KR20180056767A - 인 비트로 암 전이 모델링을 위한 방법 및 장치 - Google Patents
인 비트로 암 전이 모델링을 위한 방법 및 장치 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180056767A KR20180056767A KR1020187012233A KR20187012233A KR20180056767A KR 20180056767 A KR20180056767 A KR 20180056767A KR 1020187012233 A KR1020187012233 A KR 1020187012233A KR 20187012233 A KR20187012233 A KR 20187012233A KR 20180056767 A KR20180056767 A KR 20180056767A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- chamber
- cell
- cancer
- liver
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 120
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 169
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 46
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 44
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 43
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 41
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 19
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 claims description 17
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 claims description 16
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 claims description 4
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 4
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 claims description 2
- 206010001197 Adenocarcinoma of the cervix Diseases 0.000 claims description 2
- 208000034246 Adenocarcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 claims description 2
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011057 Breast sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000034254 Squamous cell carcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011892 carcinosarcoma of the corpus uteri Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007455 central nervous system cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000025997 central nervous system neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006662 cervical adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006612 cervical squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000005168 endometrial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000005073 lymphatic endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002632 myometrial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000005290 uterine carcinosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 abstract description 4
- 238000009509 drug development Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000968 medical method and process Methods 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 19
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 17
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 17
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 14
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 10
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 10
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 9
- OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N marimastat Chemical compound CNC(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)[C@H](O)C(=O)NO OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N 0.000 description 9
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 8
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 229950008959 marimastat Drugs 0.000 description 8
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 8
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 8
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 5
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 4
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 125000004386 diacrylate group Chemical group 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- -1 methylcarbamoyl Chemical group 0.000 description 4
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 2
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000671 polyethylene glycol diacrylate Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000002174 soft lithography Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- IAHOUQOWMXVMEH-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitroaniline Chemical compound NC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O IAHOUQOWMXVMEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Chemical compound CC(C)(O)C(=O)C1=CC=C(OCCO)C=C1 GJKGAPPUXSSCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010146 3D printing Methods 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 206010055114 Colon cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 description 1
- 239000002138 L01XE21 - Regorafenib Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101000957678 Mus musculus Cytochrome P450 7B1 Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101000957679 Rattus norvegicus 25-hydroxycholesterol 7-alpha-hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000007824 aliphatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002257 antimetastatic agent Substances 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229930003827 cannabinoid Natural products 0.000 description 1
- 239000003557 cannabinoid Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003040 circulating cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940089482 combination collagen Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005137 deposition process Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009969 flowable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000006510 metastatic growth Effects 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M methacrylate group Chemical group C(C(=C)C)(=O)[O-] CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000006677 mitochondrial metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000006855 networking Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001432 poly(L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 229960004836 regorafenib Drugs 0.000 description 1
- FNHKPVJBJVTLMP-UHFFFAOYSA-N regorafenib Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=C(F)C(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 FNHKPVJBJVTLMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000820 replica moulding Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229920000260 silastic Polymers 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004511 skin melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003787 sorafenib Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/22—Transparent or translucent parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/18—Flow directing inserts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/20—Degassing; Venting; Bubble traps
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Fluid Mechanics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
암 세포의 전이를 검사하는데 유용한 장치로서, (a) 제1 챔버; (b) 적어도 하나의 제2 챔버; (c) 상기 제1 및 제2 챔버를 연결하고 그들 사이의 유체 연통(communication)을 제공하는 적어도 하나의 제1 도관; (d) 상기 제1 챔버 내의 제1 오르가노이드, 상기 제1 오르가노이드는 포유류 암세포를 포함하는 것인 제1 오르가노이드; (e) 상기 제2 챔버(들)에 대해 별도로 선택되고 제2 챔버(들) 내의 적어도 하나의 제2 오르가노이드; 및 (f) 선택적으로 상기 제1 챔버, 각각의 상기 제2 챔버 및 상기 제1 도관 내의 성장 배지를 포함하는 것인 장치이다. 상기 장치는 약물 스크리닝 및 개발 방법 및 개인화된 의학 방법에 사용될 수 있다.
Description
본 출원은 2015년 10월 2일 출원된 미국 가출원 제62/236,361호 및 미국 가출원 제62/241,872호에 대한 우선권과 그 이익을 주장하며, 둘 모두의 개시 내용은 본 명세서에 참조로서 통합된다.
본 발명은 잠재적인 치료적인 화합물의 효과를 포함하여, 인 비트로(in vitro)에서 암의 진행을 연구하기 위한 유용한 방법 및 장치에 관한 것이다.
치료법의 발전에도 불구하고 암 전이는, 특히: i) 종양 세포 성장과 악성 종양의 활성화 기전, ii) 이러한 기전이 전이의 로지스틱스(logistics)와 동역학에 어떻게 영향을 주는지, 및 iii) 이러한 현상을 조절하는 것에 있어서 미세환경이 하는 역할이 여전히 잘 알려져 있지 않다.1 ,2 암 연구가 계속 진행되는 동안, 최근 몇 년 동안 통제된 환경에서 종양의 진행과 전이를 정확하게 모델링할 수 없기 때문에 제한적이었다. 동물 모델은 제한된 조작과 메커니즘의 연구만을 허용하며 인간의 결과를 반드시 예측하지는 않는다. 그러나, 전통적인 2차원(2D) 배양과 같은 인 비트로 방법은, 인 비보(in vivo) 조직의 3차원(3-D) 미세 환경을 재현하지 못한다.3 약물 확산 동역학은 극적으로 다양하며, 2D에서 효과가 있는 약물 투여량은 환자에게 맞춰질 때 종종 효과가 없으며, 세포 표현형은 다를 수 있고, 및 세포-세포/세포-세포외 기질(cell-extracellular matrix: ECM) 상호 작용은 종종 부정확하게 모델링된다.4 -6 이러한 제한이 "최상위(top level)" 약물 후보가 종종 임상시험에 들어가지만 실패하는 결과를 낳는데, 왜냐하면 그들이 정확한 인간-기반 모델에서 테스트되지 못하였기 때문이다.
3-D 바이오물질 시스템과 인간 (또는 다른 포유류) 유래 세포를 사용하여 만들어진, 3차원 조직 구조체(construct) 또는 오르가노이드(organoid)를 포함하는 플랫폼은, 천연 생리학을 모방하고, 질병을 모델링하고, 약물 스크리닝을 수행하기 위한 더 나은 해결방안을 제공한다.7, 8
본 발명자의 실험실은 간 및 장을 포함하는, 다양한 유형의 조직 구조체를 제조하고 유지하는 광범위한 경험을 가지고 있으며, 이를 수행하기 위한 수많은 하이드로겔 기술의 개발 및 구현의 일부가 되어 왔다.9 -15 이러한 하이드로겔 바이오제조에 대한 접근법의 유형은, 일부 구체예에서는 히알루론산 하이드로겔을 사용할 수 있는,16 -20 포유류 생리학 및 질병을 보다 정확하게 재현할 수 있는 조작된 3차원 포유류-특이적 모델을 만드는데 사용될 수 있다.
전이 연구의 경우, 1차 종양과 원거리 전이성 성장을 구별하는 인 비트로 모델이 없었다. 이에 본 발명자는 두 개의 별개의 조직을 가로지르는 하나의 플랫폼 - "전이-온-어-칩(metastasis-on-a-chip: MOC)" - 에서의 조작을 통해 환경에서의 제어 및 전이 메커니즘에 대한 조사를 허용하는, 닫힌 유체소자 시스템 내의 다중 3차원 오르가노이드의 초기 구현을 설명한다. 숙주 조직 구조체 내 종양 초점(foci)의 도입은 지금까지는 충분히 활용되지 못하였던 개념이다. 실시간 라이브 영상의 잠재력을 가지는, 소형 또는 마이크로-크기 기기를 이용한, 조직 공학의 연결은 강력한 조사 및 진단 도구를 제공한다. 유체소자 장치 오르가노이드 시스템을 통해 흐름을 제공함으로써, 본 발명자는 장 오르가노이드에서 순환으로의 대장 암종 세포의 전파를 연구할 수 있고, 그 후에 전이성 세포가 간 오르가노이드 다운스트림에 부착하고 침입할 수 있다. 미세유체소자 모델은 3차원 원발성 조직에서 3차원 표적 조직으로의 이동을 재현하는 전이의 첫 번째 인 비트로 모델 중 하나이다. 이것이 특히 주목할 만한 이유는 원발성 악성 종양 및 전이에 있는 세포의 표현형이 매우 다양할 수 있기 때문으로 - 예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테나아제(MMP) 분비와 줄기 세포-유사 유전자 발현으로 인한 다양한 수준의 침윤성이 나타나는 것21 ,22 - 다양한 세팅, 그들의 미세환경, 및 이동 중에 종양을 연구할 수 있는 능력을 만드는 것은 매우 유익하다.
본 발명의 제1 양상은, 따라서, 암세포의 전이를 검사하기 위한 유용한 장치로서,
(a) 제1 챔버;
(b) 적어도 하나의 제2 챔버;
(c) 상기 제1 및 제2 챔버를 연결하고 그들 사이의 유체 연통(communication)(예를 들어, 성장 배지의 흐름)을 제공하는 적어도 하나의 제1 도관;
(d) 상기 제1 챔버 내의 제1 오르가노이드, 상기 제1 오르가노이드는 포유류 암세포를 포함하는 것인 제1 오르가노이드;
(e) 상기 제2 챔버(들) 내의 적어도 하나의 제2 오르가노이드; 및
(f) 선택적으로 상기 제1 챔버, 각각의 상기 제2 챔버, 및 상기 제1 도관 내의 성장 배지를 포함하는 것인 장치이다.
일부 구체예에서, 상기 장치는 추가로 후술되는 바와 같이, 상기 제1 및/또는 제2 챔버 내에 광학적으로 투명한 윈도우를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 장치는 상기 제1 챔버에 연결된 유체 유입구 및 각각의 상기 제2 챔버에 연결된 유체 유출구를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 암세포는 검출가능한 화합물을 발현한다.
전술한 일부 구체예에서, 제1 오르가노이드는 상기 제1 오르가노이드는 (i) 포유류 조직 세포, 선택적으로 세포외 기질 내에 존재하는; 또는 (ii) 상기 암세포를 보유하는 세포외 기질; (iii) 선택적으로, 적어도 부분적으로 상기 제1 오르가노이드 둘레에 또는 위에 있는 혈관의 층 또는 림프 내피 세포층(예를 들어, 순환에 들어가기 위해 암세포가 침투해야 하는 체내 장벽의 표상(representation)으로 기능하기 위해); 및 (iv) 선택적으로, 면역 시스템 세포(예를 들어, 쿠퍼 세포, 대식세포, 단핵구, 호중구 등)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 암세포에 대한 항-전이 (또는 다른 생리학적 또는 약리학적) 활성을 위한 피검 화합물의 스크리닝 방법으로서,
(a) 본 명세서에 기재된 장치를 제공하는 단계;
(b) 상기 제1 챔버로부터 상기 제2 챔버로 성장 배지를 순환시키는 단계;
(c) 상기 제1 오르가노이드에 피검 화합물을 투여하는(예를 들어, 피검 화합물을 성장 배지에 첨가하여) 단계; 및
(d) 상기 피검 화합물이 투여되지 않을 때 상기 제2 오르가노이드에 존재하는 암세포의 수와 비교하여 상기 제2 오르가노이드에서의 암세포의 존재 감소(수와 밀도의 변화)를 결정하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명은 본 명세서 및 이하에 설명되는 명세서에서보다 상세하게 설명된다. 본 명세서에 인용된 모든 미국 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
도 1a. 장에서 간으로 대장 암종 전이를 모방하는 2-오르가노이드 "전이-온-어-칩"장치 및 유체소자 플랫폼. 중합체 용액에서 세포의 광중합은 3차원 조직 구조체를 형성한다.
도 1b. 성형된(molded) PDMS 조각, 유입구 및 유출구 밸브 및 플라스틱 클램프를 사용한 장치 제작. 오르가노이드 배치("오르가노이드(Orgs.)")는 파란색과 노란색 영역으로 표시된다.
도 1c. 장치의 사진과 묘사, 및 이동하는 암세포를 가지는 흐름 하의 장치 내의 장 및 간 구조체.
도 1d. MOC 장치는 배지 저장소, 버블 트랩 및 마이크로-연동식 펌프와 나란히 배치되고, 장-간(gut to liver) 방향으로 순환 흐름을 제공한다.
도 2. 결장암은 장에서 간으로 전이한다. A) 제1 구조체에서의 HCT-116 세포의 성장 및 RFP-표지된 HCT-116 세포의 순환으로의 다음의 발산. B) (i-ii) RFP-표지된 HCT116 세포의 간 오르가노이드로의 침윤, 다세포 돌출부 및 간-하이드로겔 오르가노이드를 침윤하는 응집체를 통한 것. (화살표-침윤 방향; 점선-오르가노이드 계면(interface); L/H - 간/하이드로겔 구조체). 막대눈금 - 250 μm. 오르가노이드 계면; L/H - 간/하이드로겔 구조체). 막대눈금 - 250 μm. C) 원발생(origin) 위치 및 하류 전이 위치에서 시간에 따른 합성 오르가노이드 이미지 내의 RFP-염색된 HCT-116 종양 면적의 정량화.
