KR20180044225A - 불용성 및 가용성의 옥살레이트의 분해를 위한 고효율의 옥살레이트 분해 효소 - Google Patents

불용성 및 가용성의 옥살레이트의 분해를 위한 고효율의 옥살레이트 분해 효소 Download PDF

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Abstract

pH 및 열 안정성을 갖는 옥살레이트 유도 효소 및 옥살레이트 관련 병태에 대해 또는 식품 가공에서 사용하는 방법이 본원에서 개시된다.

Description

불용성 및 가용성의 옥살레이트의 분해를 위한 고효율의 옥살레이트 분해 효소
본 발명은 촉매적으로 고효율인 옥살레이트 분해 효소(옥살레이트 데카르복실라제, OxDC)에 관한 것이다. 본 발명은 이전에 발견되어 보고된 것보다 옥살레이트에 대한 훨씬 더 높은 친화도를 갖는 OxDC 효소를 사용하여 불용성 및 가용성 옥살산칼슘 둘 모두의 효율적인 분해 문제를 해결한다(Km: 마이크로몰 대 밀리몰). 본 발명은 또한 몇몇 OxDC 효소가 산성 조건, 예를 들어 pH 1.5-5.0에서 보다 안정하고 활성인 이유에 대한 증거를 제공하며, 불안정성은 4차 구조에서의 손실로 인한 것이다. 본 발명은 또한 삼량체로 치밀(packing)해지는 제1 옥살레이트 데카르복실라제에 대한 증거를 제공한다. 본 발명은 또한 일상적인 음식물로부터 식이 옥살레이트 섭취량을 줄이기 위해 식(료)품(예를 들어, 밀가루, 빵, 채소 통조림, 파이 등) 및 음료(예를 들어, 차, 맥주, 과일 주스 등)에서 옥살레이트(옥살산으로도 알려짐)의 농도를 낮추고/낮추거나 완전히 제거하는 것에 관한 것이다. 이것은 개체가 그의 옥살레이트 관련 질환 상태를 보다 잘 관리하는 것을 돕고/돕거나 건강한 개체가 영양가가 보다 높은 식단(옥살레이트는 항영양소로 간주됨)을 섭취하도록 할 수 있는 옥살레이트 저함량 및 옥살레이트 미함유 식품 및 음료의 라인을 본질적으로 만든다. 본 발명은 또한 효소를 열에 대해 안정화하고 또한 복수 배치의 식(료)품 및 음료를 처리하기 위해 동일한 효소를 재사용할 수 있도록(즉, 효소가 재순환될 수 있도록) 효소를 고정하기 위해 사용되는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 효소를 안정화하고 신규한 제제에 의해 국소 pH 환경을 생성하기 위하여 효소를 제제화하는데 사용되는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료, 산업, 생명공학, 화학적, 물리적 또는 다른 관련 응용 분야, 특히 치료 제제, 예컨대 의약 및 기능 식품(nutraceutical) 제제를 위한 효소 입자의 제조에 있어서 설명된 효소 및 설명된 제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비제제화되거나 제제화된 고효율 효소를 함유하는 제약 및 식품 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 식품 가공 보조제, 식품 첨가제, 산업 또는 다른 관련 응용 분야에서의 상기 설명된 효소의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 식품 제조 공정에서 효소의 사용을 포함한다. 또한, 본 발명은 산업 공정(펄프 및 종이, 화학물질 등)에서 효소의 사용을 포함한다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 고효율 효소 또는 하나 이상의 제제화된 효소를 포함하는 제약 조성물 또는 기능 식품 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에서의 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
옥살레이트는 작은 유기 디카르복실산의 염이다. 이것은 다음과 같은 2개의 pKa 점을 갖는다: pH 1.25 및 4.14. 따라서, 감소된 pH에서 보다 많은 옥살레이트가 일양성자화 또는 옥살산으로 존재하며, 칼슘과 같은 2가 반대 이온에 대한 친화도가 감소되고, 결과적으로 용해도가 증가한다. 불용성 옥살레이트는 칼슘(Ca2 +)과 같은 반대 이온에 이온성 상호작용을 통해 강하게 결합된 옥살레이트 이온(C2O4 2-)을 지칭한다.
옥살레이트는 약한 유기산이기 때문에, 그의 용해도는 pH에 크게 의존한다. 산의 pKa는 산 및 그의 상응하는 염기가 동일한 양으로 존재하는 pH와 동일하다. 옥살산은 디-카르복실산(2개의 산기)이고, 따라서 다음과 같은 2개의 pKa 점을 갖는다: pH 1.25 및 4.14. 따라서, pH가 낮아질수록 보다 많은 옥살레이트가 일양성자화(HC2O4 1 -) 또는 옥살산으로 존재할 것이고, 칼슘에 대한 친화도가 감소하고, 이어서 용해도가 증가한다.
옥살레이트는 포유동물에서 최종 대사산물이다. 옥살레이트는 또한 식물, 주로 잎, 나물열매, 과일 및 나무껍질에 통상적으로 존재하기 때문에 식이를 통해 섭취될 수도 있다. 포유동물은 다음과 같은 2개의 옥살레이트 공급원을 갖는다: 내인성(신체 대사에서 유래) 또는 외인성(식이 유래). 옥살레이트의 흡수는 위에서 시작하여 소장에서 그의 최대치에 도달한다. 연구에 따르면, 옥살레이트 섭취 후 20분만에 옥살레이트의 소변 배설이 즉시 증가하는 것으로 나타났고, 배설은 섭취 후 40분 및 180분에 2개의 분명한 피크를 나타낸다. 위에서의 흡수를 지지하는 것은 위 절제술 환자에서는 옥살레이트 흡수의 제1 피크가 감지되지 않는다는 것이다(1[Chen, Z., et al. Chin Med J., 116 (2003) 1749-51], 2[Prenen, JAC., et al. Am J Clin Nutr ., 40 (1984) 1007-10]). 최대 흡수는 소장에서 일어나고, 이것은 위에서의 옥살레이트 수송이 아마도 위 내의 단단한 상피 연결 때문에 세포 사이의(para-cellular) 수송보다는 세포를 통한(trans-cellular)(상피 세포를 통한) 수송으로 제한된다는 사실에 의해 영향을 받을 수 있다(3[Hatch, M., Urol ., Res 33 (2005) 1-16]).
몸에는 옥살레이트를 분해하거나 대사할 수 있는 방법이 없고; 따라서, 옥살레이트는 주로 신장을 통해 배설된다. 옥살레이트가 충분히 제거되지 않으면, 혈액 내 그 수준이 증가하고 소변에 농축되어, 고옥살산뇨증(소변 내 옥살레이트 상승), 및 심한 경우 옥살산증(oxalosis)(조직 내 옥살레이트 침적) 및 후속 조직 손상을 야기한다.
개요
본원에서 설명되는 발명은 높은 촉매 효율의 옥살레이트 분해 효소(옥살레이트 데카르복실라제, OxDC) 및 가용성 및 불용성 옥살레이트 둘 모두의 분해에서의 그의 용도에 관한 것이고, 상기 효소는 이전에 개시된 것보다 옥살레이트에 대한 훨씬 더 높은 친화도를 갖고 있음이 발견되었다(Km: 마이크로몰 대 밀리몰). 본 발명은 또한 라디칼 형성이 OxDC 효소를 저해하는 것을 방지하는 방법, 예컨대 위치 340의 잔기(Cb6301, 도 10)의 글루탐산으로의 대체 및 비타민 첨가에 대한 증거를 제공한다. 본 발명은 또한 일부 OxDC 효소가 산성 조건, 예를 들어 pH 1.5-5.0에서 보다 안정하고 활성인 이유 및 불안정성이 4차 구조에서의 손실로 인해 발생하는 정도에 대한 증거를 제공한다. 본 발명은 또한 천연적으로 삼량체로 치밀해지는 제1 OxDC에 대한 증거 및 삼량체로 치밀해지는 이유를 제공한다. Cb6301은 삼량체 계면에 가장 적은 양의 이온 하전 잔기를 갖고, 가장 많은 양의 수소 결합 잔기를 갖는다. 감소된 수의 이온성 상호작용 및 증가된 수의 수소 결합으로 인해, Cb6301은 본질적으로 보다 안정할 것이다. 천연적으로 삼량체로 치밀해지는 효소(Cb6301, Cb6312 및 Cb6803)는 극한 산 조건, 예를 들어 pH 1.5에서 향상된 안정성 및 활성을 갖는다. 육량체로 치밀해지는 나머지 효소는 주로 육량체 계면에서의 이온성 상호작용에 의해 육량체로서 함께 유지된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 이들 효소는 삼량체 계면에서 보다 많은 수의 이온성 상호작용을 보였다. 이온성 상호작용의 수가 많을수록 산성 pH, 특히 pH 3.0 미만에서 효소의 안정성이 떨어진다. 이것은 산성 pH에서 아스파르트산(pKa = 3.65) 및 글루탐산(pKa = 4.25)의 양성자화에 의한 것이다. 이들 아미노산이 양성자화될 때, OxDC의 4차 구조가 해리되어 효소가 비폴딩(unfolding)되고, 후속적으로 활성이 손실된다(비가역적 사건). 육량체 및 삼량체 계면 둘 모두에서 보다 많은 수의 이온성 상호작용은 이들 계면이 산 pH에서 해리되기 쉽게 만들 것이다.
본 발명은 또한 이들 효소가 재조합 방식으로 발현되는 방법, 상기 효소의 제제화, 및 상기 제제화된 또는 비제제화된 효소로 제조된 의약, 특수 식이 용도를 위한 식품 또는 의료용 식품 조성물을 설명한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 치료 목적, 예를 들어, 의약, 특수 식이 용도를 위한 식품 또는 의료용 식품에 이들 조성물을 사용하는 것이다. 또한, 본 발명은 식(료)품(즉, 빵, 밀가루, 채소 통조림)으로부터 옥살레이트를 분해하기 위해 식품 가공, 음료(즉, 맥주, 차, 과일 주스) 및 산업 공정(즉, 펄프 및 종이, 화학물질)에서의 상기 효소의 용도를 설명한다. 본 발명의 한 실시양태는 재조합 방식으로 발현된 효소 및 회수 및/또는 재사용을 위한 상기 효소의 고정화이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 식품 가공에서 이들 고정화된 조성물의 용도이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 산업용 응용에서 이들 고정화된 조성물의 용도이다. 다른 실시양태는 옥살산 분해 효소를 의도된 용도로 재순환 및 재사용할 수 있도록 고정화하는 것을 포함한다. 고정화는 효소가 어떻게 열에 대한 안정성을 증가시킬 수 있는지를 설명한다.
본 발명은 pH 민감성 효소가 준최적 pH 환경에 놓일 때의 활성 손실을 감소시키기 위해, 옥살레이트 분해 효소 및 pH 민감성인 다른 효소의 제제를 설명한다. 이 신규한 제제는 활성에 도움이 되는 효소 주위에 미세 환경을 유지함으로써, 준최적 pH에도 불구하고 효소의 활성을 유지시킨다. 본 발명의 추가의 실시양태는 질환, 특히 옥살레이트 관련 질환을 치료 및 예방하기 위한 상기 제조된 조성물의 용도이다.
도 1. OxDC 서브유닛 배열. OxDC는 삼량체의 이량체로 치밀해져 육량체를 생성한다. 삼량체로서 서브유닛 A는 두 서브유닛 B 및 C와 상호작용한다. 육량체로서 서브유닛 A는 육량체 계면에서 서브유닛 D와 상호작용하고 삼량체 계면에서 B 및 C와 상호작용한다.
도 2. 아그로시베 아에게리타(Agrocybe aegerita)("A0"와 "A8"), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)("Bce") 및 시네코코쿠스 에롱가투스(Synechococcus elongatus)("Cb6301_D29")로부터의 OxDC 효소의 열 안정성. 상대적인 OxDC 활성은 모든 활성 결과를 실시예 4에서 설명되는 바와 같이 25℃에서의 활성으로 정규화함으로써 계산하였다.
도 3. 바실루스 세레우스("Bce") 및 시네코코쿠스 에롱가투스("Cb6301_D29")로부터의 OxDC 효소의 pH 안정성. 상대적인 OxDC 활성은 모든 활성 결과를 실시예 5에서 설명되는 바와 같이 25℃에서의 활성으로 정규화함으로써 계산하였다.
도 4. 실시예 6에서 설명되는 바와 같이, 다양한 양의 칼슘을 함유하는 9개의 상이한 식품에서 pH 2 내지 pH 7.5에서의 "A0"으로부터의 OxDC에 의한 옥살레이트 분해. 분해된 옥살레이트 백분율은 시간 T=0에서 총(불용성 + 가용성) 출발 옥살레이트에 대한 비율을 나타낸다.
도 5. 실시예 7에서 설명되는 바와 같이, 다양한 pH 및 인큐베이팅 시간에서 재조합 "Cb6301_D29" 효소의 OxDC 활성. 1 단위(U)는 분당 분해된 1 μmol 옥살레이트로 정의된다.
도 6은 실시예 7에서 설명되는 바와 같이, 다양한 pH 및 인큐베이팅 시간에서 재조합 "Bce" 효소의 OxDC 활성. 1 단위(U)는 분당 분해된 1 μmol 옥살레이트로 정의된다.
도 7. 실시예 7에서 설명되는 바와 같은, 다양한 pH에서 재조합 Bce, Bpu, Bam, Bcl, Cb6301, Cb6803, A8 및 YvrK OxDC 효소의 OxDC 활성.
도 8. 산성 조건, 예를 들어 pH 1.5, vs 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 Bce, Bpu, Bam, Bcl, Cb6301, Cb6803, A8 및 YvrK OxDC 효소가 옥살레이트 분해 활성을 나타내는 대부분의 산 pH 하에서 육량체 계면에서의 순 이온 전하. 2개의 서브유닛 사이의 하나의 계면에서의 아미노산 또는 전하의 수. 예를 들어, 도 1에 따르면 이것은 A와 D 서브유닛 사이의 계면일 것이다. OxDC 효소는 삼량체의 이량체를 형성하고; 따라서, 하나의 OxDC 육량체는 3개의 계면활성제을 갖는다. 따라서 y축은 전체 육량체 구조 사이의 총 전하를 설명하기 위해 3을 곱해야 한다. 서브유닛 A와 D, B와 E, 및 C와 F 사이에는 도 1에 따른 3개의 육량체 계면이 있다.
도 9는 중성 조건 vs 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 Bce, Bpu, Bam, Bcl, Cb6301, Cb6803, A8 및 YvrK OxDC 효소가 옥살레이트 분해 활성을 나타내는 대부분의 산 pH에서 삼량체 계면에서의 순 이온 전하. 2개의 서브유닛 (도 1에 따른 A 및 B) 사이의 하나의 계면에서의 순 이온 전하. OxDC 효소는 삼량체의 이량체를 형성한다. 각각의 삼량체는 도 1에 도시된 바와 같이 A와 B, B와 C, 및 C와 A 사이에 3개의 계면을 갖는다.
도 10. MUSCLE 3.8에 의한 Clustal 다중 서열 정렬을 이용한 Cb6301, A8, Bcl, Bce, Bpu, Bam 및 YvrK OxDC 효소의 부분 다중 아미노산 정렬. 밑줄로 표시된 영역은 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 육량체 계면에서의 아미노산이다. 진하게 밑줄로 표시된 잔기는 실시예 8에서 설명되는 바와 같은 삼량체 계면에 있다. 진하게 강조 표시된 잔기는 Cb6301, Cb6803 및 Cb6312에서 옥살레이트 분해 활성을 유지하는데 중요하다.
도 11. 실시예 8에서 설명되는 바와 같이 다양한 pH에서의 Cb6301, Bce 및 YvrK 효소의 천연-PAGE 겔.
도 12. 실시예 9에서 설명되는 바와 같이 6일 동안 40℃에서 다양한 화학물질과 함께 인큐베이팅한 후 "Bce"의 OxDC 활성. 1 단위(U)는 분당 분해된 1 μmol 옥살레이트로 정의된다.
도 13. 실시예 9에서 설명되는 바와 같이 6일 동안 40℃에서 상이한 화학물질과 함께 인큐베이팅한 후 "Cb6301_D29"의 OxDC 활성. 1 단위(U)는 분당 분해된 1 μmol 옥살레이트로 정의된다.
도 14. Cb6301_D29 OxDC의 효소 동역학: 실시예 10에서 설명되는 바와 같이 결정된 옥살레이트 농도(mM)당 반응 속도(v0).
도 15. pH의 함수로서의 A8의 효소 동역학: Km은 실시예 10에서 설명되는 바와 같이 계산된다.
도 16. 실시예 11에 따른 Bce 비제제화된 효소(속이 찬 막대) 및 제제화된 Bce(빈 막대)의 pH에 의한 상대적인 활성 비율.
도 17. 1시간 내에 분해된 옥살레이트 비율: 실시예 11에 따른 비제제화된 Bce 효소(흑색 원) 및 제제화된 Bce(백색 원).
도 18. 실시예 12에서 설명되는 바와 같이 저 옥살레이트 식이요법 기간(LOD), 고 옥살레이트 식이요법 기간(HOD) 및 저 용량 A0을 사용한 고 옥살레이트 식이요법 기간에서 크레아티닌당 평균 옥살레이트. 오차 막대는 SEM을 나타낸다(p-값 = 0.00001, t 임계값 5% = 1.81246).
도 19. 실시예 12에서 설명되는 바와 같이 저 옥살레이트 식이요법 기간(LOD), 고 옥살레이트 식이요법 기간(HOD) 및 저 용량 Ox1-CY(Cb6301)을 사용한 고 옥살레이트 식이요법 기간 (CY L)에서 크레아티닌당 평균 옥살레이트. 오차 막대는 SEM을 나타낸다(p-값 = 0.00064, t 임계값 5% = 1.81246).
도 20. 실시예 12에서 설명되는 바와 같이 저 옥살레이트 식이요법 기간(LOD), 고 옥살레이트 식이요법 기간(HOD) 및 저 용량 Ox1-BC(Bce)을 사용한 고 옥살레이트 식이요법 기간(BC L)에서 크레아티닌당 평균 옥살레이트. 오차 막대는 SEM을 나타낸다(p-값 = 0.05188, t 임계값 5% = 1.81246).
도 21. 실시예 12에서 설명되는 바와 같이 저 옥살레이트 식이요법 기간(LOD), 고 옥살레이트 식이요법 기간(HOD) 및 저 용량 Yvrk를 사용한 고 옥살레이트 식이요법 기간(Yvrk)에서 크레아티닌당 평균 옥살레이트. 오차 막대는 SEM을 나타낸다(뇨중 옥살레이트의 유의한 감소는 제시되지 않음).
도 22. 등몰 조건(1:1 옥살레이트:칼슘)에 따라 표준화된 각각의 옥살레이트:칼슘 반응당 생성된 포르메이트 비율. Bce는 실시예 13에서 설명되는 바와 같이 비희석된 상태로(neat), 1/2x 희석액 및 1/4x 희석액으로 시험되었다.
도 23. 등몰 조건(1:1 옥살레이트:칼슘)에 따라 표준화된 각각의 옥살레이트:칼슘 반응당 생성된 포르메이트 비율. Cb6301은 실시예 13에서 설명되는 바와 같이 비희석된 상태로, 1/5x, 1/10x 및 1/20x 희석액으로 시험되었다.
도 24. 등몰 조건(1:1 옥살레이트:칼슘)에 따라 표준화된 각각의 옥살레이트:칼슘 반응당 생성된 포르메이트 비율. YvrK는 실시예 13에서 설명되는 바와 같이 비희석된 상태로, 1/2x 및 1/4x 희석액으로 시험되었다.
정의
본원 명세서에서 사용되는 모든 용어는 관련 기술 분야에서 통상적으로 부여된 의미를 갖는 것으로 의도된다. 명료성을 위해, 일부 용어는 아래에서 또한 정의된다.
옥살레이트 분해 효소:
"옥살레이트 분해 효소"라는 용어는 옥살레이트를 감소시킬 수 있는 모든 효소로서 해석될 것이다. 이 효소는 단지 옥살레이트 감소 경로에서 기능하는 것이 아니라, 옥살레이트를 생성물 그 자체로 전환하는 반응을 촉매해야 한다. 이 정의에 따른 옥살레이트 분해 효소는 옥살레이트 데카르복실라제, 옥살레이트 옥시다제 및 옥살릴-CoA 데카르복실라제를 포함한다. 용어 "옥살레이트"는 옥살산뿐만 아니라 그의 임의의 염을 포함한다.
보조 인자:
용어 "보조 인자"는 효소의 활성에 필요한 비효소 화합물로 해석될 것이고, 예를 들어 NAD+, NADP+, FAD, CoA, ATP 및 ADP를 포함한다.
기질:
"기질"이라는 용어는 효소가 촉매 반응을 일으키는 도입되는 화합물로 해석될 것이다. 옥살레이트 분해 효소에 의해 촉매되는 반응의 경우, 이것은 옥살레이트를 의미하여야 한다.
서브유닛:
효소 서브유닛은 효소 복합체를 형성하기 위해 다른 효소 분자와 조립(또는 "공동조립")되는 단일 효소 분자이다. OxDC는 전형적으로 육량체(삼량체의 이량체)를 만든 6개의 서브유닛으로 이루어진다. 그림 형식의 묘사는 도 1을 참조한다. 그러나, 본원에서 설명되는 Cb6301, Cb6803 및 Cb6312는 본래 3개의 서브유닛으로 이루어진 삼량체이다.
효소 또는 촉매 효율:
반응을 촉매하는 효소가 보이는 효율. kcat/Km으로 정의되고, 다음 단위로 설명된다: 전환/M/s. 전환은 기질의 반응 생성물(들)로의 전환을 의미한다.
옥살레이트 관련 질환 및/또는 옥살레이트 관련 불균형:
"옥살레이트 관련 질환 및/또는 옥살레이트 관련 불균형"이란 용어는 전신 옥살레이트 수준의 불균형에 의해 야기되는 질환으로 해석될 것이고, 원발성 고옥살산뇨증, 고옥살산뇨증, 흡수성 고옥살산뇨증, 장 고옥살산뇨증, 특발성 옥살산칼슘 신장 결석 질환(요로결석증), 외음부동통, 말기 신장 질환과 관련된 옥살산증, 심전도 장애, 염증성 장 질환, 크론(Crohn)병, 궤양성 대장염, 및 위장 수술, 배리아트릭 수술(bariatric surgery)(비만 수술) 및/또는 항생제 치료에 의해 유발되는/이와 관련된 장애/병태를 포함한다.
pH 비민감성 효소:
pH 비민감성 효소는 특정 pH에서 비제제화된 효소보다 더 높은 활성을 나타내는 제제화된 효소로 정의되고; 따라서 비제제화된 대응물보다 주위 pH에 더 둔감해진다.
미세 환경:
미세 환경은 본원에서 활성 효소와 접촉하고/하거나 가장 근접한 환경으로 정의된다. 특정 실시양태에서, 미세 환경은 입자의 경계 내의 것이고; 따라서 입자의 외부 표면에서 시작하여 동일한 입자의 코어에 도달한다. 본 발명은 또한 나노미터 규모의 입자를 고려하기 때문에, 미세 환경은 또한 미세 입자 또는 나노 입자 내의 환경을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 본원에서 설명되는 미세 환경은 미세 환경을 둘러싼 주위 환경과 비교하여 제제화된 활성 효소에 가장 가까운 환경인 것으로 간주된다. "주위 환경"이라는 용어는 미세 환경을 둘러싼 환경으로 간주된다. 효소가 입자와 회합된 실시양태에서, 주위 환경은 활성 효소와 회합된 입자의 경계 외부에 있다.
pH-활성 프로파일:
효소 pH-활성 프로파일은 상이한 pH 조건에서 비제제화된 효소 활성을 결정하고 이들을 서로에 대해 그래프(즉, x축의 pH 및 y축의 활성)로 가시화할 때 얻어진 프로파일이다. 효과적인 pH-활성 프로파일은 상이한 pH 조건에서 제제화된 효소 활성을 결정하고 이들을 서로에 대해 그래프(즉, x축의 pH 및 y축의 활성)로 가시화할 때 얻어진 pH-활성 프로파일로서 정의된다. 따라서, 효과적인 pH-활성 프로파일은 비제제화된 효소의 특성을 설명하지는 않지만, 제제화된 효소가 상이한 주위 환경에 놓일 때 검출된 활성을 나타낸다. 효과적인 pH-활성 프로파일의 pH는 미세 환경이 아닌 주위 환경의 pH를 설명한다.
pH 활성 화합물:
pH 활성 화합물은 그의 환경의 pH에 직접 또는 간접적인 영향을 미치는 화합물이다.
