KR102132221B1 - Regulation mechanism of allergic reaction by miR-154-5p, and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 miR-154-5p에 의한 알레르기 반응 조절 매커니즘 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 검사대상의 알레르기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 miR-154-5p의 발현수준을 측정하는 방법, miR-154-5p의 활성 저해물질을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 miR-154-5p에 의한 알레르기 반응 조절 메커니즘을 이용한 알레르기 질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a mechanism for regulating an allergic reaction by miR-154-5p and use thereof, specifically measuring the expression level of miR-154-5p from a sample to provide information necessary for diagnosis of an allergic disease of a test subject Method, a pharmaceutical composition for preventing or treating allergic diseases containing an active inhibitor of miR-154-5p as an active ingredient, and a screening method for treating allergic diseases using a mechanism for regulating allergic reactions by miR-154-5p.
마이크로 RNA(miRNA)는 일반적으로 21 ~ 23 뉴클레오티드로 구성된 작은 길이의 RNA로서 표적 유전자의 3'-UTR(untranslated region)에 결합하여 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는 것으로 알려져 있다. SiRNA(small interfering RNA)와는 달리 3'-UTR(untranslated region)과의 결합에서 완전한 상보성을 요구하지 않기 때문에 다수의 표적 유전자들을 갖고 있다. 이러한 miRNA 모방 분자(miR-mimic)는 miRNA 유전자의 발현을 증가시키고 miRNA 억제분자(miR-inhibitor)는 miRNA 유전자의 발현 수준을 감소시킬 수 있다.Micro RNA (miRNA) is a small length RNA generally composed of 21 to 23 nucleotides, and is known to bind to a 3'-UTR (untranslated region) of a target gene and reduce the expression level of the target gene. Unlike small interfering RNA (SiRNA), it does not require complete complementarity in binding with a 3'-UTR (untranslated region), so it has multiple target genes. The miRNA mimic molecule (miR-mimic) increases the expression of the miRNA gene, and the miRNA inhibitory molecule (miR-inhibitor) decreases the expression level of the miRNA gene.
많은 결과들에서 마이크로 RNA들이 염증반응에 관련함이 밝혀졌다. miR-384-HDAC3 feedback loop는 알레르기 반응과 알레르기 반응이 촉진하는 종양생성력증가와 암전이력 증가를 조절하는 것으로 보고되었고(Eom et al., 2014), miR-155 감소는 SOCS1 발현을 증가시킴으로써 항염증 효과를 유도하며(Lv et al., 2015), miR-155는 SOCS1을 표적으로 하여 STAT3와 NF-kB 신호전달을 증가시킴으로써 동맥경화에 따른 염증반응을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다(Yang et al., 2015). 전신성 홍반성낭창에서 감소하는 miR-155는 SOCS1의 발현을 증가시키며(Rasmussen et al., 2015), miR-155는 SOCS1을 표적으로 하여 장 염증을 증가시키고(Pathak et al., 2015), SOCS1의 발현을 억제하여 혈관신생을 억제하는 것으로 보고되었다(Pankratz et al., 2015). 또한, 바이러스에 의한 중추신경계의 염증은 뇌세포에서의 SOCS1 mRNA 발현 증가에 기인하며(Steffensen et al., 2014), miR-122a-SOCS1 feedback loop은 알레르기 반응과 알레르기 반응에 수반되는 세포 간 상호작용을 조절하는 것으로 보고되었다(Noh et al., 2017).It has been found in many results that micro RNAs are involved in the inflammatory response. The miR-384-HDAC3 feedback loop has been reported to control allergic reactions and increase in tumor production and cancer metastasis promoted by allergic reactions (Eom et al., 2014), and miR-155 decreases anti-inflammatory by increasing SOCS1 expression Inducing effects (Lv et al., 2015), miR-155 has been reported to increase the inflammatory response to arteriosclerosis by increasing STAT3 and NF-kB signaling by targeting SOCS1 (Yang et al. ., 2015). MiR-155 decreasing in systemic lupus erythematosus increases the expression of SOCS1 (Rasmussen et al., 2015), miR-155 targets SOCS1 and increases intestinal inflammation (Pathak et al., 2015), SOCS1 It has been reported to inhibit angiogenesis by inhibiting the expression of (Pankratz et al., 2015). In addition, the inflammation of the central nervous system by the virus is due to increased SOCS1 mRNA expression in brain cells (Steffensen et al., 2014), and miR-122a-SOCS1 feedback loop is an allergic reaction and interaction between cells involved in the allergic reaction. It has been reported to modulate (Noh et al., 2017).
본 발명에서는 miR-154-5p가 세포와 동물 수준에서 알레르기 반응을 매개하며, 이에 따라 알레르기 질환의 진단에 필요한 정보를 위해 miR-154-5p을 바이오마커로 이용할 수 있고, miR-154-5p 활성 저해물질(miR-154-5p inhibitor)이 아나필락시스를 포함하는 각종 알레르기 질환의 치료제로 이용될 수 있으며, 또한 miR-154-5p를 알레르기 치료제 개발의 표적으로 이용할 수 있음을 새롭게 규명하였다.In the present invention, miR-154-5p mediates an allergic reaction at the cell and animal level, and accordingly, miR-154-5p can be used as a biomarker for information necessary for diagnosis of allergic diseases, and miR-154-5p activity It has been newly established that an inhibitor (miR-154-5p inhibitor) can be used as a therapeutic agent for various allergic diseases including anaphylaxis, and miR-154-5p can be used as a target for the development of allergic treatments.
본 발명의 주된 목적은 알레르기 질환에 필요한 정보를 제공하기 위한 효과적인 방법을 제공하는데 있다.The main object of the present invention is to provide an effective method for providing information necessary for allergic diseases.
본 발명의 다른 목적은 알레르기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition that can effectively prevent or treat allergic diseases.