도 3. 2차원 조직 배양 플라스틱 상의 HCT-116 세포에서 세포 표면 마커와 MMP의 발현. 조직 배양 플라스틱 상의 HCT-116 세포는 막-결합 A) ZO-1 및 B) β- 카테닌을 나타냈다. 반대로, 2-D HCT-116 세포는, C) N-카드헤린을 발현하는 데 실패했고, 그러므로, 중간엽과 전이성 표현형보다는 2-D에서 상피 표현형을 시사하고, 2-D 암세포 배양에서 생리학적 정밀도의 부족을 보여준다. 막대눈금-100 μM.
도 4. 3차원에서 HCT116 세포의 전이성 이동에 대한 조직 및 종양 미세환경 탄성 계수의 영향. A) 변화하는 기하 구조의 아크릴레이트-기능기화된 PEG-기반 가교제를 사용하면 하이드로겔-기반 오르가노이드 및 종양 기계적 특성을 조작할 수 있다. 유동학적 데이터는 상기 가교제를 사용하여 생성된 하이드로겔의 전단 탄성 계수가 통계적으로 다른(* p <0.05) 것을 보여준다. B) HCT116 세포는 부드러운 100 Pa 하이드로겔-기반 조직 구조체(왼쪽)로 둘러싸인 중심의 딱딱한 젤 코어에 삽입되거나, 또는 딱딱한 4.5 kPa 하이드로겔-기반 조직 구조체(오른쪽)로 둘러싸인 부드러운 100 Pa 코어에 삽입되었다. C) 탑-다운(Top-down), D) 사이드, 및 (E) 등측도(isometric) 종양의 및 종양 위 공간의 마크로-공초점 이미지. 딱딱한 코어, 부드러운 환경의 종양은 성장하지만, 주로 종양의 위치에 남아 있다. 부드러운 코어, 딱딱한 환경의 종양은, 대형 다세포 돌출부 및 응집체의 형태로, 종양으로부터 딱딱한 환경으로 바깥쪽으로 증가된 이동을 나타낸다.
도 5. HCT-116 이동에 대한 마리마스타트(Marimastat)의 효과. A) 마리마스타트는 3-D에서 HCT-116 종양 구조체로부터 외부로의 응집체의 성장을 방해하지만, 대조군 조건에서는 그렇지 않다. B) HCT-116 세포의 이동은 픽셀 수의 길이로 정량화된다. 유의성: 각 시점에서 실험 그룹 간 * p <0.05.
도 6. (A) 인 시츄(in situ) 패터닝에 의한 각 기관 구조체의 제작의 개략적인 작업흐름도. (i) 각 챔버는 상응하는 채널을 통해 상응하는 셀/HA 혼합물(핑크색)로 채워진다. (ii) 인 시츄 패턴화는 포토마스크(회색)를 통한 UV 가교에 의해 달성된다. (iii-iv). 상기 비-가교 용액은 제거된다. 시스템의 배지 흐름은 결장 구조체에서 시작하여 간, 폐, 내피 및 샘플로 흐른다. (B) 생존능은 생존 및 사멸(Live & dead) 분석에 의하여 평가되는데, 살아있는 세포는 녹색으로 염색되고, 죽은 세포는 붉은색으로 염색되었다. 대조군(시간 0), 결장-샘플 및 간 배지(둘 다 7 일차)의 요소(C) 및 알부민(D)의 농도를 각 기관의 수집 저장소에서 측정하였다.
도 7. 맞춤형 의학 종양학을 위해 구현된 종양 오르가노이드 및 전이 플랫폼의 개략도.
도 1b. 성형된(molded) PDMS 조각, 유입구 및 유출구 밸브 및 플라스틱 클램프를 사용한 장치 제작. 오르가노이드 배치("오르가노이드(Orgs.)")는 파란색과 노란색 영역으로 표시된다.
도 1c. 장치의 사진과 묘사, 및 이동하는 암세포를 가지는 흐름 하의 장치 내의 장 및 간 구조체.
도 1d. MOC 장치는 배지 저장소, 버블 트랩 및 마이크로-연동식 펌프와 나란히 배치되고, 장-간(gut to liver) 방향으로 순환 흐름을 제공한다.
도 2. 결장암은 장에서 간으로 전이한다. A) 제1 구조체에서의 HCT-116 세포의 성장 및 RFP-표지된 HCT-116 세포의 순환으로의 다음의 발산. B) (i-ii) RFP-표지된 HCT116 세포의 간 오르가노이드로의 침윤, 다세포 돌출부 및 간-하이드로겔 오르가노이드를 침윤하는 응집체를 통한 것. (화살표-침윤 방향; 점선-오르가노이드 계면(interface); L/H - 간/하이드로겔 구조체). 막대눈금 - 250 μm. 오르가노이드 계면; L/H - 간/하이드로겔 구조체). 막대눈금 - 250 μm. C) 원발생(origin) 위치 및 하류 전이 위치에서 시간에 따른 합성 오르가노이드 이미지 내의 RFP-염색된 HCT-116 종양 면적의 정량화.
도 3. 2차원 조직 배양 플라스틱 상의 HCT-116 세포에서 세포 표면 마커와 MMP의 발현. 조직 배양 플라스틱 상의 HCT-116 세포는 막-결합 A) ZO-1 및 B) β- 카테닌을 나타냈다. 반대로, 2-D HCT-116 세포는, C) N-카드헤린을 발현하는 데 실패했고, 그러므로, 중간엽과 전이성 표현형보다는 2-D에서 상피 표현형을 시사하고, 2-D 암세포 배양에서 생리학적 정밀도의 부족을 보여준다. 막대눈금-100 μM.
도 4. 3차원에서 HCT116 세포의 전이성 이동에 대한 조직 및 종양 미세환경 탄성 계수의 영향. A) 변화하는 기하 구조의 아크릴레이트-기능기화된 PEG-기반 가교제를 사용하면 하이드로겔-기반 오르가노이드 및 종양 기계적 특성을 조작할 수 있다. 유동학적 데이터는 상기 가교제를 사용하여 생성된 하이드로겔의 전단 탄성 계수가 통계적으로 다른(* p <0.05) 것을 보여준다. B) HCT116 세포는 부드러운 100 Pa 하이드로겔-기반 조직 구조체(왼쪽)로 둘러싸인 중심의 딱딱한 젤 코어에 삽입되거나, 또는 딱딱한 4.5 kPa 하이드로겔-기반 조직 구조체(오른쪽)로 둘러싸인 부드러운 100 Pa 코어에 삽입되었다. C) 탑-다운(Top-down), D) 사이드, 및 (E) 등측도(isometric) 종양의 및 종양 위 공간의 마크로-공초점 이미지. 딱딱한 코어, 부드러운 환경의 종양은 성장하지만, 주로 종양의 위치에 남아 있다. 부드러운 코어, 딱딱한 환경의 종양은, 대형 다세포 돌출부 및 응집체의 형태로, 종양으로부터 딱딱한 환경으로 바깥쪽으로 증가된 이동을 나타낸다.
도 5. HCT-116 이동에 대한 마리마스타트(Marimastat)의 효과. A) 마리마스타트는 3-D에서 HCT-116 종양 구조체로부터 외부로의 응집체의 성장을 방해하지만, 대조군 조건에서는 그렇지 않다. B) HCT-116 세포의 이동은 픽셀 수의 길이로 정량화된다. 유의성: 각 시점에서 실험 그룹 간 * p <0.05.
도 6. (A) 인 시츄(in situ) 패터닝에 의한 각 기관 구조체의 제작의 개략적인 작업흐름도. (i) 각 챔버는 상응하는 채널을 통해 상응하는 셀/HA 혼합물(핑크색)로 채워진다. (ii) 인 시츄 패턴화는 포토마스크(회색)를 통한 UV 가교에 의해 달성된다. (iii-iv). 상기 비-가교 용액은 제거된다. 시스템의 배지 흐름은 결장 구조체에서 시작하여 간, 폐, 내피 및 샘플로 흐른다. (B) 생존능은 생존 및 사멸(Live & dead) 분석에 의하여 평가되는데, 살아있는 세포는 녹색으로 염색되고, 죽은 세포는 붉은색으로 염색되었다. 대조군(시간 0), 결장-샘플 및 간 배지(둘 다 7 일차)의 요소(C) 및 알부민(D)의 농도를 각 기관의 수집 저장소에서 측정하였다.
도 7. 맞춤형 의학 종양학을 위해 구현된 종양 오르가노이드 및 전이 플랫폼의 개략도.
이하, 본 발명의 실시예가 도시된 첨부 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구체화될 수 있으며, 여기에 설명된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다; 오히려 이들 실시예는 이 개시가 철저하고 완전하며 당업자에게 본 발명의 범위를 완벽하게 전달하도록 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어는 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명백히 다르게 지시하지 않는 한, 복수 형태 역시 포함하고자 하는 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"이라는 용어는 명시된 특징, 정수, 단계, 운용, 구성 요소 및/또는 그의 그룹 또는 조합의 존재를 나타내지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 운용, 요소, 구성 요소 및/또는 그의 그룹 또는 조합의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 것임을 추가적으로 이해할 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 용어(기술 용어 및 과학 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 용어와 같은 용어는, 본 명세서에서 명시적으로 정의된 경우가 아니라면, 명세서 및 청구범위의 의미에서의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 이상적이거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다는 것을 추가적으로 이해할 것이다. 간략화 및/또는 명확화를 위해 잘 알려진 기능 또는 구성을 상세히 기술하지 않을 수도 있다.
A. 정의
본 발명에서 사용된 용어 "세포"는, 일반적으로 동물세포, 특히 포유동물 및 영장류 세포, 예시로서, 인간, 개, 고양이, 토끼, 원숭이, 침팬지, 소, 돼지, 염소 세포를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 대상 또는 암의 치료가 진행되는 환자로부터 얻어진 것이다. 상기 세포는 바람직하게는 적어도 부분적으로 특정 세포 또는 조직 유형, 예를 들어, 간, 장, 췌장, 림프절, 평활근, 골격근, 중추 신경, 말초 신경, 피부, 면역계 등과 같은 특정 세포 또는 조직 유형으로 분화된다. 어떠한 세포는 암세포일 수 있고, 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 그러한 경우에 그들은 선택적으로 그러나 바람직하게는 (자연적으로 또는 재조합 기술로) 검출가능한 화합물을 발현시키는 암세포일 수 있고, 이 역시 아래에서 추가로 논의된다.
"오르가노이드(organoid)"는 본 명세서에서 "3차원 조직 구조체(three dimensional tissue construct)"와 교환 가능하게 사용되고, 삼차원 또는 다층 구조로 (단층(monolayer)과는 대조적으로) 배열된, 전형적으로는 담체 배지 내에 있는, 살아 있는 세포의 조성물을 지칭한다. 적합한 담체 배지는 하이드로겔을 포함하고, 하기 기술된 바와 같은 가교된 하이드로겔과 같은 하이드로겔을 포함한다. 오르가노이드는 모델링되거나 모방하는 특정 조직 또는 기관에 따라, 하나의 분화된 세포 유형, 또는 2 이상의 분화된 세포 유형을 포함할 수 있다. 일부 오르가노이드는 하기에 논의되는 바와 같이, 암세포를 포함할 수 있다. 오르가노이드가 암세포를 포함하는 경우, 조직 세포를 포함할 수 있고, 및/또는 세포외 기질(또는 이로부터 유래된 단백질 또는 중합체), 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트 등과 그를 조합한 세포 없는 조직 모방물(tissue mimic)을 포함할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 세포는 세포외 기질 또는 가교된 기질과 함께 혼합되어 오르가노이드 또는 구조체를 형성하지만, 다른 구체예에서는 스페로이드 또는 오르가노이드와 같은 세포 응집체는 미리 형성된 후, 세포외 기질과 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "성장 배지(Growth media)"는 본 발명을 수행하는데 사용된 세포를 유지시키는 임의의 천연 또는 인공 성장 배지(전형적으로 수성 액체)일 수 있다. 예를 들어, 필수 배지 또는 최소 필수 배지(minimal essential media: MEM), 또는 이글 최소 필수 배지 (Eagle's minimal essential medium: EMEM) 및 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium DMEM)와 같은 그의 변이형뿐만 아니라, 혈액, 혈청, 혈액 혈장, 림프액 등, 그의 합성 모방물을 포함하지만 그에 한정되지는 않는다. 일부 구체예에서, 성장 배지는 pH 색 지시약(예를 들어, 페놀 레드)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피검 화합물(Test compound)" 또는 "후보 화합물(candidate compound)"은 제1 부위로부터 제2 부위로의 암세포의 확산을 억제하는 활성을 결정하는 임의의 화합물일 수 있다. 설명을 목적으로, 마리마스타트(Marimastat) (N-[2,2-디메틸-1-(메틸카르바모일)프로필]-2-[히드록시-(히드록시 카르바모일)메틸]-4-메틸-펜탄아미드(N-[2,2-dimethyl-1-(methylcarbamoyl)propyl]-2-[hydroxy-(hydroxycarbamoyl)methyl]-4-methyl-pentanamide))가 피검 화합물로 사용된다. 그러나, 임의의 화합물이 사용될 수 있으며, 전형적으로 유기 화합물, 예를 들어 단백질, 펩티드, 핵산 및 작은 유기 화합물(지방족, 방향족 및 혼합 지방족/방향족 화합물)과 같은 유기 화합물이 사용될 수 있다. 후보 화합물은 조합 기술에 의해 무작위로 생성되는 것을 포함하는 임의의 적합한 기술에 의하여 생성되거나, 및/또는 임의의 특정 표적에 기초하여 합리적으로 설계될 수 있다. 예를 들어, A.M. Stock et al., Targets for anti-metastatic drug development, Curr. Pharm. Des. 19(28): 5127-34 (2013)를 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 "검출가능한 화합물(Detectable compound)"은 형광 단백질(예를 들어, 붉은색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질 등), 효소, 형광 또는 방사성 그룹에 결합되는 항체 또는 다른 표지(label)에 커플링된 항체가 특이적으로 결합할 항원성 단백질 또는 펩티드, 또는 기타 적합한 검출가능한 화합물일 수 있다. 검출가능한 화합물은 암세포에서 자연적으로 발생하는 화합물(예를 들어, 비-암 세포보다 암세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 세포 마커 단백질)이거나, 또는 유전 공학/재조합 DNA 기술에 의해 암세포에 삽입된 것(즉, 이종성)일 수 있다.
