KR20180047734A - 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법 - Google Patents

타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법에 관한 것으로서, 덱스트란 고분자에 나노구조체 형성을 위한 짧은 핵산 서열 혹은 상보적 서열과 특정 타겟분자 포획을 위한 핵산 압타머 서열을 연결하고 각각의 고분자 핵산 물질을 혼합하여 나노구조체를 형성시킨 후에 회전환 증폭 효소 반응을 통하여 반복되는 핵산 압타머를 형성하고, 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체는 특정한 타겟분자를 효율적이며 선택적으로 포획하는 효과가 있다.

Description

타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법{Method of Preparing Amplified Aptamer Nanoconsturcts Based on Dextran Polymer for Selectively Capturing Target Protein}
본 발명은 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 덱스트란 고분자에 나노구조체 형성을 위한 짧은 핵산 서열 혹은 상보적 서열과 특정 타겟분자 포획을 위한 핵산 압타머 서열을 연결하고 각각의 고분자 핵산 물질을 혼합하여 나노구조체를 형성시킨 후에 회전환 증폭 효소 반응을 통하여 반복되는 핵산 압타머를 형성함으로써 특정한 타겟분자를 효율적이며 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법에 관한 것이다.
최근에 압타머가 암의 치료 및 진단에 각광을 받고 있다. 압타머는 특이적 3차원 형성을 형성하는 15-40개의 단일가닥 올리고뉴클레오티드로서, 스템 루프(stem loop) 구조를 가지며, 특정 분자에 특이적으로 결합하는 성질이 있다. 압타머는 화학적으로 합성이 용이하며, 화학적 변형이 쉽고 열에 안정적이면서 타겟에 대한 특이도가 매우 높은 화합물이다. 압타머의 서열은 SELEX(selective evolution of ligands by exponential enrichment)란 방법으로 찾을 수 있으며, 이미 수백 종의 압타머 서열이 공개되어 있다. 압타머는 특이적으로 타겟과 결합한다는 점에서 흔히 항체와 비교되기도 하며 면역반응이 없다. 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속 해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 'chemical antibody'라 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성도 매우 높다.
먼저 압타머의 장점들을 살펴보면 다음과 같다.
항체는 분자 구조가 크기 때문에(~150kDa) 생산하는데 어려움이 있고 변형(modification) 또한 용이하지 못한 반면, 압타머는 약 20~60mer 정도 길이의 핵산으로 구성되어 있는 작은 분자 구조이고, 여러 필요한 변형이 용이한 장점을 가지고 있다. 압타머는 항체에 비해 안정성이 매우 높다. 단백질이나 항체 의약품의 경우 실온에서 보관이나 운반이 불가능하지만 압타머는 가능하고, 심지어 멸균 후에도 기능을 유지할 수 있으며, 만약 변성(denaturation)이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생(regeneration)이 가능하기 때문에 특히 장시간 또 반복사용이 요구되는 진단용으로의 응용이 매우 용이하다.
새로운 압타머 발굴 방법은 다음과 같다.
SELEX를 통해 새로운 압타머를 선별하는 과정을 살펴보면 먼저 (i) DNA 합성 및 RNA인 경우에는 시험관내 전사(in vitro transcription) 방법을 이용하여 다양한 형태를 가지는 핵산 라이브러리를 만든다. (ii) 항체가 여러 종류의 항원과 결합하는 것처럼 핵산 구조체 라이브러리 안에 있는 다양한 핵산 구조체들 (압타머 후보 분자들)은 다양한 표적물질과 결합할 수 있는 능력을 가지고 있고 따라서 다음 과정으로 원하는 표적분자와 결합할 수 있는 핵산 구조체만을 선별하는 과정을 거치게 된다. (iii) 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)와 같은 방법을 통해 결합하지 않은 핵산구조체는 제거되고 표적분자에 결합하는 것만을 선택적으로 얻을 수 있게 된다. (iv) 마지막으로 표적분자로부터 핵산 구조체를 분리(elution)하게 되고 그 핵산을 증폭시킨 후 얻은 핵산 구조체를 이용하여 다시 이 과정들을 5~15번 정도 더 반복함으로써 매우 우수한 결합력과 특이성을 보이는 압타머를 발굴할 수 있다.
