KR20180041082A - Composition of therapeutic agent containing microrna for treatment of atopy dermatitis - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 짧은 간섭 RNA에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 microRNA를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to short interfering RNA having a therapeutic effect on atopic dermatitis, and more particularly to a composition for treating atopic dermatitis comprising microRNA as an active ingredient.
아토피성 피부염은 현대인에게 빈번하게 발생되고 있는 의학적으로 원인이 불분명한 만성적 피부질환이다. 아토피성 피부염은 일반적으로 인간 면역체계의 불균형에 의해 초래된 질환으로 알려져 있다. 우리 몸의 면역은 B 림프구가 주관하는 체액성 면역과 T 림프구가 주관하는 세포성 면역으로 이루어져 있다.Atopic dermatitis is a chronic skin disease that is medically undetermined and frequently occurring in modern humans. Atopic dermatitis is generally known as a disease caused by an imbalance of the human immune system. Our body's immune system consists of humoral immunity mediated by B lymphocytes and cellular immunity mediated by T lymphocytes.
세포성 면역을 주관하는 T 세포에는 Tc-세포와 Th-세포가 있으며, Th-세포는 Th-1과 Th-2로 구분된다. 상기 Th-1과 Th-2의 균형이 깨져 Th-2의 양이 갑자기 늘어나고 Th-1의 양이 줄어들면 알레르기 질환, 즉 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 등의 질환이 발생하며, 반대로 Th-1의 양이 많이 늘어나게 되면 자가 면역 질환이 초래된다. 따라서 Th-2 면역반응의 과민은 아토피성 피부질환의 핵심요소이다. Th-2 면역반응은 즉시형 과민반응으로 IL-4, IL-5, IL-13 사이토카인의 분비를 매개로 이루어지며, IL-4와 IL-13은 B 세포의 isotype을 자극하고 IgE의 생성을 조절한다.T-cells and Th-cells are involved in T-cells that mediate cell-mediated immunity, and Th-cells are divided into Th-1 and Th-2. When the amount of Th-2 is suddenly increased and the amount of Th-1 is decreased, the allergic diseases such as atopic dermatitis, allergic rhinitis and allergic asthma occur, Conversely, when the amount of Th-1 is increased, an autoimmune disease is caused. Thus, the hypersensitivity of the Th-2 immune response is a key component of atopic skin disease. The IL-4 and IL-13 stimulate the isotype of B cells and the production of IgE by the IL-4, IL-5 and IL-13 cytokines .
최근 들어 국내외적으로 아토피성 피부염 발병이 소아에서 성인에 이르기까지 광범위하게 발생하고 있어 치료제의 개발이 시급하다. 현재 스테로이드 계열의 아토피성 피부염 억제제가 치료제로 사용되고 있으나, 아토피성 피부염의 원천적인 해결방법이 아닌 일시적인 경감효과를 보여주며 동시에 내성이 생기는 부작용이 알려져, 적절하고 광범위한 치료제 개발이 필요한 실정이다.Recently, the incidence of atopic dermatitis has developed extensively from childhood to adulthood, so it is urgent to develop a therapeutic agent. Currently, steroid-based atopic dermatitis inhibitors are used as therapeutic agents. However, it is not a primary solution for atopic dermatitis but a temporal relief effect and at the same time a side effect of tolerance is known.