B. 조성물
본 발명의 조성물은 "바이오잉크(bioink)" 내에 살아 있는 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 "바이오잉크"는 가교가능한 중합체, 사후-침적 가교 그룹 또는 제제; 및 기타 선택적인 성분, 성장 인자, 개시제(예컨대, 가교의), 물(균형을 이루기 위해) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 조성물은 바람직하게는 하이드로겔의 형태이다. 조성물의 다양한 구성 요소 및 특성은 하기에서 더 논의된다.
세포 . 상기한 바와 같이, 본 발명을 수행하는데 사용되는 세포는 바람직하게는 동물 세포(예를 들어, 조류, 파충류, 양서류 등)이고, 일부 구체예에서는 바람직하게는 포유류 세포(예를 들어, 개, 고양이, 마우스, 래트, 원숭이, 유인원, 인간). 세포는 분화된 세포 또는 미분화된 세포일 수 있으나, 일부 구체예에서는 조직 세포(예를 들어, 간 세포(liver cell)과 같은 간세포(hepatocyte), 췌장 세포, 심장 근육 세포, 골격근 세포 등)이다. 또한 상기한 바와 같이, 일부 실시예에서, 상기 세포는 대상으로부터 또는 암 치료가 진행되는 환자로부터 얻을 수 있다.
세포의 선택은 생성되는 특정 오르가노이드에 달려있다. 예를 들어, 간 오르가노이드의 경우, 간(liver) 간세포(hepatocyte)를 사용할 수 있다. 말초 신경 또는 중추 신경 오르가노이드의 경우, 말초 신경 세포, 중추 신경 세포, 신경교세포(glia cell), 또는 그의 조합이 사용될 수 있다. 뼈 오르가노이드의 경우, 뼈 골아세포(osteoblast), 뼈 파골세포(osteoclast) 또는 그의 조합이 사용될 수 있다. 폐 오르가노이드의 경우, 폐 기도 상피 세포가 사용될 수 있다. 림프절 오르가노이드의 경우, 여포성 수지상(follicular dendritic) 림프 세포, 섬유아세포성 망막(fibroblastic reticular) 림프 세포, 백혈구(leukocyte), B 세포, T 세포, 또는 그의 조합이 사용될 수 있다. 평활근 또는 골격근 오르가노이드의 경우, 평활근 세포, 골격근 세포 또는 그의 조합이 사용될 수 있다. 피부 오르가노이드의 경우, 피부 케라틴 세포(keratinocyte), 피부 멜라닌 세포(melanocyte) 또는 그의 조합이 사용될 수 있다. 상기 세포는 조성물에 초기 통합 시 분화되었을 수 있거나, 또는 차후에 분화하는 미분화 세포가 사용될 수 있다. 환자로부터 수집된 세포는 필요에 따라 역-분화(de-differentiated)되거나 재-분화(re-differentiated)될 수 있다. 추가의 세포가 상기 기술된 조성물 중 임의의 조성물에 첨가될 수 있으며, 후술하는 바와 같은 암세포는 하기 기술된 바와 같이, 제1(primary) 또는 "제1(first)" 오르가노이드에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 선택적으로 사용되는 암세포는 흑색종, 암종, 육종, 모세포종, 신경아교종 및 성상세포종 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 모든 유형의 암세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 암세포는 본 명세서에서 교시된 방법에서 N-카드헤린을 발현하고, 및/또는 상피에서 중간엽으로의 변이(transition)를 나타낸다.
따라서, 다양한 오르가노이드를 형성하기 위해 각 챔버에 침적된 조성물에 대한 세포의 상이한 조합을 선택함으로써, 본 발명은 다양한 암 및 이들의 전이 중 임의의 것에 대한 모델 시스템으로서 작용하는 방식으로 수행될 수 있다. 상이한 셀 조합의 비-한정적인 예는 다음 경우를 포함한다:
(i) 상기 제1 오르가노이드는 장 상피 세포를 결장암 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드가 간, 중추 신경, 말초 신경, 또는 뼈 오르가노이드를 포함하는 것;
(ii) 상기 제1 오르가노이드는 폐 기도 상피 세포를 소세포 폐암 또는 폐 선암종 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 말초 신경, 중추 신경, 간, 또는 뼈 오르가노이드를 포함하는 것;
(iii) 상기 제1 오르가노이드는 유선 상피 세포를 유방암, 선암종 또는 육종 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 간, 말초 신경, 중추 신경(예를 들어, 뇌조직), 뼈, 폐, 림프절, 평활근, 골격근, 또는 피부 오르가노이드를 포함하는 것;
(iv) 상기 제1 오르가노이드는 전립선 세포를 전립선 암세포(prostate acinar cells) 또는 덕트 선암 세포(ductal adenocarcinoma)와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 간, 말초 신경, 중추 신경, 뼈, 폐, 또는 림프절 오르가노이드를 포함하는 것;
(v) 상기 제1 오르가노이드는 케라틴 세포(keratinocyte), 선택적으로 멜라닌 세포 및 흑색종 세포를 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 간, 말초 신경, 중추 신경, 뼈, 폐, 피부, 또는 림프절 오르가노이드를 포함하는 것;
(vi) 상기 제1 오르가노이드는 선택적으로 중추 신경계 세포(예를 들어, 성상교세포, 뉴런 등)로 분화된 중추 신경계 종양 세포(예를 들어, 교모세포종 세포, 성상세포종 세포 등)를 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 중추 신경 오르가노이드를 포함하는 것;
(vii) 상기 제1 오르가노이드는 간 세포를 간암 또는 간세포 암종 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 말초 신경, 중추 신경, 림프절, 폐, 또는 뼈 오르가노이드를 포함하는 것;
(viii) 상기 제1 오르가노이드는 췌장 세포를 췌장 선암 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 말초 신경, 중추 신경, 림프절, 간, 폐, 또는 뼈 오르가노이드를 포함하는 것;
(ix) 제1 오르가노이드는 자궁내막(endometrial) 세포 및 선택적으로 자궁근육층(myometrial) 세포를 자궁내막암, 자궁육종(uterine sarcoma), 또는 자궁육종(uterine carcinosarcoma) 세포와 조합하여 포함하고, 제2 오르가노이드는 폐, 림프절, 간, 뼈, 중추 신경, 피부, 평활근, 또는 골격근 오르가노이드를 포함하는 것; 또는
(x) 제1 오르가노이드는 자궁 경부 점막 세포 및 선택적으로 평활근 세포를 자궁 경부 편평 상피암 또는 선암 세포와 조합하여 포함하고, 제2 오르가노이드는 방광, 뼈, 폐, 간, 평활근, 골격근 또는 장 오르가노이드를 포함하는 것.
상기 세포는 캡슐화되지 않은 세포 또는 이전에 스페로이드에 캡슐화된 세포 또는 예비-형성된 오르가노이드를 포함하는, 임의의 적합한 형태로 조성물에 통합될 수 있다(전술한 바와 같음). 캡슐화되거나 중합체 스페로이드에 포함된 동물 조직 세포는 공지된 기술에 따라 제조될 수 있거나, 일부 경우에는 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, Insphero AG, 3D Hepg2 Liver Microtissue Spheroids (2012); Inspherio AG, 3D InSight TM Human Liver Microtissues, (2012)을 참조한다).
가교가능한 예비 중합체 ( Cross- linkable prepolymers ). 임의의 적합한 예비 중합체는, 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 경우, 침적 이후에 탄성 계수(elastic modulus)를 증가시키기 위해 추가로 가교될 수 있는 한, 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 예비 중합체는 적어도 부분적인 가교 반응을 통해 형성될 수 있다: (i) 올리고사카라이드(예를 들어, 히알루론산, 콜라겐, 그의 조합 및 특히 그의 티올-치환된 유도체) 및 (ii) 제1 가교 제제(예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리알킬렌 글리콜 메타크릴레이트 등과 같은 티올-반응성 가교 제제, 및 특히 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 등; 티올-티올 디설파이드 결합을 생성시키는 티올화된 가교 제제; 티올-금 결합을 형성하는 금 나노 입자의 금 기능기화된 가교제; 등과 그의 조합을 포함함).
가교 그룹(Cross-linking group) . 일부 구체예에서, 조성물은 사후-침적 가교 그룹을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 다이알카인(dialkyne), 다른 알카인-기능기화된 그룹, 아크릴레이트 또는 메타아크릴레이트 그룹, 등과 그의 조합과 같은 다중-팔 티올-반응성 가교 제제가 포함되지만 이에 한정되지는 않는 임의의 적합한 가교 그룹이 사용될 수 있다.
개시제 ( Initiators ). 본 발명의 조성물은 선택적으로, 그러나 일부 구체예에서 바람직하게는, 개시제(예를 들어, 열 또는 광개시제)를 포함할 수 있다. 상기 예비 중합체와 제2(또는 사후-침적) 가교 그룹(예를 들어, 가열시 또는 빛에 노출시) 사이의 반응을 촉매하는 임의의 적합한 개시제가 사용될 수 있다.
성장 인자(Growth factors) . 본 발명의 조성물은 선택적으로, 그러나 일부 구체예에서, 바람직하게는 적어도 하나의 성장 인자(예를 들어, 포함된 특정 세포 및/또는 생산되는 특정 조직 대체물에 적합한)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 성장 인자 및/또는 다른 성장 촉진 단백질은 조직 세포에 상응하는 조직으로부터 탈세포화된 세포외 기질 조성물("ECM")에 제공될 수 있다(예를 들어, 살아 있는 동물 세포가 간세포인 경우 탈세포화 세포 외 간 매트릭스(decellularized extracellular liver matrix); 살아 있는 동물 세포가 심장 근육 세포인 경우 탈세포화된 세포 외 심장 근육 매트릭스; 살아 있는 동물 세포가 골격근 세포인 경우 탈세포화된 골격 근육 매트릭스; 등). 추가적인 콜라겐, 글리코스아미노글리칸, 및/또는 엘라스틴(예를 들어, 세포외 기질 조성물을 보충하기 위해 첨가될 수 있음) 등이 또한 포함될 수 있다.
탄성 계수(Elastic modulus) . 상기 조성물은, 바람직하게는 실온 및 대기압에서 임의의 침적 방법(예를 들어, 압출 침적)이 사용됨에 따라 기판 상에서 조작되고 침적될 수 있도록 충분히 낮은 탄성 계수를 갖는다. 또한, 상기 조성물은 선택적으로, 그러나 일부 구체예에서 바람직하게는, 탄성 계수를 가지되, 실온 및 대기압에서의 탄성 계수가, 후속의 가교(가교가 자발적인 경우, 열적 또는 광 개시 등이든 아니든)될 때까지 침적되는 형상(shape) 또는 배치(configuration)를 실질적으로 유지할 정도로 충분히 높은 탄성 계수를 갖는다. 일부 구체예에서, 조성물은, 침적 전에, 실온 및 대기압에서, 0.05, 0.1 또는 0.5 내지 1, 5 또는 10 킬로파스칼(kilo Pascal), 또는 그 이상의 강성을 갖는다.
B. 장치를 제조하는 방법
하나의 비-한정적이지만, 바람직한, 사용의 방법에서, 상기 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 오르가노이드를 제조하는 방법에 사용된다. 이러한 방법은 일반적으로 다음의 단계를 포함한다:
(a) 전술한 바와 같은 압출 가능한 하이드로겔 조성물을 함유하는 저장소를 제공한 다음,
(b) 기판 상에 하이드로겔 조성물을 침적시키는 단계(예를 들어, 주사기를 통한 압출에 의함); 및 다음에
(c) 상기 하이드로겔의 강성을 증가시키고 상기 3차원 기관 구조체를 형성하기에 충분한 양만큼 상기 예비 중합체를 상기 제2 가교 그룹으로 가교시키는 단계(예를 들어, 상기 하이드로겔을 가열하거나, 하이드로겔 조성물을 빛(주변 광, UV 광)으로 조사하거나, 하이드로겔의 pH를 변화시키는 등에 의함).
일부 구체예에서, 세포를 포함하는 하이드로겔 조성물은 세포가 없는 예비 형성된 3D 오르가노이드 기판의 중앙 영역에 적용되어, 외부 오르가노이드 영역 내부에 별개의 세포-포함 영역(예를 들어, 종양 세포-함유 영역)을 생성한다.