위와 같이 SELEX를 통해 얻어진 초기의 압타머들은 더 안정적이고 강력한 압타머로 개량하고자 하는 후-SELEX(post-SELEX) 과정을 수행하기도 한다. 대표적인 예로 RNA 압타머의 리보오스 2'-OH를 2'-F나 2'-NH2, 2'-O-메틸기로 치환하는 것이다. 이런 변화를 거치게 되면 핵산 분해효소에 대한 저항성이 우수하여 혈액 내에서 안정성이 10,000배 이상 증가된 압타머를 얻을 수 있게 된다. 이 외에도 압타머를 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자나 디아실글리세롤(diacylglycerol) 혹은 콜레스테롤(cholesterol)을 접합시켜 혈액 내에서 빠르게 소멸되는 것을 줄일 수 있다. 그리고 5'말단이나 3'말단에 비오틴(biotin)을 결합시킨 압타머를 만들어 스트렙타아비딘 지지체(streptavidin support)에 부착시켜 바이오 센서/칩 분야에서 사용될 수 있다(Dausse E. et al., Aptamers: a new class of oligonucleotides in the drug discovery pipeline, Curr . Opin . Pharmacol, 2009).
이러한 기술적 배경하에서, DNA을 이용해 개발된 DNA 구조체는 상보적인 핵산끼리 서열 특이적 상호작용을 함으로써 자기조립되며, 자기조립된 나노단위 구조체인 DNA 구조체는 염기 서열을 조절함으로써 pH와 온도, 빛 등 주변 환경 변화에 의해 구조변환을 유도함으로써 역동적인 움직임을 유발한다. 하지만 DNA가 접합된 나노입자에 대해서는 많은 연구가 진행되고 있지만 혈관을 따라 주입했을 때 비특이적인 축적이 많아 독성을 유발할 수 있어 암세포만 표적으로 삼아 약물체를 전달하는 시스템에 대한 연구가 필요한 실정이다.
R. Namgung et al.에는 덱스트란-siRNA 나노구조체를 이용하여 siRNA를 전달하여 암을 치료하는 방법을 개시하고 있다(R. Namgung and W.J. Kim, Small, 2012, 8, No. 20, 3209-3219).
한편, 혈관내피세포 성장인자(VEGF)-A는 먼저 혈관내피세포의 중요한 생존 인자로 확인되었다. 생물학적 기능의 관점에서 VEGF는 가장 강력한 신생혈관유발인자 중 하나이며, 혈관 투과성의 중요한 조절자이다. VEGF는 습성 연령 관련 황반 변성(wet-type age-related macular degeneration, AMD) 및 혈관 신생종양성장과 같은 병리학적 혈관신생 관련 질환의 주요한 조절자로 널리 허용되고 있다. 또한, 혈관 투과성의 강력한 증강제로서, 또한 당뇨병 황반 부종을 포함하여 병원성 혈관 누수와 관련된 질환에 깊이 관여한다.
항 VEGF의 치료는 습성 AMD, 당뇨병성 황반부종 및 암에 대한 가장 중요한 치료 방법으로 간주된다. (1) 항체(베바시주맙(bevacizumab), 라니비주 맙(ranibizumab)) 또는 (2) VEGF 또는 VEGF 수용체(VEGFR)를 중화하기 위한 압타머(pegaptanib), (3) VEGF mRNA를 타겟팅하기 위한 siRNA (4) VEGF 수용체에 대한 소분자 티로신 키나제 저해제(lapatinib, sunitinib) 및 (5) VEGF와 VEGFR의 상호작용을 저해하는 용해성 VEGF 수용체(sVEGFR)를 이용하여 VEGF 경로를 블록킹하는 다양한 기술들이 있다(Cardones, A. R. et al., Current pharmaceutical design 2006, 12, 387-394; Vasudev, N. S. et al., Angiogenesis 2014, 17, 471-494).