한편, CCL22는 T 세포에서 Th-2 phenotype의 CD+ T 세포들을 선택적으로 발현하는 CCR4의 리간드로써, 정상 환자군에 비해 아토피성 피부염 환자군에서 CCL22의 혈중 농도가 급격히 증가되어 있다.On the other hand, CCL22 is a ligand of CCR4 that selectively expresses CD2 + T cells of Th-2 phenotype in T cells. The concentration of CCL22 in the atopic dermatitis patients is rapidly increased compared with that of normal patients.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 CCL22의 혈중 농도를 조절하는 microRNA 개발을 위해 예의 연구 노력한 결과, 21 ~ 25개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 단일 염기가닥인 microRNA를 이용하여 아토피성 피부염이 유발된 실험군에 피하주사하는 경우, Th-2 면역반응의 지표인 IL-4의 발현을 감소시키고, Th-1 면역반응의 지표인 IFN-γ의 발현을 증가시키며, 또한 아토피 질환의 지표인 IgE의 면역반응을 급격히 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.In order to overcome the problems of the prior arts, the inventors of the present invention have conducted intensive research to develop microRNAs that regulate the blood concentration of CCL22. As a result, they have found that using microRNA, a single nucleotide base composed of about 21 to 25 nucleotides, Subcutaneous injection in the induced experimental group reduces the expression of IL-4, which is an index of Th-2 immune response, increases the expression of IFN-y, which is an index of Th-1 immune response, and is an indicator of atopic disease IgE < / RTI > can be rapidly reduced, and the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 microRNA를 이용한 아토피성 피부염 치료제를 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a therapeutic agent for atopic dermatitis using microRNA.
본 발명의 다른 목적은 microRNA를 피하주사함으로써 IL-4와 IgE의 발현을 감소시키고, IFN-γ의 발현을 증가시켜 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 microRNA 함유 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a microRNA-containing composition having a therapeutic effect on atopic dermatitis by reducing the expression of IL-4 and IgE by subcutaneous injection of microRNA and increasing the expression of IFN-y.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 microRNA를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.According to an embodiment of the present invention, there is provided a composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising microRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
일 측에 따르면, 상기 조성물은 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 microRNA 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.According to one aspect, the composition may further comprise one or more of the microRNAs represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
일 측에 따르면, 상기 조성물은 IL-4(interleukin 4)의 발현을 감소시킬 수 있다.According to one aspect, the composition may reduce the expression of IL-4 (interleukin 4).
일 측에 따르면, 상기 조성물은 IFN-γ(Interferon gamma)의 발현을 증가시킬 수 있다.According to one aspect, the composition may increase the expression of IFN-y (Interferon gamma).
일 측에 따르면, 상기 조성물은 IgE(immunoglobulin E)의 발현을 감소시킬 수 있다.According to one aspect, the composition may reduce the expression of IgE (immunoglobulin E).
일 측에 따르면, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.According to one aspect, the composition may be a pharmaceutical composition.
본 발명에 따르면 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p microRNA를 제조할 수 있으며, 상기 유전자를 이용하여 아토피성 피부염의 유발을 억제시킬 수 있다.According to the present invention, miR-432-3p, miR-222-3p and miR-23a-3p microRNA can be produced, and the gene can be used to inhibit the induction of atopic dermatitis.
따라서, 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p microRNA를 이용한 치료제는 난치성 질환으로 적절한 치료제가 부재한 아토피성 피부질환의 치료 및 예방제로서 의약산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.Therefore, a therapeutic agent using miR-432-3p, miR-222-3p, and miR-23a-3p microRNA having therapeutic effect for atopic dermatitis is a therapeutic agent for the treatment and prevention of atopic skin diseases in which there is no suitable therapeutic agent for intractable disease And can be very usefully used in industries.
도 1은 miR-432-3p microRNA를 포함하는 조성물에 의해 피부염증 마우스의 가려움증을 억제한 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 miR-432-3p microRNA를 포함하는 조성물에 의해 피부염의 유발 항체인 IgE의 발현을 억제한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 miR-432-3p microRNA를 포함하는 조성물에 피부염을 유도시킨 마우스에서 피부의 염증 완화를 나타낸 것이다.
도 4는 miR-432-3p microRNA의 발현 수준 및 아토피성 피부염의 환자의 중증도와 IgE 발현 수준을 측정한 것이다.
도 5는 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p microRNA 제제를 투여한 피부염 쥐에서의 IL-4 발현양상을 나타낸 것이다.
도 6은 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p microRNA 제제를 투여한 피부염 쥐에서의 IFN-γ 발현양상을 나타낸 것이다.