침적 단계는 임의의 적합한 장치로 수행될 수 있으며, 이를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌, H.-W. Kang, S.J. Lee, A.Atala 및 J.J.Yoo, 미국 특허 출원 공개번호 제2012/0089238호 (2012년 4월 12일)에 기술된 바에 따라 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 침적 단계는 패턴화된 침적 단계이다: 즉, 침적은 침적된 조성물이 규칙적 또는 불규칙한 격자, 그리드, 나선형 등과 같은 규칙적 또는 불규칙한 패턴의 형태로 침적되도록 수행된다.
일부 구체예에서, 가교 단계는 실온 및 대기압에서, 상기 하이드로겔의 강성을 1 또는 5에서 10, 20 또는 50 킬로파스칼, 또는 그 이상까지 증가시킨다.
일부 구체예에서, 상기 하이드로겔은 실온 및 대기압에서 상기 가교 단계 (c) 후에 1 또는 5에서 10, 20 또는 50 킬로파스칼의 강성을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 지지하는 중합체(supporting polymer)(예를 들어, 폴리-L-락트산, 폴리(글리콜산), 폴리카프로락톤; 폴리스티렌; 폴리에틸렌 글리콜 등과 폴리(락틱-코-글리콜산)과 같은 그의 공중합체를 포함함)를 상기 기판 상에 상기 하이드로겔 조성물과 인접한 위치에(예를 들어, 상기 하이드로겔을 침적시키는 단계와 동시에, 그 후에, 또는 교호(alternating) 반복과 함께, 및 일부 구현예에서는 상기 가교 단계 이전에) 침적시키는 단계를 더 포함한다.
임의의 적합한 기판이 침적을 위해 사용될 수 있고, 유기 및 무기 기판을 포함하고, 웰, 챔버 또는 그 위에 형성된 채널과 같은 구성이 있거나 없는 기판을 포함한다. 본 명세서에 기재된 특정 생산물에 대해, 상기 기판은 그를 통하여 성장 배지가 순환할 수 있는 제1 유체 도관에 의해 연결된 적어도 2개 이상의 챔버(상기 챔버는 선택적으로 그러나 바람직하게는 유입구 채널 및/또는 유출구 채널과 결합된(associated) 챔버)를 갖는 미세유체소자 장치를 포함할 수 있고, 침적은 각 챔버에서 개별적으로 수행된다. 대안적으로, 상기 기판은 제1 및 제2 평면 부재(예를 들어, 현미경 커버 슬립)를 포함할 수 있고, 상기 침적 단계는 그 평면 부재 상에서 수행될 수 있으며, 상기 방법은 각각의 평면 부재를 미세유체소자 장치의 별도 챔버로 삽입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 후-처리 단계, 예를 들어 챔버를 밀봉하는 단계 및 세포의 생존능을 유지하는 단계,는 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다.
본 발명은 주로 하나의 제2 챔버를 참조하여 설명되지만, 원한다면 동일하거나 상이한 유기 오르가노이드를 갖는 다수의 제2 챔버가 기판 상에 포함될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 제2 챔버는 직렬, 병렬, 또는 그의 조합을 포함하는 임의의 적절한 구성으로 서로, 및 제1 챔버와 연결될 수 있다.
제1 및 제2 챔버, 관련된(associated) 오르가노이드, 유입구, 유출구 및 도관을 운반하는 기판은, 사용하기 위한 추가 구성 요소와 함께 더 큰 장치 내에 설치될 수 있는 독립적인 "카트리지(cartridge)" 또는 하위 조합의 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 이러한 더 큰 장치 구체예에서, 상기 장치는 성장 배지를 제1 챔버로부터 제2 챔버로 순환시키기 위해 제1 챔버와 작동적으로 결합된(operatively associated) 펌프를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 장치는 상기 제1 챔버와 작동적으로 결합된 성장 배지 저장소 및/또는 버블 트랩을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 장치는 상기 제2 챔버를 통해 순환하는 성장 배지를 복귀시키기 위해 상기 제1 및 제2 챔버(및 존재하는 경우 상기 펌프 및 저장소 및/또는 버블 트랩)와 작동적으로 결합된 복귀 도관(return conduit)을 더 포함한다.
C. 포장, 보관 및 운송.
일단 생산되면, 위에서 설명한 것과 같은 하위 조합 또는 "카트리지" 장치를 즉시 사용하거나, 보관 및/또는 운반을 위해 준비할 수 있다.
생산품을 보관하고 운반하기 위해, 물과 혼합된 젤라틴과 같이, 상온(예를 들어, 25℃)에서는 유동성 액체이지만, 냉장 온도(예를 들어, 4℃)에서는 젤화 또는 고형화되는 임시적 보호 지지 매질이 챔버들, 바람직하게는 관련 도관을 실질적으로 또는 완전히 채우기 위해 장치에 첨가될 수 있다. 임의의 유입구 및 유출구 포트는 적절한 캡핑 요소(예를 들어, 플러그) 또는 캡핑 물질(예를 들어, 왁스)로 캡핑될 수 있다. 이어서 상기 장치는 냉각 요소(예를 들어, 얼음, 드라이 아이스, 열전기 냉각기 등)와 함께 포장되고 모두(바람직하게는 절연된) 패키지에 배치될 수 있다.
대안적으로, 상기 생산품을 보관하고 운반하기 위해 폴리(N-이소프로필아크릴아미드 및 폴리(에틸렌 글리콜) 블록 공중합체와 같이, 냉각된 온도(예를 들어, 4℃)에서 유동성 액체이지만, 실내 온도(예를 들어, 20℃) 또는 체온(예를 들어, 37℃)과 같은 따뜻한 온도에서 젤화 또는 고형화되는 임시적 보호 지지 매질을 사용할 수 있다.
수령 즉시, 최종 사용자는 관련 패키지 및 냉각 요소에서 장치를 제거하고, 온도가 상승하거나 하강(임시적 보호 지지 매질의 선택에 따라 다름)하도록 두고, 포트의 캡을 떼어 내고 임시적 보호 지지 매질을 주사기(예를 들어, 성장 배지로 플러싱함으로써)로 제거할 수 있다.
D. 사용의 방법
전술한 바와 같이, 본 발명의 또 다른 양태는 암세포에 대한 항-전이 (또는 다른 생리학적 또는 약리학적) 활성을 위한 피검 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 본 명세서에 기재된 장치를 제공하는 단계;
(b) 상기 제1 챔버로부터 상기 제2 챔버로 성장 배지를 순환시키는 단계;
(c) 상기 제1 오르가노이드에 피검 화합물을 투여하는(예를 들어, 피검 화합물을 성장 배지에 첨가하는 것에 의함) 단계; 및
(d) 상기 피검 화합물이 투여되지 않을 때 상기 제2 오르가노이드에 존재하는 암세포의 수와 비교하여 상기 제2 오르가노이드에서의 암세포의 존재 감소를 결정하는 단계를 포함한다.
암 세포가 검출가능한 화합물을 발현할 때, 제2 챔버는 광학적으로 투명한 윈도우를 가질 수 있고, 상기한 바와 같이, 결정하는 단계는 윈도우를 통해 검출가능한 화합물을 검출함으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 장치는 절차의 끝에서 분해될 수 있고 오르가노이드는 직접 검사될 수 있다.
결정하는 단계는 하나의 경우로, 또는 복수의 경우에 서로 순차적으로 이격된 복수의 시간들(예를 들어, 적어도 하루의 간격으로 이격된, 적어도 두 번의 경우)로 수행될 수 있다.
전술한 일부 구체예에서, 스크리닝은 특정 피검 화합물의 대사 또는 암세포 또는 특정 피검 화합물에 의해 유도된 세포 독성을 포함하는 세포 대사의 평가를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비-한정적인 구체예에서 보다 상세히 설명된다.
실험
재료 및 방법
세포 배양 . 인간 결장암 세포(Human colon carcinoma cells)(HCT-116, 이전에 붉은색 형광 단백질[RFP]로 형질감염됨), 인간 장 내피 세포(Human intestine epithelial cells)(INT-407) 및 인간 간암 세포(human hepatoma cell)(HepG2)을 조직 배양 플라스틱에서 2D로 15 cm 조직-처리된 디쉬에서 90% 컨플루언스(comfluence)될 때까지 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, UT)을 포함한 둘베코 최소 필수 배지(DMEM, Sigma, St. Louis, MO)에서 확장시켰다. 세포는 트립신/EDTA(Trypsin/EDTA)(Hyclone)로 기판에서 분리되고 추가 연구에 사용하기 전에 배지에 재현탁된다.
유체소자 장치 제조 및 유체 회로 작동 . 각 장치는 2 개의 원형 챔버(직경 10 mm, 두께 3 mm)로 구성되며, 각 채널은 개별적으로 주소 지정이 가능한 유입구 및 유출구가 있는 자체 유체 채널을 통해 액세스할 수 있다. 이러한 구조는 전통적인 소프트 리소그래피, 복제 성형 및 레이어-바이-레이어 적층23을 사용하여 제조된다. 간단히 말하자면, 역전된 챔버/채널 구조가 3D 프린팅(Zprinter 450, Z Corp., Rock Hill, SC)으로 제작되어, 금형(mold)으로 사용된다. 폴리디메틸실록산(Sylgard 184, Dow Corning Corporation, Midland, MI)을 금형에 직접 붓고 60℃에서 60 분 동안 경화(cure)시키기 전에, 경화제와 완전히 혼합하고 건조 챔버에서 진공 하에 탈기시켰다. 경화 후, 장치는 면도기를 사용하여 불필요한 물질로부터 분리되고 금형으로부터 제거되었다. 에탄올로 세척한 후, PDMS 층을 적층하고 오르가노이드 통합을 위한 준비를 하였다. 오르가노이드의 도입 후, 유입구 및 유출구 포트를 포함하는 편평한 PDMS 조각을 챔버 및 채널을 덮기 위해 사용하였고, 전체 장치를 밀봉하고 클램핑시켰다. 유체소자 연결은 선-제작된 액세스 가능한 포트를 통해 PDMS 장치와 접하는(interface) 스테인레스 스틸 카테터 커플러(Instech Laboratories, PA) 및 실라스틱 튜빙(Corning, Corning, NY)을 사용하여 이루어졌다.
하이드로겔 오르가노이드 형성 . 오르가노이드는 티올화된 히알루론산(thiolated hyaluronic acid), 티올화된 젤라틴(thiolated gelatin) 및 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)-기반 하이드로겔 시스템(ESI-BIO, Alameda, CA)을 사용하여 형성되었다. 티올화된 HA 및 젤라틴 성분을 0.1% w/v 광개시제(2-히드록시-4'- (2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논, Sigma, St. Louis, MO)를 포함하는 물에 각각 1% w/v로 용해시키고, 2:2:1의 부피비로 2% w/v 선형 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴레이트 가교제 용액과 혼합하였다. 오르가노이드 형성을 위해, 하이드로겔-전구체 용액을 10 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 세포를 재현탁시키기 위해 사용하였다. 결장암 종양 초점을 포함하는 제1 위치 장 오르가노이드 조직은 Int-407 소장 상피 세포와 붉은색 형광 단백질(RFP)-표지된 HCT-116 결장암 세포를 세포 수에 따라 10:1의 비율로 조합하여 형성되었다. 제2 위치 간 오르가노이드는 HepG2 간세포만을 이용하여 형성되었다. 하이드로겔 전구체의 세포 현탁액을 적절한 장치 챔버에 25 μL 분액으로 분주한 후, UV 광 노출을 이용하여 구조체 광중합성을 달성했다. 실험은 전술한 바와 같이 DMEM을 사용하여 수행되었다.
전이-온-어-칩 배양 . MOC 장치에 내장된 이중 오르가노이드 배양은 각 장치 챔버에 오르가노이드가 형성된 후에 수행되었고, 장치 조각이 밀봉되고 함께 클램핑되었다. 실라스틱 튜빙(Sylastic tubing)은 MOCs, 배지 저장소(media reservoirs) 및 버블 트랩을 MP2 프리시젼(Precision) 마이크로-연동식 펌프(Elemental Scientific, Inc., NE Omaha)에 연결하는 데 사용되었다. 추가 튜빙은 펌프를 장치에 추가로 연결하고 저장소로 다시 연결하여, 여러 개의 닫힌 병렬 회로를 형성하였다. 배양 시작시, 4 mL의 배지(DMEM)가 각 저장소 내에 위치하였고, 그 후 마이크로-연동식 펌프에 의해 유체 흐름이 시작되었다. 배지 흐름은 실험 전반에 걸쳐 5 μL/분의 속도로 시작되고 유지되었다. 장치는 만약 배지 저장소의 pH 수준이 떨어지면, 배지 내의 페놀 레드 성분으로 표시되고, 배지 변경이 발생하도록 지속적으로 작동되었다. 배지를 교환하는 동안, 사용된 배지는 시스템에서 제거되고, 원추형 튜브에 위치되고, 원심 분리되어, 순환에 들어간 종양 세포를 잃지 않도록 했다. 사용된 배지는 흡인되고 신선한 DMEM으로 교체되었다. 원추형 튜브는 마치 세포 펠렛이 존재하는 것처럼 처리되었으며 - 배지를 아래 위로 피펫팅(pipetting)하여 재현탁 - 이 배지와 존재하는 임의의 세포는 배지 저장소로 되돌려졌다. MOC 시스템 배양 동안, 오르가노이드 및 형광 RFP-표지된 종양 초점의 존재는 현미경으로 시간이 경과에 따라 기록되었다. 1, 4, 9, 11, 14, 및 17 일차에 제1 오르가노이드의 복합체 이미지(composite image)가 찍히고, 제1 오르가노이드 종양 세포 분산에 따른 제2 위치에서 14, 18, 20 및 24 일차에 복합체 이미지를 촬영하였고, 여기서 오르가노이드는 비-형광 숙주 간 오르가노이드 내에서 RFP-표지된 HCT-116 세포의 진행을 분석하기 위해 광 현미경 및 594 nm에서의 에피플루오레센스(epifluorescence)로 이미지화되었다. RFP-표지된 HCT-116 종양 세포 함량의 백분율은 맞춤형 매트랩(MatLab) 분할 스크립트를 사용하여 측정되었다. 오르가노이드의 하위집합은 21 일차에 조직학적 분석을 위해 고정되었다.