최근에는 많은 항-VEGF 약물이 VEGF-관련 질환의 치료에 사용된 예가 보고되었다. 그러나 생리학적 조건하에 체내에서의 이들 약물의 효율, 독성 및 안정성이 불확실한 문제가 있다(Kamba, T. et al., British Journal of Cancer 2007, 96, 1788-1795; Al-Husein, B. et al., Pharmacotherapy : The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy 2012, 32, 1095-1111)
VEGF165에 대한 RNA 압타머인 pegaptanib는 신생혈관 AMD의 치료를 위한 항-VEGF 약물로 FDA에 의하여 처음 승인되었다. 이 압타머 약물은 안전하나, 항 VEGF 단클론 항체인 라니비주맘(ranibizumab) 및 IgG의 Fc 부분에 융합된 VEGF 수용체 1 및 2인 애플리버셉트(aflibercept)과 같은 다른 대체 항-VEGF 약물과 비교하였을 때 그리 효율적이지 않아, 실제 임상에서는 거의 사용되지 않는다(Gragoudas, E. S. et al., The New England journal of medicine 2004, 351, 2805-2816; Schmidt-Erfurth, U. et al., The British journal of ophthalmology 2014, 98, 1144-1167). VEGF에 대한 결합 친화도 및 생체 내 안정성은 항-VEGF 압타머의 생물학적 효과를 영향을 미치는 주요한 인자이다. 뉴클레아제에 대한 내성을 향상시키기 위하여 구조적으로 변형시킬지라도 pegaptanib는 정맥주사 후에 9.3시간이고, 피하주사 후에 12시간으로 생체 내 반감기가 비교적 짧다는 문제점이 있다(Tucker, C. E. et al., Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications 1999, 732, 203-212).
이에, 본 발명자는 덱스트란 고분자에 나노구조체 형성을 위한 짧은 핵산 서열 혹은 상보적 서열과, 특정 타겟 분자 포획을 위한 핵산 압타머 서열을 화학 반응으로 연결한 후에 각각의 고분자-핵산 물질을 혼합하여 나노구조체를 형성하고, 회전환 증폭 효소 반응을 통한 핵산 압타머를 형성할 경우, 높은 타겟 분자 포획 효율성을 가질 수 있으며, 나아가 상기 나노구조체를 활용하여 질병의 원인인 혈관내피세포 성장인자를 선택적으로 포획함으로써 암과 황반부종 질병치료 효과가 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 특정한 타겟 분자를 효율적으로 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체를 유효성분으로 함유하는 암과 황반부종 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 타겟분자에 대한 압타머 서열(Apt) 및 나노구조체를 형성할 수 있는 DNA 서열을 덱스트란 고분자에 각각 결합시켜 덱스트란 고분자 기반의 DNA 압타머(Dex-DNA-Apt)를 생성시키는 단계; (b) 타겟분자에 대한 압타머 서열 및 상기 DNA 서열과 상보적인 서열(cDNA)을 덱스트란 고분자에 각각 결합시켜 덱스트란 고분자 기반의 cDNA 서열을 가진 덱스트란 고분자 기반의 cDNA 압타머(Dex-cDNA-Apt)를 생성시키는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 생성된 Dex-DNA-Apt와 (b) 단계에서 생성된 Dex-cDNA-Apt를 혼합한 다음, 어닐링시켜 나노구조체(NCs)를 생성시키는 단계; 및 (d) 상기 나노구조체를 회전환 증폭 효소 반응을 통해 상기 압타머(Apt)를 증폭시켜 Apt가 증폭된 나노구조체(aNCs)를 생성시키는 단계를 포함하는 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 제조방법에 의해 제조된 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체를 제공한다.
본 발명은 또한, 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체를 유효성분으로 함유하는 암 및 황반부종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 합성한 나노구조체를 이용하여 질병의 원인이 되거나 질병과 관련이 깊은 물질을 타겟분자로 설정하고 해당 타겟분자를 선택적이고 효과적으로 포획해 질병을 치료하거나 예방할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조반응을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Dextran-CHO의 합성을 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Dex-DNA/VEGF, NCs 및 aNCs의 크기를 확인한 TEM 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 aNCs의 안정성을 효소결합 면역흡착 분석법으로 확인한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 압타머의 증폭시간 및 핵산 압타머 프라이머의 양에 따른 VEGF의 포획률을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의하여 쥐 암 모델에서의 aNCs를 이용한 혈관내피세포 성장인자 포획 및 암 성장 저해 효과를 확인한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의하여 쥐 암 모델에서의 aNCs를 이용한 혈관내피세포 성장인자 포획 및 암 성장 저해 효과를 조직학적 검사로 확인한 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의하여 쥐 황반부종 모델에서의 aNCs를 이용한 혈관내피세포 성장인자 포획 및 황반부종 성장 저해 효과를 확인한 사진이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 특정한 타겟분자를 효율적이며 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체를 제조하였다. 먼저 덱스트란 고분자에 나노구조체 형성을 위한 짧은 핵산 서열 혹은 상보적 서열과 특정 타겟분자 포획을 위한 핵산 압타머 서열을 화학 반응으로 연결하고 각각의 고분자 핵산 물질을 혼합하여 나노구조체를 형성시키고, 높은 타겟분자의 포획 효율성을 지니기 위하여 회전환 증폭 효소 반응을 통한 반복되는 핵산 압타머를 형성하였으며, 이러한 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체 를 활용하여 질병의 원인 물질인 혈관내피세포 성장인자를 선택적으로 포획함으로써 암과 황반부종 질병 치료 효과를 확인할 수 있었다.