도 7은 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p microRNA 제제를 투여한 피부염 쥐에서의 IgE 발현양상을 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the effect of inhibiting itching of skin-inflamed mice by a composition comprising miR-432-3p microRNA.
Fig. 2 shows the results of suppressing the expression of IgE, a dermatitis-inducing antibody, by a composition containing miR-432-3p microRNA.
Figure 3 shows the inflammation relief of the skin in mice that induced dermatitis in a composition comprising miR-432-3p microRNA.
Figure 4 shows the expression levels of miR-432-3p microRNA and severity of patients with atopic dermatitis and IgE expression levels.
FIG. 5 shows IL-4 expression patterns in dermatitis mice to which miR-432-3p, miR-222-3p and miR-23a-3p microRNA preparations were administered.
FIG. 6 shows IFN-y expression patterns in dermatitis mice to which miR-432-3p, miR-222-3p and miR-23a-3p microRNA preparations were administered.
Fig. 7 shows IgE expression patterns in dermatitis mice to which miR-432-3p, miR-222-3p and miR-23a-3p microRNA preparations were administered.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.In the following, embodiments will be described in detail with reference to the accompanying drawings. Like reference symbols in the drawings denote like elements.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Various modifications may be made to the embodiments described below. It is to be understood that the embodiments described below are not intended to limit the embodiments, but include all modifications, equivalents, and alternatives to them.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terms used in the examples are used only to illustrate specific embodiments and are not intended to limit the embodiments. The singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, the terms "comprises" or "having" and the like refer to the presence of stated features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof, But do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps, operations, elements, components, or combinations thereof.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this embodiment belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries are to be interpreted as having a meaning consistent with the contextual meaning of the related art and are to be interpreted as either ideal or overly formal in the sense of the present application Do not.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.In the following description of the present invention with reference to the accompanying drawings, the same components are denoted by the same reference numerals regardless of the reference numerals, and redundant explanations thereof will be omitted. In the following description of the embodiments, a detailed description of related arts will be omitted if it is determined that the gist of the embodiments may be unnecessarily blurred.
본 발명의 일 실시예에 따르면, miR-432-3p microRNA를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.According to one embodiment of the present invention, there is provided a composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising miR-432-3p microRNA as an active ingredient.
상기 microRNA는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 microRNA인 것을 특징으로 한다. 상기 microRNA는 21개 뉴클레오티드의 miR-432-3p microRNA의 염기서열로써, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 염기서열과 이와 상보적인 서열을 포함하는 이중가닥(double-strand) siRNA(small interfering RNA)일 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1의 microRNA를 합성하여 사용하였다. 상기 microRNA는 CCL22 유전자 등의 발현을 억제하는 과정을 통해 유전자 기능을 억제할 수 있다. 또한, 상기 microRNA 내지 이를 포함하는 조성물은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 microRNA 및/또는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 microRNA를 더 포함할 수 있다. 서열번호 2 및 서열번호 3의 microRNA는 각각 miR-222-3p 및 miR-23a-3p에 해당하는 것으로, 이들은 miR-432-3p와 함께 아토피성 피부염 치료에 효과적으로 작용할 수 있다.The microRNA is a microRNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The microRNA is a nucleotide sequence of miR-432-3p microRNA of 21 nucleotides, preferably a double-stranded siRNA (small interfering RNA) comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a complementary sequence thereof. . In the present invention, the microRNA of SEQ ID NO: 1 was synthesized and used. The microRNA can inhibit gene function by inhibiting the expression of CCL22 gene and the like. In addition, the microRNA and the composition comprising the microRNA may further comprise a microRNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and / or a microRNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. The microRNAs of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 correspond to miR-222-3p and miR-23a-3p, respectively, which together with miR-432-3p can be effective in treating atopic dermatitis.
아래 표 1은 microRNA에 쓰이는 miR-432-3p, miR-222-3p, miR-23a-3p microRNA의 서열을 나타낸 것이다.Table 1 below shows the sequences of miR-432-3p, miR-222-3p and miR-23a-3p microRNA used in microRNA.
