 모드를 사용하여 획득하였다. 원소 분석은 갤브레이스 래보러토리즈(Galbraith Laboratories)에서 GLI 절차 ME-14 (겔브레이스 인크.(Galbraith Inc.), 미국 테네시주 녹스빌 2323 시카모어 드라이브, 37921)를 이용하여 수행하였다. 시약, 용매 및 공급원은 통상의 화학자에게 알려져 있다. 본 발명의 화합물에 대한 명칭은 IUPAC 명명 기능을 갖는, 예를 들어, 시믹스(Symyx) 버전 3.2.NET를 사용하여 생성할 수 있었다.
약어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적이고 보편적인 용법으로 사용되며, 본원에 사용된 특정 약어는 하기 의미를 갖는다.
약어:
BPV 벌크 생성물 바이알
bs 넓은 단일선
CDCl3 중수소화 클로로포름
CH2Cl2 메틸렌 클로라이드
d 이중선
DAD 다이오드 어레이 검출기
dd 이중선의 이중선
dt 삼중선의 이중선
DMPAO [(2,6-디메틸페닐)아미노](옥소)아세트산
DMSO 디메틸 술폭시드
DMSO-d6 헥사듀테로디메틸 술폭시드
EtOH 에탄올
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
HRMS 고해상도 질량 분광측정법
IHC 면역조직화학
K2CO3 탄산칼륨
LCMS 액체 크로마토그래피 질량 분광측정법
N 노르말
NMR 핵 자기 공명
PHF 쌍형성된 나선형 필라멘트
ppm 백만분율
QTof 사중극자 비행 시간
s 단일선
SUV 표준 흡수 값
SUVr 표준 흡수 값 비
t 삼중선
UPLC 초고성능 액체 크로마토그래피
PBS 포스페이트 완충 염수
WFI 주사용수
반응식
반응식 1은 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성을 제공한다. 합성은 상업적으로 입수가능한 2-브로모-4-메틸아닐린과 2,4-디브로모피리딘의 구리 촉매된 커플링에 이은 분자내 고리화를 통한 벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 코어의 형성으로 시작된다. 목적 생성물인 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘은 3-브로모-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (3) 및 3-플루오로아제티딘 히드로겐 클로라이드의 제2 구리 촉매된 커플링을 통해 수득된다. 실리카 겔 상 칼럼 크로마토그래피, 쿼드라실(Quadrasil) MP 수지를 이용한 금속 스캐빈징 및 연화처리 후, 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 4)을 황색 고체 로서 수득한다 (4.44 g, 21% 전체 수율).
반응식 1: 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성.
Figure pct00012
반응식 2는 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-일 4-메틸벤젠술포네이트의 합성을 제공하는데, 이는 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘에 대한 전구체이다. 3-브로모-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (3) 및 3-히드록시아제티딘의 구리 촉매된 커플링은 히드록실 중간체 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-올 (5)을 제공하고, 이는 또한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이어서, 깨끗한 중간체를 토실 무수물 및 트리에틸아민과 반응시킨 후, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 목적 생성물인 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-일 4-메틸벤젠술포네이트 (6)를 베이지색 고체로서 수득한다 (3.21 g, 31% 전체 수율).
반응식 2: 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-일 4-메틸벤젠술포네이트 (6)의 합성.
Figure pct00013
반응식 3에 따라, 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘인 화합물 8을, R이 적합한 이탈기인 화학식 7의 화합물로부터 제조한다. 보다 구체적으로, R이 이탈기, 예컨대 메탄술포닐 (메실) 또는 4-메틸벤젠술포닐 (토실)인 화학식 7의 화합물을 적합한 염기, 예컨대 탄산칼륨의 존재 하에 18F 플루오라이드 ([18F]F-)의 적합한 공급원과 반응시킬 수 있다. 18F 플루오라이드 ([18F]F-)의 공급원은 [18F]F K222를 포함한다. 적합한 용매는 디메틸술폭시드를 포함한다.
반응식 3: 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (8)의 합성.
Figure pct00014
실시예 1
3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 4)의 합성.
Figure pct00015
단계 1: 3-브로모-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 3)의 합성.
Figure pct00016
1 L 둥근 바닥 플라스크에서, 2,4-디브로모피리딘 (20.0 g, 84.6 mmol), 아이오딘화구리 (3.22 g, 16.9 mmol), 1,10-페난트롤린 (6.10 g, 33.8 mmol), 탄산세슘 (110 g, 338 mmol), 셀라이트® (16 g) 및 p-크실렌 (170 mL)을 합하였다. 생성된 슬러리에 2-브로모-4-메틸아닐린 (10.6 mL, 84.6 mmol)을 첨가하고, 질소를 격렬히 교반되는 혼합물을 통해 10분 동안 버블링하였다. 플라스크에 환류 응축기를 장착하고, 시스템을 135℃에서 24시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하였다. 필터 케이크를 메틸렌 클로라이드 및 에틸 아세테이트로 헹구고, 합한 유기 여과물을 실리카 겔 상에서 감압 하에 농축시켰다. 조 반응 생성물을, 메틸렌 클로라이드 중 0에서 10% 에틸 아세테이트의 구배를 이용한, 실리카 겔 상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 얻어진 갈색 고체를 메틸렌 클로라이드 중에 슬러리화시키고, 헥산으로 연화처리한 다음, 여과에 의해 단리시켜 표제 화합물 (6.52 g, 25.0 mmol, 30% 수율)을 반짝이는 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400.13 MHz, DMSO-d6과 TFA-d) δ ppm: 9.40 (dd, J=0.9, 7.2Hz, 1H), 8.45 (dd, J=0.7, 1.8Hz, 1H), 8.42 (bs, 1H), 7.86 (dd, J=2.1, 7.3Hz, 1H), 7.83 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.64 (dd, J=0.9, 8.4Hz, 1H), 2.57 (s, 3H); 13C NMR (100.62 MHz, DMSO-d6과 TFA-d) δ ppm 142.6, 134.6, 131.9, 130.8, 129.9, 129.4, 127.0, 119.7, 115.0, 113.8, 113.4, 21.1; HRMS (m/z): 실측치: 261.0013 (M+H), C12H10N2Br에 대한 계산치: 261.0027, Err= -5.4 ppm.
단계 2: 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 4)의 합성.