본 발명은 R. Namgung et al.(Namgung and W.J. Kim, Small, 2012, 8, No. 20, 3209-3219)의 플랫폼(platform)을 참고하여, 즉, 덱스트란(dextran)에 siRNA를 연결하여 나노구조체(nanoconstructs)를 제조한다는 개시로부터 덱스트란(dextran)에 DNA를 연결하여 나노구조체(nanoconstructs)를 제조하는 것으로 적용하였다. 또한, VEGF 표적 압타머(aptamer)를 덱스트란(dextran)에 마찬가지로 연결하고 이를 증폭하여 VEGF에 대한 표적성을 높인 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 타겟분자에 대한 압타머 서열(Apt) 및 나노구조체를 형성할 수 있는 DNA 서열을 덱스트란 고분자에 각각 결합시켜 덱스트란 고분자 기반의 DNA 압타머(Dex-DNA-Apt)를 생성시키는 단계; (b) 타겟분자에 대한 압타머 서열 및 상기 DNA 서열과 상보적인 서열(cDNA)을 덱스트란 고분자에 각각 결합시켜 덱스트란 고분자 기반의 cDNA 서열을 가진 덱스트란 고분자 기반의 cDNA 압타머(Dex-cDNA-Apt)를 생성시키는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 생성된 Dex-DNA-Apt와 (b) 단계에서 생성된 Dex-cDNA-Apt를 혼합한 다음, 어닐링시켜 나노구조체(NCs)를 생성시키는 단계; 및 (d) 상기 나노구조체를 회전환 증폭 효소 반응을 통해 상기 압타머(Apt)를 증폭시켜 Apt가 증폭된 나노구조체(aNCs)를 생성시키는 단계를 포함하는 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법을 개략적으로 도시하여 도 1에 나타내었다. 특히 타겟분자가 혈관내피세포 성장인자(VEGF)인 경우를 나타내었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 있어서 타겟분자가 혈관내피세포 성장인자(VEGF)인 경우, VEGF에 대한 압타머 서열(Apt)은 CCCGTCTTCCAGACAAGAGTGCAGGG-3'로, C-G까지 총 26nts의 서열이 VEGF를 표적하는 압타머 서열이다. 5'-TTTT에서 TTTT는 덱스트란과의 화학 반응성을 높이기 위하여 연장(elongation)한 것이다. 나노구조체를 형성할 수 있는 DNA 서열 (ODN: TTT TCC GCA AGA TGG ATC GCA CGC C, cODN: TTT TGG CGT GCG ATC CAT CTT GCG G, 각 25 nts)이다.
DNA의 서열은 표 1에 나타내었다. 5' 말단의 변형은 중괄호로 나타내었다.
Figure pat00001
본 발명에 있어서, 상기 타겟분자는 혈관내피세포 성장인자(VEGF), BSA, ATP, HCV 및 HIV-1으로 구성된 군에서 1종 이상 선택될 수 있으며, DNA 기반 압타머가 개발된 표적 물질이면 모두 사용 가능하다. 즉, VEGF 외의 물질도 압타머 디자인만 일치되도록 되도록 해주면 어느 물질이든 선택하여 포획될 수가 있다. 예를 들어 BSA에 대한 압타머를 특정해 덱스트란 나노구조체를 제조하여 BSA만을 포획할 수 있다.
본 발명에서는 특정 타겟분자를 선택적이고 효율적으로 포획하기 위하여 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체를 제조하는 데에 있어서, 특정한 타겟 단백질로 암 주변에서 흔히 발견되며 황반부종의 원인 물질인 혈관내피세포 성장인자를 설정할 수 있어, 바람직하게는 혈관내피세포 성장인자를 선택하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
우선, 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 혈관내피세포 성장인자와 선택적으로 상호작용하기 위하여 혈관내피세포 성장인자에 관한 압타머 서열(VEGFapt)을 덱스트란(dextran) 고분자에 화학 결합을 실시한다. 또한 나노구조체 형성을 위하여 짧은 핵산 서열(DNA)를 덱스트란에 마찬가지로 화학결합시킨다. 이처럼 형성된 덱스트란 고분자 기반의 핵산 압타머(Dex-DNA/VEGF)와 상보적인 서열을 이용하여 만든 Dex-cDNA/VEGF를 혼합하고 온도를 올렸다가 내리는 어닐링(annealing)이라는 과정을 통해 나노구조체(NCs)를 형성시킨다. 위의 과정은 기존에 알려진 방법을 사용한다(R. Namgung and W.J. Kim, Small, 2012, 8, No. 20, 3209-3219). 이후의 NCs의 VEGFapt를 증폭시키기 위하여 회전환 증폭 효소 반응(rolling circle amplification, RCA)을 실시하면 aNCs가 형성된다.
상기와 같이 제조된 나노구조체(NCs)의 크기는 덱스트란의 분자량이나 DNA가 컨쥬게이션(conjugation)된 비율에 따라서 달라질 수 있다. 바람직하게는 200~600nm, 더욱 바람직하게는 400~450nm일 수 있다. 상기 증폭된 나노구조체의 크기는 덱스트란의 분자량이나 DNA가 컨쥬게이션된 비율, 압타머의 개수, 압타머 증폭시간에 따라서 달라질 수 있다. 바람직하게는 400~1000nm, 더욱 바람직하게는 600~650nm일 수 있다. 또한, 상기 덱스트란 고분자 기반의 DNA 압타머의 크기 또한, 덱스트란의 분자량이나 DNA가 컨쥬게이션된 비율에 따라서 달라질 수 있다. 바람직하게는 100~400nm, 더욱 바람직하게는 200~300nm일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 제조방법에 의해 제조된 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체를 유효성분으로 함유하는 암 또는 황반부종 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암 또는 황반부종의 예방 또는 치료는 상기 압타머가 혈관내피 성장인자와 결합하여 이루어질 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체( aNCs )의 제조
혈관내피세포 성장인자와 선택적으로 상호작용하기 위하여 혈관내피세포 성장인자에 관한 압타머 서열(VEGFapt)을 덱스트란(dextran) 고분자에 화학 결합을 실시하였다. 또한 나노구조체 형성을 위하여 짧은 핵산 서열(DNA)를 덱스트란에 마찬가지로 화학결합시켰다. 이처럼 형성된 덱스트란 고분자 기반의 핵산 압타머(Dex-DNA/VEGF)와 상보적인 서열을 이용하여 만든 Dex-cDNA/VEGF를 혼합하고 온도를 올렸다가 내리는 어닐링(annealing)이라는 과정을 통해 나노구조체(NCs)를 형성시켰다. 위의 과정은 기존에 알려진 방법을 사용하였다(R. Namgung and W.J. Kim, Small, 2012, 8, No. 20, 3209-3219). 알데히드 기능기가 결합된 덱스트란을 합성하고(도 2(A)), 설파이드-탄소 결합(sulfide-carbon linkage)을 통해 하이드라진-변형된 DNA(DNA-S-C-Hydrazide)를 합성하고(도 2(B)), Dex-CHO 및 DNA-S-C-hydrazide를 컨쥬게이트시켰다(도 2(C)). 이후의 NCs의 VEGFapt를 증폭시키기 위하여 회전환 증폭 효소 반응(rolling circle amplification, RCA)을 실시하여 aNCs를 형성하였다(도 2(D)).
(1) Dextran - CHO의 합성 확인
GPC를 이용하여 Dextran-CHO의 피크가 덱스트란보다 늦은 시간에 나타남을 확인하였다(도 3).
(2) aNCs의 크기 확인
aNCs의 크기는 TEM과 DLS를 이용하여 확인하였다. sNCs는 약 600nm 크기를 가지고 있으며, NCs는 400nm 정도이며 VEGF aptamer는 약 200~300nm의 크기를 가진다. 그 결과는 표 2 및 도 4에 나타내었다.
DLS measurement Size(nm)
Dex-DNA/VEGF 285±15
NCs 420±10
aNCs 620±30
(3) aNCs의 안정성 확인
aNCs의 안정성은 실온에서 2달간 혹은 FBS 조건 상에서 5일간 확인하였는데, 실온에서 2달 동안 안정했고, FBS 조건 상에서 4일간 유지됨을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 2: aNCs를 이용한 혈관내피세포 성장인자 포획 성질 확인
VEGF가 포함된 용액에서 제조한 aNCs의 포획 효과를 확인하기 위하여 VEGF 500pg/ml이 포함된 증류수에 aNCs를 넣어 10시간 36℃에서 VEGF 포획을 진행하였다 포획을 진행한 후에 PD-10 컬럼을 이용하여 포획된 VEGF와 포획되지 않은 VEGF를 분리하였다 이후 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통하여 VEGF가 얼마나 포획되었는지 확인하였다. 먼저 핵산 압타머의 증폭 시간에 따라서 VEGF 포획률이 얼마나 달라지는지 확인하였고, 이를 바탕으로 45분간 증폭하는 것을 기준으로 삼았다 또한 핵산 압타머 프라이머의 양에 따라서 얼마나 VEGF와 상호작용하는지도 확인하였고, 25pmole의 프라이머와 500pg/ml의 VEGF가 효율적으로 반응함을 알 수 있었다. 이 방법을 통하여 각 NCs_V, NCs_Sc, NCs_aV, NCs_aSc에 대한 VEGF에 대한 VEGF 포획률을 계산하였다(프라이머 25pmole, 45분 증폭됨)에 대한 포획률을 계산하였다(도 6).
도 6(A)에 나타낸 바와 같이, 0.75시간 동안 증폭한 경우 PA-aNCs는 가장 효율적인 VEGF 포집 용량을 보여주었다. 또한, 효율적인 VEGF 포획을 위한 PA-aNCs에서 프라이머(올리고머 압타머)의 양이 유사한 공정으로 최적화되었으며, PA-aNCs의 25pmole 프라이머는 주어진 VEGF 농도에서 효율적인 VEGF 포착 특성을 나타내었다(도 6(B)). 그러므로, 0.75시간 동안 증폭을 하고 50pg [VEGF]당 25pmole의 프라이머를 가진 PA-aNCs를 이용하여 VEGF 포획 분석을 추가로 하였다. 최종적으로 VEGF 함유 용액을 PA-NCs, PSc-NCs, PA-aNCs 및 PSc-aNCs([프라이머]=25pmole) 각각과 혼합하고 12시간 동안 37℃에서 흔들었다(도 2(C)). PD-10칼럼을 가진 프리-VEGF의 정제 후에, 결합되지 않은 VEGF의 양을 VEGF ELISA 키트를 이용하여 분석하였다. 약 97.0%의 VEGF가 PSc-aNCs에 의하여 포획되었으며, 이는 PA-NCs(9.21%), PSc-NCs(8.18%) 및 PSc-aNCs(7.12%)에 대한 낮은 VEGF 포획 효율에 비견할만하다. 이러한 결과는 VEGF 증폭된 VEGF 압타머가 효율적인 VEGF 포착 능력에 기여한다는 것을 의미한다.
VEGF는 고형 종양 조직에서 과발현되고 혈관신생 및 종양 등 다양한 신호 전달 경로를 활성화하기 위해 VEGF 수용체(VEGFR) 티로신 키나제에 결합된다. 따라서, 종양의 성장은 항-VEGF 제제로 VEGF를 제거하는 것과 같은 항-VEGF 치료에 의해 억제될 수 있다. 이러한 관점에서, PA-aNCs는 짧은 올리고머 압타머를 가진 PA-NCs에 비교하여 보다 효율적으로 종양 성장을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있다.
각 시료의 비특이적 세포 독성을 확인하기 위하여, PA-aNCs를 준비하여 생체내 독성 검사를 실시하였다(도 2(D)). 모든 샘플(P, PA-NCs 및 PA-aNCs)를 A549세포에서 유의미한 독성을 나타내지 않았으며, 이는 VEGF-유도 망막 혈관 투과성 항진 모델(VEGF-induced retinal vascular hyperpermeability model)에서 생체 내에서 종양 퇴행 시험 및 치료를 위해 적용 할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 3: 쥐 암 모델에서의 aNCs를 이용한 혈관내피세포 성장인자 포획 및 암 성장 저해 효과 확인
쥐 암 모델에서 aNCs를 이용하여 VEGF를 포획하고 이를 통한 암의 생장 억제를 확인하였다. 사용한 쥐는 balb/c nu/nu female이다. A549 암세포를 쥐에 주입한 후(1x108 cells/mice) 약 80mm3의 크기를 가질 때 aNCs_VEGF 압타머, ancs_Sc를 주사하였다. 7일이 지난 후에 두 번째 주사를 진행하였다. 암의 크기와 쥐의 몸무게에 대한 모니터링을 33일간 지속하였고, 그 결과 aNCs_VEGF 압타머를 두 번 주사한 경우 나머지 경우보다 암의 성장이 크게 저해됨을 확인할 수 있었다. 쥐의 몸무게는 모니터링 기간 동안에 크게 변화하지 않았다(도 7).
도 7(A)에 나타낸 바와 같이, P, PA-NCs, PSC-NCs, PA-aNCs 및 PSc-aNCs는 종양(0일째 평균 크기는 66mm3)에 주사하였다(day O 및 day 7). P, PA-NCs, PSc-NCs 및 PSc-aNCs으로 처리된 그룹은 중간 정도의 종양 퇴행 효과를 나타내었으며(P은 6.6배, PA-NCs는 6.5배, PSc-NCs는 7.0배 및 Psc-aNCs는 5.9배의 증가), 이는 효율적인 항종양 치료에 충분하였다. 이와 반대로 PA-aNCs로 처리한 마우스는 32일째 종양의 크기가 0.74배 감소를 보였다. PA-NCs에 의한 종양 성장 저해의 효율성이 PA-aNCs에 비하여 8.8배 낮기 때문에, 압타머 서열의 증폭이 타겟분자의 포획에 대한 결정적인 요인으로 간주된다.
본 발명에서는 PA-NCs의 압타머가 나노구조체의 표면에 노출되지 않기 때문에, 타겟분자와 거의 상호작용하지 않는다는 것을 전제로 한다.
도 7(B)에 나타낸 바와 같이, PA-aNCs 주사 후에(0일째 및 7일째), 종양 성장이 5일까지 억제되어 PA-aNCs의 혈청 안정성과 연관된다. 이와 같은 결과는 초기 PA-aNCs의 VEGF 포획으로 인한 종양 조직에서의 VEGF 경로의 저해가 종양 성장의 저해에 상당하게 기여했기 때문이다. 체중 프로파일에 나타낸 바와 같이, 32일째 체중의 상당한 감소가 없었으며, 이는 PA-aNC가 무독성이라는 것을 나타낸다(도 7(D)).
또한 조직 검사를 위하여 첫 번째 시료 주사 후 4일 째 되는 날 쥐를 희생하여 암조직을 얻어 H&E 염색과 CD31 염색을 실시하였다. aNCs_VEGF aptamer를 주사한 쥐암의 경우 나머지 보다 혈관이 적게 발현되어 있음을 확인할 수 있었고 염증 및 암세포의 세포자멸사를 확인할 수 있었다(도 8).
P, PA-NCs, PSc-NCs 또는 PSc-aNCs로 처리하거나 무처리한 후에 CD31로 염색 한 종양 조직은 높은 FITC 형광을 나타내는 반면에, PA-aNC 군에서는 형광이 거의 관찰되지 않았다. 상기한 결과는 PA-aNCs에 의하여 VEGF 포획이 종양 부위에서의 혈관신생을 저해하여 종양 성장을 억제하는 것을 나타낸다.
실시예 4: 황반부종 모델에서의 aNCs를 이용한 혈관내피세포 성장인자 포획 및 황반부종 예방 치료 효과 확인
황반부종 모델에서 aNCs를 이용하여 VEGF를 포획하고 이를 통한 황반부종의 예방 및 치료를 확인하였다.
각각의 Dextran-CHO, NCs_VEGF aptamer, NCs_Sc, aNCs_VEGF aptamer, aNCs_Sc와 VEFG 60ng을 혼합하여 쥐의 눈에 주사하였다. 하루 뒤 에반스블루(evans blue) 염료를 심장주사하고 2시간 후에 쥐를 희생하여 안구를 적출하였다. 적출한 안구는 망막을 벗겨내 형광 현미경을 통하여 형광 이미지를 얻었다. VEGF를 포획하지 못한 시료(실험군)의 경우 혈관이 느슨해져 에반스블루 염료가 혈관 밖으로 빠져 나와 있음을 확인할 수 있고, VEGF를 포획한 시료(실험군)의 경우 혈관이 느슨하지 않아 염료가 혈관 밖으로 나오지 않음을 알 수 있다. 실험 결과, aNCs_VEGF aptamer의 경우 VEGF를 효과적으로 포획하여 혈관이 느슨해지지 않음을 도 9를 통하여 확인하였다. 즉, aNCs_VEGF aptamer은 황반부종을 치료하는 치료제로서 사용이 가능할 것으로 예상된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> IBS POSTECH SNU SNUH <120> Method of Preparing Amplified Aptamer Nanoconsturcts Based on Dextran Polymer for Selectively Capturing Target Protein <130> P16-B259 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> [Thiol]ODN <400> 1 ttttccgcaa gatggatcgc acgcc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> [Thiol]cODN <400> 2 ttttggcgtg cgatccatct tgcgg 25 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> [Thiol]VEGF-aptamer <400> 3 ttttcccgtc ttccagacaa gagtgcaggg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> [Thiol]Scramble <400> 4 tttttattat tgaaccgaat tttgtttcat 30 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> [Thiol]DNA-TAMRA <400> 5 ttttgcagta ct 12 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> [Phos]Circ_cVEGF <400> 6 gatcctaact aaaaaaaaaa ccctgcactc ttgtctggaa gacgggaaaa aaaaaaaaaa 60 ccacac 66 <210> 7 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> [Phos]Circ_cSc <400> 7 gatcctaact aaaaaaaaaa atgaaacaaa attcggttcc ataataaaaa aaaaaaaaaa 60 ccacac 66

Claims (7)

  1. 다음 단계를 포함하는 타겟분자를 선택적으로 포획하는 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법:
    (a) 타겟분자에 대한 압타머 서열(Apt) 및 나노구조체를 형성할 수 있는 DNA 서열을 덱스트란 고분자에 각각 결합시켜 덱스트란 고분자 기반의 DNA 압타머(Dex-DNA-Apt)를 생성시키는 단계;
    (b) 타겟분자에 대한 압타머 서열 및 상기 DNA 서열과 상보적인 서열(cDNA)을 덱스트란 고분자에 각각 결합시켜 덱스트란 고분자 기반의 cDNA 서열을 가진 덱스트란 고분자 기반의 cDNA 압타머(Dex-cDNA-Apt)를 생성시키는 단계;
    (c) 상기 (a) 단계에서 생성된 Dex-DNA-Apt와 (b) 단계에서 생성된 Dex-cDNA-Apt를 혼합한 다음, 어닐링시켜 나노구조체(NCs)를 생성시키는 단계; 및
    (d) 상기 나노구조체를 회전환 증폭 효소 반응을 통해 상기 압타머(Apt)를 증폭시켜 Apt가 증폭된 나노구조체(aNCs)를 생성시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 타겟분자는 혈관내피세포 성장인자, BSA, ATP, HCV 및 HIV-1으로 구성된 군에서 1종 이상 선택된 것을 특징으로 하는, 타겟분자를 선택적으로 포획하는 핵산 압타머 나노구조체의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체.
  4. 제3항의 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암 예방 또는 치료는 상기 압타머가 혈관내피 성장인자와 결합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제3항의 덱스트란 고분자 기반의 증폭된 핵산 압타머 나노구조체를 유효성분으로 함유하는 황반부종 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 황반부종 예방 또는 치료는 상기 압타머가 혈관내피 성장인자와 결합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 황반부종 예방 또는 치료용 조성물.
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