본 발명의 또 다른 목적은 알레르기 질환 치료제를 효과적으로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for effectively screening for therapeutic agents for allergic diseases.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 검사대상의 알레르기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 miR-154-5p의 발현수준을 측정하는 방법을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method of measuring the expression level of miR-154-5p from a sample in order to provide information necessary for diagnosis of an allergic disease of a test subject.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 접촉피부염 중에서 선택된 질환일 수 있다.In the method of the present invention, the allergic disease may be a disease selected from anaphylaxis, asthma, allergic rhinitis and allergic contact dermatitis.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 검체는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 및 복수 중에서 선택된 것일 수 있다.In the method of the present invention, the sample may be selected from tissue, cells, whole blood, serum, plasma and ascites.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 발현수준의 측정은 miR-154-5p에 대한 정량적 실시간 PCR을 수행하여 이루어질 수 있다.In the method of the present invention, the measurement of the expression level can be made by performing quantitative real-time PCR for miR-154-5p.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-154-5p의 활성 저해물질을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases containing the active inhibitor of miR-154-5p as an active ingredient.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 miR-154-5p의 활성 저해물질은 miR-154-5p의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산분자일 수 있다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the activity inhibitor of miR-154-5p may be a nucleic acid molecule capable of binding all or part of the nucleotide sequence of miR-154-5p.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 miR-154-5p의 활성 저해물질은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 핵산분자일 수 있다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the miR-154-5p activity inhibitor may be a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 접촉피부염 중에서 선택된 질환일 수 있다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the allergic disease may be a disease selected from anaphylaxis, asthma, allergic rhinitis and allergic contact dermatitis.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 a) miR-154-5p 발현 시스템을 갖는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; b) 상기 피검화합물이 처리된 세포에서 miR-154-5p의 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 대조군과 비교하여 miR-154-5p의 발현수준이 감소된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 알레르기 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of: a) treating a test compound on cells having a miR-154-5p expression system; b) measuring the expression level of miR-154-5p in the cells treated with the test compound; And c) selecting a test compound of the test group in which the expression level of miR-154-5p is reduced compared to the control group.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 세포는 인간 또는 쥐의 비반세포(mast cell)일 수 있다.In the screening method of the present invention, the cells may be human or rat mast cells.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 접촉피부염 중에서 선택된 질환일 수 있다.In the screening method of the present invention, the allergic disease may be a disease selected from anaphylaxis, asthma, allergic rhinitis and allergic contact dermatitis.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 발현수준의 측정은 miR-154-5p에 대한 정량적 실시간 PCR을 수행하여 이루어질 수 있다.In the screening method of the present invention, the measurement of the expression level can be made by performing quantitative real-time PCR for miR-154-5p.
본 발명에 따르면 miR-154-5p의 발현수준을 측정하는 방법을 통해 알레르기 질환의 진단에 필요한 정보를 효과적으로 제공할 수 있으며, miR-154-5p의 활성 저해물질을 함유하는 본 발명에 따른 약학 조성물을 사용하면 알레르기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 miR-154-5p의 발현을 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 통해 알레르기 질환 치료제를 효과적으로 탐색할 수 있어, 앞으로 새롭고 보다 효과적인 알레르기 질환 치료제의 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.According to the present invention, it is possible to effectively provide information necessary for the diagnosis of allergic diseases through a method of measuring the expression level of miR-154-5p, and the pharmaceutical composition according to the present invention containing an active inhibitor of miR-154-5p Using can effectively prevent or treat allergic diseases. In addition, it is expected that a method for screening a substance that reduces the expression of miR-154-5p can effectively search for a treatment for allergic diseases, and is expected to greatly contribute to the development of a new and more effective treatment for allergic diseases.
도 1의 A는 RBL2H3 세포주에서 항원 자극에 의해 miR-154-5p의 발현이 증가함을 기지의 마이크로 RNA 어레이(array) 기법을 통해 확인한 결과이다.
도 1의 B는 RBL2H3 세포주에서 항원 자극에 의해 자가포식(autophagy)의 지표 단백질들인 P62, LC3-II, pBeclin1Ser15 등의 발현, 알레르기 지표 단백질들인 HDAC3, SOCS1, COX2 등의 발현 및 FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3의 결합이 증가하고, miR-154-5p 활성 저해물질에 의한 miR-154-5p 발현 감소로 이러한 지표 단백질들의 발현 증가 현상 및 FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3의 결합 증가 현상이 억제되는 것을 기지의 웨스턴블롯(western blot) 기법을 통해 확인한 결과이다.
도 1의 C는 miR-154-5p 활성 저해물질에 의한 miR-154-5p 발현 감소로 알레르기 반응의 지표 반응인 베타-헥소스아미니다제(β-hexosaminidase) 활성이 감소하고, 히스타민 분비 증가가 억제되고, 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2) 분비 증가가 억제됨을 확인한 결과이다.
도 2의 A는 BALB/C 쥐를 이용한 수동적 피하 아나필락시스 모델에서 miR-154-5p 활성 저해물질에 의한 miR-154-5p 발현 감소로 수동적 피하 아나필락시스 유도에 따른 혈관 투과성 증가가 억제되고, 항원 자극에 의한 베타-헥소스아미니다제 활성 증가가 억제됨을 확인한 결과이다.
도 2의 B는 BALB/C 쥐를 이용한 수동적 피하 아나필락시스 모델의 조직에서 수동적 피하 아나필락시스에 의한 알레르기 지표 단백질들과 자가포식 지표 단백질들의 발현 증가가 miR-154-5p에 의존적으로 일어남을 기지의 웨스턴블롯 기법을 통해 확인한 결과, 및 miR-154-5p 활성 저해물질에 의한 miR-154-5p 발현 감소로 아나필락시스 유도에 따른 FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-SOCS1 결합이 억제됨을 기지의 면역침강 기법을 통해 확인한 결과이다.