3-브로모-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (6.52 g, 25.0 mmol), 3-플루오로아제티딘 히드로클로라이드 (3.90 g, 35.0 mmol), 아이오딘화구리 (I) (475 mg, 2.50 mmol), [(2,6-디메틸페닐)아미노](옥소)아세트산 (DMPAO, 963 mg, 4.99 mmol) 및 인산칼륨 (15.9 g, 74.9 mmol)의 고체 혼합물에 디메틸술폭시드 (110 mL)를 첨가하였다. 교반을 개시하고, 질소를 슬러리를 통해 15분 동안 버블링하였다. 시스템에 환류 응축기를 장착하고, 헤드스페이스를 질소로 플러싱하고, 혼합물을 90℃에서 48시간 동안 가열하였다. 추가의 3-플루오로아제티딘 히드로클로라이드 (1.39 g, 12.5 mmol), 아이오딘화구리 (I) (166 mg, 0.871 mmol), DMPAO (344 mg, 1.78 mmol) 및 인산칼륨 (5.56 g, 26.2 mmol)을 첨가하고, 교반을 90℃에서 추가로 24시간 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (1000 mL)을 격렬한 교반 하에 천천히 첨가하였다. 침전된 고체를 진공 여과에 의해 단리시키고, 수성 여과물을 메틸렌 클로라이드 중 10% 메탄올 (3 x 250 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 초기 수성 여과로부터의 단리된 고체와 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 단리된 조 고체 (6.46 g)를 실리카 겔 (40 g) 상에 예비흡수시키고, 메틸렌 클로라이드 중 0에서 20% 에틸 아세테이트 구배에 이어서 메틸렌 클로라이드 중 0에서 10% 메탄올의 구배를 이용한, 실리카 겔 상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 합한 분획을 농축시키고, 얻어진 암황색 고체 (5.43 g)를 메틸렌 클로라이드 (40 ml) 중에 현탁시키고 초음파처리하였다. 디에틸 에테르 (800 mL)를 첨가하고, 밝은 황색 고체를 여과에 의해 단리시키고, 추가의 디에틸 에테르 (400 mL)로 세척하고, 고진공 하에 건조시켰다. 10% 메탄올/메틸렌 클로라이드 (200 mL) 중 단리된 생성물 (4.62 g)의 용액을 쿼드라실 MP 수지 (1.60 g)로 처리하고, 슬러리를 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 고체를 메탄올/메틸렌 클로라이드 (100 mL)로 헹구었다. 합한 유기부를 감압 하에 농축시키고, 얻어진 고체를 메틸렌 클로라이드 중에 현탁시키고, 초음파처리하고, 디에틸 에테르 (750 mL)로 연화처리하였다. 침전된 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르로 헹구고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 황색 분말 (4.44 g, 17.4 mmol, 70% 수율, 2 단계에 걸침)로서 수득하였다:
1H NMR (400.13 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.11 (dd, J=0.7, 7.5Hz, 1H), 7.63 (d, J=8.3Hz, 1H), 7.47-7.48 (m, 1H), 7.23 (ddd, J=0.5, 1.5, 8.3Hz, 1H), 6.26 (d, 2.1Hz, 1H), 6.13 (dd, J=2.5, 7.3Hz, 1H), 5.35-5.54 (m, 1H), 4.24-4.34 (m, 2H), 4.07-4.17 (m, 2H), 2.53 (s, 3H); 13C NMR (100.62 MHz, CDCl3) δ ppm: 150.7, 150.3 (d, J=1.5Hz), 143.7, 129.5, 129.0, 126.5, 125.5, 118.1, 109.4, 101.0, 91.6, 82.2 (d, J=206.9Hz), 59.1 (d, J=24.9Hz), 21.8; 19F NMR (376.44 MHz, CDCl3) δ ppm: -180.4; HRMS (m/z): 실측치: 256.1244 (M+H), C15H15N3F에 대한 계산치: 256.1250, Err= -2.3 ppm; 원소 분석 (GLI 절차 ME-14): C15H14FN3에 대한 계산치 C 70.57 H 5.53 N 16.46, 실측치 C 70.17 H 5.68 N 16.43, max diff = 0.41.
제조예 1
1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-일 4-메틸벤젠술포네이트 (화합물 6)의 합성.
Figure pct00017
단계 1: 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-올 (화합물 5)의 합성.
Figure pct00018
3-브로모-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (6.57 g, 25.2 mmol), 아제티딘-3-올 히드로클로라이드 (5.52 g, 50.4 mmol), 아이오딘화구리 (I) (480 mg, 2.52 mmol), [(2,6-디메틸페닐)아미노](옥소)아세트산 (DMPAO, 972 mg, 5.04 mmol) 및 인산칼륨 (21.4 g, 101 mmol)의 고체 혼합물에 디메틸술폭시드 (110 mL)를 첨가하였다. 교반을 개시하고, 질소를 슬러리를 통해 15분 동안 버블링하였다. 시스템에 환류 응축기를 장착하고, 헤드스페이스를 질소로 플러싱하고, 혼합물을 90℃에서 24시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (1000 mL)을 격렬한 교반 하에 천천히 첨가하였다. 침전된 고체를 진공 여과에 의해 단리시키고, 메틸렌 클로라이드 중 10% 메탄올 (500 mL) 중에 용해시켰다. 수성 여과물을 메틸렌 클로라이드 중 10% 메탄올 (3 x 250 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 초기 수성 여과로부터의 단리된 고체의 용액과 합하고, 혼합물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 여과 및 농축시켰다. 얻어진 고체를 메틸렌 클로라이드 중에 용해시키고, 실리카 겔 상에 예비흡수시키고, 메틸렌 클로라이드 중 0에서 30% 메탄올의 구배를 이용한, 실리카 겔 상 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 생성물을 회색-녹색 고체 (3.18 g, 50%)로서 수득하였다.
1H NMR (400.13 MHz, DMSO-d6과 TFA-d) δ ppm: 8.95 (d, J=7.6Hz, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.51 (d, J=8.2Hz, 1H), 7.36 (dd, J=0.9, 8.3Hz, 1H), 6.76 (dd, J=2.3, 7.5Hz, 1H), 6.27 (d, J=2.1Hz, 1H), 4.66-4.71 (m, 1H), 4.38-4.41 (m, 2H), 3.92-3.95 (m, 2H), 2.48 (s, 3H); 13C NMR (100.62 MHz, DMSO-d6과 TFA-d) δ ppm: 153.6, 144.6, 132.4, 129.5, 128.6, 128.1, 126.9, 112.0, 111.9, 104.3, 83.3, 61.0, 60.16, 21.0; HRMS (m/z): 실측치: 254.1296 (M+H), C15H16N3O에 대한 계산치: 254.1293, Err= 1.2 ppm.
단계 2: 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-일 4-메틸벤젠술포네이트 (화합물 6).
디클로로메탄 (135 mL) 중 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-올 (화합물 5) (3.18 g, 12.6 mmol)의 현탁액을 트리에틸아민 (17.5 mL, 126 mmol)으로 처리하고, 10분 동안 교반하고, 이어서 p-톨루엔술폰산 무수물 (12.31 g, 37.7 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 22시간 동안 교반하였다. 추가의 p-톨루엔술폰산 무수물 (1.84 g, 5.6 mmol)을 첨가하고, 반응물을 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 메틸렌 클로라이드 (175 mL) 중에 재현탁시키고, 1N 수성 수산화나트륨 용액 (150 mL)으로 처리하였다. 혼합물을 격렬히 1.5시간 동안 교반하고, 분리 깔때기로 옮겨서 층 분리하였다. 유기 층을 1N 수성 수산화나트륨 용액 (2 x 100 mL, 1 x 150 mL)과 함께 격렬히 진탕하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 고진공 하에 여과, 농축 및 건조시켰다. 메틸렌 클로라이드 중 10% 메탄올 중 단리된 갈색 고체의 용액을 실리카 겔 (24 g) 상에서 감압 하에 농축시켰다. 표제 화합물을 메틸렌 클로라이드 중 0에서 10% 메탄올의 구배를 이용한 실리카 겔 상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 얻어진 고체를 메틸렌 클로라이드 (약 50 mL) 중에 현탁시키고, 초음파처리하고, 디에틸 에테르 (750 mL)로 연화처리하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르로 헹구고, 진공 하에 건조시켜 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-일 4-메틸벤젠술포네이트를 베이지색 고체 (3.21 g, 7.89 mmol, 63% 수율)로서 수득하였다.
