KR20180041360A - 소포체 선택적 형광 프로브 화합물 및 그 제조방법 - Google Patents

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샤르마 아밋
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강철훈
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Abstract

본 발명은 소포체 선택적 형광 프로브 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 소포체 선택적 형광 프로브 화합물은 근적외선 영역에서 뚜렷한 형광 방출, 우수한 광 안정성 및 생물 안정성을 가지므로 여러 ER 스트레스 모델에서 ER 동태에 대한 효율적인 모니터링을 제공할 수 있으며 나아가 형광 바이오 탐침자 및 치료제 개발에 큰 효용성을 갖는다.

Description

소포체 선택적 형광 프로브 화합물 및 그 제조방법{Endoplasmic reticulum selective fluorescent probe compound and method for preparing the same}
본 발명은 소포체 선택적 형광 프로브 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
소포체(ER)는 활면 소포체 및 조면 소포체로 구성되며, 단백질 합성, 접힘, 변형 및 골지체로의 운반, 세포 내 칼슘(Ca2 +) 풀의 제한, 지질 대사 및 생체이물의 대사를 포함하여 다양한 생물학적 과정에서 필수적인 역할을 한다(비특허문헌 1). 활면 소포체는 대개 관 모양을 지니며, 세포질을 통해 팽창하는 반면, 조면 소포체는 겹겹이 쌓인 시트 구조를 가지며 핵 주변에 존재한다(비특허문헌 2). 이러한 서브도메인들의 일부는 ER 스트레스 또는 세포 사이클과 같은 여러 세포 과정에 대응하여 동적으로 대응한다(비특허문헌 3). 예를 들어, 조면 소포체의 시트 구조는 ER 스트레스 하에서 극적으로 팽창한다. 따라서, 매우 안정하고 선택적인 형광 프로브를 이용한 ER 역동성의 시각화는 ER-관련 주제들을 조사하는데 있어 가장 중요하게 다뤄진다.
ER의 그물망 구조가 친유성 염료에 의해 쉽게 염색된다는 관찰에 기초하여, DiOC6(3), DiOC5(3) 및 헥실 로다민 B을 포함하는 몇몇 친유성 형광 프로브들이 ER의 시각화에 사용되어 왔다(비특허문헌 4). 그러나 이러한 프로브들은 나쁜 광-안정성, 광범위한 방출 스펙트럼 둔감성, 낮은 선택성, 및 여러 세포소기관에 대한 비특이적 편재화와 같은 한계를 지닌다(비특허문헌 5).
따라서, 협소한 방출 스펙트럼, ER 선택적 편재화, 내구성 있는 광 및 생물 안정성, 다양한 생물학적 환경에 대한 둔감성을 가진 신뢰성 있는 ER 선택적 형광 프로브에 대한 개발이 계속적으로 요구되고 있다.
S. R. Pfeffer and J. E. Rothman, Annu. Rev. Biochem., 1987, 56, 829-852. G. K. Voeltz, M. M. Rolls and T. A. Rapoport, EMBO Rep., 2002, 3, 944-950. S. Varadarajan, E. T. Bampton, J. L. Smalley, K. Tanaka, R. E. Caves, M. Butterworth, J. Wei, M. Pellecchia, J. Mitcheson, T. W. Gant, D. Dinsdale and G. M. Cohen, Cell Death Differ., 2012, 19, 1896-1907. L. Cole, D. Davies, G. J. Hyde and A. E. Ashford, J. Microsc., 2000, 197, 239-249. M. Terasaki and T. S. Reese, J. Cell Sci., 1992, 101, 315-322.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안추된 것으로, 본 발명에서는 근적외선 영역에서 뚜렷한 여광 방출, 광 및 생물체에서 우수한 안정성을 지닌 소포체 선택적 형광 프로브 화합물 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
하기 [화학식 1]로 표시되는 소포체 선택적 형광 프로브 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
.
또한, 본 발명은 하기 [화학식 2]의 화합물과 하기 [화학식 3]의 화합물을 반응시켜 하기 [화학식 1]의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 소포체 선택적 형광 프로브 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 1]
Figure pat00004
.
본 발명에 따른 소포체 선택적 형광 프로브 화합물은 근적외선 영역에서 뚜렷한 형광 방출, 우수한 광 안정성 및 생물 안정성을 가지므로 여러 ER 스트레스 모델에서 ER 동태에 대한 효율적인 모니터링을 제공할 수 있으며 나아가 형광 바이오 탐침자 및 치료제 개발에 큰 효용성을 갖는다.