도 3의 A는 miR-154-5p가 수동적 전신성 아나필락시스를 매개함을 BALB/C 쥐 모델을 이용하여 확인한 결과이다. 수동적 전신성 아나필락시스는 직장의 온도를 강하시키고 miR-154-5p 활성 저해물질에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 이를 억제함을 나타낸다.
도 3의 B는 miR-154-5p 활성 저해물질에 의해 miR-154-5p 발현이 감소될 경우 알레르기 지표 단백질들과 자가포식 지표 단백질들의 발현 증가가 억제되고, 아나필락시스 반응 유도에 따른 FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-Lyn 결합이 억제 됨을 폐 조직을 이용한 웨스턴블롯 기법으로 확인한 결과이다.
도 3의 C는 miR-154-5p 활성 저해물질에 의해 miR-154-5p 발현이 감소될 경우 알레르기 반응의 지표 반응인 베타-헥소스아미니다제 활성이 감소되고, 아나필락시스 반응에 따른 히스타민 분비 증가, 프로스타글란딘 E2 분비 증가가 억제됨을 폐 조직을 이용한 효소 분석 기법으로 확인한 결과이다.
도 4의 A는 항원 자극된 RBL2H3 세포주를 배양하여 수득한 조건배지 배양액을 B16F1 흑색종 세포주에 처리할 경우 miR-154-5p 의존적으로 HDAC3 등의 알레르기 지표 단백질들과 LC-3II 등의 자가포식 지표 단백질들의 발현이 증가됨을 확인한 결과이다.
도 4의 B는 항원 자극된 RBL2H3 세포주를 배양하여 수득한 조건배지 배양액을 B16F1 흑색종 세포주에 처리할 경우 miR-154-5p 의존적으로 침윤능(invasion) 및 이동능력(migration)이 증가됨을 확인한 결과이다.
도 4의 C는 항원 자극된 RBL2H3 세포주를 배양하여 수득한 조건배지 배양액을 대식세포(lung macrophages)에 처리할 경우 miR-154-5p 의존적으로 HDAC3 등의 알레르기 지표 단백질들과 LC-3II 등의 자가포식 지표 단백질들의 발현이 증가되고, CD163, iNOS 등의 대식세포 활성화 지표 단백질들의 발현이 조절됨을 확인한 결과이다.
도 5의 A는 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 miR-154-5p 의존적으로 케모카인의 일종인 CXCL10의 발현이 증가함을 기지의 사이토카인 어레이(cytokine array) 기법으로 확인한 결과이다.
도 6의 B는 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 CXCL10 의존적으로 p62, ATG5, LC-3II, pBeclin1Ser15 등의 자가포식 지표 단백질들과 HDAC3, MCP1 등의 알레르기 지표 단백질들의 발현이 증가되고, FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-SOCS1 결합이 유도됨을 확인한 결과이다.1A is a result of confirming an increase in the expression of miR-154-5p by antigen stimulation in the RBL2H3 cell line through a known micro RNA array technique.
1B shows expression of autophagy indicator proteins P62, LC3-II, and pBeclin1 Ser15 by antigen stimulation in RBL2H3 cell line, expression of allergy indicator proteins HDAC3, SOCS1, COX2, and FcεRI-Lyn, The increase in the binding of FcεRI-HDAC3 and the decrease in the expression of miR-154-5p by the miR-154-5p activity inhibitor inhibits the increase in expression of these indicator proteins and the increase in binding of FcεRI-Lyn and FcεRI-HDAC3. The result was confirmed by the known Western blot technique.
1C shows a decrease in miR-154-5p expression by miR-154-5p activity inhibitor, which decreases beta-hexosaminidase activity, an index response of allergic reactions, and increases histamine secretion. It is suppressed, and it is a result confirming that prostaglandin E2 (prostaglandin E2, PGE2) secretion increase is suppressed.
In FIG. 2A, in the passive subcutaneous anaphylaxis model using BALB/C mice, an increase in vascular permeability due to passive subcutaneous anaphylaxis induction is suppressed by miR-154-5p expression decrease by miR-154-5p activity inhibitor, and the It is the result confirming that the increase in beta-hexose aminidase activity is suppressed.
FIG. 2B is a Western blot based on the increase in expression of allergic indicator proteins and autophagy indicator proteins by passive subcutaneous anaphylaxis in tissues of a passive subcutaneous anaphylaxis model using BALB/C mice. As a result of confirming through the technique, and the reduction of miR-154-5p expression by the miR-154-5p activity inhibitor, the known immunoprecipitation technique of inhibiting the binding of FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, and FcεRI-SOCS1 due to anaphylactic induction It is the result confirmed through.
3A is a result confirming using a BALB/C mouse model that miR-154-5p mediates passive systemic anaphylaxis. Passive systemic anaphylaxis lowers the rectal temperature and decreases miR-154-5p expression by miR-154-5p activity inhibitors inhibits it.
3B shows that when miR-154-5p expression is reduced by the miR-154-5p activity inhibitor, the increase in expression of allergic indicator proteins and autophagy indicator proteins is suppressed, and FcεRI-Lyn according to induction of anaphylactic reaction, It was confirmed by Western blot technique using lung tissue that FcεRI-HDAC3 and FcεRI-Lyn binding were inhibited.
3C shows that when miR-154-5p expression is reduced by the miR-154-5p activity inhibitor, beta-hexomiminidase activity, which is an index reaction of allergic reaction, is decreased, and histamine secretion increases according to an anaphylactic reaction. , Prostaglandin E2 secretion is suppressed by the enzyme analysis using lung tissue analysis results.