1H NMR (400.13 MHz, DMSO-d6과 TFA-d) δ ppm: 9.01 (d, J=7.7Hz, 1H), 8.11 (bs, 1H), 7.85-7.88 (m, 2H), 7.52-7.55 (m, 3H), 7.39 (dd, J=1.0, 8.3Hz, 1H), 6.82 (dd, J=2.2, 7.5Hz, 1H), 6.38 (d, J=2.3Hz, 1H), 5.32-5.37 (m, 1H), 4.94-4.54 (m, 2H), 4.21-4.25 (m, 2H), 2.46 (s, 3H); 13C NMR (100.62 MHz, DMSO-d6과 TFA-d) δ ppm: 153.3, 145.6, 144.3, 132.6, 132.2, 130.4, 129.5, 128.7, 128.3, 127.7, 126.9, 112.2, 112.0, 104.4, 84.4, 68.5, 58.4, 21.1, 21.0; HRMS (m/z): 실측치: 408.1401 (M+H), C15H16N3O에 대한 계산치: 408.1382, Err= 4.7 ppm; 원소 분석 (GLI 절차 ME-14): C22H21N3O3S에 대한 계산치 C 64.85 H 5.19 N 10.31, 실측치 C 64.38 H 5.27 N 10.27, max diff = 0.48.
실시예 2
3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 합성.
Figure pct00019
3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 합성을 1-2 Ci의 출발 방사능으로 GE 트레이서랩(TRACERlab) FXF -N 자동화 방사성합성장치를 사용하여 수행하였다. 대표적 합성 시간은 ~60 ± 5분이었고, 붕괴 보정 수율의 범위는 22-44%였다. [18F]플루오라이드 방사능을 셉-팩 아셀 플러스 QMA 카르보네이트 플러스 라이트 카트리지(Sep-Pak Accell Plus QMA Carbonate Plus Light Cartridge) (카트리지 당 46 mg 수착제, 40 μm 입자 크기, 워터스 파트 번호 186004540)에 담고, 0.8 mL의 수성 크립탄드 2.2.2-K2CO3 용액 [아세토니트릴 (0.4 mL) 및 WFI (주사용수, 0.4 mL) 각각 중 크립탄드 2.2.2 (7 mg) 및 탄산칼륨 (0.75 mg)]을 사용하여 반응 용기로 용리시켰다. 용리된 방사능을 질소 흐름 및 진공 하에 4.5분 동안 70℃에서 가열하여 건조시켰다. 이어서, 온도를 진공 하에 5분 동안 100℃로 상승시켜, 무수 크립탄드 2.2.2-K2CO3 [18F]플루오라이드를 수득하였다.
1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-일 4-메틸벤젠술포네이트 [무수 디메틸술폭시드 (2 mL) 중 1 mg]의 용액을 무수 크립탄드 2.2.2-K2CO3 [18F]플루오라이드를 함유하는 반응 용기에 첨가하고, 생성된 혼합물을 140℃에서 10분 유지시킨 후, 65℃의 1N 수산화나트륨 1 mL로 3분 동안 가수분해시켰다. 60℃로 냉각시킨 후, 조 반응 혼합물을 2 mL의 0.5N 염산 (HCl) (1 mL의 1N HCl + 1 mL WFI)으로 중화시켰다. 이어서, 조 반응 생성물을 반정제용 HPLC 칼럼 상에 로딩하고, 등용매 용리를 이용하여 정제하였다 (대표 크로마토그램에 대한 도 1 참조). 반정제용 칼럼: 애질런트 조르박스 이클립스 플러스 페닐-헥실(Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl), 커스텀 PN, 5 μm, 9.4 mm × 250 mm, 유량 = 4 mL/분; 280 nm; 체류 시간 ~12-13분. 이동상 조성: 76%의, WFI 중 9 mM HCl (1 L의 WFI 중 3 mL의 3N HCl), 24%의 아세토니트릴 (HPLC 등급).
정제된 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 함유하는 HPLC 분획을 WFI 중 0.5% (w/v) 아스코르브산나트륨 (40 mL)으로 희석시켰다. 이어서, 희석 용액을 셉-팩® C18 플러스 라이트 카트리지 (카트리지당 130 mg 수착제, 55-105 μm 입자 크기, 워터스 파트 번호 WAT023501; 사용 전 에탄올 (5 mL)에 이어서 WFI (5 mL)로 컨디셔닝함)에 통과시키고, 보유된 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 주사용수 중 0.5% (w/v) 아스코르브산나트륨 용액 (10 mL)으로 세척하였다. 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을, 탈수 알콜, USP (1 mL)를 이용해서 C18 카트리지로부터, 0.9% 염화나트륨 주사액, USP 중 0.5% (w/v) 아스코르브산나트륨 7 mL를 함유하는 플라스크 내로 용리시켰다. 이어서, C18 카트리지를 추가적 2 mL의, 0.9% 염화나트륨 주사액, USP 중 0.5% (w/v) 아스코르브산나트륨으로 헹구었다. 얻어진 용액 (총 10 mL)을 0.22 μm 밀렉스(Millex) GV PVDF 필터 (밀리포어(Millipore) SLGV013SL)를 통해 벌크 생성물 바이알 (BPV; 알레르기 래보러토리즈(Allergy Laboratories)로부터의 30 mL 멸균 엠티 바이알, 20 mm 클로로부틸 스톱퍼 구비) 내로 멸균 여과시켰다. 하기 표 1에 상세히 기술된 구배 방법을 이용한 HPLC에 의한 품질 관리 (대표 크로마토그램에 대한 도 2 참조)를 위해 BPV로부터 샘플을 취하였다.
<표 1> 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘에 대한 분석용 HPLC 방법A..
Figure pct00020
A. 분석 칼럼 조건은 다음과 같았음: 애질런트 조르박스 이클립스(Agilent ZORBAX Eclipse) XDB-C18 4.6 mm × 150 mm, 파트 번호 993967-902, 유량 = 1 mL/분; UV = 320 nm.
3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8) 제제의 예비 안정성을 평가하였다. (235 mCi로부터 471 mCi까지 범위의 크기) 배치로부터의 샘플을 취하여 6시간 기간에 걸쳐 HPLC에 의해 방사화학적 순도를 분석하였다. 아스코르브산나트륨을 사용하여 제제화된 배치는 6시간까지 96-97% 순도를 유지하였지만, 아스코르브산나트륨 없이 제제화된 배치는 시간 경과에 따라 열화되어 5시간만에 분해되었다. 상세사항에 대하여 표 2를 참조할 수 있다.