면역조직화학 . 오르가노이드를 4% 파라포름알데히드로 1 시간 동안 고정시키고, 단계별 에탄올 세척 다음 자일렌으로 탈수시키고, 파라핀에 포매하고, 5 ㎛로 절편화 하였다. IHC의 경우, 별도로 명시하지 않는 한 모든 배양은 실온에서 수행했다. 슬라이드를 60℃에서 1 시간 동안 가온시켜 슬라이드에 대한 본딩(bonding)을 증가시켰다. 모든 슬라이드에서 항원 회수를 수행하고 5 분 동안 프로테나아제 K(Proteinase K)(Dako, Carpinteria, CA) 내에서 인큐베이션하여 수득하였다. 5 분 동안 0.05% Triton-X에서 인큐베이션함으로써 절편을 투과성으로 만들었다. 비-특이적 항체 결합은 15 분 동안 단백질 블록 용액(Abcam)에서 인큐베이션함으로써 차단되었다. 절편을 제1 ZO-1(토끼유래, cat. # 61-7300, Invitrogen), β-카테닌(토끼유래, Cat. # 71-2700, Invitrogen), 빈큘린(마우스유래, cat. # V9264, Sigma Aldrich), N-카드헤린(마우스유래, 610921, BD Biosciences) 및 PCNA (토끼유래, Cat. # 07-2162, Millipore)를 모두 항체 희석제(Abcam)로 1:200로 희석하여, 가습 챔버에서 60 분 동안 인큐베이션하였다.
제1 인큐베이션 후, 슬라이드를 5 분 동안 PBS로 3 회 세척되었다. 샘플들은 그 다음에 1 시간 동안 항체 희석제(1:200 희석액)에 적합하게 항-토끼 또는 항-마우스 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 2차 항체(Invitrogen)로 인큐베이션되었다. 세포를 DAPI로 5 분간 대조 염색하고 형광 이미징 전에 1X PBS로 3 회 세척하였다. 음성 대조군은 일차 항체 인큐베이션과 병행하여 수행하였고, 일차 항체 대신에 차단 용액으로 인큐베이션하였다. 면역 반응성은 음성 대조군에서 관찰되지 않았다. 라이카 DM 4000B 직립 현미경 (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL)을 사용하여 중앙 여기 파장이 380 nm, 488 nm, 및 594 nm 인 여기 밴드 필터를 사용하여 에피플루오레센스(epifluorescence)로 이미지화되었다.
오르가노이드 환경 강성 조작 및 이동 추적 . 종양 세포 이동에 대한 물리적 종양 미세 환경 변수의 영향을 평가하기 위해서, 위에서 설명한 오르가노이드의 변형물이 형성되었다. 하이드로겔 전체에 균질하게 혼합된 세포를 캡슐화하는 대신, 먼저 3-D 오르가노이드 부피를 형성한 다음, 하이드로겔 전구체 용액 중의 5 μL HCT-116 세포의 부피를 오르가노이드 공간의 중심으로 피펫팅하고 UV 광에 1초 노출함으로써 공간 내 중합한다. 이 제조 계획은 구별되는 종양 영역이 내부에 있는 외부 오르가노이드 영역을 만들었다. 오르가노이드 및 종양 영역의 탄성 계수는 보다 강건한 하이드로겔을 생성하기 위하여 4-팔 PEG-아크릴레이트 분자(10 kDa MW, Creative PEGWorks, Winston-Salem, NC) 또는 8-팔 PEG-아크릴레이트 가교제 분자(10kDa MW, Creative PEGWorks)를 가지는 선형 PEDGA 가교제 분자(3.4 kDa MW)를 사용함으로써 조정하였다. 오르가노이드 구조체는 2 가지 주요 조건으로 제작되었다: 조건 1 - 연약한 환경(선형 가교제) 내부의 딱딱한(8-팔 가교제) HCT-116 종양 초점; 또는 조건 2 - 딱딱한 환경(8-팔 가교제) 내부의 연약한(선형 가교제) HCT-116 종양 초점. 오르가노이드는 DMEM을 사용하여 위에서 설명한 대로 유지되었다. 7 일 후, 오르가노이드가 고정되고 라이카 TCS LSI 마크로-공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. 최대 프로젝션(2차원 압축 이미지)이 얻어진 초기 종양 영역의 상부 부근에서 각 구조체의 150 ㎛ Z-스택을 취했다.
약물 처리 및 이동 평가 . MOC 시스템 내 가능성 있는 이동 메커니즘을 조사하고, 종양 세포가 약물 개입에 민감한지를 검증하기 위해, 항-매트릭스 메탈로프로테나아제 약물 마리마스타트(Marimastat)의 유효성이 전술한 다중-영역 이동 모델을 사용하여 테스트되었다. 종양 오르가노이드는 위에서 설명한 조건 2(연약한 종양, 딱딱한 조직)를 사용하여 다시 한 번 생성되었으며, 거기서, 결과에서 설명한 바와 같이, HCT-116 세포는 향상된 이동 행동을 보였다. 준비된 시스템의 절반은 정상적인 DMEM을 받은 반면에, 나머지 절반은 DMEM에서 50μM의 마리마스타트(Marimastat, 시그마)를 받았다. 약물-함유 배지는 생리학적 pH로 pH 조정되어 약물에 의한 pH 변화 때문에 혼란스런 결과가 되지 않도록 하였다. 3 일, 7 일 및 10 일에 형광 및 명시야(brightfield) 오버레이(overlay) 이미지를 캡쳐한 후 이미지J(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 시간 경과에 따라 종양에서 세포가 이동하는 거리를 측정했다.
통계 분석 . 데이터는 일반적으로 복제 수의 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 모든 실험은 n = 3 또는 그 이상으로 수행되었다. 두 개의 표본 불평등 분산을 갖는 스튜던트의 티-검정법(Student's t-test)(2-tailed)를 사용하여 값을 비교하였고, p <0.05 이하를 통계적으로 유의하다고 간주했다.
결과
MOC 시스템 내의 종양 오르가노이드 는 장에서 간으로 이동한다 . 오르가노이드는 히알루론산(hyaluronic acid: HA)과 젤라틴-기반 하이드로겔(gelatin-based hydrogel)을 사용하여 세포 캡슐화(도 1A)에 의해 제작되었다. 하이스템(HyStem)은 3차원 배양,11 , 15 종양 모델,10 및 바이오패브리케이션 기술12 -14과 같은 조직 공학 및 재생 의학에 광범위하게 사용되었다16 , 24. 가교제 기하학(선형, 4-팔, 및 8-팔)의 조절은 오르가노이드 탄성 계수를 제어하는데 사용될 수 있고, 이는 이후(later) 포인트에서 기술될 것이다. 각각의 미세유체소자 장치는 기존의 부드러운 리소그래피, 복제 성형 및 레이어바이레이어 적층(도 1B)을 사용하여 제작된, 유체소자 채널로 연결된, 두 개의 원형 챔버 (직경 10 mm, 두께 3 mm)로 구성된다.23 각 세트 챔버는 회로를 통과하는 흐름을 유도하기 위한 마이크로-연동식 펌프 및 배지 저장소에 연결된 유입구와 유출구를 가지고 있다(도 1C-D). 밀봉된 장치에서, 25 μL의 장-종양(gut-tumor) 오르가노이드와 간 오르가노이드가 형성되었으며 그 다음에 마이크로-연동식 펌프에 의해 저장소에서 공급되는, 일정한 10 μL/min 흐름으로 유지되었다. 배양에서 시간의 경과에 따라 1차 오르가노이드 내 종양 초점을 포함하는 RFP-표지된 HCT-116 세포가 증식하였고, RFP-양성 종양 부분은 오르가노이드로부터 순환으로 발산까지, 전형적으로 배양의 14일 차 무렵까지, 크기가 증가하였다(도 2A). 순환에 들어가기 전, 전이성 세포는 이차 간 오르가노이드 구조체에 도달할 수 있고, 생착될 수 있고, 계속 증식하는 다세포 돌출부와 응집체를 통해 침윤할 수 있다(도 2B). 발산에서 이식까지의 시간은 가변적이었지만, 일반적으로 순환에 발산된 후 2 - 3일 이내에 일어났다. 종양이 차지하는 오르가노이드 부위의 백분율은 맞춤형 매트랩 세분화 코드를 사용하여 각 부위에서 합성 이미지를 평가하여 결정되었으며(도 2C), 일차 오르가노이드에서 종양 성장의 추세를 더 보여준다. 형광 HCT-116 세포는 1 일차에 평가된 시야(field of view)의 낮은 비율(0.05% 미만)을 차지했지만, 시간의 경과에 따라 증식하여, 평가된 시야에서 거의 20%가 평가되었다. 중요하게도, 이 데이터는 또한 콜로니화된 후 전이 하류 위치에서 종양 성장의 개시 및 지속을 보여준다. 이 두 번째 성장 곡선에서는, 14 일차에 HCT-116 세포가 관찰되지 않았는데, 이는 본 발명자가 처음으로 종양 세포가 순환에 들어가는 것을 관찰한 때이고, 그러나 그들은 18 일차에 신속하게 발판을 마련하고 그 다음 6 일 동안 수와 종양의 비율이 급속히 증가한다.
전이된 결장암 종양 초점은 종양형성 및 중간엽 표현형의 마커를 나타낸다. 간 오르가노이드로의 생착 및 침윤을 관찰한 후, 전이부위를 포함하는 제2 위치 구조체가 고정되고 면역염색 프로토콜을 위한 조직 절편을 생성하도록 처리되었다. 구조체의 HepG2-기반 간 부분(RFP가 없는 것으로써 특정됨)은 전형적인 상피 표현형을 나타냈다. 이 부분은 세포막 주위에 집중적으로 발현되는, 세포-세포 부착의 모든 마커들인 ZO-1 타이트 정션 단백질, β-카테닌과 빈큘린을 가지는 세포들이 보였다. 전이 영역에서 RFP에 의해 강조된 전이 부분에서는, ZO-1, β-카테닌 및 빈큘린은 일반적으로 세포막을 따라 발현되지 않았다(데이터는 기재하지 않음). 이러한 세포-세포 결합의 결핍은 HCT-116 세포가 운동성(motile) 표현형을 가지고 있음을 시사하며, 이는 이러한 전이부위를 형성하도록 이동할 것으로 예상되는 것이다.25 , 26 흥미롭게도 HCT-116 세포의 세포질 및 핵 영역에서 β-카테닌 염색이 양성으로 - 이는 WNT/β-카테닌 경로가 활성화될 때 상피에서 중간엽으로의 전환(EMT)에 일반적으로 나타나는 현상이다. 활성화는 β-카테닌이 핵으로 이동하여 침윤성 전이 표현형을 유도할 수 있는 전사 인자처럼 행동하도록 한다.27 -29 또한, N-카드헤린과 PCNA는 중간엽 및 증식성 표현형을 나타내는 종양 부위에서 양성으로 염색되었다(데이터는 기재하지 않음). 대조적으로, 2차원 조직 배양 플라스틱에서 배양된 HCT-116 세포는 상피 세포로 나타나, 막-결합 ZO-1과 β-카테닌의 양성 발현을 보이고, N-카드헤린을 발현하지 못하는 것으로 나타났고(도 3), 그러므로 충분한 정확도로 종양 생물학을 재현하기 위해 3-D 시스템을 사용할 필요를 뒷받침한다.
이 데이터는 본 발명자의 MOC 시스템이 장에서 간으로 전이하는 동안 발생하는 로지스틱(logistic)의 팩시밀리(facsimile)를 제공한다는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명자가 간 조직체에서 전이를 평가할 때 본 발명자는 전이/중간엽 및 상피 마커 프로파일에 각각 상응하는, 전이 RFP-양성 부분과 RFP-음성 간 부분 사이의 명확한 구분의 증거를 관찰했다.