4A shows miR-154-5p-dependent allergen indicator proteins such as HDAC3 and autophagy indicators such as LC-3II when the conditional medium culture obtained by culturing the antigen-stimulated RBL2H3 cell line is treated with the B16F1 melanoma cell line. It is a result of confirming that the expression of proteins is increased.
B of FIG. 4 shows that miR-154-5p-dependent invasion and migration are increased when the conditioned medium obtained by culturing the antigen-stimulated RBL2H3 cell line is treated with the B16F1 melanoma cell line. to be.
C of FIG. 4 shows miR-154-5p-dependent allergen marker proteins such as HDAC3 and autologous agents such as LC-3II depending on the condition medium culture obtained by culturing the antigen-stimulated RBL2H3 cell line to macrophages. This is a result of confirming that the expression of predation indicator proteins is increased and the expression of macrophage activation indicator proteins such as CD163 and iNOS is regulated.
5A is a result of confirming an increase in the expression of CXCL10, a type of chemokine, that is dependent on miR-154-5p in an antigen-stimulated RBL2H3 cell line by a known cytokine array technique.
6B, CXCL10 dependent antigen-stimulated RBL2H3 cell line increases the expression of autophagy indicator proteins such as p62, ATG5, LC- 3II , pBeclin1 Ser15 and allergy indicator proteins such as HDAC3, MCP1 , and FcεRI-Lyn, It is a result confirming that FcεRI-HDAC3 and FcεRI-SOCS1 binding are induced.
본 발명은 알레르기 질환의 바이오마커로 miR-154-5p를 이용하는 것을 특징으로 하며, 알레르기 질환의 예방 또는 치료를 위해 miR-154-5p의 활성 저해물질을 이용하는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized by using miR-154-5p as a biomarker for allergic diseases, and is characterized by using miR-154-5p active inhibitors for the prevention or treatment of allergic diseases.
miR-154-5p는 작은 크기의 RNA 분자로, 마이크로 RNA 데이터베이스인 miRBase(http://www.mirbase.org) 등을 통해 잘 알려져 있다. 대표적으로 인간(Homo sapiens)과 생쥐(Mus musculus)의 miR-154-5p 서열은 서열번호 1로 알려져 있다.miR-154-5p is a small-sized RNA molecule, and is well-known through the micro RNA database miRBase (http://www.mirbase.org). Representatively, the miR-154-5p sequence of human ( Homo sapiens ) and mouse ( Mus musculus ) is known as SEQ ID NO: 1.
본 발명에서 miR-154-5p의 발현수준은 통상적인 miRNA의 발현수준 측정방법을 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, miR-154-5p에 대한 정량적 실시간 PCR, 마이크로어레이 발현 프로파일링(microarray expression profiling), 노던블롯(northern blot) 등을 이용할 수 있다.In the present invention, the expression level of miR-154-5p can be confirmed through a conventional method for measuring the expression level of miRNA. For example, quantitative real-time PCR for miR-154-5p, microarray expression profiling, and Northern blot may be used.
본 발명에 따르면 검사대상의 검체로부터 이러한 miR-154-5p의 발현수준 측정을 통해 검사대상의 알레르기 질환의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.According to the present invention, it is possible to provide information necessary for diagnosis of an allergic disease of a test subject through measurement of the expression level of miR-154-5p from a test subject's sample.
이때 상기 알레르기 질환은 그 종류가 제한되는 것은 아니나 특히 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 접촉피부염 중에서 선택된 질환의 진단에 필요한 정보를 보다 효과적으로 제공할 수 있다.At this time, the type of allergic disease is not limited, but in particular, anaphylaxis, asthma, allergic rhinitis, and allergic contact dermatitis can provide information necessary for diagnosis of a disease more effectively.
또한, 이때 검체는 miR-154-5p의 발현수준을 측정할 수 있는 것이라면 어떠한 생물학적 검체도 사용할 수 있다. 예를 들어, 검사대상의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 복수 등을 검체로 사용할 수 있다.In addition, at this time, any biological sample can be used as long as the sample can measure the expression level of miR-154-5p. For example, tissue, cells, whole blood, serum, plasma, ascites, and the like, to be tested can be used as samples.
본 발명에 따르면, 측정된 miR-154-5p의 발현수준이 대조군에 비해 높을 경우 알레르기 질환의 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있다.According to the present invention, if the measured expression level of miR-154-5p is higher than the control group, it can be determined that the risk of allergic disease is high.
본 발명에서 miR-154-5p의 활성 저해물질은 miR-154-5p의 세포 내 작용 또는 기능을 저해하는 물질을 의미하는 것으로, 전형적으로 안타고미르(antagomir)가 해당될 수 있다. 이 밖에 miR-154-5p에 대한 안티센스 분자, 쇼트헤어핀 RNA 분자(shRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA) 분자, 시드 표적(Seed-targeting) LNA(locked nucleic acid), 앱타머, 리보자임, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 인지하는 항체를 포함할 수 있다.In the present invention, the activity inhibitor of miR-154-5p refers to a substance that inhibits the function or function of miR-154-5p in the cell, and may typically be an antagomir. Other antisense molecules for miR-154-5p, short hairpin RNA molecules (shRNA), short interfering RNA (siRNA) molecules, seed-targeting locked nucleic acid (LNA), aptamers, ribozymes, or DNA -An antibody that recognizes an RNA hybrid may be included.
바람직하게는 miR-154-5p의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산분자이며, 이 핵산분자는 DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid)와 같은 형태일 수 있다.It is preferably a nucleic acid molecule capable of binding all or part of the nucleotide sequence of miR-154-5p, which may be in the form of DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNA) or locked nucleic acids (LNA). have.
보다 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 핵산분자이며, 이 핵산분자를 함유하여 동물의 세포 내에서 이 핵산분자를 발현하는 벡터일 수 있다. 또한, 서열번호 2의 염기서열에서 일부 염기서열이 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형되더라도 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체도 포함할 수 있다.More preferably, it is a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and may be a vector containing the nucleic acid molecule and expressing the nucleic acid molecule in an animal cell. In addition, even if some of the nucleotide sequences in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 are modified by deletion, substitution, or insertion, it may also include a variant that can function functionally.