본 발명에 따른 microRNA 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)" 된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다.A microRNA polynucleotide sequence according to the present invention may be operably linked to an expression control sequence, wherein the operably linked gene sequence and expression control sequence are operably linked to a single expression comprising a selectable marker and a replication origin Vector. Said "operably linked" may be a gene and expression control sequence linked in such a way as to enable gene expression when a suitable molecule is coupled to an expression control sequence.
상기 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.The expression control sequence refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked to a particular host cell. Such regulatory sequences include promoters for conducting transcription, any operator sequences for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, sequences controlling the termination of transcription and translation.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 miR-432-3p microRNA를 아토피와 유사한 피부병을 유발시킨 마우스 모델에 상기 miR-432-3p microRNA를 피하에 투여함으로써 그에 의한 아토피성 피부질환의 예방 및 치료효과를 투여시키지 않은 대조군과 비교분석하여 확인하였다.In a specific example of the present invention, miR-432-3p microRNA is subcutaneously administered to a mouse model causing atopic dermatosis-like skin disease to thereby prevent and treat atopic skin diseases And compared with the control group.
분석 결과 도 1 내지 3에 나타낸 것과 같이, 대조군 시약을 피하투여한 경우 아토피성 피부염을 오히려 증가시켰으나, miR-432-3p microRNA를 피하투여한 경우 아토피성 피부염을 치료하는 효과가 나타남을 확인하였다.As a result of the analysis, as shown in FIGS. 1 to 3, subcutaneous administration of the control reagent increased the atopic dermatitis, but it was confirmed that the subcutaneous administration of miR-432-3p microRNA resulted in the treatment of atopic dermatitis.
구체적으로, 상기 miR-432-3p microRNA를 포함하는 조성물은 Th-2 면역반응의지표인 IL-4(interleukin 4)의 발현을 감소시키고, Th-1 면역반응의 지표인 IFN-γ(Interferon gamma)의 발현을 증가시키며, 아토피성 피부염 질환의 지표인 IgE(immunoglobulin E)의 발현을 감소시킴으로써 아토피성 피부염의 예방 내지 치료 효과를 나타낼 수 있다.Specifically, the composition containing the miR-432-3p microRNA reduces the expression of IL-4 (interleukin 4) which is an index of Th-2 immune response and IFN-γ (Interferon gamma ) And decreases the expression of IgE (immunoglobulin E), which is an indicator of atopic dermatitis disease, and thus can prevent or treat atopic dermatitis.
상기 miR-222-3p microRNA는 상기 miR-432-3p microRNA와 유사하게 IL-4 및 IgE의 발현을 감소시키고, IFN-γ의 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 miR-23a-3p microRNA는 IgE의 발현을 감소시킬 수 있다.The miR-222-3p microRNA can reduce the expression of IL-4 and IgE and increase the expression of IFN-y similarly to the miR-432-3p microRNA. In addition, the miR-23a-3p microRNA can reduce the expression of IgE.
이에 따라, 상기 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p은 모두 아토피성 피부염의 예방 내지 치료 효과를 나타낼 수 있고, 더욱이 이들을 혼합하여 사용하는 경우 그 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.Accordingly, miR-432-3p, miR-222-3p, and miR-23a-3p can all exhibit the preventive or therapeutic effect of atopic dermatitis, and when they are used in combination, the effect can be further improved have.
본 발명에 있어서, 상기 microRNA는 miR-432-3p, miR-222-3p, miR-23a-3p microRNA의 개열지도일 수 있다. 본 발명에서 아토피성 피부염 치료 효과를 유도하는 miR-432-3p, miR-222-3p, miR-23a-3p microRNA는 통상 사용되는 유전자 합성에 의해 제조 가능하며, 제조된 microRNA를 체내에 도입시킬 때, 상기 microRNA는 바이러스 벡터나 플라스미드 벡터 등에 의해서도 발현될 수 있다.In the present invention, the microRNA may be a cleavage map of miR-432-3p, miR-222-3p, miR-23a-3p microRNA. MiR-432-3p, miR-222-3p, and miR-23a-3p microRNAs that induce the therapeutic effect of atopic dermatitis in the present invention can be produced by commonly used gene synthesis. When microRNAs are introduced into the body , The microRNA can be expressed by a viral vector, a plasmid vector or the like.
한편, 상기 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다.Meanwhile, the composition for preventing or treating atopic dermatitis may be a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition may be prepared by a method known in the pharmaceutical field for use as a pharmaceutical agent, and may be prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent or the like to prepare a powder, granule, tablet, capsule, And can be manufactured and used as a formulation. They may also be administered parenterally (e. G., Intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally.
상기 치료용 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 질병의 증상, 투여시간, 투여방법에 따라 적적히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.001 ~ 100㎎이 투여될 수 있다.The therapeutic composition may be administered in a therapeutically effective amount. The term "therapeutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and includes the age, sex, weight, , The time of administration, and the method of administration, and preferably 0.001 to 100 mg per day on an adult basis may be administered.
실시예Example 1: One: microRNA의microRNA 선별 및 제작 Selection and production
인체 비만세포주(hmc-1)와 PMA/IONOMYCIN을 처리하여 염증유사활성이 유도된 인체 비만세포주(hmc-1)를 배양하였다. 배양된 세포주 107 cell을 수득하여 세포내 microRNA를 microRNA Isolation kit(quiagen, germany)를 이용하여 수집하였다.The human obesity cell line (hmc-1) and the PMA / IONOMYCIN were treated to cultivate human obesity cell line (hmc-1) induced inflammation-like activity. 10 7 cells of the cultured cell line were obtained and microRNAs in the cells were collected using a microRNA isolation kit (quiagen, germany).
수집된 세포내 microRNA들을 human microRNA array 분석을 통해서 염증관련된 서열번호 1의 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p microRNA를 선별하였다. 선별된 microRNA는 miRBASE를 활용하여 서열을 확인 분석하였으며, 이에 해당하는 microRNA를 바이오니어(한국 대전) 바이오텍 회사로부터 합성하여 시험에 준비하였다.MiR-432-3p, miR-222-3p, and miR-23a-3p microRNAs of inflammation-related SEQ ID NO: 1 were selected through human microRNA array analysis of collected microRNAs. The selected microRNAs were identified and analyzed using miRBASE, and the corresponding microRNAs were synthesized from Bioni (Korea Daejeon) Biotech Company and prepared for the test.
실시예Example 2: 2: 생체내In vivo (in (in vivovivo ) 실험을 위한 아토피성 피부염 모델 제조 및 아토피성 피부염 지표 측정) Production of atopic dermatitis model for the experiment and measurement of atopic dermatitis index
5주령의 ICR mouse를 5 마리씩 대조군과 실험군의 두 그룹으로 나눈 후, 각각 피부병 유발 물질인 DNCB를 1%의 농도로 1주일간 100㎕씩 도포하여 아토피와 유사한 피부병을 유발시켰다. 이후, 실험군 쥐에 각각의 miR-432-3p microRNA를 (1-10㎍/mouse)의 농도로 PBS에 혼합된 상태로 피하주사 하였다. 투여 일주일 경과 시점에 안와채취법을 이용하여 각각의 쥐의 혈청을 추출하였고, 아토피성 피부염의 지표인 IL-4, IFN-γ, IgE의 혈청 내 적정농도를 구하기 위해 ELISA 실험을 수행하였다. 상기 IL-4는 아토피를 유도하는 사이토카인이고, IFN-γ는 아토피를 억제시키는 사이토카인이며, IgE는 아토피 피부염을 유발하는 항체이다.5-week-old ICR mice were divided into two groups: control and experimental groups. DNCB, a skin disease inducing substance, was applied at a concentration of 1% for 1 week to induce atopic dermatosis. The mice were then subcutaneously injected with each miR-432-3p microRNA (1-10 μg / mouse) in PBS. Serum of each rat was extracted using orbital harvesting method one week after the administration, and ELISA experiments were performed to determine the titers of IL-4, IFN-γ and IgE, which are indicators of atopic dermatitis, in serum. The IL-4 is a cytokine that induces atopy, IFN-y is a cytokine that suppresses atopy, and IgE is an antibody that induces atopic dermatitis.
실험 결과 도 1에 나타낸 것과 같이 miR-432-3p microRNA를 피부염이 유발된 쥐에 투여한 경우, 피부염증의 지표인 가려움증 정도가 감소하였으며, 도 2에 나타낸 것과 같이 아토피 질환의 지표인 IgE 면역반응이 급격히 감소하였다.Experimental Results As shown in Fig. 1, when miR-432-3p microRNA was administered to dermatitis-induced rats, the degree of itching, which is an index of skin inflammation, was decreased. As shown in Fig. 2, IgE immunoreaction Respectively.
또한 도 3에 나타낸 것과 같이 miR-432-3p microRNA를 투여한 실험군의 경우 가려움증 및 피부염의 증상완화가 눈에 띄게 감소함을 볼 수 있었다.In addition, as shown in Fig. 3, it was observed that the symptom relief of itching and dermatitis was remarkably reduced in the case of miR-432-3p microRNA-administered experimental group.
실시예Example 3: 3: 환자에서의In patients miRmiR -432-3p 검출 및 중증도와의 연관성 확인-432-3p Detection and association with severity
아토피 피부염 환자로부터 혈액 2cc를 수집하고 microRNA를 추출하여 miR-432-3p microRNA의 발현 수준을 qPCR 시험으로 확인한 뒤, 환자의 피부염증 중증도와 IgE 측정 값을 비교하였고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 결과와 같이, 환자의 피부염증 중증도와 IgE는 역상관관계에 있음을 확인하였다.2 cc of blood was collected from patients with atopic dermatitis and microRNA was extracted and miR-432-3p microRNA expression level was confirmed by qPCR test. Then, skin inflammation severity and IgE measurement value were compared with each other, and the results are shown in FIG. As shown in FIG. 4, it was confirmed that the severity of skin inflammation in the patient was inversely correlated with IgE.
실시예Example 4: 4: microRNA의microRNA 사이토카인 조절 확인 Check cytokine regulation
1) 동물모델 내 화학적 피부염 유발1) inducing chemical dermatitis in animal models
상기 실시예 2와 같이 5~6주령이 된 ICR 마우스(SLC. Japan)의 등 부위를 제모한 후에 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 이후, 아세톤과 올리브오일이 3:1의 부피비로 혼합된 용액에 1% DNCB(Sigma, USA)가 혼합된 반응액을 준비하여 혼합액 200㎕를 마우스의 등 부위에 도포하였다. 도포 4일 후부터 1주일에 2-3번씩 0.2% DNCB용액 150㎕를 등 부위에 도포하였다.The ICR mice (SLC, Japan), which was 5 to 6 weeks of age, were depilated as in Example 2, and left to stand for 24 hours to heal the skin micro-wounds. Thereafter, a reaction solution in which 1% DNCB (Sigma, USA) was mixed with a mixture of acetone and olive oil in a volume ratio of 3: 1 was prepared and 200 쨉 l of the mixed solution was applied to the back region of a mouse. After 4 days from the application, 150 쨉 l of a 0.2% DNCB solution was applied 2-3 times a week to the back region.
4-5주 처리 후에 피부염이 유발되었음을 확인하였고, 이 상태에서 105 생균수/회의 젖산균주와 박테리아 코팅 금(Ag)을 마우스에 경구투여하고 피부도포하여 증상 변화를 관찰하였다. 이 때, 대조군으로는 PBS용액 200㎕를 피하주사한 마우스를 사용하였다.After 4-5 weeks of treatment, it was confirmed that dermatitis was induced. In this condition, 10 5 live cells / lactic acid bacteria and bacterial coated gold (Ag) were orally administered to mice and skin changes were observed. At this time, as a control group, mice subcutaneously injected with 200 μl of PBS solution were used.