3-D에서의 종양 세포 이동은 환경적 기계적 특성 및 약물 처리의 변화에 반응한다. 튜닝 가능한(tunable) 하이드로겔 시스템, 새로운 배지 또는 다른 물질을 쉽게 도입할 수 있는 저장소가 있는 폐쇄형 순환 시스템 및 이미징을 위한 명확한 하우징으로 구성된 이 시스템은, 따라서 이를 이용하여 시스템을 조작하고 하류(downstream) 결과를 평가하며, 연구(play)에 생물학적 메커니즘을 조사하고, 약물 검사 연구를 수행할 수 있는 강력한 도구이다. 이 시스템의 유용성을 입증하기 위해 본 발명자는 그러한 실험을 수행하기 시작했다. 일 적용에서, 본 발명자는 전이성 침윤에 대한 물리적 미세 환경 변수의 영향을 조사하기 위해 이 플랫폼을 사용했다. 다른 적용에서, 본 발명자는 기존의 항-암제가 인간 환자에서와 그랬던 것과 동일한 효과를 본 시스템에서도 가지고 있는지 여부를 결정하기 위하여 MOC 시스템을 사용하기 시작했다. 만약 이 상관관계가 검증될 수 있다면, 본 발명자는 MOC 시스템이 약물 후보 스크리닝에서 견고하게 구현될 수 있으며, 나중에 환자-유래 종양 생검을 통합함으로써 예측 도구로서 맞춤형 의학에 적용될 수 있다고 믿는다.
사용된 하이드로겔 시스템의 모듈식 특성은, 가교 제제를 교환할 수 있는 능력을 지지함으로써, 하이드로겔 네트워크 내에서 유효 가교 밀도를 변화시키고, 차후에 탄성 계수를 변화시켜 가교제 기하 구조(goemetry)를 변화시킴으로써 조직 및 종양 탄성 계수 E' 또는 전단 탄성 계수 G' 의 제어를 허용하므로 유익하다. 상기 기술된 선형 PEGDA 가교제(MW 3.4 kDa)을 사용함으로써, 하이드로겔은 G' 가 약 100 Pa 으로 형성된다. 그러나 대신에 8-팔 PEG 아크릴레이트 가교제를 사용함으로써, 약 4500 Pa의 G' 값이 얻어질 수 있다(도 4A). 4-팔 가교제를 사용하는 것은 2000 Pa 근처의 G' 를 갖는 하이드로겔을 초래한다. 본 발명자의 전이 플랫폼에서 이러한 3-D 환경을 사용함으로써, 본 발명자는 이러한 기계적 특성의 조작이 HCT-116 이동 행동에 중요한 영향을 미친다는 것을 발견했다. HCT-116 종양 초점은 이산 강성(100 Pa 또는 4500 Pa)의 주변 하이드로겔 내부에서 이산 미세 환경 강성 수준(100 Pa 또는 4500 Pa)으로 생성되었다(도 4B). 도 4C-E는 부드러운 하이드로겔 내의 딱딱한 종양 구조체(조건 1) 또는 딱딱한 하이드로겔 내의 부드러운 종양 구조체(조건 2)의 마크로-공초점 탑-다운 뷰, 사이드 뷰 및 등축도(isometric) 뷰를 보여준다. 조건 1에서, 본 발명자는 주변 하이드로겔로 종양의 상부 계면 근처에서 몇몇의 성장을 관찰했다. 그러나, 조건 2에서, 본 발명자는 대형 다세포 돌출부 및 응집체가 종양 구조체의 상부로부터 위쪽 및 외부로 이동하는 것을 관찰하였다. 이것은 조직이나 종양의 뻣뻣함 수준이 종양 세포를 유도하거나 촉진하여 증가된 이동 및 침윤 행동, 아마도 전이를 촉진시킬 수 있음을 본 발명자에게 암시한다. 흥미롭게도, 마우스 모델에서 정상 조직이 WNT 경로의 상향 조절과 관련된, 침윤성 전이를 지지한다는 것이 입증되었다. 반대로, 콜라겐 가교가 감소된 녹아웃 마우스 모델에서 조직의 E' 감소는, 동일한 전이성 종양이 전이하지 못했지만, 원래 위치에서 증가했다.31 종양 침윤성에 대한 물리적 매개 변수의 영향 개념은 새로운 개입의 목표 방향을 제시할 수 있다. 아마도 어떤 사람은 일시적으로 변경된 조직의 기계적 성질을 인위적으로 유도하여, 전이 가능성을 줄일 수도 있다. 또는, 종양 및 그 주변 환경의 물리적 매개 변수가 종양 악성 및 전이 가능성을 나타내는 바이오마커 역할을 매우 적어도 할 수 있다.
이 시스템을 약물 테스트에 사용하는 방법을 입증하기 위해, 본 발명자는 HCT-116 구조체에서 마리마스타트가 실제로 주변 환경으로의 종양 세포 침윤을 감소시킬 수 있음을 보여주었다(도 5). 또한, 이 테스트는 MOC의 종양이 매트릭스 메탈로프로테아제 억제성 약물에 예상대로 반응함을 입증하여, 도 2에 설명된 전이 관찰의 유효성 검사로도 사용되었다. 종양 오르가노이드는, 위에서 설명한 조건 2(부드러운 종양[~ 100 Pa], 딱딱한 조직[~ 4500 Pa])를 사용하여, 상기 설명된 대로 생성되어, 주변 3차원 환경으로의 전이성 침윤을 악화시켰다. 준비된 시스템의 절반은 정상적인 DMEM을, 나머지 절반은 DMEM에서 50μM의 마리마스타트 (Marimastat, sigma)를 받았다. 3 일, 7 일 및 10 일차에 겹쳐진(overlaid) 형광 및 명시야(brightfield) 이미지가 캡쳐되었고, 이로부터 시간 경과에 따라 종양 밖으로 세포가 이동하는 거리를 측정했다. 도 5A는 10 일 차의 겹쳐진 이미지를 보이는데, 이는 RFP-양성 세포 집합체가 더 적게 존재하는 마리마스타트(Marimastat) 그룹과 비교하여 비 약물 상태에서 종양 코어로부터 멀어지게 이동하는 RFP-양성 다세포 HCT-116 응집체의 증가된 존재를 설명한다. 도 5B는 비 약물 조절 조건이 각 시간 지점에서 숫자 픽셀의 이동 거리를 현저하게 증가시키는, 이 이동 활성의 정량화를 도시한다. 즉, 마리마스타트의 투여는, 주로 아마도 MMPs의 억제를 통해, 전이성 HCT-116 세포의 이동을 크게 막았다.21 , 32 또한, 이 특정 시스템에서는 수행되지 않았지만, 본 발명자는 최근에 유사한 3-D 종양 오르가노이드 시스템이 5-FU에 인 비보 조직이 하는 것과 비슷한 방식으로 반응하는 것을 보여주었다.33
토론
3-D 오르가노이드를 사용하는 MOC 시스템의 개념은 암 연구에서 많은 현재의 단점을 해결한다. 무엇보다 먼저, 동물 모델은 종종 긴 실험 시간 코스와 연구 규모를 조정하는 어려움 때문에 빠른 연구와 고성능 시나리오에 최적이 아니다. 그들은 제한된 메커니즘 조작만 지지할 수 있으며, 결과를 모니터링하는 간단한 방법은 항상 제공하지는 않는다. 아마도, 가장 중요하게는, 동물에서의 결과가 인간에서의 결과를 반드시 예측하지 않는다는 것이다. 암 연구에서 가장 흔히 사용되는 다른 도구, 전통적인 2-D 배양은, 인 비보 조직의 3차원 미세 환경을 재현하지 못한다.3 여러 가지 이유로, 2-D에서 효과가 있는 것으로 밝혀진 약물 투여량은 종종 환자들에게 적용될 때 종종 덜 효과적이다.4 , 5 MOC 시스템은 인간-유래 세포를 사용하고 3-D 하이드로겔-지지된 환경에서 이들을 사용함으로써 이러한 문제를 해결한다. 본 발명자는 숙주 조직이나 종양 부위에 따라 적절한 세포-세포 상호 작용을 관찰했으며, 종양은 약물에 적절하게 반응했다. 많은 연구 접근법에서 또 다른 부족한 측면은, 제1 종양 위치(site)와 전이의 하류 위치, 또는 위치들 모두를 고려하지 않는 것이다. MOC는 연구자가 원발생(originating) 조직에서 표적 조직으로의 전이 이동의 동역학을 요약할 수 있도록, 이 위치들을 대표하는 조직-공학적 3차원 오르가노이드를 구체적으로 포함하도록 개념화되었다. 이것은 원발생 종양과 전이에서 세포의 표현형이 크게 다를 수 있기 때문에 중요하다.21 , 22 종양 유형과 미세 환경을 모두 연구하는 능력은 전이 모델을 전체적으로 정확하게 모델링하는 데 필수적이다. 본 발명자의 시스템은 시간의 경과에 따라 제1 위치 오르가노이드에서 종양 성장을 성공적으로 지지한다. 본 발명자가 채용한 전이성 결장 암종 세포인 HCT-116은, 오르가노이드에서 분리되어 순환(circulation)에 들어갈 수 있었다. 더욱이, 및 중요하게는, 순환 세포는 장치 내부의 하류 오르가노이드에 생착되어, 오르가노이드의 3차원 공간을 침윤하고, 크기가 계속 증가한다. 이것은 최근 본 발명자가 개발 한 간-종양 스페로이드-기반 오르가노이드 모델과 일치하며, 간 숙주 조직 내에서 전이성 종양이 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 나타났다.6 중요하게도, 이 연구와 이전에 참고된 연구에서 둘 다에서 나온 면역 염색 데이터는 상피 오르가노이드 환경 및 중간엽 마커를-발현하는 종양 초점 사이의 명확한 구별을 입증한다. 특히, 이것은 HCT-116 세포가 전통적인 2-D 조직 배양 플라스틱에서 배양되는 것과 극적으로 다르며, 이들은 성질에서 간엽 및 전이성 대신에 상피 세포로 나타난다. 여기에 설명된 데이터는 시스템에서 수행된 첫번째 검증 및 입증 실험의 모음이다. 그러나, 본 발명자는 또한 종양의 미세 환경 변화를 유발하도록 모듈화된 하이드로겔 기술을 사용하여 시스템을 조작하거나, 화학 요법 약물을 투여함으로써 조작할 수 있는 능력을 입증했으며, 그 후에 이러한 요인의 영향을 직접 관찰하고 간단한 방식으로 문서화하여, 그럼으로써 이 플랫폼이 다수의 역학 및 스크리닝 적용에 사용되도록, 본 발명자가 이 플랫폼이 가지고 있다고 믿는 중요한 잠재력을 입증하였다.
참고문헌
1.
I. J. Fidler, S. J. Kim and R. R. Langley, J Cell Biochem, 2007, 101, 927-936.
2.
R. R. Langley and I. J. Fidler, Endocr Rev, 2007, 28, 297-321.
3.
L. A. Kunz-Schughart, J. P. Freyer, F. Hofstaedter and R. Ebner, J Biomol Screen, 2004, 9, 273-285.
4.
W. J. Ho, E. A. Pham, J. W. Kim, C. W. Ng, J. H. Kim, D. T. Kamei and B. M. Wu, Cancer science, 2010, 101, 2637-2643.
5.
M. Drewitz, M. Helbling, N. Fried, M. Bieri, W. Moritz, J. Lichtenberg and J. M. Kelm, Biotechnol J, 2011, 6, 1488-1496.
6.
A. Skardal, M. Devarasetty, C. Rodman, A. Atala and S. Soker, Ann Biomed Eng, 2015.
7.
A. Polini, L. Prodanov, N. S. Bhise, V. Manoharan, M. R. Dokmeci and A. Khademhosseini, Expert opinion on drug discovery, 2014, 9, 335-352.
8.
K. H. Benam, S. Dauth, B. Hassell, A. Herland, A. Jain, K. J. Jang, K. Karalis, H. J. Kim, L. MacQueen, R. Mahmoodian, S. Musah, Y. S. Torisawa, A. D. van der Meer, R. Villenave, M. Yadid, K. K. Parker and D. E. Ingber, Annual review of pathology, 2015, 10, 195-262.
9.
S. V. Murphy, A. Skardal and A. Atala, J Biomed Mater Res A, 2013, 101, 272-284.
10.
A. Skardal, S. F. Sarker, A. Crabbe, C. A. Nickerson and G. D. Prestwich, Biomaterials, 2010, 31, 8426-8435.
11.
A. Skardal, L. Smith, S. Bharadwaj, A. Atala, S. Soker and Y. Zhang, Biomaterials, 2012, 33, 4565-4575.
12.
A. Skardal, J. Zhang, L. McCoard, S. Oottamasathien and G. D. Prestwich, Adv Mater, 2010, 22, 4736-4740.
13.
A. Skardal, J. Zhang, L. McCoard, X. Xu, S. Oottamasathien and G. D. Prestwich, Tissue Eng Part A, 2010, 16, 2675-2685.
14.
A. Skardal, J. Zhang and G. D. Prestwich, Biomaterials, 2010, 31, 6173-6181.
15.
J. Zhang, A. Skardal and G. D. Prestwich, Biomaterials, 2008, 29, 4521-4531.
16.
J. A. Burdick and G. D. Prestwich, Adv Mater, 2011, 23, H41-56.
17.
G. D. Prestwich, J Cell Biochem, 2007, 101, 1370-1383.
18.
G. D. Prestwich, Acc . Chem . Res., 2008, 41, 139-148.
19.