본 발명에 따르면 이러한 miR-154-5p의 활성 저해물질은 알레르기 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.According to the present invention, these miR-154-5p active inhibitors can prevent or treat allergic diseases.
본 발명의 약학 조성물은 이러한 miR-154-5p의 활성 저해물질을 유효성분으로 함유하여 알레르기 질환의 예방 또는 치료의 용도로 제공되는 것으로, 이때 알레르기 질환은 그 종류가 제한되는 것은 아니나 특히 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 접촉피부염 중에서 선택된 질환의 예방 또는 치료에 효과적이다.The pharmaceutical composition of the present invention contains an active inhibitor of miR-154-5p as an active ingredient and is provided for use in the prevention or treatment of allergic diseases. In this case, allergic diseases are not particularly limited, but anaphylaxis and asthma , Allergic rhinitis and allergic contact dermatitis is effective in the prevention or treatment of diseases selected.
본 발명의 약학 조성물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약학 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated on the basis of the formulation standards of the Food and Drug Administration (KFDA) into conventional pharmaceutical formulations or the formulation standards of health supplements.
본 발명의 약학 조성물에서 miR-154-5p의 활성 저해물질은 그 자체를 사용하거나, 저해물질의 종류에 따라 저해물질 본연의 기능, 즉 miR-154-5p의 활성을 저해하는 기능을 발휘할 수 있는 한도 내에서 약학적으로 허용 가능한 산부가염 또는 금속 복합체 등의 형태로도 사용할 수 있을 것이다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the active inhibitor of miR-154-5p may use itself, or may exhibit the function of the inhibitor intrinsically depending on the type of inhibitor, that is, the function of inhibiting the activity of miR-154-5p. It may also be used in the form of pharmaceutically acceptable acid addition salts or metal complexes within the limits.
또한 본 발명의 약학 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시킬 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be diluted by mixing the active ingredient with a pharmaceutically acceptable carrier according to the administration method, administration form and treatment purpose, or sealed in a carrier in a container form.
본 발명의 약학 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여 시에는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있을 것이다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally during clinical administration, and when administered parenterally, intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine epidural injection, cerebrovascular It may be administered by injection or intrathoracic injection, and may be used in the form of a general pharmaceutical preparation.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있을 것이다.The pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormonal therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.
본 발명 약학 조성물의 일일 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 것이나, 통상적으로 조성물에 함유된 본 발명의 유효성분을 기준으로 하루에 약 0.0001 내지 100㎎/㎏일 수 있으며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여될 수 있을 것이다.The daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease, etc. It may be about 0.0001 to 100mg/kg per day based on the active ingredient of the invention, and may be administered once to several times a day.
실제 임상 투여 시에 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있을 것이다.In actual clinical administration, it may be administered in various dosage forms. When formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있을 것이다.The pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function in addition to the active ingredients.
본 발명에서 miR-154-5p 발현 시스템을 갖는 세포는 알레르기 반응을 유발되었을 때 miR-154-5p의 발현이 증가하는 세포를 의미하는 것으로, 인간 또는 쥐의 비반세포(mast cell)일 수 있다.In the present invention, the cell having the miR-154-5p expression system refers to a cell in which the expression of miR-154-5p increases when an allergic reaction is induced, and may be a human or mouse mast cell.
본 발명에 따르면, 상기와 같은 세포에 피검화합물을 처리하고, 피검화합물이 처리된 세포에서 miR-154-5p의 발현수준을 측정하고, 대조군과 비교하여 miR-154-5p의 발현수준이 감소된 시험군의 피검화합물을 선별하는 방법으로 알레르기 질환 치료제를 스크리닝 할 수 있다. 이때 알레르기 질환은 그 종류가 제한되는 것은 아니나 특히 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 접촉피부염 중에서 선택된 질환에 대한 치료제를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.According to the present invention, the test compound is treated on the cells as described above, the expression level of miR-154-5p is measured in the cell treated with the test compound, and the expression level of miR-154-5p is reduced compared to the control group. As a method of selecting a test compound of the test group, a therapeutic agent for allergic diseases can be screened. At this time, the type of allergic disease is not limited, but in particular, it can effectively screen for therapeutic agents for diseases selected from anaphylaxis, asthma, allergic rhinitis and allergic contact dermatitis.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, it should not be construed that the scope of the present invention is limited by these examples.
[실시예][Example]
1. miR-154-5p에 의한 알레르기 반응 매개1.Mediation of allergic reactions by miR-154-5p
DNP(dinitropheny)-특이적 IgE 항체로 감작된 RBL2H3 세포주(rat basophilic leukmia)에 항원(DNP-HSA, DNP-human serum albumin, 100ng/㎖)을 16시간 처리하고 수득한 RNA를 대상으로 마이크로 RNA 어레이(array) 분석을 기지의 방법에 따라 수행한 결과, 항원 자극에 의해 miR-154-5p 등의 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 1의 A 참조).Micro RNA array of RNA obtained by treating antigen (DNP-HSA, DNP-human serum albumin, 100ng/ml) in RBL2H3 cell line (rat basophilic leukmia) sensitized with DNP (dinitropheny)-specific IgE antibody for 16 hours (array) As a result of performing the analysis according to a known method, it was found that the expression of miR-154-5p and the like is increased by antigen stimulation (see FIG. 1A ).
RBL2H3 세포주에 대조 저해제(10nM)(miRNA 저해 기능이 없는 RNA)(Ctrl. Inh.) 또는 miR-154-5p 저해제(5'-CGA AGG CAA CAC GGA UAA CCU A-3'(서열번호 2) 서열의 RNA)(10nM)(miR-154-5p Inh.)를 처리하고 다음날 DNP-특이적 IgE 항체로 24시간 감작한 후 전술한 항원으로 1시간 처리 후에 웨스턴블롯을 수행한 결과, miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 항원 자극에 의한 HDAC3 등의 발현과 자가포식(autophagy) 지표 단백질들의 발현 증가를 억제하고 항원 자극에 의한 FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3 결합을 억제하는 것으로 나타났다(도 1의 B 참조).Control inhibitor (10nM) (RNA without miRNA inhibitory function) (Ctrl. Inh.) or miR-154-5p inhibitor (5'-CGA AGG CAA CAC GGA UAA CCU A-3' (SEQ ID NO: 2) sequence in RBL2H3 cell line RNA)(10nM)(miR-154-5p Inh.), sensitized with DNP-specific IgE antibody for 24 hours on the next day, and Western blot after 1 hour treatment with the above-mentioned antigen, miR-154- Reduction of miR-154-5p expression by 5p inhibitors inhibits expression of HDAC3, etc. by antigen stimulation, and increase in expression of autophagy indicator proteins, and inhibits FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3 binding by antigen stimulation. Appeared (see B in Figure 1).
miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 항원 자극에 의한 β-hexosaminidase 활성 증가, 히스타민 분비 증가, 프로스타글란딘 E2 분비 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 1의 C 참조).Reduction of miR-154-5p expression by the miR-154-5p inhibitor was shown to inhibit increased β-hexosaminidase activity by antigen stimulation, increased histamine secretion, and increased prostaglandin E2 secretion (see FIG. 1C ).
이상의 결과들로 볼 때 miR-154-5p는 in vitro 알레르기 반응을 매개하는 것으로 판단된다.Based on the above results, it is thought that miR-154-5p mediates an in vitro allergic reaction.
2. miR-154-5p에 의한 수동적 피하 아나필락시스 매개2. Passive subcutaneous anaphylaxis mediated by miR-154-5p
수동성 피하 아나필락시스(passive cutaneous anaphylaxis)는 기지의 방법을 사용하여 유도하였다. 구체적으로, DNP-특이적 IgE 항체(0.5㎍/㎏ 쥐)를 BALB/C 쥐의 귀에 주사하고 24시간 후에 항원인 DNP-HSA(250㎍/㎏ 쥐)와 에반스 용액(evans blue solution)을 포함한 PBS(phosphate buffered saline)를 전술한 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하여 아나필락시스를 유도하였다.Passive cutaneous anaphylaxis was induced using known methods. Specifically, DNP-specific IgE antibody (0.5 μg/kg rat) was injected into the ears of BALB/C mice and 24 hours later, the antigens included DNP-HSA (250 μg/kg rat) and Evans blue solution. Anaphylaxis was induced by injecting PBS (phosphate buffered saline) into the tail vein of the aforementioned BALB/C mice.
항원 자극 30분 후에 쥐의 귀를 잘라서 포름아마이드 용액에 침지시킨 다음 에반스 용액을 용출하고 용출정도를 광학밀도(optical density)로 측정함으로써 혈관 투과도를 측정하였다.After 30 minutes of antigen stimulation, the rat's ears were cut and immersed in a formamide solution, and then the evanescence solution was eluted and the elution degree was measured by optical density to measure vascular permeability.
기지의 방법에 따라 수동적 피하 아나필락시스를 유도한 다음 대조 저해제 또는 miR-154-5p 저해제의 처리에 따른 혈관 투과도를 측정한 결과, miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 혈관 투과성 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 2의 A 참조).Induction of passive subcutaneous anaphylaxis according to a known method, and then measurement of vascular permeability following treatment with a control inhibitor or miR-154-5p inhibitor, decreased miR-154-5p expression by the miR-154-5p inhibitor decreased vascular permeability It was shown to inhibit the increase (see A in Figure 2).
같은 쥐의 귀 조직을 이용하여 효소활성을 측정한 결과, 아나필락시스 유도는 β-hexosaminidase 활성을 증가시키고 miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 이의 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 2의 A 참조).As a result of measuring enzymatic activity using the ear tissues of the same mouse, anaphylaxis induction increased β-hexosaminidase activity and decreased miR-154-5p expression by miR-154-5p inhibitors inhibited the increase (Fig. 2, A).
같은 쥐의 귀 조직을 이용하여 웨스턴블롯을 수행한 결과, 아나필락시스 유도는 HDAC3 등의 알레르기 지표 단백질들과 LC-3II 등의 자가포식 지표 단백질들의 발현을 증가시키고, miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 아나필락시스에 의한 상기와 같은 단백질의 발현 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 2의 B 참조). 또한 miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 아나필락시스에 의한 FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-SOCS1의 결합을 억제하는 것으로 나타났다(도 2의 B 참조).As a result of performing Western blot using the ear tissues of the same rat, anaphylaxis induction increases the expression of allergic indicator proteins such as HDAC3 and autophagy indicator proteins such as LC-3II, miR by miR-154-5p inhibitor The decrease in -154-5p expression was shown to inhibit the increase in the expression of the protein as described above by anaphylaxis (see B in Figure 2). In addition, miR-154-5p inhibitor miR-154-5p expression reduction was shown to inhibit the binding of FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-SOCS1 by anaphylaxis (see B in Figure 2).
이상의 결과들로 볼 때 miR-154-5p는 수동적 피하 아나필락시스를 매개하는 것으로 판단된다.Based on the above results, it is considered that miR-154-5p mediates passive subcutaneous anaphylaxis.
3. miR-154-5p에 의한 수동적 전신성 아나필락시스 매개3. Passive systemic anaphylaxis mediated by miR-154-5p
수동성 전신성 아나필락시스(passive systemic anaphylaxis)는 기지의 방법을 사용하여 유도하였다. 구체적으로, DNP-특이적 IgE 항체(0.5㎍/㎏ 쥐)를 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하고 24시간 후에 항원인 DNP-HSA(250㎍/㎏ 쥐)를 BALB/C 쥐의 꼬리 정맥에 주사하여 아나필락시스를 유도하였다.Passive systemic anaphylaxis was induced using known methods. Specifically, DNP-specific IgE antibody (0.5 μg/kg rat) was injected into the tail vein of BALB/C mice, and 24 hours later, the antigen DNP-HSA (250 μg/kg rat) was injected into the tail vein of BALB/C mice. Was injected to induce anaphylaxis.
유도 후 직장 온도(rectal temperature)는 기지의 digital gauge를 이용하여 측정하고 조직으로부터 용출물을 기지의 방법에 따라 수득하여 웨스턴블롯, 면역침강, 효소활성측정 등을 수행하였다.After induction, the rectal temperature was measured using a known digital gauge, and an eluate from the tissue was obtained according to a known method to perform western blot, immunoprecipitation, and enzyme activity measurement.
이의 결과, 기지의 방법에 따라 아나필락시스를 유도할 경우 직장의 온도가 강하되며, miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 아나필락시스에 의한 직장온도 강하를 억제하는 것으로 나타났다(도 3의 A 참조).As a result of this, when inducing anaphylaxis according to the known method, the rectal temperature is lowered, and the decrease in miR-154-5p expression by the miR-154-5p inhibitor was shown to inhibit the rectal temperature drop by anaphylaxis (Fig. 3). See A).
BALB/C 쥐의 폐 조직을 이용한 웨스턴블롯 결과, 아나필락시스 유도는 HDAC3, MCP1, p62 등의 발현과 자가포식 지표 단백질들의 발현을 증가시키며, miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 아나필락시스에 의한 이들 단백질들의 발현 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 3의 B 참조). 또한 miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 아나필락시스에 의한 FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-SOCS1 결합을 억제하는 것으로 나타났다(도 3의 B 참조).As a result of Western blot using lung tissue of BALB/C mice, induction of anaphylaxis increases expression of HDAC3, MCP1, p62, etc. and expression of autophagy marker proteins, and decreases miR-154-5p expression by miR-154-5p inhibitor Has been shown to inhibit the increased expression of these proteins by anaphylaxis (see B in Figure 3). In addition, miR-154-5p inhibitor miR-154-5p expression reduction was shown to inhibit FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-SOCS1 binding by anaphylaxis (see B in Figure 3).
BALB/C 쥐의 폐 조직을 이용한 효소활성 측정 결과, 아나필락시스 유도는 β-hexosaminidase 활성을 증가시키고, miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 이의 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 3의 C 참조). 또한 miR-154-5p 저해제에 의한 miR-154-5p 발현 감소는 아나필락시스 유도에 의한 히스타민 분비 증가, 프로스타글란딘 E2 분비 증가를 억제하는 것으로 나타났다(도 3의 C 참조).As a result of enzymatic activity measurement using lung tissue of BALB/C mice, induction of anaphylaxis increased β-hexosaminidase activity, and decrease of miR-154-5p expression by miR-154-5p inhibitor inhibited the increase (Fig. 3, C). In addition, miR-154-5p inhibitor miR-154-5p expression decrease was shown to inhibit the increase in histamine secretion and prostaglandin E2 secretion by induction of anaphylaxis (see FIG. 3C).
이상의 결과들로 볼 때 miR-154-5p는 수동적 전신성 아나필락시스를 매개하는 것으로 판단된다.Based on the above results, it is believed that miR-154-5p mediates passive systemic anaphylaxis.
4. miR-154-5p에 의한 세포 간 상호작용 조절4. Inter-cell interaction regulation by miR-154-5p
여러 논문들에서 알레르기 반응에 따른 종양생성력증가와 암 전이력 증가에서 암 세포와 비반세포 사이의 상호작용이 보고된 바 있다. 이에 miR-154-5p에 의한 세포 간 상호작용 조절 여부를 조사하였다.Several papers have reported interactions between cancer cells and virocytes in increasing tumor production and cancer metastasis due to allergic reactions. Therefore, it was investigated whether to control the interaction between cells by miR-154-5p.
이의 결과, 항원 자극된 RBL2H3 세포주를 조건배지에서 배양하여 수득한 배양액은 B16F1 세포주의 HDAC3, p62, MCP1 등의 발현을 증가시키며 이는 miR-154-5p 의존적인 것으로 나타났다(도 4의 A 참조).As a result, the culture solution obtained by culturing the antigen-stimulated RBL2H3 cell line in conditioned medium increased the expression of HDAC3, p62, MCP1, etc. of the B16F1 cell line, which was shown to be miR-154-5p dependent (see FIG. 4A).
또한, 항원 자극된 RBL2H3 세포주를 조건배지에서 배양하여 수득한 배양액을 B16F1 세포주에 처리할 경우, B16F1 세포주의 침윤성(invasion) 및 이동성(migration)을 증가시키는 것으로 나타났다(도 4의 B 참조). 그러나 miR-154-5p 저해제를 발현시킨 항원 자극된 RBL2H3 세포주를 조건배지에서 배양하여 수득한 배양액은 B16F1 세포주의 침윤성 및 이동성에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 4의 B 참조).In addition, when the culture medium obtained by culturing the antigen-stimulated RBL2H3 cell line in a conditioned medium is treated with the B16F1 cell line, it has been shown to increase the invasion and migration of the B16F1 cell line (see FIG. 4B ). However, the culture solution obtained by culturing the antigen-stimulated RBL2H3 cell line expressing the miR-154-5p inhibitor in the conditioned medium did not affect the invasiveness and mobility of the B16F1 cell line (see B in FIG. 4).