4차 구조:
4차 구조는 다중-서브유닛 복합체 내에서 다중 폴딩 단백질 서브유닛의 수 및 배열이다. 이것은 단순한 이량체부터 큰 호모올리고머에 이르는 조직 및 규정되거나 가변적인 수의 서브유닛이 있는 복합체를 포함한다.
육량체 계면:
육량체 계면은 한 서브유닛의 아미노산이 제2 서브유닛의 잔기와 상호작용하는 곳이다. 이러한 상호작용은 수소 결합, 이온성 및/또는 소수성 상호작용으로 이루어질 수 있다. OxDC의 경우, 이온성 상호작용이 육량체 구조를 유지하는데 가장 큰 기여를 한다. 육량체 계면의 잔기는 도 8에 도시된 다중 서열 정렬에 밑줄로 표시되어 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 육량체 계면은 2개의 서브유닛 사이에서, 예를 들어, 서브유닛 A와 D 사이에서 일어나는 상호작용으로 이루어질 것이다. 서브유닛 B와 E, 및 또한 C와 F 사이에 2개의 추가의 육량체 계면이 존재한다. 그림 형식의 묘사는 도 1을 참조한다.
전체 육량체 계면:
전체 육량체 계면은 3개의 모든 육량체 계면에서 상호작용하는 아미노산의 총 수 및 유형이다. OxDC는 6개의 동일한 서브유닛을 갖는 육량체로 치밀해지기 때문에, 3개의 개별 육량체 계면이 존재하고; 따라서 전체 육량체 계면은 육량체 계면에 3을 곱하여 계산된다. 이러한 상호작용은 수소 결합, 이온성 및/또는 소수성 상호작용으로 이루어질 수 있다. OxDC의 경우, 관심 상호작용은 주로 이온성이다. 육량체 계면의 잔기는 도 8에 도시된 다중 서열 정렬에 밑줄로 표시된다. 그림 형식의 묘사는 도 1을 참조한다. 전체 육량체 계면은 A와 D, B와 E, 및 C와 F 사이의 상호작용의 합계이다.
삼량체 계면:
삼량체 계면은 하나의 서브유닛의 아미노산이 제2 서브유닛의 잔기와 상호작용하는 곳이다. 이러한 상호작용은 수소 결합, 이온성 및/또는 소수성 상호작용으로 이루어질 수 있다. OxDC의 경우, 이온성 및 수소 결합 상호작용은 삼량체 구조를 유지하는데 가장 큰 기여를 한다. 삼량체 계면의 잔기는 밑줄로 표시되고, 도 8에 도시된 다중 서열 정렬에서 진하게 표시되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 삼량체 계면은 2개의 서브유닛 사이에서, 예를 들어, 서브유닛 A와 B 사이에서 일어나는 상호작용으로 이루어질 것이다. 서브유닛 B와 C, 및 또한 C와 A 사이에 2개의 추가 삼량체 계면이 존재한다. 그림 형식의 묘사는 도 1을 참조한다.
전체 삼량체 계면:
전체 삼량체 계면은 3개의 모든 삼량체 계면에서 상호작용하는 아미노산의 총 수와 유형이다. Cb6301, Cb6803 및 Cb6312는 3개의 동일한 서브유닛이 삼각형으로 치밀해져서 삼량체로 치밀해지기 때문에, 3개의 개별 삼량체 계면이 존재하고; 따라서 전체 삼량체 계면은 삼량체 계면에 3을 곱하여 계산된다. 이러한 상호작용은 수소 결합, 이온성 및/또는 소수성 상호작용으로 이루어질 수 있다. OxDC의 경우, 관심 상호작용은 주로 이온성 및 수소 결합이다. 삼량체 계면의 잔기는 도 8에 도시된 다중 서열 정렬에서 진한 글씨로 밑줄로 표시된다. 그림 형식의 묘사는 도 1을 참조한다. 전체 삼량체 계면은 A와 B, B와 C, 및 C와 A 사이의 상호작용의 합계이다.
순 이온 전하:
순 이온 전하는 정의된 pH 조건에서 2개의 상호작용하는 서브유닛 사이의 육량체 또는 삼량체 계면의 총 전하이다. 이것은 모든 아스파르트산 및 글루탐산이 양성자화되는 조건(산성 pH)에서 또는 이들 잔기가 이온으로 존재하는 중성 pH에서 계산될 수 있다. OxDC와 관련하여, 대부분의 상동체는 삼량체의 이량체로 치밀해진다. 따라서, 3개의 서브유닛은 3개의 다른 서브유닛과 상호작용하고 있다(예시를 위해 도 1 참조). 표 4 및 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, Cb6301의 경우, -3의 이온 순 전하는 3개의 서브유닛 상호작용 중 하나에만 대응한다. 전체 삼량체 분자를 고려한 경우 총 순 이온 전하는 -3 x 3 = -9가 될 것이다.
안정성:
효소는 옥살레이트 분해 활성이 대조 조건의 80-125%일 때 특정 조건(pH, 온도 등)에서 안정한 것으로 정의된다.
효소 명명법:
Yvrk = 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)의 옥살레이트 데카르복실라제
Cb6301 = 시네코코쿠스 에롱가테스(Synechococcus elongates)의 옥살레이트 데카르복실라제.
Cb6301_D29 = n-말단의 처음 29개의 아미노산이 제거된, 시네코코쿠스 에롱가테스 6301의 옥살레이트 데카르복실라제.
Cb6803 = 시네코코쿠스 에롱가테스 6803의 옥살레이트 데카르복실라제.
Bce = 바실루스 세레우스의 옥살레이트 데카르복실라제
Bcl = 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii)의 옥살레이트 데카르복실라제
Bam = 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 옥살레이트 데카르복실라제
A8/A0 = 아그로시베 아에게리타의 옥살레이트 데카르복실라제
Bpu = 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus)의 옥살레이트 데카르복실라제
상세한 설명
개요
고옥살산뇨증에는 원발성 고옥살산뇨증(PH) 및 속발성 고옥살산뇨증(SH)이라는 2개의 유형이 있다. 원발성 고옥살산뇨증(PH)은 글리옥실레이트 대사의 선천적 오류이며, 발생률은 1백만 명당 0.1-0.2이다. 원발성 고옥살산뇨증은 I, II 및 III의 세 가지 유형으로 나뉘는데, 타입 I은 간 특이적 퍼옥시솜 알라닌/글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제(AGT) 활성의 결핍 또는 부재에 의해 유발되며, 24시간당 약 88-352 mg(24시간당 1-4 mmol에 해당)의 뇨중 옥살레이트를 생성할 수 있다. PH 타입 II는 글리옥실레이트 리덕타제/히드록시피루베이트 리덕타제(GRHPR) 활성의 결핍 또는 부재에 의해 유발되며, 뇨중 옥살레이트는 24시간당 약 88-176 mg(24시간당 1-2 mmol에 해당)일 수 있다. PH 타입 III은 새로 발견된 선천적 오류로서, 24시간당 0.8 mmol 초과의 뇨중 옥살레이트를 배설하는 심각한 고옥살산뇨증을 제시하는 것으로 밝혀졌다.
PH 타입 I 및 II 상태에서, 고통받는 환자는 만성 또는 말기 신부전(ESRF)이 발생하면 100 μmol/L 초과의 혈장 옥살레이트 농도를 생성할 수 있다. PH 환자의 혈액에 CaOx 과포화가 발생하면 CaOx 결정이 신장, 갑상선, 심근, 뼈, 피부, 혈관 및 눈을 비롯한 여러 장기에 침착되는 전신성 옥살산증이 생길 것이다. 전신 옥살산증은 궁극적으로 치료하지 않으면 ESRF 및 사망으로 이어질 것이다.
PH 타입 I-III을 치료하거나 예방하는 승인된 치료법은 없다. 현재 권장되는 치료법은 마그네슘, 시트레이트 및 오르토포스페이트를 보충하여 옥살산칼슘 침적물의 용해도를 높이고 24시간당 적어도 2L의 소변 생산량을 권장하는 데 집중할 수밖에 없다. 피리독신은 결핍된 AGT의 보조 인자이고, 뇨중 옥살레이트 수준을 감소시키기 위해 PH 타입 I에 대해 긍정적인 효과가 있다. 불행히도, 현재까지 유일한 치료 방법은 신장 및 간 이식을 병행하는 것이지만, 많은 이식 장기는 이식 후에도 거부되거나 일정 수준의 혈장 옥살레이트를 통해 손상된다.
속발성 고옥살산뇨증은 고옥살산뇨증, 흡수성 고옥살산뇨증, 장 고옥살산뇨증, 특발성 옥살산칼슘 신장 결석 질환(요로결석증), 외음부동통, 말기 신장 질환과 관련된 옥살산증, 심전도 장애, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 및 위장 수술, 공회장(jejunoileal) 또는 루와이(Roux-en-Y) 우회 수술을 포함하는 배리아트릭 수술(비만 수술) 및/또는 항생제 치료에 의해 유발되는/이와 관련된 장애/병태를 포함하고 이로 제한되지 않는 옥살레이트 관련 병태를 포함한다.
요로결석증(신장/요로 결석 질환)은 고옥살산뇨증의 일반적인 결과이며, 전 세계적인 주요 건강 문제이다. 신장 결석 형성의 위험은 아직 완전히 이해되지 않은 많은 인자를 중심으로 이루어진다. 신장 또는 요로 결석 질환은 서방 국가에서 인구의 12%의 많은 인간에서 발생하며, 이 결석의 약 70%는 옥살산칼슘 또는 옥살산칼슘(CaOx) + 인산칼슘으로 이루어진다. 이 질환의 발생은 신장 및 소변에서 옥살레이트의 수준이 증가하기 때문이며, 상기 인간에서 가장 흔한 고옥살산뇨 증후군은 장 고옥살산뇨증으로 알려져 있다.
CaOx 신장 결석의 형성은 매우 흔하고, 증거는 뇨중 옥살레이트 농도의 최소 상승이 특발성 CaOx 요로결석증 환자의 하위군에서 중요한 인자가 될 수 있음을 시사한다(4[Lieske, J.C., et al. Kidney Int ., 78 (2010) 1178-1185]). 일부 이유는 일반 집단에 비해 결석 형성 집단에서 평균 소변내 칼슘이 더 높다는 보편적인 의견의 일치에 관련됨을 시사하였다. 고칼슘뇨증의 발생률은 건강한 인간보다 결석 형성자에서 5-10배 더 높고, 옥살산칼슘의 상대적인 과포화는 다른 인간들보다 고칼슘뇨증 개체에서 더 높다(5[Holmes, R.P., Kidney Int ., 59(2001) 270-276]). 정상적인 소변에서, 칼슘 대 옥살레이트의 비율은 5:1이고, 따라서, 칼슘은 가용성이 높기 때문에, 옥살레이트의 작은 증가는 생성될 수 있는 가능한 결정 질량에 큰 영향을 미칠 것이다. 정상적인 소변 범위에서, 옥살레이트의 작은 변화가 칼슘의 변화보다 더 큰 영향을 CaOx의 과포화에 미친다.
많은 재발하는 결석 형성 개체는 건강한 인간들과 상이한 소변 화학물질을 가지고 있고, 결석 형성 개체에서 소변 화학물질을 평가할 때, 뇨중 옥살레이트 및 옥살산칼슘 과포화가 제어된 대사 식이에 의해 제어될 수 있음이 입증된다. 이것은 뇨중 옥살레이트 및 옥살산칼슘 과포화의 결정 요인으로서의 식이의 핵심적인 역할을 강력하게 뒷받침한다8.
칼슘 대 옥살레이트 비율의 중요성이 또한 매우 분명하다. 제어된 대사 식이 내의 칼슘이 저하되면 뇨중 옥살레이트가 증가하는 경향이 있고, 이것은 흡수를 위해 더 많이 이용 가능함을 보여준다9.
젤웨거 스펙트럼 질환(ZSD: Zellweger spectrum disease)은 퍼옥시솜 조립의 결핍에 의해 야기되는 퍼옥시솜 기능의 일반적인 손실을 특징으로 하고, 이들 환자는 고옥살산뇨증의 높은 발생률(83%)을 갖는다. 비록 ZSD 환자에서 옥살레이트 합성 메커니즘이 불명확하지만, 일부 ZSD 환자에서 뇨중 옥살레이트의 수준은 PH 환자와 비슷하다.
만성 신부전 및 만성 혈액 투석 중인 ESRF 환자는 신부전 합병증으로 인해 옥살레이트를 충분히 제거할 수 없고, 따라서 고옥살산뇨증이 발생할 가능성이 있다. 또한 비타민 C는 종종 혈액 투석 항산화제로서 정맥 내로 주사되며, 이것은 나중에 인체에서 옥살레이트로 대사된다. 이 환자들의 혈장 옥살레이트 농도는 30-90 μmol/L인 것으로 밝혀질 수 있다. 2006년도에, 미국에서만 345,000명의 혈액 투석 환자가 존재하였다.
인체에서 옥살레이트의 균형은 복잡하고, 아직 완전히 이해되지는 못하고 있다. 옥살레이트는 주로 신장을 통해 배설되지만, 인체에서 배설하는 또 다른 방법은 장관을 통과하는 것이다. 옥살레이트는 신장을 구제하기 위한 또 다른 배설 경로로서 장관 내로 분비될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 장관의 옥살레이트 유입은 요로결석증의 발생에서 큰 역할을 할 수 있다(6[Hatch, M., Freel, R.W., Urol . Res. 2005; 33 (1): 1-16]). 옥살레이트 수송은 용질 연결 담체(SLC: solute-linked carrier) 수송체, 특히 SLC26 수송체 패밀리를 통해 발생하는 것으로 밝혀졌다(7[Mount, D.B., et al., Pflugers Arch. 2004; 447 (5):710-721], 8[Soleimani, M., Xu, J., Seminars in nephrology. 2006; 26 (5):375-385]). 이 유전자 패밀리는 모두 옥살레이트 친화도를 갖는 것으로 밝혀지고 장관에서 발견되는 수송체(SLC26A1(SAT1), SCL26A2(DTDST), SLC26A3(DRA), SLC26A6(PAT1 또는 CFEX), SLC26A7 및 SCL26A9)를 코딩한다.
식품 옥살레이트:
다양한 식품이 옥살산을 함유한다. 예를 들어, 시금치, 대황, 및 견과류와 같은 식품은 높은 수준의 옥살산을 함유하는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나, 사탕무, 초콜렛, 딸기, 밀기울 및 차와 같은 많은 다른 식품 및 음료에도 많은 옥살레이트가 함유되어 있다. 옥살레이트를 함유하는 다른 식품은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 콩, 자몽, 오렌지, 양파, 사탕무, 감자, 상추, 서양자두, 라즈베리, 파인애플, 키위, 케일 및 토마토(표 1 참조). 의사가 옥살산칼슘 신장 결석을 가진 인간에게 가장 일반적으로 추천하는 것은 저 옥살레이트 식이를 준수하는 것이다. 그러나, 옥살레이트 수준은 식물 성장 환경, 기후, 계절 및 원산지에 영향을 받기 때문에, 저 옥살레이트 식이를 유지하는 것은 종종 식이요법자의 통제 한계를 벗어난다. 저 옥살레이트 식이는 종종 따르는 것을 불가능하게 만드는 당뇨와 같이 다른 더 심각한 병태와 상충될 수 있다.
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옥살레이트 생체이용률:
옥살레이트 생체이용률은 옥살레이트 용해도에 의해 결정된다. 수용성 형태에서, 옥살레이트는 옥살산(저 pH에서) 또는 옥살레이트 이온(강한 친화도 반대 이온 결여시에)으로 존재한다. 따라서, 옥살레이트 용해도 및 생체이용률에 직접적으로 영향을 미치는 주된 인자는 높은 친화도를 갖는 반대 이온(칼슘, 철 및 어느 정도 마그네슘)이고, 간접적으로 영향을 주는 인자는 포스페이트(칼슘에 결합함), 지방(고 pH에서) 및 피테이트(칼슘에 결합함)이다(9[Israr, B., et al, Food Chem 2013; 141 (3): 1690-1693]). 따라서, pH가 낮아질수록 보다 많은 옥살레이트가 일양성자화(HC2O4 1 -) 또는 옥살산(H2C2O4)으로 존재할 것이고, 칼슘에 대한 친화도가 감소하고, 이어서 용해도가 증가한다.
불용성 옥살레이트는 반대 이온에 결합하는, 즉 염으로 존재하는 모든 C2O4 2 - 옥살레이트를 지칭하고, 이들은 pH를 감소시킴으로써 가용화된다. 칼슘은 위장(GI)관 내에서의 옥살레이트 불용성의 주요 인자이다. 성인의 경우, 1일 칼슘 섭취 권장량은 약 1000 mg/일이다. 성인에서, 칼슘의 대부분(72%)은 유제품을 통해 공급된다. pH가 산성이 될수록, 위에서 설명한 바와 같이 옥살레이트가 증가한다. 재거(Jaeger) 및 로버트슨(Robertson)은 상이한 농도의 칼슘 및 pH에서 이용할 수 있는 옥살레이트 농도를 제시하였고, pH 2 및 평균 칼슘 농도 5 mM(200 mg/L)에서 가용성 옥살레이트 농도가 최대치인 0.49 mM(43 mg/L)임을 보여주었고, 이것은 정기적인 식사 중 예상되는 옥살레이트의 양에 근접한 것이다(10[Jaeger, Ph., Robertson, W.G., Nephron Physiol 2004;98 (2):p64-71]). 따라서, 정기적인 성인 식사 내의 칼슘 및 옥살레이트의 예상 농도에서, 옥살레이트의 대부분은 pH 2에서 가용성이고, 따라서 흡수 또는 산 안정성 효소에 의한 분해를 위해 이용 가능하다. 이 사실은 또한 옥살레이트가 위에서 생체 이용이 가능함을 보여주는, 섭취 20분 후 옥살레이트 배설에 대한 연구에 의해서도 지지된다. 칼슘 및 옥살레이트 비율이 변화함에 따라, 옥살레이트의 용해도가 변하고, 따라서 치료 목적을 위한 옥살레이트 분해 효소의 가장 중요한 두 가지 특징은 낮은 pH 내성 및 효소 또는 촉매 효율이다.
옥살레이트 분해 효소:
옥살레이트 분해제로서 다음과 같은 3개의 효소 유형이 확인되었다: (1) 옥살레이트 데카르복실라제(OxDC, 옥살레이트 카르복시-리아제, EC 4.1.1.2), (2) 옥살레이트 옥시다제(OXO, 옥살레이트:산소 옥시도리덕타제, EC 1.2.3.4), 및 (3) 옥살릴-CoA 데카르복실라제(옥살릴-CoA 카르복시-리아제, EC 4.1.1.18). OxDC는 포르메이트 및 이산화탄소를 생성하고 촉매 작용을 위해 Mn2 + 및 O2를 필요로 하는 1단계 전자 끌어당기기 반응(electron withdrawal reaction)에서 옥살산(옥살레이트로서)을 분해한다. OXO 효소는 O2에 의해 산화된 후, 옥살산을 2개의 CO2 분자로 절단하고 H2O2를 생성한다. 제3 효소는 박테리아에서 발견되고, 보조 인자로서 티아민 피로포스페이트를 사용하여 옥살릴-CoA를 포르밀-CoA 및 이산화탄소로 전환한다.
효소 효율:
효소는 옥살레이트의 효과적인 분해제일 수 있고, 통상 대량으로 생산하기 쉽다. 효소가 GI관에서 효과적인 옥살레이트 분해제가 되기 위해서는, 프로테아제 저항성, pH 내성이고, 높은 효소 효율을 가질 필요가 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 것은 효소 효율이 종종 kcat/Km으로 설명된다는 것이다. Km은 효소가 반응 속도의 50%를 나타내는 기질 농도로 설명될 수 있다. 따라서, Km이 낮을수록 기질의 보다 낮은 농도에서 효소는 더 빠르게 작용한다. kcat은 촉매 반응 속도로서 설명될 수 있고, 단위는 초 기준이다(초당 전환, 기질의 생성물(들)로의 전환). 따라서, kcat은 가능한 한 높아야 하고, 비 kcat/Km은 낮은 기질 농도에서 기질을 빠르게 분해할 수 있는 효소를 설명하기 위해 높아야 한다.
효소 효율은 생체 내에서 옥살레이트의 분해에 특히 중요하다. 그 이유는 옥살레이트가 가용성 및 불용성(염 형태) 둘 모두로 존재하기 때문이다. 가용성 옥살레이트는 효소가 자유롭게 이용할 수 있지만, 불용성 옥살레이트는 효소가 칼슘과 같은 반대 이온과의 이온성 상호작용과 경쟁할 것을 필요로 한다. 가용성 및 불용성 종은 일정한 평형을 이룬다(아래 식 참조). 칼슘 대 옥살레이트의 비율이 높을수록 더 많은 옥살레이트가 결합되어 효소가 자유롭게 이용할 수 없게 된다("가용성"). 아래의 평형 상태에서 옥살레이트가 제거되면, 칼슘 대 옥살레이트의 비가 증가하여 훨씬 더 적은 양의 가용성 옥살레이트를 이용할 수 있게 된다.
Ca-옥살레이트 <-> Ca + 옥살레이트(가용성)
식의 오른쪽에서 가용성 옥살레이트를 제거함으로써 더 많은 옥살산칼슘이 용해된다. 평형은 또한 칼슘 농도에 의해 영향을 받기 때문에, 칼슘 농도가 높을 때 가용성 옥살레이트의 양은 더 적을 것이다. 따라서, 효소는 기질의 낮은 농도에서(소량의 가용성 옥살레이트에서) 높은 활성을 가질 수 있어야 하기 때문에 효소의 Km이 중요해진다(11[Thalji, N.K., et al. Urology. 2011; 78 (3): 721.e13-721.217]). 치료 환경에서 이것의 중요성은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백하고, 그 이유는 식이 칼슘은 통상적인 식이의 일부이며, 이용 가능한 가용성 옥살레이트의 양을 효과적으로 줄이기 때문이다. 치료 목적으로 사용되거나 높은 칼슘 농도의 환경에서 옥살레이트를 제거하기 위해 사용되는 효소는 매우 효과적이어야 하고, 즉 가용성 옥살레이트의 양이 매우 적은 경우에도 옥살레이트 분해 반응을 촉매할 수 있어야 한다. 이것은 효소가 그의 기질에 대한 높은 친화도를 가질 것을 필요로 하고 다른 측면에서 그의 kcat/Km은 높을 것을 필요로 한다.
효소 산 안정성:
최근 생명공학의 발전으로 인해, 치료 목적을 위한 약물로 사용될 수 있는 펩티드 및 단백질과 같은 새로운 거대분자 화합물의 선택 및 제조가 가능하다. 이러한 화합물은 강력한 선택적 치료 활성을 나타내지만; 단백질의 치료 활성은 예를 들어 pH, 온도 및 표면 상호작용과 같은 최적의 환경 인자에 크게 의존한다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 바와 같이, 특정 거대분자는 천연 효소 구조 자체에 고유한, 산성 pH에 대한 보다 높은 저항성을 갖는다. 그러나, 많은 효소는 높은 활성이 얻어지는 매우 좁은 pH 범위를 갖는다. 예를 들어, 비. 섭틸리스(YvrK) 또는 비. 세레우스(Bce)로부터의 OxDC 효소는 각각 pH 4 및 2.5 부근에서 최적 활성을 갖지만; 효소(들)는 pH >7에서 완전히 불활성이다. 이것은 중성 또는 알칼리성 pH에서 체액 또는 다른 유체에 사용되는 이들 효소의 임의의 적용 가능성을 감소시킨다.