2) 2) microRNA에microRNA 의한 by IgEIgE 발현 억제 및 사이토카인의 발현 변화 확인 Inhibition of expression and confirmation of expression of cytokine
상기 실시예1에서 제작한 miR 432-3p, miR-222-3p, miR-23a-3p microRNA와 기타 miR(miR-4507, miR-CON)을 마우스에 피하주사한 뒤, 2주 경과 시점에 쥐의 눈에서 혈액을 채취하여 IgE의 발현 양상을 측정하였다. 또한, 사이토카인의 변화는 동일 혈액샘플을 가지고 ELISA 실험법(참고문헌: Shibayagi ELISA KIT protocol, Shibayaki.co.Japan)을 통해서 확인하였다.Mice were subcutaneously injected with miR 432-3p, miR-222-3p, miR-23a-3p microRNA prepared in Example 1 and other miR (miR-4507, miR-CON) mice, Blood was collected from the eyes of the mice and the expression pattern of IgE was measured. In addition, changes in cytokines were confirmed by ELISA assay (Shibayagi ELISA KIT protocol, Shibayaki.co.jp) with the same blood samples.
도 5 내지 7은 각각 miR-432-3p, miR-222-3p, miR-23a-3p 및 기타 microRNA 제제를 피하주사한 후 피부염 쥐에서의 IL-4, IFN-γ 및 IgE의 발현양상을 비교한 것이다. 도 5를 참고하면, miR-432-3p, miR-222-3p 제제의 경우 miR-CON 대조군에 비해 알레르기 증상의 악화인자인 IL-4의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있다.FIGS. 5 to 7 show the expression patterns of IL-4, IFN-γ and IgE in dermatitis rats after subcutaneous injection of miR-432-3p, miR-222-3p, miR-23a-3p and other microRNA preparations It is. Referring to FIG. 5, it can be seen that the expression of miR-432-3p and miR-222-3p inhibits the expression of IL-4, which is an exacerbation factor of allergic symptoms, as compared with the miR-CON control.
또한, 도 6을 참고하면 miR-432-3p, miR-222-3p 제제를 피하주사한 뒤 피부염 쥐에서 IFN-γ의 발현은 증가되었음을 확인할 수 있고, 도 7을 참고하면 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p 제제의 경우 IgE의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있다.6, the expression of IFN-y was increased in dermatitis rats after subcutaneous injection of miR-432-3p and miR-222-3p preparations. As shown in Fig. 7, miR-432-3p, miR-222-3p and miR-23a-3p preparations inhibit the expression of IgE.
본 발명의 miR-432-3p, miR-222-3p 및/또는 miR-23a-3p 제제가 아토피 피부염의 억제인자 중 하나인 인터페론 감마(Interferon-gamma)의 발현을 높이고 동시에 면역글로불린 E(IgE)의 발현을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있다. 특히 본 발명의 조성물은 피부도포시 피부염을 증가시키는 면역글로불린 E(IgE)의 억제효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.The miR-432-3p, miR-222-3p and / or miR-23a-3p agents of the present invention enhance the expression of interferon-gamma, one of the inhibitors of atopic dermatitis, while enhancing the immunoglobulin E (IgE) Of the present invention. In particular, the composition of the present invention was found to have the highest inhibitory effect of immunoglobulin E (IgE), which increases dermatitis in skin application.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p microRNA를 제조할 수 있으며, 상기 유전자를 이용하여 아토피성 피부염의 유발을 억제시킬 수 있다.As described above, miR-432-3p, miR-222-3p and miR-23a-3p microRNA can be produced according to the present invention, and the gene can be used to inhibit the induction of atopic dermatitis.