또한, 항원 자극된 RBL2H3 세포주를 조건배지에서 배양하여 수득한 배양액을 대식세포(macrophages)에 처리할 경우, 알레르기 지표 단백질들과 자가포식 지표 단백질들의 발현을 miR-154-5p 의존적으로 증가시키고, 활성화된 대식세포의 지표 단백질들인 CD163, iNOS 등의 발현을 조절하는 것으로 나타났다(도 4의 C 참조).In addition, when the culture medium obtained by culturing the antigen-stimulated RBL2H3 cell line in conditioned medium is treated with macrophages, miR-154-5p increases the expression of allergic marker proteins and autophagy marker proteins dependently, and activates the culture medium. It has been shown to regulate the expression of the marker proteins CD163, iNOS, etc. of the macrophages (see C in FIG. 4).
이상의 결과들로 볼 때 miR-154-5p는 알레르기 반응에 수반되는 세포 간 상호작용을 조절하는 것으로 판단된다.Based on the above results, it is considered that miR-154-5p regulates the interaction between cells involved in an allergic reaction.
5. CXCL10을 통한 miR-154-5p의 알레반응 조절5. Control of allergic reaction of miR-154-5p through CXCL10
miR-154-5p에 의해 발현이 조절되는 사이토카인(cytokines) 또는 케모카인(chemokines)을 발굴하기 위해 기지의 방법에 따라 사이토카인 어레이 분석을 수행하였다.To discover cytokines or chemokines whose expression is regulated by miR-154-5p, cytokine array analysis was performed according to known methods.
이의 결과, 항원 자극된 RBL2H3 세포주에서 CXCL10(C-X-C chemokine ligand 10)의 발현이 miR-154-5p 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다(도 5의 A 참조).As a result, it was found that the expression of CXCL10 (C-X-C chemokine ligand 10) in the antigen-stimulated RBL2H3 cell line increased miR-154-5p dependently (see FIG. 5A ).
또한, RBL2H3 세포주에 scrambled siRNA(10nM) 혹은 siCXCL10(10nM)을 처리하고 다음날 DNP-특이적 IgE 항체로 24시간 감작한 후 전술한 항원으로 1시간 처리 후에 웨스턴블롯을 수행한 결과, siCXCL10에 의한 CXCL10 발현 감소는 항원 자극에 의한 HDAC3 등의 발현과 자가포식 지표 단백질들의 발현 증가를 억제하고 항원 자극에 의한 FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-SOCS1 등의 결합을 억제하는 것으로 나타났다(도 5의 B 참조).In addition, after treatment with scrambled siRNA (10nM) or siCXCL10 (10nM) on the RBL2H3 cell line, followed by sensitization with DNP-specific IgE antibody for 24 hours the day after Western blot treatment with the above-mentioned antigen for 1 hour, CXCL10 by siCXCL10 The decrease in expression was shown to suppress the expression of HDAC3, etc. by antigenic stimulation, and the increase in the expression of autophagy indicator proteins, and inhibit the binding of FcεRI-Lyn, FcεRI-HDAC3, FcεRI-SOCS1, etc. by antigenic stimulation (Fig. 5B) Reference).
이상의 결과들로 볼 때 miR-154-5p는 CXCL10의 발현 조절을 통해 알레르기 반응을 매개하는 것으로 판단된다.Based on the above results, it is considered that miR-154-5p mediates an allergic reaction through regulation of CXCL10 expression.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Regulation mechanism of allergic reaction by miR-154-5p, and use thereof <130> PA-D19007 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uagguuaucc guguugccuu cg 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-154-5p inhibitor <400> 2 cgaaggcaac acggauaacc ua 22 <110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Regulation mechanism of allergic reaction by miR-154-5p, and use thereof <130> PA-D19007 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uagguuaucc guguugccuu cg 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-154-5p inhibitor <400> 2 cgaaggcaac acggauaacc ua 22
Claims (12)
상기 miR-154-5p의 활성 저해물질은 miR-154-5p의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산분자인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.The method of claim 5,
The miR-154-5p activity inhibitor is a pharmaceutical composition, characterized in that the nucleic acid molecule capable of binding to all or part of the nucleotide sequence of miR-154-5p.
상기 miR-154-5p의 활성 저해물질은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 핵산분자인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.The method of claim 5,
The miR-154-5p activity inhibitor is a pharmaceutical composition, characterized in that the nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
상기 알레르기 질환은 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 접촉피부염 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.The method of claim 5,
The allergic disease is a pharmaceutical composition characterized in that it is selected from anaphylaxis, asthma, allergic rhinitis and allergic contact dermatitis.
b) 상기 피검화합물이 처리된 분리된 세포에서 miR-154-5p의 발현수준을 측정하는 단계; 및
c) 대조군과 비교하여 miR-154-5p의 발현수준이 감소된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 알레르기 질환 치료제 스크리닝 방법.a) treating the test compound with isolated cells having a miR-154-5p expression system;
b) measuring the expression level of miR-154-5p in the isolated cells treated with the test compound; And
c) selecting a test compound of the test group with reduced expression level of miR-154-5p compared to the control group; Allergic disease treatment screening method comprising a.
상기 분리된 세포는 인간 또는 쥐의 비반세포(mast cell)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.The method of claim 9,
The isolated cells are human or mouse screening method, characterized in that the (mast cell).
상기 알레르기 질환은 아나필락시스, 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 접촉피부염 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.The method of claim 9,
The allergic disease is anaphylaxis, asthma, allergic rhinitis and allergic contact dermatitis screening method, characterized in that selected from.
상기 발현수준의 측정은 miR-154-5p에 대한 정량적 실시간 PCR을 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
The method of claim 9,
The expression level is measured by performing a quantitative real-time PCR for miR-154-5p screening method.
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