산업 및 생명공학 공정에서의 효소 적용은 종종 효소가 아주 특이적인, 때때로 상당히 비생리학적 조건 하에서 기능할 것을 필요로 하고, 많은 경우에 공정은 사용되는 효소의 특성에 맞도록 조정될 필요가 있다. 몇몇 산업 공정은 재조작된 pH 의존 특성을 갖는 효소의 적용(예를 들어, 에탄올 및 고프럭토스 시럽 생산을 위한 전분 액화(Shaw, Bott, & Day, 1999), 세제 용도(Ito et al., 1998) 및 염료 표백(Cherry et al., 1999))으로부터 이익을 얻고, 미래에 계속 이익을 얻을 것이다. 따라서, 효소의 pH 의존 특성을 변경하기 위한 실험적 및 이론적 방법을 개발하는 데 대한 큰 관심이 존재한다.
단백질공학 및 유도 진화 분야에서 발전이 이루어졌으며, 합리적인 조작 또는 스크리닝/선택 기반 접근법을 사용하여 다양한 조건에서 효소의 성능을 통상적으로 최적화하는 것이 현재 가능하다. 돌연변이 유발에 의한 효소 특성 및 효소 pH-활성 프로파일을 변경하는데 대한 많은 연구가 이루어졌지만, 이것은 매우 어려운 작업임이 입증되었고, 효소 구조-기능 관계에 대한 수십 년의 연구에도 불구하고 효소 pH-활성 프로파일의 합리적 재조작은 거의 성공하지 못한 상태이다. 변경된 활성 부위 pKa 값에 대한 몇 가지의 실험 예가 있으며, 이를 사용하여 pH-활성 프로파일은 재조작되었지만, 그 변화는 작았고, 종종 비교 단백질 조작 전략을 사용하여 필수 돌연변이가 발견되었다(즉, 돌연변이는 원하는 pH-활성 프로파일을 갖는 상동성 효소와의 비교에 기초하여 도입된다). 20년 간의 연구 결과에 따른 결론은 활성 부위의 매우 특이적인 점 돌연변이가 효소 활성의 pH 의존성을 변화시킬 수 있지만, 그러한 특이적인 활성 부위 점 돌연변이가 알려지지 않는 한(예를 들어, 비교 연구로부터), 돌연변이체 효소를 불활성으로 또는 극도로 감소된 활성을 갖도록 만들지 않으면서 합리적인 조작 방법으로 극적인 pH-활성 프로파일 변화를 달성할 희망이 크지 않다는 것이다. 다른 한편으로, 먼 점 돌연변이는 대부분 야생형 활성을 갖는 돌연변이체 효소를 제공하지만, 이 역시 매우 작은 pH-활성 프로파일 변화를 일으킨다(Tynan-Connolly & Nielsen, 2006).
4차 구조:
많은 효소는 여러 폴리펩티드 사슬의 조립체이다. 따라서, 4차 구조는 서로에 대한 효소 서브유닛의 수 및 배열을 지칭한다. OxDC에 대해서, 이 특정 효소가 본질적으로 삼량체의 이량체인 육량체로 치밀해진다는 것이 문헌을 통해 잘 알려져 있다.
효소 고정화:
가장 적절한 효소를 확인한 후에, 효소는 나중에 더 나은 공정 통합을 위해 제제화될 수 있다. 가장 널리 고려되는 접근법 중 하나는 효소의 고정화이다. 고정화는 다음을 달성할 수 있다: (1) 높은 활성을 갖는 높은 효소 부하, 이에 따른 높은 용적 생산성 유도; (2) 반응의 연장 제어 가능; (3) 생체 촉매가 쉽게 회수되고 재사용되기 때문에 하류 공정이 단순화된다; (4) 생성물 스트림에 생체 촉매가 없다; (5) 연속 운전(또는 드레인 앤 필(drain-and-fill) 방식의 배치 운전) 및 공정 자동화가 가능하다; 및 (6) 기질 저해가 최소화될 수 있다. 이와 함께, 고정화는 자가분해 또는 유기 용매에 의한 변성을 방지하고, 고정화가 적절하게 설계된다면 열, 운전 및 저장 안정성을 가져올 수 있다. 고가의 효소가 사용된다면 경제적 타당성을 위해서 고정화가 중요할 수 있다. 연속적인 재사용을 가능하게 하는 향상된 안정성은 높은 비생산성을 유도하고, 이것은 생물 촉매 관련 생산 비용에 영향을 미친다. 전형적인 예는 고정화된 글루코스 이소머라제의 생산량이며, 생체 촉매의 작동 수명 전체에 걸쳐 생체 촉매 1 kg당 12,000-15,000 kg의 건조 생성물 고 프럭토스 옥수수 시럽(42% 프럭토스 함유)을 허용한다. 상기 통상적인 반응기 작동을 허용하는 증가된 열 안정성은 미생물 성장의 위험을 최소화함으로써, 미생물 성장의 위험을 낮추고, 더 낮은 반응기 세정 빈도가 필요하기 때문에 위생 요건을 덜 까다롭게 만든다.
효소 및 제제의 경구 투여:
특정 실시양태에서, 조성물은 단독으로 또는 치료될 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료제와 조합하여 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 투여된 조성물이 위장관으로 전달되도록 하는 경구 투여이다. 투여 경로는 질환 또는 병태, 원하는 효과 및 사용되는 세포의 성질에 따라 선택될 수 있다. 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있거나 또는 명백할 것이다(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins] 참조). 본원에서 설명되는 조성물이 개체에게 투여되는 경우, 투여는 바람직하게는 "예방 유효량" 또는 "치료 유효량"으로 이루어지며, 이것은 환자에게 이익을 나타내기 위해 충분한 양이다. 옥살레이트 관련 질환의 치료와 관련하여, 치료 유효량은 대상체에서 옥살레이트를 감소시키고/시키거나 질환 증상을 감소시키는 양이다.
의약의 경구 투여가 선호되고, 가장 널리 사용되는 투여 경로이다. 그러나, 이 경로는 낮은 생체이용률로 인해 단백질과 같은 거대분자의 전달에 일반적으로 적합하지 않다. 감소된 생체이용률은 그의 GI관의 거친 환경에서의 고유한 불안정성 및 낮은 흡수성 때문이다. 따라서, 경구 전달 단백질의 생체이용률을 향상시키기 위해 사용된 기술은 산에 의한 GI관 내의 분해를 억제하거나 GI관의 상피층을 통한 단백질의 투과성을 증가시키는 특정 접근법에 기초한다(K. Park, Kwon, & Park, 2011). 경구 투여 경로의 어려움으로 인해, 많은 치료용 단백질이 비경구로 투여된다. 불편을 최소화하고 환자의 순응도를 향상시키기 위해, 장기간에 걸쳐 지속적으로 단백질 약물을 전달하는 지속 방출형 제제가 바람직하다. 단백질 약물의 장기 전달을 위해 가장 널리 사용되는 방법은 생분해성 중합체로 만든 미세구 내의 단백질 약물을 비경구 투여하는 것이다.
미국 식품의약국(FDA)은 많은 제품에서 생분해성 및/또는 생체적합성 중합체를 승인하였다. 합성 중합체 패밀리 중에서, 폴리에스테르는 매력적이고, 광범위하게 연구되어 왔다. 그들의 매력적인 특징은 에스테르 연결의 가수분해에 의한 분해의 용이성, 일부 경우에 대사 경로를 통해 재흡수되는 분해 산물, 및 분해 속도에 영향을 주기 위한 구조 변경 가능성 등을 포함한다. 생분해성 및 생체적합성 폴리에스테르의 예는 폴리(글리콜산) 및 폴리(락트산) 및 다양한 이들의 공중합체, 예를 들어, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)이다. PLGA는 단백질 및 펩티드의 제어된 전달을 위한 담체로서 광범위하게 연구되어 왔고([Ding & Schwendeman, 2008], [Cohen, Yoshioka, Melissa, Hwang, & Langer, 1991], [Gupta, Singh, & O'Hagan, 1998], [van de Weert, Hennink, & Jiskoot, 2000], [Schwendeman, 2002]), 시판되는 여러 주사가능 데포(depot)로 제품화되었고([Okada, Doken, Ogawa, & Toguchi, 1994], [Ogawa, Okada, Heya, & Shimamoto, 1989], [Johnson et al., 1996]), 우수한 안전성이 보고되었다(Chasin & Langer, 1990). PLGA는 락트산 및 글리콜산 단량체로 분해되고, 그 후 산은 크렙스(Krebs) 회로를 통해 C02 및 물로 생체 내에서 제거된다. 생분해성 및 생체적합성 폴리에스테르 또는 공폴리에스테르의 다른 예는 폴리(오르토 에스테르), 폴리카프로락톤 및 폴리(프로필렌 푸마레이트)이다.
폴리프로필렌 푸마레이트는 생분해성 불포화 선형 폴리에스테르이다. 분해 산물은 프로필렌 글리콜, 폴리(아크릴산-코-푸마르산) 및 푸마르산이다. 분해 시간은 복합 재료(Temenoff & Mikos, 2000)에서의 다른 성분뿐만 아니라 중합체 구조에 의존한다.
제어된 약물 전달에 적용되는 생분해성 중합체의 또 다른 예는 폴리무수물(polyanhydride)이다(Brem et al., 1995). 폴리무수물은 무수물 연합의 가수분해에 의해 분해되며, 분해 산물은 독성이 없고, 최소 염증 반응을 생성한다(Gunatillake & Adhikari, 2003). 분해 속도는 적절한 이산성 단량체를 선택하여 중합체 골격의 구조를 변경함으로써 간단히 변경할 수 있다. 예를 들어, 폴리(1,6-비스(p-카르복시페녹시)) 헥산은 대략 1년 내에 분해되는 반면, 폴리(세바식산)은 신속하게 분해된다(염수에서 약 54일). 따라서, 이들 단량체의 상이한 양의 조합은 특정 용도에 대해 맞춤 설계된 분해 특성을 갖는 중합체를 생성할 것이다(Temenoff & Mikos, 2000). 생분해성 중합체의 추가의 예는 폴리(비닐 술폰)산 및 폴리(아크릴)산이다.
다양한 수준의 수용성 산 불순물이 PLGA에 존재하는 것으로 잘 알려져 있고, 이것은 고체 상태 안정성, 약물 캡슐화 효율 및 약물 방출 거동에 영향을 줄 수 있다(Yamamoto, Okada, Yasuaki, & Miyagawa, 1993). 또한, 지방족 폴리에스테르 미세구의 분해 메커니즘은 가수분해 메커니즘이라고 일반적으로 고려되고; 에스테르 골격은 체액과 같은 수성 환경에서 가수분해되고, PLGA의 경우 중합체는 최종적으로 락트산 및 글리콜산 단량체로 분해되어, 즉각적인 환경에서 pH를 감소시킨다([Freitas, Merkle, & Gander, 2005], [Fu, Pack, Klibanov, & Langer, 2000], [Zhu, Mallery, & Schwendeman, 2000]). 이것은 캡슐화된 단백질의 안정성에 대한 문제로서 관련 기술 분야에서 인정되고 있다.
버트(Vert)와 동료들은 락트산 및 글리콜산 중합체를 기초로 하여 장치의 가수분해에 의한 분해의 크기 의존성에 대한 광범위한 연구를 수행하였다. 락티드/글리콜리드 단독 중합체 및 공중합체 미세구의 가수분해에 의한 분해 거동을 조절할 수 있는 인자는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 수 투과성 및 용해도(친수성/소수성), 화학적 조성, 가수분해 메커니즘(비촉매, 자가촉매, 효소), 첨가제(산성, 염기성, 단량체, 용매, 약물), 형태(결정질, 비정질), 장치 또는 입자 치수(크기, 모양, 표면 대 부피 비율), 매트릭스의 다공성, 유리 전이 온도(유리질, 고무질), 분자량 및 분자량 분포, 물리화학적 인자(이온 교환, 이온 강도, pH), 및 제조 절차의 특성(이온 교환, 이온 강도, pH), 살균 및 이식 부위([Anderson & Shive, 1997], [T. G. Park, 1995], [S. M. Li, Garreau, & Vert, 1990], [Grizzi, Garreau, Li, & Vert, 1995], [T. G. Park, 1995]). 이들 인자 중 일부는 또한 상기 설명한 다른 유형의 중합체의 가수분해에 의한 분해 거동과 관련되고, 관련된 인자는 다음 단락에서 더 자세히 설명된다.
첨가제는 산성 또는 염기성 특성 및 로딩 수준을 통해 분해 속도에 영향을 줄 수 있다. 몰딩(Maulding) 등은 3차 아민 화합물인 티오리다진에 의한 분해의 촉진에 대해 보고하였다. 촉매 작용은 아미노기의 친핵 특성에 기인하였다(Maulding et al., 1986). 따라서, 염기성 화합물은 에스테르 연결 절단을 촉매할 수 있고, 따라서 중합체 분해를 촉진할 수 있다. 다른 한편으로, 적절한 양의 염기성 화합물은 카르복실 말단기를 중화할 수 있고, 따라서 산 유도된 분해 속도를 감소시킬 수 있다.
사용된 단독 중합체 또는 공중합체의 결정도는 분해 속도에 중요한 역할을 할 수 있다. 동물의 장기간 연구는 비정질 구조의 임플란트 시편이 반결정질 샘플에 비해 임플란트의 분자량을 감소시킴을 보여주고, 따라서 비정질 성분의 분해가 부분적으로는 자가 촉매 분해 거동에 기인함을 시사한다(Pistner et al., 1994).
미세구의 다공성은 올리고머 및 그의 카르복실 사슬 말단이 자가 촉매 분해를 촉진할 수 있는 저분자량 분해 산물의 확산을 향상시킬 수 있기 때문에 중요한 역할을 한다(Shive & Anderson, 1997). 중합체 농도가 보다 낮은 용액으로 제조된 미세구는 일반적으로 보다 다공성의 내부 구조를 갖고(Yang, 2001), 이것은 중합체 매트릭스를 통한 산성 분해 산물의 보다 효과적인 확산을 유발하여 그의 방출을 촉진할 가능성이 있다(Liu & Schwendeman, 2012).
단량체의 분자량 분포는 또한 큰 또는 넓은 분자량 분포가 자가 촉매 작용을 위해 이용 가능한 더 많은 카르복실산 말단기를 갖기 때문에 자가 촉매 작용의 과정에 영향을 미칠 수 있다.
분해 산물은 단지 단량체가 아님이 밝혀졌고; PLGA 필름에서 3주의 인큐베이팅 후의 수용성 산의 주성분은 글리콜산, 락트산 및 락토일락트산 및 락트산의 사량체로 가정된 하나의 알려지지 않은 중합체이었다(Ding & Schwendeman, 2004). 산 함량은 3주 후에 극적으로 증가하였고, 이것은 폴리에스테르 가수분해를 자가 촉매 작용하는 산에 의한 중합체 분해 및 가속화된 분해 속도로 인해 산이 연속적으로 축적되었기 때문이다(Pearce & Schaefgen, 1992). 글리콜산의 선형 이량체는 불안정하고, 글리콜산으로 빠르게 가수분해되는 반면, 락토일락트산은 훨씬 더 오랜 시간 동안 손상되지 않은 상태로 유지된다. 또한, 글리콜산은 락트산보다 3-4배 더 빨리 방출되는 것으로 관찰되었다([Marcato, Paganetto, Ferrara, Cecchin, 1996], [Giunchedi, Conti, Scalia, & Conte, 1998]). 중합체의 락티드 함량이 50%에서 100%로 증가함에 따라(50:50 PLGA, vs. PLA), 락티드 풍부 공중합체 및 단일 중합체의 보다 느린 분해 속도에 의해 설명되는 대응하는 단량체 산의 감소가 관찰되었다([Tamada & Langer, 1993], [Shih, Waldron, & Zentner, 1996]).
또한, PLGA에 Mg(OH)2, MgCO3, 및 ZnCO3와 같은 제산제를 함께 첨가하면 1개월 초과 동안 산 민감성 단백질의 구조적 손실 및 응집을 강력하게 억제할 수 있다([Zhu et al., 2000]; [Zhu & Schwendeman, 2000], [Jiang & Schwendeman, 2008], [Kang & Schwendeman, 2002]).
최근에, 매우 광범위한 pH에 걸친 PLGA 미세구의 미기후(microclimate) pH 분포의 모니터링은 공초점 주사 현미경 및 pH 민감성 프로브를 사용한 pH 매핑을 통해 개선되었다([Sansdrap & Moes, 1997], [Ding & Schwendeman, 2008]). 또한, 미세 환경 pH를 예측하기 위한 기본 모델이 얇은 PLGA 필름에 대해 확립되었고(Liu & Schwendeman, 2012), 다른 구조의 예측에도 도움이 될 것으로 입증될 것이다.
실시양태의 추가의 설명
4차 구조:
본 발명은 대상체, 산업 프로세스 및/또는 식품 프로세스에서 옥살레이트를 분해하기 위한 새로운 조성물을 개발하려는 본 발명자들의 추구에 기초한다. OxDC 활성은 7가지 박테리아 종에서 발견된 효소 및 하나의 박테리아 종 Cb6301로부터의 많은 변이체로부터 평가되었다. 또한, 하나의 진균 종인 아그로시베 아에게리타(A8/A0)로부터 활성이 평가되었다. 활성은 실시예 1에 기재된 절차에 따라 시험하였다. 많은 상기 상동체로부터의 OxDC 활성은 안정하고, 도 5-7에 제시된 바와 같이 적어도 pH 1.5(Cb6301, Cb6312 및 Cb6803), pH 2.0(A8 및 Bcl), pH 2.5(Bce), pH 3.0(Bam) 및 pH 3.5 (Yvrk 및 Bpu)에서 활성을 보인다. Cb6301, Cb6312 및 Cb6803은 펩신으로부터 pH 1.5까지 완전한 보호를 나타낸다. Cb6301, Cb6312 및 Cb6803은 pH 1.5에서 활성을 보이며 안정하고, 그 이유는 이러한 효소의 4차 구조가 삼량체이기 때문이다. 삼량체 4차 구조가 pH 변화에 보다 저항성인 이유는 삼량체 계면에서의 이온성 상호작용의 수가 적고 수소 결합 상호작용의 수가 증가하기 때문이다. 이들 세 가지 효소는 천연적으로 삼량체로 치밀해지는 것으로 밝혀진 최초의 옥살레이트 데카르복실라제 효소 패밀리이다. 나머지 모든 효소는 육량체 계면에서 아미노산 구성으로 인해 육량체로 치밀해진다(표 4). 육량체를 함께 유지하는 상호작용은 주로 이온성이고; 글루탐산 및 아스파르트산으로부터의 음전하가 라이신 및 아르기닌으로부터의 양전하와 상호작용한다. 아스파르트산(pKa 3.65) 및 글루탐산(pKa 4.25)이 양성자화될 때, 산성 조건 하에서 OxDC의 4차 구조가 해리되고, 따라서 효소는 비폴딩되고, 후속적으로 활성이 감소한다(비가역적인 사건)(도 11 참조). YvrK 및 Bpu는 각각 Bam 및 Bce보다 더 많은 글루탐산을 가지고 있고(표 4 참조), 이에 의해 글루탐산의 pKa가 4차 구조 해리의 핵심 유도 원인이 되고, 따라서 Yvrk 및 Bpu가 pH 3.5에 대해서만 활성을 보이고 안정하게 된다. 천연적으로 육량체로 치밀해지는 효소는 육량체 계면에서 더 많은 수의 이온성 상호작용을 가질 뿐만 아니라, 삼량체 계면에서도 더 많은 수의 이온성 상호작용을 갖는다. 서브유닛당 이온성 상호작용의 조합된 수는 다음과 같다:
Cb6301: 25
Bcl: 29
A8: 32
Bce: 32
Bam: 44
YvrK: 45
Bpu: 47
총 이온성 상호작용의 수와 산성 pH 안정성 사이에는 직접적인 상관관계가 있으며, 가장 적은 양을 갖는 Cb6301이 가장 안정성이 높고 가장 많은 양을 갖는 Bpu가 가장 안정성이 낮다.
천연적으로 육량체인 효소는 활성 부위가 서브유닛 계면에 근접하기 때문에 활성을 보이는 육량체 4차 구조를 가질 필요가 있다. 육량체 계면에 10개 초과의 이온성 아미노산 잔기(D, E, R 및 K)를 갖는 효소(6개 서브유닛 중 2개 사이의 상호작용)는 pH 3.0 초과에서만 활성을 보인다(표 4 참조). 육량체 계면에 5-9개의 이온성 잔기(D, E, R 및 K)를 갖는 효소(6개 서브유닛 중 2개 사이의 상호작용)는 pH 2.0 초과에서만 활성을 보이고, 5개 미만의 이온성 잔기를 갖는 효소(6개 서브유닛 중 2개 사이의 상호작용)는 pH 2.0 미만에서 활성을 나타낸다. 이것은 또한 모든 아스파르트산 및 글루탐산이 양성자화되었기 때문에 단지 계면 내의 아르기닌 및 라이신 잔기의 수에 기인하는, 육각형 계면에서의 양의 총 순 이온 전하에 대응한다. 이들 결과는 다음과 같은 강한 경향을 보여준다:
1.) 총 순 이온 전하가 +8 이상인 효소는 pH 3.0 초과에서만 옥살레이트 분해 활성을 갖는다(6개의 서브유닛 중 2개 사이의 전하).
2.) 총 이온 전하가 +4 내지 +7인 효소는 pH 2.0 초과에서 옥살레이트 분해 활성을 갖는다(6개의 서브유닛 중 2개 사이의 전하).
3.) 총 이온 전하가 +4 미만인 효소는 pH 2.0 미만에서 옥살레이트 분해 활성을 보인다(6개의 서브유닛 중 2개 사이의 전하).
전부는 아니지만 대부분의 아스파르트산 및 글루탐산이 양성자화되는 pH 조건에서, 육량체 계면은 총 양의 순 전하를 갖는다. 총 양의 순 전하는 라이신 및 아르기닌 아미노산 잔기의 수에 따라 증가한다. 육량체 계면에서 이온성 잔기의 비율이 보다 큰 효소는 pH가 감소된 산의 양성자화에 의해 보다 큰 총 양의 순 전하가 생성되기 때문에, 이온성 잔기가 보다 적은 효소보다 pH 변화에 더 민감하다. 실제로, 도 7은 모든 아스파르트산 및 글루탐산이 양성자화된 pH vs. YvrK, Bam, Bpu, Bcl, Cb6301, A8/A0 및 Bce 효소가 옥살레이트 분해 활성을 나타내는 대부분의 산성 pH에서 총 순 이온 전하의 직접적인 상관관계를 보여준다. 실제로, R2 값은 상당한 세트의 데이터를 통해 0.95를 넘는 강력한 상관관계를 보여준다.
한 계면에서 아미노산 또는 전하의 수는 2개의 서브유닛, 예를 들어 서브유닛 A와 D 사이에 있음에 유의한다(도 1 참조). OxDC 효소는 삼량체의 이량체를 형성하고; 따라서 하나의 OxDC 육량체는 3개의 계면을 가지고 있다. 따라서, 상기 언급된 이온 전하는 "전체 육량체 계면" 사이의 총 전하를 설명하기 위해 3을 곱해야한다.
육량체 계면 내에서뿐만 아니라 모든 계면(육량체 및 삼량체) 내에서 직접적인 상관관계가 존재한다. 예를 들어, 산 안정성이 가장 작은 효소(Bam, Bce 및 Bpu)는 육량체 및 삼량체 계면 둘 모두에 44개 초과의 이온성 아미노산을 갖는다. Bel, Bce 및 A8은 29-32개의 이온성 아미노산을 갖고, Cb6301은 25개를 갖는다. Bcl, Bce, A8 및 Cb6301은 감소된 수의 이온성 상호작용을 갖지만, 이들은 더 많은 수의 수소 결합 상호작용을 갖는다. 이러한 수소 결합 상호작용은 계면에서의 안정성을 증가시키고, 계면이 산 변성을 덜 일으키게 만든다.
따라서, 다음 컷오프(cutoff)를 사용하여 발견될 또는 발견된 임의의 OxDC의 아미노산 서열을 기초로 하여, 본 발명자들은 효소가 삼량체 또는 육량체인지의 여부, 및 또한 효소의 산 안정성을 예측할 수 있다. 이 정보는 또한 효소의 특성, 즉 pH 활성 프로파일을 변화시키는 서열 변형 전략을 제공한다. 예를 들어, 이 지식을 갖추고 있으면, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 안정성 및 pH 프로파일을 변경시키는 효소에 대한 변형을 어디에서 수행할 것인지 결정할 수 있다. 컷오프는 다음과 같이 정의된다:
육량체 및 삼량체 계면에서 하나의 서브유닛의 총 하전 아미노산:
1.) >39: 효소는 육량체일 것이고, pH 3.0 이상에서만 활성을 나타낸다.
2.) 29-39: 효소는 육량체일 것이고, pH 2.0 이상에서만 활성을 나타낸다.
3.) <29: 효소는 삼량체일 것이고, pH 2.0 이하에서만 활성을 나타낸다.
육량체 계면에서 하나의 서브유닛의 총 하전 아미노산:
1.) >10: 효소는 육량체일 것이고, pH 3.0 이상에서만 활성을 나타낸다.
2) 5-9: 효소는 육량체일 것이고, pH 2.0 이상에서만 활성을 나타낸다.
3.) <5: 효소는 삼량체일 것이고, pH 2.0 이하에서만 활성을 나타낸다.
전체 육량체 계면에서 총 아르기닌 및 라이신:
1.) >22: 효소는 육량체일 것이고, pH 3.0 이상에서만 활성을 나타낸다.
2) 10-21: 효소는 육량체일 것이고, pH 2.0 이상에서만 활성을 나타낸다.
3.) 9 이하: 효소는 삼량체일 것이고, pH 2.0 이하에서만 활성을 나타낸다.
촉매 효율:
본 발명의 특정 실시양태는 촉매 효율이 높은 옥살레이트 분해 효소에 관한 것이다. 촉매 효율이 높기 때문에, 효소는 칼슘과 옥살레이트 사이의 강력한 이온성 상호작용과 경쟁할 수 있고, 따라서 주위 칼슘 이온이 고농도임에도 불구하고 옥살레이트를 분해할 수 있다. 촉매 효율은 효소의 아미노산 서열 및 구조에 고유한 것으로, 대체로 kcat 및 Km으로 측정된다.
제제화되지 않은 경우에도 촉매 효율이 높고 안정한 신규한 효소가 개시된다. 촉매 효율은 871-77000회 전환/M/s의 범위를 갖는다(표 5 참조). 효소는 산성 pH, 예컨대 1.5-5.0의 산성 pH에서도 매우 안정하다(Cb6301, Cb6312 및 Cb6803). A8, Cb6301, Cb6312, Cb6803 및 Bce와 같은 효소는 지금까지 발견/보고된 것보다 훨씬 더 강력한 옥살레이트 친화도를 갖는다. 이들 효소의 Km은 0.08-0.5 mM이고, 8.4 mM인 Yvrk 효소와 대비된다. 실제로, 불용성 옥살레이트를 사용하여 옥살레이트 분해를 모니터링할 때, Cb6301 및 Bce는 Yvrk 효소에 비해 가용성 및 불용성 옥살레이트 둘 모두를 분해하는 데 보다 효과적이다(도 22-24 참조). 이들 효소는 옥살레이트에 대한 높은 친화도를 가져서 칼슘을 효과적으로 압도할 수 있고, 따라서 가용성 부분만이 아닌 전체 옥살레이트를 분해할 수 있다. 이러한 시험관 내 결과는 A8, Cb6301, Bce 및 Yvrk가 동일한 수의 옥살레이트 분해 단위를 사용하여 평가된 비글(Beagle) 개 연구에서 확인되었다. 결과는 A8 및 Cb6301 효소가 뇨중 옥살레이트를 각각 60% 및 40% 낮출 수 있음을 보여준다(도 18-21 참조). Bce는 뇨중 옥살레이트를 24% 감소시켰고, Yvrk 효소는 뇨중 옥살레이트의 유의한 감소를 나타내지 않았다 (도 18-21).
일양성자화된 옥살레이트(pKa = 3.81 및 pKa = 1.25)는 활성 부위 내의 비양성자화된 글루탐산에 결합한다. 붕괴되지 않은 활성 부위 내의 비양성자화된 글루탐산은 붕괴된 활성 부위(예컨대, 붕괴된 육량체의 활성 부위) 내의 동등한 잔기보다 비양성자화된 상태로 유지될 가능성이 더 높다. 따라서 pH가 6으로부터 대략 3으로 감소하면, 일양성자화된 옥살레이트의 비율은 비양성자화된 옥살레이트에 비해 최대화될 것이다. 따라서, 이것은 붕괴되지 않은 활성 부위에 대한 옥살레이트의 결합을 증가시켜, 보다 낮은 Km 및 보다 높은 촉매 효율을 유도할 것이다(도 15 참조). 글루탐산은 또한 비양성자화된 상태로 유지될 필요가 있고, 따라서 소수성 환경, 예컨대 붕괴되지 않은 활성 부위의 환경에서 발생하는 것과 같이 그의 pKa를 보다 낮은 값으로 변경하는 것은 잔기를 비양성자화된 상태로 유지하여 결합력을 향상시킬 것이다. YvrK 효소 구조는 3.5 미만의 pH에서 불안정하기 때문에, Km은 보다 적은 일양성자화된 옥살레이트가 이용 가능한 pH 4.0에서 결정되어야 하고, 8.4 mM인 Km 값이 유도된다. 그러나, Cb6301, A8/A0, Bce와 같은 효소는 보다 산성 조건인 pH 3.0 이하에서 결정된 Km 값을 가질 수 있다. 이러한 보다 산성인 pH 조건에서, 더 큰 비율의 일양성자화된 옥살레이트가 이용 가능하고, 1 mM 미만인 Km 값이 유도된다. 또한, 이들 산 안정성 효소는 활성 부위 주위에 안정한 구조를 제공하여, 글루탐산이 보다 산성인 조건에서 비양성자화된 상태로 유지되도록 한다.
안정성:
조사한 대부분의 효소는 안정하고, 60℃를 초과하는 온도에서 OxDC 활성을 보인다(도 1 참조). 이 특성은 안정성 예측에 매우 도움이 된다. 따라서, 본 발명은 이들 촉매 효율이 높고, pH 및 열적으로 안정한 옥살레이트 분해 효소를 포함한다. 따라서, 설명된 촉매 효율이 높은 효소는 프로테아제, 산 및 온도에 대해 높은 안정성에 도움이 되는 구조를 갖는다. 이러한 안정한 프로파일은 예를 들어 경구 투여시 활성 손실 위험을 감소시킨다. 이러한 안정하고 촉매 효율이 높은 효소는 인간 위와 같은 가혹한 환경에서도 높은 활성을 유지하기 위한 안정화 제제를 필요로 하지 않는다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 당, 예컨대 덱스트로스, 프럭토스, 트레할로스, 글루코스 또는 락토스를 함유하는 간단한 제제가 효소를 제제화하기 위해 사용된다. 효소는 이어서 분무 또는 동결 건조 방법을 포함하는 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 건조될 수 있다.
Cb6301, Cb6803 및 Cb6312는 모두 소량의 옥살레이트 옥시다제 활성을 가지고 있어, 이들 특정 효소에 유해한 라디칼을 생성한다. 이러한 라디칼의 생성은 시간의 함수로서 활성의 손실을 초래한다. 본 발명자들은 위치 340의 이소류신 잔기(도 10에서 진한 글씨로 강조됨)를 글루탐산으로 돌연변이시키면, 상기 라디칼 형성이 옥살레이트 분해 활성의 손실을 야기하지 않는다는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 o-페닐렌디아민, 히드로퀴논 및 아스코르브산과 같은 비타민을 효소 용액에 도입하면, 효소가 보다 긴 시간 동안 활성을 유지할 수 있음을 발견하였다.
효소의 변형
1.) 산성 조건에서의 pH 활성 프로파일: 산성 활성 프로파일을 갖는 효소를 조작하기 위해, 육량체 계면 내의 이온성 아미노산은 극성 또는 소수성 잔기로 대체될 수 있고/있거나 효소는 N-말단에서 처음 10-30개의 아미노산을 제거하기 위해 말단 절단될 수 있다. 또한, 삼량체 계면은 3+/- 가변성으로, 대략 10-14(D/E) 및 8-11(R/K) 아미노산을 갖도록 조작될 것이다. 결정 구조에 따르면, 이들 이온성 아미노산은 수소 결합을 형성하는 극성 아미노산뿐만 아니라 서로 상호작용하도록 위치되고 설계될 것이다. 이것은 아스파르트산 및 글루탐산이 산성 조건에 덜 취약하게 만들 것이다. 실시형태는 이 기준을 포함하도록 변형된 효소를 포함한다.
2.) 시간의 함수로서 유지된 pH 활성: Cb6301, Cb6312 및 Cb6803에 대한 중요한 구조적 특징은 아미노산 340이 소수성이라는 것이다. 이것은 이들 효소가 라디칼 형성으로 인해 시간의 함수로서 활성을 상실하게 한다. 아미노산 340이 글루탐산으로 돌연변이되면, 효소는 시간의 함수로서 활성을 완전히 유지하고, 따라서 효소는 안정하고,라디칼 저해에 취약하지 않다. 따라서, 이 잔기는 지속적인 활성을 갖기 위해 글루탐산으로 돌연변이될 것이다. 따라서, 실시양태는 잔기 340이 글루탐산으로 치환된 Cb6301, Cb6312 및 Cb63803에 관한 것이다.
3.) 넓은 pH 활성 프로파일: 산성 활성 프로파일을 갖는 효소를 조작하기 위해, 육량체 계면 내의 이온성 아미노산은 약 4-5(D/E) 및 4-5(R/K) 아미노산 +/- 2 아미노산으로 이루어질 수 있다. 결정 구조에 따르면, 이들 이온성 아미노산은 수소 결합을 형성하는 극성 아미노산뿐만 아니라 서로 상호작용하도록 위치되고 설계될 것이다. 이것은 아스파르트산 및 글루탐산이 산성 조건에 덜 취약하게 만들 것이다. 특정 실시양태에 따르면, 효소는 육량체 계면에서 언급된 아미노산을 보유하도록 조작된다. 또한, 삼량체 계면은 약 16(D/E) 및 7(R/K) 아미노산(+/- 5 아미노산)을 갖도록 조작될 것이다. 다시, 결정 구조에 따르면, 이들 이온성 아미노산은 수소 결합을 형성하는 극성 아미노산뿐만 아니라 서로 상호작용하도록 위치되고 설계될 것이다. 이것은 아스파르트산 및 글루탐산이 산성 조건에 덜 취약하게 만들 것이다. 특정 실시양태는 삼량체 계면에 언급된 아미노산 잔기 함량을 포함하도록 변형된 효소에 관한 것이다.
4.) 낮은 Km/높은 촉매 효율: 낮은 Km/높은 촉매 효율을 갖는 효소를 달성하기 위해, 바로 위의 3.)("넓은 pH 활성 프로파일")에서 제시된 바와 동일한 전략이 사용될 것이다.
재조합 발현:
본원에서 설명되는 효소는 서열 번호 1 내지 47의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 임의의 서열, 및 그 대부분이 상업적으로 입수가능하고 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있거나 맞춤 제조될 수 있는 다양한 발현 시스템 및 숙주 세포를 사용하여 재조합 방식으로 발현될 수 있다. 본래의 서열은 예컨대 코돈 최적화에 의해 발현을 향상시키거나 분비 서열의 포함과 같이 하류 공정을 촉진시키는 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 유전자 서열 변경은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 구상될 수 있다. 숙주 균주는 다른 코드들 중에서 효소의 유전자 발현 프로모터의 코딩을 제공할 적합한 벡터로 형질전환될 것이다. 또한, 발현되는 유전자 서열은 친화도 정제 등에 사용하기 위한 친화도 태그와 같이 하류에서 유용한 서열의 코딩을 함유할 수 있다.
재조합 효소는 이. 콜라이(E. coli), 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 바실루스 종, 아스페르길루스(Aspergillus) 종 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 단백질 발현 분야의 통상의 기술자에게 알려진 매우 다양한 숙주에서 발현될 수 있다.
효소의 재조합 생산을 위해, 숙주는 효소 또는 단백질 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 플라스미드, 벡터, 파지미드 또는 전사 또는 발현 카세트의 형태의 구축물을 포함해야한다. 단일 또는 다중 카피로 유지되는 구축물을 포함하여 다양한 구축물이 이용 가능하다. 많은 재조합 발현 시스템, 성분 및 재조합 발현을 위한 시약은 예를 들어 인비트로겐 코퍼레이션(Invitrogen Corporation, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); 유.에스. 바이올로지컬(US Biological, 미국 매사추세츠주 스웜프스코트 소재); 비디 바이오사이언시스 파밍겐(BD Biosciences Pharmingen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재); 노바겐(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재); 스트라타젠(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 홀라 소재); 및 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 독일 브라운쉬바이크 소재)로부터 상업적으로 이용 가능하다.
구성적 및/또는 유도성 프로모터를 포함하는 이종성 프로모터는 선택적으로 단백질의 재조합 발현을 제어한다. 예를 들어 T7과 같은 프로모터 또는 숙주에 적합한 것으로서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 프로모터.
효소 또는 단백질의 재조합 핵산 서열은 정제 목적, 폴딩 목적 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 단백질의 발현 이외의 추가의 목적을 위한 핵산을 포함할 수 있다. 이들의 일부 예는 분비 서열, 신호 서열, 링커, 발현 제어 요소, 친화도 태그 등이다. 이들 핵산 서열로부터 생성된 아미노산은 단백질 발현 후 제거될 수 있거나 제거되지 않을 수 있다. 상기 언급된 모든 구축물은 효소 및 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있으며, 이는 본원에서 설명되는 방법에서 사용될 것이다.
숙주 세포는 상기 개요가 설명된 선택된 발현 시스템으로 형질전환/형질감염될 것이다. 세포는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 배양될 것이고, 상기 방법은 진탕 플라스크, 생물 반응기 및 발효기에서의 액체 배양뿐만 아니라 플레이트 등에서의 고형 배양도 포함한다.
단백질은 본원에서 개요가 설명된 방법에 사용되기 전에 천연 또는 재조합 공급원과 같은 공급원으로부터 정제될 수 있다. 정제는 초음파 처리, 프렌치 프레스, 유리 비드 또는 다른 물리적 용해 수단, 또는 화학적 세포 용해에 의한 숙주 세포로부터의 추출, 및 침전, 원심분리 또는 크로마토그래피 단계 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 수단에 의한 분리를 포함할 수 있다. 선택적으로, 예를 들어 투석, 정용여과(diafiltration), 접선 유동 여과(TFF: tangential flow filtration), 크로마토포커싱 크로마토그래피 및/또는 완충제 교환과 관련된 농축 단계가 사용될 수 있다.
고정화:
열적으로 안정하고, 넓은 pH 활성 프로파일(1 mM 미만의 Km)을 경험하고, 광범위한 pH 범위 내에서 안정적인 OxDC 효소가 고정화를 위한 이상적인 후보 물질이다. 따라서, A8 효소는 열 융점이 약 77℃이고 pH 2.0-6.0에서 활성을 보이고 pH 2.0-11.0에서 안정하기 때문에 이상적인 후보이다. 고정화는 다음을 달성할 수 있다: (1) 높은 활성을 갖는 높은 효소 부하; (2) 반응의 연장 제어; (3) 용이한 회수 및 재사용 허용; (4) 생체 촉매가 없는 생성물; (5) 연속 운전(또는 드레인 앤 필 방식의 배치 운전) 및 공정 자동화 가능; 및 (6) 기질 저해의 최소화 가능. 이와 함께, 고정화는 자가분해 또는 유기 용매에 의한 변성을 방지하고, 고정화가 적절하게 설계된다면 열, 운전 및 저장 안정성을 가져올 수 있다. 경제적 타당성을 위해서 고정화가 중요할 수 있다. 연속적인 재사용을 가능하게 하는 향상된 안정성은 높은 비생산성을 유도하고, 이것은 생물 촉매 관련 생산 비용에 영향을 미친다. 상기 통상적인 반응기 작동을 허용하는 증가된 열 안정성은 미생물 성장의 위험을 최소화함으로써, 미생물 성장의 위험을 낮추고, 더 낮은 반응기 세정 빈도가 필요하기 때문에 위생 요건을 덜 까다롭게 만든다.
식품 옥살레이트 분해:
인간 식품에서 옥살레이트를 분해하는, 아그로시베 아에게리타(A0)로부터의 OxDC 효소의 효과를 평가하기 위해, 몇 가지 정기적인 서양 식사(미리 만들어진 "린 퀴진(Lean Cuisine) 식사")를 포장재 상의 지시에 따라 전자레인지에서 조리하고, 균질화하고, A0 효소의 옥살레이트 분해 활성 스크리닝에서 매트릭스로 사용하였다. 평가된 식사 및 최종 반응 혼합물 내의 대략적인 칼슘 농도를 표 3에 제시한다. 이들 실험은 인간 위 내에서 소화되고 있는 식사로부터 옥살레이트를 제거하기 위해 OxDC 효소를 경구로 사용하는 효과를 입증하기 위해 수행되었다.
도 4에 제시된 바와 같이, A0으로부터의 OxDC는 알칼리성 pH보다 산성 pH에서 및 칼슘 수준이 더 낮은 식사에서 더 많은 옥살레이트를 분해할 수 있다. 칼슘 수준이 매우 낮은 식사(<1 mM Ca2 +)에서, 총 옥살레이트의 90% 초과가 pH 2 내지 5에서 60분 동안 분해되었다. 칼슘 수준이 낮은 식사(<3 mM Ca2 +)에서, 총 옥살레이트의 70% 초과가 pH 2 내지 4에서 60분 동안 분해되었다. 칼슘 수준이 중간인 식사(3-5 mM Ca2 +)에서는, A0 OxDC 효소가 pH 2 내지 3에서 60분 동안 총 옥살레이트의 60-80%를 분해할 수 있고, pH 4에서는 50%를 분해할 수 있다. 고 칼슘 식사(>5 mM Ca2 +)에서, 효소는 pH 2 및 3에서 60분 동안 총 옥살레이트의 40-60%를 분해한다. 분해율의 감소는 중등도 내지 고 칼슘 함유 식사에서 옥살레이트의 용해도 감소로 인한 것일 수 있다. Yvrk(Km = 8.4 mM)와 달리, A0은 옥살레이트에 대한 높은 친화도 갖고(Km = 0.08 mM), 이에 의해 A0은 인간 위 내에서 낮은 수준의 옥살레이트를 보다 잘 분해할 수 있다. OxDC 효소가 인간 위 내에서 옥살레이트를 분해할 때 효과적이 되도록, 효소는 음식이 공급된 인간 위(pH 1.0-4.5)에 일치하는 pH 프로파일 및 1.0 mM 미만의 Km을 필요로 한다. 따라서, Cb6301, Cb6312 및 Cb6803은 옥살레이트를 감소시키기 위한 경구 효소 투여를 위해 A0/A8 및 Bce만큼 이상적인 후보 물질이다.
옥살레이트는 식품을 산성화하고 식이 칼슘을 이용할 수 없게 만들고, 화학 화상을 일으키고, 치아를 손상시키고, 요로 및 신장 결석을 유발하는 것과 같이 인체 건강에 문제를 일으키는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 옥살산 관련 병태 및 증상에 취약한 인간들이 식이 옥살레이트를 피할 수 있도록 옥살레이트가 적거나 옥살레이트가 없는 식품을 제공하는 것이 유익할 것이다. 이것은 개별 음식 및 음료의 건강상 가치를 증가시킬 것이다. 식품 가공 산업에서, 효소는 많은 다양한 생산 단계에서 널리 사용되고, 따라서, OxDC 효소를 포함시키는 것이 실행 가능할 것이다. 실제로, OxDC 효소가 개별 음식물 내의 옥살레이트를 분해하는 효과를 입증하기 위해 몇 가지 식(료)품을 평가하였다. 이 식품들은 차, 맥주 및 과일 주스로 음용하기 위해 준비되었다. 그러나, 통조림 제품(채소, 과일 및 수프), 초콜릿, 밀가루, 향신료 가공과 같은 다양한 식품 유형의 식품 가공에 OxDC 효소를 사용하는 것이 구상될 수 있다.
이러한 음료에 Cb6301 OxDC 효소를 첨가하면 대부분의 상기 음료에서 옥살레이트가 완전히 제거되었다. 옥살레이트의 감소 범위는 75-100%이었다. 이 실험은 식품 가공에서 OxDC 효소 사용의 유용성을 입증하기 위해 수행되었다. 또한, 상기 식사 내용물에서 옥살레이트의 제거를 보여주는 결과는 효소가 음료 제조뿐만 아니라, 특히 통조림 제품, 수프, 밀가루, 초콜릿, 향신료 가공과 같은 보다 복잡한 식품 제조 공정 및 매트릭스에서도 효과적임을 입증한다.
실시예 9 및 도 10 내지 도 11에 제시된 바와 같이, 효소 활성을 완전히 억제하는 시험된 분자는 존재하지 않았다. 이들 분자는 OxDC 활성을 억제할 잠재력에 대해 선택되었다. 이것은 OxDC 효소가 매우 다양한 식품에 사용될 수 있고 옥살레이트 제거에 효과적임을 입증한다.
제제화:
본원에서 설명되는 신규한 제제는 pH 활성 화합물의 혼입으로 인하여 주위 pH에 비해 효소를 즉시 둘러싸는 변경된 미세 환경 pH를 생성한다. 이러한 변화는 미세 환경 pH를 준최적 환경과 상이하게 만들고 각각의 효소에 최적으로 만든다. 따라서, 미세 환경은 각각의 효소의 최적 pH 범위 내에 있는 pH를 갖는다. 예를 들어, 약 pH 1.5 - 4.5에서 활성이 매우 높은 자유(유리) 산 안정 효소는 pH 6에서, 설령 갖더라도 낮은 활성을 가질 것이다. 그러나, pH가 약 1.5 - 4.5인 미세 환경을 효소 주위에 생성함으로써, pH가 6인데도 높은 활성이 유지될 수 있다. 따라서, 제제화된 효소를 보다 넓은 범위의 상이한 pH에서 보다 활성을 갖도록 만들면, 효소는 pH-활성 프로파일에 의해 덜 제한되고, 주위 pH에 보다 덜 민감하게 된다.
준최적 pH에서 제제화된 효소의 지속적인 높은 활성은 효소 반응 생성물의 형성을 주시함으로써 측정되고 모니터링될 수 있다. 제제화된 효소의 효과적인 pH-활성 프로파일은 본 발명에 따라 제제화된 효소가 최적 pH 조건에 비해 ≥20% 활성을 유지하는 환경(주위) pH의 범위로 본원에서 정의된다.
본 발명자들은 놀랍게도, 본원에서 설명되는 제제가 pH 7.0 이상에서 비제제화된 바실루스 유래의 예시적인 효소인 옥살레이트 데카르복실라제(OxDC)에 대해 이전에 활성이 관찰된 적이 없는 주위 pH 조건에서 상기 예시적인 효소의 활성을 유지할 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 특정 용도의 예로서, YvrK, Bce 또는 A8의 제제가 본원에서 설명되지만; 이들 예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 설명된 본 발명이 임의의 효소에 적용될 수 있다는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백하고, 실제 적용은 각각의 비제제화된 효소에 대한 최적 pH보다 더 산성이거나 염기성이라면 비제제화된 효소에 대한 준최적 pH를 나타내는 작용 부위에서 이루어진다.
특정 실시양태에 따르면, 주위 환경의 pH와 상이한 미세 환경 pH가 제공된다. 한 실시양태에서, 이것은 주위 pH와 비교하여 pH의 감소이다. 그의 미세 환경에 대한 산성화 효과를 가지며 효소의 활성을 감소시키지 않는 임의의 화합물을 이 목적을 위해 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 비추어, 상기 효과를 갖는 화합물을 사용하여 보다 낮은 주위 pH로부터 pH를 증가시킴으로써 미세 환경 pH를 조정하는 것은 주위 pH보다 더 높은 pH에서 안정하고 활성을 갖는 효소의 활성을 유지할 것이 명백한 것으로 고려되어야 한다. 본 발명을 더 설명하기 위해, 중성 또는 염기성 주위 환경의 예, 및 산성인 미세 환경 pH가 사용될 것이다.
제제에서 산성화 효과를 나타내는 산성 종은 부가, 생성, 분해, 반응 및/또는 불순물을 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 수단에 의해 제제에 도입될 수 있다. 따라서, 산성 종은 개개의 화합물로서 제제에 첨가될 수 있다. 산성 종은 또한 제제의 일부인 임의의 화합물의 화학 반응 또는 분해의 결과일 수 있다. 또한, 산성 종은 제제의 일부인 개별 화합물을 제조하기 위해 사용된 공정의 결과일 수 있으며, 따라서 원래의 원료의 불순물로 간주될 수 있다. 최종 제제에서 산성화 효과를 야기하는 모든 경우는 본 발명의 부분으로 고려된다. 생성된 분해 산물 또는 전환 또는 반응 생성물은 제제화된 효소를 둘러싼 환경을 산성화하는 공통적인 특성을 갖는 단량체 또는 중합체 구조일 수 있다. 설명된 제제의 산성 종은 미세 환경 내에서 방출, 함유, 농축, 전개, 생성, 용해 및/또는 현탁되고, 따라서 준최적 pH 환경에 놓일 때 효소 기질을 이용할 수 있는, 해당 효소의 활성에 유익한 국소 pH 조건을 생성한다.
제제 화합물의 산성화 효과는 즉각적이거나 시간이 경과함에 따라 발생할 수 있다. 예를 들어, 산성화 화합물이 제제의 원료로부터의 불순물인 경우, 산성화 효과는 제제화시 즉각적일 수 있지만; 산성화 효과가 분해 산물에 기인하는 경우, 효과는 시간이 경과함에 따라 나타날 수 있다. 시간의 길이는 원료의 유형, 환경 및 제제 첨가제를 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 인자에 따라 달라지며, 즉각적인 산성화와 몇 주에서 몇 달 또는 몇 년 후에 알아볼 수 있는 산성화 사이의 모든 시간 길이에 걸칠 수 있다.
산성화 화합물 및 그의 효과는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있지만, 그러한 화합물의 예가 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 제시된다. 미세 환경에 대한 산성화 효과를 갖는 산성화 화합물은 유기산, 무기산, 산성 측쇄 및 산성 관능기를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 제제에 사용될 수 있는 작은 유기산의 예는 L-타르타르산, 시트르산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 말레산, 아디프산, DL-말산, 숙신산, L-아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 산성 측쇄 및 관능기의 예는 몇몇 예를 들면 카르복실기, 페놀기, 암모늄 이온을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
산성 분해 산물을 생성하는 많은 유형의 중합체가 존재한다. 이러한 중합체 및 분해 산물은 미세 환경 pH를 조정하기 위해 효소 제제 실시양태에 포함될 수 있다. 이들 중합체는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 그 예가 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본원에서 제시된다. 산성 분해 산물을 생성하는 중합체의 예는 폴리에스테르, 예를 들어 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(d-락트산)(PLA), 폴리(l-락트산), 폴리(dl-락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(오르토 에스테르), 폴리카프로락톤 및 폴리무수물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 추가의 예는 폴리(비닐 술폰산), 폴리(아크릴산) 및 폴리(프로필렌 푸마레이트)이다.
폴리(오르토 에스테르)의 몇 가지 독특한 유형이 개발되었다. 각각의 설계는 본질적으로 다르며, 특정한 특성을 가지고 있고, 예를 들어 타입 I 폴리(오르토 에스테르)는 적절한 알칸 디올 및 γ-부티로락톤을 형성한다. 락톤은 쉽게 가수분해되어 γ-히드록시부티르산을 형성한다. 산은 미세 환경 pH에 영향을 미치고, 중합체의 추가의 분해를 촉진한다.
생분해성 중합체 폴리무수물은 그의 무수물 연결의 가수분해에 의해 분해된다. 폴리무수물의 예는 아디프산, 푸마르산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 도데칸디오산, 도데칸디카르복실산, 이소프탈산, 테레프탈산, p-카르복시페녹시 아세트산, 5-(p-카르복시페녹시) 발레르산, 8-(p-카르복시페녹시) 옥탄산, 에리크산, 리시놀레산 말레에이트, 리시놀레산 숙시네이트, 12-히드록시스테아르산 숙시네이트, 옥스탄산, 라우르산, 미리스트산, 스테아르산, 올레산, 지방산 에스테르화된 리시놀레산 및/또는 메타크릴화된 세바식산으로 제조된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
설명된 중합체 클래스 및/또는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이미드의 많은 공중합체가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 많은 경우에, 공중합체는 미세 환경의 생성에 유익한 특성을 제공할 수 있다. 이러한 특성은 다음 단락에서 자세히 설명된다. 언급된 공중합체는 예를 들어 락트산 및 글리콜산으로 제조된 것이다. 2개의 주요 계열은 (1) LA/GA 및 (dl) LA/GA의 계열이다. 조성물은 이하에서 추가로 설명되는 바와 같이 상이할 수 있다.
중합체 특성 및 분해율은 중합체의 선택, 블록 중합체 또는 공중합체의 선택, 단량체 및 서로에 대한 단량체 종의 비율의 선택, 단량체 친수성 및 소수성, 단량체 분자량, 중합체 말단기, 단량체 종의 비율 및 일부 경우 중합체의 결정도 비율에 의해 조정될 수 있다([Brunner, Maeder, & Goepferich, 1999], [S. Li, 1999], [Goepferich & Tessmar, 2002]). 따라서, 매우 다양한 특성이 동일한 분자 빌딩 블록 또는 단량체로부터 수득될 수 있으며, 본 발명의 범위는 상이한 단량체의 임의의 특정 조합 또는 비율로 한정되지 않아야 한다.
추가로, 미세 환경 pH의 변경은 상기 설명한 중합체 내의 불순물에 의해서도 달성될 수 있다. 이러한 불순물은 상기 설명한 중합체의 분해 산물이거나 설명된 중합체의 제조로부터 유래한 것일 수 있다. 불순물의 정체는 원래의 재료 및 그의 생산 또는 제조 공정에 따라 결정되지만, 몇 가지의 예를 들면 상기 불순물은 락트산, 글루콘산, 락토일락트산 및 산성 올리고머, 예를 들어 락트산의 올리고머를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
하나 이상의 효소, 하나 이상의 중합체 물질 및 하나 이상의 산성화 화합물 이외에, 입자는 또한 하나 이상의 첨가제, 예를 들어 완충제, 가용화제, 안정화제, 방부제, 비타민, 또는 효소에 대한 보조 인자, 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 예를 들어 충전제, 증량제, 희석제, 담체 등을 함유할 수 있다. 첨가제는 당, 아미노산, 계면활성제, 염 등과 같은 열, 탈수 및 저장으로부터 효소를 보호하는 임의의 분자(들)일 수 있다. 첨가제는 또한 중합체의 분해 속도 및 따라서 산성 환경이 생성되는 속도에 영향을 줌으로써 산성화에 간접적인 영향을 미치는 임의의 분자(들)일 수 있다. 예를 들어, 수화 및 외부 물과의 교환 속도는 일부 중합체의 분해 속도에 영향을 미치고, 따라서 수화 첨가제의 혼입은 예를 들어 시간이 경과함에 따라 분해 속도 및 따라서 산성 환경을 변경할 수 있다. 중합체 분해 및 미세 환경 pH의 후속적인 변화는 또한 자가 촉매성 사슬 절단이 산성 pH에서 가속화됨에 따라 초기 미세 환경 pH에 의해 영향을 받고(Witschi & Doelker, 1998); 따라서, 분해 속도는 푸마르산 및 숙신산과 같은 자유 유기산을 혼입함으로써 조정될 수 있다. 이러한 산의 보유는 예를 들어 그의 용해도를 고려하여 조정할 수 있다. 분해 과정을 가속화할 수 있는 이들 첨가제는 분해 촉진제로 불리고, 제제의 제어된 분해를 달성하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 중합체 내에 혼입된 효소 그 자체도 중합체의 분해 속도에 영향을 미칠 수 있다. 이는 2% 소 혈청 알부민을 혼입하여 제제 성분의 분해 속도가 가속화된 결과를 통해 입증되었다.
산성화 화합물, 중합체 및 첨가제는 효소(들)로 둘러싸이고 중합체 네트워크에 의해 포함될 수 있다. 이 중합체 네트워크는 산성화 화합물로 분해되는 동일한 중합체로 또는 별개의 중합체로 제조될 수 있다. 이러한 중합체는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는 합성 또는 천연 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않는다: i) 다당류: 알긴산을 포함하는 알기네이트, 예컨대 알긴산나트륨, 알긴산칼륨, 알긴산암모늄, 알긴산칼슘, 프로판-1,2-디올 알기네이트, 아카시아, 카라기난, 키토산 및 그의 유도체, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란 유도체, 헤파린, 히알루론산, 펙틴, 이눌린, 셀룰로스 또는 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 에틸메틸셀룰로스 등을 포함하는 셀룰로스 유도체 등 또는 이들의 조합물; ii) 점액 다당류, iii) 로커스트 빈 검, 구아 검, 트라가칸트, 아가, 아카시아 검, 크산탄 검, 카라야 검, 타라 검, 젤란 검 등 또는 이들의 조합을 포함하는 검; iv) 히드로콜로이드 및 히드로겔화제, 예컨대 아가, 카라기난, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등 또는 이들의 조합을 포함하는 겔화 또는 팽윤제; v) 예를 들어 단백질 및 폴리아미드와 같은 기타 물질: 콜라겐, 알부민, 프로타민, 스페르민, 및 다음을 포함하는 합성 고분자: 폴리(아크릴산), 폴리인산, 트리폴리포스페이트, 폴리(L-락트산), 폴리(DL-락트산), 폴리(D-락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(비닐 알콜), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(오르토 에스테르), 폴리카프로락톤, 폴리(프로필렌 푸마레이트), 폴리무수물, 폴리(비닐 술폰산), 폴리에틸렌 글리콜 등, 또는 이들의 조합물; 및 L-100, L-100-55, RS, RL, 또는 이들의 공중합체 또는 혼합물 및 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는 유드라기트(Eudragit) 중합체.
제제에 첨가되거나 제제화된 효소(들) 및 동반 화합물을 둘러싸기 위해 사용될 수 있는 다른 중합체 물질은 생체중합체 또는 합성 중합체일 수 있다. 생체중합체의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 단백질, 다당류, 점액 다당류, 헤파린, 헤파린 술페이트, 헤파리노이드, 데르마탄 술페이트, 펜토산 폴리술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 셀룰로스, 아가로스, 키틴, 카라기닌, 리놀레산 및 알란토인, 가교결합된 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 가교결합된 엘라스틴, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 키토산 알기네이트, 덱스트란, 메틸셀룰로스, 폴리라이신 및 천연 고무.
중합체 매트릭스가 형성되는 본 발명의 제제에서, 이들 매트릭스는 작은 수용성 분자가 중합체 매트릭스에 들어오고 나갈 수 있도록 설계되고, 상기 분자는 옥살레이트, 옥살산, 포르메이트, 포름산, 이산화탄소, 산소 및 효소 보조 인자를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이러한 매트릭스는 입자, 시트, 블록 또는 필름을 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 형태를 취할 수 있다.
또한, 본 발명의 중합체 매트릭스는 효소를 환경으로 실질적으로 방출하지 않는다. 즉, 효소는 환경 내의 충분한 양의 기질이 분해되어 그의 수준이 감소될 수 있도록 충분한 시간 동안 최적의 미세 환경 내에 유지된다.
중합체 매트릭스 내에서, 중합체 물질(들)은 효소에 대한 보호 및 유지용 담체로서 산성화 종의 생성제로서 기능할 수 있고, 이와 동시에 계내 분해가 가능하도록 기질을 조성물 내로 확산되거나 달리 수송되도록 할 수 있다. 모든 기능이 동일한 중합체에 기인할 필요는 없지만, 상이한 중합체를 함유하는 입자의 집합적인 특성일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 생분해성 성분을 사용하며, 생성된 분해 산물은 생물학적 조직 또는 유체에 대한 자극 또는 손상을 일으키지 않고; 따라서, 예를 들어 인간 또는 동물과 같은 생물학적 시스템 내에 안전하게 적용할 수 있다. 또한, 본 발명은 제제화된 pH 민감성 효소의 유익한 효과를 향상시키기 위해 표적 용도 또는 전달 부위와의 높은 상용성을 보장하는 제제의 설계를 고려한다. 예를 들어, 위장관에서의 전달이 예정된 미세 입자는 또한 점막 점착성 특성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 이들은 점막 점착성을 갖지만, 흡수되지는 않을 것이다. 이러한 최종 입자는 마이크로미터 규모이고, 따라서 흡수되기 어려울 것이다. 점막 점착성은 양이온 전하를 갖는 중합체 또는 부착된 아미노기를 갖는 공중합체로 코팅함으로써 얻어지고(Bivas-Benita, Romeijn, Junginger, & Borchard, 2004), 후자는 또한 비정상적으로 짧은 분해 시간을 다시 보여 주었으며, 이것은 독창적인 중합체 합성에 의해 분해 특성, 및 따라서 미세 환경의 산성화 속도를 변경할 기회를 다시 제시하였다. 동일한 방식으로, 정맥 전달을 위한 미세 또는 나노 입자는 임의의 면역 반응을 감소시키도록 설계될 수 있다. 이러한 설계는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 입자의 PEG화를 수반할 수 있다.
입자 형성:
본 발명의 다른 방법은 미세 입자 또는 나노 입자를 생성함으로써 각각의 효소(들)를 제제화하는 방법에 관한 것이다. 입자 형성(사용된 입자 및 특정 중합체 또는 공중합체를 제조하기 위한 특정 방법의 사용과 조합하여)은 효소(들)를 보호할 뿐만 아니라, 제제화된 효소(들)의 지속적인 pH 비민감성 활성을 위해 적합한 pH의 국소 미세 환경을 생성하는 것으로 고려된다. 상기 설명한 바와 같은 효소(들), 중합체 물질, 산성화 종 및 다른 첨가제의 입자 형성이 본 발명에 의해 고려된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 입자 형성은 중합체 또는 공중합체 용액, 및 활성 효소, 중합체 또는 공중합체, 산성화제, 안정화제, 비타민 및 상기한 바와 같은 다른 첨가제를 포함하는 작은 입자를 형성하기 위해, 효소(들)와 적합한 국소 pH를 보장하고 필요에 따라 단백질을 안정화하는 다른 물질의 회합을 의미한다. 이러한 활성 효소 입자의 형성 방법은 입자 내의 활성 효소의 양을 증가시키고, 질환 치료 또는 예방 요법에 사용될 때 입자를 함유하는 투여 형태의 효능을 증가시킬 수 있다. 입자 형성은 또한 프로테아제 소화로부터 효소를 보호하는 것을 도울 수 있다.
액적 형성(coacervation), 상 분리, 중합, 분무 건조, 정전기적 방법 및 공기 현탁 방법과 같은, 입자 형성에 대한 많은 방법이 있다. 분무 건조는 1930년대에 개발된 기계적 미세캡슐화 방법이며, 본 발명의 활성 효소 입자 구현에 적합한 방법 중 하나이다. 이러한 방법에서, 효소(들), 중합체(들), 산성화 종 및 첨가제는 수성 매질, 용매 매질 또는 에멀젼에 분산되거나 용해되고, 노즐을 통해 적합한 분무 건조 장치에 적재된다. 또한, 효소(들)의 활성이 심각하게 감소되지 않는다면(최대 활성에 비해 적어도 20%의 활성을 유지한다면) 다른 방법도 관련될 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 중합체 물질 내에 효소(들), 산성화 화합물 및 첨가제를 조합하는 것을 포함하는 조성물이 제조된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 조성물의 제제화 및 조성물의 제조에 사용하기 적합한 다른 방법을 발견할 수 있다. 효소를 중합체 물질에 혼입함으로써, 효소는 특정 보호를 얻고, 상기 설명된 산성화 화합물에 의해 크게 영향을 받는 국소 pH 환경에 고립된다. 생성된 제제화된 효소 조성물은 미세 또는 나노 크기의 개별 단위로 나타난다. 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 미세 또는 나노 크기의 개별 단위는 단순히 "입자"로 지칭될 것이지만; 많은 상이한 형상, 형태, 디자인 및 구조가 pH 민감성 효소에 적합한 미세 환경을 제공하는 것이 명백할 수 있고, 따라서 본원에서 고려된다.
입자는 공지된 방법, 바람직하게는 분무 건조에 의해 형성될 수 있다. 하나 이상의 효소, 하나 이상의 중합체 물질, 및 하나 이상의 산성화제 또는 산성화 중합체, 및 하나 이상의 첨가제를 포함하는 입자를 형성한 후에, 입자는 예를 들어 건조, 동결 건조(freeze-drying) 또는 동결건조(lyophilization)에 의해 추가로 처리될 수 있다. 동결 건조는 입자 형성을 일으키지 않지만, 효소 및 중합체 물질을 포함하는 이미 형성된 입자를 건조할 수 있다. 이러한 입자는 현탁액, 분산액 또는 에멀젼의 상태일 수 있으며, 그런 다음 동결 건조 조건에 적용된다. 동결 건조는 효소의 가열을 피하고, 건조 과정을 열에 민감한 단백질에 적합하게 만든다. 동결 건조 또는 다른 방법(예를 들어, 코팅)은 생략할 수 있으며, 언급된 입자를 형성하기 위해 분무 건조만을 사용할 수 있다. 이어서, 상기 입자는 예를 들어 증량제와 혼합하고, 예를 들어 사셰(sachet)에 넣거나, 캡슐에 입자를 첨가하거나, 입자를 정제로 압축하거나, 입자를 씹을 수 있는 정제에 혼입하거나, 입자를 신속한 용해 또는 구강 용해 정제에 혼입하거나, 액체, 시럽, 엘릭시르 또는 식(료)품에 입자를 첨가함으로써 경구 제약 또는 식품 제제로 제제화될 수 있다.
입자 형태 및 크기는 수화, 산 보유, 입자 내로의 기질 이동 및 점막 점착성에 큰 영향을 미칠 것이고, 따라서 분무 건조 파라미터, 예컨대 분무 공기 흐름, 공급 속도, 용매 및 농도로 인해 생성되는 형태는 제제화된 효소의 최종 pH-활성 프로파일에 큰 영향을 미칠 것이다. 다른 파라미터, 예컨대 분무 건조 공급 점도, 밀도, 표면 장력 및 분무화(atomization) 조건은 액적 크기 및 따라서 최종 입자 크기에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 공급물 특성뿐만 아니라 분무 건조 공정 파라미터의 복잡한 조합은 제제화된 효소의 최종 pH-활성 프로파일에 영향을 미칠 것이고, 제제화된 효소의 pH-활성 프로파일을 변경하기 위해 제조 공정을 변경하는 것이 분명한 것으로 간주되어야 한다.
상기 설명된 방법 중 일부에서는 활성을 손상시키는 시약, 용매, 온도, 장치 등에 대한 노출에 의해 효소 활성 감소의 위험이 발생할 수 있다. 손상 조건에 의한 효과는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 단백질 안정화 화합물을 혼입함으로써 감소될 수 있다.
일부 경우, 입자의 보관 안정성을 증가시키거나 효소의 분해를 억제하기 위해 중합체 물질이 입자에 적용될 수 있다(예를 들어, 코팅으로서). 적절한 코팅 물질은 기질 및/또는 반응 생성물을 함유하는 수성 조성물이 본 발명의 입자 내로 확산되거나 다른 방식으로 도입되고, 입자 밖으로 배출되도록 하는 물질이다. 상기한 바와 같이, 기질은 효소 분해가 발생할 수 있도록 본 발명의 입자 조성물에 도입된다. 따라서, 확산 코팅 또는 다른 투과성 코팅(예를 들어, 실질적으로 수용성인 세공 형성 물질을 함유하는 코팅)을 생성하는 코팅 물질을 적용할 수 있다. 적합한 코팅 물질의 예는 중합체 물질로서 고려되는 물질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 중합체 물질로서 사용된 것과 상이한 코팅 물질이 선택될 수 있지만, 중합체 물질 및 코팅 물질은 동일할 수도 있다. 코팅 물질의 구체적인 예는 필름 형성제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 폴리덱스트로스, 말토덱스트린, 또는 키토산, 알기네이트 및 히알루론산을 포함하는 다른 다당류이다.
상기 설명된 입자는 옥살레이트 감소 효소, 중합체, 산성화 화합물 및 첨가제를 함유하는 것에 추가로, 다른 입자를 또한 함유할 수 있다. 이러한 내재화된 입자는 다른 효소, 중합체, 산성화 종 및/또는 첨가제를 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에서 설명되는 성분들의 몇몇 층의 실체를 고려한다.
실시양태는 활성 형태의 효소를 특정 환경으로 전달하기 위해 제약 또는 다른 조성물에 최종 비코팅 또는 코팅된 입자의 사용을 포함할 수 있다. 상기 환경은 생물학적, 환경적, 산업적 및/또는 화학적 환경일 수 있다. 특히, 한 예로서, 이 방법은 비. 섭틸리스, 비. 세레우스 또는 에이. 아에게리타로부터의 OxDC의 입자를 분무 건조하거나 다른 방법으로 제조하기 위해 사용될 수 있고, 이들 입자는 이어서 인간 또는 동물의 위, 장 또는 혈관 시스템에서 옥살레이트를 분해하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 제제화된 단백질 또는 이를 포함하는 제약 조성물의 투여에 의해 옥살레이트 관련 질환 상태를 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.
조성물:
특정 실시양태에 따르면, 상기 설명된 입자를 포함하는 조성물이 개시된다. 입자는 하나 이상의 촉매 효율이 높은 옥살레이트 감소 효소(들), 하나 이상의 중합체 물질(들), 산성화 종 및/또는 첨가제를 포함한다. 상기 조성물은 또한 다른 효소, 중합체, 산성화 종 및/또는 첨가제를 포함하는 다른 입자를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 효소 활성을 개선할 수 있는 하나 이상의 추가 인자를 포함할 수 있다. 이러한 추가의 요소는 예를 들어 옥살릴 CoA, MgCl2, 및/또는 티아민 디포스페이트(비타민 B1의 활성 형태), 기타 비타민, 또는 pH 완충 화합물일 수 있다.
조성물 실시양태는 상기 설명된 바와 같은 한 유형의 입자 또는 상이한 유형 및 함량의 입자를 함유할 수 있다. 조성물의 입자(들)는 개별적으로 또는 함께 경구 또는 정맥 내 투여 형태로 제공될 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 활성의 제제화된 촉매 효율이 높은 pH 민감성 효소가 조성물 중에 제공되고, 유효량으로 투여된다. 유효량은 유익한 임상 결과를 나타내기 위해 옥살레이트 수준을 유의하게 감소시키는 양을 포함한다. 유효량은 조성물의 투여 전에 존재하는 옥살레이트의 양에 비해, 존재하는 옥살레이트의 일부를 감소시키는 옥살레이트 감소 효소 활성의 활성 단위의 양 또는 옥살레이트의 양의 감소를 개시하거나 개체에서 감소된 양의 옥살레이트를 유지하는 옥살레이트 감소 효소 활성의 활성 단위의 수준을 포함한다. 단일 투여 조성물에 사용될 수 있는 옥살레이트 감소 효소 활성의 활성 단위의 수는 일반적으로 약 0.001 단위 내지 약 20,000 단위, 및 이 안에 포함되는 모든 범위이다. 효소의 단위는 37℃에서 분당 1 마이크로몰의 옥살레이트를 분해하는 효소의 양으로 정의된다.
상기 설명된 입자를 인간 또는 동물에게 전달하기 위해, 입자를 투여하기 위한 적합한 투여 형태로 제제화할 수 있다. 투여 형태는 투여 경로에 의해 결정된다. 예를 들어 효소 OxDC의 경우, 적합한 투여 경로는 표적 질환 상태에 따라 경구 또는 정맥 내 투여이고, 이 두 유형의 조성물은 본원에서 설명될 것이다.
조성물은 구강, 입에, 협측 패치(buccal patch)로, 위에 전달되거나, 또는 사셰, 캡슐, 정제, 씹을 수 있는 정제, 신속 용해 정제, 경구 용해 정제, 분말, 과립, 펠렛, 액체, 시럽, 엘릭시르, 서방성 액체, 속방성 정제 또는 제약 및 식품 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 경구 투여 제제를 사용하여 위 점막에 부착될 수 있는, 의약, 기능 식품, 특수 식이 사용 또는 의료용 식품 제제를 위한 식품으로서 제공된다. 조성물은 식품과 함께, 식품 섭취 전 또는 식품 섭취 직후에 전달될 수 있다.
경구 제제는 선택적으로 완충 능력을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 일단 조성물이 섭취되면 조성물의 pH 및 따라서 주위 환경, 예컨대 위를 조절하는 완충 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 완충 화합물은 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 완충 화합물일 수 있다.
투여되는 조성물은 일반적으로 고체 형태, 예를 들어 분말 형태 또는 고체 투여 형태, 예를 들어 사셰, 캡슐 또는 정제 형태일 수 있다(예를 들어, 입자는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 의해 적합한 투여 형태로 추가로 처리된다). 이를 위해, 예를 들어 충전제, 결합제, 붕해제, 착색제, 향미제, pH 조절제, 안정화제 등과 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 첨가할 수 있다. 또한, 하나 이상의 추가의 치료 및/또는 예방 물질 및/또는 다른 효소, 보조 인자, 비타민, 기질, 조효소, 미네랄 및 옥살레이트의 감소에 도움이 되는 다른 작용제를 을 첨가할 수 있다.
적합한 제약상 허용되는 부형제의 예는 다음을 포함한다: 덱스트린, 말토덱스트린, 덱스트로스, 프럭토스, 글루코스, 락토스, 카르복시메틸셀룰로스 칼슘, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 미세결정 셀룰로스(예를 들어, 다양한 등급의 아비셀(Avicel))를 포함하는 셀룰로스 유도체, 전분 또는 변형된 전분(예를 들어, 감자 전분, 옥수수 전분, 쌀 녹말, 알파화(pre-gelatinised) 전분), 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 아가, 알긴산나트륨, 크로스카르멜로스 나트륨, 인산수소칼슘, 인산칼슘(예를 들어, 염기성 인산칼슘, 인산수소칼슘), 황산칼슘, 카르복시알킬셀룰로스, 덱스트레이트, 이염기성 인산칼슘, 젤라틴, 아라비아 검(gummi arabicum), 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥시드, 및 윤활제로서 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아르산, 수소화 식물성 오일 등.
다른 효소, 중합체, 보조 인자, 비타민, 조효소, 산성화 종 또는 첨가제를 포함하는 입자를 포함하는 조성물은 옥살레이트 감소 효소를 포함하는 입자의 조성물의 투여와 동시에, 순차적으로 또는 전 또는 후에 투여될 수 있다. 다른 효소, 보조 인자, 조효소, 산성화 종 또는 첨가제를 포함하는 입자를 함유하는 조성물은 작용 부위에 유효량의 옥살레이트 감소를 제공하기 위한 단일 투여 용량을 형성하는 옥살레이트 감소 효소를 포함하는 입자를 포함하는 조성물과 조합될 수 있다.
상기 설명된 구강 조성물은 식품 섭취 후 또는 프로테아제 존재 하에 발견되는 것과 같은 조건에서, GI관 전체에 걸쳐서 가용성 옥살레이트의 양을 감소시킨다. 본 발명의 특정 조성물은 인간 및 다른 동물의 GI관에서 옥살레이트를 감소시키도록 설계된다. 조성물은 옥살레이트, 예를 들어 GI관, 특히 장 내의 옥살레이트를 감소시키고, 외인성 옥살레이트(예를 들어, 식품으로부터의)가 전신 순환계에 들어가는 것을 방지할 뿐만 아니라, 옥살레이트의 혈액으로부터 장 내로의 분비를 유도하여 GI관뿐만 아니라 전신에서 옥살레이트를 감소시키기 위해 적합한 상피 통과 구배(trans-epithelial gradient)를 생성한다.
특정 실시양태에 따르면, 인간 또는 동물의 옥살레이트 수준을 감소시키는데 사용하기 적합한 조성물이 제공된다. 이들은 또한 고옥살산뇨증, 흡수성 고옥살산뇨증, 장 고옥살산뇨증, 원발성 고옥살산뇨증, 특발성 옥살산칼슘 신장 결석 질환(요로결석증), 외음부동통, 말기 신장 질환과 관련된 옥살산증, 심전도 장애, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 및 위장 수술, 배리아트릭 수술(비만 수술)을 받고/받거나 항생제 치료를 받은 환자를 포함하고 이로 제한되지 않는 옥살레이트 관련 병태를 치료하거나 예방하는데 적합할 수 있다. 본 발명의 실시양태는 본원에서 교시된 조성물의 치료 유효량 또는 예방 유효량을 각각 투여함으로써 인간 및 동물에서 옥살레이트 관련 병태를 치료하고 예방하는 것을 고려한다. 치료 유효량은 옥살레이트 관련 병태로 진단된 대상체에서 옥살레이트를 감소시키는 양이다. 예방 유효량은 옥살레이트 관련 병태의 위험이 있거나, 예비 증상을 보이거나, 이전에 옥살레이트 관련 병태로 고통받은 대상체에게 제공되는 양이다.
본 발명의 옥살레이트 분해 입자 또는 조성물 실시양태는 유익한 임상 효과를 갖는 것으로 밝혀진 정도로 신체 조직 또는 유체에서 옥살레이트 수준을 효과적으로 감소시키기에 충분한 양과 같은 원하는 양으로 투여될 수 있다. 옥살레이트 흡수의 감소는 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변, 또는 다른 체액, 조직 및 장기에서 발견되는 옥살레이트 수준의 감소로 제시될 수 있다.
입자 및 조성물의 용도 - 치료 방법:
추가의 실시양태에 따르면, 인간 또는 동물의 장에 입자 조성물을 제공하는 단계, 예를 들어 위장관으로부터 옥살레이트의 흡수를 감소시키고 혈액으로부터 장 내로의 옥살레이트의 분비에 유리한 적합한 상피 통과 구배를 생성하기 위해 위 내의 옥살레이트를 감소시킬 수 있는 조성물을 제공하는 단계를 수반하는 방법이 개시된다. 입자의 제제 및 조성물은 옥살레이트 감소 효소를 위의 효소 손상 환경으로부터 추가로 보호할 수 있다.
다른 실시양태에서, 식품 가공 동안 식품 및 음료에 하나 이상의 OxDC 효소를 첨가하여 식품 유래 옥살레이트를 낮추거나 제거함으로써 뇨중 옥살레이트의 감소를 가능하게 하는 방법이 제공된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 방법은 식품 또는 음료를, 식품 또는 음료 내의 옥살레이트 존재를 감소시키기에 충분한 조건 하에서 및 충분한 양으로 본원에서 교시되는 옥살레이트 감소 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 입자 및 조성물은 체내에서 옥살레이트 흡수를 감소시키는 방법뿐만 아니라 체내에서 내인성으로 생성된 옥살레이트 수준을 감소시키는 방법에 적합하고, 고옥살산뇨증, 흡수성 고옥살산뇨증, 장 고옥살산뇨증, 원발성 고옥살산뇨증, 특발성 옥살산칼슘 신장 결석 질환(요로결석증), 외음부동통, 말기 신장 질환과 관련된 옥살산증, 심전도 장애, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 및 위장 수술 및 배리아트릭 수술(비만 수술)을 받고/받거나 항생제 치료를 받은 환자를 포함하고 이로 제한되지 않는 옥살레이트 관련 병태의 치료 또는 예방에 사용된다.
특정 실시양태에 따르면, 예를 들어 식품 공급원으로부터 옥살레이트를 감소시킴으로써 인간 또는 동물의 신체에 의한 옥살레이트의 흡수를 피하기 위해, 식품, 위 및/또는 장에서 옥살레이트를 감소시키는 것을 가능하게 하는 조성물을 투여하는 단계를 수반하는 방법이 제공된다. 장에 활성 옥살레이트 감소 효소를 제공하는 방법은 경구 제약 제제에서 효소에 적합한 미세 환경 pH를 유지할 수 있는 중합체 물질 내의 옥살레이트 감소 효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 특정 방법은 생물학적 조직, 장기 및 체액에서 통상적으로 발견되는 pH에서 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소에 의한 옥살레이트의 분해를 가능하게 하는 조성물의 실시양태를 투여하는 것을 포함한다. 특정 방법의 실시양태는 혈액, 및 혈액으로부터 유래하는 다른 유체, 예컨대 혈장, 혈청 및 소변에서 옥살레이트 수준을 감소시키기 위해 혈액 내의 옥살레이트 감소를 가능하게 하는 조성물을 투여하는 것을 수반한다.
옥살레이트 흡수 감소는 옥살산 분해 효소를 GI관 또는 혈류에 제공하여 내인성으로 생성된 옥살레이트뿐만 아니라 흡수를 위한 이용 가능한 식이 옥살레이트의 농도를 낮춤으로써 달성될 수 있다. 흡수 경로 이외에, 옥살레이트 분비 경로가 인간 GI관에서 확인되었다. 조성물의 실시양태는 또한 순환계로부터 장 내로 분비되는 옥살레이트를 분해하는데 유용할 것이며, 따라서 개체의 옥살레이트 부하의 전반적인 감소를 고려한다.
옥살레이트 흡수의 감소는 식품 가공 동안 옥살레이트 분해 효소를 제공하여 흡수를 위해 이용 가능한 식이 옥살레이트의 농도를 낮춤으로써 달성될 수 있다.
인간 또는 동물에서 옥살레이트를 감소시키는 방법은 본 발명의 입자 조성물에 하나 이상의 옥살레이트 감소 효소 또는 옥살레이트 감소 활성을 갖는 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체, 인간 또는 동물에게 투여하는 단계, 국소적으로 또는 전신적으로 존재하는 옥살레이트를 감소시키는 단계를 수반할 수 있다. 감소는 대상체의 임의의 조직 또는 체액 환경에서 측정될 수 있다. 체액에는 비강 또는 위 분비물, 타액, 혈액, 혈청, 소변, 유미즙(chyme) 또는 소화 물질, 조직액, 및 인간 또는 동물이 만든 기타 유체 또는 반고체 물질과 같은 신체 분비물이 포함된다. 예를 들어, 옥살레이트 감소 효소 입자 조성물은 인간 또는 동물에게 경구 투여될 수 있고, 옥살레이트 감소 효소 활성은 인간 또는 동물의 장에 존재하는 옥살레이트를 감소시킨다. 본 발명의 입자 조성물은 액체, 식품 또는 다른 식이 물질에서 혼합되고, 본 발명의 국소 미세 환경 pH에서 유지될 때, 입자의 옥살레이트 감소 효소 활성이 장 환경에서 효과적이도록 인간 또는 동물에게 제공된다. 또한, 본 발명의 입자 조성물은 옥살레이트가 발견되고 입자의 옥살레이트 감소 효소 활성이 식(료)품 또는 다른 물질에 존재하는 옥살레이트를 감소시키는 식(료)품 또는 다른 물질과 혼합될 수 있다.
인간 또는 동물에 의한 옥살레이트 흡수를 감소시키고 옥살레이트 관련 병태를 치료 및 예방하기 위한 다른 방법은 유효량의 활성 옥살레이트 감소 효소를 포함하는 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 유효량은 조성물의 투여 전에 존재하는 옥살레이트의 양에 비해, 존재하는 옥살레이트의 일부를 감소시키는 옥살레이트 감소 효소 활성의 활성 단위의 양, 또는 식사에 존재하는 또는 대상체의 조직 체액에 존재하는 옥살레이트 양의 감소를 개시하거나, 대상체에서 감소된 양의 옥살레이트를 유지하는 옥살레이트 감소 효소 활성의 활성 단위의 수준을 포함한다.
치료 방법에서, 본원에서 교시된 바와 같은 유효량의 입자 조성물은 1일 1회 이상, 또는 필요하다면 더 많이 대상체에게 경구 또는 정맥 내 투여되고, 이러한 투여는 1일 또는 수일 또는 1주일 또는 한 달 또는 수년 동안 또는 환자의 생애에 걸쳐 계속해서 이루어질 수 있다. 이러한 치료는 대상체에서 원하는 옥살레이트 수준을 유지하기 위해 계속될 수 있다.
본원에 포함된 모든 특허, 특허 출원 및 참고문헌은 그 전체가 참고로 구체적으로 포함된다. 물론, 상기 내용은 단지 본 발명의 예시적인 실시양태에 관한 것이며, 본 개시내용에서 제시된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 많은 변경 또는 변경이 가능함을 이해하여야 한다.
본 발명의 예시적인 실시양태가 본원에서 제공되지만, 본 발명은 이들 실시양태로 한정되지 않는다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 제안할 수 있는 많은 변형 또는 변경이 있다. 본 발명의 바람직한 적용의 한 예로서, YvrK, Bce, A8 또는 Cb6301의 제제가 본원에서 설명되지만; 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
본 발명은 이해를 명확하게 하기 위해 본원에 포함된 실시예에 의해 추가로 설명된다. 예시적인 실시양태는 본 발명의 범위에 대한 제한을 설정하는 것으로서 어떠한 방식으로도 해석되지 않아야 한다. 반대로, 본원의 설명을 읽은 후에, 본 발명의 사상 및/또는 첨부된 청구항의 범위를 벗어나지 않으면서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 제안할 수 있는 다양한 다른 실시양태, 변형 및 그의 균등물에 대한 변경이 이루어질 수 있음이 명확하게 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1:
활성 시험:
효소의 옥살레이트 분해 활성을 결정하기 위해 기질 제거(옥살레이트) 및 생성물 형성(포르메이트)을 모니터링한다. 활성 시험은 10 mM 옥살레이트 이온(C2O4 2 -)을 함유하는 완충 용액 내의 pH 3 또는 pH 4의 50 mM 시트레이트 또는 포스페이트 완충 용액에서 수행된다. 효소의 pH 활성 프로파일을 결정하기 위해, 시트레이트 및 포스페이트 완충제 (50 mM)의 조합을 사용하여 pH 1.5 내지 8.0에서 활성을 결정하였다. 시험 샘플을 미리 가열된 반응 완충제에 첨가하고, 37℃에서 1100 rpm으로 진탕하면서 일정한 시간(t) 동안 인큐베이팅한다. 반응 혼합물에 대한 산의 비율 10%로, 2.5 N H2SO4를 사용하여 반응물을 시간 t±5초에서 급랭한다. 급냉된 반응 혼합물을 여과하고, 등용매(isocratic) 이온 배제 HPLC 방법을 사용하여 포르메이트 농도를 분석한다. 특이적 활성은 1분당 단백질 1 mg당 분해된 옥살레이트 μmol로서 정의된다.
HPLC 방법:
급냉된 반응 혼합물을 여과하고, 페노메넥스(Phenomenex)의 레젝스(Rezex)™ ROA-오개닉 애시드(Organic Acid) H+(8%), LC 컬럼(300 x 7.8 mm)이 구비된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템에서 분석한다. 주입 부피는 40 ㎕이고, 이동상은 5 mM H2S04(등용매)이고, 유속은 0.6 mL/분, 컬럼 온도는 40℃이다. 표준 곡선을 작성하기 위해, 모든 배치 동안 옥살산 및 포름산의 표준물질을 분석한다. 각각의 주입 사이의 실행 시간은 20분이고, 옥살산 및 포름산은 각각 약 8분 및 16분에 용리되고, 210 nm 파장에서 검출된다.
실시예 2:
OxDC 효소의 아미노산 서열
서열 번호 1
옥살레이트 데카르복실라제 [ 바실루스 세레우스, Bce ]
Figure pct00002
서열 번호 2
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 ( Synechococcus elongates), Cb6301 ] 전장 천연 서열 12 (진하게 강조 표시된 서열은 잠재적인 신호 서열이다)
Figure pct00003
서열 번호 3
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] -D29 서열 13 (-D29 서열은 서열 번호 2의 아미노산 2-30(메티오닌 다음의 처음 29개)의 잠재 신호 서열을 제외하고 서열 번호 2와 동일하다)
Figure pct00004
서열 번호 4
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] -D10 서열 14 (-D10 서열은 아미노산 2-11 (메티오닌 다음의 처음 10개)을 제외하고 서열 번호 2와 동일하다)
Figure pct00005
서열 번호 5
옥살레이트 데카르복실라제 [ 바실루스 세레우스, Bce ][ 시네코코쿠스 에롱가테 스, Cb6301 ] - 융합 서열 15 (융합 서열은 천연 Cb6301(서열 번호 3)에 신호-말단 서열(서열 번호 1 참조)을 부가한다)
Figure pct00006
서열 번호 6
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] -D20 서열 16 (-D20 서열은 아미노산 2-21(메티오닌 다음의 처음 20개)을 제외하고 서열 번호 2와 동일하다)
Figure pct00007
서열 번호 7
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 6 C5N 17 (돌연변이는 규약에 따라 표시된다: 아미노산 제거, 메티오닌(아미노산 번호 1의 메티오닌)으로부터의 위치, 아미노산 부가)
Figure pct00008
서열 번호 8
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 6 C5S 17
Figure pct00009
서열 번호 9
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 6 C5A 17
Figure pct00010
서열 번호 10
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] "루프 돌연변이" 서열 번호 2 G167N, A168S, S171Q, I172L 17
Figure pct00011
서열 번호 11
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340E 17
Figure pct00012
서열 번호 12
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340E, G167N, A168S, S171Q, I172L 17
Figure pct00013
서열 번호 13
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340A
Figure pct00014
서열 번호 14
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340C 17
Figure pct00015
서열 번호 15
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340D 17
Figure pct00016
서열 번호 16
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340E 17
Figure pct00017
서열 번호 17
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340F 17
Figure pct00018
서열 번호 18
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340G 17
Figure pct00019
서열 번호 19
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340H 17
Figure pct00020
서열 번호 20
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340K 17
Figure pct00021
서열 번호 21
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340L 17
Figure pct00022
서열 번호 22
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340M 17
Figure pct00023
서열 번호 23
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340N 17
Figure pct00024
서열 번호 24
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340P 17
Figure pct00025
서열 번호 25
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340Q 17
Figure pct00026
서열 번호 26
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340R 17
Figure pct00027
서열 번호 27
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340S 17
Figure pct00028
서열 번호 28
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340T 17
Figure pct00029
서열 번호 29
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340V 17
Figure pct00030
서열 번호 30
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340W 17
Figure pct00031
서열 번호 31
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 I340Y 17
Figure pct00032
서열 번호 32
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 V291Y 17
Figure pct00033
서열 번호 33
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 L312Y 17
Figure pct00034
서열 번호 34
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 V338F 17
Figure pct00035
서열 번호 35
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 V291Y, L312Y 17
Figure pct00036
서열 번호 36
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 V291Y, V338F 17
Figure pct00037
서열 번호 37
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 L312Y, V338F 17
Figure pct00038
서열 번호 38
옥살레이트 데카르복실라제 [ 시네코코쿠스 에롱가테스 , Cb6301 ] 서열 번호 2 V291Y, L312Y, V338F 17
Figure pct00039
서열 번호 39
옥살레이트 데카르복실라제 [시네코코쿠스 에롱가테스, Cb6301] 서열 번호 2 E194K, V291Y, L312Y, V338F17
Figure pct00040
서열 번호 40
옥살레이트 데카르복실라제 [시네코코쿠스 에롱가투스] "6803"
Figure pct00041
서열 번호 40
옥살레이트 데카르복실라제 [시네코코쿠스 에롱가투스] "6312"
Figure pct00042
서열 번호 41
옥살레이트 데카르복실라제 [ 바실루스 클라우시이 ] " Bcl "
Figure pct00043
서열 번호 42
옥살레이트 데카르복실라제 [ 아그로시베 아에게리타 ] "A0" / "A8"
Figure pct00044
서열 번호 43
옥살레이트 데카르복실라제 [ 아그로시베 아에게리타 ] "A0" / "A8 D-18"
Figure pct00045
서열 번호 44
옥살레이트 데카르복실라제 [ 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 ] " Bam "
Figure pct00046
서열 번호 45
옥살레이트 데카르복실라제 [ 바실루스 푸밀루스 ] " Bpu "
Figure pct00047
서열 번호 46
옥살레이트 데카르복실라제 [클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum )]
Figure pct00048
서열 번호 47
옥살레이트 데카르복실라제 [바실루스 섭틸리스, YvrK]
Figure pct00049
OxDC는 서브유닛당 2개의 활성 부위를 갖고, Cb6301의 전장 서열에서 활성을 위해 중요한 잔기는 다음과 같다:
97- HWHXXXXE - 104　 　 　 　 　 　H -143
280- HWHXXXXE - 287 H -326
변이체의 활성을 보존하기 위해, 진하게 강조 표시된 잔기는 100% 보존되어야 한다. 효소의 다른 영역은 변형된 효소가 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%의 천연 아미노산 서열을 보유하는 한, 유사한 유형의 아미노산으로 아미노산을 치환하도록, 또는 상기 설명된 바와 같이 효소의 특성에 영향을 줄 수 있는 영역을 변형하도록 변형될 수 있다.
실시예 3:
효소의 발현, 발효 및 추출:
OxDC-A0은 아그로시베 아에게리타("A0")의 발효에 의해 생산되었고, pH를 3.0으로 낮추고 MnCl2를 최종 농도 5 mM로 첨가함으로써 유도되었다. OxDC 단백질의 대부분은 원심분리에 의해 수거된 진균 세포 내에 존재하였다. 펠렛을 pH 3의 50 mM 포스페이트 완충제 내에 재현탁하고 균질화한 후, 혼합물을 시험에 사용하였다.
OxDC-A8은 아그로시베 아에게리타("A8")의 발효에 의해 생산되었고, pH를 3.0으로 낮추고 MnCl2를 최종 농도 5 mM로 첨가하여 유도하였다. OxDC 단백질의 대부분은 원심분리에 의해 세포로부터 분리된 배양 상청액 내에 존재하였다. 상청액 내의 단백질은 황산암모늄 침전 및 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제 및 농축되었다. 최종 단백질 용액은 pH 3의 50 mM 시트레이트 완충제에 존재하였다.
모든 효소 및 변이체(A8 포함)는 구축된 이. 콜라이 균주에서 재조합 방식으로 발현되었다. 전장 유전자를 pColdIV 또는 pOTlpr 또는 pET 벡터의 NdeI과 BamHI 부위 사이에 삽입하고, 서열 확인된 플라스미드를 이. 콜라이 오리가미(Origami) 또는 BW25113 또는 BL21의 수용성(competent) 세포 내로 형질전환하여 발현 세포주를 구축하였다. 단백질 발현은 유가식(fed-batch) 발효로 수행되었고, 표 2에 요약된 유도 조건에 따라 유도되었다. 세포를 수거하고, 균질화 또는 초음파 처리에 의해 용해시켰다. pH 5의 50 mM 시트레이트 완충제에서 세척한 후, 단백질을 pH 9.5의 50 mM 아르기닌 완충제에 용해시켰다.
다양한 발현 구축물에 대한 유도 조건
벡터 유도 조건
pColdIV 온도를 15℃로 내리고, IPTG를 최종 농도 0.8 mM로, MnCl2를 최종 농도 5 mM로 첨가하였다.
pOTlpr 온도를 42℃로 올리고, MnCl2를 최종 농도 5 mM로 첨가하였다.
pET IPTG를 최종 농도 0.8 mM로, MnCl2를 최종 농도 5 mM로 첨가하였다.
모든 효소는 가용성 형태로 발현되었다. 효소는 이 과정에서 결정화되지 않았으며, 하기 실시예에서 모든 효소의 평가는 가용성 형태의 효소에 대해 수행된다.
실시예 4:
열 안정성:
실시예 3에 기재된 바와 같이 수득된 4개의 상이한 공급원 유기체(A0, A8, Bce 및 Cb6301_D29)로부터의 용액 내의 OxDC 효소를 25 내지 95℃의 다양한 온도에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 20분의 인큐베이팅 종료시에, 각각의 샘플을 활성 분석 설명에 따라 잔존하는 옥살레이트 분해 활성에 대해 시험하였다. 25℃(주위 온도)에서 인큐베이팅한 샘플의 활성을 100%로 간주하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 진균 A0 및 A8로부터 추출한 OxDC 효소는 박테리아 공급원인 Bce 및 Cb6301_D29로부터의 효소보다 더 안정한 것으로 결정되었다.
실시예 5:
pH 안정성:
실시예 3에 기재된 바와 같이 수득된 2개의 상이한 공급원 유기체(Bce 및 Cb6301_D29)로부터의 용액 내의 OxDC 효소를 120분 동안 1-13 범위의 다양한 pH에서 인큐베이팅하였다. 120분의 인큐베이팅 종료시에 각각의 샘플을 활성 분석 설명에 따라 잔존하는 옥살레이트 분해 활성에 대해 시험하였다. 25℃(주위 온도)에서 인큐베이팅한 샘플의 활성을 100%로 간주하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, Cb6301_D29 효소는 pH 3.0 내지 10에 비해 pH 2.5 내지 11의 범위의 안정성으로 Bce보다 더 안정하다. 실시예 8에서 개요가 설명된 바와 같이, 육량체 및 삼량체 계면에서 이온성 잔기의 수 및 조성이 4차 구조의 안정성을 결정한다. Cb6301은 육량체로 치밀해지는 필요한 잔기가 부족하고; 따라서, Cb6301은 Bce(육량체)와는 달리 삼량체이다. 또한, Cb6301은 삼량체 계면에서 가장 적은 양의 이온 하전 잔기를 갖고, 가장 많은 양의 수소 결합 잔기를 갖는다. 감소된 수의 이온성 상호작용 및 증가된 수의 수소 결합으로 인해, Cb6301은 본질적으로 보다 안정할 것이다. 따라서, 삼량체로서의 Cb6301은 육량체로 치밀해지는 다른 효소에 비해 산성 조건에서 향상된 pH 안정성을 갖는다. 천연 육량체인 효소는 활성을 보이기 위해 육량체 4차 구조를 가질 필요가 있다.
실시예 6:
모의 위 조건(인간 위 내의 식사 내용물을 모방한 것) 하에서 여러 식사에서 식품 옥살레이트의 분해:
인간 식품에서 옥살레이트를 분해하는 아그로시베 아에게리타(A0)로부터의 OxDC 효소의 효과를 평가하기 위해, 몇 가지 정기적인 서양 식사(미리 만들어진 "린 퀴진 식사")를 포장재 상의 지시에 따라 전자레인지에서 조리하고, 균질화하고, A0 효소의 옥살레이트 분해 활성 스크리닝에서 매트릭스로 사용하였다. 평가된 식사 및 최종 반응 혼합물 내의 대략적인 칼슘 농도를 표 3에 제시한다. 칼슘 농도는 식사 조성 설명(라벨)과 근사하였다. 프레쉬 익스프레스(Fresh Express)에 의해 제조된 신선한 비조리된 시금치를 30 g/L으로 각각의 식사에 첨가하여 옥살레이트를 공급하고, 최종 농도 약 3 mM의 옥살레이트를 수득하였다.
Figure pct00050
*시금치(프레쉬 익스프레스 함량 설명에 따름) 및 식사(린 퀴진 함량 설명에 따름)의 총 Ca% 1일 값.
**[Ca](mM) = (Ca% 1일 값) * 1000/40의 식을 사용하여 계산됨. 칼슘 1일 값은 1000 mg이고, 칼슘의 분자량은 40 g/mol이다.
모든 식사는 린 퀴진 지시에 따라 조리되었고, 식품 가공업체에 의해 작은 조각으로 잘라졌다. 식품을 400 mL의 50 mM 시트르산(최종 농도 20 mM)과 조합하고, 최종 부피를 탈이온수(DI)에 의해 800 mL로 조정하였다. 6 N HCl 및/또는 10 M NaOH의 첨가에 의해 식품 혼합물의 pH를 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 및 7.5로 조정하였다.
각각의 반응을 위해, 0.8 mL의 상기 식품 혼합물, 0.1 mL의 30 g/L 펩신(최종 농도 3 g/L) 및 0.1 mL의 800 U/L OxDC(최종 80 U/L)를 함께 혼합하고, 37℃에서 1000 rpm으로 진탕하면서 60분 동안 반응시켰다. 반응물을 0.1 mL의 2.5 N H2S04를 첨가하여 급냉(종료)하였다. 잔여 옥살레이트 및 생성된 포르메이트의 농도를 이온 배제 HPLC 방법에 의해 분석하였다(실시예 1 참조). 옥살레이트 분해율은 하기 식을 사용하여 계산하였다:
옥살레이트 분해율 = 포르메이트 농도/(옥살레이트 농도 + 포르메이트 농도) x 100%
시금치 단독(식사 없이)을 저 칼슘 대조군으로 사용하였다. 음성 대조군(효소 없음)으로서, OxDC 용액 대신에 0.1 mM의 50 mL 시트르산을 각각의 반응물에 첨가하였다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, A0으로부터의 OxDC는 보다 알칼리성의 pH보다는 산성 pH에서 및 칼슘 수준이 보다 낮은 식사에서 더 많은 옥살레이트를 분해할 수 있다. 칼슘 수준이 극히 낮은 식사(<1 mM Ca2 +)에서, 총 옥살레이트의 90% 초과가 pH 2 내지 5에서 60분 내에 분해되었다. 칼슘 수준이 낮은 식사(<3 mM Ca2 +)에서, 총 옥살레이트의 70% 초과가 pH 2 내지 4 사이에서 60분 내에 분해되었다. 칼슘 수준이 중간인 식사(3-5 mM Ca2 +)에서, A0 OxDC 효소는 pH 2 내지 3 사이에서 60분 내에 총 옥살레이트의 60-80%를 분해할 수 있고, pH 4에서 50%를 분해할 수 있다. 고 칼슘 식사(> 5 mM Ca2+)에서, 효소는 pH 2 및 3에서 60분 내에 총 옥살레이트의 40-60%를 분해한다. 분해율의 감소는 중등도 내지 고 칼슘 함유 식사에서 옥살레이트의 용해도 감소로 인한 것일 수 있다. Yvrk(Km = 8.4 mM)와 달리, A0은 옥살레이트에 대한 높은 친화도 갖고(Km = 0.08 mM), 이에 의해 A0은 인간 위 내에서 낮은 수준의 옥살레이트를 보다 잘 분해할 수 있다. OxDC 효소가 인간 위 내에서 옥살레이트를 분해할 때 효과적이 되도록 하기 위해, 효소는 음식이 공급된 인간 위(pH 1.0-4.5)에 일치하는 pH 프로파일 및 1.0 mM 미만의 Km을 필요로 한다. 따라서, Cb6301, Cb6803, Cb6312 및 Bcl은 A0/A8 및 Bce만큼 이상적인 후보 물질이다.
실시예 7:
OxDC 효소의 pH 및 시간 프로파일:
실시예 3에 기재된 바와 같이 수득된 Bce 및 Cb6301의 OxDC 효소를 실시예 1에 기술된 바와 같이 시험하였지만, 시험된 반응에서의 pH는 1.5 내지 7.0의 범위이었다. 37℃에서 5분, 10분, 20분 및 40분 동안 반응시킨 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 반응을 종결시켰다. 생성된 포르메이트 농도를 HPLC에 의해 결정하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 OxDC 효소 활성을 계산하였다.
도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, Cb6301_D29는 pH 1.5 내지 4.5에서 활성을 보이고, 이것은 Bce(pH 2.4 내지 4.5)보다 더 넓다. 그러나, Bce는 이러한 조건 하에서보다 오랜 기간 동안 활성을 보인다. 많은 OxDC 효소의 pH 활성 프로파일이 도 7에 제시된다. 이들 효소는 모두 특유한 pH 활성 프로파일을 갖고, A8/A0, Cb6301, Cb6803, Cb6312 및 Bcl의 4개의 효소만이 pH 2.0 이하에서 활성을 보인다.
Cb6301, Cb6803 및 Cb6312는 이들 특정 효소에 유해한 라디칼을 생성하는 소량의 옥살레이트 옥시다제 활성을 모두 가지고 있다. 이러한 라디칼의 생성은 시간의 함수로서 활성의 상실을 초래한다. 본 발명자들은 위치 340의 이소류신 잔기(도 10에서 진한 글씨로 강조표시됨)를 글루탐산으로 돌연변이시키면, 상기 라디칼 형성으로 인해 옥살레이트 분해 활성이 감소하지 않는다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 비타민, 예컨대 o-페닐렌디아민, 히드로퀴논 및 아스코르브산을 효소 용액에 첨가하면 효소가 보다 오랜 시간 동안 활성을 유지할 수 있음을 발견하였다.
실시예 8에서 개요가 설명된 바와 같이, 육량체 계면에서 이온성 잔기의 수 및 조성이 4차 구조의 안정성을 결정한다. Cb6301, Cb6312 및 Cb6803은 이러한 잔기의 대부분이 결여되고, 따라서 이들 효소는 다른 효소들과는 달리 천연적으로 삼량체로 치밀해진다. 삼량체는 육량체에 비해, 특히 2.0 미만의 pH에서 향상된 pH 안정성을 갖는다. 삼량체 4차 구조가 pH 변화에 보다 저항성인 이유는 삼량체 계면에서의 이온성 상호작용의 수가 더 적고 수소 결합 상호작용 수가 증가하기 때문이다. 육량체인 효소는 활성을 보이기 위해 육량체 4차 구조를 가질 필요가 있다. 실시예 8에 정의된 바와 같이 육량체 계면에서 10개 초과의 이온성 잔기(D, E, R 및 K)를 갖는 효소는 pH 3.0 초과에서만 활성을 보인다. 육량체 계면에서 5-9개의 이온성 잔기(D, E, R 및 K)를 갖는 효소는 pH 2.0 초과에서만 활성을 보이고, 5개 미만의 이온성 잔기를 갖는 효소는 pH 2.0 미만에서 활성을 나타낸다. 이것은 육량체 계면에서의 총 순 이온 전하(모든 아스파르트산 및 글루탐산이 양성자화된 pH)에 대응한다:
1.) 총 순 이온 전하가 +8 이상인 효소는 pH 3.0 초과에서만 옥살레이트 분해 활성을 보인다.
2.) 총 이온 전하가 +4 내지 +7인 효소는 pH 2.0 초과에서 옥살레이트 분해 활성을 보인다.
3.) 총 이온 전하가 +4 미만인 효소는 pH 2.0 미만에서 옥살레이트 분해 활성을 보인다.
천연적으로 육량체로 치밀해지는 효소는 육량체 계면에서 더 많은 수의 이온성 상호작용을 가질 뿐만 아니라, 삼량체 계면에서도 더 많은 수의 이온성 상호작용을 갖는다. 서브유닛당 이온성 상호작용의 조합된 수는 다음과 같다:
Cb6301: 25
Bcl: 29
A8: 32
Bce: 32
Bam: 44
YvrK: 45
Bpu: 47
총 이온성 상호작용의 수와 산성 pH 안정성 사이에는 직접적인 상관관계가 있으며, 가장 적은 양을 갖는 Cb6301이 가장 안정성이 높고 가장 많은 양을 갖는 Bpu가 가장 안정성이 낮다. 산 안정성이 가장 낮은 효소(Bam, Bce 및 Bpu)는 육량체 및 삼량체 계면 둘 모두에서 44개 초과의 이온성 아미노산을 가지고 있다. Bcl, Bce 및 A8은 29-32개의 이온성 아미노산을 갖고, Cb6301은 25개를 갖는다. Bcl, Bce, A8 및 Cb6301은 감소된 수의 이온성 상호작용을 갖는 반면, 더 많은 수의 수소 결합 상호작용을 갖는다. 이러한 수소 결합 상호작용은 계면에서의 안정성을 증가시키고 계면이 산 변성을 덜 일으키게 만든다.
상기 정보가 갖춰지면, 상기 언급된 기준 중 하나 이상을 충족하는 효소(들)가 선택되는, 다수의 효소로부터 효소를 선택하는 스크리닝 방법이 제공된다.
실시예 8:
4차 구조의 특성 분석:
1. 아미노산 서열 분석
결정 구조 및 아미노산 서열을 분석한 결과, 특정 OxDC 효소가 산성 환경 하에서 향상된 안정성을 갖는 이유는 육량체 및 삼량체 계면에서의 이온성 상호작용의 수 및 조성 때문인 것으로 판명되었다. 육량체 계면에 있는 아미노산은 도 10에서 발견되는 다중 서열 정렬에 밑줄로 표시된다. 또한, 삼량체 계면에 있는 아미노산은 도 10에 도시된 다중 서열 정렬에서 밑줄과 함께 진하게 표시된다. Cb6301, Cb6312 및 Cb6803 외에, 알려진 모든 OxDC 효소는 육량체이다. 육량체 계면에서 이온성 상호작용(D, E, K 및 R 아미노산)의 비율이 더 큰 효소는 환경이 보다 산성이 되면 4차 구조를 상실한다. 유사하게, 육량체 및 삼량체 계면 둘 모두에서 더 많은 수의 이온성 상호작용을 갖는 효소는 산성 조건에서 그의 4차 구조를 잃는 경향이 더 크다. 예를 들어, Bam, Yvrk 및 Bpu는 4차 구조의 해리로 인해 pH 3.0 이하에서 활성을 보이지 않는다. 이 4차 구조의 상실은 비가역적이고, 육량체/삼량체의 해리시에 효소는 더이상 옥살레이트 분해 활성을 갖지 않는다. 이것은 육량체 및 삼량체 계면에서의 아스파르트산 및 글루탐산의 양성자화에 기인하고; 따라서 이들 계면을 함께 유지하는 이온성 상호작용을 붕괴시킨다. 아스파르트산 및 글루탐산은 각각 3.65 및 4.25의 pKa를 갖고, 이것은 주위 환경이 주로 소수성일 경우 약 0.5-1.0 pH 단위를 낮출 수 있다.
반대로, Cb6301은 육량체 구조를 형성하지 않으며, 이것은 육량체를 형성하기 위해 필요한 이온성 상호작용이 결여되기 때문에 타당하다. 따라서, Cb6301은 삼량체로 치밀해지고, pH 1.5까지 더 산성인 조건 하에서 활성을 갖는다. Bcl 및 Bce 효소는 Yvrk, Bam 및 Bpu 효소보다 훨씬 더 약하지만 육량체 구조를 형성한다. 이것은 계면 구조를 함께 유지하는 이온성 상호작용이 적기 때문이다. Bcl과 Bce 둘 모두는 이온성 상호작용이 적어 향상된 산성 pH 안정성 및 유지된 활성을 제공하는 추세에 따라 각각 pH 2.0 및 2.5까지 활성을 보인다. 예를 들어, 산 안정성이 가장 낮은 효소(Bam, Bce 및 Bpu)는 육량체 및 삼량체 계면 둘 모두에서 44개 초과의 이온성 아미노산을 갖는다. Bcl, Bce 및 A8은 29-32개의 이온성 아미노산을 갖고, Cb6301은 25개의 아미노산을 갖는다. Bcl, Bce, A8 및 Cb6301은 감소된 수의 이온성 상호작용을 갖는 반면, 더 많은 수의 수소 결합 상호작용을 갖는다. 이들 수소 결합 상호작용은 계면에서의 안정성을 증가시키고 계면이 산 변성을 덜 일으키게 만든다.
육량체인 효소는 활성을 보이는 육량체 4차 구조를 가질 필요가 있다. 육량체 계면에 10개 초과의 이온성 아미노산 잔기(D, E, R 및 K)를 갖는 효소(6개 서브유닛 중 2개 사이의 상호작용)는 pH 3.0 초과에서만 활성을 보인다. 육량체 계면에 5-9개의 이온성 잔기(D, E, R 및 K)를 갖는 효소(6개 서브유닛 중 2개 사이의 상호작용)는 pH 2.0 초과에서만 활성을 보이고, 5개 미만의 이온성 잔기를 갖는 효소(6개 서브유닛 중 2개 사이의 상호작용)는 pH 2.0 미만에서 활성을 나타낸다. 이것은 또한 육량체 계면에서의 총 순 이온 전하(모든 아스파르트산 및 글루탐산이 양성자화된 pH)에 대응한다. 이들 결과는 다음과 같은 강한 경향을 보여준다:
1.) 총 순 이온 전하가 +8 이상인 효소는 pH 3.0 초과에서만 옥살레이트 분해 활성을 갖는다(6개의 서브유닛 중 2개 사이의 전하).
2.) 총 이온 전하가 +4 내지 +7인 효소는 pH 2.0 초과에서 옥살레이트 분해 활성을 갖는다(6개의 서브유닛 중 2개 사이의 전하).
3.) 총 이온 전하가 +4 미만인 효소는 pH 2.0 미만에서 옥살레이트 분해 활성을 보인다(6개의 서브유닛 중 2개 사이의 전하).
전부는 아니지만 대부분의 아스파르트산 및 글루탐산이 양성자화되는 pH 조건에서, 육량체 계면은 총 양의 순 전하를 갖는다. 육량체 계면에서 이온성 잔기의 비율이 보다 큰 효소는 이온성 잔기가 보다 적은 효소보다 pH 변화에 더 민감하다. 실제로, 도 7은 모든 아스파르트산 및 글루탐산이 양성자화된 pH vs. YvrK, Bam, Bpu, Bcl, Cb6301, A8/A0 및 Bce 효소가 활성을 나타내는 대부분의 산성 pH에서 총 순 이온 전하의 직접적인 상관관계를 보여준다. 실제로, R2 값은 상당한 세트의 데이터를 통해 0.95를 넘는 강력한 상관관계를 보여준다.
상기 정보가 갖춰지면, 상기 언급된 기준 중 하나 이상을 충족하는 효소(들)가 선택되는, 다수의 효소로부터 효소를 선택하는 스크리닝 방법이 제공된다.
Figure pct00051
AA = 아미노산
*두 서브유닛 사이의 한 계면에서의 아미노산 또는 전하의 수. OxDC 효소는 삼량체의 이량체를 형성하고, 따라서 하나의 OxDC 육량체는 3개의 계면을 갖는다. 따라서, 표 4제 제시된 모든 값에 3을 곱해야한다.
∧총 순 이온 전하는 모든 글루탐산 및 아스파르트산이 양성자화되는 pH에서 라이신 및 아르기닌 잔기의 총 수이다.
1이온 전하는 중성 pH에서 삼량체 계면에서의 총 전하이다.
2. 크기 배제 크로마토그래피
SEC-HPLC는 이량체/응집체의 형성을 모니터하기 위해 사용된다.
SEC-HPLC를 위한 분자량 표준 곡선을 작성하였다. 겔 여과 분자량 표준물질은 처음에 HPLC 등급 H2O에서 20 mg/ml의 농도로 재구성된 후, 공급자의 권고에 따라 50 mM 아르기닌 완충제 내에 희석하였다. 작성된 표준 곡선을 사용하여 OxDC 분자량을 결정하기 위해, 효소를 50 mM 아르기닌 완충제 내에 2 mg/ml, 1 mg/ml 및 0.5 mg/ml의 농도로 희석하였다.
분자량 표준물질은 다음과 같다:
· 블루 덱스트란(Blue Dextran): 1 mg/ml
· 티로글로불린: 5 mg/ml
· 페리틴: 0.3 mg/ml
· 알돌라제: 4 mg/ml
· 콘알부민: 3 mg/ml
· 난알부민: 4 mg/ml
공급자의 권고에 따라 보정 곡선을 작성하였다:
1. 분배 계수(Kav)는 다음 식을 사용하여 계산되었다:
Kav = (ve - vo)/(vc - vo)
여기서, ve = 용리 부피, vc = 기하학적 컬럼 부피 및 vo = 컬럼 공극 부피(column void volume).
컬럼 공극 부피는 블루 덱스트란 표준물질의 용리 부피로 정의된다.
기하학적 컬럼 부피는 다음과 같이 계산된다:
vc = r2 x π x l
여기서, r은 컬럼 반지름이고, l은 컬럼 길이이다.
2. 분배 계수는 로그(MW)에 대해 플로팅된다.
SEC 결과는 Yvrk 효소가 체류 시간이 8.8분인 하나의 올리고머 종인 육량체임을 보여준다. 보다 고차의 응집체 또는 분해에 대응하는 추가의 피크는 없다. 마찬가지로, Bce도 체류 시간이 8.7분인 하나의 올리고머인 육량체 종이다. 그러나, Cb6301은 체류 시간이 9.6분인 삼량체 종이다. 이 결과는 이전 섹션인 아미노산 서열 분석 및 다음 섹션(천연-PAGE 분석)에서 제시된 가설을 확인해준다.
3. 천연 PAGE 분석
천연-PAGE는 분자량 및 pI의 조합을 기초로 하여 효소를 분리한다. 따라서, OxDC의 해리가 발생하면, 겔 이동이 일어고, 이것은 효소 밴드가 겔 내로 더 멀리 이동할 것임을 의미한다.
상이한 pH에서의 Cb6301, Bce 및 Yvrk의 천연-PAGE는 도 9에 제시된다.
시험 샘플을 제조하기 위해, 20 ㎕의 CB6301을 각각 1980 ㎕의 pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 및 4.0 완충제에 첨가하고, 볼텍싱에 의해 혼합하였다. 40 ㎕의 Yvrk를 각각 1960 ㎕의 pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 및 4.0 완충제에 첨가하고, 볼텍싱에 의해 혼합하였다. 50 ㎕의 Bce를 각각 450 ㎕의 pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 및 4.0 완충제에 첨가하고, 볼텍싱에 의해 혼합하였다. 농도는 상기 모든 샘플에 대해 1 mg/ml이었다. 농도가 2 mg/ml인 샘플을 제조하고, 겔 상에 로딩하였다.
상기 용액을 37℃ 및 300 rpm에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 15 ㎕의 각각의 용액을 15 ㎕의 5x 샘플 완충제와 혼합하였다. 20 ㎕의 각각의 샘플을 각각의 겔 웰에 첨가하였다. 10% 천연-PAGE 겔을 100 볼트에서 75분 동안 이동시켰다.
주: 각각의 개별 샘플의 pH는 겔에 로딩하기 전에 측정되었다. 실제 pH 측정값은 도 11의 범례에 제시된다.
천연-PAGE 겔 전기영동(도 11)에 따르면, Cb6301 OxDC 효소는 평가된 모든 pH, 즉 1.40-2.52(겔 이동이 없음)에서 삼량체(SEC 및 질량 분광법으로 확인됨)로 계속 유지된다. Yvrk 효소는 겔 이동에 의해 결정된 바와 같이, pH 4.07에서 육량체(SEC 및 질량 분광법으로 확인됨)로서, pH 3.6에서 육량체와 삼량체/이량체/단량체의 혼합물(하나의 더 넓은 밴드로 제시됨)로서, 및 pH 3.02-3.05에서 삼량체/이량체/단량체(하나의 더 넓은 밴드로 제시됨)로서 발견된다. 마지막으로, Bce 효소는 1.57-2.27 사이에서 평가된 모든 pH에서 삼량체/이량체/단량체 혼합물이지만(밴드는 레인에서 보다 확산되는 것으로 나타남), pH 2.57에서 효소는 육량체이다. 이러한 결과는 OxDC 효소의 pH 프로파일이 4차 구조의 해리와 직접적으로 연관되어 있다는 강력한 증거를 제공한다. 예를 들어, Cb6301 효소는 pH 1.5-5.0에서(모든 pH 조건에서 삼량체임), YvrK는 pH 3.5-5.5에서(이들 pH에서 육량체임), Bce는 pH 2.4-4.5에서(이들 pH에서 육량체임) 활성을 나타낸다. 일단 pH가 Yvrk 효소의 경우 pH 3.5 미만으로, Bce의 경우 pH가 2.4 미만으로 떨어지면, 4차 구조가 해리되고, 그 결과로 활성이 완전히 상실된다. 4차 비폴딩 과정 및 활성 상실은 비가역적이다.
실시예 9:
40℃에서 상이한 화학물질의 존재 하에서의 OxDC의 안정성:
최종 농도가 2 mM인 상이한 화학물질을 실시예 3에서 얻은 Bce 또는 Cb6301_D29의 정제된 OxDC 효소 용액에 첨가하였다. 잘 혼합한 후, pH 9.5의 50 mM 아르기닌 내의 이들 혼합물을 40℃에서 진탕하지 않으면서(정치) 6일 동안 인큐베이팅하였다. 화학물질을 첨가하지 않은 효소 자체를 40℃ 및 4℃에서 대조군으로 인큐베이팅하였다. 효소 활성은 실시예 1에서 설명된 절차에 따라 pH 3에서 8분, 17분, 41분 및 106분의 반응 시간 동안 시험하였다.
도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 40℃에서 인큐베이팅하면 Bce의 효소 활성이 2배 초과로 증가한다. 또한, 활성은 Bce 40℃ 대조군 샘플과 비교할 때, MgSO4의 존재 하에서 거의 20% 증가하고, ZnSO4 또는 EDTA의 존재 하에 현저하게 감소한다.
도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, Bce과는 달리, 40℃에서 인큐베이팅한 후 Cb6301_D29의 효소 활성은 크게 변하지 않는다. 활성은 MgSO4 또는 MnSO4의 존재 하에서 80% 초과로 증가한다. 그러나, 이들은 모두 반응 과정 동안 활성 손실을 계속 보인다.
실시예 10:
효소 동역학:
4개의 상이한 종으로부터의 OxDC, 즉 Bce, Bcl, Cb6301_D29 및 A8의 효소 동역학을 측정하고, YvrK의 알려진 동역학 데이터와 비교하였다. 상이한 농도의 옥살레이트(0.024-12.5 mM)가 존재하는 반응 완충제(100 mM 시트레이트 완충제, pH 3)을 제조하였다. A8 효소는 5.0, 4.0, 3.5 및 3.0의 4개의 독립적인 pH에서 측정되었다. 이들 완충제는 옥살레이트 분해 및 포르메이트 생성을 모니터링함으로써 상이한 OxDC 효소의 옥살레이트 분해 효소 활성을 시험하기 위해 사용되었다. 옥살레이트 반응 완충제에 OxDC 효소를 첨가하고, 37℃에서 1100 rpm으로 진탕하면서 5분 동안 인큐베이팅하여 반응을 개시시켰다. 2.5 NH2S04를 첨가하여 반응을 종료시키고, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 포르메이트 함량에 대해 HPLC에 의해 분석하였다. 옥살레이트가 없는 반응물을 음성 대조군으로 포함시켰다. 처음 5분 동안의 초기 반응 속도는 실시예 1에서 설명된 바와 동일한 절차를 사용하여 0.024-12.5 mM 사이의 기질 농도에 대해 결정되었다. 상이한 옥살레이트 농도에서의 Cb6301_D29의 초기 반응 속도를 도 14에 예시로서 나타내었다.
동역학 파라미터 kcat 및 Km을 결정하기 위해, 상이한 기질 농도 [S]에서의 반응 속도 v0을 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 소프트웨어에서 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식에 피팅하였다:
V0 = kcat*[E]t*[S]/(Km + [S])
여기서,
· v0은 HPLC로 측정한, 단시간(5분) 반응 동안 초기 반응 속도이고,
· Kcat은 대사 회전수이고.
· KM은 미카엘리스 상수이고,
· [E]t는 OxDC 효소의 총 농도이고,
· [S]는 기질인 옥살레이트의 초기 농도이다.
결과를 표 5에서 비교한다. pH 3.0에서 Bce, Bcl, Cb6301_D29 및 A8의 KM(각각 0.32 mM, 0.2 mM 및 0.08 mM)은 pH 4.2에서의 YvrK보다 훨씬 더 낮았고, 이것은 이들 효소가 기질 옥살레이트에 대한 훨씬 더 강한 친화도를 갖는다는 것을 나타내었다. 보다 낮은 KM은 또한 Bce, Bcl, Cb6301 및 A8이 옥살레이트를 YvrK보다 훨씬 더 낮은 수준으로 효율적으로 분해할 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 pH 3.0에서 YvrK의 KM을 결정하려고 시도하였지만, 이 효소는 상기 pH에서 어떠한 활성도 나타내지 않았다. 실제로, YvrK 효소는 pH 3.3 미만에서 주목할 만한/지속된 활성을 보이지 않고, 이것은 음식이 공급된 위 pH가 pH 1.0-4.5 사이인 것으로 알려진 인간의 위 환경으로부터 옥살레이트를 제거하는 효소로서 사용되는 그의 유용성을 제한한다.
A8의 Km은 5.0, 4.0, 3.5, 및 3.0의 4개의 pH에서 결정되었다. 도 15에서 강조 표시된 바와 같이, 효소의 Km은 pH가 보다 산성으로 되면서 감소한다. 일양성자화된 옥살레이트(pKa = 3.81 및 pKa = 1.25)는 활성 부위 내의 비양성자화된 글루탐산에 결합한다. 붕괴되지 않은 활성 부위의 비양성자화된 글루탐산은 붕괴된 활성 부위(예컨대, 붕괴된 육량체의 활성 부위) 내의 동등한 잔기보다 비양성자화된 상태로 유지될 가능성이 더 크다. 따라서, pH가 6에서 대략 3으로 감소할 때, 일양성자화된 옥살레이트의 비율은 비양성자화된 옥살레이트에 비해 최대화될 것이다. 따라서, 이것은 붕괴되지 않은 활성 부위에 대한 옥살레이트의 결합을 증가시켜, 보다 낮은 Km 및 보다 높은 촉매 효율을 유도할 것이다.
Figure pct00052
출처: [Ellen W. Moomaw, etc. Biochemistry. 2009; 48(26): 6116-6125]
실시예 11:
효소에 대한 이상적인 pH 미기후를 생성하기 위한 건조 및 제제화:
동결 건조:
Bce 효소는 탈이온수 내의 5% w/v 트레할로스의 제제에서 동결 건조하였다. 개시시의 보관 온도 및 압력은 -30℃ 및 50-150 mTorr이었다. 18시간 후, 온도를 4℃까지 올리고(0.1℃/분), 처리될 때까지 유지하였다.
에멀젼 :
산 말단 캡(cap)이 있는 폴리(락티드-코-글리콜리드), 즉 PLGA(락티드:글리콜리드 85:15, Mn 85,000-100,000)를 21% w/v의 비율로 디클로로메탄에 용해시켰다. 동결 건조된 OxDC를 1.3% w/v의 비율로 PLGA 용액과 혼합하고, 약 18,000 rpm에서 30초 동안 바이오스펙 프라덕츠 티소(Biospec Products Tissor) 균질화기를 사용하여 혼합하였다. 균질화 직후, 1.5 mL의 2% 폴리비닐 알콜 용액(Mw 9,000-10,000)을 첨가하고, 샘플을 30초 동안 볼텍싱하였다. 생성된 에멀젼을 100 mL의 0.5% 폴리비닐 알콜 용액 적가하고, 14시간 동안 교반하였다. 생성된 마이크로비드를 원심분리에 의해 수거하고, DI H2O에 재현탁하여 반복적으로 세척하고, 원심분리에 의해 수거하였다. 마지막 세척 후, 5 mL의 DI H2O를 사용하여 비드를 재현탁하였다. 비드를 분무 건조 전에 4℃에서 보관하였다.
분무 건조:
비드 현탁액(3 mL)을 RL30D 유드라기트(1.9 mL) 및 트레할로스(0.5 g)와 혼합하고, DI H2O를 총 부피가 100 mL로 첨가하였다. 분무 건조는 부치(Buchi) B-191에서 유입구 온도 및 배출구 온도를 각각 100℃ 및 약 58-65℃로 하여 수행하였다. 공급 속도는 10%(약 2 mL/분)로 설정하고, 가스 분무(N2) 유량 및 압력은 각각 20 L/분 및 70 psi이었다. 건조 분말(g)의 수율은 68%이었다.
활성 시험:
활성은 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하되, 시트레이트 및 포스페이트 완충제를 사용하여 반응 pH를 4, 5, 6, 7, 7.3 및 7.8로 설정하였다. 도 13 및 도 14에 도시된 바와 같이, Bce 효소가 PLGA와 함께 제제화될 때, pH 중성 환경(pH 6, 7, 7.3 및 8)에서 옥살레이트 분해 활성이 관찰되기 때문에 산성 미기후가 달성된다. 비제제화된 Bce 효소는 이들 pH에서 활성을 보이지 않는다. 따라서, 미기후 pH가 달성되어, Bce 효소가 입자 내에서 활성을 유지한다.
실시예 12:
비글 개 원리 증명 연구
6마리의 비글 개에게 고 옥살레이트 식이(1일당 2.73 mmol 옥살레이트)를 투여하여 고옥살산뇨증을 유도하였다. 고옥살산뇨증은 즉시 나타나고, 동물은 24시간 소변당 평균 0.8 mmol의 옥살레이트를 배설한다. 이 수준은 고 옥살레이트 식이(하루 2끼) 약 48시간 후에 안정화된다. 이 고옥살산뇨증 비글 모델에서 각 식사와 함께 효소를 경구로(위관 영양법에 의해) 투여함으로써 4개의 상이한 효소를 평가하였다. 효소는 50 mM 아르기닌(pH 9.5)에서 가용성 형태로 존재하였고, 위관 영양법 전에 대략 6:96의 효소 용액 대 비히클의 비율로 비히클과 혼합하였다. 사용된 비히클은 시트르산(pH 3)이었다. 소변의 산성 pH를 보장하기 위해 소변은 항상 황산을 담은 용기에 채취하였다. 뇨중 옥살레이트는 트리니티 바이오텍(Trinity Biotech) (5910D)의 옥살레이트 결정 키트를 사용하여 12시간 소변 수집물에서 측정되었고, 소변 크레아티닌은 스탄바이오(StanBio)의 다이렉트 크레아티닌 리퀴컬러 절차(Direct Creatinine LiquiColor Procedure) 0421을 사용하여 결정되었다.
8마리의 동물(비글 개)은 위 pH에 대한 연구전 스크리닝 및 투여 전 할당을 받았다. 연구 할당은 pH 2.0-4.5 내의 음식이 공급된 상태의 위 pH(인간의 음식이 공급된 상태와 비슷함)를 기초로 하였다. 6마리의 동물을 연구를 위해 선택하고, Bce, Yvrk, A0, Cb6301_D29를 상이한 용량으로, 경구 위관 영양법을 통해 또는 옥살레이트 미함유 식품에 혼합하여 투여하였다.
결과:
모든 동물들은 고 옥살레이트 식이에 의해 고옥살산뇨증을 갖게 되었고, 24시간당 0.16 mmol 옥살레이트의 기준선 옥살레이트 배설로부터 24시간당 0.8 mmol 옥살레이트로 증가하였다(고 옥살레이트 식이기). 총 크레아티닌 배설은 연구 전반에 걸쳐 24시간당 평균 2 mmol 정도에서 안정적이었다. A0, Cb6301_D29 및 Bce 시험물은 경구 위관 영양법을 사용한 비히클 투여시에 뇨중 옥살레이트의 유의한 감소를 입증하였다. A0 및 Cb6301_D29는 평균 60% 및 40%의 뇨중 옥살레이트의 가장 높은 감소를, 개별 동물(높은 감소: 85%)에 따라 나타냈다(도 18-19 참조). Bce는 평균 23%의 감소를 보였으며, 동물 사이의 차이가 보다 컸다(도 20 참조). Yvrk 효소는 현저한 감소를 보이지 않는다(도 21 참조). 이러한 결과는 산 조건(예를 들어, pH 1.5-5.5)에 걸쳐있는 pH 활성 프로파일을 갖는 효소만이 생체 내에서 효과적일 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, pH 프로파일이 약 1.5-5.0인 A0/A8 및 Cb6301은 Bce(pH 2.4-4.5, 24%) 및 Yvrk(pH 3.5-5.5, 유의한 감소 없음)보다 뇨중 옥살레이트의 보다 유의한 감소를 보인다. 시트르산 비히클 내의 시험물을 투여하면, 옥살레이트를 함유하지 않은 식품과 혼합하는 것보다 더 양호한 결과가 나타났다(결과는 본원에 제시되지 않음). 연구 중 측정시의 위 pH는 식후 처음 1시간 동안 평균 약 4이었지만(결과는 본원에 제시되지 않음); 모든 동물들은 극히 높고 낮은 pH 스파이크를 보였다.
실시예 13:
불용성 옥살레이트 분해
3개의 OxDC 효소, 즉 Bce, Yvrk 및 Cb6301은 그의 pH 활성 최대 값(Bce는 pH 3.0에서, Cb6301은 pH 2.5에서, YvrK는 pH 4.0에서 시험됨)에서 옥살레이트 대 칼슘의 상이한 몰비에서 옥살레이트 분해 활성에 대해 평가하였다. 활성 반응은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수행되었지만, 옥살레이트 대 칼슘의 몰비가 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5가 되도록 칼슘 이온을 포함하였다. 생성된 포르메이트 비율은 분해된 옥살레이트의 양에 대해 등몰(equimolar) 수준이고, 1:1 조건에 따라 표준화하고, 도 22(Bce), 도 23(Cb6301) 및 도 24(Yvrk)에서 옥살레이트:칼슘 비율에 대해 그래프로 표시하였다. 총 단백질의 동일한 농도에서 효소를 비교하기 위해 각각의 희석(Bce - 비희석, 1/2x, 1/4x; Cb6301 - 1/5, 1/10, 1/20, Yvrk - 비희석, 1/2x, 1/4x)을 수행하였고; 따라서, 첨가된 효소의 3가지 수준은 샘플 내의 총 단백질의 mg당 동등한 양이다. 효소 용액의 순도는 비슷하다(85%).
Cb6301은 Bce 또는 Yvrk보다 불용성 옥살레이트를 분해하는데 더 효과적이다(도 22-24)(조사된 모든 비율의 Ca:Ox에서 보다 많은 포르메이트가 생산되었다). 이것은 Cb6301 효소가 Bce 또는 Yvrk보다 더 낮은 Km 및 더 높은 촉매 효율을 가지고 있다는 사실에 기인할 수 있다. Yvrk 효소는 불용성 옥살레이트 분해시 효능이 가장 낮은 효소이다. 이것은 다음과 같이 두 가지 요인과 관련될 수 있다: (1) Yvrk 효소는 높은 Km(mM 수준) 및 낮은 촉매 효율을 갖고, (2) pH 활성 프로파일은 불용성 옥살레이트를 용해시키는데 도움이 되지 않는다. 불용성 옥살레이트는 산성 조건에서 보다 쉽게 이용 가능하고, 수준이 높을수록 보다 높은 산성 조건에서 잘 가용화된다. Yvrk 효소는 pH 3.5 이상에서만 활성을 보이기 때문에, 이 효소는 가용성 또는 불용성 옥살레이트 상관하지 않고 옥살레이트를 제거하는 데 매우 비효과적이다.
실시예 14:
상이한 식(료)품에서의 식품 옥살레이트의 분해:
OxDC 효소가 인간의 식품에서 옥살레이트를 분해하는 효과를 평가하기 위해, 여러 식(료)품을 평가하였다. 이들 식품은 다음과 같았다:
1.) 즉석 차 음료(ready to drink tea),
2.) 맥주,
3.) 과일 주스.
각각의 반응을 위해, 0.990 mL의 식(료)품 및 0.010 mL의 80 U/L OxDC를 함께 혼합하고, 37℃에서 1000 rpm으로 진탕하면서 60분 동안 반응시켰다. 이어서, 반응물을 0.1 mL 2.5 N H2S04를 첨가하여 급냉(종료)하였다. 잔여 옥살레이트 및 생성된 포르메이트의 농도를 이온 배제 HPLC 방법에 의해 분석하였다(실시예 1 참조). 옥살레이트 분해율은 하기 식을 사용하여 계산하였다:
옥살레이트 분해율 = 포르메이트 농도/(옥살레이트 농도 + 포르메이트 농도) x 100%
표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, OxDC는 식(료)품 옥살레이트의 유의한 부분을 분해한다.
식(료)품 및 음료 내의 옥살레이트 분해
옥살레이트 제거
골드 피크(Gold Peak) RTD 차



총 옥살레이트의 75-100%가 음료로부터 제거됨
네스티(Nestea) 레몬 RTD 차
퓨어 리프(Pure Leaf) RTD 차
립톤 그린(Lipton Green) RTD 차
네이키드 석류 아사이(Naked Pomegranate acai)
심플리 레모네이드(Simply Lemonade)
V-8 쥬스
웰치(Welch) 포도 쥬스
뉴캐슬(Newcastle) 맥주
사무엘 아담스(Samuel Adams) 맥주
블루 문(Blue Moon) 맥주

Claims (50)

  1. 3.0 미만의 pH에서 삼량체인 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소를 포함하는 조성물.
  2. 전체 육량체 계면 내에 9개 이하의 아르기닌 및 라이신 아미노산을 갖는 적어도 하나의 옥살레이트 분해 효소를 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 옥살레이트 분해 효소가 재조합 방식으로 발현되고, 서열 번호 2-40 중 임의의 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 옥살레이트 분해 효소가 pH 3.0에서 삼량체인 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 옥살레이트 분해 효소가 pH 2.0 이상에서 옥살레이트 분해 활성을 갖는 것인 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 옥살레이트 분해 효소가 pH 2.5에서 옥살레이트에 대해 1 mM 이하의 Km을 갖는 것인 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 옥살레이트 분해 효소가 적어도 7000회 전환/M/s의 촉매 효율을 갖는 것인 조성물.
  8. 전체 육량체 계면 내에 21개 이하의 아르기닌 및 라이신 아미노산을 갖는 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 재조합 방식으로 발현되고, 서열 번호 1 및 41 내지 43 중 임의의 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 pH 3.0에서 육량체인 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 pH 2.5 이상에서 옥살레이트 분해 활성을 갖는 것인 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 pH 2.5에서 옥살레이트에 대해 3 mM 이하의 Km을 갖는 것인 조성물.
  13. 제8항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 적어도 7000회 전환/M/s의 촉매 효율을 갖는 것인 조성물.
  14. 전체 육량체 계면 내에 24개 이하의 아르기닌 및 라이신 아미노산을 갖는 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 재조합 방식으로 발현된 옥살레이트 분해 효소가 서열 번호 44-47 중 임의의 하나와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 pH 4.0에서 육량체인 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 pH 3.5 이상에서 옥살레이트 분해 활성을 갖는 것인 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 pH 3.5에서 옥살레이트에 대해 10 mM 이하의 Km을 갖는 것인 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 적어도 7000회 전환/M/s의 촉매 효율을 갖는 것인 조성물.
  20. 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 재조합 방식으로 발현되는 것인 조성물.
  21. 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 옥살레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 것인 조성물.
  22. 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 식품 내의 옥살레이트 수준을 감소시키는데 사용하기 위한 것인 조성물.
  23. 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 음료 내의 옥살레이트 수준을 감소시키는데 사용하기 위한 것인 조성물.
  24. 포유동물에게 옥살레이트 감소 유효량의 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 뇨중 옥살레이트를 감소시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법.
  25. 식품 및/또는 음료에 옥살레이트 감소 유효량의 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 식품 및/또는 음료에서 옥살레이트를 감소시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법.
  26. 제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 총 옥살레이트의 감소를 위해 불용성 옥살레이트 및 가용성 옥살레이트를 분해하는 것인 조성물.
  27. 제14항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 가용성 옥살레이트를 분해하는 것인 조성물.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성 옥살레이트 분해 효소를 유지하는데 안정화 화합물을 추가로 포함하는 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 안정화 화합물 중 하나가 비타민인 조성물.
  30. 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소 및 적어도 1.0 pH 단위의 pH 활성 프로파일의 이동을 유도하는 중합체를 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 주위 환경이 상이한 pH를 갖는 동안 미세 환경의 pH가 유지되는 것인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 미세 환경이 중합체의 분해를 통해 생성되는 것인 조성물.
  33. 포유동물에게 옥살레이트 감소 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 옥살레이트를 감소시키기 위해 제30항의 조성물을 사용하는 방법.
  34. 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 고정화되는 것인 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 촉매 활성이 60℃ 초과의 온도에서 유지되는 것인 조성물.
  36. 포유동물에게 옥살레이트 감소 유효량의 제34항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 뇨중 옥살레이트를 감소시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법.
  37. 식품 및/또는 음료에 옥살레이트 감소 유효량의 제34항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 식품 및/또는 음료에서 옥살레이트를 감소시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법.
  38. 식품 프로세스 동안 식품에 옥살레이트 감소 유효량의 제34항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 식품 프로세스에서 옥살레이트를 감소시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법.
  39. 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하여 포유동물에서 총 옥살레이트를 감소시키는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 투여가 경구 투여인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소가 포유동물의 위에 활성 상태로 전달되는 것인 방법.
  42. 제16항 또는 제17항에 있어서, 하나 이상의 효소가 포유동물의 장에 활성 상태로 전달되는 것인 방법.
  43. 치료 유효량의 제1항, 제2항, 제8항 및 제14항 중 어느 한 항의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 옥살레이트의 상승된 수준과 연관된 장애를 치료하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 조성물이 옥살산칼슘 결정의 형성 속도를 감소시키는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 옥살산칼슘 결정 형성의 감소가 신장 결석 형성을 감소시키기 위해 사용되는 것인 방법.
  46. 서열 번호 2-40의 서열 중 임의의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 옥살레이트 분해 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트.
  47. 제46항에 있어서, 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  48. 순 이온 전하가 pH 2.0에서 감소하도록 육량체 계면에서 아스파르트산 및 글루탐산 아미노산을 극성 아미노산으로 대체하여 효소를 변경하는 것을 포함하는, 육량체 계면을 갖는 옥살레이트 감소 효소의 안정성을 증가시키는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 효소가 재조합 방식으로 발현되고, 변경이 옥살레이트 감소 효소를 코딩하는 핵산 서열을 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항의 방법에 따라 생산되는 옥살레이트 감소 효소.
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