<표 2> 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 안정성 결과.
Figure pct00021
검정 실시예 3:
알츠하이머병 공여자로부터의 타우를 사용한 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 대 [18F]AV-1451의 Ki 결정, 및 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 Kd.
PHF 제조:
문헌 [Jicha, et al. (G. A. Jicha, A. O'Donnell, C. Weaver (1999) "Hierarchical phosphorylation of recombinant tau by the paired-helical filament-associated protein kinase is dependent on cyclic AMP-dependent protein kinase" J Neurochem. 72(1):214)]에 기재된 절차를 변형한 프로토콜을 이용하여 AD 뇌 조직으로부터 정제된 가용성 PHF를 단리시켰다. 간략히 요약하면, AD 피질을 휴대용 키네마티카 폴리트론(Kinematica Polytron)을 사용하여 균질화한 후, 파르(Parr) 세포 파괴 봄베를 사용한 고압 배치 - 기체 팽창에 의해 균질화하였다. 조 균질물을 28 kg에서 원심분리시켜 세포 파편을 펠릿화하였다. 타우의 병리학적 입체형태를 인식하는 타우 항체 MC1이 고정되어 있는 아피겔(Affigel)-10 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 상청액으로부터 가용성 PHF를 단리시켰다 (G. A. Jicha, R. Bowser, I. G. Kazam (1997), "Alz-50 and MC-1, a new monoclonal antibody raised to paired helical filaments, recognize conformational epitopes on recombinant tau" J Neurosci Res. 48(2):12.).
3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 Ki 결정:
비표지된 화합물에 대한 IC50 (즉, 방사성리간드의 특이적 결합을 50%만큼 감소시키는 경쟁 리간드의 몰 농도)을, PHF에 대한 [18F]AV-1451의 결합이 다양한 농도에서의 비표지된 화합물과 경쟁하는 경쟁 방사성리간드 결합에 의해 결정하였다. 반응 혼합물 (200 μl)은 PHF (0.12 ug), 0.1-0.5 nM의 [18F]AV-1451, 및 316 nM로부터 0.01 nM까지 연속 희석된 콜드 화합물을 함유하였고; 검정은 96 웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트 내 0.01% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS, pH 7.4 중에서 수행되었다. 비특이적 결합은 공지된 PHF 리간드인 T808/AV-680 (5 μM)의 존재 하에서의 방사성리간드의 결합으로서 정의되었다 (Zhang, J. (2012), "A highly selective and specific PET tracer for imaging of tau pathologies" J Alzheimers Dis., 31(3):601)). 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 후, 결합된 방사능을, 밀리포어 멀티스크린(Millipore MultiScreen)HTS 진공 매니폴드를 사용하여 밀리포어 멀티스크린HTS 96-웰 유리 섬유 FB 필터 플레이트 상에서 수집한 후, PBS, pH 7.4로 5회 세척하였다. 결합된 [18F]AV-1451을 보유하는 필터를 위저드(Wizard) 2480 자동 감마-카운터 [퍼킨 엘머(Perkin Elmer)]에서 방사능에 대하여 분석하였다. 이러한 검정 조건을 이용했을 때, 전형적으로 전체 결합 분율은 첨가된 방사성리간드의 10% 미만이다. IC50을 액티비티베이스(ActivityBase) 또는 엑스엘피트(XLfit) 모델 205 (또는 유사 모델)를 사용하여 결정하였고, 여기서
y = A+(B-A)/(1+((C/x)^D)
Y = % 억제
X = 콜드 경쟁 리간드의 농도 (nM)
A = 최소 Y (0%)
B = 최대 Y (100%)
C = IC50
D = 기울기 인자이다.
Ki (즉, 비표지된 화합물의 결합에 대한 평형 해리 상수)는 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 방정식을 이용하여 IC50 값으로부터 계산하였다 (Cheng Y., Prusoff W.H. (1973), "Relationship between the inhibition constant (KI) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (I50) of an enzymatic reaction" Biochem Pharmacol 22 (23):3099-3108):
Ki = IC50/(1 + [L]/Kd)
[L] = [18F]AV-1451의 농도 (전형적으로 ~0.5 nM)
Kd = [18F]AV-1451 (0.57 nM)에 대한 해리 상수.
[18F]AV-1451 대비 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘에 대한 Ki는, 알츠하이머병 공여자로부터 얻어진 타우에 대하여 0.6 nM이었고, 이는 이 화합물이 타우와 결합한다는 것을 나타낸다. 따라서, 화합물 8을 이용한 PET 영상화 및 영상화 패턴의 검사는 환자 내 타우의 존재를 검출하는 데 유용하며 AD 또는 비-AD 타우병증의 진단을 확인해 줄 수 있다.
3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 Kd 결정:
방사성표지된 화합물 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘에 대한 해리 상수 [Kd]는 포화 결합에 의해 결정되었으며, 여기서 방사성리간드의 전체 및 비특이적 결합이 다양한 방사성리간드 농도에서 측정되었다. 반응 혼합물 (250 μl)은 PHF (150 0.15 μg), 및 PBS 중에 25 nM로부터 0.3 nM로 연속 희석된 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 함유하였고; 검정은 96 웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트 내 0.01% 소 혈청 알부민 함유 PBS 중에서 수행되었다. 비특이적 결합은 T808/AV-680 (10 μM)의 존재 하에서의 방사성리간드의 결합으로서 정의되었다. 37℃에서 1.5시간 동안의 인큐베이션 후, 결합된 방사능을 밀리포어 멀티스크린HTS 진공 매니폴드를 사용하여 밀리포어 멀티스크린HTS 96-웰 유리 섬유 FB 필터 플레이트 상에서 진공 여과에 의해 수집한 후, PBS로 5회 세척하였다. 결합된 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 보유하는 필터를 위저드 2480 자동 감마-카운터 [퍼킨 엘머]에서 방사능에 대하여 검정하였다. 이러한 검정 조건을 이용했을 때, 전형적으로 전체 결합 분율은 첨가된 방사성리간드의 10% 미만이다. 전체 결합 및 비특이적 결합 데이터를 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 이용한 비선형 회귀 분석에 의해 분석하여 방사성리간드의 Kd를 결정하였다.
3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 Kd는 알츠하이머병 공여자로부터 얻어진 타우에 대하여 0.85 ± 0.02 nM였으며, 이는 이 화합물이 타우와 고친화도로 결합함을 나타낸다. 따라서, 화합물 8을 이용한 PET 영상화 및 영상화 패턴의 검사는 환자 내 타우의 존재를 검출하는 데 유용하고, AD 또는 비-AD 타우병증의 진단을 확인해 줄 수 있다.
검정 실시예 4
인간 AD 뇌 조직 내 천연 타우 응집체에의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 결합에 대한 Kd 결정
통상의 기술자에게 공지된 방법에 따른 항-타우 및 항-아밀로이드 면역염색을 이용하여 특징지운 인간 AD 뇌 절편에서의 천연 타우-응집체에 결합하는 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 Kd 결정에 자가방사선촬영을 이용하였다 (예를 들어 [( 18)F ]T807, a novel tau positron emission tomography imaging agent for Alzheimer's disease. Xia CF, et al., Alzheimer's Dement . 2013 Nov; 9(6):666-76), ( Zhang , J. (2012), "A highly selective and specific PET tracer for imaging of tau pathologies" J Alzheimers Dis ., 31(3):601 참조). 실험은, 비특이적 결합을 정의하기 위해 두 개의 AD 뇌, 즉 타우-풍부 및 아밀로이드-풍부 (타우+Aβ+) 뇌, 및 타우-부족 및 아밀로이드-풍부 (타우-Aβ+) 뇌 각각으로부터의 15개의 인접 전두엽 절편을 이용하였다. 절편들을, 결합 완충제 (2.5% 디메틸술폭시드 + 2.5% 에탄올, PBS 중, pH 7.4) 중에 ~250 nM로부터 연속 희석된 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 0.5 ml로 커버했다. 실온에서의 60분 인큐베이션 후, 비결합 리간드를 연속 세척 사이클 (2분 PBS, 2분 30% 에탄올/PBS, 2분 70% 에탄올/PBS, 2분 PBS)을 통해 제거하였다. 후드 하에서 건조시킨 후, 절편들을 밤새 인광체영상화 스크린에 노출시켰다. 인광체영상화 스크린 상에 기록된 자가방사선촬영 신호를, GE 헬스케어 라이프 사이언시스 타이푼 FLA 7000 포스포르이미저(GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000 Phosphorimager)를 사용하여 판독하였다. 회색질 상에서의 신호 강도를 후지필름 멀티 게이지(Fujifilm Multi Gauge) 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 화합물의 Kd를 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 결합 농도 대 유리 화합물의 농도의 비-선형 회귀 분석에 의해 결정하였다.
Kd 결정을 위해 AD 뇌 절편 상의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘에 대하여 수행된 자가방사선촬영이 도 3에 도시되어 있다. 비-선형 회귀 분석에 의해 결정된, AD 뇌 조직의 천연 타우-응집체에 대한 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 Kd는 2.4 nM였고, 이는 이 화합물이 타우와 결합함을 나타낸다. 따라서, 화합물 8을 이용한 PET 영상화, 및 영상화 패턴의 검사는 환자 내 타우의 존재를 검출하는 데 유용하며, AD 또는 비-AD 타우병증의 진단을 확인해 줄 수 있다.
검정 실시예 5
AD 인간 뇌 조직에서 β 아밀로이드 대비 타우에 대한 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 선택성
방법
뇌 절편들의 항-타우 및 항-아밀로이드 면역염색 결과에 기초하여, 자가방사선촬영 실험을 위한 3개의 그룹의 인간 뇌 절편을 선택하여 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 천연 타우-결합 선택성을 결정하였다. 그룹 A는 타우-풍부 AD 뇌 슬라이스 (타우+Aβ+로서 표지됨)이고, 그룹 B는 타우-부족 AD 뇌 슬라이스 (타우-Aβ+로서 표시됨)이고, 그룹 C는 타우-Aβ- 정상 뇌 슬라이스였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 사용된 그룹 A 인간 AD 뇌 절편은 #0185, #28770, #30121, #30311 및 #30461이다. 그룹 B의 인간 AD 뇌 절편은 #33562, #32656, #33998, #35682 및 #33563이다. 그룹 C의 정상 인간 뇌 절편은 #29092 및 #32566이다. 검정 실시예 5에 따른 시험을 위해, 동일 공여자로부터의 조직 슬라이스를 사용하여 3개 화합물 모두의 선택성을 계산하였다. 이들 3개 그룹의 뇌 각각에 대하여 인접 10 μm 절편들 상에서 아밀로이드 트레이서 [18F]W372로 자가방사선촬영을 수행하여 β-아밀로이드 부담을 정량하였다. [18F]W372는 지멘스에 의해 개발되고 IND 105173 하에 평가된 선택적 아밀로이드 결합 트레이서이다. 절편들을 0.5 ml의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (2.5:2.5:95 DMSO:EtOH:1×PBS 중, 약 20 μCi/슬라이드)으로 커버하고, 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 연속 세척 사이클 (1분 PBS, 2분 30% EtOH/PBS, 2분 70% EtOH/PBS, 1분 PBS)을 이용하여 임의의 비결합 트레이서를 제거하였다. 절편들을 공기 건조시키고, 인광체영상화 플레이트 (후지(Fuji) IP 플레이트)에 배치하고, 밤새 노출시켰다. IP 플레이트를 GE 헬스케어 라이프 사이언시스 타이푼 FLA 7000 포스포르이미저를 사용하여 판독하였다. 회색질의 신호 강도를 후지필름 멀티 게이지 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 배경 신호 (그룹 C의 피질 영역의 신호)를 감산한 후, 그룹 A 및 B의 개별 절편들의 신호를, [18F]W372에 의한 각 인접 절편들의 자가방사선촬영으로부터의 상응하는 신호에 대해 정규화하였다. 계산은, 면역조직화학에 의해서는 검출불가능한 타우 병리상태를 갖는 그룹 B 뇌 절편 #32656 및 #33998에 기초하였다. 그룹 B 뇌 절편에서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘에 대한 정규화된 신호는, 천연 β-아밀로이드 응집체에 대한 결합으로부터 얻어진, [F-18]W372에 대한 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 상대적 신호 수준이었다. 그룹 A 절편에서의 천연 타우-응집체에 대한 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 결합 수준은, β-아밀로이드에 대한 결합에 기인한 전체 신호의 양 (인접 절편에서의 β-아밀로이드에 결합된 [18F]W372로부터의 전체 신호를, 그룹 B 절편으로부터 결정된, [18F]W372에 대한 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 상대적 신호와 곱하여 계산함)을 감산함으로써 추정된다. 이어서 결과적 차이를, β-아밀로이드에 대한 결합에 기인한 신호로 나누어 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 선택성을 추정한다.
3개 그룹의 인간 뇌 절편들 상에서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 자가방사선촬영이 도 4에 도시되어 있다. 그룹 A (타우+Aβ+)의 절편의 회색질 (피질 영역) 상에서 강한 신호가 관찰되었고, 한편 그룹 B (타우-Aβ+)에서는, 절편의 피질 영역 상에서 신호가 약하게 검출되거나 검출되지 않았다. 그룹 C (타우-Aβ-)의 정상 뇌의 절편 상에서는 자가방사선촬영 신호가 보이지 않았다. 이러한 결과는 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘이 인간 AD 뇌의 천연 타우 응집체에 특이적으로 결합하며, 천연 β-아밀로이드 응집체와는 약한 상호작용을 갖거나 상호작용이 없음을 나타낸다.
IHC 결과에 따르면 그룹 B 뇌 절편 #32656 및 #33998에는 타우 단백질 응집체가 결여되어 있으므로, 이들 AD 뇌 절편의 피질 영역 상에서의 정규화 자가방사선촬영 신호는 천연 β-아밀로이드 응집체에 대한 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 결합으로부터 유래된 것이다. 천연 β-아밀로이드 응집체 대비 천연 타우 응집체에 결합되는 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 선택성은 뇌 절편 #32656 및 #33998의 신호에 대한 그룹 A (타우+Aβ+) 신호의 비에 반영된다.
검정 실시예 5에 요약되고 도 4에 나타내어진 실험에서, 화합물 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)은, 5개의 타우+Aβ+ 뇌 시료 및 2개의 타우-Aβ+ 뇌 시료에 근거할 때, 대략 26.6 ± 4.5의 타우:Aβ 선택성 비를 나타냈다. 이 섹션에서 사용된 바, 시료는 상이한 공여자로부터의 조직 샘플을 지칭한다. 검정 실시예 5에 요약되고 도 4에 나타내어진 바와 같이, 화합물 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)은 대략 17.3 ± 1.7의, 백질에 대한 회색질의 신호 비 (GM/WM)를 나타낸다. 정상 뇌 절편 상에서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 자가방사선촬영 신호는 약하고, 심지어 회색질과 백질 사이에 차이가 거의 없었는데, 이는 비-특이적 결합이 적음을 나타내는 것이다. 검정 실시예 5로부터의 실험으로부터, 인간 AD 뇌의 회색질 영역에서 천연 타우 응집체에 결합되는 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 선택성 비는 천연 β-아밀로이드 응집체에 결합되는 것에 비해 대략 27배인 것으로 관찰되었다.
3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)에 대한 자가방사선촬영 선택성 결과는, US2011/0182812에서 타우 PET 영상화제로서 언급된 3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (하기에 나타낸 T821로서도 알려진 것), 및 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (하기에 나타낸 T798로서도 알려진 것)과 비교하여 고려했을 때, 상기 실험들에서 놀랍게도 유리한 선택성을 입증하였다.
Figure pct00022
검정 실시예 5에 요약되고 도 5에 도시된 실험에서, 화합물 3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T821)은, 5개의 타우+Aβ+ 뇌 시료 및 2개의 타우-Aβ+ 뇌 시료에 근거할 때, 대략 2.22 ± 0.45의 타우:Aβ 선택성 비를 나타냈다. 검정 실시예 5에 요약되고 도 5에 도시된 실험에서, 화합물 3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T821)은 대략 11.7 ± 1.2의, 백질에 대한 회백질의 신호 비 (GM/WM)를 나타냈다. 즉, 화합물 3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T821)은 정상 인간 뇌에서 타우, 아밀로이드, 및 미확인 결합 부위에 결합하였다. 이러한 선택성 결여는 타우 영상화에 이용하는 데 있어서의 T821의 단점을 나타낸다.
검정 실시예 5에 요약되고 도 6에 도시된 실험에서, 화합물 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T798)은, 5개의 타우+Aβ+ 뇌 시료 및 2개의 타우-Aβ+ 뇌 시료에 근거할 때, 대략 8.4 ± 1.7의 타우:Aβ 선택성 비를 나타냈다. 검정 실시예 5에 요약되고 도 6에 도시된 실험에서, 화합물 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T798)은, 5개의 타우+Aβ+ 뇌 시료에 근거할 때, 대략 18.0 ± 3.2의, 백질에 대한 회백질의 신호 비 (GM/WM)를 나타냈다. 즉, 화합물 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T798)은 정상 인간 뇌에서 타우, 아밀로이드, 및 미확인 결합 부위에 결합하였다. 이러한 선택성 결여는 타우 영상화에 이용하는 데 있어서의 T798의 단점을 나타낸다.
즉, T821 및 T798은, 화합물 8에 비해, 타우와 A-베타 아밀로이드 사이 뿐만 아니라, 타우와, 타우 및 A-베타 아밀로이드가 상대적으로 결여된 정상 인간 뇌 조직에서 관찰되는 미확인 결합 부위 사이에서도 불량한 선택성을 보인다 (화합물 8에 대하여 도 4, T821에 대하여 도 5 및 T798에 대하여 도 6 참조). 3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 및 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘은 이러한 선택성 결여로 인해, 유용한 PET 타우 영상화제가 아니다. 그와 대조적으로, 인간 AD 뇌의 회색질 영역에서 천연 타우 응집체에 결합되는 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 선택성은 천연 β-아밀로이드 응집체에 결합되는 것에 비해 대략 27배인 것으로 관찰되었다. 화합물 8의 이러한 놀라운 선택적 결합 특성은 타우 영상화에 특히 유리하며, 강한 타우 신호 및 감소된 비-타우 신호로 인해 보다 우수한 선명도를 갖는 영상을 생성하며, 공지된 작용제에 비해 향상된 타우 영상을 제공할 수 있다. 통상의 기술자는 임상 환자 영상화에서 타우의 축적 및 분포를 평가하기 위해 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 방사성제약 제제를 단독으로, 또는 기존의 베타 아밀로이드 영상화제와 비교하여 사용하는 방법을 알 것이다.
검정 실시예 6
정상 인간 뇌 슬라이스에 대한 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 결합의 결여
비-타우 결합이 없음을 보여주기 위해, 정상 인간 뇌 조직 상에서 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘으로부터 자가방사선촬영 스캔을 얻었다. 실험 절차는, 단지 20 uCi의 18F-리간드를 조직 슬라이스에 적용하고 세척 조건이 덜 엄격했다는 것을 제외하고는 실시예 5에 제공된 절차와 동일하였다. 도 7은, 연속 세척 사이클 (2분 PBS, 2분 10% 에탄올/PBS, 2분 30% 에탄올/PBS, 2분 PBS)이 이용되었을 때 정상 조직에서의 방사능 신호가 AD 뇌 조직에서의 방사능 신호보다 상당히 더 낮았음을 보여준다. AD 뇌 조직 (AD30121, 전두 피질)에서의 신호는, 타우-특이적 결합의 차단에 관한 예상대로, 비-방사성표지된 화합물 또는 공지된 타우 PET 트레이서 T807 (또한 AV-1451로서 알려짐)에 의해 차단될 수 있다. 세척 용액에서 에탄올을 사용하지 않고서 자가방사선촬영을 추가로 수행하였다. 도 8은, [18F]T807 (또한 AV-1451로서 알려짐)에 비해, 타우 트레이서 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘이 정상 피질 또는 백질 조직에서 크게 더 낮은 자가방사선촬영 신호를 가졌음을 보여준다. 정상 조직 상에서의 화합물 8의 이렇듯 크게 감소된 비-타우 결합은 [18F]T807/AV-1451과 비교할 때 놀랍게도 유리한 개선을 나타낸다.
검정 실시예 7
3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 이용했을 때 얻어진 마우스 PET/CT 스캔
다이나믹 마이크로-양전자 방출 단층촬영(Dynamic Micro-Positron Emission Tomography) (mPET) 영상을 CD-1 야생형 마우스로부터 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 이용하여 얻었다. 각각의 대상체의 마이크로-컴퓨터 단층촬영 (mCT)을 영상 분석을 위한 해부학적 참조물로 사용하였다. 융합된 mPET/mCT 영상을 사용하여 시간 방사능 곡선 (TAC)을 생성함으로써 뇌, 근육, 골, 간 및 신장에서의 트레이서의 생체분포를 평가하였다. mPET/mCT를 위해 인베온(INVEON) 다중모드 스캐너 (지멘스, 독일)를 사용하였다. 모든 동물 작업은 과학 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(University of Sciences Institutional Animal Care & Use Committee)-승인 절차에 따라 수행하였다.
동물을 3% 이소플루란/97% 산소로 마취하였고, 스캐너 베드 상에 위치시켰다. 해부학적 기록을 위해 먼저 짧은 고해상도 CT 스캔을 수행하였고, 이후 120-분 PET 스캔을 수행하였다. PET 스캔 동안, 체온 유지를 돕기 위해 베드의 아래에 온수 가열 시스템을 배치하였다. PET 획득 시작 후 3분 내에, [18F]-표지된 화합물 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 동물에게 꼬리 정맥 주사 (총 부피 200 uL 염수 중 250 uCi)를 통해 투여하였다. 획득 시간의 매 분마다 PET 영상을 생성시켰다. 트레이서의 흡수는 융합 PET/CT 영상에 기초하여 관심 영역을 시각적으로 그림으로써 얻었으며, 상응하는 방사능 값을 인베온 리서치 워크플레이스(INVEON Research Workplace) 소프트웨어 (지멘스, 독일)를 사용하여 결정하였다. 모든 값은 그램 당 주사 선량 백분율 (%ID/g)로 나타냈다.
3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘으로부터 얻어진 시간 방사능 곡선을 공지된 타우 PET 트레이서 T807/AV-1451로부터 얻어진 곡선과 비교하였다. 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘은 [18F]AV-1451보다 더 높은 %ID/g로 뇌에 진입하였고, 신속하게 소거되고, 골 조직에서 유의한 방사능 흡수를 나타내지 않았다. 이러한 특성은 개선된 뇌 영상화제를 위해 유리하다.
검정 실시예 8
3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T821) 및 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T798) 대 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 마우스 PET/CT 시간 방사능 곡선
3-(4-(2-[18F]-플루오로에틸)피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T821) (도 9 참조) 및 3-(4-[18F]-플루오로피페리딘-1-일)-8-메톡시벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (T798) (도 10 참조)의 마우스 PET/CT 시간 방사능 곡선을 검정 실시예 7에 기재된 바와 같이 하여 얻었다 (T821 및 T798은 US2011/0182812에 언급되어 있음). 도 9 및 10은 T821 및 T798의 경우 방사능의 골 흡수가 시간에 따라 증가함을 보여주는데, 이는 골을 표지할 수 있는 방사성 플루오라이드 이온의 방출 가능성을 시사한다. 따라서, T821 및/또는 T798을 이용하여 영상화할 때에는, 두개골로부터의 바람직하지 않은 비-타우 PET 신호가 뇌 피질로부터의 바람직한 타우 신호를 간섭할 수 있다. 따라서, T821 및 T798의 선택성 결여 이외에도, 이들 화합물은 추가로, 골로부터의 간섭 방사능 신호 때문에, 인간 뇌 타우 PET 트레이서에 대해 불량한 후보이다. 그에 비해, 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)은 골에서 무시가능한 방사능 신호를 야기하며, T821 및 T798에 비해 상당히 우수하고 놀라운 뇌 흡수를 갖는다. 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘은, 유리한 조직 분포, 유리한 PK 특성 및 우수한 타우 선택성 프로파일을 비롯한, 개선된 타우 PET 영상화제에 요구되는 놀랍게도 유리한 특성을 갖는다. 화합물 8의 유리한 특성은 인간에서의 향상된 타우 PET 영상화를 제공하는 데 유용하다. 이러한 결정적 특성의 조합은 알려진 바가 없었고, 기존의 타우 영상화 화합물로부터는 예상될 수 없었다.
검정 실시예 9
정상 마우스에서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 생체분포
정상 마우스에서의 기관 분포, 뇌 침투 및 클리어런스를 결정하기 위해, 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 정상 마우스에 주사한 후, 주사 후 2, 60, 120 및 180분째에 마취 및 절개하였다. 마취 상태에 있는 동안, 20 μCi의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 함유하는 염수 용액 0.2 mL를 꼬리 정맥 내에 직접 주사하였다. 시점 당 3마리의 마우스를 이용하였고, 시차를 두는 방식으로 희생시켰다. 하기 기관 및 체액을 수집하였다: 혈액, 비장, 갑상선, 고환, 심장, 간, 췌장, 신장, 근육, 피부, 위, 골, 폐, 뇌, 장, 비뇨생식기계. 기관을 칭량하고, 각각의 기관의 방사능을 오토매틱 감마 카운터(Automatic Gamma Counter) (퍼킨 엘머)에서 카운팅했다. 피부, 골, 근육 및 혈액에 대하여, 샘플을 카운팅하고, 기관 또는 체액의 총 중량을 추정했다. 주사 선량의 샘플을 참조물로서 카운팅했다. 조직 그램 당 주사 선량 백분율 (%ID/g)을 각 기관에 대하여 계산하였다.
뇌에서 2분 시점에 9.53%선량/g 수준의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘을 얻었다. 뇌로부터 피크의 10% 미만으로의 클리어런스가 30분 지점 전에 나타났고, 2시간 동안 지속되었다. 방사능은 처음 2분 내에 주로 간, 장 및 신장으로 분포되며, 장에서 2시간의 연구 기간에 걸쳐 잔존하였다 (표 4 및 5).
간 및 장에서의 방사능 수준은, 방광을 비롯한 비뇨생식기계 내의 약간의 존재량과 더불어, 이 화합물 및 그의 대사물이 간 및 소화기계를 통해 소거됨을 시사한다. 골 조직에서 방사능이 증가되지 않는다는 것은, 이 화합물 및 그의 대사물이 처음 2시간 내에는 탈-플루오린화되지 않는다는 것을 보여준다. 근육에 의한 흡수는 2%ID/g 미만으로 유지되며, 이는 PET 영상화를 위한 강조된 인간 신호 대 잡음 비에 유리하다. 이러한 결과는 화합물 8이 놀랍게도 유리한 조직 분포, 약동학 및 생체내 대사 안정성을 나타낸다는 것을 입증한다. 이러한 특성은 개선된 뇌 타우 영상화제를 위해 특히 유리하다.