상기 실시예를 살펴본 바와 같이, miR-432-3p, miR-222-3p 및/또는 miR-23a-3p microRNA를 피부염이 유발된 쥐에 투여한 경우, 아토피 피부염의 활성인자 중 하나인 IL-4의 발현을 억제시키고, 억제인자인 IFN-γ의 발현을 증가시켰으며 동시에 아토피 질환의 지표인 IgE의 면역반응을 억제시키는 효과를 확인할 수 있었다. 또한 상기 면역반응의 결과로 아토피성 피부염의 증상인 가려움증 및 피부염의 증상완화 효과가 나타남을 확인하였다. 따라서, 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 miR-432-3p, miR-222-3p 및 miR-23a-3p microRNA를 이용한 치료제는 난치성 질환으로 적절한 치료제가 부제한 아토피성 피부질환의 치료 및 예방제로서 의약산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.When miR-432-3p, miR-222-3p and / or miR-23a-3p microRNA were administered to dermatitis-induced rats, IL-4, one of the active factors of atopic dermatitis, And suppressed the immune response of IgE, which is an indicator of atopic disease, at the same time. In addition, as a result of the above immune response, it was confirmed that the symptoms of atopic dermatitis, that is, itching and dermatitis, Therefore, the therapeutic agent using miR-432-3p, miR-222-3p and miR-23a-3p microRNA having therapeutic effect for atopic dermatitis is a therapeutic agent for the treatment and prevention of atopic skin diseases, And can be very usefully used in industries.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. For example, if the techniques described are performed in a different order than the described methods, and / or if the described components are combined or combined in other ways than the described methods, or are replaced or substituted by other components or equivalents Appropriate results can be achieved.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.Therefore, other implementations, other embodiments, and equivalents to the claims are also within the scope of the following claims.
<110> KOREA UNIVERSITY <120> COMPOSITION OF THERAPEUTIC AGENT CONTAINING MICRORNA FOR TREATMENT OF ATOPY DERMATITIS <130> APC-2016-0401 <150> KR 10-2016-0133041 <151> 2016-10-13 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-432-3p <400> 1 cuggauggcu ccuccauguc u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-222-3p <400> 2 agcuacaucu ggcuacuggg u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-23a-3p <400> 3 aucacauugc cagggauuuc c 21 <110> KOREA UNIVERSITY <120> COMPOSITION OF THERAPEUTIC AGENT CONTAINING MICRORNA FOR TREATMENT OF ATOPY DERMATITIS <130> APC-2016-0401 <150> KR 10-2016-0133041 <151> 2016-10-13 <160> 3 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-432-3p <400> 1 cuggauggcu ccuccauguc u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-222-3p <400> 2 agcuacaucu ggcuacuggg u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-23a-3p <400> 3 aucacauugc cagggauuuc c 21
Claims (6)
A composition for preventing or treating atopic dermatitis, which comprises microRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
상기 조성물은 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 microRNA 중 하나 이상을 더 포함하는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the composition further comprises at least one of the microRNAs represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, for the prevention or treatment of atopic dermatitis.
상기 조성물은 IL-4(interleukin 4)의 발현을 감소시키는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물.
3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the composition reduces the expression of IL-4 (interleukin 4), a composition for preventing or treating atopic dermatitis.
상기 조성물은 IFN-γ(Interferon gamma)의 발현을 증가시키는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물.
3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the composition increases the expression of IFN-y (Interferon gamma), a composition for preventing or treating atopic dermatitis.
상기 조성물은 IgE(immunoglobulin E)의 발현을 감소시키는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물.
3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein the composition reduces the expression of IgE (immunoglobulin E), for the prevention or treatment of atopic dermatitis.
상기 조성물은 약학적 조성물인, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물.3. The method according to claim 1 or 2,
A composition for preventing or treating atopic dermatitis, wherein the composition is a pharmaceutical composition.
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|---|---|---|---|---|
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- 2017-10-13 KR KR1020170133348A patent/KR101998478B1/en active IP Right Grant
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| KR102132221B1 (en) * | 2019-02-11 | 2020-07-09 | 강원대학교산학협력단 | Regulation mechanism of allergic reaction by miR-154-5p, and use thereof |
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