G. D. Prestwich and J. W. Kuo, Curr Pharm Biotechnol, 2008, 9, 242-245.
20.
D. D. Allison and K. J. Grande-Allen, Tissue Eng, 2006, 12, 2131-2140.
21.
G. Karakiulakis, C. Papanikolaou, S. M. Jankovic, A. Aletras, E. Papakonstantinou, E. Vretou and V. Mirtsou-Fidani, Invasion & metastasis, 1997, 17, 158-168.
22.
C. Franci, J. Zhou, Z. Jiang, Z. Modrusan, Z. Good, E. Jackson and H. Kouros-Mehr, PLoS One, 2013, 8, e58183.
23.
Y. Xia and G. M. Whitesides, Annu Rev Mater Scie, 1998, 28, 153-184.
24.
G. D. Prestwich, J Control Release, 2011, 155, 193-199.
25.
N. Gavert and A. Ben-Ze'ev, F1000 biology reports, 2010, 2, 86.
26.
D. J. McGrail, R. Mezencev, Q. M. Kieu, J. F. McDonald and M. R. Dawson, FASEB J, 2014.
27.
J. Behrens, Ann N Y Acad Sci, 2000, 910, 21-33; discussion 33-25.
28.
H. Brantjes, N. Barker, J. van Es and H. Clevers, Biol Chem, 2002, 383, 255-261.
29.
S. Orsulic, O. Huber, H. Aberle, S. Arnold and R. Kemler, J Cell Sci, 1999, 112 ( Pt 8), 1237-1245.
30.
M. Tania, M. A. Khan and J. Fu, Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 2014, 35, 7335-7342.
31.
K. R. Levental, H. Yu, L. Kass, J. N. Lakins, M. Egeblad, J. T. Erler, S. F. Fong, K. Csiszar, A. Giaccia, W. Weninger, M. Yamauchi, D. L. Gasser and V. M. Weaver, Cell, 2009, 139, 891-906.
32.
M. H. Zaman, L. M. Trapani, A. L. Sieminski, D. Mackellar, H. Gong, R. D. Kamm, A. Wells, D. A. Lauffenburger and P. Matsudaira, Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103, 10889-10894.
33.
A. Skardal, M. Devarasetty, C. Rodman, A. Atala and S. Soker, Ann Biomed Eng, 2015, In Press .
34.
R. Lang, M. M. Stern, L. Smith, Y. Liu, S. Bharadwaj, G. Liu, P. M. Baptista, C. R. Bergman, S. Soker, J. J. Yoo, A. Atala and Y. Zhang, Biomaterials, 2011, 32, 7042-7052.
실시예
2
전이 역학(dynamics) 연구를 위한 복수의 기관-온-어-칩(Organ-on-a-Chip) 플랫폼
암 전이에 관여하는 세포 현상은 "종자 및 토양(seed and soil)" 가설에 의하여 연구되거나 또는 해부학적 및 기계적 경로로 정의되었다[1]. 결장암(colorectal cancer: CRC)의 경우, 종양 세포는 아마도 인접 림프 배수로(drainage) 때문에, 주로 간으로 전이한다. 통합된 세포외 기질(ECM)에 기초한 스캐폴드(scaffold)와 함께, 기관-온-어칩(OC) 플랫폼의 모듈 및 미세유체소자 레이아웃의 발전은, 인 비보 환경 조성 및 역학(mechanics)을 재현하는 데 도움이 된다[2-3]. 인 시츄 패턴화된 히알루론산 하이드로겔 기관; HepG2/C3A(간), A549(폐), HUVEC(내피) 및 HCT 116(결장) 세포를 등거리 미세유체소자 관류 챔버에 설치하였다. 본 발명자는 3D ECM 기초한 스캐폴드에 포매된 >500 μm의 인 시츄 패턴화된 장기를 가지는 고정밀 다중 OC 장치의 제작을 달성했다.
도 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명자는 3D ECM 구조체를 가지는 다중 기관 플랫폼을 제조하고 등거리의 미세유체소자 시스템을 통해 연결했다. 기관 구조체는 인 시츄 패터닝(in situ patterning)을 사용하여 개별 미세유체소자 챔버에서 격리되어 있었고 1 주일 동안, 지금까지는, 생존능을 유지할 수 있다. 각 구조체의 건강 상태는 대표 대사 산물에 의해 평가되었다. 이 시스템은 인 비보 환경 조성 및 물리적 흐름의 인 비트로 모방을 제공한다. 플랫폼은 결장암 전이에 대한 조직 환경 요인 대(vs.) 유동적 네트워크 설계의 영향을 평가하는 데 유용하다.
참고문헌:
1. Skardal, A. Biomaterial. 33: 4565-4575 (2012).
2. Skardal, A. Biotechnol Bioeng. 9999: 1-13 (2016).
3. Oleaga, C. Scientific Reports. 6:20030 (2016).
실시예
3
종양 오르가노이드-온-어-칩 플랫폼
정밀 의학-주도의 치료법 스크리닝
정밀 의학 - 종양 유전 프로파일을 기초로 환자를 위한 치료법을 확인하는 것 - 이 중요한 관심을 끌고 있다. 그러나, 실무에서는, 핵심 돌연변이가 확인된 후에도, 종양전문의는 몇가지 약물 옵션을 남겨 둠으로써 유효한 치료법을 예측하는 데 시스템이 필요하다는 것을 암시한다. 도 7에 개략적으로 도시된 바와 같이, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 장치는 임상에서 일반적으로 관찰되는 돌연변이를 갖는 종양 세포주의 "도구 상자(toolbox)"를 사용하여 뉘앙스가 있는(nuanced) 돌연변이-특이적 약물 반응을 입증함으로써 종양 오르가노이드를 정밀 의학에 사용하기 위한 플랫폼을 제공한다. 비-제한적인 예로, 결장암(CRC) 오르가노이드는 미세유체소자 장치에서 히알루론산 및 젤라틴 하이드로겔에 CRC 세포(Caco2 및 SW480-WT; HCT116-KRASMT; 및 HT29-BRAFMT)를 캡슐화함으로써 생성되었다. 각 유형의 CRC 오르가노이드는 그 다음에 임상 CRC 약물의 패널에 적용되었다: 5-FU 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)(WT 종양에 유효한 제1 라인 약제), 트라마티닙(Tramatinib) (KRASMT 종양에 유효한 EGFR 경로 약물) 및 소라페닙(sorafenib) 또는 레고라페닙(regorafenib) (BRAFMT 종양에서 유효한 EGFR 경로 약물). 48-시간 처리 후, 오르가노이드는 MTS 분석에 의해 미토콘드리아 대사(mitochondrial metabolism)에 대해 평가되었다. EGFR 유전 상태와 관련이 있는 약물 반응의 명확한 차이가 나타났다. Caco2와 SW480 오르가노이드(WT)는 5-FU에 특히 민감하였으며, 다른 약물에는 덜 민감했다. HCT116 오르가노이드는 5-FU와 소라페닙에 특히 민감했다. HT29 오르가노이드는 보통 전반적으로 더 내성적이었지만, 레고라페닙에 약간의 민감성을 보였다. 여기에 설명된 결과는 3D 종양 오르가노이드가 종양 유전 프로파일을 기초로 한 약물 스크리닝에 성공적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 상기 방법 및 시스템은 전이 동역학 및 환자 생검-유래 종양 세포로의 변이(transitioning)를 평가하는데 유용하며, 상기한 바와 같이 개별 환자에게 맞춤화된 종양-온-어-칩 시스템을 사용하여 잠재적으로 유효한 약물을 스크리닝하도록 구현될 수 있어, 투여하기에 가장 효과적이고 안전한 치료법을 결정할 수 있다.
참고문헌:
1. Skardal A, et al., Biofabrication. 7(3): 031001 (2015).
2. Skardal A, et al., Biotechnol Bioeng. (2016).
3. Skardal A, et al., Ann Biomed Eng. 43(10): 2361-73 (2015).
전술한 내용은 본 발명의 설명이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 다음의 청구 범위에 의해 정의되고, 청구 범위의 균등물도 여기에 포함된다.
Claims (20)
- 암 세포의 전이를 검사하기 위한 유용한 장치로서,
(a) 제1 챔버;
(b) 적어도 하나의 제2 챔버;
(c) 상기 제1 및 제2 챔버를 연결하고 그들 사이의 유체 연통(communication)을 제공하는 적어도 하나의 제1 도관;
(d) 상기 제1 챔버 내의 제1 오르가노이드, 상기 제1 오르가노이드는 포유류 암세포를 포함하는 것인 제1 오르가노이드;
(e) 상기 제2 챔버(들)에 대해 별도로 선택되고 제2 챔버(들) 내의 적어도 하나의 제2 오르가노이드; 및
(f) 선택적으로 상기 제1 챔버, 각각의 상기 제2 챔버 및 상기 제1 도관 내의 성장 배지를 포함하는 장치. - 청구항 1에 있어서, 상기 제1 오르가노이드는
(i) 포유류 조직 세포, 선택적으로 세포외 기질 내의 것; 또는
(ii) 상기 암세포를 보유하는 세포외 기질;
(iii) 선택적으로, 적어도 부분적으로 상기 제1 오르가노이드 둘레에 또는 위에 있는 혈관의 층 또는 림프 내피 세포층; 및
(iv) 선택적으로, 면역 시스템 세포(예를 들어, 쿠퍼 세포, 대식세포, 단핵구, 호중구 등)를 더 포함하는 것인 장치. - 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 챔버 내에 광학적으로 투명한 윈도우를 더 포함하는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 오르가노이드는 하이드로겔(예를 들어, 가교된 하이드로겔)을 더 포함하는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 챔버에 연결된 유체 유입구 및 각각의 상기 제2 챔버에 연결된 유체 유출구를 더 포함하는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 챔버들은 직렬, 병렬, 또는 그의 조합으로 서로 연결되는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암세포는 검출가능한 화합물을 발현하는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 제2 오르가노이드는 폐, 림프절, 간, 뼈, 중추 신경, 피부, 평활근, 또는 골격근 오르가노이드를 포함하는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 제1 오르가노이드는 결장 상피 세포를 결장암 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드가 간, 중추 신경, 말초 신경, 또는 뼈 오르가노이드를 포함하는 것;
(ii) 상기 제1 오르가노이드는 폐 기도 상피 세포를 소세포 폐암 또는 폐 선암종 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 말초 신경, 중추 신경, 간, 또는 뼈 오르가노이드를 포함하는 것;
(iii) 상기 제1 오르가노이드는 유선 상피 세포를 유방암, 선암종 또는 육종 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 간, 말초 신경, 중추 신경, 뼈, 폐, 림프절, 평활근, 골격근, 또는 피부 오르가노이드를 포함하는 것;
(iv) 상기 제1 오르가노이드는 전립선 세포를 전립선 암세포(prostate acinar cells) 또는 관성 선암 세포(ductal adenocarcinoma)와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 간, 말초 신경, 중추 신경, 뼈, 폐, 또는 림프절 오르가노이드를 포함하는 것; 또는
(v) 상기 제1 오르가노이드는 케라틴 세포(keratinocyte), 선택적으로 멜라닌 세포 및 흑색종 세포를 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 간, 말초 신경, 중추 신경, 뼈, 폐, 피부 또는 림프절 오르가노이드를 포함하는 것;
(vi) 상기 제1 오르가노이드는, 선택적으로 중추 신경계 세포(예를 들어, 성상교세포, 뉴런 등)로 분화된, 중추 신경계 종양 세포(예를 들어, 교모세포종 세포, 성상세포종 세포 등)를 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 중추 신경 오르가노이드를 포함하는 것;
(vii) 상기 제1 오르가노이드는 간 세포를 간암 또는 간세포 암종 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 말초 신경, 중추 신경, 림프절, 폐, 또는 뼈 오르가노이드를 포함하는 것;
(viii) 상기 제1 오르가노이드는 췌장 세포를 췌장 선암 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 말초 신경, 중추 신경, 림프절, 간, 폐, 또는 뼈 오르가노이드를 포함하는 것;
(ix) 제1 오르가노이드는 자궁내막(endometrial) 세포 및 선택적으로 자궁근육층(myometrial) 세포를 자궁내막암, 자궁육종(uterine sarcoma), 또는 자궁육종(uterine carcinosarcoma) 세포와 조합하여 포함하고, 상기 제2 오르가노이드는 폐, 림프절, 간, 뼈, 중추 신경, 피부, 평활근, 또는 골격근 오르가노이드를 포함하는 것; 또는
(x) 제1 오르가노이드는 자궁 경부 점막 세포 및 선택적으로 평활근 세포를 자궁 경부 편평 상피암 또는 선암 세포와 조합하여 포함하고, 제2 오르가노이드는 방광, 뼈, 폐, 간, 평활근, 골격근, 또는 장 오르가노이드를 포함하는 것인 장치. - 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 챔버로부터 상기 제2 챔버로 상기 성장 배지를 순환시키기 위한 상기 제1 챔버와 작동적으로 결합된(operatively associated) 펌프를 더 포함하는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 챔버와 작동적으로 결합된 성장 배지 저장소 및/또는 버블 트랩을 더 포함하는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 챔버를 통해 순환된 성장 배지를 상기 제1 챔버로 복귀시키기 위한 상기 제1 및 제2 챔버(및 존재하는 경우 상기 펌프 및 저장소 및/또는 버블 트랩)와 작동적으로 연결된 복귀 도관(return conduit)을 더 포함하는 것인 장치.