도 1은 본 발명에 따른 소포체 선택적 형광 프로브 화합물(이하 'ERp'라 함)의 분광학적 특성을 나타낸 것으로, (A) 아세토니트릴 중 ERp의 흡수 및 방출 스펙트럼, (B) 여러 유기 용매(THF, MC, EA, MeOH, EtOH, 및 ACN) 각각에서의 ERp의 흡수 스펙트럼이다. 580 nm에서 여기(excitation) 시켰으며, ERp 농도는 5 μM 이었다.
도 2는 (A) 570 nm에서 여기된, 다양한 pH에서 수용액 중 ERp (10 uM)의 형광 스펙트럼, (B) 양으로 전하된 미셀, CTAB (2.5 uM), 또는 (C) 음으로 전하된 미셀, SDS (10 mM)의 존재 하에서 ERp (5 uM)의 형광 스펙트럼이다. 미셀을 지닌 ERp는 600 nm에서 여기되었다.
도 3은 헬라세포에서 여러 세포소기관 특정 탐침자를 이용한 ERp (2.5 mM)의 동일-위치 이미지 측정 실험 결과를 나타낸다. B, E 및 H는 ERp의 형광 이미지 (LP 650 nm 방출 필터로 543 nm에서 여기)이고, A, D 및 G은 각각 ER-트래커, 미토-트래커 및 리소-트래커의 이미지(BP 505-550 nm로 488 nm에서 흥분)이다. C, F 및 I은 각각 A + B, D + E, 및 G + H의 겹쳐진 이미지이다.
도 4는 ERp (2.5 uM) 및 미토-트래커 녹색 (분자 프로브; M-7514; 인비트로겐) (0.1 uM)를 사용한 헬라세포의 형광 이미지이다. 세포를 37 ℃에서 20분 동안 프로브와 함께 배양시켰으며, 미토-트래커 및 ERp 각각에 대해 필터가 LP 650 nm 및 BP 505-530 nm인 488 nm 및 543 nm에서 5분 마다 이미지를 측정하였다. 각 필터로부터의 이미지에서 세포(n = 6) 당 형광 강도는 이미지 J로 측정하였다.
도 5는 20분 동안의 ERp (2.5 uM) 처리 전, 3시간 동안 튜니카마이신(40 ㎍ ml-1)을 사용한 헬라세포의 형광 이미지이다. GFP-튜불린(C-10613; Thermo)은 실험 전 37 ℃에서 밤새 배양되었다. 형광 공초점 현미경에 의한 분석은 방출 bp 500-560 nm (GFP-튜불린) 당 여기는 488 nm, 방출 bp 660-700 nm (ERp) 당 여기는 633 nm 이었다.
도 6은 다양한 pH에서 ERp(10 μM)의 흡수 스펙트럼이다.
도 7은 다양한 농도의 CTAB micelles (A, B) 및 SDS micelles (C, D)의 존재 하에서 ERp (5 μM)의 흡수 및 형광 스펙트럼이다. 형광 스펙트럼의 경우 샘플은 600 nm에서 여기하였다.
도 8은 (A) BOIPY (0.5 μM), (B) ERp. (2.5 μM), (C) Mito-tracker (RED-CMXRos) (0.02 μM)를 사용한 Hela 세포의 형광 이미지이다. 세포는 37 ℃에서 15분 동안 프로브와 함께 배양하였다. 상기 A, B, C 이미지는 각각 488 nm 여기/BP 505-530 nm filter, 543 nm 여기/LP 650 nm 또는 BP 585-615 nm filter에서 각각 얻었다. 병합된 이미지는 D에 나타내었다. E는 각 프로브에 대하여 선택적으로 취득한 이미지를 보여준다.
도 9는 ERp (2.5 μM) 20분 처리 전에 tunicamycin (40 ㎍/ml) 1시간 처리한 Hela 세포의 형광이미지이다. RFP-ER (C-10591; Thermo)은 실험 전에 37 ℃에서 밤새 배양하였다.
도 10은 ER tracker red (Invitrogen; E34251, 2 μM) (A), 및 10 μM ERp (B)의 형광 스펙트럼이다. 두 샘플은 석영 큐벳에 넣고 자외선 램프(FL20T10BLB, Lumiaction Co. Ltd., Taiwan)에 지속적으로 노출시켰다. ER tracker red 및 Erp 각각에 대하여는 580 nm and 600 nm로 여기시켰다.
도 11은 ERp 농도에 따른 세포 생존율을 나타낸다.
도 12는 DMSO-d6에서 ERp의 1H NMR 스펙트럼(400 MHz)이다.
도 13은 DMSO-d6에서 ERp의 13C NMR 스펙트럼(100 MHz)이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 하기 [화학식 1]로 표시되는 소포체 선택적 형광 프로브 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00005
.
상기 [화학식 1]에 따른 화합물은 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 근적외선 영역에서 뚜력한 형광 방출, 우수한 광 안정성, 생물안정성 및 ER에 대한 높은 선택성을 가지는바, 여러 ER 스트레스 모델에서 ER 동태에 대한 효율적인 모니터링을 제공할 수 있으며 나아가 형광 바이오 탐침자 및 치료제 개발에도 효과적으로 활용될 수 있다.
한편, 본 발명은 하기 [화학식 2]의 화합물과 하기 [화학식 3]의 화합물을 반응시켜 상기 [화학식 1]의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 소포체 선택적 형광 프로브 화합물의 제조방법을 제공하며:
[화학식 2]
Figure pat00006
[화학식 3]
Figure pat00007
예를 들어, 상기 반응은 상기 [화학식 2]의 화합물('1' 로 표시)과 상기 [화학식 3]의 화합물('2'로 표시)을, 에탄올(EtOH), 피페리딘(piperidine)의 존재 및 불활성 분위기 하에서 환류 시킴으로써 수행될 수 있다(하기 반응식 1 참조).
[반응식 1]
Figure pat00008
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
물질 및 방법
물질
모든 반응은 불활성 대기하에서 화염 건조된 반응 플라스크에서 수행하였다. 모든 시약은 알드리치로부터 구입하여 사용하였다. 1H NMR 스펙트럼은 Varian (400 MHz), 13C NMR 스펙트럼은 Varian 400 (100 MHz)을 이용하여 측정하였다. 이때, chemical shifts (δ) 는 ppm, 커플링 상수(J)는 Hertz (Hz)로 표시하였다.
분광 측정
ERp 스톡 용액을 DMSO에서 제조하였다. 형광 스펙트럼의 경우, 여기(excitation)는 570-650 nm에서 수행하였고, 별도로 명시하지 않는 한 여기와 발광 슬릿 폭은 모두 5 nm이었다. 광학적 측정을 위한 모든 샘플은 1% (v/v) DMSO를 함유한 PBS 버퍼 용액에서 제조하였다(pH 7.4). 흡수 스펙트럼은 V-560 (Jasco) 분광 광도계에서 기록하였으며, 형광 스펙트럼은 상온 조건에서 제논(Xenon) 램프를 구비한 PC sspectrofluorometer (Shimadzu) 를 이용하여 기록하였다.
세포 배양 및 이미징
인간 자궁 경부암 세포주(HeLa)를 10% FBS (Gipco), penicillin (100 units/mL), 및 streptomycin (100 μg/mL)이 포함된 둘베코수정이글배지(DMEM)에서 배양하였다. 촬영 1일 전에, 37 ℃, 5% (v/v) CO2를 함유한 가습 분위기 하에서 세포를 배양하여 유리 바닥 접시(SPL)에 도말하였다. 세포 이미지는 공초점 현미경(Zeiss model LSM 510)을 이용하여 얻었다. ERp의 모든 형광 이미지는 543 nm의 여기 파장 및 긴 경로(>650 nm)의 방출 필터를 이용하여 수득하였다.
pH 적정/화합물
샘플들은 10 mM 의 시트르산, 10 mM의 monobasic potassium phosphate (KH2PO4), 10 mM Tris base가 함유된 범용 버퍼 내에서 제조하였다. 샘플의 pH 는 써모 피셔 pH 전극을 이용하여 모니터링 하면서 HCl을 첨가하여 조정하였다. CTAB (cetyl trimethylammonium bromide) 및 SDS (sodium dodecyl sulfate) 스톡 용액 10 mM 을 각각 범용 버퍼에서 제조한 후 측정 전에 희석하였다.
MTT assay
세포 생존률은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석에 의해 평가하였다. 2×105/ml의 세포를 96-웰 플레이트에서 37 ℃, 24 시간 동안 다양한 농도의 ERp로 처리하였다. 그리고 나서 MTT 작업 용액(5 mg/ml in serum free media)을 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 세포를 배양하였다. 배양 동안 불용성 포르마잔(formazan)이 형성되었고, 각 웰에 DMSO를 첨가하여 용해시켰다. 포르마잔의 양을 멀티-웰 플레이트 리더(n=3)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
소포체 선택적 형광 프로브 화합물( ERp )의 합성
[반응식 1]
Figure pat00009
상기 반응식 1에 따라 본 발명에 따른 소포체 선택적 형광 프로브 화합물(ERp)를 합성하였다.
이때, 상기 화합물 2는 종래 문헌의 절차에 따라 합성하였다(T. Zhang, K. P. Guo, L. Qiu, Y. Shen, Synth . Commun. 2006, 36, 1367-1372).
먼저, 화합물 1(0.100 g, 0.460 mmol) 및 2 (0.092 g, 0.460 mmol) 를 무수에탄올 20 ml에 용해시켰다. 피페리딘(5uL, catalytic)을 첨가한 후, 상기 혼합물은 3시간 동안 불활성 분위기하에서 환류시켰다. TLC 확인 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 형성된 녹색 침전물을 여과시키고, 에탄올, 디에틸에테르로 세척 및 건조 시켜 녹색 분말의 ERp(0.160 g, 87%)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6) δ (ppm): δ 1.65 (s, 6H), 1.81-1.86 (m, 4H), 2.53-2.58 (m, 4H), 2.63-2.66 (m, 4H), 6.68-6.72 (brs, 1H), 7.45 (s, 1H), 8.42- 8.45 (m, 1H), 9.80 (br s, 1H), 7.41 (s, 1H);
13C NMR (DMSO-d6) δ(ppm): 20.71, 21.34, 21.75, 26.86, 27.42, 50.29, 51.09, 97.33, 97.35, 106.87, 106.89, 114.37, 114.62, 115.53, 118.37, 118.39, 151.85, 158.03, 178.33, HRMS: m/z = 270.0892 [M].
결과 및 고찰
프로브 ERp는 미리 합성된 중간체로부터 한 단계 반응으로 합성하였다 (반응식 1참조)( P. Gopalan, H. E. Katz, D. J. McGee, C. Erben, T. Zielinski, D. Bousquet, D. Muller, J. Grazul and Y. Olsson, J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 1741-1747). 피페리딘의존재 하에서 에탄올 중 알데하이드(화합물 1)과 2-디시아노메틸렌-3-시아노-4,5,5-트리메틸-2,5-디하이드로퓨란(화합물 2)의 반응을 통해, 87%의 수율로 붉은색 고체의 프로브 ERp을 생성하였다. 프로브 ERp는 1H, 13C-NMR 및 질량 스펙트럼 분석을 통해 잘 특정되었다.
프로브 ERp의 광-물리적 특성을 분석하기 위해, 여러 용매 시스템에서 흡수 및 방출 스펙트럼을 관찰하였다 (도 1 참조). 상기 프로브는 아세토니트릴 중 600 nm에서 광범위한 흡수 밴드를 나타내었으나, ~30 nm의 밴드폭을 지닌 653 nm에서 강하고 뚜렷한 방출 밴드를 나타낸다. 여러 유기 용매에서의 ERp의 형광 방출 밴드(도 1B 참조)는 수용액에서의 것에 비해 향상된 강도를 지니며 약간 적색-이동되었다. 방출 밴드는 협소하며, 이의 파장은 용매의 극성 변화에 거의 영향을 받지 않으며, 이는 상기 방출 밴드가 사실상 전하 이동 특성을 지니지 않음을 의미한다(A. E. Cribb, M. Peyrou, S. Muruganandan and L. Schneider, Drug Metab. Rev., 2005, 37, 405-442.). 바닥상태 및 전자의 흥분상태 간의 쌍극자 모멘트 상의 차이가 작을 수 있다. 흥분하는 경우에 이러한 전하 분리의 부족은 주변 환경의 극성 변화에 둔감해질 것이 요구되는 이상적인 프로브에게 있어 중요한 역할을 수행케 할 수 있다. 수용액에서의 상대적으로 낮은 형광 방출 강도는 물과 프로브 ERp의 아미노기 및 하이드록실기 간의 수소 결합으로 인해 커져야 한다. 프로브의 친유적 특성 외에, 이러한 형광 방출 특성은 ERp가 세포소기관 동태에 대한 신뢰할만한 형광 트레이서에게 요구되는 여러 특성을 지녔음을 의미한다.
세포막에서의 프로브를 모사하고자 임계 미셀 농도보다 높은 농도로 수용액에서 그리고 세틸-트리메틸-암모늄 브로마이드(CTAB)와 소듐 도데실 설페이트 (SDS)의 미셀에서 형광 방출을 측정함으로써, 가변적인 환경에서 ERp의 특성을 추가로 조사하였다 (도 7 참조). 도 2A에 나타낸 바와 같이, 수용액에서의 형광 강도는 pH가 증가함에 따라 꾸준하게 증가한다. 보다 높은 pH에서의 이러한 방출 증가는 대개 하이드록실기의 이온화를 동반하는 흡수의 증가로 설명될 수 있다 (도 6 참고). 대조적으로, 도 2B 및 C에 나타낸 바와 같이 미셀의 존재 하에서 이러한 pH-의존성은 빠르게 감소하며 이는 미셀에 대한 프로브의 결합이 효과적으로 수성 환경으로부터 프로브를 보호한다는 것을 의미한다. ERp가 미셀 내부에 위치한다는 사실은 형광 강도의 극적인 증가 및 미셀의 존재에 의한 밴드의 ~ 7 nm 적색-이동에 의해 추가로 증명된다. 미셀 시스템에서 소수성 영역에 대한 프로브 ERp의 결합은 수소 결합 형성을 지연시키며, 이는 방출 강도의 상당한 증가로 이어진다. 또한, 측정된 pH 범위에서 관찰된 프로브의 형광 특성은, CTAB 및 SDS가 각각 (+)와 (-) 전하를 갖는 미셀에서 머리 부분의 전하에 의해 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 프로브가 세포에서 수용상 내보다는 막상 내에 위치될 수 있으며, 막의 전하 및 극성의 변화에 대해 사실상 민감하지 않음을 의미한다.
프로브 ERp가 간 세포 내부에 위치하는 타겟 세포소기관을 확인하기 위해, 상이한 세포소기관 탐침자들(미토-트래커, 리소-트래커 및 ER-트래커)을 이용하여 동일-위치(co-localization) 이미지 실험을 수행하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 합쳐진 공초점 이미지는 ER 트래커 이미지가 피어슨 상관계수가 0.81인 ERp 이미지 (도 3C 참조)와 잘 겹쳐짐을 증명한다. 대조적으로, 미토-트래커 및 리소-트래커는 피어슨 상관계수가 각각 0.31 및 0.54인 ERp와의 좋은 동일-위치 이미지를 생성하는데 실패하였다. 이러한 결과는 ERp가 세포의 ER 내에 선택적으로 위치함을 증명한다. 친유성 분자들이 대개 ER 내에서 대사작용을 거친다는 점을 고려하였을 때, ER 편재화에 대한 프로브의 우선도는 친유성에 기인한 것일 수 있다((a) A. Samali, U. Fitzgerald, S. Deegan and S. Gupta, Int. J. Cell Biol., 2010, 830307; (b) C. Xu, B. Bailly-Maitre and J. C. Reed, J. Clin. Invest., 2005, 115, 2656-2664.). ERp가 여러 상이한 염료를 사용하여 다색 이미지 측정에 있어 확실하게 이점을 제공할 수 있는 협소한 방출 밴드를 지닌다는 점에 주목하였으며, 이에 서로 방출 영역이 겹쳐지지 않는 ERp 및 다른 상업적으로 이용가능한 프로브들(미토-트래커RED, CMX-Ros 및 BODIPY)을 사용하여 세 가지 색상의 형광 이미지 측정을 헬라세포에서 시도하였다. 도 8은 각각의 프로브 형광에 대해서 선택적인 공초점 필터를 선택하면, 프로브의 이미지들 간에 최소 겹쳐짐을 지닌 세 가지 색상의 이미지를 얻을 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 ER-탐침자로서 ERp를 응용하는 것이 다른 트래커에 비해 여러 다색 실험을 보다 용이하게 만들 수 있음을 보여준다.
간 세포의 온라인 관찰에 있어서, 프로브의 광-안정성 및 생물학적-안정성이 또 다른 중요한 이슈가 될 수 있다. 이에 ERp의 광 안정성을 관찰하였으며, 488 및 543 nm에서 각각 동시 여기되는 경우에 미토콘드리아 트래커의 광 안정성과 비교하였다. 도 4는 ERp의 형광 강도가 처음 15분 내에서는 약간 증가하고 이후에 반복된 조사 동안에 일정하게 유지됨을 보여준다. 대조적으로, 미토-트래커의 강도는 처음 5분에서 감소하기 시작하여, 20분 내에 극적으로 감소하였다. 또한, 수용액에서 UV-조사 후의 상업적으로 이용 가능한 ER 트래커 (인비트로겐; E34251)과의 ERp의 안정성 비교는 ERp가 수성 환경에서 우수한 광-안정성을 가짐을 보여준다 (도 10 참조). 또한, ERp를 여러 농도에서 24 시간 동안 세포와 배양시켰을 경우(도 11 참조), 세포 생존율은 프로브의 고농도(10 mM)에서도 영향을 받지 않았으며, 이를 통해 생체적합성을 증명하였다. 이러한 결과는 ERp 프로브가 높은 광-안정성 뿐만 아니라 세포 내에서 추정되는 분해성 물질대사로부터 생물학적-안정성을 지닌다는 것을 의미한다.
도 2 내지 4 및 도 7 내지 10에 나타낸 바와 같이, 이러한 환경 둔감성, ER 편재화 및 광/생물학적-안정성을 이용하여, ER에서 새롭게 합성된 단백질의 N-글리코실화를 억제함으로써 ER 스트레스를 유도할 수 있도록 3 시간 동안 튜니카마이신으로 처리한 세포에서 ERp의 공초점 현미경으로 ER 스트레스를 관찰하였다(A. E. Cribb, M. Peyrou, S. Muruganandan and L. Schneider, Drug Metab. Rev., 2005, 37, 405-442.). 도 5에서는, ERp의 형광 이미지의 시간 과정을 GFP-튜불린의 형광 이미지와 함께 그 결과를 보여주며, 여기서 튜불린은 활면 소포체 구조와 관련된 주요 세포골격이다. 두 가지의 흥미로운 현상이 나타났다: (i) 세포의 핵 주변에 축적된 ERp의 형광 강도, 및 (ii) 세포 구조 도처에서 감소된 GFP-튜불린 방출. 튜불린의 약화된 강도는, 활면 소포체 구조가 튜불린-기반 세포골격에 의해 지지되고 ER 스트레스에 민감하다는 점에 의한 것으로 예상된다((a) S. Schuck, W. A. Prinz, K. S. Thorn, C. Voss and P. Walter, J. Cell Biol., 2009, 187, 525-536; (b) S. Varadarajan, E. T. Bampton, J. L. Smalley, K. Tanaka, R. E. Caves,M. Butterworth, J.Wei,M. Pellecchia, J. Mitcheson, T. W. Gant, D. Dinsdale and G. M. Cohen, Cell Death Differ., 2012, 19, 1896-1907.). ER 스트레스에 의해 핵 주변에 ERp 강도의 축적은, 활면 소포체 막이 확대된 ER을 지닌 핵 주변부에서 점점 줄어든다는 최근의 발견과 밀접한 관련성이 있을 것이다(J. R. Lakowicz, Chapter 6: Solvent effects on emission spectra, in Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2nd edn, 1999, pp. 185-210.). 유사한 결과가 RFP-ER, 적색 형광 단백질로 구성된 ER 단백질 탐침자, 칼레티쿨린 신호 펩타이드 및 KDEL 펩타이드를 사용하여 추가로 확인되었으며, 그 결과는 도 9에 나타나 있다. 결과적으로 본 발명에 따른 ERp가 ER 스트레스 동안 ER 막구조의 변화를 관찰할 수 있다는 점은 명백히 증명되었는바, ERp는 일반적인 ER 동태의 조사를 위한 다목적 도구로 유용하게 활용될 수 있다.
결론적으로, 본 발명에 따른 ERp는 약 600 nm에서 최대 흡수를 지닌 적외선 근처에서 협소하면서도 강한 방출 밴드를 보여주었으며, 광범위한 pH 및 미셀에서 극성 머리 부분의 유형에 대해서 덜 민감한 특성을 보여주었다. 또한, 소포체에서 편재화되고 세포에서 우수한 광 및 생물학적 안정성을 보여주었다. 마지막으로, 본 발명에 따른 ERp는 ER 스트레스 유도인자에 의한 ER 구조의 동적 변화를 보여주었는바, 이를 통해 본 발명에 따른 ERp가 안정한 ER 트래커일 뿐만 아니라 ER 스트레스 모델에서 ER 동태 조사를 위한 우수한 프로브로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (2)

  1. 하기 [화학식 1]로 표시되는 소포체 선택적 형광 프로브 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00010
    .
  2. 하기 [화학식 2]의 화합물과 하기 [화학식 3]의 화합물을 반응시켜 하기 [화학식 1]의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 소포체 선택적 형광 프로브 화합물의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00011

    [화학식 3]
    Figure pat00012

    [화학식 1]
    Figure pat00013
    .
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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