<표 4> 정상 마우스에서의 그램 당 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 생체분포
Figure pct00023
<표 5> 정상 마우스에서의 기관 당 [18F] 3-(3-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘의 생체분포
Figure pct00024
검정 실시예 10
알츠하이머병 환자의 뇌 내 타우 단백질의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8) PET 영상화
AD 또는 다른 신경변성 장애 환자에서의 타우 단백질 침착을 영상화하기 위한 PET 방사성리간드로서의 3-(3-[18F]-플루오로아제티딘-1-일)-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘 (화합물 8)의 임상 평가를 건강한 지원자, AD 환자, 또는 만성 외상성 뇌병증 (CTE) 대상체에서 화합물 8을 이용한 1회 이상의 PET 스캔을 완료함으로써 수행하였다. 동적 PET 영상화를, 화합물 8 또는 [18F]AV-1451 주사 후 150분에 걸쳐 지멘스 ECAT EXACT HR+ 상에서 획득하였다 (0 내지 60분 및 90 내지 150분 영상화 구간). 화합물 8 또는 [18F]AV-1451 스캔은 두 영상화 세션에서 유사하게 획득되었다. 뇌 MRI를 또한 획득하였다. PET 및 MRI 영상을 정렬 및 정규화하였고, 아틀라스(ATLAS)-기반 관심 부피 (VOI)를 동적 PET 시리즈에 적용하였다. 화합물 8 또는 [18F]AV-1451을, 건강한 지원자와 AD 또는 CTE 대상체 사이의 소뇌 표준 흡수 값 비 (100-120분 사이의 SUVr)에 대하여 동역학적 프로파일 뿐만 아니라 표적 영역에 관련하여 평가하였다.
건강한 대조군 및 AD 대상체에서의 분포는 대상체-내에서 화합물 8 및 [18F]AV-1451 간에 유사하였다. 화합물 8 및 [18F]AV-1451은 AD 대상체의 뇌에서의 타우 흡수에 대하여 유사한 대상체-내 분포를 보였다. 화합물 8 및 [18F]AV-1451, 둘 모두에 대해 건강한 대조군에 비해 AD 대상체의 피질 뇌 영역에서 더 높은 흡수가 관찰되었다. 화합물 8은, [18F]AV-1451의 경우의 ~6 SUV에 비해, ~8 SUV의 더 높은 피크 뇌 흡수를 나타냈다. 화합물 8 및 [18F]AV-1451은 뇌로부터 유사한 소실을 나타냈다. 화합물 8의 대사는 신속했고, 주사 후 60분에 남아있는 무손상 모체는 5 ± 3% (n=7)였다.
화합물 8 SUVr 곡선은 건강한 지원자 대상체에서는 피질 영역에서 대략 1.0-1.1 값으로 신속하게 평형화되었고, 한편 피질하 영역 (피각, 시상)에서는 [18F]AV-1451에 비해 흡수가 적은 것으로 나타났다. AD 대상체에서는, [18F]AV-1451과 유사하게, 화합물 8 SUVr 곡선이 연구 기간 (150분) 내에 평형에 도달하지는 않았고, 한편 화합물 8이 [18F]AV-1451에 비해 약간 더 높은 SUVr 값을 보였다. 화합물 8을 이용한 영상은 보다 선명했고, 비-특이적 배경 신호가 더 낮은 것으로 해석된다. 화합물 8 SUVr 플롯은 건강한 지원자 및 AD 대상체 간의 우수한 분리를 나타내며, 여기서 모든 영역에 걸쳐 평균된, 평균 SUVr이 건강한 지원자 대상체의 경우, ~1.1이고, AD 대상체의 경우, ~1.6이다. 화합물 8은 건강한 지원자 및 AD 대상체, 둘 모두에서 [18F]AV-1451에 비해 더 높은 뇌 흡수를 보이며, 이때 최대 화합물 8 SUV는 [18F]AV-1451보다 ~50% 더 높다.
CTE 대상체에서의 화합물 8 분포는, 흡수가 상승된 작은 병소 부위를 보여준다. CTE 대상체의 경우, 흡수가 높은 병소 영역 (하 외측 두정 피질, 상 두정 피질 및 후 측두 피질의 하위 영역)에서 보다 작은 관심 용적이 수작업으로 상세히 묘사된다. 이러한 하위 영역에서 화합물 8 SUVr 곡선은 상승된 신호를 나타내며, ~1.5의 값에 도달하지만, 다른 피질 영역은 건강한 지원자 대상체에서와 유사하게 1.0에 가깝게 유지된다.
검정 실시예 10, 및 상기 다른 검정 실시예에 기재된 것 등의 결과는, AD 환자 및/또는 다른 신경변성 장애, 예컨대 CTE에서의 응집된 타우 단백질의 수준을 검출하기 위한 개선되고 유리한 PET 영상화 프로브로서의 화합물 8의 용도를 지지한다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00025
  2. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00026
  3. 하기 화학식의 화합물.
    Figure pct00027
  4. 하기 화학식의 화합물.
    Figure pct00028
  5. 하기 화학식의 화합물의 제조 방법이며,
    Figure pct00029

    하기 화학식의 화합물:
    Figure pct00030

    을 [18F]플루오라이드의 공급원과 반응시키는 것을 포함하는 방법.
  6. 하기 화학식의 화합물의 제조 방법이며,
    Figure pct00031

    하기 화학식의 화합물:
    Figure pct00032

    을 [18F]플루오라이드의 공급원과 반응시키는 것을 포함하는 방법.
  7. 하기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
    Figure pct00033
  8. 하기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
    Figure pct00034
  9. 0.9% 염화나트륨 중 0.45% (w/v) 아스코르브산나트륨, 10% EtOH (v/v) 및 하기 화합물을 포함하는 조성물.
    Figure pct00035
  10. 0.9% 염화나트륨 중 0.45% (w/v) 아스코르브산나트륨, 10% EtOH (v/v); 및 제5항 또는 제6항의 방법에 의해 제조된 하기 화합물을 포함하는 조성물.
    Figure pct00036
  11. 응집된 타우의 영상화 방법이며,
    a. 하기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 검출가능한 양을 포유동물에 도입하고,
    Figure pct00037

    b. 상기 화합물이 타우와 회합되기에 충분한 시간이 경과되도록 두고,
    c. 상기 화합물을 검출하는 것
    을 포함하는 방법.
  12. 응집된 타우의 영상화 방법이며,
    a. 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 검출가능한 양을 포유동물에게 도입하고,
    b. 상기 조성물이 타우와 회합되기에 충분한 시간이 경과되도록 두고,
    c. 상기 조성물을 검출하는 것
    을 포함하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 포유동물이 알츠하이머병에 걸린 것으로 의심되는 인간인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 포유동물이 알츠하이머병에 걸린 것으로 의심되는 인간인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 포유동물이 만성 외상성 뇌병증 (CTE)에 걸린 것으로 의심되는 인간인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 포유동물이 만성 외상성 뇌병증 (CTE)에 걸린 것으로 의심되는 인간인 방법.
  17. 3-브로모-8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘인, 제2항의 화합물을 제조하기 위한 중간체.
  18. 1-(8-메틸벤조[4,5]이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)아제티딘-3-올인, 제3항의 화합물을 제조하기 위한 중간체.
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