- 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 겔화된 형태로 상기 제1 및 제2 챔버 내에 임시적 보호 지지 매질(protective support media)과 함께 용기(container) 내에 포장된 것이고, 및 선택적으로 상기 용기 내에 냉각 요소와 함께인 것인 장치.
- 암 세포에 대한 항-전이 활성을 위해 피검 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 장치를 제공하는 단계;
(b) 상기 제1 챔버로부터 상기 제2 챔버로 성장 배지를 순환시키는 단계;
(c) 상기 제1 오르가노이드에 피검 화합물을 투여하는(예를 들어, 피검 화합물을 성장 배지에 첨가함에 의함) 단계; 및
(d) 상기 피검 화합물이 투여되지 않은 경우 상기 제2 오르가노이드에 존재하는 암세포의 수와 비교하여, 상기 제2 오르가노이드에서 존재하는 암세포의 감소를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 청구항 14에 있어서, 상기 암세포는 검출가능한 화합물을 발현하고, 상기 제2 챔버는 광학적으로 투명한 윈도우를 가지고, 상기 결정하는 단계는 상기 윈도우를 통해 상기 검출가능한 화합물을 검출함으로써 수행되는 것인 방법.
- 청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 결정하는 단계는 서로 순차적으로 이격된 복수의 시간들(예를 들어, 적어도 하루의 간격으로 이격된, 적어도 두 번의 경우)로 수행되는 것인 방법.
- 개체에서 암세포에 대한 항-암 또는 항-전이 활성을 위해 피검 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 청구항 1 내지 12의 장치를 제공하는 단계로서, 상기 포유류 암세포는 상기 개체로부터 분리된(예를 들어, 종양 생검에 의함) 것인 단계;
(b) 상기 제1 챔버로부터 상기 제2 챔버로 성장 배지를 순환시키는 단계;
(c) 상기 제1 오르가노이드에 피검 화합물을 투여하는(예를 들어, 피검 화합물을 성장 배지에 첨가함에 의함) 단계; 및
(d) 상기 피검 화합물이 투여되지 않은 경우 상기 제1 및/또는 제2 오르가노이드에 존재하는 암세포의 수와 비교하여, 상기 제1 및/또는 제2 오르가노이드에서 존재하는 암세포의 감소를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 청구항 17에 있어서, 상기 암세포는 검출가능한 화합물을 발현하고, 상기 제1 및 제2 챔버는 광학적으로 투명한 윈도우를 가지고, 및 상기 결정하는 단계는 상기 윈도우를 통해 상기 검출가능한 화합물을 검출함으로써 수행되는 것인 방법.
- 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 결정하는 단계는 서로 순차적으로 이격된 복수의 시간들(예를 들어, 적어도 하루의 간격으로 이격된, 적어도 두 번의 경우)로 수행되는 것인 방법.
- 청구항 14 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검 화합물은 저분자 독소 또는 암-특이적 항체와 같은, 항암 치료제인 것인 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562236361P | 2015-10-02 | 2015-10-02 | |
| US62/236,361 | 2015-10-02 | ||
| US201562241872P | 2015-10-15 | 2015-10-15 | |
| US62/241,872 | 2015-10-15 | ||
| PCT/US2016/054611 WO2017059173A1 (en) | 2015-10-02 | 2016-09-30 | Methods and apparatus for modeling cancer metastasis in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180056767A true KR20180056767A (ko) | 2018-05-29 |
Family
ID=58424354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020187012233A KR20180056767A (ko) | 2015-10-02 | 2016-09-30 | 인 비트로 암 전이 모델링을 위한 방법 및 장치 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11047847B2 (ko) |
| EP (1) | EP3356512B1 (ko) |
| JP (1) | JP7002040B2 (ko) |
| KR (1) | KR20180056767A (ko) |
| AU (1) | AU2016331081B2 (ko) |
| CA (1) | CA3000718A1 (ko) |
| WO (1) | WO2017059173A1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210108865A (ko) * | 2020-02-25 | 2021-09-03 | 고려대학교 산학협력단 | 환자 맞춤형 약물 선택을 위한 정보 제공 방법 |
| KR20220096652A (ko) * | 2020-12-31 | 2022-07-07 | 서울대학교병원 | 암세포 전이능 측정 시스템 및 이를 이용한 암세포 전이능 측정 방법 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018027023A1 (en) * | 2016-08-03 | 2018-02-08 | Wake Forest University Health Sciences | Cancer modeling platforms and methods of using the same |
| AU2017342467B2 (en) | 2016-10-14 | 2024-03-28 | Wake Forest University Health Sciences | Compositions, cell constructs, and methods of making and using the same |
| WO2018081425A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Wake Forest University Health Sciences | Hydrogen-bonding compounds, compositions comprising the same, and methods of preparing and using the same |
| US11649424B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-05-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Smart micro bioreactor platform for high throughput mechanical stimulation of cardiac microtissue |
| US11826757B2 (en) | 2017-08-02 | 2023-11-28 | Wake Forest University Health Sciences | Niches-on-a-chip |
| DE102017217738B3 (de) * | 2017-10-05 | 2018-10-04 | Eberhard Karls Universität Tübingen | Mikrophysiologische Organoidkultur |
| US11629329B2 (en) | 2017-10-11 | 2023-04-18 | Wake Forest University Health Sciences | Bioink compositions and methods of preparing and using the same |
| EP3746785A4 (en) * | 2018-02-02 | 2022-05-11 | Wake Forest University Health Sciences, Inc. | IMMUNOTHERAPY RELATED ORGANOIDS AND METHODS OF PREPARING AND USING THEREOF |
| EP3830244A4 (en) * | 2018-07-27 | 2022-04-27 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | ORGAN-ON-CHIP MODELS FOR PREDICTIVE SCREENING |
| US11993785B2 (en) | 2018-08-07 | 2024-05-28 | Wake Forest University Health Sciences | Immersion deposition methods and compositions for use in the same |
| US11213608B2 (en) | 2018-08-14 | 2022-01-04 | Wake Forest University Health Sciences | Compositions including gelatin nanoparticles and methods of use thereof |
| US20220025465A1 (en) * | 2018-11-14 | 2022-01-27 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Systems and methods for characterizing and treating cancer |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4734372A (en) * | 1983-02-04 | 1988-03-29 | Brown University Research Foundation | Cell culturing methods and apparatus |
| AU2004292180A1 (en) | 2003-11-13 | 2005-06-02 | Genentech, Inc. | Screening assays and methods of tumor treatment |
| WO2007095192A2 (en) * | 2006-02-10 | 2007-08-23 | Tengion Inc. | Bioreactor for organ reconstruction and augmentation |
| US20090076584A1 (en) * | 2007-09-19 | 2009-03-19 | Xtent, Inc. | Apparatus and methods for deployment of multiple custom-length prostheses |
| US20120089238A1 (en) | 2010-10-06 | 2012-04-12 | Hyun-Wook Kang | Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus |
| CN113699105A (zh) | 2011-12-23 | 2021-11-26 | 人类起源公司 | 包含脱细胞并再群体化的胎盘血管支架的类器官 |
| JP2014033626A (ja) | 2012-08-08 | 2014-02-24 | Juntendo | ヒト癌上皮細胞の遠隔転移のモデルマウス作出方法 |
| US10012640B2 (en) * | 2013-02-14 | 2018-07-03 | Cfd Research Corporation | Cell culture device with an array of microfluidic networks |
| EP2971057A4 (en) * | 2013-03-15 | 2016-11-02 | Kiyatec Inc | BIOREACTOR SYSTEM |
| US9023719B2 (en) * | 2013-09-17 | 2015-05-05 | Sandisk Technologies Inc. | High aspect ratio memory hole channel contact formation |
| EP3097178A4 (en) | 2014-01-22 | 2017-09-06 | Zpredicta, Inc. | Method and apparatus for isolating invasive and metastatic cells for evaluating therapeutics and prediction of metastatic capacity |
| JP6284147B2 (ja) | 2014-03-07 | 2018-02-28 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 乳癌の骨髄高転移性マウス乳癌細胞株の樹立方法 |
| EP3209718B1 (en) | 2014-10-24 | 2023-06-07 | Wake Forest University Health Sciences | Tissue-mimicking hydrogel compositions for biofabrication |
| AU2016331079B2 (en) | 2015-10-02 | 2022-07-14 | Wake Forest University Health Sciences | Spontaneously beating cardiac organoid constructs and integrated body-on-chip apparatus containing the same |
| WO2018027023A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | Wake Forest University Health Sciences | Cancer modeling platforms and methods of using the same |
| AU2017342467B2 (en) | 2016-10-14 | 2024-03-28 | Wake Forest University Health Sciences | Compositions, cell constructs, and methods of making and using the same |
| US20210324311A1 (en) | 2016-10-14 | 2021-10-21 | Wake Forest University Health Sciences | Multi-organ "body on a chip" apparatus utilizing a common media |
| WO2018081425A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Wake Forest University Health Sciences | Hydrogen-bonding compounds, compositions comprising the same, and methods of preparing and using the same |
| US11826757B2 (en) | 2017-08-02 | 2023-11-28 | Wake Forest University Health Sciences | Niches-on-a-chip |
| US11629329B2 (en) | 2017-10-11 | 2023-04-18 | Wake Forest University Health Sciences | Bioink compositions and methods of preparing and using the same |
| EP3746785A4 (en) | 2018-02-02 | 2022-05-11 | Wake Forest University Health Sciences, Inc. | IMMUNOTHERAPY RELATED ORGANOIDS AND METHODS OF PREPARING AND USING THEREOF |
-
2016
- 2016-09-30 AU AU2016331081A patent/AU2016331081B2/en active Active
- 2016-09-30 KR KR1020187012233A patent/KR20180056767A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-09-30 JP JP2018517132A patent/JP7002040B2/ja active Active
- 2016-09-30 WO PCT/US2016/054611 patent/WO2017059173A1/en active Application Filing
- 2016-09-30 CA CA3000718A patent/CA3000718A1/en active Pending
- 2016-09-30 US US15/765,085 patent/US11047847B2/en active Active
- 2016-09-30 EP EP16852659.8A patent/EP3356512B1/en active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210108865A (ko) * | 2020-02-25 | 2021-09-03 | 고려대학교 산학협력단 | 환자 맞춤형 약물 선택을 위한 정보 제공 방법 |
| KR20220096652A (ko) * | 2020-12-31 | 2022-07-07 | 서울대학교병원 | 암세포 전이능 측정 시스템 및 이를 이용한 암세포 전이능 측정 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20180348203A1 (en) | 2018-12-06 |
| EP3356512B1 (en) | 2021-03-31 |
| WO2017059173A1 (en) | 2017-04-06 |
| CA3000718A1 (en) | 2017-04-06 |
| JP7002040B2 (ja) | 2022-02-04 |
| JP2018533931A (ja) | 2018-11-22 |
| EP3356512A1 (en) | 2018-08-08 |
| US11047847B2 (en) | 2021-06-29 |
| AU2016331081B2 (en) | 2021-04-29 |
| EP3356512A4 (en) | 2019-04-10 |
| AU2016331081A1 (en) | 2018-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20180056767A (ko) | 인 비트로 암 전이 모델링을 위한 방법 및 장치 | |
| Skardal et al. | A reductionist metastasis‐on‐a‐chip platform for in vitro tumor progression modeling and drug screening | |
| KR102534195B1 (ko) | 암 모델링 플랫폼 및 그를 사용하는 방법 | |
| Seo et al. | In vitro models of tumor vessels and matrix: engineering approaches to investigate transport limitations and drug delivery in cancer | |
| Ng et al. | A perfusable 3D cell–matrix tissue culture chamber for in situ evaluation of nanoparticle vehicle penetration and transport | |
| EP2526978B1 (en) | Device and method of generating in vitro blood vessels | |
| JP2019534000A (ja) | 一般的な培地を活用する、多臓器「生体機能チップ」装置 | |
| US20200115667A1 (en) | Vascularized microfluidic platforms | |
| Johnson et al. | The applications and challenges of the development of in vitro tumor microenvironment chips | |
| US20240026261A1 (en) | Engineering of organoid culture for enhanced organogenesis in a dish | |
| Tutty et al. | Three-dimensional spheroids for cancer research | |
| US11782051B2 (en) | Systems and methods for reperfusion injury | |
| WO2024026566A1 (en) | Microfluidic cell spheroids and organoids culture insert for disease modeling and screening of therapeutics | |
| Gómez Vázquez | Development of in vitro blood-brain barrier models: from traditional 2D models to microfluidics | |
| Gadde | Development of a three dimensional in vitro vascularized tumor platform for investigating the role of the tumor stroma on inflammatory breast cancer | |
| Mayo | Modular Tissue Engineering of Bone Microenvironment as an Extravasation Model | |
| Anand | Development of a FRET-based 3D in vitro breast tumor model and its application in evaluating drug-induced apoptosis | |
| Netti et al. | Tumoral bioengineered microtissues in microfluidic platforms to investigate on chip Colorectal cancer liver metastasis | |
| Sánchez Salazar | Integration of 3D bioprinting and tumor-on-chip platforms for the fabrication of simple and relevant colorectal cancer models |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |